Upload
noer-roman
View
239
Download
0
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Bioteknologi Farmasi
Citation preview
Teknologi GenaBioteknologi
Binar Asrining Dhiani, M.Sc., Apt
Teknologi Gena
• Kegiatan untuk:
– Mengetahui ekspresi gen
– Mengambil manfaat dari variasi genetik
– Memodifikasi gen
– Memindahkan gen ke inang baru
Langkah-langkah dalam Teknologi Gena
I. Persiapan DNA atau gen tertentu
II. Seleksi dan identifikasiklon yang benar
III. Produksi massalIII. Penerapan di bidang
kedokteran dan pertanian
Introduction ke dalam inang
DNA
Central DogmaAlur Informasi Genetik (dari DNA ke Protein)
Replikasi DNA
• DNA Polimerase:– Mensintesis DNA
hanya dari arah 5’ ke3’, menambah dNTPke gugus hidroksil 3’
– Hanya menambahdeoksiribonukleotidabaru pada primer strand yang berikatanhidrogen dengantemplate strand
Kloning DNA
Vektor Rekombinan DNA
• Molekul DNA yang dapat berpindah dan bereplikasidalam suatu organisme
• Contoh:Vektor Ukuran yang dapat disisipkan (kb)
– Plasmid sampai 15
– Bakteriofage sampai 90
– Bacterial Artificial Chromosome (BAC) 100-500
– Yeast Artificial Chromosome (YAC) 250-2000
• Ciri utama:– Origin of replication: untuk membantu multiplikasi di inang
– Cloning site: untuk dipotong oleh enzim untuk menyisipkanDNA
– Drug resistance marker: untuk seleksi
Metode Transfer GenProkariot
• Elektroporasi
• Perlakuan kimia– Kalsium klorida
– Rubidium klorida
– DMSO
Eukariot
• Elektroporasi– Pembentukan pori oleh arus listrik tegangan
tinggi
• Ko-presipitasi dengan kalsium fosfat– Presipitasi DNA dengan kalsium fosfat
– Absorb ke dalam membran sel
– Masuk ke dalam sel melalui proses kalsium-dependen
• Liposom enkapsulasi– Meng-enkapsulasi DNA pada vesikle liposom
– Peleburan liposom dengan membran sel
• Mikroinjeksi– Injeksi DNA dalam mikropipet gelas kapiler
langsung ke inti sel melalui tekanan udara
• Infeksi retrovirus– DNA rekombinan disambungkan ke genom
retrovirus
– Sel diinfeksi virus
Seleksi DNA Rekombinan
• Sel yang di-introduce molekul DNA kedalam sel bakteri:
– Sel tidak ada plasmidnya
– Sel mengandung plasmid yang tidakmengandung gen asing
– Sel mengandung plasmid yang mengandunggen asing
Seleksi DNA Rekombinan
• Menggunakanobat/antibiotik
• Menggunakan warna– Koloni biru/putih– Vektor mengandung
gen LacZ• Vektor tanpa insert
gene, gen lacz tetaptranskripsi
– Adanya substrat X-Gal akanmenghasilkan warnabiru
• Vektor dengan insert gene, gen Lacz pecah, dipisahkan oleh sisipanDNA asing tidak adaproduk warna
Koloni bakteri resisten terhadap ampisilin
Media kultur mengandung ampisilin
Isolasi koloni
Bakteri mengandungplasmid rekombinan
GENE DELETION vs GENE SILENCING
• Gene Deletion (penghilangan gen)
– Mutasi (perubahan genetik) akibat hilangnyasebagian dari kromosom atau sekuen DNA
• Gene Silencing
– Ekspresi suatu gen di-”switch off” olehmesin-mesin di dalam sel.
– Terjadi ketika RNA tidak dapat menghasilkanprotein saat translasi
GENE DELETION : PrincipleConstruction of KanMX4 deletion cassette
1128 bp1331 bp
SNQ2_L1 SNQ2_L3
SNQ2_L2 SNQ2_L4
SNQ2
First step PCR
Second step PCR
SNQ2_up SNQ2_dw
218bp 294bp
SNQ2_L1
SNQ2_L4
1.5 kb of NotI digested pFA6-KanMX4
KanA_R
KanA_F
SNQ2
Rekombinasi
GENE SILENCING: RNAi (RNA interference)
TEKNOLOGI GENA DALAMPRODUKSI INSULIN
Insulin
• Molekul kecil yang terdiri dari dua rantai protein:– Rantai A: terdiri dari 21 asam amino
– Rantai B: terdiri dari 30 asam amino
• Mengatur kadar gula dalam darah
• Dihasilkan oleh sel beta di pankreas (islet Langerhans)
• Dihasilkan terus menerus dalam jumlah sedikit, namun diproduksi dalam jumlah banyak dalamrangka merespon kenaikan kadar gula dalam darah
Insulin Synthesis
Insulin Synthesis
Insulin Synthesis
• Signal sequence:24 aa
• Chain C: 35 aa
Peptidase
Protease
Insulin Production (History)
• 1920 ekstraksi insulin dari anjing sapi dan babidipurifikasi
• 1950 struktur kimia insulin dan lokasi gen insulin pada kromosom 11 ditemukan
• 1977 gen insulin tikus untuk produksi insulin
• 1980 rekayasa genetik untuk produksi insulin
• 1982 produk insulin manusia melalui rekayasagenetika dari Eli Lilly Corp. di setujui (produk obat hasilrekayasa genetika pertama)
• 2001 95% pengguna insulin menggunakan human insulin (Eli Lilly Corp.)
Porcine dan Bovine Insulin
Mengubah porcine menjadihuman insulin
• Porcine + tripsinmemecah alanin, menambahkanthreonin ester, + water hidrolisis ester danmemecah butanol human insulin
Ala
Thr Ester
Ala
Thr Ester
Thr Ester+
Porcine insulin
Human insulin
Produksi Insulin Rekombinan
Produksi Insulin Rekombinan
• Gen proinsulin
Insulin Purification
• Kromatografiafinitasmenggunakanantibodi spesifikterhadap insulin