Deteksi Non-Halal transglutaminase Plasma dalam Terpilih Surimi Berbasis Produk dengan menggunakan Metode Sandwich ELISA

Abstrak: Penggunaan non-halal transglutaminase plasma untuk memperbaiki sifat gel yang dari surimi adalah dilarang untuk konsumen muslim. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mendeteksi non-halal transglutaminase plasma dalam produk surimi. Sebanyak 12 sampel diuji menggunakan DEAE, Unosphere Q dan Macroprep BioScale Tinggi Q kolom dan selanjutnya dikonfirmasi dengan metode ELISA Sandwich. Tiga berbeda antibodi monoklonal (mAbs) spesies yang sapi, ayam dan babi yang digunakan untuk mengamati reaksi terhadap sampel. Reaktivitas antibodi terhadap antigen itu didefinisikan dalam rentang tertentu dari nilai cutoff yang sangat kuat, kuat, sedang, lemah dan negatif. Dengan menggunakan mAbs dari spesies yang berbeda, hasilnya menunjukkan S1, S2, dan S3 tidak mengandung transglutaminase dari sapi sedangkan sampel lain lakukan. Enam sampel yang S1, S2, S3, S8, S11 dan S12 dipilih dalam prosedur ELISA memiliki reaksi yang sangat kuat dengan transglutaminase dari spesies babi. Untuk mAbs spesies ayam, S12 memiliki reaktivitas lemah, sementara sampel lainnya menunjukkan reaksi yang sangat kuat dan kuat transglutaminase. Sandwich ELISA dapat menjadi metode yang berguna untuk mendeteksi keberadaan transglutaminase di produk berbasis surimi, yang berasal dari darah spesies yang berbeda dari hewan mamalia. Studi lebih lanjut harus dilakukan untuk mengoptimalkan spesifisitas antibodi yang digunakan dalam konfirmasi TGase di surimi.

Kata kunci: Surimi, Antibodi monoklonal, Tekstural, Sandwich ELISA

PENDAHULUAN

Surimi menyediakan sumber terbesar dari bahan protein. Hal ini dibuat dari daging ikan mekanis de-bertulang yang dicuci dengan air dan dicampur dengan krioprotektan. Hal ini dapat digunakan sebagai bahan baku serbaguna untuk memproduksi berbagai jenis nilai tambah produk makanan laut [1]. Surimi dari berbagai spesies telah digunakan di berbagai negara untuk memproduksi produk-produk berbasis surimi seperti ikan kue, bakso ikan, burger ikan, sosis ikan, mie ikan, tongkat imitasi kepiting dan udang ekor imitasi [2]. Surimi memiliki fungsi termasuk gelling, mengikat dan emulsifying sifat dan dapat digunakan sebagai bahan protein fungsional dalam beberapa produk. Ini juga merupakan tiga-dimensi otot jaringan protein.

Karakteristik tekstur dinyatakan dalam hal kekuatan gel adalah penentu utama untuk kualitas surimi dan harga [3]. Aditif protein telah banyak digunakan untuk memaksimalkan kekuatan gel surimi. Aditif berfungsi sebagai inhibitor proteinase dan / atau sebagai peningkat gel. Inhibitor yang paling sering digunakan adalah plasma protein bovine (BPP), putih telur dan tepung kentang whey protein konsentrat [4, 5]. Benjakul et al. [6] melaporkan bahwa penambahan babi plasma protein (PPP) akan meningkatkan kekuatan gel surimi. Selain itu, PPP ayam protein plasma (CPP) mampu meningkatkan kekuatan gel dengan bertindak sebagai pengisi di surimi gel matriks dan juga sebagai inhibitor proteinase [7].

Penelitian sebelumnya telah melaporkan bahwa plasma darah mengandung jenis senyawa bioaktif termasuk inhibitor proteinase dan plasma transglutaminase [6, 8]. Jiang dan Lee [9] dimurnikan transglutaminase (plasma faktor XIII) sebagai mungkin oleh-produk plasma babi dan menunjukkan bahwa transglutaminase, diaktifkan dengan trombin dan Ca 2 +, silang kovalen terkatalisis MHC dan secara substansial meningkatkan kekuatan gel makarel cincang . Transglutaminases (TG: EC 2.3.2.13, protein glutamin: amina-glutamyltransferase) adalah kelompok enzim tiol yang mengkatalisis modifikasi pasca-translasi protein terutama oleh protein untuk protein silang, tetapi juga melalui konjugasi kovalen dari poliamina, lipid esterifikasi, atau deamidation residu glutamin [10-12].

Dalam rangka untuk melindungi konsumen Muslim dari non-halal aditif protein, deteksi aditif harus dilakukan. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk deteksi Enzim-linked Immunosorbent assay (ELISA). Enzim-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) metode immunoassay teknik yang digunakan untuk deteksi atau kuantifikasi suatu zat berdasarkan specific antigen-antibodi reaksi [13]. ELISA, sebagai alat fundamental dan kuat, sudah banyak digunakan di berbagai bidang seperti kedokteran, farmasi, ilmu lingkungan dan pertanian. Ilmuwan makanan telah berhasil diterapkan metode ELISA dalam spesiasi daging selama lebih dari dua dekade [14]. Penelitian ini akan fokus pada masalah non-halal aditif protein dengan mengembangkan metode sandwich ELISA untuk mendeteksi keberadaan protein yang aditif non-halal pada produk surimi berbasis.

BAHAN DAN METODE

Sampel Persiapan: Sampel dibeli dan dipilih secara acak. Mereka disiapkan oleh pencampuran dan disimpan dalam-20A ° C sampai dibutuhkan. Sampel diberi label sebagai S3 S1, S2,, S4,, S5 S6, S7, S8, S9, S10, S11 dan S12.

Contoh Ekstraksi transglutaminase: Persiapan transglutaminase mentah (TGase) dilakukan berdasarkan metode Worratao dan Yongsawatdigul [15]. Sampel ikan dihomogenkan dengan empat volume buffer ekstraksi (10 mM NaCl, 5 mM EDTA, 2 mM DTT dan 10 mM Tris-HCl, pH 7,5). Homogenat disentrifugasi (Allegra 25R Beckman Coulter) pada 14.000 g selama 30 menit pada suhu 4 ° C untuk memisahkan fase cair atau supernatan dari fase padat. Protein itu dalam supernatan. Selanjutnya, protein mengandung supernatan yang transglutaminase adalah disentrifugasi pada 14.000 g selama 60 menit pada suhu 4 ° C untuk desalting. Supernatan digunakan sebagai TGase mentah.

Pemutaran Protein Tgase dari Ekstrak mentah: Dalam hal ini studi, pemurnian Tgase dilakukan berdasarkan Worratao dan Yongsawatdigul [15]. Pemurnian protein dilakukan dengan menggunakan kromatografi tekanan rendah (Model 2110, Bio-Rad, Richmond, CA, USA) sistem sesuai dengan puncak fraksi. Fraksi yang menunjukkan puncak diduga mengandung protein bunga. Fraksi sampel selanjutnya dianalisis dengan menggunakan kolom yang berbeda untuk menentukan bahwa protein itu TGase. The TGase kasar diterapkan pada tiga kolom termasuk kolom UNOsphereâ "¢ Q (Bio-Rad, Richmond, CA, USA), Makro-prepa ® Tinggi Q kolom (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) dan Makro-prepa ® DEAE Kolom (Bio-Rad, Richmond, CA, USA) untuk menentukan adanya TGase secara terpisah.

The TGase kasar diterapkan ke masing-masing kolom disetimbangkan dengan 10 mM NaCl, EDTA 5mm, 2 mM DTT, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5 (buffer A). Tingkat aliran 1mL/min dipertahankan. Setelah dicuci dengan dua volume tidur buffer A, komponen yang terikat dielusi dengan gradien linier dari 0-5 M NaCl. Fraksi 3 mL dikumpulkan dengan menggunakan kolektor fraksi (Bio-Rad, Richmond, CA, USA). Fraksi yang memiliki puncak TGase dikumpulkan.

Protein Jumlah Pengukuran: Jumlah kandungan protein diukur dengan menggunakan Metode Bradford (1976). Dalam pengujian ini, bovine serum albumin (BSA-Sigma) yang digunakan sebagai standar. Ini serum albumin Bovine (BSA) solusi di lima konsentrasi termasuk 0 (Âμg / mL), 32 (Âμg / mL), 48 (Âμg / mL), 64 (Âμg / mL) dan 80 (Âμg

/ mL) yang dibuat dengan menambahkan volume tertentu air suling dengan jumlah tertentu dari nilai absorbansi BSA powder.The OD ini konsentrasi 5 dari BSA dibacakan oleh spektrofotometer dan kurva standar selanjutnya diplot. Konsentrasi protein total dievaluasi berdasarkan kurva standar. Deteksi TGase oleh Prosedur Sandwich ELISA:

Deteksi TGase dilakukan dengan menggunakan metode ELISA sandwich yang sesuai dengan prinsip-prinsip MP Biomedicals. Setelah screening dengan menggunakan 3 kolom, ekstrak kasar mengandung protein TGase yang selanjutnya dianalisis dengan sandwich ELISA. Beberapa ekstrak kasar dari sampel lainnya yang dipilih secara acak yang dimuat dalam kolom desalting Econo-Pac (Biorad) sebelum digunakan dalam prosedur ELISA.

Tabel 1: antibodi primer yang digunakan untuk Sandwich ELISA Jenis Primer antibodi

Termasuk keluarga sapi Tikus Anti Factor VIII C, Faktor VIII C, Antibodi monoklonal, 2A5

Seperti babi Tikus Anti Porcine tubulin Beta (N-Terminal), Beta tubulin (N-Terminal), antibodi monoklonal, TU-13

Ayam Tikus Anti Chicken MHC Kelas II antibodi monoklonal monomorfik, 21-1A6

Antibodi primer yang digunakan adalah Tikus Anti Chicken MHC Kelas II monomorfik, antibodi monoklonal, 21-1A6, Mouse Anti Factor VIII C, Faktor VIII C, Antibodi monoklonal, 2A5 dan Mouse Anti Porcine Beta tubulin (N-Terminal), Beta tubulin (N -Terminal), antibodi monoklonal, TU-13 untuk spesies tertentu seperti dirangkum pada Tabel 1. Antibodi ini diencerkan dengan buffer coating (10 mM buffer fosfat yang mengandung 145 mM NaCl, pH 7,2). Sebuah ÂμL 100 dari masing-masing antibodi diencerkan ditambahkan ke piring 96 microtitre baik (Costar, USA). Antibodi harus diarahkan terhadap antigen yang akan ditentukan. Piring ditutupi dengan plastik film atau aluminium foil sebelum semalam di C.After º suhu 4 inkubasi semalam, piring dicuci dan dibilas dengan 100 mM buffer fosfat yang mengandung 500 mM NaCl dan 0,1% Tween 20 pada pH 7,2 (Buffer B ) dua kali. 100 ÂμL standar sampel diencerkan dalam 100 mM buffer fosfat yang mengandung 500 mM NaCl dan 0,1% Tween 20 pada pH 7,2 sebelum ditambahkan ke setiap sumur. Piring kemudian ditutup dan dibiarkan pada suhu kamar selama sekitar 2 jam.

Dua antibodi sekunder yang digunakan adalah (1) Kambing Anti Tikus IgG, A, M: HRP, IgG IgA IgM, PolyclonalAntibody, Poliklonal IgG dan (2) Mouse Rabbit Anti (H dan L), IgG (H dan L), Antibodi Poliklonal yang dikonyugasikan dengan Peroksidase Horseradish (HRP). Setelah inkubasi 2 jam, 100 ÂμL antibodi sekunder dilusian (dalam 100 mM penyangga asam sitrat-fosfat pada pH 5,0) selanjutnya ditambahkan dalam setiap sumur. Antibodi sekunder harus diarahkan terhadap antigen yang akan ditentukan. Piring kemudian ditutup dengan plastik film atau aluminium foil dan dibiarkan pada suhu kamar selama sekitar 1 jam sebelum dicuci dengan buffer B.

Setelah langkah mencuci, 100 ÂμL substrat chromogenic (OPD) ditambahkan ke setiap sumur. Piring itu ditutupi dan dibiarkan pada suhu kamar selama 15 menit atau sampai warna telah dikembangkan. Piring itu terlindung dari cahaya selama periode ini. Reaksi ini kemudian dihentikan dengan menambahkan 150 ÂμL dari asam sulfat 1 M untuk setiap nilai optik well.The kemudian diukur dalam waktu 3 jam pengembangan warna dengan menggunakan ELISA plate reader (Elx 800 Biotek) pada 490 nm dalam waktu 3 jam dari pengembangan warna.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Pemutaran transglutaminase (TGase) protein dari ekstrak kasar: Protein TGase ditentukan berdasarkan kolom yang berbeda dan gradien NaCl. TGase dimurnikan dengan menggunakan tiga kolom, termasuk Unospehere Q, Macroprep Tinggi Q dan Macroprep DEAE kolom ini memiliki ukuran pori yang berbeda. Puncak yang dielusi yang diterapkan ke kolom. Kolom dielusi bahwa puncak adalah anion kolom penukar. Ukuran pori kolom bahwa puncak dielusi ditunjukkan pada Tabel 2.

Puncaknya dielusi menunjukkan bahwa sampel memiliki sifat anionik (Gambar 1a, b, dan c). Unospehere Q, Q Macroprep Tinggi, Makro dan DEAE Macroprep kolom berbatasan dengan protein yang menarik yang TGase. Worratao dan Yongsawatdigul [15] memperoleh puncak tunggal TGase yang dari Tropical nila (Oreochromis niloticus) dengan menggunakan DEAE-sephacel kolom.

Dalam kolom Q Unospehere, TGase aktivitas yang dielusi sebagai puncak pada fraksi 1 dan 2, sementara di Macroprep puncak kolom Q Tinggi dielusi pada fraksi 1. Untuk kolom DEAE Macroprep, itu menunjukkan puncak dielusi bagian mana dari mereka adalah pada fraksi 6 dan 13. Puncak dielusi untuk kolom Q Unospehere dan Macroprep Tinggi kolom Q ditemukan dalam sampel 12. Sementara itu Macroprep kolom DEAE dielusi puncak dalam sampel 2. Kedua sampel dianalisa lebih lanjut dengan Sandwich ELISA.

Komponen yang terikat dielusi dengan gradien linier dari 0-0,5 M NaCl. Hasil penelitian menunjukkan bahwa puncak yang terelusi dalam kolom Unosphere Q dan Macroprep Tinggi Q antara 0,1-0,25 M NaCl. Untuk Macroprep kolom Q Tinggi puncak dielusi antara 0,4-0,5 M NaCl. Penelitian yang dilakukan oleh Worratao dan Yongsawastdigul [15] juga dielusi dengan gradien linier NaCl dalam pemurnian Tropis nila (Oreochromis niloticus) antara 0,15-0,20 M dengan menggunakan DEAE-sephacel kromatografi.

Tabel 2: Jenis kolom dan ukuran pori (Âμm)

Jenis kolom Ukuran pori (Âμm) Unospehere Q 120Âμm Macroprep Tinggi Q, 50Âμm Macroprep DEAE 50Âμm

Kesimpulannya, puncak dielusi menunjukkan bahwa kehadiran protein yang menarik, yaitu TGase ditemukan dalam sampel 12 untuk Unospehere Q kromatografi dan Macroprep Tinggi Q kromatografi. Kehadiran protein bunga diperoleh pada sampel 2 untuk Macroprep DEAE kromatografi. Sampel done.All untuk mengkonfirmasi sumber TGase berasal dari darah, langkah lebih lanjut dari ELISA akan

menunjukkan tidak ada perbedaan antara sarana yang menyatakan pentingnya non berbeda dalam konsentrasi protein mereka.

Gambar 2 menunjukkan bahwa sampel mengandung 7 konsentrasi protein tertinggi di antara sampel yang berbeda. Namun, ia memiliki kotak terbesar yang berarti deviasi standar tertinggi dengan nilai adalah 813,0. Ada banyak tumpang tindih antara konsentrasi protein dari sampel. Contoh 3 memiliki konsentrasi protein terendah di antara sampel yang berbeda dengan standar deviasi 357,9. Konsentrasi protein selalu berhubungan dengan sifat gelling dari surimi. Sebuah penelitian yang dilakukan oleh Luo et al [16]. Menunjukkan bahwa konsentrasi protein memiliki efek positif besar pada kekuatan melanggar dan jarak pada surimi yang dihasilkan dari ikan mas perak.

Deteksi Tgase dengan menggunakan Sandwich ELISA:

Kekhususan antibodi yang digunakan adalah penting dalam mendeteksi kontaminasi non-halal Tgase dalam sampel. Antibodi monoklonal yang berbeda (mAbs) yang digunakan untuk mendeteksi TGase berasal dari sapi, babi dan ayam. Untuk identifikasi spesies daging, mAbs kekhususan dikenal akan memberikan penggunaan universal reagen yang konsisten dan akhirnya mengurangi biaya assay [18]. Antibodi memainkan peran untuk sandwich sampel yang bertindak sebagai antigen.

Reaktivitas dari babi, sapi spesifik dan antibodi terhadap antigen ayam yang ditunjukkan pada Tabel 3. Setiap nilai yang berada di kisaran tertentu yang diperoleh didefinisikan. Reaktivitas sangat kuat menunjukkan bahwa sampel curiga untuk memiliki non-halal plasma sesuai dengan kekhususan antibodi terhadap sampel dan sebagai gantinya.

Semua 7 diuji surimi menunjukkan pemalsuan dengan transglutaminase dari Porcine dan ayam. Dari 7 sampel, 4 diuji surimi menunjukkan pemalsuan dengan transglutaminase dari bovine (Tabel 3). Hasil penelitian menunjukkan bahwa S8, S9, S11 dan S12 reaktivitas yang sangat kuat sementara reaktivitas S1, S2 dan S3 adalah negatif sebagai antibodi sapi bereaksi terhadap sampel. Semua sampel menunjukkan reaktivitas yang sangat kuat sebagai babi antibodi diterapkan pada sampel kecuali sampel 9 yang hanya reaktivitas kuat. Untuk antibodi ayam, S1, S2, dan S8 S9 menunjukkan aktivitas yang sangat kuat dan reaktivitas kuat dengan S3 dan S11. Sampel lainnya yang S12 menunjukkan reaktivitas lemah terhadap antibodi.

Dari Tabel 3, ada sampel yang menunjukkan hasil positif yang sama untuk spesies yang berbeda. Molekul besar, seperti protein biasanya memiliki beberapa situs untuk mengikat antibodi. Pada protein tertentu, lebih dari 2 antibodi demikian mampu mengikat. Dalam kasus ini, TGase yang bertindak sebagai antigen mungkin memiliki epitop banyak yang bisa mengikat antibodi dari spesies yang berbeda [19].

KESIMPULAN

Dari penelitian ini ELISA, TGase terdeteksi pada beberapa sampel dengan reaktivitas yang berbeda karena berbagai cutoff. TGse berasal dari darah sebagaimana dibuktikan oleh reaktivitas dari tiga spesies antigen. Dengan menggunakan mAbs dari spesies yang berbeda, hasilnya menunjukkan S1, S2, dan S3 tidak mengandung TGase dari sapi sedangkan sampel lainnya lakukan. Enam sampel yang S1, S2, S3, S8, S11 dan S12 dipilih dalam prosedur ELISA memiliki reaktivitas yang sangat kuat dengan TGase dari spesies babi. Untuk mAbs spesies ayam, S12 memiliki reaktivitas lemah, sementara sampel lainnya menunjukkan reaktivitas yang sangat kuat dan kuat TGase. ELISA merupakan teknik yang cepat dapat

diandalkan, sangat sensitif dan spesifik untuk transglutaminase skrining. Konsumen Muslim harus waspada terhadap isu TGase di surimi terutama jika itu berasal dari sumber-sumber non-halal.

UCAPAN TERIMA KASIH Penelitian ini didukung oleh Fakultas Sains dan Teknologi, Universiti Sains Islam Malaysia dan Institute for Halal Penelitian dan Manajemen (Ihram), Universiti Sains Islam Malaysia.

REFERENSI Shaviklo dan R. Gholam, 2000. Produksi Manual produk Surimi dan surimi berbasis. Naghsh-e Mehr

publikasi. Teheran. Park, JW, J. Yongsawatdigul dan TM Lin, 2005. Surimi: Manufaktur dan evaluasi. Dalam: Editor Taman

JW. Surimi dan surimi sea food, Boca Raton: Taylor dan Francis Group, pp: 33-106. Lanier, TC, K. Hart dan RE Martin, 1991. Manual metode standar untuk mengukur dan menentukan sifat

surimi, University of North Carolina Program Universitas SeaGrant. Raleigh, NC. Morrissey, MT, JW Wu, DD Lin dan H. An, 1993. Pengaruh inhibitor protease food grade pada autolisis

dan kekuatan gel surimi. J. Food Sci, 58 (5):. 1.050-1.054. Weerasinghe, VC, MT Morrissey dan H. An, 1996. Karakterisasi komponen aktif dalam food grade PI

untuk surimi Industri. J. Agric. Makanan Chem, 44 (3):. 2.584-2.590. Benjakul, S., W. Visessanguan dan J. Srivilai, 2001. Porcine plasma protein sebagai gel enhancer dalam

kakap matabesar (Priacanthus tayenus) surimi. J. Makanan Biochem, 25 (4):. 285-308. Rawdkuen, S., S. Benjakul, W. Visessanguan dan TC Lanier, 2004. Ayam protein plasma mempengaruhi

gelasi dari surimi dari kakap matabesar (Priacanthus tayenus). Makanan hydrocolloids, 18 (2): 259-270.

Benjakul, S., W. Visessanguan dan C. Srivilai, 2001. Gel sifat kakap matabesar (Priacanthus tayenus) surimi yang dipengaruhi oleh pengaturan dan babi plasma protein. J. Makanan Qual, 24 (5):. 453-471.

Jiang, ST dan JJ Lee, 1992. Pemurnian, karakterisasi dan pemanfaatan plasma babi faktor XIII. J. Agric. Makanan Chem, 40 (12):. 1101-l 107.

Folk, JE dan SI Chung, 1985. Transglutaminases. Metode Enzymol, 113: 358-375.. Aeschlimann, DA dan M. Paulsson, 1994. Transglutaminase: Protein silang enzim dalam jaringan dan

cairan tubuh. Thromb. Haemost, 71 (4):. 402-415. Nemes, Z. dan PM Steinert, 1999. Bata dan mortir dari penghalang epidermal. Exp. Mol. Med, 31 (1):. 5-

19. Kemeny, DM, 1991. Sebuah Panduan Praktis untuk ELISA. NY: Pergamon Press. Whittaker, RG, TL Spencer dan JW Copland, 1982. Enzim-linked immunosorbent assay untuk pengujian

daging spesies. Aust. Vet. J., 59 (4): 125 DOI: 10.1111/j.1751-0813.1982.tb02748.x. Worratao, A. dan J. Yongsawatdigul, 2005. Pemurnian dan karakterisasi transglutaminase dari Tropical

nila (Oreochromis niloticus). Makanan Chem, 93 (4):. 651-658. Luo, Y., H. Shenb, D. Panc dan G. Bua, 2008. Gel sifat surimi dari perak ikan mas (Hypophthalmichthys

molitrix) yang dipengaruhi oleh perlakuan panas dan isolat protein kedelai. Makanan hydrocolloids, 22 (3): 1.513-1.519.

Belitz, HD, W. Grosch dan Schieberle, 2009.. Springer Berlin Heidelberg. Edisi 4. Makanan Chem. Martin, R., RJ Wardale, SJ Jones, PE Hernandez dan RLS Patterson, 1991. Antibodi monoklonal Sandwich

ELISA untuk mendeteksi potensi daging ayam dalam campuran daging sapi mentah dan daging babi. Daging Sains, 30 (1): 23-31.

Yeung, J., 2006. Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) untuk mendeteksi alergen dalam makanan. Dalam SJ Koppelman dan Hefle SL editor. Mendeteksi alergen dalam makanan. pp: 109-124. Cambridge: Woodhead Publishing Limited. R. de Luis et al. / Food Control, 20 (7): 643-647.