i

EFEK EKSTRAK KULIT BUAH RAMBUTAN

TERHADAP KADAR MDA DAN SOD

TIKUS YANG DIPAPAR ASAP ROKOK

Skripsi

disusun sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Sarjana Sains

Program Studi Biologi

oleh

Erni Wulandari

4411412053

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI SEMARANG

2016

ii

iii

iv

ABSTRAK

Wulandari, Erni. 2016. Efek Ekstrak Kulit Buah Rambutan terhadap Kadar

MDA dan SOD Tikus yang Dipapar Asap Rokok. Skripsi. Jurusan Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri

Semarang. Dr. drh. R. Susanti, M.P. Dr. Lisdiana, M.Si

Asap rokok merupakan polutan bagi manusia dan lingkungan. Asap rokok

mengandung senyawa radikal bebas yang akan menyebabkan stres oksidatif. Pada

kondisi stres oksidatif, radikal bebas menyebabkan peroksidasi lipid membran sel

dan merusak organisasi membran sel. Penelitian ini bertujuan untuk menganalisis

kadar MDA dan SOD pada tikus yang dipapar asap rokok dan diberi ekstrak kulit

buah rambutan. Penelitian dilakukan pada 30 ekor tikus putih jantan galur Wistar

yang dibagi menjadi 6 kelompok, yaitu kelompok A (normal), B (negatif), C

(positif) dan D, E, F merupakan kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan

dengan dosis secara berturut-turut 3, 6, 12 mg/200 gramBB dan paparan asap

rokok selama 14 hari. Untuk mengetahui perbedaan kadar MDA dan SOD setiap

kelompok dilakukan analisis data menggunakan uji one way anova dan uji lanjut

LSD. Hasil analisis statistik menunjukkan kadar MDA pada kelompok A tidak

berbeda nyata dengan kelompok C dan E. Kelompok D tidak berbeda nyata

dengan kelompok F. Aktivitas SOD pada kelompok A berbeda nyata dengan

kelompok lainnya. Aktivitas SOD kelompok C tidak berbeda nyata dengan

kelompok E. Simpulan dari penelitian ini adalah ekstrak kulit buah rambutan

dosis 6 mg/200 gramBB dapat menurunkan kadar MDA dan meningkatkan

aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok.

Katakunci: Asap rokok, ekstrak kulit buah rambutan, MDA, SOD

v

KATA PENGANTAR

Alhamdulillah, segala puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT

atas rahmat dan hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul Efek Ekstrak Kulit Buah Rambutan terhadap Kadar MDA dan SOD

Tikus yang Dipapar Asap Rokok. Skripsi ini disusun sebagai salah satu syarat

untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biologi Universitas

Negeri Semarang. Penulis menyadari dalam pembuatan skripsi ini tidak lepas dari

bantuan berbagai pihak, maka pada kesempatan ini penulis menyampaikan

penghargaan dan terimakasih kepada:

1. Rektor Universitas Negeri Semarang atas kesempatan yang diberikan untuk

menempuh pendidikan di Unnes.

2. Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri

Semarang yang telah memberikan izin penelitian.

3. Ketua Jurusan Biologi Universitas Negeri Semarang yang telah membantu

kelancaran administrasi dalam penyelesaian skripsi.

4. Dr. drh. R. Susanti, M.P. dan Dr. Lisdiana, M.Si. selaku dosen pembimbing I

dan II atas bimbingan, saran, bantuan dan berbagai kemudahan selama proses

penyusunan skripsi.

5. Dr. Wiwi Isnaeni, M.S. selaku penguji skripsi yang telah memberikan kritik

dan saran untuk kelayakan naskah skripsi saya.

6. Bapak, Ibu, Mas Heri, Dek Andry dan semua keluarga atas doa, perhatian dan

dukungannya.

7. Melisa, Wawan, Alam, Nikmah, Mas Herdi dan Mba Fera atas bantuannya

selama penelitian.

8. Nok Ely, Tante nCum, Uti Zamia serta teman-teman Biologi 2012 atas

kebersamaan dan kenangan yang tak terlupakan.

9. Teman-teman seperjuangan di Kos Griya Ayu atas persaudaraan dan

semangat.

Semarang, 3 Oktober 2016

Penulis

vi

DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ......................................................................... i

PERNYATAAN KEASLIAN SKRIPSI ........................................... ii

PENGESAHAN .................................................................................. iii

ABSTRAK ....................................................................................... iv

KATA PENGANTAR ...................................................................... v

DAFTAR ISI ..................................................................................... vi

DAFTAR GAMBAR ........................................................................ viii

DAFTAR TABEL ............................................................................. ix

DAFTAR LAMPIRAN ..................................................................... x

BAB I PENDAHULUAN

A. Latar Belakang ............................................................................. 1

B. Rumusan Masalah ......................................................................... 4

C. Tujuan Penelitian .......................................................................... 4

D. Manfaat Penelitian ........................................................................ 4

E. Penegasan Istilah .......................................................................... 4

BAB II LANDASAN TEORI

A. Kandungan Senyawa Kimia Rokok ............................................. 6

B. Asap Rokok sebagai Sumber Radikal Bebas ............................... 11

C. Kandungan Senyawa Kimia Kulit Buah Rambutan ..................... 14

D. MDA ............................................................................................. 20

E. SOD .............................................................................................. 23

F. Senyawa Antioksidan Vitamin C ................................................. 25

G. Mekanisme Kerja Kulit Buah Rambutan sebagai Antioksidan .................................................................. 26

H. Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal DPPH ....................... 27

I. Kerangka Berfikir ......................................................................... 29

J. Hipotesis Penelitian ...................................................................... 29

vii

BAB III METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian ...................................................... 30

B. Populasi dan Sampel .................................................................... 30

C. Variabel Penelitian ....................................................................... 31

D. Rancangan Penelitian ................................................................... 31

E. Alat dan Bahan Penelitian ............................................................ 33

F. Prosedur Penelitian ....................................................................... 36

G. Analisis Data ................................................................................ 39

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian ............................................................................. 40

B. Pembahasan .................................................................................. 41

BAB V SIMPULAN DAN SARAN

A. Simpulan ....................................................................................... 49

B. Saran ............................................................................................. 49

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................... 50

LAMPIRAN ...................................................................................... 58

viii

DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

1. Kandungan senyawa kimia pada rokok ......................................... 7

2. Sumber eksogen dan endogen radikal bebas ................................. 12

3. Kulit buah rambutan ...................................................................... 15

4. Struktur kimia MDA ..................................................................... 22

5. Reaksi antara radikal DPPH dengan antioksidan .......................... 28

6. Struktur molekul DPPH setelah menerima donor atom OH ......... 28

7. Kerangka berfikir penelitian ......................................................... 29

8. Desain penelitian ........................................................................... 35

ix

DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

1. Senyawa yang terkandung dalam asap rokok ............................... 8

2. Kandungan total phenolic content, total anthocyanin content

dan tanin pada kulit buah rambutan ............................................... 16

3. Kandungan geraniin, ellagic acid, corilagin dan asam askorbat

pada kulit buah rambutan .............................................................. 17

4. Kandungan saponin, alkaloid, tanin dan flavonoid pada kulit

buah rambutan (mg/100 g berat kering) ........................................ 17

5. Alat penelitian ............................................................................... 33

6. Bahan penelitian ............................................................................ 34

7. Prosedur pengukuran kadar MDA ................................................ 38

8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD ............................................. 38

9. Hasil rerata kadar MDA dan SOD ................................................ 40

x

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1. Hasil pemeriksaan kadar MDA dan aktivitas SOD ....................... 58

2. Uji normalitas, homogenitas, anova dan post hoc kadar MDA .... 59

3. Uji normalitas, homogenitas, anova dan post hoc

aktivitas SOD ................................................................................ 64

4. Hasil identifikasi tumbuhan rambutan .......................................... 70

5. Hasil uji DPPH ekstrak kulit buah rambutan ................................ 71

6. Dokumentasi penelitian ................................................................. 72

1

BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar belakang

Rokok adalah produk dari daun tembakau yang kemunculannya

menyebabkan kontroversial karena mampu menimbulkan pro dan kontra di

masyarakat (Fitria et al. 2013). Merokok merupakan salah satu gaya hidup

masyarakat di dunia, salah satunya Indonesia. Mengonsumsi rokok

diketahui dapat menyebabkan gangguan kesehatan, baik secara langsung

maupun tidak. Gangguan kesehatan yang ditimbulkan antara lain dapat

berupa bronkitis kronis, emfisema, kanker paru-paru dan penyempitan

pembuluh nadi (Church & Pryor 1985). Dampak rokok terhadap kesehatan

sering disebut sebagai silent killer. Pengaruh tersebut timbul secara

perlahan, dalam tempo yang relatif lama, tidak langsung dan tidak nampak

secara nyata (Rupinder 2014).

Indonesia merupakan negara berkembang dengan penduduk

perokok terbesar ketiga di dunia setelah Cina dan India (WHO 2013).

Menurut survei WHO (2008), sepertiga dari penduduk dunia terutama orang

dewasa adalah perokok. Jumlah perokok setiap tahun cenderung meningkat

seiring dengan meningkatnya konsumsi rokok. Angka kematian di dunia

akibat rokok mencapai 500 juta orang per tahun. Dalam setiap enam detik

terdapat satu kematian akibat rokok

Pembakaran rokok akan menimbulkan asap rokok. Asap rokok

dapat dibedakan menjadi dua, yaitu asap utama (mainstream smoke) dan

asap samping (sidestream smoke). Asap utama adalah asap yang dihisap

oleh perokok aktif. Asap samping merupakan asap yang terhirup oleh

perokok pasif dan secara terus-menerus keluar dari ujung rokok (Lodovici &

Bigagli 2009). Asap utama terdiri dari 8% fase tar dan 95% fase gas. Asap

rokok di ruangan sekitar perokok 85% asap samping dan 15% asap utama

(Lodovici et al. 2004). Asap rokok yang dihirup oleh seorang perokok

mengandung komponen gas dan partikel. Komponen gas sangat berpotensi

menimbulkan radikal bebas karbon monoksida, asam hidrosianat, nitrogen

2

oksida dan formalin. Komponen partikel asap rokok diantaranya adalah tar,

indol nikotin, karbarzol dan kresol (KPAI 2009).

Asap rokok merupakan campuran senyawa yang mengandung

4000 bahan kimia antara lain tar, nikotin, karbon monoksida dan zat-zat

berbahaya lainnya. Senyawa yang terkandung pada asap rokok terdiri dari

200 zat bersifat racun (asam hidrosianat, akrolein, oksida nitrogen) dan

40 zat bersifat karsinogen (tar, nikotin, benzo(a)piren, senyawa

hidrokarbon) (Palanisamy et al. 2009). Dalam satu kali hisapan rokok

terdapat 1014-16

molekul radikal bebas yang masuk ke dalam tubuh

(Yanbaeva et al. 2007). Asap rokok adalah polutan bagi manusia dan

lingkungan.

Asap rokok dapat menimbulkan respons stres, yaitu kondisi pada

saat individu tidak mampu mengatasi beban fisik atau psikologis. Stres yang

berat diketahui dapat menyebabkan stres oksidatif. Stres oksidatif adalah

ketidakseimbangan antara jumlah radikal bebas dengan antioksidan tubuh.

Pada kondisi stres oksidatif, terjadi peningkatan jumlah reactive oxygen

species (ROS) di dalam tubuh (Haliwell & Gutteridge 1999). ROS adalah

oksidan yang sangat reaktif. Dampak negatif senyawa tersebut timbul

karena aktivitasnya, sehingga dapat merusak komponen sel yang sangat

penting untuk mempertahankan integritas sel. Setiap ROS yang terbentuk

dapat memulai suatu reaksi berantai yang terus berlanjut hingga ROS itu

dihilangkan oleh ROS yang lain atau sistem antioksidan (Pillon & Soulage

2012).

Aktivitas radikal bebas di dalam tubuh diimbangi dengan

mekanisme pertahanan endogen, yaitu tubuh akan memproduksi antioksidan

yang mempunyai pengaruh sebagai anti radikal bebas. Salah satu

antioksidan endogen adalah superoxide dismutase (SOD) yang merupakan

sistem pertahanan tubuh garis pertama terhadap aktivasi ROS (Fridovich

1981). Pada saat level ROS meningkat melebihi kemampuan pertahanan

endogen, maka terjadilah ketidakstabilan oksidatif yang disebut stres

oksidatif. Pada kondisi stres oksidatif, radikal bebas akan menyebabkan

3

peroksidasi lipid membran sel dan merusak organisasi membran sel. Salah

satu biomarker terjadinya stres oksidatif adalah tingginya kadar

malondialdehyde (MDA) dan menurunnya aktivitas SOD akibat proses

peroksidasi lipid yang berlebihan di dalam sel (Hu et al. 2014).

Suatu cara untuk mengendalikan terjadinya stres oksidatif yang

berlebihan yaitu dengan mengonsumsi antioksidan dari makanan

(antioksidan eksogen). Salah satu sumber antioksidan eksogen adalah kulit

buah dari tanaman rambutan (Nephelium lappaceum L). Tanaman rambutan

banyak ditemui di Indonesia. Tanaman rambutan terdiri dari bagian akar,

daun, biji, buah, kulit kayu dan kulit buah yang memiliki banyak manfaat

sebagai sumber vitamin dan senyawa berkhasiat obat. Kulit buah rambutan

merupakan salah satu bagian dari tanaman rambutan yang belum

dimanfaatkan secara maksimal. Kulitnya yang berwarna merah ditemukan

mengandung berbagai macam senyawa kimia.

Berdasarkan penelitian, kulit buah rambutan memiliki aktivitas

antioksidan yang mengandung senyawa fenolik, alkaloid, steroid, terpenoid

(Wardhani & Supartono 2015), asam askorbat (Wall 2006), flavonoid

(Dirmawati 2008) serta antosianin (Hutapea et al. 2014) dengan kandungan

tertinggi adalah senyawa fenolik (Fila et al. 2012). Penelitian Thitilerdecha

et al. (2010) berhasil mengisolasi asam ellagat, korilagin dan geranin yang

merupakan senyawa fenolik pada kulit buah rambutan. Senyawa fenolik

bersifat antioksidan kuat dan terdapat paling banyak pada kulit buah

rambutan. Senyawa tersebut mempunyai cincin aromatik dengan gugus

hidroksil lebih dari satu dan berperan melindungi sel tubuh dari bahaya

radikal bebas dengan cara mengikat radikal bebas.

Palanisamy et al. (2008) menyatakan bahwa sebagai tanaman yang

mengandung antioksidan, kulit buah rambutan diduga dapat menghambat

terjadinya kerusakan oksidatif, sehingga diperlukan suatu penelitian untuk

mengetahui pengaruh ekstrak kulit buah rambutan terhadap kadar MDA dan

aktivitas SOD akibat paparan asap rokok.

4

B. Rumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang di atas, maka rumusan masalah dalam

penelitian ini adalah:

Bagaimana pengaruh pemberian ekstrak kulit buah rambutan terhadap kadar

MDA dan aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok?

C. Tujuan Penelitian

Tujuan penelitian ini adalah: Untuk menganalisis kadar MDA dan

aktivitas SOD pada tikus yang dipapar asap rokok dan diberi ekstrak kulit

buah rambutan.

D. Manfaat Penelitian

Dengan dilaksanakannya penelitian ini diharapkan dapat memberi

manfaat sebagai berikut :

1. Memberikan informasi tentang hasil kajian efek pemberian ekstrak kulit

buah rambutan sebagai sumber antioksidan

2. Meningkatkan kepercayaan masyarakat terhadap penggunaan obat yang

berasal dari bahan-bahan alami.

3. Berguna sebagai bahan acuan untuk penelitian lebih lanjut mengenai

ekstrak kulit buah rambutan sebagai antioksidan.

E. Penegasan Istilah

Untuk menghindari salah pengertian dalam memahami isi skripsi

ini, perlu ada batasan-batasan terhadap beberapa istilah sebagai berikut :

1. Ekstrak Kulit Buah Rambutan

Ekstrak merupakan sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi

zat aktif dari simplisia menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian

semua pelarut diuapkan dan massa yang tersisa diperlakukan

sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes RI 1995).

Ekstrak kulit buah rambutan dalam penelitian ini adalah ekstrak dari

seluruh bagian kulit buah rambutan yang diperoleh dari hasil ekstraksi

menggunakan pelarut etanol. Hasil akhirnya berupa pasta.

5

2. MDA

MDA merupakan senyawa dialdehida produk akhir dari peroksidasi

lipid (Winarsi 2007). MDA dalam penelitian ini adalah hasil

peroksidasi lipid oleh senyawa radikal bebas akibat dipapar asap rokok.

MDA diukur menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang

545 nm.

3. SOD

SOD adalah antioksidan enzimatis yang melindungi jaringan dari

kerusakan oksidatif akibat radikal bebas (Muchtadi 2013). SOD dalam

penelitian ini diukur dengan metode kolorimetri dari BioVision

Incorporated menggunakan microplate reader pada panjang gelombang

450 nm.

4. Asap Rokok

Asap rokok merupakan bahan toksik yang diperoleh dari hasil

pembakaran rokok. Jenis rokok dalam penelitian ini adalah rokok kretek

yang dijual bebas di pasaran dengan kandungan tar 30 mg dan nikotin

1,8 mg per batang rokok.

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Kandungan Senyawa Kimia Rokok

Rokok merupakan salah satu sumber utama paparan toksin yang

secara kimiawi berpengaruh dalam menimbulkan berbagai jenis penyakit.

Rokok adalah produk dari tembakau yang mengandung nikotin dan tar.

Rokok berbentuk silinder terdiri dari kertas berwarna putih dan cokelat,

berukuran panjang antara 70-120 mm (bervariasi tergantung negara) dengan

diameter 10 mm, berisi cacahan daun tembakau dengan tambahan sedikit

racikan cengkeh (Triswanto 2007). Rokok dibakar pada salah satu ujungnya

dan dibiarkan membara agar asapnya dapat dihirup lewat mulut pada ujung

lainnya. Rokok terdiri dari dua jenis, yaitu rokok yang berfilter dan rokok

tidak berfilter. Filter pada rokok terbuat dari bahan busa serabut sintesis

yang berfungsi untuk menyaring nikotin. Filter rokok mampu mengurangi

jumlah tar dan nikotin dalam asap hingga 40-50% dibandingkan dengan

rokok tidak berfilter (Shin et al. 2009).

Berdasarkan bahan bakunya rokok terbagi menjadi tiga kategori

yaitu rokok putih, rokok kretek dan rokok klembak. Rokok putih adalah

rokok yang terbuat dari daun tembakau dan diberi saus. Rokok kretek adalah

rokok berbahan daun tembakau dan cengkeh yang diberi saus, sedangkan

rokok klembak yaitu rokok yang terbuat dari daun tembakau, cengkeh,

kemenyan dan saus. Fungsi penambahan bahan lain dalam pembuatan rokok

adalah untuk mendapatkan efek rasa dan aroma tertentu (Sitepoe 2000).

Merokok adalah kegiatan menghisap asap dari pembakaran

tembakau pada rokok. Mengonsumsi rokok sudah menjadi tren dan bahkan

didalilkan sebagai tanda kedewasaan seseorang. Di Indonesia, jenis rokok

yang banyak dikonsumsi adalah rokok kretek. Rokok kretek mengandung

60-70% tembakau, 30-40% cengkeh dan ramuan lainnya (Hutapea 2013).

Rokok kretek mengandung 5 komposisi tambahan yaitu eugenol, acethyl

6

7

eugenol, -caryophillene, -humulene dan caryophillene epoxide.

Berdasarkan penelitian, eugenol merupakan bahan anestetik yang digunakan

oleh dokter gigi. Apabila eugenol dikonsumsi maka akan timbul efek

anestesi pada pengguna rokok kretek. Eugenol juga memiliki efek

antikonvulsan, penghambat transmisi neural dan peradangan (Guidotti et al.

1989).

Gambar 1. Kandungan senyawa kimia pada rokok (Kandar 2014)

Pembakaran rokok menghasilkan asap rokok, terdiri dari dua

komponen yaitu 85% komponen cepat menguap yang berbentuk gas dan

15% komponen partikel-partikel terdispersi di dalamnya. Asap yang

dihasilkan pembakaran rokok terdiri dari asap utama dan asap samping.

Asap utama adalah asap rokok yang dihirup & dihembuskan langsung oleh

perokok, sedangkan asap samping adalah asap dari ujung rokok terbakar

yang disebarkan ke udara bebas sehingga dapat terhirup oleh lingkungan

sekitar (Lodovici et al. 2004). Asap rokok merupakan radikal bebas yang

berasal dari sumber eksogen. Beberapa unsur yang terdapat dalam asap

rokok dapat diamati dalam Tabel 1.

8

Tabel 1. Senyawa-senyawa yang terkandung dalam asap rokok

Fase Asap Rokok Senyawa Efek

Fase Partikel a. Tar Karsinogen

b. Hidrokarbon aromatik polinuklear

Karsinogen, depressor

ganglion, kokarsinogen

c. Nikotin Kokarsinogen & iritan

d. Fenol Kokarsinogen & iritan

e. Kresol Kokarsinogen & iritan

f. -Naftilamin Karsinogen

g. N-Nitrosonomikotin Karsinogen

h. Benzo(a)piren Karsinogen

i. Logam renik Karsinogen

j. Indol Akselerator tumor

k. Karbazol Akselerator tumor l. Katekol Kokarsinogen

Fase Gas a. Karbon monoksida Pengurangan transfer dan pemakaian O2

b. Asam hidrosianat Sitotoksik & iritan

c. Asetaldehid Sitotoksik & iritan

d. Akrolein Sitotoksik & iritan

e. Amonia Sitotoksik & iritan

f. Formaldehid Sitotoksik & iritan

g. Oksida dari nitrogen Sitotoksik & iritan

h. Nitrosamin Karsinogen

i. Hidrozin Karsinogen

j. Vinil klorida Karsinogen

(Palanisamy et al. 2009)

Fase gas asap rokok berisi hingga 1014

radikal bebas dan zat-zat

reaktif per kepulan asap rokok. Radikal bebas dan oksidan yang terdapat

pada fase gas asap rokok memiliki waktu paruh pendek namun senyawa

tersebut dapat memasuki aliran darah dan menyebabkan kerusakan oksidatif

makromolekul. Fase gas asap rokok terbukti menginisiasi autooksidasi in

vitro dari PUFA sehingga terjadi peroksidasi lipid (Swan & Lessov-

Schlagger 2007). Fase gas asap rokok juga mengandung aldehida jenuh dan

tak jenuh yang lebih stabil daripada radikal bebas dan hidrogen peroksida.

Senyawa tersebut dapat masuk ke dalam aliran darah menghasilkan ROS

melalui interaksi dengan enzim NADPH. Akibatnya, jaringan yang jauh dari

9

paru-paru juga dapat mengalami peningkatan stres oksidatif (Tostes et al.

2008).

Fase partikel asap rokok mengandung kompleks hidrokarbon yang

akan bereaksi dengan nitrogen oksida (NO) dan membentuk senyawa

radikal lain. NO yang terdapat pada asap rokok dapat menginisiasi PUFA

dan mengakibatkan pembentukan peroksidasi lipid. Fase partikel asap rokok

memiliki waktu paruh lebih lama daripada fase gas. Fase partikel

mengandung ion logam yang dapat menghasilkan radikal hidroksil dari

hidrogen peroksida. Radikal tersebut dapat menembus membran sel dan

dapat menginduksi stres oksidatif (Pryor 1997). Radikal bebas akan

mengikat molekul-molekul yang paling rentan pada membran sel seperti

PUFA. Jembatan metilen pada PUFA merupakan sasaran utama radikal

bebas yang akan membentuk radikal alkil, peroksil dan alkoksil (Allard et

al. 1994).

Zat-zat yang terkandung dalam asap rokok sangat beracun karena

mampu menimbulkan efek inflamasi dan radikal bebas yang dapat

menurunkan efek antioksidan. Menurut Fitria et al. (2013) racun utama pada

asap rokok yang mengganggu kesehatan sebagai berikut:

1. Tar

Tar adalah sejenis cairan kental berwarna coklat tua atau hitam,

merupakan substansi hidrokarbon yang bersifat lengket dan menempel pada

paru-paru. Tar merupakan suatu zat karsinogen yang dapat menimbulkan

kanker pada saluran pernafasan dan paru-paru. Tar terdiri dari dua fase yaitu

fase tar dan fase gas. Pada fase tar, merupakan pembentuk radikal bebas

seperti quinon, semiquinon dan hidroquinon dalam bentuk matriks polimer.

Pada fase gas, mengandung nitrit oksida dan nitrit peroksida yang dapat

mengubah oksigen menjadi radikal bebas superoksida dan radikal bebas

hidroksil yang sangat merusak (Lustbrader et al. 1983).

2. Nikotin

Nikotin adalah senyawa porillidin dalam Nicotiana tabacum,

Nicotiana rustica dan spesies lainnya yang bersifat adiktif serta dapat

10

mengakibatkan ketergantungan. Nikotin berbentuk cair, tidak berwarna dan

merupakan basa yang mudah menguap. Nikotin dapat meracuni saraf tubuh,

meningkatkan tekanan darah, menimbulkan penyempitan pembuluh darah

tepi dan menyebabkan ketagihan serta ketergantungan pada pemakainya

(Benowitz 2008). Jumlah nikotin yang dihisap perokok dipengaruhi oleh

berbagai faktor, yaitu kualitas rokok, jumlah tembakau setiap batang rokok,

dalamnya isapan dan penggunaan filter.

Kandungan nikotin dalam rokok kretek lebih besar daripada rokok

filter. Nikotin yang terdapat dalam asap rokok samping 46 kali lebih besar

dari asap rokok utama. Rokok kretek mengandung lebih banyak nikotin

dibandingkan dengan rokok putih. Kadar nikotin pada rokok kretek sebesar

46,8 mg sedangkan pada rokok putih yaitu 16,3 mg. Nikotin yang

dikeluarkan oleh rokok kretek jumlahnya lebih banyak karena rokok kretek

tidak dilengkapi dengan filter (Susanna et al. 2003).

3. Karbon monoksida

Karbon monoksida adalah sejenis gas beracun yang tidak berwarna

dan tidak berbau. Gas CO yang dihasilkan sebatang rokok dapat mencapai

3-6%, sedangkan CO yang dihisap oleh perokok sejumlah 400 ppm (parts

per million). Karbon monoksida terkandung dalam asap rokok mainstream

maupun sidestream. Pada dosis rendah, paparan karbon monoksida dapat

meningkatkan kadar karboksi hemoglobin (COHb) dalam darah sejumlah 2-

16% yang dapat menyebabkan kekurangan oksigen pada jaringan (Sitepoe

2000).

4. Logam timbal (Pb)

Timbal adalah logam beracun yang berwarna abu-abu. Timbal

paling banyak ditemukan pada gas buangan kendaraan bermotor dan asap

rokok (Rodgaman & Perfetti 2009). Timbal yang dihasilkan oleh sebatang

rokok adalah sebesar 0,5 g, sementara ambang batas bahaya Pb yang

masuk ke dalam tubuh adalah 20 g per hari (Patrick 2006). Paparan timbal

yang terjadi secara terus-menerus di dalam tubuh dapat menimbulkan efek

11

negatif dalam tubuh serta menyebabkan penurunan kemampuan antioksidan

sehingga menyebabkan stres oksidatif.

B. Asap Rokok sebagai Sumber Radikal Bebas

Radikal bebas adalah suatu senyawa yang memiliki satu atau lebih

elektron tidak berpasangan di orbital luarnya (unpaired electron). Oleh

karena elektronnya tidak berpasangan, maka senyawa tersebut labil dan

sangat reaktif mencari pasangan. Radikal bebas akan menyerang dan

mengikat elektron molekul di sekitarnya. Molekul yang terambil

elektronnya akan mewarisi sifat reaktifnya sehingga timbul reaksi berantai

yang tidak terputus (Muchtadi 2013). Reaksi rantai akan berhenti apabila

reaktivitasnya diredam oleh senyawa yang bersifat antioksidan.

Radikal bebas dapat terbentuk melalui 3 tahapan reaksi yaitu

inisiasi, propagasi dan terminasi.

1. Tahap inisiasi (permulaan), yaitu tahap pembentukan awal radikal-

radikal bebas.

Misalnya:

Fe++

+ H2O2 Fe

+++ + OH

- + OH

R1 H + OH R1 + H2O

2. Tahap propagasi (perambatan), yaitu tahap radikal bebas mengawali

sederetan reaksi sampai terbentuk radikal bebas baru yang sering disebut

sebagai reaksi rantai

R2 H + R1 R2 + R1 H

R3 H + R2 R3 + R2 H

3. Tahap terminasi (pengakhiran), yaitu tahap terputusnya daur propagasi

oleh reaksi-reaksi terminasi. Reaksi ini mengubah radikal bebas menjadi

radikal bebas yang stabil dan tidak reaktif.

R1 + R1 R1 R1

R2 + R1 R2 R1

Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh (endogen) maupun

dari luar tubuh (eksogen). Radikal yang berasal dari dalam tubuh terbentuk

12

sebagai sisa proses metabolisme protein, karbohidrat, lemak pada

mitokondria, proses inflamasi, reaksi antara besi logam transisi dalam

tubuh, fagosit, xantin oksidase, peroksisom maupun pada kondisi iskemia.

Sumber dari luar tubuh adalah asap rokok, asap kendaraan bermotor, polusi

lingkungan, radiasi ultraviolet, obat-obatan dan pestisida. Radikal bebas

terpenting dalam tubuh adalah radikal derivat dari oksigen yang disebut

kelompok oksigen reaktif (ROS) (Haliwell & Gutteridge 2007). ROS adalah

senyawa pengoksidasi turunan oksigen yang bersifat sangat reaktif, terdiri

atas kelompok radikal bebas dan kelompok nonradikal. Kelompok radikal

bebas antara lain superoxide anion (O2-), hydroxyl radicals (OH) dan

peroxyl radicals (RO2). Kelompok nonradikal misalnya hydrogen peroxide

(H2O2) dan organic peroxides (ROOH) (Haliwell & Whiteman 2004).

Gambar 2. Sumber eksogen dan endogen radikal bebas

(Young & Woodside 2001)

Radikal bebas dalam jumlah normal diperlukan bagi kelangsungan

beberapa proses fisiologis dalam tubuh, karena radikal bebas berperan

dalam transportasi elektron (Ott et al. 2007). Pada saat tubuh mengandung

radikal bebas dalam jumlah yang banyak, maka radikal bebas akan

dinetralkan oleh enzim yang berperan sebagai antioksidan intraseluler

menjadi molekul yang lebih stabil. Namun, apabila jumlah radikal bebas

terus menerus mengalami peningkatan, maka antioksidan dalam tubuh tidak

13

dapat mengikat radikal bebas lagi. Hal tersebut berbahaya karena radikal

bebas berpotensi untuk berikatan dengan molekul lain sehingga molekul lain

tidak stabil, menyebabkan peroksidasi lipid membran sel yang berlebihan,

serta menyebabkan kerusakan pada protein dan DNA (Packer 1994).

Merokok telah diketahui dapat menyebabkan gangguan kesehatan

yang diakibatkan oleh nikotin dari asap perokok aktif dan asap perokok

pasif. Target utama asap rokok adalah paru-paru. Rusaknya paru-paru

sebagai target utama yang langsung terkena asap rokok dapat dijelaskan

dengan adanya paparan agen kimia di dalam asap rokok. Namun, efek yang

menyebabkan penyakit kronik pada sistem organ lain kemungkinan adalah

hasil pajanan secara tidak langsung (Yanbaeva et al. 2007). Merokok juga

merupakan salah satu faktor resiko utama terhadap penyakit kardiovaskuler.

Mekanisme potensial yang disebabkan merokok terhadap penyakit

kardiovaskuler meliputi gangguan homeostasis, abnormalitas lipid dan

disfungsi endotel (Papathanasiou et al. 2014).

Berdasarkan mekanisme kerjanya di dalam tubuh manusia, racun

dibagi menjadi dua yaitu racun yang bekerja lokal dan sistemik (Wu &

Wang 2005). Racun yang bekerja lokal dapat bersifat korosif, iritasi atau

anestetik. Racun yang bekerja sistemik biasanya mempunyai afinitas

terhadap salah satu sistem, contohnya alkohol dan karbon monoksida.

Adapun racun yang bekerja lokal maupun sistemik misalnya asam karbol,

arsen dan Pb. Efek lokal maupun sistemik dari paparan asap rokok dapat

dijelaskan melalui mekanisme stres oksidatif dan inflamasi (Pearson et al.

2003).

Radikal bebas dari asap rokok dapat menyebabkan peroksidasi dari

asam lemak tak jenuh membran sel yang memperkuat stres oksidatif selama

merokok. Stres oksidatif akan terjadi apabila ROS yang dihasilkan lebih

besar dibandingkan yang dapat diredam oleh mekanisme pertahanan sel.

Apabila senyawa-senyawa tersebut tidak diredam, maka oksigen akan

berbalik menjadi racun bagi tubuh (Droge 2002).

14

Stres oksidatif dapat dilihat dari beberapa tanda yang berbeda, yaitu

dengan pengukuran langsung agen oksidatif seperti produksi ROS oleh sel

darah perifer, efek stres oksidatif pada target molekul (produk lipid

peroksidasi dan protein teroksidasi), atau respon kapasitas antioksidan

dalam plasma (Yanbaeva et al. 2007). Paparan bahan kimia oksidan dalam

asap dikaitkan dengan penurunan tingkat antioksidan endogen dalam

kompartemen sistemik. Sejumlah penelitian melaporkan bahwa merokok

mengakibatkan rendahnya konsentrasi antioksidan dalam plasma.

Hasil penelitian Adyttia et al. (2014) menunjukkan bahwa

pemberian asap rokok (3 batang/hari) pada tikus selama 14 hari

mengakibatkan peningkatan kadar MDA. Penelitian Muhammad (2009),

melaporkan bahwa pemberian asap rokok (4 batang/hari selama 30 hari)

pada tikus menunjukkan adanya kenaikan kadar MDA dan penurunan

aktivitas SOD. Hal ini dikarenakan keadaan stres akibat pemaparan asap

rokok dapat meningkatkan jumlah radikal bebas yang menyebabkan

penggunaan SOD semakin banyak sehingga jumlahnya semakin berkurang.

C. Kandungan Senyawa Kimia Kulit Buah Rambutan

Tanaman rambutan merupakan salah satu tanaman tropis asli Asia

Tenggara. Tanaman tersebut sangat mudah dijumpai dan dikembangkan.

Saat ini tanaman rambutan telah menyebar hingga Amerika Latin dan dapat

ditemukan di daratan yang mempunyai iklim sub tropis. Tanaman rambutan

dapat tumbuh subur pada ketinggian 30-50 mdpl. Tanaman rambutan

memiliki klasifikasi sebagai berikut:

Kingdom : Plantae

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Subkelas : Rosidae

Ordo : Sapindales

Famili : Sapindaceae

Genus : Nephelium

Spesies : Nephelium lappaceum L.

Kultivar : Nephelium lappaceum L. Sekaran (Lampiran 4)

15

Rambutan merupakan tumbuhan yang memiliki banyak manfaat

dan sangat digemari masyarakat. Salah satu bagian yang belum

dimanfaatkan secara maksimal adalah kulit buah rambutan. Banyak

penelitian telah membuktikan berbagai macam senyawa kimia yang

terkandung di dalamnya. Kulit buah rambutan ditemukan memiliki efek

biologis seperti aktivitas antioksidan, antibakteri (Palanisamy et al. 2008;

Thitilerdecha et al. 2008), antiproliferasi (Khonkarn et al. 2010), anti herpes

simplex virus tipe 1 (Nawawi et al. 1999) dan antihiperglikemik

(Palanisamy et al. 2011).

Gambar 3. Buah rambutan kultivar Sekaran (Dokumentasi penulis 2016)

Kulit buah rambutan mengandung berbagai macam antioksidan

seperti alkaloid, fenolik, steroid, terpenoid (Wardhani & Saptono 2015),

tanin (Thinkratok 2011), saponin (Fila et al. 2012) dan asam askorbat (Wall

2006). Kulit buah rambutan juga mengandung flavonoid dan antosianin.

Antosianin merupakan senyawa golongan flavonoid yang memberikan

pigmen sehingga berwarna merah tua (Nurdin et al. 2013).

16

Tabel 2. Kandungan total phenolic content, total anthocyanin content dan tanin pada kulit buah rambutan

Metode ekstraksi Pelarut Total phenolic

content

Total

anthocyanin

content (mg/100

g ekstrak segar)

Tanin

(% ekstraksi)

Referensi

Maserasi Butanol

Etanol

Etil asetat

Heksana

Metanol

1.73 0.03a

0.72 0.05a

2.28 0.02a

0.29 0.01a

2.05 0.11a

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Khonkarn et al. (2010)

Maserasi Etanol

Air

762b

300b

-

-

-

-

Palanisamy et al. (2008)

Maserasi Etanol - - - Palanisamy et al. (2011a)

Maserasi Etanol

Air

Aquades

975 34b

428 21b

393.2 7.4c

-

-

-

-

-

-

Palanisamy et al (2011b)

Maserasi Eter

Metanol : Etanol

293.3 0.5c

542.2 0.0c

-

-

-

-

-

-

Thitilerdecha et al. (2008)

Maserasi Water : asam

asetat (60:39:1)

- 181.3

-

-

-

Sun et al. (2011)

Maserasi Air - - 21.18 Wongsiri et al. (1993)

a = mg gallic acid/ml; b = mg gallic acid/g berat ekstrak kering; c = mg katekin/g ekstrak kering

17

Tabel 3. Kandungan geraniin, ellagic acid, corilagin dan asam askorbat pada kulit buah rambutan

Metode ekstraksi Pelarut Geraniin Ellagic acid

(mg/g ekstrak

kering)

Corilagin (mg/g

ekstrak kering)

Asam askorbat

(mg/100 g

berat segar)

Referensi

Maserasi Etanol

Air

37.9 8.3d

15.2 2.3d

-

-

-

-

-

-

Palanisamy et al. (2011b)

Maserasi Etanol 3.79%c - - - Palanisamy et al. (2011a)

Maserasi Methanol 568d 53.5 71.9 - Thitilerdecha et al. (2010)

- - - - - 36.4 Wall 2006

Tabel 4. Kandungan saponin, alkaloid, tanin dan flavonoid pada kulit buah rambutan (mg/100 g berat kering)

Metode ekstraksi Pelarut Saponin Alkaloid Tanin Flavonoid Referensi

- - 2.24 0.57 4.41 0.01 1.72 0.02 22.30 0.30 Fila et al. (2010)

18

Alkaloid merupakan kelompok dari metabolit sekunder yang

memiliki atom nitrogen, dan merupakan bagian dari cincin heterosiklik.

Sebagian besar alkaloid mempunyai aktivitas biologis tertentu. Beberapa

alkaloid dilaporkan memiliki sifat beracun, tetapi ada pula yang sangat

berguna dalam pengobatan. Senyawa alkaloid dapat bertindak sebagai

penangkap radikal bebas dan dapat mencegah terjadinya peroksidasi lipid

pada hepatik mikrosomal (Moura et al. 2007).

Terpenoid merupakan senyawa yang mengandung atom karbon

kelipatan lima. Terpenoid merupakan antioksidan alami, seperti halnya

tokoferol dan asam askorbat. Terpenoid merupakan senyawa hidrokarbon

isometrik terdapat pada lemak esensial, dapat membantu tubuh dalam proses

sintesis organik dan pemulihan sel-sel tubuh. Terpenoid mampu menunda,

memperlambat dan mencegah proses oksidasi lipid (Grassman 2005).

Tanin merupakan senyawa polifenol yang memiliki berat molekul

cukup tinggi (lebih dari 1000) dan dapat membentuk kompleks dengan

protein. Berdasarkan strukturnya, tanin dibedakan menjadi dua kelas yaitu

tanin terkondensasi (condensed tannins) dan tanin terhidrolisiskan

(hydrolysable tannins) (Harborne 1996). Tanin dilaporkan memiliki efek

fisiologis seperti mempercepat pembekuan darah, menurunkan tekanan

darah, menurunkan kadar lipid serum, menghasilkan nekrosis hati dan

memodulasi respons imun (Chung et al. 1998). Tanin mempunyai

kemampuan untuk mengikat protein dan juga menimbulkan astringent

sensation (rasa tidak enak) bagi hewan ternak atau manusia yang

mengkonsumsinya. Astringent sensation ini ditimbulkan karena adanya

ikatan kompleks antara mukoprotein dengan tanin (Farida et al. 2000).

Konsumsi senyawa tanin dalam jumlah banyak akan menimbulkan

pengaruh negatif, misalnya menghambat penyerapan mineral. Selain itu,

tanin juga berperan sebagai zat karsinogenik, hepatoksik dan memiliki

aktivitas antinutritional (Chung et al. 1998).

Tanaman yang mengandung senyawa flavonoid telah terbukti

mempunyai aktivitas antioksidan (Alan & Miller 1996). Flavonoid adalah

19

senyawa golongan fenolik yang mempunyai struktur kimia C6-C3-C6

Flavonoid merupakan salah satu kelompok fenol yang terbesar di alam.

Lebih dari 4000 jenis flavonoid telah diidentifikasi dan beberapa

diantaranya memberikan warna pada bunga, buah dan daun. Flavonoid

merupakan pigmen tumbuhan kuning, kuning jeruk, dan merah yang dapat

ditemukan pada buah, sayuran, kacang, biji batang, bunga, herba, rempah-

rempah, serta produk pangan dan obat dari tumbuhan seperti teh, minyak

zaitun, cokelat, anggur merah dan obat herbal (de Groot & Rauen 1998).

Flavonoid adalah senyawa polifenol yang mempunyai sifat kimia fenol,

yaitu bersifat agak asam sehingga dapat larut dalam basa. Flavonoid

mempunyai gugus hidroksil tak tersulih atau suatu gula, sehingga

merupakan senyawa polar. Flavonoid larut dalam pelarut polar seperti

etanol, metanol, butanol, aseton, dimetilsulfoksida, dimetilformamida, dan

lain-lain (Markham 1988).

Flavonoid berperan sebagai antioksidan dengan cara mengkelat

logam, berada dalam bentuk glukosida (memiliki rantai samping glukosa)

atau dalam bentuk bebas yang disebut aglikon. Mekanisme flavonoid

sebagai antioksidan yaitu mendonorkan ion hidrogen sehingga menetralisir

efek toksik dari radikal bebas serta meningkatkan ekspresi gen antioksidan

endogen melalui aktivasi nuclear factor erythroid 2 related factor 2 (Nrf2 ).

Akibat dari proses tersebut akan terjadi peningkatan gen yang berperan

dalam sintesis enzim antioksidan endogen, misalnya SOD (Sumardika &

Jawi 2012).

Kandungan senyawa kimia tertinggi pada kulit buah rambutan

adalah senyawa fenolik (Fila et al. 2012). Senyawa fenolik adalah senyawa

antioksidan alami yang berupa flavonoid, turunan asam sinamat, kumarin,

tokoferol dan asam-asam organik. Komponen senyawa fenolik bersifat polar

dan memiliki kemampuan antioksidan melalui mekanisme sebagai

pereduksi, penangkap radikal bebas, pengkelat logam, peredam

terbentuknya singlet oksigen serta pendonor elektron (Winarsi 2007).

Senyawa fenolik dapat larut dalam air. Penelitian Thitilerdecha et al. (2010)

20

berhasil mengisolasi senyawa fenolik bentuk polifenol dalam kulit buah

rambutan. Senyawa tersebut yaitu asam ellagat, corilagin dan geraniin yang

berpotensi sebagai antioksidan. Polifenol merupakan senyawa kimia yang

mempunyai cincin aromatik dengan gugus hidroksil lebih dari satu.

Komponen fenolik merupakan terminator dari radikal bebas dan

sebagai pengkelat ion logam redoks aktif. Ion logam tersebut

memungkinkan peranannya untuk mengatalisasi reaksi peroksidasi lipid.

Antioksidan fenolik menghalangi oksidasi lipid dan molekul lain dengan

cara mendonasikan atom hidrogen ke senyawa radikal membentuk

intermediet radikal fenoksil. Senyawa intermediet radikal fenoksil relatif

stabil sehingga tidak mampu lagi menginisiasi reaksi radikal selanjutnya.

Aktivitas biologis yang tinggi pada senyawa fenolik terletak pada posisi dan

jumlah gugus OH (Nzaramba 2008).

Grup fenolik memiliki aktivitas sebagai antioksidan juga

prooksidan. Banyaknya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat

berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi rendah, grup fenolik dapat

menghambat atau mencegah pembentukan radikal bebas. Namun, pada

konsentrasi tinggi aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan

antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Gordon 1990).

D. Malondialdehida (MDA)

Kerusakan oksidatif pada senyawa lipid terjadi ketika senyawa

radikal bebas bereaksi dengan senyawa polyunsaturated fatty acid (PUFA).

Lipid membran bilayer diketahui merupakan campuran fosfolipid dan

glikolipid yang berikatan dengan asam lemak pada C1 dan C2 rantai gliserol.

Tingkat maupun jenis reaksi oksidasi pada berbagai asam lemak akan

berlainan. Perbedaan ini sangat bergantung pada jumlah dan posisi ikatan

rangkap pada rantai asam lemaknya (Muchtadi 2013).

Peroksidasi lipid pada membran dapat mendegradasi asam lemak

tak jenuh secara selektif kemudian mengakumulasikannya menjadi aldehid,

hidrokarbon dan produk-produk cross linking (Winarsi 2007). Peroksidasi

21

lipid merupakan inisiasi reaksi berantai oleh radikal hidrogen atau oksigen

yang menyebabkan teroksidasinya PUFA. PUFA lebih rentan terhadap

reaksi radikal bebas dibandingkan asam lemak jenuh. Jembatan metilen

yang dimiliki PUFA merupakan sasaran utama radikal bebas yang akan

membentuk radikal alkil, peroksil, dan alkoksil. Bentuk produk oksidasi

lipid yang banyak ditemukan dalam cairan biologis antara lain diena

terkonjugasi dalam plasma, hidroperoksida dalam plasma, LDL teroksidasi

dalam plasma, aldehid dalam plasma seperti TBARs, MDA dan 4-

hidroksinoneal (Allard et al. 1994).

MDA terbentuk dari peroksidasi lipid pada membran sel yang

merupakan reaksi radikal bebas. Apabila aktivitas radikal bebas melebihi

mekanisme pertahanan normal, maka akan terjadi berbagai gangguan

metabolis dan seluler. Radikal bebas dapat merusak sel dengan cara

merusak membran sel tersebut. Kerusakan pada membran sel dapat terjadi

dengan cara:

a. Radikal bebas berikatan secara kovalen dengan enzim dan/atau

reseptor yang berada di membran sel sehingga mengubah aktivitas

komponen-komponen yang terdapat pada membran sel tersebut

b. Radikal bebas berikatan secara kovalen dengan komponen membran

sel sehingga mengubah struktur membran dan mengakibatkan

perubahan fungsi membran dan/atau mengubah karakter membran

menjadi seperti antigen

c. Radikal bebas mengganggu sistem transpor membran sel melalui

ikatan kovalen, mengoksidasi kelompok thiol atau dengan mengubah

PUFA

d. Radikal bebas menginisiasi peroksidasi lipid secara langsung

terhadap PUFA dinding sel

Radikal bebas akan menyebabkan terjadinya peroksidasi lipid membran sel.

Peroksida-peroksida lipid akan terbentuk dalam rantai yang makin panjang

dan dapat merusak organisasi membran sel. Peroksidasi lipid akan

22

mempengaruhi fluiditas membran, cross-linking membran, serta struktur

dan fungsi membran (Powers & Jackson 2008).

Mekanisme kerusakan sel akibat serangan radikal bebas yang

paling awal diketahui dan terbanyak diteliti adalah peroksidasi lipid.

Peroksidasi lipid paling banyak terjadi di membran sel, terutama asam

lemak tidak jenuh yang merupakan komponen penting penyusun membran

sel. Pengukuran tingkat peroksidasi lipid diukur dengan mengukur produk

akhirnya, yaitu malondialdehida (Lima et al. 2004). MDA merupakan

produk peroksidasi lipid yang relatif konstan terhadap proporsi peroksidasi

lipid, oleh karena itu merupakan indikator yang tepat untuk mengetahui

kecepatan (rate) proses peroksidasi lipid in vivo. Malondialdehida memiliki

tiga rantai karbon dengan rumus molekul C3H4O2 (Pryor et al. 1976).

MDA dapat bereaksi dengan komponen nukleofilik atau

elektrofilik. Aktivitas non spesifiknya, MDA dapat berikatan dengan

berbagai molekul biologis seperti protein, asam nukleat dan aminofosfolipid

secara kovalen (Muchtadi 2013). Efek negatif senyawa radikal maupun

metabolit elektrofilik dapat diredam oleh antioksidan, baik antioksidan zat

gizi maupun antioksidan non gizi. Oleh karena itu, tinggi rendahnya kadar

MDA sangat bergantung pada status antioksidan dalam tubuh seseorang.

Gambar 4. Struktur kimia MDA (Current Protocols 2010)

Winarsi et al. (2005), menemukan bahwa dalam tubuh wanita

perimenopause banyak terbentuk radikal bebas. Hal tersebut diketahui

melalui pengukuran kadar MDA plasma. Tingginya produk MDA

merupakan bukti rendahnya status antioksidan tubuh sehingga tidak dapat

mencegah reaktivitas senyawa radikal bebas. Di sisi lain, tingginya kadar

23

MDA plasma membuktikan kerentanan komponen membran sel terhadap

reaksi oksidasi.

Pemeriksaan kadar MDA dapat dilakukan menggunakan beberapa

cara, salah satunya dengan metode thiobarbituric acid reactive substance

(TBARs) yang dapat dilakukan secara in vivo maupun in vitro (Josephy

1997). Tes ini didasarkan pada reaksi kondensasi antara satu molekul MDA

dengan dua molekul TBA pada kondisi asam. Jumlah MDA yang terdeteksi

menggambarkan banyaknya peroksidasi lipid yang terjadi.

E. Superoksida Dismutase (SOD)

Antioksidan adalah senyawa pemberi elektron yang mampu

menangkal atau meredam dampak negatif oksidan dalam tubuh. Antioksidan

bekerja dengan cara mendonorkan satu elektronnya kepada senyawa yang

bersifat oksidan sehingga aktivitas senyawa oksidan tersebut bisa dihambat.

Antioksidan terbagi menjadi tiga kelompok besar yaitu:

a. Antioksidan primer

Antioksidan primer disebut juga antioksidan enzimatis.

Antioksidan meliputi enzim SOD, katalase dan glutation peroksidase (GSH-

Px). Enzim-enzim tersebut mampu menekan atau menghambat

pembentukan radikal bebas dengan cara memutus reaksi berantai dan

mengubahnya menjadi produk lebih stabil, disebut sebagai reaksi chain

breaking antioxidant. Suatu senyawa dikatakan sebagai antioksidan primer

apabila dapat memberikan atom hidrogen secara cepat kepada senyawa

radikal, kemudian radikal antioksidan yang terbentuk segera berubah

menjadi senyawa yang lebih stabil (Winarsi 2007).

b. Antioksidan sekunder

Antioksidan sekunder merupakan antioksidan non enzimatis atau

antioksidan eksogen. Antioksidan dalam kelompok ini disebut sebagai

sistem pertahanan preventif. Dalam sistem pertahanan ini, terbentuknya

senyawa oksigen reaktif dihambat dengan cara pengkelatan logam atau

dirusak pembentukannya. Antioksidan non enzimatis dapat berupa

24

komponen non nutrisi dan komponen nutrisi dari sayuran dan buah-buahan

meliputi vitamin E, vitamin C, -karoten, flavonoid, asam urat, bilirubin dan

albumin. Kerja antioksidan non enzimatis dengan cara memotong reaksi

oksidasi berantai dari radikal bebas atau dengan cara menangkap radikal

bebas (scavenger free radical). Akibatnya, radikal bebas tidak akan bereaksi

dengan komponen seluler (Lampe 1999).

c. Antioksidan tersier

Kelompok antioksidan tersier meliputi sistem enzim DNA repair

dan metionin sulfoksida reduktase. Enzim-enzim tersebut berfungsi dalam

perbaikan biomolekuler yang rusak akibat reaktivitas radikal bebas.

Enzim SOD merupakan antioksidan penting yang berasal dari

tubuh sendiri, berpengaruh sangat kuat dan merupakan pertahanan tubuh

garis pertama dalam mengatasi stres oksidatif (Fridovich 1981). SOD

merupakan antioksidan pencegah yang dapat menghambat kerusakan anion

superoksida. Cara kerja SOD yaitu dengan mengkonversi anion superoksida

menjadi komponen lain yang kurang berbahaya, yaitu hidrogen peroksida.

Hidrogen peroksida di dalam mitokondria akan mengalami detoksifikasi

oleh enzim katalase menjadi senyawa H2O dan O2, sedangkan H2O2 yang

berdifusi ke dalam sitosol akan didetoksifikasi oleh enzim glutation

peroksidase (Lee et al. 2004). SOD bersifat tidak stabil terhadap panas,

cukup stabil pada kondisi basa dan masih mempunyai aktivitas walaupun

disimpan sampai lima tahun pada suhu 5 0C.

SOD

O2- + O2

- + 2H

+ H2O2 + O2

Aktivitas enzim SOD memiliki peran penting dalam sistem

pertahanan tubuh, terutama terhadap aktivitas senyawa oksigen reaktif yang

dapat menyebabkan stres oksidatif. Berdasarkan adanya logam yang

berperan sebagai kofaktor pada sisi aktif enzim, dapat dikelompokkan

menjadi 3 yaitu Cu/ZnSOD, MnSOD dan FeSOD (Bannister et al. 1987).

Menurut Haliwell & Gutteridge (2007), aktivitas SOD tertinggi ditemukan

25

di hati, kelenjar adrenalin, ginjal, darah, limfa, pankreas, otak, paru-paru,

lambung, usus, ovarium dan timus.

F. Senyawa Antioksidan Vitamin C

Vitamin C atau L-asam askorbat merupakan antioksidan yang larut

dalam air (aqueous antioxidant). Senyawa tersebut merupakan bagian dari

sistem pertahanan tubuh terhadap senyawa oksigen reaktif dalam plasma

dan sel (Zakaria 1996). Vitamin C merupakan antioksidan yang bekerja

sebagai donor elektron dengan cara memindahkan satu elektron ke senyawa

logam Cu. Vitamin C juga dapat menyumbangkan elektron ke dalam reaksi

biokimia intraseluler dan ekstraseluler. Vitamin C mampu menghilangkan

senyawa oksigen reaktif di dalam sel netrofil, monosit, protein lensa dan

retina. Vitamin tersebut juga dapat berinteraksi dengan Fe-ferritin. Di luar

sel, vitamin C mampu menghilangkan senyawa oksigen reaktif, mencegah

terjadinya LDL teroksidasi, mentransfer elektron ke dalam tokoferol

teroksidasi dan mengabsorpsi logam dalam saluran pencernaan (Levine et

al. 1995).

Kulit buah rambutan mengandung senyawa kimia, salah satunya

adalah vitamin C. Rata-rata kadar vitamin C yang terkandung pada kulit

buah rambutan adalah 36,4 mg/100 g (Wall 2006). Penelitian Palanisamy et

al. (2008), menunjukkan bahwa ekstrak etanol kulit buah rambutan

memiliki aktivitas penangkapan radikal bebas sebanding dengan vitamin C

dan jauh lebih tinggi dari biji anggur. Antioksidan vitamin C mampu

bereaksi dengan radikal bebas kemudian mengubahnya menjadi radikal

askorbil. Senyawa radikal terakhir tersebut akan segera berubah menjadi

askorbat dan dehidroaskorbat. Asam askorbat dapat bereaksi dengan

oksigen teraktivasi, seperti anion superoksida dan radikal hidroksil. Pada

konsentrasi rendah, vitamin C dapat bereaksi dengan radikal hidroksil

menjadi askorbil yang sedikit reaktif. Pada konsentrasi tinggi asam tersebut

tidak akan bereaksi. Kerja askorbat sebagai antioksidan secara tidak

26

langsung juga meregenerasi ikatan antioksidan membran dengan cara

menangkap radikal peroksil dan oksigen singlet (Zakaria 1996).

Penelitian Huang et al. (2002) pada perokok menunjukkan bahwa

pemberian suplemen vitamin C 500 gram memberikan pengaruh dalam

menurunkan peroksidasi lipid subjek yang diukur dengan kadar 8-iso-

prostaglandin F2 urin. Mahfudz (2013), melaporkan bahwa pemberian

vitamin C mampu menurunkan kadar MDA dan meningkatkan FMD (Flow

Mediated Dilatation) pada pasien PGK stadium V yang menjalani

hemodialisis. Ramatina (2014), melaporkan bahwa suplementasi vitamin C

500 mg mampu menurunkan kadar MDA plasma pada kelompok wanita

muda sehat, mahasiswi alih jenis IPB. Berdasarkan hal tersebut, dapat

disimpulkan bahwa vitamin C merupakan antioksidan sekunder yang

mampu menangkap radikal bebas (scavenger free radical) sehingga radikal

bebas tidak akan bereaksi dengan komponen seluler.

G. Mekanisme Kerja Kulit Buah Rambutan sebagai Antioksidan

Dalam pengertian kimia, senyawa antioksidan adalah senyawa

pemberi elektron (electron donors). Secara biologis, pengertian antioksidan

adalah senyawa yang mampu menangkal atau meredam dampak negatif

oksidan dalam tubuh. Antioksidan mampu memerangi radikal bebas baik

dengan cara mencegah, menghentikan ataupun memperlambat proses

oksidasi. Antioksidan melindungi sel dan jaringan sasaran dengan cara

memusnahkan ROS secara enzimatik atau dengan reaksi kimia langsung,

mengurangi pembentukan ROS, mengikat ion logam yang terlibat dalam

pembentukan ROS (tranferin, seruplasmin, albumin), memperbaiki

kerusakan sasaran serta menghancurkan molekul yang rusak dan

menggantinya dengan yang baru (Schuler 1990).

Antioksidan bereaksi melalui pembersihan senyawa ROS atau

penurunan konsentrasinya secara lokal (eliminating oxygen), pembersihan

ion logam katalitik (immobilizing catalysts or metal ion), pembersihan

radikal bebas yang berfungsi sebagai inisiator seperti hidroksil, peroksil dan

27

alkalosil (terminating chain reaction), pemutus rantai dari rangkaian reaksi

yang diinisiasi oleh radikal bebas (inhibiing radical generating enzymes)

dan peredam reaksi serta pembersih singlet oksigen (Kartikawati 1999).

Kulit buah rambutan mengandung senyawa polifenol yang

berperan sebagai zat antioksidan. Polifenol memiliki struktur kimia yang

sangat baik dalam aktivitas scavenging radikal dan menunjukkan aktivitas

antioksidasi yang lebih efektif secara in vitro dibandingkan dengan asam

askorbat dan -tokoferol. Aktivitas antioksidasi dari polifenol ditandai

dengan aktivitas yang relatif tinggi sebagai donor hidrogen (elektron),

pemutus rantai dan pengkelat transisi logam (Rice-Evans et al. 1995).

Aktivitas antioksidan senyawa polifenol dapat menghambat kerja radikal

bebas melalui pengubahan senyawa radikal bebas reaktif menjadi stabil.

Polifenol mampu menangkal oksigen dan radikal alkil dengan memberikan

donor elektron (hidrogen) kepada radikal bebas sehingga terbentuk radikal

fenoksil. Radikal fenoksil memiliki ikatan rangkap terkonjugasi sehingga

tidak menimbulkan radikal bebas dan bersifat lebih stabil (Thitilertdecha et

al. 2010).

H. Penentuan Aktivitas Penangkapan Radikal menggunakan DPPH

DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) merupakan suatu radikal

bebas yang stabil pada suhu ruangan dan dapat bereaksi dengan atom

hidrogen dari suatu antioksidan membentuk DPPH tereduksi. DPPH

berperan sebagai sumber radikal bebas. Penangkapan radikal bebas

menggunakan DPPH paling umum digunakan untuk menentukan aktivitas

antioksidan suatu ekstrak tumbuhan. Radikal DPPH adalah suatu senyawa

organik yang mengandung nitrogen tidak stabil dengan absorbansi kuat pada

maks 517 nm dan berwarna ungu gelap. DPPH akan bereaksi dengan

senyawa antioksidan kemudian mereduksi DPPH. Proses tersebut akan

menyebabkan perubahan warna menjadi kuning. Perubahan warna menjadi

kuning dapat diukur menggunakan spektrofotometer. Aktivitas antioksidan

dinyatakan dengan persentase penghambatan (inhibisi) yang diperoleh dari

28

nilai absorbansi blanko dikurangi absorbansi sampel (Kedare & Singh

2011). Reaksi penangkapan radikal bebas menggunakan DPPH oleh suatu

antioksidan dapat dilihat pada Gambar 6.

Gambar 5. Reaksi antara radikal DPPH dengan antioksidan (Windono 2001)

Gambar 6. Struktur molekul DPPH setelah menerima donor atom H

(Cowie & Arrighi 2007)

Penggunaan DPPH sebagai metode penangkapan radikal

mempunyai keuntungan, yaitu mudah digunakan, mempunyai sensitivitas

yang tinggi dan dapat menganalisis sejumlah sampel dalam waktu yang

singkat.

29

I. Kerangka Berfikir

Gambar 7. Kerangka berfikir penelitian

J. Hipotesis Penelitian

Berdasarkan rumusan masalah yang telah dikemukakan, maka

hipotesis yang akan diuji dalam penelitian ini adalah:

Pemberian ekstrak kulit buah rambutan menurunkan kadar MDA dan

meningkatkan aktivitas SOD tikus yang dipapar asap rokok.

Peroksidasi lipid

Ekstrak kulit buah

rambutan

Kandungan senyawa

fenolik, alkaloid,

steroid, terpenoid, tanin,

flavonoid, asam

askorbat, antosianin

MDA SOD

ROS meningkat

Karbon monoksida, tar,

nikotin dan senyawa

berbahaya lainnya

Paparan asap rokok

Antioksidan MDA SOD

Peroksidasi lipid

Menghambat

30

BAB III

METODE PENELITIAN

A. Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilaksanakan selama 2 bulan. Penelitian ini terdiri dari

beberapa tahap, yaitu pembuatan ekstrak kulit buah rambutan, pengukuran

aktivitas antioksidan, pemeliharaan hewan coba, pemeriksaan kadar MDA

dan aktivitas SOD. Pembuatan ekstrak kulit buah rambutan dilakukan di

Laboratorium Farmasi FK Unissula. Pemeliharaan hewan coba dilakukan di

Laboratorium Biologi FMIPA Unnes. Pengukuran aktivitas antioksidan

dilakukan di Laboratorium Pangan Unika Soegijapranata. Pemeriksaan

kadar MDA dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran

UNDIP dan pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan di Laboratorium Gizi

Pusat Studi Pangan dan Gizi UGM.

B. Populasi dan Sampel

Populasi

Populasi yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih

(Rattus novergicus) galur Wistar yang diperoleh dari Laboratorium Biologi

Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Negeri

Semarang.

Sampel

Sampel yang digunakan dalam penelitian adalah tikus putih galur

Wistar jantan terdiri dari 30 ekor, berumur 2 bulan dengan berat badan 150-

200 gram, sehat, tidak cacat secara anatomi. Sampel diambil secara acak

dan dibagi menjadi 6 kelompok. Masing-masing kelompok terdiri dari 5

ekor. Banyaknya jumlah sampel sesuai rekomendasi dari WHO (1993)

bahwa besar sampel minimal yang digunakan untuk uji eksperimental

adalah 5 ekor setiap kelompoknya.

31

C. Variabel Penelitian

Ada 3 macam variabel dalam penelitian ini yaitu:

1. Variabel Bebas

Variabel bebas berupa ekstrak kulit buah rambutan.

2. Variabel terikat

Variabel terikat dalam penelitian ini adalah kadar MDA dan aktivitas

SOD tikus.

3. Variabel kendali

Variabel kendali dalam penelitian ini adalah jenis rokok, jenis

kelamin, umur, berat badan, jenis pakan tikus, ukuran dan kondisi

lingkungan kandang tikus.

D. Rancangan Penelitian

Desain penelitian adalah Randomized Post Test Only With Control

Group Design dengan rancangan kelompok:

Kelompok A : Merupakan kelompok kontrol normal, tikus diberi

akuades

Kelompok B : Merupakan kelompok kontrol negatif, tikus diberi

paparan asap rokok selama 14 hari

Kelompok C : Merupakan kelompok kontrol positif, tikus diberi

asap rokok dan vitamin C 1 mg/200gBB selama 14

hari

Kelompok D : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap

rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 3

mg/200gBB selama 14 hari

Kelompok E : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap

rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 6

mg/200gBB selama 14 hari

Kelompok F : Merupakan kelompok tikus dengan perlakuan asap

rokok dan ekstrak kulit buah rambutan 12

mg/200gBB selama 14 hari

32

Ekstrak kulit buah rambutan dalam penelitian ini adalah kulit buah

rambutan kultivar Sekaran yang diperoleh dari Gunungpati, Semarang.

Paparan asap rokok dalam penelitian ini merupakan hasil pembakaran 3

batang rokok kretek sebagai bahan penyebab peningkatan radikal bebas.

Desain penelitian dapat dicermati pada Gambar 8.

Penentuan Dosis Ekstrak Kulit Buah Rambutan, Vitamin C dan Rokok

1. Dosis ekstrak kulit buah rambutan

Dosis ekstrak kulit buah rambutan mengacu pada penelitian

Sandhiutami et al. (2015). Dosis ekstrak kulit buah rambutan yang

digunakan yaitu: 21 mg/kgBB, 42 mg/kgBB dan 84 mg/kgBB. Sandhiutami

et al. (2015) melaporkan bahwa dosis efektif untuk menurunkan kadar

MDA mencit yang diberi aktivitas fisik berlebihan selama 7 hari adalah 42

mg/kgBB.

Dosis per 200 gram tikus adalah sebagai berikut:

Dosis I :

Dosis II :

Dosis III :

Dosis ekstrak kulit buah rambutan yang digunakan dalam penelitian ini

yaitu 3 mg/ekor/hari, 6 mg/ekor/hari dan 12 mg/ekor/hari.

2. Dosis vitamin C

Dosis vitamin C mengacu pada penelitian Sandhiutami et al.

(2015). Penelitian tersebut melaporkan bahwa pemberian vitamin C 6,5

mg/kgBB mampu meningkatkan aktivitas SOD pada mencit yang diberi

aktivitas fisik berlebihan selama 7 hari. Dosis per 200 gram tikus adalah

sebagai berikut:

Dosis Vit C : 0,13 x 7 = 1 mg

Dosis vitamin C yang digunakan adalah 1 mg/ekor/hari.

33

3. Dosis rokok

Penentuan jumlah rokok yang digunakan dalam penelitian ini

mengacu pada penelitian Adyttia et al. (2014). Pada penelitian tersebut

menunjukkan bahwa pemberian rokok 3 batang/hari selama 14 hari pada

tikus mampu meningkatkan kadar MDA tikus. Oleh sebab itu, pada

penelitian ini jumlah rokok yang digunakan adalah 3 batang/hari selama 14

hari.

E. Alat dan Bahan Penelitian

Alat dan bahan yang digunakan dalam penelitian disajikan dalam Tabel 5

dan 6.

Tabel 5. Alat penelitian

No Nama Alat Fungsi

1. Gelas ukur Tempat untuk mengukur aquades dan

larutan ekstrak kulit buah rambutan

2. Pengaduk Untuk mengaduk ekstrak kulit buah

rambutan

3. Neraca digital Untuk menimbang berat tikus

4. Wadah minum Tempat minum tikus

5. Sonde lambung spuit Alat untuk menginjeksi ekstrak kulit buah

rambutan secara oral

6. Kandang tikus Tempat pemeliharaan tikus dengan ukuran

36 cm x 28 cm x 12 cm

7. Smoking chamber Tempat untuk pengasapan rokok pada

tikus dengan ukuran 42 cm x 29 cm x 33

cm

8. Pipet hematokrit Untuk mengambil darah pada sinus

orbitalis tikus

9. Tabung eppendorf Untuk menampung darah

10. Sentrifuge scientific Untuk memisahkan bagian-bagian pada sel

darah

11. Container box Untuk penyimpanan sementara sampel

darah saat dibawa ke laboratorium

12. Kamera Sebagai dokumentasi

34

Tabel 6. Bahan penelitian

No Nama Bahan Fungsi

1. Ekstrak kulit buah

rambutan

Bahan uji coba yang dilakukan

2. Asap rokok kretek Bahan uji coba sebagai radikal bebas

3. Akuades Pelarut ekstrak kulit buah rambutan

4. EDTA Untuk mencegah terjadinya koagulasi atau

penggumpalan darah

5. Tikus putih jantan Hewan uji coba

6. Asam pikrat Untuk menandai tikus

7.

8.

Kapas/tissue

Etanol

Untuk membersihkan alat

Pelarut ekstraksi kulit buah rambutan

35

Gambar 8. Alur penelitian

30 ekor tikus

E

Asap rokok

+ ekstrak

kulit buah

rambutan 6

mg/200gB

B

D

Asap rokok

+ ekstrak

kulit buah

rambutan 3

mg/200gBB

C

Asap rokok

+ Vitamin C

1

mg/200gBB

B

Asap

rokok/har

i

A

akuades

F

Asap rokok

+ ekstrak

kulit buah

rambutan

12

mg/200gBB

Aklimatisasi selama 7 hari dengan pemberian pakan standar dan akuades

Perlakuan dilakukan selama 14 hari

Mengambil sampel darah pada hari ke

15

Mengukur kadar MDA dan SOD

Analisis data

Randomisasi menjadi 6 kelompok

36

F. Prosedur Penelitian

1. Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Rambutan

Kulit buah rambutan yang digunakan dalam penelitian ini adalah

kulit buah yang telah dipotong menjadi bagian kecil. Kulit buah kemudian

dicuci menggunakan air mengalir dan dikeringkan di dalam ruangan selama

3-5 hari. Kulit yang sudah kering selanjutnya dihaluskan menggunakan

blender hingga didapat serbuk kering. Metode ekstraksi yang digunakan

dalam penelitian ini adalah metode maserasi. Serbuk kering diekstrasi

menggunakan pelarut etanol 96% selama 24 jam pada suhu kamar dengan

perbandingan 1:1. Suspensi yang diperoleh disaring menggunakan kertas

Whatman No. 1. Filtrat yang terkumpul diuapkan menggunakan rotary

evaporator hingga terbentuk pasta.

2. Pengukuran Aktivitas Antioksidan Menggunakan DPPH

Pengukuran diawali dengan pembuatan larutan DPPH. Sebanyak

1,97 mg DPPH dilarutkan dengan metanol dalam labu ukur sampai 100 ml,

sehingga diperoleh larutan dengan konsentrasi 0,05 mM. Selanjutnya

dilakukan pengukuran aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah rambutan.

Sebanyak 25 mg ekstrak kulit buah rambutan dilarutkan dengan metanol

dalam labu ukur sampai 25 ml. Kemudian pada labu ukur sampel

ditambahkan 5 ml larutan DPPH 0,5 mM. Larutan blanko dibuat dengan

cara larutan DPPH 0,5 mM dipipet sebanyak 5 ml kemudian dimasukkan ke

dalam labu ukur 25 ml lalu volumenya dicukupkan dengan metanol sampai

garis tanda. Absorbansi DPPH diukur menggunakan spektrofotometer pada

panjang gelombang 515 nm. Kemampuan antioksidan diukur sebagai

penurunan serapan larutan DPPH akibat adanya penambahan sampel.

Nilai serapan larutan DPPH dihitung dengan rumus sebagai berikut (%):

37

3. Perlakuan Hewan Percobaan

Penelitian ini diawali dengan mempersiapkan 30 ekor tikus putih

galur Wistar yang diaklimatisasi selama 7 hari. Hewan percobaan

dikelompokkan secara acak menjadi 6 kelompok masing-masing kelompok

5 ekor. Hewan ditempatkan pada kandang individual yang dibersihkan

setiap hari. Tikus diberi pakan standar dan air minum secara ad libitum

selama penelitian. Proses pemaparan dilakukan setiap pagi menggunakan 3

batang rokok dalam satu hari. Pemaparan dilakukan selama 14 hari. Pada

saat akan diberi paparan asap rokok, hewan coba dipindahkan ke dalam

kandang khusus yaitu smoking chamber sesuai kelompoknya. Kandang

tersebut merupakan kotak pengasapan yang di dalamnya terdapat jeruji

pembatas untuk memisahkan hewan coba dengan ujung rokok yang

terbakar. Apabila hewan coba dimasukkan maka tikus dapat secara langsung

terkena paparan asap rokok. Asap rokok dihembuskan berulang kali dengan

bantuan tabung injeksi hingga rokok habis terbakar. Pemberian ekstrak kulit

buah rambutan dilakukan satu jam setelah paparan asap rokok.

4. Pengambilan Darah

Pengambilan darah dilakukan pada hari ke 15 penelitian. Darah

diambil dari sinus orbitalis dengan hematokrit sebanyak 3 ml dan

ditampung dalam tabung eppendorf yang telah berisi EDTA. Sampel yang

digunakan untuk pengukuran kadar MDA adalah plasma darah dan untuk

pengukuran aktivitas SOD adalah whole blood. Darah yang terkumpul

selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 1000 rpm selama 10 menit pada

suhu 4 0C. Plasma yang terbentuk dipindah ke dalam tabung baru dan

disimpan pada suhu -80 0C sampai siap untuk dianalisis. Larutan penyangga

yang terbentuk dihilangkan dari pelet eritrosit, kemudian eritrosit dilarutkan

sebanyak 5X volumenya dengan menggunakan ddH2O. Eritrosit yang telah

dilarutkan disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 10000 rpm dan

supernatan yang terbentuk disimpan pada suhu -80 0C sampai siap untuk

dianalisis.

38

5. Pengukuran Kadar MDA

Pemeriksaan kadar MDA menggunakan plasma darah. Prosedur

pengukuran kadar MDA dapat dilihat pada Tabel 7.

Tabel 7. Prosedur pengukuran kadar MDA

Sampel Blanko

Sampel plasma 200 l -

TCA 15% 2000 l 2000 l

TBA 0,37% dalam HCl 0,25 N 2000 l 2000 l

Campuran tersebut selanjutnya dipanaskan dalam waterbath pada

suhu 950C selama 60 menit. Kemudian tabung diletakkan pada ice bath

selama 15 menit. Sampel yang sudah dingin disentrifugasi dengan

kecepatan 3000 rpm selama 15 menit. Supernatan yang terbentuk

dipindahkan ke dalam kuvet kemudian dibaca absorbansinya menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 545 nm.

Rumus penghitungan kadar MDA (nmol/ml) :

6. Pengukuran Aktivitas SOD

Pemeriksaan aktivitas SOD dilakukan menggunakan metode

kalorimetri. Sampel yang digunakan dalam pengukuran ini adalah whole

blood. Prosedur pengukuran aktivitas SOD dapat dilihat pada Tabel 8.

Tabel 8. Prosedur pengukuran aktivitas SOD

Sampel Blanko 1 Blanko 2 Blanko 3

Whole blood 20 l - 20 l -

ddH2O - 20 l - 20 l

Larutan pereaksi WST 200 l 200 l 200 l 200 l

Larutan pengencer buffer - - 20 l 20 l

Larutan pereaksi enzim 20 l 20 l - -

Semua larutan dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu 370C selama 20 menit,

selanjutnya dilakukan pengukuran absorbansi pada panjang gelombang 450 nm

menggunakan microplate reader

Rumus penghitungan aktivitas SOD (%) :

( ) ( )

( )

39

G. Analisis Data

Analisis data dalam penelitian ini meliputi uji normalitas

menggunakan uji Kolmogorov-Smirnov test dilanjutkan uji homogenitas

dengan uji Levene test. Untuk mengetahui perbedaan rata-rata antara

kelompok dilakukan uji komparasi menggunakan uji one way Anova dan

dilanjutkan dengan uji Least Significant Differences (LSD). Analisis

statistik dibantu dengan program SPSS (Statistical Product and Service

Solutions) for windows versi 17.

40

BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

A. Hasil Penelitian

Hasil penelitian aktivitas antioksidan yang diuji menggunakan

DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil) dan dinyatakan sebagai % inhibisi,

menunjukkan bahwa aktivitas antioksidan ekstrak kulit buah rambutan

memiliki nilai sebesar 77,83% yang termasuk dalam kategori sedang. Hasil

penelitian menunjukkan bahwa setiap kelompok memiliki variasi kadar

MDA dan SOD. Berdasarkan uji normalitas diketahui bahwa data MDA dan

SOD berdistribusi normal. Hasil uji one way anova menunjukkan ekstrak

kulit buah rambutan berpengaruh terhadap kadar MDA dan SOD tikus yang

dipapar asap rokok (Lampiran 2 & 3).

Hasil uji LSD (Tabel 9) menunjukkan bahwa pada kelompok A yaitu

kelompok normal memiliki kadar MDA terendah dan SOD tertinggi.

Kelompok normal digunakan sebagai kelompok kontrol untuk mengetahui

kadar MDA dan SOD pada keadaan normal tanpa pemberian ekstrak kulit

buah rambutan dan paparan asap rokok. Kadar MDA pada kelompok A

berbeda nyata dengan kelompok B, D, F dan tidak berbeda nyata dengan

kelompok C dan E. Aktivitas SOD kelompok A berbeda nyata dengan

kelompok lainnya (B, C, D, E dan F).

Tabel 9. Hasil rerata kadar MDA dan SOD

Kelompok Perlakuan Kadar MDA

(nmol/ml)

Aktivitas SOD

(%)

A Normal 10,24 0,55a 81,09 4,37

a

B Asap rokok 15,30 0,57b 29,45 3,50

b

C Asap rokok + vitamin C 1

mg/200gBB

10,82 1,22a 65,81 3,49

c

D Asap rokok + ekstrak kulit buah

rambutan 3 mg/200gBB

12,59 1,20c 50,18 4,91

d

E Asap rokok + ekstrak kulit buah

rambutan 6 mg/200gBB

11,06 1,71a 60,72 6,62

ec

F Asap rokok + ekstrak kulit buah

rambutan 12 mg/200gBB

13,53 0,55dc

42,91 6,62f

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf pada kolom yang sama

menunjukkan perbedaan pada setiap kelompok perlakuan

dengan taraf ketelitian p

41

Pada kelompok B yaitu kelompok kontrol negatif memiliki kadar

MDA sebesar 15,30 nmol/ml dan merupakan kelompok dengan kadar MDA

tertinggi. Kelompok B memiliki aktivitas SOD terendah, yaitu sebesar

29,45%. Kelompok B merupakan kelompok yang dipapar asap rokok 3

batang/hari. Kadar MDA dan aktivitas SOD pada kelompok B berbeda

nyata dengan semua kelompok lainnya (A, C, D, E dan F)

Pada kelompok E dan F merupakan kelompok yang diberi ekstrak

kulit buah rambutan dengan dosis 6 mg/200gBB dan 12 mg/200gBB .

Kadar MDA kelompok E berbeda nyata dengan kelompok B, D, F dan tidak

berbeda nyata dengan kelompok A dan C. Aktivitas SOD kelompok E

berbeda nyata dengan kelompok A, B, D, F dan tidak berbeda nyata dengan

kelompok C. Kadar MDA kelompok F berbeda nyata dengan kelompok A,

B, C, E dan tidak berbeda nyata dengan kelompok D. Aktivitas SOD

kelompok F berbeda nyata dengan kelompok lainnya.

B. Pembahasan

Hasil penelitian menunjukkan pemaparan asap rokok menyebabkan

peningkatan kadar MDA. Pada kelompok kontrol negatif (kelompok B)

memiliki kadar MDA tertinggi yang berbeda nyata dengan kelompok

lainnya. Pada keadaan normal, radikal bebas terbentuk di dalam tubuh

sangat lambat dan perlahan. Pada saat radikal bebas meningkat melebihi

kemampuan pertahanan endogen, maka akan terjadi ketidakseimbangan

antara jumlah radikal bebas dengan antioksidan endogen, sehingga

terjadilah ketidakstabilan (stres) oksidatif. Stres oksidatif menyebabkan

peroksidasi lipid yang berlebihan. Hasil dari peroksidasi lipid adalah MDA,

sehingga meningkatnya peroksidasi lipid dapat menyebabkan kadar MDA

dalam tubuh meningkat (Winarsi 2007).

Paparan asap rokok dapat menyebabkan kerusakan pada organ

paru-paru. Rusaknya paru-paru sebagai target utama yang langsung terkena

asap rokok dapat dijelaskan dengan adanya paparan agen kimia di dalam

asap rokok. Namun, efek yang menyebabkan penyakit kronis pada sistem

42

organ lain kemungkinan adalah hasil pajanan secara tidak langsung

(Yanbaeva et al. 2014).

Fase gas asap rokok terbukti menginisiasi autooksidasi in vitro dari

PUFA sehingga terjadi peroksidasi lipid. Fase gas asap rokok dapat berisi

hingga 1014

radikal bebas dan zat-zat reaktif per kepulan asap rokok.

Radikal bebas dan oksidan yang terdapat pada fase gas asap rokok memiliki

waktu paruh pendek, namun senyawa tersebut dapat memasuki aliran darah

dan menyebabkan kerusakan oksidatif makromolekul (Swan & Lessov-

Schlagger 2007). Fase gas asap rokok juga mengandung aldehida jenuh dan

tak jenuh yang lebih stabil daripada radikal bebas dan hidrogen peroksida.

Senyawa tersebut dapat masuk ke dalam aliran darah menghasilkan ROS

melalui interaksi dengan enzim NADPH. Akibatnya, jaringan yang jauh dari

paru-paru juga dapat mengalami peningkatan stres oksidatif (Tostes et al.

2008).

Fase partikel asap rokok mengandung kompleks hidrokarbon yang

akan bereaksi dengan nitrogen oksida (NO) dan membentuk senyawa

radikal lain. NO yang terdapat pada asap rokok dapat menginisiasi PUFA

dan mengakibatkan pembentukan peroksidasi lipid. Fase partikel asap rokok

memiliki waktu paruh lebih lama daripada fase gas. Fase partikel

mengandung ion logam yang dapat menghasilkan radikal hidroksil dari

hidrogen peroksida. Radikal tersebut dapat menembus membran sel dan

dapat menginduksi stres oksidatif (Pryor 1997). Radikal bebas akan

mengikat molekul-molekul yang paling rentan pada membran sel seperti

PUFA. Jembatan metilen pada PUFA merupakan sasaran utama radikal

bebas yang akan membentuk radikal alkil, peroksil dan alkoksil (Allard et

al. 1994).

Kadar MDA pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan

dengan variasi 3 dosis mengalami penurunan. Ekstrak kulit buah rambutan

mengandung senyawa metabolit sekunder alkaloid, steroid, terpenoid,

fenolik (Wardhani & Saptono 2015) yang berfungsi sebagai antioksidan.

Senyawa fenolik adalah senyawa antioksidan alami yang berupa flavonoid,

43

turunan asam sinamat, kumarin, tokoferol dan asam-asam organik.

Komponen senyawa fenolik bersifat polar dan memiliki kemampuan

antioksidan melalui mekanisme sebagai pereduksi, penangkap radikal bebas,

pengkelat logam, peredam terbentuknya singlet oksigen serta pendonor

elektron (Winarsi 2007). Senyawa fenolik dapat larut dalam air. Penelitian

Thitilerdecha et al. (2010) berhasil mengisolasi senyawa fenolik bentuk

polifenol dalam kulit buah rambutan. Senyawa tersebut yaitu asam ellagat,

corilagin dan geraniin yang berpotensi sebagai antioksidan.

Komponen fenolik merupakan terminator dari radikal bebas dan

sebagai pengkelat ion logam redoks aktif. Ion logam tersebut

memungkinkan peranannya untuk mengatalisasi reaksi peroksidasi lipid.

Antioksidan fenolik menghalangi oksidasi lipid dan molekul lain dengan

cara mendonasikan atom hidrogen ke senyawa radikal membentuk

intermediet radikal fenoksil. Senyawa intermediet radikal fenoksil relatif

stabil sehingga tidak mampu lagi menginisiasi reaksi radikal selanjutnya

(Nzaramba 2008). Pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan

didapatkan dosis efektif untuk menurunkan kadar MDA yaitu dosis 6

mg/200gBB (kelompok E).

Kadar MDA kelompok C 10,821,22 nmol/ml berbeda nyata

dengan kelompok B (kontrol negatif) ), D dan F. Kelompok C merupakan

kelompok kontrol positif. Penelitian tersebut menunjukkan bahwa vitamin C

dapat mencegah proses peroksidasi lipid dengan mendonorkan elektron.

Vitamin C memiliki sifat antioksidan yang dapat melindungi molekul yang

dibutuhkan oleh tubuh (seperti protein, lipid, karbohidrat dan asam nukleat)

dari kerusakan oleh radikal bebas (Winarsi 2007).

Kadar MDA pada kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan

dosis 12 mg/200gBB (F) sebesar 13,53 nmol/ml tidak berbeda nyata

dengan kelompok perlakuan ekstrak kulit buah rambutan 3 mg/200gBB

(kelompok D). Penelitian Sandhiutami et al. (2015) juga memaparkan

bahwa ekstrak kulit buah rambutan dosis 84 mg/kgBB meningkatkan kadar

MDA mencit yang diberi aktivitas fisik berlebihan. Fila et al. (2012)

44

melaporkan bahwa kandungan senyawa tertinggi pada kulit buah rambutan

adalah senyawa fenolik. Beberapa penelitian menunjukkan bahwa

antioksidan fenolik juga memiliki aktivitas prooksidan dalam kondisi

tertentu, seperti pada dosis tinggi, pH tinggi atau di hadapan ion logam

(Decker 1997). Banyaknya konsentrasi antioksidan yang ditambahkan dapat

berpengaruh pada laju oksidasi. Pada konsentrasi rendah, grup fenolik dapat

menghambat atau mencegah pembentukan radikal bebas. Namun, pada

konsentrasi tinggi aktivitas antioksidan grup fenolik sering lenyap bahkan

antioksidan tersebut menjadi prooksidan (Bouayed & Bohn 2010). Oleh

karena itu, diperlukan penelitian lebih lanjut mengenai dosis ekstrak kulit

buah rambutan sehingga diketahui dosis yang efektif sebagai antioksidan

dan prooksidan.

Enzim SOD adalah antioksidan enzimatis yang memegang peranan

penting dalam melindungi sel dari stres oksidatif (Fridovich 1981). SOD

mengatalisis reaksi dismutasi dari radikal anion superoksida menjadi

hidrogen peroksida (H2O2). H2O2 akan diubah menjadi H2O oleh enzim

katalase dan glutation peroksidase (Lee et al. 2004). Kesempurnaan kerja

sistem enzim antioksidan diperankan oleh tiga macam enzim tersebut (SOD,

katalase, glutation peroksidase), namun antioksidan seluler tidak dapat

bekerja secara individual tanpa dukungan asupan antioksidan sekunder dari

bahan pangan. Oleh karena itu, diperlukan konsumsi bahan makanan yang

kaya akan komponen antioksidan dengan jumlah memadai agar mampu

memacu kerja enzim antioksidan dalam tubuh (Lampe 1999).

Pembentuk radikal bebas dari asap rokok terdapat dalam dua fase,

yaitu fase gas yang berupa NO & nitrit peroksida (NO2) dan fase partikel

berupa quinine, semiquinone & hydroquinone (Trabel et al. 2000). Kedua

fase pembentuk radikal bebas tersebut apabila bereaksi dengan logam

transisi seperti Fe dan Cu akan menghasilkan radikal bebas O2 dan H2O2

yang selanjutnya membentuk radikal hidroksil. Pemakaian enzim SOD yang

terlalu besar untuk menetralisir radikal bebas secara terus-menerus akan

menurunkan aktivitas enzim tersebut (Muhammad 2009).

45

Penurunan aktivitas SOD pada kelompok B menunjukkan bahwa

pemaparan asap rokok mengakibatkan peningkatan radikal bebas pada tikus.

Pada saat pemaparan asap rokok akan terbentuk radikal superoksida (O2),

yaitu zat reaktif yang berbahaya bagi tubuh. Enzim SOD dapat menetralisir

radikal tersebut dengan mengubah dua molekul O2 menjadi H2O2 dan O2.

Peningkatan O2 secara terus-menerus akan mengganggu aktivitas SOD

yang menyebabkan ketidakseimbangan antara oksidan dan antioksidan

endogen (Fridovich 1981). Hal ini didukung oleh penelitian Muhammad

(2009) yang menyatakan bahwa keadaan stres dapat meningkatkan jumlah

radikal bebas. Kondisi tersebut akan menyebabkan penggunaan enzim SOD

semakin banyak sehingga enzim SOD yang tersedia jumlahnya semakin

berkurang.

Pada kondisi stres oksidatif, imbangan normal antara ROS dengan

kemampuan antioksidan tubuh untuk mengeliminasinya mengalami

gangguan sehingga menggoyahkan rantai reduksi-oksidasi normal.

Akibatnya, terjadilah kerusakan jaringan (stres oksidatif). Kerusakan

jaringan akibat radikal bebas tergantung pada beberapa faktor, antara lain

target molekuler, tingkat stres yang terjadi, mekanisme yang terlibat serta

waktu dan sifat alami dari sistem yang diserang