Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska

Dobivanje i korištenje transgeničnih životinja

Genetski modificirani miševi - modeli za izučavanje humanih fizioloških i

patofizioloških procesa Prof.dr. Bojan Polić

Medicinski fakultet Sveučilišta u Rijeci

Riejka, svibanj 2013.

Humani genom

Pristupi u izučavanju funkcije gena u eukariotskim stanicama

In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - privremena (tranzijentna) - stabilna

In vivo • Transgenične životinje (u užem smislu)

• Ciljana mutacija gena („gene targeting”) – „knock out/in”

mutante miševa - konvencionalna - kondicionalna

Transfekcija ili transdukcija eukariotskih stanica

• Transgen obično sadrži cDNA i regulacijske elemente (promotor , pojačivač, transkripcijski stop signal)

• DNA vektor sadrži i marker gen za pozitivnu selekciju

• Transgen se ubacuje u stanicu transfekcijom ( precipitacija CaCl2, elektroporacija, liposomi) ili transdukcijom (retrovirusni vektori)

• Transfekcija može biti tranzijentna (vektor smješten ekstrakromosomalno) ili stabilna (vektor nasumično integriran u genom stanice)

Transfekcija stanica

Transdukcija stanica

Transfekcija i transdukcija stanica

• Nasumična integracija vektora (pozicioni efekt)

• Često višestruka integracija vektora

• Problematična razina izražaja gena (obično u suvišku)

• Moguća upotreba „dominantno-negativnih” transgena

• Ispitivanje funkcije gena ograničeno na vrstu tranficirane (transducirane) stanice

Ispitivanje funkcije gena in vivo

Najčešći organizam: MIŠ

- sisavac - genom miša je približno velik kao humani (3 x 109 pb, < 25 000 gena) - mišji genom je sekvenciran - oko 99% mišjih gena ima svog homolognog partnera u humanom genomu - vrlo slična fiziologija humanoj - brzo se razmnožava - relativno mali troškovi održavanja (u odnosu na druge sisavce)

Pristupi u izučavanju funkcije gena in vivo

In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - tranzijentna - stabilna




Transgenični miševi

- Jaenisch et al. (1976), Gordon et al. (1980), Brinster et al. (1981), Constantini & Lacy (1981), Gordon & Ruddle (1981), E. Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981)

1. Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije

2. Fenotipska karakterizacija transgena - geni eksprimirani tijekom razvoja (Kessel & Gruss, 1990) - geni za hormone i receptore (Adams & Cory, 1991) - geni u imunološkom odgovoru (Hanahan, 1989; Goodnow,

1992) - virusni geni (Berns, 1991; Skowronski et al. 1993)

Transgenični miševi

Izolacija zigota miša (0.5 dana od oplodnje)

Mikroinjiciranje transgena u muški pronukleus zigote

Dobivanje transgeničnih miševa („klasični način”)

Transgenični miševi („klasični način”)

• transgen obično sadrži cDNA i regulacijske elemente (promotor, pojačivač, transkripcijsku stop sekvencu)

• nasumična integracija transgena (moguće narušavanje funkcije drugih gena ili utjecaj drugih gena na transgen - pozicioni efekt!)

• često višestruka integracija transgena (na jednom ili više lokusa - pojačani izražaj!)

• Potrebno je pažljivo karakterizirati „foundere” kako bi se pronašla jedinka koja je odgovarajuća za daljnja istraživanja

Pristupi u izučavanju funkcije gena in vivo

In vitro • Transfekcija eukariotskih stanica - privremena (tranzijentna) - stabilna




Ciljana mutacija gena („gene targeting”)

Vektor za ciljanu mutaciju gena

- Područja homologije koja omeđuju nehomolognu sekvencu DNK

- Marker gen za pozitivnu selekciju EMS (rezistencija na G418 (genenticin), higromicin, puromicin, itd.) smješten u području nehomologne sekvence (središnji dio vektora)

- Marker gen za negativnu selekciju (HSV tk; dt) smješten na kraju jedne od homolognih sekvenci – služi za kontraselekciju nasumično (nehomologno) integriranih vektora

Ciljana mutacija gena („gene targeting”)

Ciljana mutacija gena

Ciljanu mutaciju gena postižemo homolognom rekombinacijom vektora u mišjim embironalnim matičnim stanicama (EMS) ili „embryonic stem cells” – (ESC)

Embrionalne matične stanice

- 1981.g. M. Evans et al. – prvi puta izolirali EM stanice iz teratoma, a potom iz blastociste

- 1984.g. A. Bradley – mikroinjicirao EMS u blastocistu i dobio kimere

- 1986.g. M. Capecchi; 1987/88.g. O. Smithies – prve ciljane mutacije u EMS

- 1989.g. O. Smithies i sur. (HPRT)- dobiveni prvi miševi ciljanom mutacijom gena (Jaenisch 1990, Rajewsky 1990)

2007.g. – M. Evans, M. Capecchi i O. Smithies – Nobelova nagrada

Rani embrionalni razvoj miša

Blastocista miša

Potencijal diferencijacije EMS

Izolacija EMS

Uzgoj EMS

Uzgoj EMS

Embrionalne matične stanice (EMS)

Neke od EMS linija koje se koriste za ciljanu mutaciju: - E14, D3, AB1, R1, J1, CCE - izolirane iz 129 podsojeva miševa (H2-

b)

- Bruce 4, ES623, B6-3 – izolirane iz C57BL/6 miševa (H2-b) Albino BL6 EMS iz C57BL/6-tyr(c-2J) - EMS izolirane iz Balb/c miševa

Transfekcija i selekcija EMS

• Pozitivna selekcija: G418 („Genenticin”), Puromicin, Higromicin, i dr. • Negativna selekcija: Ganciklovir, toksin difterije

Mikroinjiciranje homolognih rekombinanti EMS u blastocistu

Priprema donora i primaoca 3.5 dana starih embrija (blastociste)

Donori embrija fertilna ženka

X fertilni mužjak Početak parenja: ponedjeljak Vaginalni plak: utorak Blastociste: petak

Primaoci embrija fertilna ženka

X sterilni mužjak Početak parenja: utorak Vaginalni plak: srijeda Blastociste: petak

Uvjeti pripreme donora i primaoca embrija

• Vivarij mora imati reguliran režim svjetlog i tamnog perioda (npr. 19 h – 5 h mrak i 5 h – 19 h svjetlo)

• Ženke pod konstantnim režimom svjetlog i tamnog perioda ovuliraju svakih 4-5 dana (3-5 h nakon početka mračnog perioda)

• Koncepcija obično nastupa u sredini mračnog perioda

• Ženke moraju biti starije od 6 tj. za prirodno parenje, a mlađe u slučaju hormonski stimulirane superovulacije

• Dobri uvjeti uzgoja (mir, adekvatna hrana, vlažnost, jačina svjetla, odsutnost patogena, higijena, itd.)

Hormonski stimulirana superovulacija

• 3 – 5 tj. stare ženke (predpubertetno razdoblje)

• 48 h prije parenja injicira im se 5 i.u. PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin) - FSH

• 2 - 6 h prije parenja injicira im se 5 i.u. hCG (humani korionski gonadotropin)

Izolacija blastocisti miša

Izolacija blastocisti miša

Mikroinjiciranje homolognih rekombinanti EMS u blastocistu

Prijenos embrija u uterus pseudotrudne ženke

Prijenos embrija u uterus pseudotrudne ženke

Prijenos embrija (embriotransfer) u uterus pseudotrudne ženke

Kimerični miš

Kimerični miš

Prijenos mutacije („germ-line transmission”)


Rezultat ciljane mutacije gena: • „knock-out” miševi – ciljana delecija ili

inaktivacija gena (potpuna ili parcijalna delecija gena)

• „knock-in” miševi – ciljano ubacivanje nekog

genskog elementa ili (trans)gena u točno određen genski lokus


• Konvencionalna – mutacija gena je prisutna već od ranog embrionalnog razvoja u svim stanicama („klasični” knock-out i knock-in miševi)

• Kondicionalna – mutacija gena se može aktivirati specifično u pojedinim stanicama i/ili u željeno vrijeme

- neinducibilna (specifična i nespecifična) - inducibilna (specifična i nespecifična)

NKG2D knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)

Zafirova et al. Immunity 2009










NKG2D je važan za formiranje memorijskih CD8+ limfocita T

Felix M. Wensveen et al. submitted, 2013.

Felix M. Wensveen et al. submitted, 2013.

NKG2D je važan za formiranje memorijskih CD8+ limfocita T

NKG2D igra ulogu u atopisjkom odgovoru kože posredovanom γδ limfocitima T

Science, 334:1293, 2011.

TCR konck-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)

TCR knock-out miševi (konvencionalna ciljana mutacija)

Razvoj limfocita T u timusu


P. Mombaerts et al. Nature, 1992.

Konvencionalna ciljana mutacija

Problem: • Izražaj mnogih gena je esencijalan za razvoj

embrija ili pojedinih stanica

• Inaktivacija (mutacija) istih u ranoj embrionalnoj fazi zaustavlja razvoj embrija ili stanica

• To onemogućava istraživanje fukcije istih gena u odraslom organizmu ili zrelim stanicama


• Konvencionalna – mutacija gena je prisutna već od ranog embrionalnog razvoja u svim stanicama miša („klasični” knock-out i knock-in miševi)

• Kondicionalna – mutacija gena se može aktivirati specifično u pojedinim stanicama i/ili u željeno vrijeme

- neinducibilna (specifična i nespecifična) - inducibilna (specifična i nespecifična)


Konvencionalna mutacija

Kondicionalna inducibilna mutacija

Kondicionalna neinducibilna mutacija

Kondicionalna ciljana mutacija

Koriste se najčešće dva sustava: • Cre / loxP sustav (bakteriofag P1)

• Flp / FRT sustav (kvasac)


Cre / loxP sustav: • Cre rekombinaza • loxP mjesta

loxP mjesto


Da bismo ostvarili kondicionalnu mutaciju gena moramo imati dva miša (alela): • Miš koji sadrži gen ili dio gena omeđenog loxP

sekvencama („floksiran” gen)

• Miš koji sadrži Cre transgen (specifični i nespecifični, inducibilni i neinducibilini promotor)

Kondicionalnu mutaciju gena možemo ostvariti onda kada križamo ova dva miša, odnsno kada imamo oba alela (cre i flox) u istoj životinji


Kondicionalna neinducibilna mutacija gena

Kondicionalna ciljana mutacija (mutacija IKK kompleksa)

NF-κB

NF-κB

Akitvacija NF-κB puta

Kondicionalna ciljana mutacija (neinducibilna)

IKK - kompleks


Incontinentia pigmenti

Incontinentia pigmenti • X vezano svojstvo • mutacija u Nemo

genu (Nemo dio IKK kompleksa

• rana smrtnost muške djece

Nemo knock-out (konvencionalna ciljana mutacija)

M. Schmidt-Supprian et al., Mollecular Cell 2000


M. Pasparakis, Nature 2002

Kondicionalna ciljana mutacija IKK2 (neinducibilna)

K14 – Cre X

IKK2 fl/fl

M. Pasparakis, Nature 2002

Kondicionalna ciljana mutacija IKK2 (neinducibilna)


„Cre Zoo”

Kondicionalna inducibilna ciljana mutacija

Science, 269:1427-1429, 1995


• Miš sa „floxiranim” željenim alelom x • Miš sa MxCre ili nekim drugim

inducibilnim transgenom (npr. CreERt2)

Mx promotor – inducira ga IFNα CreERt2 – aktivira se Tamoksifenom


P. Mombaerts et al. Nature 360:225, 1992.


Kako istražiti ulogu TCR-a u homeostazi zrelih naivnih i memorijskih limfocita T?

Kondicionalni inducibilni TCR knock-out miševi

PNAS 98:8744, 2001






Rezultat ciljane mutacije gena: • „knock-out” miševi – ciljana nul-mutacija

gena

• „knock-in” miševi – ciljano ubacivanje nekog genskog elementa ili (trans)gena u točno određen genski lokus

Knock-in miševi

• Ciljano ubacujemo neki genski element ili transgen u određeni genski lokus (ili želimo ekspresiju nekog ektopičnog gena pod specifičnim promotorom ili želimo kontroliran broj kopija i ekspresiju nekog transgena)

• Obično mijenjamo postojeću strukturu genskog lokusa

• Reporter miševi (GFP, RFP, YFP i dr.) ili Cre (Flp) ili DT(R) miševi su obično knock-in miševi

• Za knock-in transgena se često koriste Rosa-26 ili HPRT lokus, ali se može koristiti i bilo koji drugi genski lokus

„Reporter” miševi

STOP GFP Rosa26 lokus knock-in

Cre CD19

CD19 Cre transgen

Specifična ekspresija GFP na limfocitima B

GFP miš

Nespecifično izražen GFP (Deleter Cre + Reporter GFP)

Kondicionalni transgen (knock-in)

„Brainbow” vektor

Kondicionalni transgen (konck-in) („Brainbow”)

Specifična i kondicionalna deplecija stanica in vivo

STOP DTR Rosa26 lokus knock-in

Cre CD19

CD19 Cre transgen

Specifična ekspresija difterija toksin receptora (DTR) na limfocitima B (miševi nemaju DTR!)

• Injiciranje difterija toksina (DT) dovodi do deplecije limfocita B

Genetski modificirani miševi

http://www.emmanet.org/

European Mouse Mutant Archive (EMMA)

http://mousemutant.jax.org/

The Mouse Mutant Resource – The Jackson Laboratory

http://www.mmrrc.org/

Mutant Mouse Regional Resource Centers (MMRRC) – supported by NIH

http://www.findmice.org/

International Mouse Strain Resource (IMSR)

http://www.emmanet.org/







Kloniranje miševa

Miševi s klonalnim TCR i BCR dobiveni nuklearnim transferom

Nature, 415:1035, 2002

Monokonski TCR i BCR miš dobiven nuklearnim transferom

Kloniranje miševa

Potencijal diferencijacije EMS

Ciljani popravak gena

Terapeutsko kloniranje miševa i popravak Rag2 mutacije

Da li možemo upotrebom određenih faktora reprogramirati bilo koju somatsku stanicu čime bismo mogli zaobići nuklearni transfer?

Inducirane pluripotentne matične stanice (iPMS)


Miševi dobiveni komplementacijom tetraploidnih blastocisti s iPMS


Nobelova nagrada 2012.g. - Shinya Yamanaka - John B. Gurdon

Reprogramiranje u iPMS je univerzalno

Primjena iPMS

Cell Stem Cell, 2012

Documents

Dobivanje i korištenje‡... · Wagner et al. (1981), T. Wagner et al. (1981) 1.Studije regulacije tkivno-specifičnih gena i gena specifičnih za pojedine razvojne stadije 2.Fenotipska