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Cromosomas bacterianos artificiales
Los cromosomas bacterianos artificiales (BAC) son simplemente plásmidos diseñados para la clonación de fragmentos de DNA muy largos (Fig. 1).
Generalmente incluyen marcadores seleccionables, tales como la resistencia al cloranfenicol (CmR) , así como un origen de replicación muy estable (ori), que mantiene una o dos copias del plásmido por célula.
Fragmentos de DNA de varios centenares de miles de pares de bases pueden clonarse en vectores BAC.
Las grandes moléculas de DNA circular son introducidas en las bacterias por electroporación.
Las bacterias huésped usadas con los BAC recombinantes tienen mutaciones que afectan a la estructura de la pared bacteriana, facilitando la incorporación de estas grandes moléculas de DNA.
Fig. 1
Clonación con cromosomas bacterianos artificiales (BAC)
El vector es un plásmido relativamente simple, con un origen de replicación ori que dirige la replicación.
Los genes par, procedentes de un tipo de plásmidos denominados plásmidos F, facilitan la distribución uniforme de los plásmidos entre las células hijas en la división celular.
Ello favorece que cada célula hija contenga una copia del plásmido, incluso cuando hay pocas copias.
Conviene que el número de copias sea bajo porque así disminuyen las posibilidades de que se produzcan reacciones de recombinación no deseadas, que pueden alterar con el tiempo los fragmentos de gran tamaño de DNA clonado.
En los BAC se incluyen marcadores seleccionables.
Un gen lac Z está colocado en la región de clonación de manera que sea inactivado por los insertos de DNA.
La introducción de BAC recombinantes en las células por electroporación se facilita con el uso de células con una pared celular alterada (más porosa).
El recuento de los DNA recombinantes se efectúa con cloranfenicol (Cm).
Las placas también contienen un sustrato artificial de la β - galactosidasa que da un producto coloreado.
Las colonias con β - galactosidasa activa (y, por lo tanto, sin inserto de DNA en el vector BAC) se vuelven azules; las colonias con los insertos de DNA deseados son blancas.
Aislamiento de un gen a partir de un cromosoma celular
Un gen es una parte muy pequeña de cualquier cromosoma, lo que obliga generalmente a realizar el aislamiento de un fragmento de DNA que contenga un gen determinado en dos fases.
En primer lugar, se construye una genoteca de DNA que contenga muchos miles de fragmentos de DNA procedentes de un genoma.
En segundo lugar, el fragmento de DNA que contiene el gen de interés se identifica mediante una propiedad clave que lo distingue de otros fragmentos de DNA: su secuencia.
La clonación de un gen generalmente necesita una genoteca
Hay diversos tipos de genotecas según el origen del DNA.
Entre las más comunes se encuentran las genotecas genómicas, obtenidas cortando primero el genoma completo de un organismo concreto en miles de fagmentos y luego insertando todos los fragmentos en un vector de clonación.
En el primer paso, el DNA que debe ser clonado es digerido parcialmente con una
endonucleasa de restricción, de manera que una secuencia determinada aparezca en fragmentos de diversos tamaños.
Se elige una gama de tamaños para los fragmentos que sea compatible con el vector de clonación y que asegure que prácticamente todas las secuencias estén representadas en los clones de la genoteca.
Los fragmentos demasiado grandes o demasiado pequeños para ser clonados son eliminados por centrifugación o por electroforesis.
El vector de clonación se corta con la misma endonucleasa de restricción y se liga con los fragmentos de DNA genómico.
La mezcla de DNA ligado se usa para trasformar las células bacterianas o se empaqueta en partículas de bacteriófago para generar bacterias o bacteriófagos que contengan cada uno una molécula de DNA recombinante diferente.
En condiciones ideales, todo el DNA del genoma estará representado en la genoteca.
Cada bacteria transformada crece para formar una colonia o "clon" de células idénticas, cada una con el mismo plásmido recombinante.
Cuando se ha usado un bacteriófago como vector, cada tipo de fago recombinante forma una región clara de células lisadas (una calva) en la capa de células bacterianas distribuidas uniformemente en la placa de agar; todos los
bacteriofagos recombinantes de una calva son idénticos.
El problema es entonces identificar el clon que contiene el gen buscado entre los miles de clones de la genoteca.
Los fragmentos de una genoteca derivada de un eucariota superior incluyen no sólo los genes, sino también el DNA no codificante que representa una parte considerable de muchos genomas eucarióticos.
Se puede construir una genoteca más especializada que sólo incluya los genes que son expresados en un determinado organismo, e incluso .en ciertas células o tejidos.
Los genes expresados son los que son transcritos en RNA.
En primer lugar, se extrae el mRNA de un organismo o de determinadas células del organismo, y se sintetizan DNA complementarios (cDNA) a partir del RNA, en una reacción de varios pasos, catalizada por la transcriptasa inversa (Fig. 2).
Fig. 2
Los fragmentos de DNA de doble hebra resultantes se insertan en un vector adecuado y se clonan, dando lugar a una población de clones denominada genoteca de cDNA.
La búsqueda de un gen concreto puede ser facilitada por el uso de una genoteca de cDNA preparada a partir de los mRNA de una célula que exprese este gen.
Construcción de una genoteca de cDNA a partir de rnRNA
En la práctica, el mRNA de una célula incluye los transcritos de miles de genes y los cDNA generados serán, en consecuencia, heterogéneos. El DNA dúplex producido de este modo se inserta en un vector de clonación adecuado.
Por ejemplo, la clonación de los genes de las globinas puede ser más sencilla a partir de una genoteca de cDNA de células precursoras de eritrocitos, en las cuales aproximadamente la mitad de los mRNA codifican globinas.
Bibliografía
• Nelson David L, Cox Michael M. “ Lehninger Principios de Bioquímica”. Ediciones Omega. 2001
