1

ANALISIS ASAM NUKLEAT Jeremia Jan Chandra Pranata, 1306414223 Teknik Kimia, Home Group Adenine ABSTRAK Asam nukleat merupakan molekul penting penyusun makhluk hidup. DNA dan RNA merupakan dua jenis asam nukleat yang berfungsi sebagai tempat penyimpanan informasi genetik. Keduanya dapat dianalisis dengan berbagai metode, baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Beberapa metode yang akan dibahas adalah staining, RFLP, southern dan northern blot, elektroforesis gel, hibridisasi, DNA/RNA sequencing, serta spektrofotometri, dan real-time PCR. Beberapa metode yang ada mampu mengukur tingkat kemurnian, kandungan, dan jumlah amplifikasi dari asam nukelat. Pembahasan akan meliputi penggunaan teknologi, batasan penerapannya, tingkat akurasi, sensitivitas, spesifikasi, dan biayanya. Dengan adanya kemajuan teknologi ini, DNA dan RNA mampu dimanfaatkan secara luas untuk berbagai keperluan, seperti deteksi sel kanker. Kata kunci: asam nukleat, DNA, RNA, staining, RFLP, southern blot, northern blot, elektroforesis gel, hibridisasi, DNA/RNA sequencing, serta spektrofotometri, real-time PCR, amplifikasi. ISOLASI ASAM NUKLEAT Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar dalam biologi molekular. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya. (Afiono, 2011) Protokol ekstraksi atau isolasi asam nukleat biasanya melibatkan proses fisik dan kimia. Proses tersebut biasanya dimulai dengan homogenisasi jaringan untuk meningkatkan jumlah sel atau permukaan area yang akan dilisiskan. Homogenisasi jaringan sangat berguna untuk mengekstrak asam nukleat dari organ atau jaringan. Langkah selanjutnya adalah permeabilisasi sel target. Permeabilisasi sel dapat dilakukan dengan menggunakan detergen non-ionik sehingga tidak mengikat asam nukleat seperti. Untuk melepaskan asam nukleat di dalamnya, sel perlu dilisiskan terlebih dahulu. Biasanya menggunakan bufer hipotonik. Langkah selanjutnya berupa degradasi dan presipitasi protein yang dapat dilakukan dengan pemanasan, enzime proteinase atau dengan menggunakan garam chaotropic. Asam nukleat yang diperoleh dapat dipresipitasi untuk dikonsentrasikan ke dalam volume yang lebih kecil. Presipitat yang sering digunakan adalah isopropanol, etanol, dan PEG (polyethylene glycol). Setelah dilakukan presipitasi, langkah terakhir adalah solubilisasi asam nukleat. Metode yang paling dikenal untuk ekstraksi/isolasi asam nukleat adalah metode fenol/khloroform/isoamilalkohol. Isolasi DNA Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim dan dilanjutkan dengan lisis sel. Isolasi DNA merupakan langkah untuk mempelajari DNA. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu super natan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell, 2002). Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Isolasi RNA Metode untuk ekstraksi RNA mirip dengan metode ekstraksi DNA. Namun, molekul RNA relatif pendek dan lebih sulit rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun begitu, RNA sangat mudah dicerna oleh RNase yang terdapat endogen dengan

2

konsentrasi yang bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari sehingga, untuk ektraksi RNA harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk segera mendenaturasi RNase yang ada. Alur isolasi RNA dari suatu jaringan dapat dilihat pada gambar 1. Proses deproteinisasi harus dilakukan secara lebih agresif karena RNA sering berikatan kuat dengan protein.

Penambahan DNase dapat digunakan untuk menghilangkan DNA. RNA kemudian dipresipitasi dengan etanol. Reagen yang sering digunakan untuk ekstraksi RNA adalah guanidinium thiocyanate yang merupakan inhibitor kuat RNase dan merupakan denaturan protein. Integritas RNA dapat dicek dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Spesies RNA yang terbanyak (molekul rRNA) berukuran 23S dan 16S untuk prokariot dan 18S dan 28S untuk eukariot. RNA tersebut akan tampak sebagai pita yang diskrit dalam gel agarose dan mengindikasikan komponen RNA lainnya masih utuh. Proses ini biasanya dilakukan dalam keadaan denaturasi untuk mencegah terjadinya formasi struktur sekunder pada RNA. RNA sangat sensitif terhadap nuklease. Semua basa RNA memiliki grup 2-hidroksil reaktif sehingga mudah terjadi reaksi kimia yang menghasilkan air dan merusakkan rantai gulanya. Yang perlu diingat, nuklease (RNase) relatif stabil di lingkungan dan bahkan kadang masih dapat bertahan setelah proses denaturasi panas dan ekstraksi fenol.

Gambar 1. Alur Isolasi RNA

3

A. ANALISIS KUALITATIF

1. STAINING Staining adalah proses identifikasi adanya DNA atau RNA dengan memberikan pewarna (dye) ke dalam sampel dan menganalisis warna untuk mengidentifikasi adanya DNA maupun RNA. Proses pemberian warna adalah dengan menyisipkan zat yang dapat mengeluarkan warna ke dalam DNA atau RNA. Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan, seperti etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, Eva Green, dan Acridin Orange. Etidium bromida Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel pada rantai DNA dan bersifat fluoresens di bawah cahaya UV. EtBr berikatan di antara basa hidrofobik pada nukleotida DNA dan memendarkan warna kuning atau jingga pada panjang gelombang 290 nm. EtBr merupakan senyawa mutagenik dan sangat berbahaya jika terpapar ke dalam tubuh manusia sehingga penggunaannya harus sangat hati-hati.

SYBR Gold SYBR Gold digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau RNA. SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat berikatan dengan asam nukleat. Pewarna ini dapat juga digunakan pada gel formaldehida. SYBR Green SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial sebagai mutagen. Oleh karena itu, pewarna ini harus ditangani dengan baik. SYBR Green I lebih cocok untuk digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green II lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA. SYBR Green bersifat 25 kali lebih sensitif dibandingkan dengan EtBr SYBR Safe SYBR Safe merupakan pewarna yang lebih aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ini memiliki tingkat sensitifitas yang sama dengan EtBr. Pewarna ini tidak bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan limbah. Pewarna SYBR Safe dapat digunakan dengan blue-light transillluminator yang mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang diamati dan lebih efisien untuk proses kloning selanjutnya. Eva Green Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR (Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil di dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan dengan DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki tingkat toksisitas yang rendah.

Gambar 2. Ethidium Bromide (EtBr)

4

Acridin Orange Pewarna lainnya adalah Acridin Orange (AO). Untuk analisis RNA, AO akan tereksitasi pada 460 nm dan memancarkan emisi 650 nm (merah). Untuk analisis DNA, AO akan tereksitasi pada 502 nm dengan emisi 565 nm dan memancarkan warna hijau. AO sendiri berikatan dengan asam nukleat pada pH = 3,5.

2. HIBRIDISASI Hibridisasi merupakan metode untuk menemukan gen tertentu di dalam DNA terdenaturasi yang berasal dari kromosom utuh dengan menggunakan suatu probe. Metode inimemanfaatkan kemampuan asam nukleat untuk membentuk molekul dengan dua rantai yang stabil ketika dua rantai tunggal dengan basa yang komplementer digabungkan dalam kondisi yang sesuai. Metode ini dilakukan pada media wadah tertentu (misal kaca preparat atau cawan petri). Probe adalah sekuens asam nukleat yang telah diberi label atau penanda yang digunakan untuk mendeteksi basa nitrogen dalam sekuens sampel DNA ataupun RNA. Probe memiliki urutan basa nitrogen yang komplementer terhadap urutan basa nitrogen DNA dan RNA sampel. Probe biasanya berupa mRNA atau single strained DNA (ssDNA). Probe biasanya terdiri dari 20-30 untaian basa dan diberi penanda radioaktif atau penanda pendar. Radioaktif isotop fosfor atau fosfodiester yang berikatan pada DNA.

Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu

Denaturasi (pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer)

DNA sampel dipisahkan menjadi rantai tunggal. DNA biasanya dipanaskan pada suhu 100C

atau dengan mengubah larutan tersebut dengan pH yang sangat tinggi (pH 13) untuk

memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat

akan terpisah. Selain itu, pemisahan juga dapat menggunakan enzim restriksi.

Renaturasi (perpaduan kembali dua rantai asam nukleat).

Probe dipasangkan dengan DNA sampel dan kemudian dia analisis. Dilakukan dengan cara

pendinginan.

Berdasarkan objek pengamatannya, hibridisasi dibedakan menjadi Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Metode ini menggunakan probe yang mengandung komponen ber-fluoresen. Komponen ini dapat berpendar jika dikenakan sinar UV sehingga lokasi gen yang dicari dapat diketahui. Adapun probe yang digunakan hanya berupa potongan asam nukleat pendek untuk jenis gen tertentu saja.

Genomic In Situ Hybridization (GISH) Prinsip dasarnya hampir sama dengan FISH, hanya saja komponen yang menjadi probe adalah keseluruhan genom DNA dari suatu spesies. Metode ini digunakan untuk memeriksa penyebaran genomic DNA interspesies dan organisasi sekuensnya.

Gambar 3. Acridin Orange (N3,N3,N6,N6-tetranetilacridina-3,6-diamina)

5

Untuk pengujian dengan hibridisasi, diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampur dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid.

Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau

membrane nitroselulosa. Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan

diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori

atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat. Semua fragment hasil

pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara

kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal. 3. BLOTTING Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari

gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi.

RNA Blotting dan DNA Blotting umumnya disebut dengan istilah Northern Blotting dan Southern

Blotting. Blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan

memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan dan untuk mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang

mengalami perubahan.

Northern Blotting Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA sequence) tertentu di antara kumpulan molekul RNA. Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Pada proses ini, RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan tertentu. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan. Hasil yang paling dalam pada penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Langkah Northern Blotting, yaitu Denaturasi atau pemisahan RNA di dalam sampel menjadi rantai tunggal.

Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak dalam posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul.

Gel elektroforesis Molekul RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode

RNA ditransfer dari gel ke blot membran.

Gambar 4. Hibridisasi Asam Nukleat

Gambar 5. Ilustrasi tahapan metode Northern Blotting

6

Membran dilalui proses probe. DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan harus memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. Dengan begitu, probe dapat terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran.

Probe mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul RNA lainnya pada membran.

Southern Blotting Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam sampel DNA. Analisis ini menggunakan dua komponen, probe dan DNA target (berasalkan dari berbagai organism). Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi dan studi pengembangan, forensik, diagnostik, dan modifikasi organisme.

Langkah Southern Blotting, yaitu

Isolasi DNA target.

DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan

enzim restriksi dan potongan DNA

divisualisasi ke dalam elektroforesis.

Hasil elektroforesis direndam ke dalam larutan asam pekat untuk memecah ikatan ganda

DNA menjadi utas tunggal.

Melalui prinsip kapilaritas, DNA dalam gel dipindahkan ke dalam membran.

Untuk mengetahui sekuen, gen harus diisolasi dan ditandai di salah satu sisi (penanda

menggunakan radioaktif, atau alkaline phosphatase). Identifikasi gen menjadi mudah karena

banyak genom sudah diketahui urutan sekuennya.

Probe dapat dibuat sekuen oligonukleotida yang unik dan diatur hanya untuk gen yang kita

targetkan. Jika probe yang digunakan berisikan ologinuklotida yang umum maka probe akan

menempel di sembarang tempat. Probe yang dipersiapkan untuk southern ditandai menggunakan

radioaktif, biotin atau digoxigenin. Metode ini mengkombinasikan elektroforesis gel agarosa untuk

memisahkan DNA berdasarkan ukurannya dan kemudian ditransfer ke membran filter untuk

selanjutnya dilakukan hibridisasi dengan probe. Probe yang dilabel akan hibridisasi pada pita-pita

DNA untuk mengetahui apakah DNA tersebut mengandung gen yang diinginkan

4. SENTRIFUGASI Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis molekul dengan

cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang lebih berat akan berada di dasar,

sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan

di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi.

Sentrifugasi merupakan proses penting dalam isolasi dan pemisahan sel. Sentrifugasi pada

pemisahan dan isolasi sel dapat menggunakan berbagai metode, yaitu metode sentrifugasi

perbedaan kecepatan, sentrifugasi bobot jenis bertingkat, sentrifugasi zonal, dan sentrifugasi

isopiknik. Metode sentrifugasi perbedaan kecepatan memiliki prinsip pemisahan sel berdasarkan

perbedaan ukuran organel sel dan densitas partikel. Partikel organel yang lebih rapat akan

membentuk pelet jika pada kecepatan yang lebih tinggi dibandingkan partikel organel yang lebih

besar atau renggang walaupun memiliki massa yang sama besar. Makin besar ukuran sebuah

partikel, maka makin besar gaya sentrifugal yang dialaminya. Oleh karena itu partikel yang memiliki

ukuran yang lebih besar akan terendapkan lebih awal di dasar tabung.

Gambar 6. Ilustrasi tahapan metode Southern Blotting

7

5. ELEKTROFORESIS

Teknik elektroforesis digunakan untuk memisahkan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan

perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik dan mempurifikasi makromolekul.

Makromolekul yang dijadikan objek elektroforesis adalah protein dan asam nukleat yang memiliki

perbedaan muatan, bentuk, ukuran, kadar ion, dan molekul-molekul penyusunnya. Molekul-molekul

tersebut diletakkan dalam di dalam medan listrik sehingga akan bermigrasi karena adanya

perbedaan muatan. Molekul protein dan asam nukleat yang bermuatan negatif akan bergerak dari

kutub negatif menuju kutub positif dari gel elektroforesis. Elektroforesis mampu memisahkan

molekul-molekul seperti protein atau fragmen asam nukleat pada basa berdasarkan kecepatan

migrasi melewati gel elektroforesis. Secara prinsip, elektroforesis merupakan tahap memisahkan

campuran bahan-bahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan

dilakukan terhadap campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda

Dari gambar di atas terlihat bahwa sampel DNA (asam nukleat) bergerak ke arah elektroda positif. Pergerakan/migrasi dari molekul-molekul asam nukleat tersebut bergantung pada berat molekul masing-masing molekul asam nukleat. Molekul yang memiliki berat lebih ringan (lebih panjang rantainya) akan bergerak lebih lambat daripada molekul yang memiliki berat molekul lebih besar. Dengan begitu, molekul asam nukleat dapat dibedakan atas berat molekulnya dengan cara membandingkannya dengan sampel standar (sudah diketahui berat molekulnya). Berat molekul asam nukleat sebanding dengan panjang rantainya sehingga asam nukleat juga dapat dibedakan berdasarkan banyaknya pasangan nukleotidnya. Semakin banyak pasangan nukleotid yang terkandung, maka akan semakin panjang pula rantainya.

Gambar 7. (a) Proses elektroforesis gel (b) Contoh hasil analisis elektroforesis gel

8

Terdapat beberapa jenis elektroforesis yang dapat digunakan untuk menganalisis makromolekul termasuk asam nukleat, yaitu elektroforesis gel agarosa, elektroforesis gel poliakrilamida, elektroforesis gel 2D, dan elektroforesis isoenzim. Metode elektroforesis gel agarosa merupakan metode yang paling umum (konvensional) yang dapat digunakan untuk menganalisis asam nukleat. Metode ini mampu memisahkan fragmen DNA yang berukuran lebih besar dari 100 pasang basa dan dijalankan secara horizontal. Elektroforesis poliakrilamid dapat memisahkan RNA atau DNA berukuran kecil atau memiliki nukleotida sebanyak 500 atau kurang. Elektroforesis poliakrilamid juga digunakan untuk menentukan urutan dua DNA (sequencing). Pemisahan DNA (asam nukleat) yang memiliki ukuran lebih dari 25 kb (kilo base) biasanya dapat dipenuhi dengan menggunakan teknik yang dinamakan pulsed-field electrophoresis, dimana teknik tersebut menyebabkan molekul DNA mengubah orientasi medannya selama migrasi berlangsung.

Langkah-langkah elektroforesis:

DNA dipotong-potong dengan enzim

restriksi sesuai dengan recognition site yang

diinginkan.

Sampel kemudian diletakkan dalam media

agar. Media agar yang digunakan adalah

media agarose dan poliakrilamid.

Sampel diletakkan pada kutub negatif

sumbu-sumbu agar.

Sampel diberi pemberat berupa larutan

buffer seperti polietilenglikol atau gliserin,

bromofenol biru dan aquades agar dapat

masuk ke gel dengan baik.

Gel kemudian dialiri listrik dan sampel DNA

akan bergerak menuju kutub positif.

Semakin panjang rantai DNA maka semakin

banyak pula waktu yang dibutuhkan untuk

menuju kutub positif.

Kemudian sampel diberi warna (staining)

agar dapat terlihat jelas.

Elektroforesis gel dapat digunakan untuk memisahkan asam nukleat berdasarkan ukurannya di

dalam agar atau gel poliakrilamida. Metode ini dapat memisahkan pecahan-pecahan asam nukleat

dengan ukuran 20 bp hingga 20 kb. Gel agarose ideal digunakan untuk pemisahan DNA, produk

PCR, dan gen DNA atau RNA sebelum dilakukan kloning, pengurutan (sequencing), Southern atau

Northern Blotting. Gel poliakrilamida dapat digunakan untuk elektroforesis gel poliakrilamida atau

PAGE.

Semua teknik elektroforesis membutuhkan arus listrik untuk menggerakkan molekul bermuatan

melalui matriks atau gel. Pada elektroforesis makromolekul, prinsipnya molekul yang lebih kecil akan

bergerak lebih cepat dan karena itu akan lebih jauh pada gel. Asam nukleat yang akan dianalisis

dimasukkan ke dalam gel agarose. Gel agarose tersebut akan berperean sebagai matrix untuk

menampung dan memisahkan molekul-molekul target. Gel tersebut dicelupkan dalam

ruang/peralatan elektroforesis beserta larutan penyangga yang memiliki arus listrik. Larutan

penyangga dibutuhkan untuk meminimalisir perubahan PH yang diakibatkan medan listrik dan untuk

mencegah gel menjadi terlalu panas akibat adanya arus listrik.

Gambar 8. Ilustrasi proses elektroforesis

9

Dalam metode elektroforesis, dibutuhkan pewarna untuk memudahkan penampakan molekul asam nukleat. Pewarna ini dibutuhkan karena molekul asam nukleat tidak memiliki warna. Terdapat beberapa pewarna yang dapat digunakan, beberapa diantaranya adalah bromophenol blue dan ethidium bromida. Pewarna bromophenol blue biasa digunakan untuk memonitor pergerakan molekul di dalam gel. Pewarna ethidium bromida merupakan pewarna fluoresens yang digunakan untuk proses staining pada DNA di gel agarose dan gel poliakrilamida.

6. PENGURUTAN DNA (DNA SEQUENCING) Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA (adenine, guanine, cytosine dan thymine) dalam segmen molekul DNA. Pengurutan (sequencing) asam nukleat memungkinkan kita mengetahui kode genetik dari molekul DNA. Saat ini teknik DNA Sequencing sudah memasuki tahap baru yang mengarah pada skala yang lebih besar atau high-throughput sequencing, jutaan bahkan miliaran basa nukleotida DNA dapat ditentukan urutannya dalam sekali putaran saja. DNA sequencing menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan (template) untuk kemudian diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR, namun ada penambahan beberapa pereaksi tertentu. Proses ini dinamakan cycle sequencing dimana primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang) seperti PCR dan ddNTPs (dideoxy-Nucleotide Triphosphate) adalah modifikasi dari dNTPs dengan menghilangkan gugus 3-OH pada ribosa. Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA cetakannya. Jika yang menempel adalah ddNTP maka otomatis proses polimerisasi akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3-OH yang seharusnya bereaksi dengan gugus 5-Posfat dNTP berikutnya membentuk ikatan posfodiester. Pada akhir cycle sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi. Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa. Ada dua metode yang dapat digunakan untuk mengurutkan molekul DNA. Metode Maxam-Gilbert

dan metode Sanger. Kedua metode tersebut menghasilkan fragmen-fragmen DNA dengan panjang

bervariasi, yang satu sama lain berbeda sebanyak satu basa tunggal. Dari fragmen-fragmen

tersebut kita dapat menarik kesimpulan mengenai sequence asam nukleat molekul DNA yang

diperiksa. Tekhnik yang digunakan adalah gel-gel poliakrilamid pendenaturasi (denaturing

polyacrylamide gels). Gel agarosa dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan perbedaan

panjang 30-50 basa, sedangkan gel poliakrilamid dapat memisahkan molekul-molekul DNA dengan

perbedaan panjang satu basa. Gel-gel pendenaturasi menyebabkan molekul DNA menjadi beruntai

tunggal dan tetap dalam keadaan seperti itu sepanjang proses elektroforesis. Gel pendenaturasi

mengandung urea dan dijalankan dengan suhu yang ditinggikan. Kedua hal tersebut mendorong

terjadinya pemisahan kedua rantai molekul DNA.

Gambar 9. DNA yang telah dianalisis

10

Metode Maxam-Gilbert Metode sekuensing DNA yang pertama dikenal adalah metode kimia yang dikembangkan oleh A.M. Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1977. Pada metode ini fragmen-fragmen DNA yang akan disekuens harus dilabeli pada salah satu ujungnya, biasanya menggunakan fosfat radioaktif atau suatu nukleotida pada ujung 3. Metode Maxam-Gilbert dapat diterapkan baik untuk DNA untai ganda maupun DNA untai tunggal dan melibatkan pemotongan basa spesifik yang dilakukan dalam dua tahap. Molekul DNA terlebih dahulu dipotong-potong secara parsial menggunakan piperidin. Pengaturan masa inkubasi atau konsentrasi piperidin akan menghasilkan fragmen-fragmen DNA yang bermacam-macam ukurannya. Selanjutnya, basa dimodifikasi menggunakan bahan-bahan kimia tertentu. Dimetilsulfat (DMS) akan memetilasi basa G, asam format menyerang A dan G, hidrazin akan menghidrolisis C dan T, tetapi garam yang tinggi akan menghalangi reaksi T sehingga hanya bekerja pada C. Dengan demikian, akan dihasilkan empat macam fragmen, masing-masing dengan ujung G, ujung A atau G, ujung C atau T, dan ujung C.

Metode Sanger Metode ini pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975, yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.

Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut di-running pada gel

elektroforesis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah. Urutan basa DNA dapat

ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai dari yang paling bawah (paling

pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer yang digunakan dilabel dengan radioaktif

atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer yang dilabel melainkan dNTP.

Gambar 10.Target DMS dan Hidrazin pada urutan basa DNA

Gambar 11. Proses siklus sequencing

11

Hal-hal yang perlu diperhatikan dalam proses DNA sequencing dengan metode Sanger:

DNA utas tunggal dalam jumlah cukup sebagai template DNA

Primer yang sesuai (sepotong kecil DNA yang berpasangan dengan template DNA dan berfungsi sebagai starting point untuk replikasi

DNA polymerase (enzim yang mengkopi DNA, menambahkan nukleotida baru ke ujung 3 dari template

Sejumlah nukeotida normal

Sejumlah kecil dideoxynucleotide yang dilabel (radioaktif atau dengan pewarna fluorescent) Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat dari salah satu subunit enzim DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah kemampuan untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuan untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi nukleotida juga akan kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen klenow dengan suatu molekul DNA maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa yang dibawa oleh molekul ddNTP. Sekuensi DNA menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang polimerisasi akan terhenti di tempat-tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang ukurannya bervariasi, tetapi ujung 3nya selalu berakhir dengan basa yang sama. 7. RESTRICTION FRAGMENT LENGTH POLYMORPHISMS RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) merupakan perbedaan pada homolog urutan DNA yang dapat dideteksi dengan menggunakan adanya perbedaan fragmen DNA yang telah dipotong dengan menggunakan enzim endonuklease tertentu. RFLP digunakan sebagai penanda molekular karena spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi. Aplikasi dari RFLP dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome typing, tes paternitas, forensik dan diagnostik hereditas penyakit. Tahapan RFLP meliputi 4 tahapan yaitu, isolasi DNA, pemotongan DNA dengan enzim restriksi endonuklease, elektroforesis hasil pemotongan DNA dan southern blot. B. ANALISIS KUALITATIF 1. POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR) PCR merupakan teknik perbanyakan (amplifikasi) potongan DNA secara in vitro (dalam tabung reaksi) pada daerah spesifik yang dibatasi oleh dua buah primer oligonukleotida. Primer yang digunakan sebagai pembatas daerah yang diperbanyak adalah DNA untai tunggal yang urutannya komplemen dengan DNA cetakannya. Metode ini merupakan metode yang paling sensitif untuk mendeteksi asam nukleat karena primer perbanyakan yang sesuai dapat diatur. Sensitivitas PCR mengikuti persamaan eksponensial berikut:

Nn = N0 x (1+E)n

Dimana Nn = jumlah molekul DNA setelah n siklus dari PCR N0 = jumlah molekul sebelum PCR E = efisiensi dari amplifikasi (0

12

polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan sepasang primer oligonukleotida. Selanjutnya, kedua primer akan saling mengenali dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir fragmen DNA target sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada DNA cetakan, DNA polimerase mengatalisis proses pemanjangan kedua primer dengan menambahkan nukleotida yang komplemen dengan urutan nukleotida cetakan. DNA polimerase mengatalisis pembentukan ikatan fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan gugus 5 fosfat dNTP yang ditambahkan sehingga proses penambahan dNTP yang dikatalisis oleh enzim DNA polimerase ini berlangsung dengan arah 53. Peristiwa ini disebut reaksi polimerisasi. Enzim DNA polimerase hanya akan menambahkan dNTP yang komplemen dengan nukleotida yang terdapat pada rantai DNA cetakan. Komponen proses PCR: 1. Enzim DNA Polymerase 2. Primer : oligonukleotida pendek rantai tunggal yang mempunyai urutan komplemen dengan DNA

template yang akan diperbanyak. 3. Reagen lainnya : dNTP untuk reaksi polimerisasi dan buffer yang mengandung MgCl2.

Konsentrasi ion Mg2+ sangat penting untuk mempengaruhi proses primer annealing, denaturasi, spesifisitas produk, aktivitas enzim, dan fidelitas reaksi.

Gambar 12. Amplifikasi Potongan DNA

13

Tahapan PCR: 1. Denaturasi

Selama proses denaturasi, DNA untai ganda membelah menjadi dua untai tunggal. Hal ini disebabkan suhu denaturasi yang tinggi mampu memutuskan ikatan hidrogen antara basa-basa yang komplemen. Akibat denaturasi, seluruh reaksi enzim tidak berjalan, misalnya reaksi polimerisasi pada siklus sebelumnya. Denaturasi biasanya dilakukan antara suhu 90oC 95oC.

2. Penempelan Primer (Annealing) Pada tahap ini, primer menuju ke daerah spesifik yang berkomplementer dengan urutan primer. Ikatan hidrogen akan terbentuk antara primer dengan urutan komplementernya pada template. Proses ini terjadi pada suhu 50oC 60oC. Selanjutnya, DNA polimerase akan berikatan sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus kembali apabila dilakukan reaksi polimerisasi selanjutnya, misalnya pada 72oC.

3. Reaksi polimerisasi (extension) Reaksi polimerisasi (perpanjangan rantai) terjadi pada suhu 72oC. Primer yang telah menempel tadi akan mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang komplemen dengan templat oleh DNA polimerase. Jika siklus dilakukan berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi secara eksponensial (disebut amplikon yang berupa untai ganda) sehingga mencapai jumlah salinan yang dapat dirumuskan dengan (2n)x dimana n adalah jumlah siklus dan x adalah jumlah awal molekul DNA.

PCR terbagi menjadi 2 macam, yaitu Real-Time PCR dan Real Competitive PCR. Real-Time PCR Real Time PCR adalah suatu metoda analisa yang dikembangkan dari reaksi PCR. Dalam ilmu biologi molekular, Real Time PCR (Quantitative Real Time Polymerase Chain Reaction atau Kinetic Polymerase Chain Reaction) adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisa. Cara kerja Real Time PCR yang utama adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi selesai. Terdapat dua cara yang umum digunakan: Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda

(dsDNA) misalnya SYBR Green Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan berpendar

(flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang dihasilkan.

Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) RT-PCR merupakan bagian dari proses PCR biasa. Perbedaannya dengan PCR yang biasa adalah pada proses ini berlangsung satu siklus tambahan yaitu adanya perubahan RNA menjadi cDNA (complementary DNA) dengan menggunakan enzim reverse transkriptase. Reverse Transcriptase adalah suatu enzim yang dapat mensintesa molekul DNA secara in vitro menggunakan cetakan RNA. Seperti halnya PCR biasa, pada pengerjaan RT-PCR ini juga diperlukan DNA polimerase, primer, buffer, dan dNTP. Namun berbeda dengan PCR, cetakan yang digunakan pada RT-PCR adalah RNA murni. Oleh karena primer juga dapat menempel pada DNA selain pada RNA, maka DNA yang mengkontaminasi proses ini harus dibuang.

14

2. SPEKTROFOTOMETRI Spektrofotometri adalah suatu metode analisis untuk mengukur konsentrasi senyawa berdasarkan

kemampuan senyawa tersebut mengabsorbsi berkas sinar atau cahaya. Alat ini terdiri dari

spektrofotometer dan fotometer. Spektrofotometer menghasilkan sinar dari spektrum dengan

panjang gelombang tertentu, sementara fotometer adalah pengukur intensitas cahaya yang

ditransmisikan atau diabsorbsi.

Spektrofotometer dilengkapi sumber cahaya atau gelombang elektromagnetik, baik cahaya UV

(ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible). Komponen utama dari alat ini adalah sumber

cahaya, pengatur intensitas, monokromator, kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar.

Keberadaan DNA dalam suatu organisme secara kuantitatif dapat diketahui dengan metode

spektrofotometri. Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA

yang terdapat dalam suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan

DNA plasmidnya dalam larutan contoh dengan cara uji kualitatif. Analisis kuantitatif merupakan salah

satu teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak suatu zat atau

komponen zat.

Jumlah DNA didefinisikan dengan berat molekul bukan oleh volume. Untuk mengetahui jumlah DNA,

maka DNA hasil isolasi harus dianalisis dengan spektrofotometer UV dengan panjang gelombang

260 nm. Kualitas DNA yang berhubungan dengan kemurnian terhadap kontaminan protein dapat

dilihat dari perbandingan absorbansi suspensi DNA pada panjang gelombang 260 nm terhadap 280

nm. Penentuan panjang gelombang maksimum perlu dilakukan untuk mengetahui dimana terjadi

absorpsi maksimum dan untuk meningkatkan proses absorpsi larutan terhadap sinar. Panjang

gelombang yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA atau RNA menggunakan

spektrofotometri UV adalah 260 nm, sedangkan untuk mengetahui kandungan protein

menggunakan spektrofotometri UV dengan panjang gelombang 280 nm.

Gambar 13. Real competitive PCR mendekati analisis gen. Total RNA dicatat dengan heksamer yang random. Selanjutnya, sebuah DNA kompetitif

oligonukelotida (dengan basa yg berbeda 1 dari gen) ditambahkan pada PCR. Reaksi penambahan basa ini dilakukan dengan menamg berbeda.

15

Rasio OD260 atau OD280 antara 1,8 - 2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari

kontaminan protein. Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dapat dikonversikan menjadi

konsentrasi, yaitu nilai 1 pada OD260 = 50 ug DNA rantai ganda tiap mililiter.

Spektrofotometri UV-Vis (Ultra Violet-Visible) Uji kuantitatif DNA dapat dilakukan dengan spektrofotometri UV-Vis. DNA murni yang didapatkan dari proses isolasi dan uji kuantitatif dapat menyerap cahaya ultraviolet karena keberadaan basa-basa purin dan pirimidin. Pita ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada = 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau phenol akan menyerap cahaya pada = 280 nm sehingga kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi = 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi = 280 (260/280), dan nilai kemurnian DNA berkisar antara 1.8-2.0. Pengukuran konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut:

[DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran 260 = Nilai absorbansi pada 260 nm 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)

[RNA] = 260 x 40 x faktor pengenceran 40 = 40ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA)

Spektrofotometri Vis (Visible) Sumber sinar atau energi adalah cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang cahaya tampak adalah 380 750. Sumber cahaya tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia dengan simbol W dan nomor atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang lebih tinggi (3422C) dibandingkan logam lainnya karena sifat inilah, ia digunakan sebagai sumber lampu. Sampel yang dapat dianalisis dengan metode ini hanya sampel yang memiliki warna. Hal ini menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagen yang digunakan harus betul-betul spesifik agar hanya bereaksi dengan analit yang akan dianalisis. Selain itu, produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil. 3. DNA MICROARRAY DNA microarray adalah teknologi yang digunakan untuk melihat urutan sekuens asam nukleat yang berada pada lokasi tertentu dan dapat digunakan untuk menganalisis beribu-ribu sampel pada waktu yang bersamaan. Prinsipnya adalah mengandalkan kemampuan DNA sampel yang telah dilabel dengan zat fluorescent untuk melakukan rekombinasi dengan probe yang telah ada pada chip microarray.

16

Aplikasi microarray banyak digunakan dalam deteksi kanker di mana sel kanker mengalami abnormalitas dalam mengekspresikan gennya. Teknologi ini juga memungkinkan untuk mengetahui tahapan perkembangan sel kanker dengan melihat level ekspresinya terhadap probe spesifik yang telah terdapat pada chip microarray. Dalam analisis ini digunakan sampel DNA normal dan DNA kanker atau tumor. Kedua jenis DNA ini kemudian diamplifikasi dan masing-masing diberi pewarna fluorescent yang berbeda satu sama lain. Pada contoh yang ditampilkan, DNA normal diberi warna hijau, dan DNA tumor memiliki warna merah. Setelah proses hibridisasi, tiap DNA akan memancarkan cahaya sesuai dengan zat warna yang dibawa masing-masing. Bila DNA membawa ekspresi normal dan tumor, maka akan muncul wana lain, seperti kuning. Namun bila tidak ada DNA yang mampu melakukan hibridisasi dengan probe, pewarna tidak terekspresi dan terlihat berwarna hitam. Warna tersebut kemudian dibaca oleh detektor dan diubah menjadi data grafik sehingga dapat dianalisis secara kuantitatif. C. KESIMPULAN Analisis asam nukleat dapat dilakukan melalui uji kualitatif dan uji kuantitatif. Uji kualitatif bertujuan

mengetahui urutan DNA atau RNA yang ingin diuji dan mengidentifikasi keberadaan makromolekul.

Sedangkan uji kuantitatif bertujuan mengetahui konsentrasi DNA atau RNA sampel dan melakukan

identifikasi DNA atau RNA tertentu terhadap molekul-molekul DNA atau RNA lain.

Terdapat banyak teknik analisis yang dapat digunakan untuk mendeteksi serta mempelajari

makromolekul asam nukleat. Beberapa di antaranya adalah staining, hibridisasi, blotting,

sentrifugasi, elektroforesis, DNA sequencing, RFLP, spektrofotometri, PCR, dan DNA microarray.

Metode-metode analisis tersebut memungkinkan adanya pengamatan, pemisahan, dan penandaan

molekul-molekul asam nukleat berupa DNA dan RNA.

Gambar 14. Tahapan Umum pada Microarray

17

DAFTAR PUSTAKA Afiono, Prasetyo, dr., Ph.D. 2011. Teknik Biologi Molekular Dasar . Surakarta: UNS Press. ISBN:

979-498-572-4. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K, and Watter, P. 2002. Molecular Biology of

The Cell, 4th ed. New York: Garland Science. Brown, S.M., Hay, J.G., Ostrer, H. 2009. Essentials of Medical Genomics, 2nd ed. New Jersey:

John Wiley & Sons, Inc. Campbell, N.A.; Reece, J.B. 2002. Biology, 6th ed. San Francisco: Benjamin Cummings. Corkill, G., Rapley, R. 2008. The Manipulation of Nucleic Acids: Basic Tools and Techniques. In:

Molecular Biomethods Handbook, 2nd ed. New Jersey: Walker, J.M., Rapley, R. Humana Press.

Dawn, Marks., Marks Allan D., Smith Colleen M. 2000. Biokimia Kedokteran Dasar : Sebuah

Pendekatan Klinis Edisii 1. Jakarta: EGC. Harth, D.L., Jones, E.W. 2000. Genetics, Analysis of genes and genomes, 5th ed. Jones & Bartlett

Publishers. Karp, Gerald. 2010. Cell and Molecular Biology Concepts and Experiments, 6th ed. New Jersey:

John Wiley & Sons. Mader, Sylvia S. 1993. Biology Part Two: Genetic Basis of Life. Iowa: Dubugue.

McPherson, M.J., Moller, S.G. 2006. PCR, 2nd ed. New York: Taylor & Francis Group. Madison

Avenue.

Primrose, S. B., R. M., Twyman, R. W. Old. 2001. Principle of Gene Manipulation, 6th ed. UK: Blackwell Science, Ltd.

Stainsfield, William., Jaime, S. Colome, Raul, J. Cano. 2003. Schaums Easy Outlines Molecular

and Cell Biology. New York: The McGraw-Hill Companies, Inc.

Strachan T, Read AP. 1999. Human Molecular Genetics, 2nd ed. New York: Wiley-Liss.