DISMINUCIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS CÉLULAS MADRES ESPERMATOGÓNICAS EN TESTÍCULOS CON CRIPTORQUIDIA

Notas del traductor: para la redacción de la traducción del artículo se emplearon las mismas abreviaturas de la versión en inglés con el objetivo de agilizar el proceso de comprensión. Dichas abreviaturas se encuentran detalladas en la parte inicial del artículo

DISMINUCIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS CÉLULAS MADRES ESPERMATOGÓNICAS EN TESTÍCULOS CON CRIPTORQUIDIA

AUTORES

HIDEYUKI KAMISAWA

YOSHIYUKI KOJIMA*

KENTARO MIZUNO

MAKOTO IMURA

YUTARO HAYASHI

KENJIRO KOHRI

DEPARTMEN OF NEPHRO-UROLOGY, NAGOYA CITY UNIVERSITY, GRADUATE SCHOOL OF MEDICAL SCIENCES,

NAGOYA, JAPAN

THE JOURNAL OF UROLOGY, Vol 187, 1047-1052, Marzo 2012


DISMINUCIÓN DE LA ACTIVIDAD DE LAS CÉLULAS MADRES ESPERMATOGÓNICAS EN TESTÍCULOS CON CRIPTORQUIDIA

Abreviaturas y acrónimos

Ad= adulta

Dpc= días post coíto

Dpp= días post parto

DT= testículos descendidos

PCR= reacción en cadena de polimerasa

RT-PCR= transcriptasa reversa-reacción en cadena de polimerasa

SC= célula madre (pluripotencial)

SSC= célula madre espermatogónica

UDT= testículo no descendido

UTF1= factor de transcripción celular embrionario indiferenciado 1

Resumen del artículo

Propósito: Para dilucidar el mecanismo de infertilidad causado por la criptorquidia nos enfocamos en las etapas tempranas de la espermatogénesis y la actividad de las células madres espermatogónicas en las espermatogonias indiferenciadas en testículos con criptorquidia.

Materiales y métodos: los encuentros histológicos y los patrones de expresión de los marcadores de las células madres con factores de transcripción celular embrionario indiferenciado 1 fueron examinados en modelos de ratas con criptorquidia unilateral. Removimos el testículo descendido unilateral y el testículo descendido contralateral de la criptorquidia y en ratas normales (control), respectivamente, 18 días post coíto hasta 144 días post parto.

Resultados: en los testículos descendidos la difrecienciación de los gonocitos en espermatogonias adultas tempranas ocurrión a los 9 días post parto. Sin embargo, esta trasformación fue alterada en testículos no descendidos. Además, el UTF1 negativo en espermatogonias adultas temprana hasta valores positivos en tasas de espermatogonias adultas temprana fue significativamente más alto en el grupo de ratas con testículos no descendidos (media +/- SD 0.69 +/- 0.04) que en el


grupo de control (0.46 +/- 0.10, p= 0.037) y en el grupo con el testículo descendido, indicando una disminución de las espermatogonias adultas tempranas con actividad de las células madres espermatogónicas en testículos con criptorquidia.

Conclusión: en los testículos con criptorquidia la diferenciación de los gonocitos a espermatogonias adultas temprana y la actividad de las células madres de las espermatogonias adultas temprana fue alterada durante las etapas tempranas de la espermatogénesis, sugiriendo que la pérdida de la actividad de las células madres espermatogónicas en la criptorquidia en las ratas resultó en una alterada espermatogénesis, en consecuencia interfiriendo con la fertilidad.

Palabras claves: criptorquidia, infertilidad, espermatogénesis, células madres embrionarias, proteína UTF1, ratas.

INTRODUCCIÓN

La criptorquidia (no descenso testicular) es la anormalidad congénita más común de todas las enfermedades urológicas y la infertilidad masculina es una de sus más serias complicaciones. Los consensos actuales recomiendan la orquipexia temprana entre el primer año de vida basados en la examinación histológica. No obstante, la orquipexia no siempre garantiza la fertilidad subsequente y paternidad. Los factores congénitos probablemente contribuyen a la infertilidad en la criptorquidia y algunos casos de criptorquidia puede haber determinada alteraciones en la espermatogénesis durante el periodo neonatal. La diferenciación de los gonocitos (células madres fetales pluripotenciales) en las espermatogonias adultas (las SC adultas pluripotenciales) es considerado crucial para la futura fertilidad, porque una alteración de este primer paso de maduración en el 2 al 3er mes en los testículos con criptorquidia podría resultar en una falla para establecer una adecuada cantidad de SC adultas pluripotenciales.

La espermatogénesis es un proceso dependiente de una SC soportado por su autorenovación y diferenciación de SC espermatogónicas. La etiología de la fertilidad masculina puede ser mejor entendida por el desciframiento de los mecanismos que controlan las funciones de SSC. Las espermatogonias adultas son consideradas SSCs que poseen habilidades de pluripotencialidad y autorenovación. Suponemos que la infertilidad futura en la criptorquidia podría resultar no solo de las alteraciones de la diferenciación de los gonocitos a espermatogonias adultas, sino también de la pobre regulación de la actividad de las SC espermatogónicas adultas (definida como la actividad de las SSC) durante el periodo perinatal. En este estudio examinamos los patrones de expresión de UTF1, un coactivador transcriptacional, marcador testicular de las SC, y un coactivador transcriptacional que regula la germinación de las células en autorenovación y/o diferenciación para evaluar la actividad de las SSC durante el


periodo perinatal. En adición, discutimos los posibles mecanismos responsables para la infertilidad masculina en la criptorquidia.

MATERIALES Y MÉTODOS

Animales

Para investigar las etapas prenatales tempranas de la espermatogénesis nosotros usamos ratas con testículos con criptorquidia como lo reportamos previamente. En los testículos de las ratas las espermatogonias indiferenciadas, o también llamadas espermatogonias adultas tempranas, expresan funciones de SC y análogos a las espermatogonias adultas en humanos. Las ratas Sprague-Dawley (Chubu Kagaku Shizai, Nagoya, Japan) fueron sujetas a un régimen controlado de luz de 12 horas de luz y 12 de oscuridad, permitiéndoles libre acceso a agua y dándoles una dieta de laboratorio estándar. La criptorquidia fue inducida inyectándoles 7,5mg de flutamida diariamente en el abdomen de las ratas Sprague-Dawley embarazadas entre los días de gestación 14 hasta el 20. Se definió el UDT unilateral como el testículo encontrado en una posición alta con un delgado gubernáculo comparado con el testículo contralateral durante los periodos tempranos reportado por otros. Por otra parte la incidencia de criptorquidia inducida por la flutamida es conocida por ser de 93,6% en 10 semanas después del nacimiento. La alta incidencia de criptorquidia y la exhaustiva observación confirmaron el diagnóstico de UDT. El testículo no descendido y el contralateral descendido fueron extirpados en cada día.

Dividimos las ratas en 3 grupos de 1) testículos de control (muestra de 5 con testículos descendidos en ratas normales sin exposición a flutamida), 2) DT (muestra de 5 con testículo contralateral descendido a pesar de la exposición a la flutamida durante la gestación) y 3) UDT (muestra de 5 con testículos no descendidos con exposición a flutamida durante la gestación). Para evaluar el tejido testicular embrional y post pubertal los testículos fueron removidos en los días 18 y 20 dpc, y en 1, 7, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 17, 19, 21, 28 y 144 dpp. La espermatogénesis en las ratas consiste en 14 etapas, con la maduración desde la espermatogonia hasta el esperma maduro requiriendo aproximadamente 6 a 7 semanas después del nacimiento. Por lo tanto, evaluamos los hallazgos testiculares durante este periodo porque la maduración de la espermatogénesis dramáticamente cambia entre el feto y el adulto. Después de la remoción, la mitad de los testículos fueron congelados en nitrógeno líquido, y la otra mitad fueron fijados en solución de Bouin y embebidos en parafina. Todos los procedimientos experimentales fueron ejecutados en acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité de Protección Animal de la Universidad de la Ciudad de Nagoya, graduados de la escuela de ciencias médicas.

Evaluación de la histopatología e inmunoquímica testicular


Las secciones de 5 micras de testículo fijados fueron teñidas con hematoxilina-eosina. También medimos alrededor de 100 diámetros de túbulos seminíferos de los túbulos seminíferos seleccionados aleatoriamente en cada sección de tejido. Para localizar el UTF1 en los testículos de ratas usamos un anticuerpo policlonal de conejo UTF1 (1: 500, ab24273, Abcam). Tres urólogos (YK, MI y KM) expertos en histopatología testicular evaluaron las tinciones de hematoxilina-eosina también conocido como inmunohistoquímica de UTF1. Estaban cegados en la rama del estudio, no sabían cuáles muestras eran de DT o UDT, seleccionaron alrededor de 100 túbulos seminíferos aleatoriamente y calcularon las tasas de negatividad a positividad de UTF1 en las espermatogonias adultas tempranas. Otro urólogo (HK) usó el promedio de los datos para generar los resultados finales.

Tiempo-Real RT-PCR

El Tiempo-Real RT-PCR fue ejecutado con un simple filamento de cDNA preparado usando la SuperScript First-Strand Synthesis System. Las reacciones de PCR fueron ejecutadas usando Power SYBR (marca registrada) Green PCR Master Mix y un 7500 Fast Real-Time PCR System (aplicado a biosistemas, Tokyo, Japón). El UTF1 y el Gapdh (control interno) cebadores fueron designados usando el software de Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi).

La pareja de cebado usada fue UTF1 fw: 5=-TTG CTC CCC AGT CTC TGA AT, rv: 5=-GAG AAA CGG TTT GGT CGA AG (78 bp), Gapdh fw: 5=-GTG GTG CCA AAA GGG TCA T, rv: 5=-ATT TCT CGT GGT TCA CAC CCA (150 bp). La autenticidad de los fragmentos ampliados fue confirmada por análisis de la curva de fusión y electroforesis. Para cuantificar los productos PCR usamos el método comparativo de ciclo umbral de acuerdo a las instrucciones suministradas por Biosistemas Aplicados.

Análisis Western-Blot

El análisis de Western-Blot fue realizado como fue descrito. Extrajimos la proteína de los testículos de las ratas usando la lisis del cultivo celular reactivo (Promega, Madison, Wisconsin) siguiendo las instrucciones de manufactura. Las muestras fueron separadas por electroforesis a través del gel SDS-PAGE y la proteínas fueron a continuación transferidas en membranas de difluoruro de polivinilo (Immobilon marca registrada). Las membranas fueron incubadas con anticuerpos policlonales de UTF1 (dilución 1:500). Las bandas proteicas fueron visualizadas con el kit de análisis de ECL de Western-Blot (Pierce Biotechnology, Rockford, Illinois) siguiendo las instrucciones de manufactura.

Análisis estadístico

Para la comparación de múltiples grupos paramétricos fue utilizado ANOVA. Cuando los valores de ANOVA fueron significativos, las diferencias individuales fueron evaluadas usando el test de Bonferroni-Dunn con una significación estadística indicada en p < 0,05.

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi


RESULTADOS

Examinamos los hallazgos histológicos y la expresión de patrones de UTF1 en DT normal. En los días 20 dpc y 7 dpp los gonocitos residían en el centro de los túbulos seminíferos pero no en otros tipo de células germinales estuvieron presentes (fig 1, a). En el día 9 dpp los gonocitos gradualmente se diferenciaron en espermatogonias adultas tempranas, las cuales aparecieron en las membranas basales de los túbulos. Casi todos los gonocitos disminuyeron por los días 21 a 28 dpp. Dilucidamos que esta transformación fue prominente en el día 9 dpp en los testículos de las ratas normales, indicando que este periodo fue importante para la etapa temprana de la espermatogénesis en la rata.

Para cuantificar los niveles de expresión de UTF1 durante el desarrollo testicular, el tiempo-real RT-PCR fue realizado. En los días 18 y 20 dpc la UTF1 fue altamente expresada pero disminuyó con el desarrollo de los testículos (fig 2, A). También realizamos el Western Blot para determinar los niveles de expresión de UTF1 y se le encontró abundante alrededor del nacimiento, gradualmente disminuyendo con el desarrollo testicular. La UTF1 fue expresada hasta el día 144 dpp (fig 2, B). Cada uno de los resultados indica que la función SC es más activa en el periodo neonatal.

Ejecutamos la inmunohistoquímica para evaluar la expresión de UTF1 durante el desarrollo testicular en las ratas con normal DT (fig 1, b). El número de células positivas con UTF1 también disminuyó con el desarrollo testicular (fig 2, C). El núcleo de todos los gonocitos fueron fuertemente teñidos con anticuerpos de UTF1. En contraste, observamos los positivos UTF1 bien conocidos como UTF1 negativos de espermatogonias adultas tempranas (fig 1). Todas las espermatogonias diferenciadas, espermatocitos, células de Sertoli y células de Leydig no fueron detectadas la expresión de UTF1, indicando que los gonocitos y algunas espermatogonias adultas tempranas poseen actividad SC.

Entonces comparamos los hallazgos histológicos y los patrones de expresión de UTF1 entre los testículos de control, DT y UDT. No hubo diferencia en los hallazgos histológicos entre los testículos de control (testículos descendidos de ratas normales sin exposición a flutamida) y DT (testículo descendido contralateral a pesar de la exposición de la flutamida durante la gestación). Las diferencias entre los túbulos seminíferos no fueron estadísticamente significativas entre los grupos control, DT y UDT (datos no mostrados). Este resultado indica que la exposición a flutamida durante el periodo fetal no inhibió el crecimiento testicular en el periodo neonatal.

Para dilucidar la actividad SC testicular y localizar las SSCs contamos con los gonocitos positivos para UTF1 y espermatogonias adultas temprana en cada grupo a los 9 días pp, y comparados los patrones de expresión de UTF1 (fig 1). El total del número de células de UTF1 positivo no fue significativamente diferente


entre los 3 grupos en cualquier etapa (datos no mostrados). Sin embargo, la tasa de gonocitos tempranos y espermatogonias adultas fue significativamente más alta en el grupo de UDT (0.29 +/- 0.09) que en el grupo de control (0.20 +/- 0.07, p= 0.028) y el grupo DT (0.19 +/- 0.10, p= 0.031), indicando que la diferenciación de los gonocitos en espermatogonias adultas tempranas fue alterada en UDT (fig 3, A). En contraste, la tasa de espermatogonias adulta temprana negativa para espermatogonias adultas tempranas fue significativamente más alta en el grupo de UDT (0.69 +/- 0.04) que en el grupo de control (0.46 +/- 0.10, p= 0.037) y el grupo de DT (0.44 +/- 0.05, p= 0.022), indicando que el número de casos de espermatogonia que poseen actividad SC fue disminuyendo en el grupo de UDT (fig 3, B).

Para examinar la actividad de SSC después de la germinación de la diferenciación celular evaluamos la patología testicular en el día 28 dpp en cada grupo. El número promedio de espermatogonias adultas con UTF1 positivo en los túbulos seminíferos fue más bajo en el grupo de UDT (0.49 +/- 0.12) que en grupo de control (0.92 +/- 0.07, p= 0.013) y el grupo DT (0.81 +/- 0.07, p= 0.032), indicando que el número de espermatogonias adultas con actividad SC también fue disminuyendo en el grupo de UDT en esta etapa y, como resultado, la actividad total de SSC fue disminuyendo (fig 3, C). Estos resultados sugieren la criptorquidia altera la diferenciación de los gonocitos en etapa temprana o en las espermatogonias del adulto como bien la actividad de las SSC.

DISCUSIÓN

La fertilidad masculina en últimas requiere el auto renovación y diferenciación de las espermatogonias adultas. Así como la espermatogonia temprana (Ad espermatogonia) han sido identificados como SSCs como marcador potencial de fertilidad. Estudios en ratones han demostrado que esas células podrían ser usadas para aumentar la fertilidad masculina. Sin embargo para nuestro conocimiento la actividad de la espermatogonia temprana (Ad espermatogonia) SSC no ha sido investigada como un factor contribuyente para la criptorquidia. En este estudio determinamos la transcripción y los patrones de la expresión proteica UTF1 en los grupos DT y UDT para evaluar la actividad SSC. La UTF1 es un transcriptor coactivador expresado en células pluripotenciales embrionarios y extraembrionarios. Es responsable de la rápida proliferación de SCs embrionarias y contribuye a la autorenovación regulando la proliferación celular. Experimentos con UTF1 con corta interferencia de RNA en ratones con embriones SC y una línea de células carcinoma embrionario resulta en un retraso sustancial o bloqueo de la diferenciación de células. Los testículos también muestran UTF1 durante todas las etapas del desarrollo y específicamente identifica SSCs testicular.


Examinamos la expresión UTF1 para evaluar la actividad de SSC en el grupo DT normal durante el desarrollo testicular y demostró que todos los gonocitos y algo de las espermatogonia tempranas expresaron UTF1 en el núcleo. Además, la expresión de UTF1 fue fuerte durante la embriogénesis y el periodo neonatal pero disminuyó durante el desarrollo testicular. Interesantemente un pequeño número de espermatogonia tempranas siguió expresando UTF1 hasta la adultez. Esos resultados sugieren que la expresión perinatal UTF1 representa una diferenciación celular germinal durante las etapas previas del desarrollo testicular. Por el contrario, en testículos adultos poca espermatogonia permanece para actuar como SSC y mantener la espermatogénesis durante este periodo. Así, la UTF1 positiva temprana podría mantener la fertilidad durante mucho tiempo en el tiempo de vida de un hombre.

También demostramos que la presencia de 2 fenotipos de (Ad) espermatogonia temprana en testículos normales se caracterizaba por inmunotinción con UTF1 detectable. El sistema involucrando (Ad) espermatogonia temprana poseyendo o sin poseer actividad SC se describió por Nakgawa como “actuales y potenciales compartimientos SC” en espermatogénesis normal el potencial SC no está limitado a las células que se autorenovan en el nicho SC (SC actual). Además una subpoblación del tránsito de las células amplificadoras (SC potenciales) que no se autoregeneran puede poseer la habilidad de funcionar como SC. Los autores propusieron que las SC potenciales tenían un rol en la robustez del sistema actuando como red de seguridad para la pérdida de SC actuales. Por lo tanto, consideramos que la espermatogonia (Ad espermatogonia) temprana positiva y negativa corresponde al actual y potencial SC respectivamente.

Para comparar las actividades de las SSC entre los grupos DT y UDT nosotros evaluamos la expresión UTF1. Nuestro estudio histológico demostró que la diferenciación de gonocitos en espermatogonia temprana o Ad espermatogonia, la cual fue observada en el día 9 dpp en las ratas con DT, fue alterada en UDT. Además la relación de espermatogonia adulta negativa para UTF1 a la espermatogonia temprana adulta positiva fue significativamente mayor en el grupo UDT que en el DT en ratones y pacientes humanos con UDT, sugiriendo que el número de (Ad espermatogonia) temprana con actividad SC disminuyó en el grupo con UDT. De manera interesante el número de espermatogonia adulta con actividad SC también disminuyó en el grupo de UDT 28 días después del nacimiento. Esos resultados sugieren que la etapa temprana de espermatogénesis en la criptorquidia ya está alterada durante el periodo neonatal. Así una adecuada espermatogénesis falla en el progreso después del desarrollo testicular en el UDT,


llevando potencialmente a la infertilidad masculina en algunos pacientes en la adultez.

La figura 4 representa nuestro modelo hipotético para la espermatogénesis durante el desarrollo testicular temprano, y la patofisiología de DT y UDT. En DT normal los gonocitos se transforman en espermatogonia indiferenciadas formados por SCs actuales y SCs potenciales. Las SCs actuales reproducidas ejercen actividad SSC y permanecen indiferenciadas. Durante el desarrollo testicular normal la espermatogénesis continua y finalmente lleva a la producción de esperma. La función del SSC es requerida para inducir una espermatogénesis óptima, así que es razonable suponer que es importante mantener la actividad de SSC durante la maduración de las células germinales. Con pérdida de SCs actual, SCs potencial cambiaría de estado de amplificación transitoria a auto renovación, obteniendo como resultado el nacimiento de SCs actuales. Este mecansimo contribuye al mantenimiento de una espermatogénesis normal. Sin embargo, nuestro estudio muestra que en el UDT no solo la diferenciación de los gonocitos a espermatogonias adultas tempranas sino también la actividad de las SC de la espermatogonia indiferenciada están alteradas. Porque la disminución de la UTF1 positiva en las espermatogonias tempranas en el UDT indica una disminución en las SC actuales, la reversibilidad en la actual espermatogonia y/o el modo potencial de autorenovación de las SC actuales muy ser perturbado en el UDT en la etapa temprana del desarrollo testicular. La disminución de la actividad de las SSC puede resultar en futura infertilidad en algunos pacientes con UDT. Las pacientes quienes la reparación espontánea de este sistema después de la orquipexia podrían ocurrir ganando la fertilidad en la adultez.

No obstante, hay muchas limitaciones en nuestro estudio y algunas cuestiones permanecen. Fuimos capaces de revelar detalles del mecanismo de este sistema durante la etapa temprana de la espermatogénesis. En adición, si la orquiopexia puede mejorar la disminución de la actividad de las SSC es desconocida. Finalmente, nuestro modelo en ratas puede no necesariamente reflejar el DT humano. Mucho permanece por ser descubierto para aclarar las respuestas a estas preguntas.

CONCLUSIÓN

En los testículos con criptorquidia la diferenciación desde los gonocitos hasta la espermatogonias tempranas, bien conocida como la actividad de las SC fue alterada durante las etapas tempranas de la espermatogénesis, sugiriendo que la


pérdida de la actividad de las SSC resulta en la alteración de la espermatogénesis, y puede prevenir el desarrollo de la fertilidad en la criptorquidia.

FIGURAS

Figura 1

a) Son secciones testiculares prenatales o postnatales teñidas con HE

b) Es la realización control con los anticuerpos de UTF1

c) Es el grupo con DT

d) Es el grupo con NDT


Figura 2

Patrones de expresión en testículos de ratas normal.

A) RT-PCR, en testículos de ratas normales, valor normal de UTF1 con desarrollo testicular apropiado, en comparación al número de días embrionarios y postnatales.

B) Análisis de Western Blot de UTF1 en testículos de ratas normales con desarrollo testicular apropiado.

C) UTF1 positivo número de células en ratas normales en sus túbulos seminíferos en función de los días.


Figura 3

Comparación de los hallazgos histológicos y los patrones de la expresión UTF1 a través de control, grupos DT y UDT. A, relación de gonocitos a espermatogonia temprana a 9dpp. B, relación de Utf1 espermatogonia negativa a UTF1 positiva a 9 dpp. C, relación de UTF1 espermatogonia positiva temprana en los túbulos seminíferos en el día 28dpp.

Figura 4

A, modelo para la espermatogénesis durante el desarrollo temprano testicular y fisiopatología del DT. B, UDT. Modelo que ilustra la transformación alterada de los gonocitos a espermatogonias tempranas, autorenovación de las SC actuales y modo intercambio de SC pontenciales, lo que posteriormente resulta en infertilidad en el hombre con UDT.

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