EFECTO DE LA FUENTE DE CARBONO SOBRE EL COMPORTAMIENTO DEL OXÍGENO DISUELTO DURANTE EL CULTIVO SUMERGIDO DE Gibberella

fujikuroi

Erika Yudit Rios Iribea, Oscar Martín Hernández Calderóna, Eleazar Máximo Escamilla Silvab a Facultad de Ciencias Químico Biológicas, Universidad Autónoma de Sinaloa, Ciudad Universitaria, Culiacán, Sinaloa,

80010, MÉXICO, erios@uas.edu.mx b Departamento de Ingeniería Química, Instituto Tecnológico de Celaya, Av Garcia Cubas S/N, Fovissste, Celaya,

Guanajuato, 38010, MÉXICO Resumen En este proyecto de investigación se analizó el comportamiento de la respiración de Gibberella fujikuroi para la producción del metabolito secundario ácido giberélico utilizando glucosa o aceite de maíz como fuente de carbono. El consumo específico de oxígeno disuelto (OD) fue más alto durante la fase de crecimiento celular de G. fujikuroi y fue reportado de 0-48 h. En dicho periodo el agotamiento de nitrógeno fue alcanzado, el consumo de fosfato cesó y la producción de ácido giberélico inició. El consumo de glucosa o aceite de maíz ocurrió aún después de agotarse la fuente de nitrógeno. Cuando la glucosa fue utilizada en el medio de cultivo, la concentración máxima de biomasa fue alcanzada a las 48 h y solo el 50 % del contenido de glucosa inicial había sido consumido. Posteriormente el consumo específico de OD fue disminuyendo paulatinamente, indicando que la glucosa remanente fue asimilada mediante un metabolismo altamente oxidativo. Por otro lado, en el caso de aceite de maíz, el cese de consumo de fosfato fue alcanzado antes que la concentración máxima de biomasa fuera obtenida, así también, en el mismo lapso de tiempo, el consumo de OD alcanzó su valor mínimo, lo cual sugiere que los ácidos grasos asimilados no fueron catabolizados por el microorganismo sino acumulados celularmente. Introducción La elección de la fuente de carbono durante los procesos de cultivo microbiano para la producción de metabolitos, incide directamente en su rendimiento [1]. A pesar de esto, la mayoría de los desarrollos experimentales sobre procesos fermentativos, disponen de la glucosa como la fuente de carbono a utilizar en los primeros ensayos, sustentado en el hecho de que la vía de la glicólisis, es la ruta más rápida para satisfacer las necesidades energéticas de las funciones celulares de los organismos vivientes. La producción de GAs mediante Gibberella fujikuroi no ha sido la excepción, puesto que sus principales líneas de investigación, se basan en el uso de glucosa; sin embargo, la necesidad de mejorar la producción de las GAs, ha motivado la búsqueda de nuevas fuentes de carbono. La utilización de aceites naturales, se ha justificado en el hecho de que podrían poseer precursores naturales para la biosíntesis de GAs [2]. El ácido giberélico (GA3) es el principal representante de las giberelinas bioactivas (GAs), y regula los procesos de crecimiento y desarrollo de las plantas superiores. Es el producto principal del metabolismo secundario durante el cultivo del hongo G. fujikuroi. Para la producción con altos rendimientos de GA3, el suministro de aire es muy importante, ya que es un cultivo aeróbico [3]. Para obtener resultados óptimos en la síntesis de este producto, es necesario operar por encima de la concentración crítica de OD en el medio de cultivo [4-5]. La técnica más empleada para la producción de GA3 es la de cultivo sumergido. En cultivo sumergido, algunos factores físicos que afectan la morfología del hongo son la geometría del reactor, sistema de agitación y el tipo de proceso [6].

Metodología Se utilizó la cepa G. fujikuroi H-984. El medio de cultivo para la producción de GA3 fue constituido por: glucosa o aceite de maíz en una concentración equivalente de 40 g L-1 de C, 2 g L-1 NH4Cl, 3 g L-1 KH2PO4, 1.5 g L-1 MgSO4.7H2O y 2 mL L-1 de solución de oligoelementos. Dicha solución contiene (g L-1): 1.0 FeSO4•7H2O, 1.5 Na2MoO4•2H2O, 0.2 MnSO4•H2O y 1.0 ZnSO4•7H2O.Las fermentaciones se realizaron en un biorreactor de tanque agitado con capacidad de 7 L a pH 3.5, temperatura de 29 °C, agitación de 600 rpm y una tasa de aireación de 1 vvm. El monitoreo de esas variables fue mediante el software BioXpert. Se determinaron las cinéticas de consumo de OD, glucosa por el método de Miller [7], el aceite de maíz se extrajo con hexano y se determinó gravimétricamente [8], nitrógeno por la técnica de Kjeldahl [9], fosfatos por método colorimétrico [10], la producción de biomasa se determinó gravimétricamente en la muestra libre de aceite utilizando membranas Millipore de nitrocelulosa de 0.45 µm de tamaño de poro y 47 mm de diámetro a peso constante (90 °C durante 4 h). Por último, para la cuantificación de GA3, se realizó una extracción líquido-líquido con acetato de etilo, se eliminó el solvente, el residuo se resuspendió en metanol absoluto grado HPLC, el cual, se analizó por Cromatografía Líquida de Alta Resolución [11]. Resultados y discusión La selección de la fuente de carbono afectó el tiempo y la producción del metabolito secundario ácido giberélico. Cuando se utilizó glucosa como sustrato (figuras 1a y 1b), el metabolismo secundario inició a las 96 h de cultivo y se obtuvo una producción de 132 mg GA3 L

-1 a las 240 h de cultivo. En contraste, cuando se usó aceite de maíz (figuras 2a y 2b) se cuantificó una producción de 248 mg GA3L

-1 a las 240 h de cultivo, y se inició la detección del metabolito a las 48 h de cultivo. Se observó un súbito cambio de la concentración oxígeno disuelto en el periodo de 0-48 h cuando se utilizó glucosa (figura 3), y de 0-36 h en el caso de aceite de maíz (figura 4). Dichos periodos se presumen como la fase de crecimiento celular. Un modelo logístico fue ajustado en ambos casos, obteniendo así una constante de consumo de oxígeno disuelto de 0.2662 h-1 y 0.2123 h-1, cuando se utilizó glucosa y aceite de maíz respectivamente. Para el caso de glucosa como fuente de carbono: (1) la estabilización de la concentración de fosfato a las 48 h fortalece la hipótesis del cese del crecimiento celular; (2) se carece de lipogénesis, debido a que la concentración de biomasa también alcanza su valor máximo a las 48 h; (3) el agotamiento de nitrógeno a las 36 h hace suponer la translocación de depósitos de nitrógeno en el lapso de 36-48 h, lo cual propició un estrés débil por limitación de nitrógeno, y por tanto la producción del metabolito secundario fue aproximadamente 48 h posterior al agotamiento de nitrógeno en el medio; (4) la recuperación de la concentración de oxigeno disuelto en el medio y el consumo de glucosa después de las 48 h, se comportan de acuerdo a una cinética de primer orden, lo cual vincula estrechamente el uso del oxígeno para catabolizar la glucosa asimilada celularmente.

0 48 96 144 192 240

0

24

48

72

96

120

Glucosa

Glu

cosa

[g L

-1]

Tiempo de Fermentación [h]

0.00

0.03

0.06

0.09

0.12

0.15

Acido Giberélico

Aci

do G

iber

élic

o [g

L-1]

Figura 1a. Producción de GA3 utilizando glucosa como fuente de carbono.

0 48 96 144 192 240

0.0

4.4

8.8

13.2

17.6

22.0

Biomasa

Bio

ma

sa [g

L-1]

Tiempo de Fermentación [h]

0.00

0.12

0.24

0.36

0.48

0.60

Nitrógeno N

itróg

eno

[g L

-1]

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Fosfato

Fos

fato

[g L

-1]

Figura 1b. Cinéticas del cultivo microbiano durante la producción de GA3 utilizando glucosa como fuente de carbono.

0 48 96 144 192 240

0

11

22

33

44

55 Aceite de MaízAc

eite

de

Maí

z [g

L-1]

Tiempo de Fermentación [h]

0.00

0.06

0.12

0.18

0.24

0.30

Acido Giberélico

Áci

do G

iber

élic

o [g

L-1]

Figura 2a. Producción de GA3 utilizando aceite de maíz como fuente de carbono.

0 48 96 144 192 240

0

5

10

15

20

25

Biomasa

Bio

ma

sa [g

L-1]

Tiempo de Fermentación [h]

0.00

0.12

0.24

0.36

0.48

0.60

Nitrógeno

Nitr

ógen

o [g

L-1]

0.0

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

Fosfato

Fos

fato

[g L

-1]

Figura 2b. Cinéticas del cultivo microbiano durante la producción de GA3 utilizando aceite de maíz como fuente de carbono.

Figura 3. Comportamiento del OD utilizando glucosa como fuente de carbono durante el cultivo microbiano de G. fujikuroi.

Figura 4. Comportamiento del OD utilizando aceite de maíz como fuente de carbono durante el cultivo microbiano de G. fujikuroi.

En el caso de aceite de maíz como fuente de carbono: (1) se presume la existencia de lipogénesis celular, debido a que la recuperación de la concentración de oxígeno disuelto y la estabilización de la contenido de fosfatos en el medio de cultivo, son logradas antes de alcanzar una concentración máxima de biomasa; (2) la producción de GA3 a las 48 h sugiere el instante de tiempo del cese del crecimiento celular; (3) el agotamiento de aceite de maíz y el nuevo abatimiento del contenido de oxígeno ocurrido a las 144 h, sugiere la activación de un metabolismo alterno no identificado, pero presumiblemente de carácter anabólico; (4) la producción de GA3 con respecto a otros mecanismos metabólicos, requiere bajo consumo de OD, debido a que en el periodo de 84-136 h, la producción del metabolito secundario, la lipogénesis, y el mantenimiento celular disminuyen el contenido de OD en el medio solamente a un 86 %. Conclusiones Un análisis de la dinámica de OD durante el cultivo de G. fujikuroi: (1) establece que el crecimiento celular es interrumpido cuando es utilizado glucosa como fuente de carbono y desacelerado cuando es utilizado aceite de maíz; (2) sugiere que el alto consumo de oxígeno podría ser debido a la producción alterna de otros metabolitos competitivos al ácido giberélico; específicamente cuando glucosa es utilizada como fuente de carbono en lugar de aceite de maíz; (3) indica que a pesar de que la síntesis de ácido giberélico es altamente oxidativa, los requerimientos de consumo de OD no agotan su contenido en el medio de cultivo. La cinética de consumo de oxígeno juega un papel primordial en la identificación de posibles mecanismos metabólicos. Referencias 1. Rodrigues C., Porto de Souza L., de Oliveira J., Soccol, C.R. New perspectives of gibberellic acid production: a review.

Critical Reviews in Biotechnology. 32(3): 263-273, 2012. 2. Vass R.C., Jefferys E.G. Gibberellic acid. Chapter 9. In: Economic microbiology. Volume 3. Edited by: A.H. Rose.

Academic Press London, 1979. 3. Brückner, B. and Blechschmidt, D. “The Gibberellin Fermentation”, Critical Reviews in Biotechnology, Vol. 11, p.163-

192, 1991. 4. Kumar P. K. B. and Lonsane B. K. “Microbial Production of Gibberellins.State of the Art”, Advances in applied

Microbiology. Vol. 34, p. 28-139, 1989. 5. Tudzynski B. “Biosynthesis of gibberellins in Gibberella fujikuroi: biomolecular aspects”, Appl. Microbiol Biotechnol,

Vol. 52, p. 298-310, 1999. 6. Papagianni, M. “Fungal morphology and metabolite production in submerged mycelia processes”, Biotechnology

Advances, Vol. 22, p. 189–259, 2004. 7. Miller G.L. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugars. Anal. Chem. 31: 426-428. 1959. 8. Folch J., Less M, Sloane-Stanley, G.H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal

tissues. Journal of Biological Chemistry. 226: 497-509. 1957. 9. A.O.A.C. Official Methods of Analysis.15th Edition of the Association of Official Chemists. Washington, D.C. 1990. 10. Juarez C., Rochín L.C. Manual de Química Aplicada. Imprenta Arana, S.A. 1966. 11. Negrete-Rodríguez X. Tesis de maestría: Producción de ácido giberélico en biorreactor de tanque agitado con Gibberella

fujikuroi empleando aceite de maíz como fuente de carbono. Instituto Tecnológico de Celaya. 2002.