Deteksi Asam Nukleat

  • Published on
    18-Nov-2015

  • View
    59

  • Download
    29

Embed Size (px)

DESCRIPTION

Deteksi Asam Nukleat - Biologi Molekuler

Transcript

<ul><li><p>1 </p><p>ANALISIS ASAM NUKLEAT Jeremia Jan Chandra Pranata, 1306414223 Teknik Kimia, Home Group Adenine ABSTRAK Asam nukleat merupakan molekul penting penyusun makhluk hidup. DNA dan RNA merupakan dua jenis asam nukleat yang berfungsi sebagai tempat penyimpanan informasi genetik. Keduanya dapat dianalisis dengan berbagai metode, baik secara kualitatif maupun kuantitatif. Beberapa metode yang akan dibahas adalah staining, RFLP, southern dan northern blot, elektroforesis gel, hibridisasi, DNA/RNA sequencing, serta spektrofotometri, dan real-time PCR. Beberapa metode yang ada mampu mengukur tingkat kemurnian, kandungan, dan jumlah amplifikasi dari asam nukelat. Pembahasan akan meliputi penggunaan teknologi, batasan penerapannya, tingkat akurasi, sensitivitas, spesifikasi, dan biayanya. Dengan adanya kemajuan teknologi ini, DNA dan RNA mampu dimanfaatkan secara luas untuk berbagai keperluan, seperti deteksi sel kanker. Kata kunci: asam nukleat, DNA, RNA, staining, RFLP, southern blot, northern blot, elektroforesis gel, hibridisasi, DNA/RNA sequencing, serta spektrofotometri, real-time PCR, amplifikasi. ISOLASI ASAM NUKLEAT Ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah salah satu teknik dasar dalam biologi molekular. Tujuan dari ekstraksi atau isolasi asam nukleat adalah membuang dan memisahkan asam nukleat dari komponen sel lainnya (protein, karbohidrat, lemak, dll) sehingga asam nukleat yang diperoleh dapat dianalisis dan atau dimodifikasi lebih lanjut dengan teknik biologi molekular lainnya. (Afiono, 2011) Protokol ekstraksi atau isolasi asam nukleat biasanya melibatkan proses fisik dan kimia. Proses tersebut biasanya dimulai dengan homogenisasi jaringan untuk meningkatkan jumlah sel atau permukaan area yang akan dilisiskan. Homogenisasi jaringan sangat berguna untuk mengekstrak asam nukleat dari organ atau jaringan. Langkah selanjutnya adalah permeabilisasi sel target. Permeabilisasi sel dapat dilakukan dengan menggunakan detergen non-ionik sehingga tidak mengikat asam nukleat seperti. Untuk melepaskan asam nukleat di dalamnya, sel perlu dilisiskan terlebih dahulu. Biasanya menggunakan bufer hipotonik. Langkah selanjutnya berupa degradasi dan presipitasi protein yang dapat dilakukan dengan pemanasan, enzime proteinase atau dengan menggunakan garam chaotropic. Asam nukleat yang diperoleh dapat dipresipitasi untuk dikonsentrasikan ke dalam volume yang lebih kecil. Presipitat yang sering digunakan adalah isopropanol, etanol, dan PEG (polyethylene glycol). Setelah dilakukan presipitasi, langkah terakhir adalah solubilisasi asam nukleat. Metode yang paling dikenal untuk ekstraksi/isolasi asam nukleat adalah metode fenol/khloroform/isoamilalkohol. Isolasi DNA Isolasi DNA diawali dengan perusakan dan atau pembuangan dinding sel yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim dan dilanjutkan dengan lisis sel. Isolasi DNA merupakan langkah untuk mempelajari DNA. Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung (Mader, 1993). Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu super natan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell, 2002). Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi. Isolasi RNA Metode untuk ekstraksi RNA mirip dengan metode ekstraksi DNA. Namun, molekul RNA relatif pendek dan lebih sulit rusak dengan shearing sehingga disrupsi sel dapat dilakukan dengan lebih agresif. Meskipun begitu, RNA sangat mudah dicerna oleh RNase yang terdapat endogen dengan </p></li><li><p>2 </p><p>konsentrasi yang bervariasi di dalam sel dan di eksogen di jari sehingga, untuk ektraksi RNA harus menggunakan sarung tangan dan medium yang digunakan untuk isolasi harus mengandung detergen kuat untuk segera mendenaturasi RNase yang ada. Alur isolasi RNA dari suatu jaringan dapat dilihat pada gambar 1. Proses deproteinisasi harus dilakukan secara lebih agresif karena RNA sering berikatan kuat dengan protein. </p><p>Penambahan DNase dapat digunakan untuk menghilangkan DNA. RNA kemudian dipresipitasi dengan etanol. Reagen yang sering digunakan untuk ekstraksi RNA adalah guanidinium thiocyanate yang merupakan inhibitor kuat RNase dan merupakan denaturan protein. Integritas RNA dapat dicek dengan elektroforesis menggunakan gel agarose. Spesies RNA yang terbanyak (molekul rRNA) berukuran 23S dan 16S untuk prokariot dan 18S dan 28S untuk eukariot. RNA tersebut akan tampak sebagai pita yang diskrit dalam gel agarose dan mengindikasikan komponen RNA lainnya masih utuh. Proses ini biasanya dilakukan dalam keadaan denaturasi untuk mencegah terjadinya formasi struktur sekunder pada RNA. RNA sangat sensitif terhadap nuklease. Semua basa RNA memiliki grup 2-hidroksil reaktif sehingga mudah terjadi reaksi kimia yang menghasilkan air dan merusakkan rantai gulanya. Yang perlu diingat, nuklease (RNase) relatif stabil di lingkungan dan bahkan kadang masih dapat bertahan setelah proses denaturasi panas dan ekstraksi fenol. </p><p>Gambar 1. Alur Isolasi RNA </p></li><li><p>3 </p><p>A. ANALISIS KUALITATIF </p><p>1. STAINING Staining adalah proses identifikasi adanya DNA atau RNA dengan memberikan pewarna (dye) ke dalam sampel dan menganalisis warna untuk mengidentifikasi adanya DNA maupun RNA. Proses pemberian warna adalah dengan menyisipkan zat yang dapat mengeluarkan warna ke dalam DNA atau RNA. Terdapat banyak jenis pewarna yang dapat digunakan, seperti etidium bromida, SYBR Gold, SYBR Green, SYBR Safe, Eva Green, dan Acridin Orange. Etidium bromida Etidium bromida merupakan pewarna yang paling umum digunakan untuk memvisualisasikan DNA. Pewarna ini dapat digunakan dalam gel, baik pada larutan penyangga elektroforesis ataupun pada gel. Molekul-molekul pewarna ini menempel pada rantai DNA dan bersifat fluoresens di bawah cahaya UV. EtBr berikatan di antara basa hidrofobik pada nukleotida DNA dan memendarkan warna kuning atau jingga pada panjang gelombang 290 nm. EtBr merupakan senyawa mutagenik dan sangat berbahaya jika terpapar ke dalam tubuh manusia sehingga penggunaannya harus sangat hati-hati. </p><p> SYBR Gold SYBR Gold digunakan untuk DNA rantai tunggal, rantai ganda, atau RNA. SYBR Gold merupakan salah satu alternatif pewarna etidium bromida dan dinilai lebih sensitif daripada pewarna etidium bromida. Tingkat fluoresens pewarna SYBR Gold di bawah sinar UV 1000 kali lebih tinggi daripada etidium bromida saat berikatan dengan asam nukleat. Pewarna ini dapat juga digunakan pada gel formaldehida. SYBR Green SYBR Green I dan II dapat berikatan dengan DNA dan berpotensial sebagai mutagen. Oleh karena itu, pewarna ini harus ditangani dengan baik. SYBR Green I lebih cocok untuk digunakan pada DNA rantai ganda, sedangkan SYBR Green II lebih cocok digunakan untuk DNA rantai tunggal or RNA. SYBR Green bersifat 25 kali lebih sensitif dibandingkan dengan EtBr SYBR Safe SYBR Safe merupakan pewarna yang lebih aman daripada pewarna etidium bromida dan pewarna SYBR lainnya. Pewarna ini memiliki tingkat sensitifitas yang sama dengan EtBr. Pewarna ini tidak bersifat beracun dan aman untuk dibuang langsung ke dalam sistem pembuangan limbah. Pewarna SYBR Safe dapat digunakan dengan blue-light transillluminator yang mengakibatkan lebih sedikit kerusakan terhadap DNA yang diamati dan lebih efisien untuk proses kloning selanjutnya. Eva Green Eva Green adalah pewarna hijau-fluoresens yang digunakan pada PCR (Polymerase Chain Reaction). Selain itu, pewarna ini juga cocok digunakan untuk gel yang memiliki titik leleh yang rendah. Pewarna Eve Green bersifat sangat stabil di dalam suhu tinggi dan memiliki tingkat fluoresens yang tinggi saat berikatan dengan DNA. Pewarna Eva Green juga dinilai memiliki tingkat toksisitas yang rendah. </p><p>Gambar 2. Ethidium Bromide (EtBr) </p></li><li><p>4 </p><p>Acridin Orange Pewarna lainnya adalah Acridin Orange (AO). Untuk analisis RNA, AO akan tereksitasi pada 460 nm dan memancarkan emisi 650 nm (merah). Untuk analisis DNA, AO akan tereksitasi pada 502 nm dengan emisi 565 nm dan memancarkan warna hijau. AO sendiri berikatan dengan asam nukleat pada pH = 3,5. </p><p>2. HIBRIDISASI Hibridisasi merupakan metode untuk menemukan gen tertentu di dalam DNA terdenaturasi yang berasal dari kromosom utuh dengan menggunakan suatu probe. Metode inimemanfaatkan kemampuan asam nukleat untuk membentuk molekul dengan dua rantai yang stabil ketika dua rantai tunggal dengan basa yang komplementer digabungkan dalam kondisi yang sesuai. Metode ini dilakukan pada media wadah tertentu (misal kaca preparat atau cawan petri). Probe adalah sekuens asam nukleat yang telah diberi label atau penanda yang digunakan untuk mendeteksi basa nitrogen dalam sekuens sampel DNA ataupun RNA. Probe memiliki urutan basa nitrogen yang komplementer terhadap urutan basa nitrogen DNA dan RNA sampel. Probe biasanya berupa mRNA atau single strained DNA (ssDNA). Probe biasanya terdiri dari 20-30 untaian basa dan diberi penanda radioaktif atau penanda pendar. Radioaktif isotop fosfor atau fosfodiester yang berikatan pada DNA. </p><p>Teknik hibridisasi meliputi dua proses, yaitu </p><p> Denaturasi (pemisahan dua rantai asam nukleat yang komplementer) </p><p>DNA sampel dipisahkan menjadi rantai tunggal. DNA biasanya dipanaskan pada suhu 100C </p><p>atau dengan mengubah larutan tersebut dengan pH yang sangat tinggi (pH 13) untuk </p><p>memecah ikatan hidrogen yang terdapat di antara pasangan basa sehingga rantai asam nukleat </p><p>akan terpisah. Selain itu, pemisahan juga dapat menggunakan enzim restriksi. </p><p> Renaturasi (perpaduan kembali dua rantai asam nukleat). </p><p>Probe dipasangkan dengan DNA sampel dan kemudian dia analisis. Dilakukan dengan cara </p><p>pendinginan. </p><p> Berdasarkan objek pengamatannya, hibridisasi dibedakan menjadi Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) </p><p>Metode ini menggunakan probe yang mengandung komponen ber-fluoresen. Komponen ini dapat berpendar jika dikenakan sinar UV sehingga lokasi gen yang dicari dapat diketahui. Adapun probe yang digunakan hanya berupa potongan asam nukleat pendek untuk jenis gen tertentu saja. </p><p> Genomic In Situ Hybridization (GISH) Prinsip dasarnya hampir sama dengan FISH, hanya saja komponen yang menjadi probe adalah keseluruhan genom DNA dari suatu spesies. Metode ini digunakan untuk memeriksa penyebaran genomic DNA interspesies dan organisasi sekuensnya. </p><p>Gambar 3. Acridin Orange (N3,N3,N6,N6-tetranetilacridina-3,6-diamina) </p></li><li><p>5 </p><p>Untuk pengujian dengan hibridisasi, diperlukan suatu probe asam nukleat yang komplementer dicampur dengan fragmen asam nukleat yang terdapat pada bahan solid pada kondisi yang mendukung terjadinya hibridisasi. Proses hibridisasi dapat juga dilakukan dalam larutan (bukan bahan solid). Baik DNA yang hendak didiagnosis (target) maupun probe dimasukkan dalam larutan buffer. Kedua DNA tersebut bebas bergerak dan proses hibridisasinya berlangsung 5-10 kali lebih cepat daripada di bahan solid. </p><p>Proses hibridisasi dan visualisasi diawali dengan transfer DNA dari gel agarose ke nilon berpori atau </p><p>membrane nitroselulosa. Pada metode ini mula-mula gel didenaturasi dengan larutan dasar dan </p><p>diletakkan pada suatu nampan. Selanjutnya di atas gel hasil elektroforesis diletakkan nilon berpori </p><p>atau membrane nitroselulosa, kemudian di atasnya diberi pemberat. Semua fragment hasil </p><p>pemotongan dengan enzim restriksi yang pada awalnya berada pada gel akan ditransfer secara </p><p>kapiler ke membrane tersebut dalam bentuk untai tunggal. 3. BLOTTING Blot adalah suatu teknik memindahkan bagian protein yang telah dipisahkan, RNA atau DNA dari </p><p>gel ke lembaran tipis atau matriks membran agar bagian protein tersebut mengalami imobilisasi. </p><p>RNA Blotting dan DNA Blotting umumnya disebut dengan istilah Northern Blotting dan Southern </p><p>Blotting. Blot analysis bermanfaat untuk mengidentifikasi bentuk berbeda, menentukan </p><p>memasukkan atau menyisipkan jumlah salinan dan untuk mendeteksi jumlah penyusunan DNA yang </p><p>mengalami perubahan. </p><p>Northern Blotting Northern Blotting digunakan untuk menganalisis urutan RNA (RNA sequence) tertentu di antara kumpulan molekul RNA. Pada dasarnya metode ini adalah kombinasi dari denaturasi RNA elektroforesis gel dan staining. Pada proses ini, RNA dipisahkan berdasarkan ukuran dan kemudian ditransfer ke membran yang kemudian diperiksa dengan pelengkap berlabel urutan kepentingan tertentu. Hasilnya dapat digambarkan melalui berbagai cara tergantung pada label yang digunakan. Hasil yang paling dalam pada penyataan band yang mewakili ukuran RNA terdeteksi dalam sampel. Intensitas band-band ini berkaitan dengan jumlah RNA target dalam sampel yang dianalisis. Prosedur ini umumnya digunakan untuk mempelajari kapan dan berapa banyak ekspresi gen yang terjadi dengan mengukur berapa banyak RNA hadir dalam sampel yang berbeda. Langkah Northern Blotting, yaitu Denaturasi atau pemisahan RNA di dalam sampel menjadi rantai tunggal. </p><p>Hal ini memastikan bahwa rantai RNA tidak dalam posisi terlipat dan tidak terdapat ikatan diantara rantai molekul. </p><p> Gel elektroforesis Molekul RNA dipisahkan berdasarkan ukuran melalui metode </p><p> RNA ditransfer dari gel ke blot membran. </p><p>Gambar 4. Hibridisasi Asam Nukleat </p><p>Gambar 5. Ilustrasi tahapan metode Northern Blotting </p></li><li><p>6 </p><p> Membran dilalui proses probe. DNA atau RNA yang digunakan pada proses ini dipastikan harus memiliki urutan yang sesuai dengan urutan sampel. Dengan begitu, probe dapat terhibridisasi atau terikat pada pecahan RNA di membran. </p><p> Probe mengizinkan molekul RNA yang diinginkan dapat terdeteksi diantara molekul RNA lainnya pada membran. </p><p> Southern Blotting Southern Blotting adalah metode untuk menganalisis urutan DNA tertentu dalam sampel DNA. Analisis ini menggunakan dua komponen, probe dan DNA target (berasalkan dari berbagai organism). Southern blotting digunakan untuk penemuan gen dan pemetaan DNA, evolusi dan studi pengembangan, forensik, diagnostik, dan modifikasi organisme. </p><p>Langkah Southern Blotting, yaitu </p><p> Isolasi DNA target. </p><p> DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan </p><p>enzim restriksi dan potongan DNA </p><p>divisualisasi ke dalam elektroforesis. </p><p> Hasil elektroforesis direndam ke dalam larutan asam pekat untuk memecah ikatan ganda </p><p>DNA menjadi utas tunggal. </p><p> Melalui prinsip kapilaritas, DNA dalam gel dipindahkan ke dalam membran. </p><p> Untuk mengetahui sekuen, gen harus diisolasi dan ditandai di salah satu sisi (penanda </p><p>menggunakan radioaktif, atau alkaline phosphatase). Identifikasi gen menjadi mudah karena </p><p>banyak genom sudah diketahui urutan sekuennya. </p><p>Probe dapat dibuat sekuen oligonukleotida yang unik dan diatur hanya untuk gen yang kita </p><p>targetkan. Jika probe yang digunakan berisikan ologinuklotida yang umum maka probe akan </p><p>menempel di sembarang tempat. Probe yang dipersiapkan untuk southern di...</p></li></ul>