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II
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ
CRISTIANE SILVA AGUIAR
DIFERENTES ASSOCIAÇÕES ENTRE TROLOX ® E ÁCIDO
DOCOSAHEXAENOICO NA CONGELAÇÃO E REFRIGERAÇÃO DE SÊ MEN
DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR
ILHÉUS – BAHIA
2018
III
CRISTIANE SILVA AGUIAR
DIFERENTES ASSOCIAÇÕES ENTRE TROLOX ® E ÁCIDO
DOCOSAHEXAENOICO NA CONGELAÇÃO E REFRIGERAÇÃO DE SÊ MEN
DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR
Tese apresentada à Universidade Estadual de Santa
Cruz, como parte das exigências para obtenção do
título de Doutora em Ciência Animal.
Área de concentração: Reprodução Animal
Orientadora: Profa. Dra. Paola P. das Neves Snoeck
Co-orientadora: Profa. Dra. Larissa Pires Barbosa
ILHÉUS – BAHIA
2018
IV
A282 Aguiar, Cristiane Silva.
Diferentes associações entre trolox e ácido docosahexaenoico na congelação e refrigeração de sêmen de garanhões da raça man- galarga marchador / Cristiane Silva Aguiar. - Ilhéus : UESC, 2018. 131f. : il. Anexos. Orientadora : Paola P. das Neves Snoeck. Co-orientadora : Larissa Pires Barbosa. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual de Santa Cruz. Pro- grama de Pós-graduação em Ciência Animal.
Inclui referências.
1. Reprodução animal – Biotecnologia. 2. Equinos – Reprodu- ção. 3. Antioxidantes. I. Snoeck, Paola P. das Neves. II. Barbosa, Larissa Pires. III. Título. CDD – 636.0824
V
CRISTIANE SILVA AGUIAR
DIFERENTES ASSOCIAÇÕES ENTRE TROLOX ® E ÁCIDO
DOCOSAHEXAENOICO NA CONGELAÇÃO E REFRIGERAÇÃO DE SÊ MEN
DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR
Ilhéus – BA, 27 de Fevereiro de 2018.
_____________________________________________________________
Paola Pereira das Neves Snoeck - DSc. UESC-DCAA (Orientadora)
______________________________________________________________ Amauri Arias Wenceslau - DSc.
UESC-DCAA
_____________________________________________________________ Ivan Bezerra Allaman - DSc.
UESC-DCET
______________________________________________________________ José Augusto Carvalho - DSc.
UESC-DCAA
_______________________________________________________________ Diogo Ribeiro Câmara - DSc.
UFAL
ILHÉUS – BAHIA
2018
VI
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos que estiveram ao meu lado nessa jornada e aos que suportaram minha ausência em vários momentos: ao meu filho Henrico, ao meu companheiro Márcio, ao meu sobrinho e afilhado Ícaro, ao meu pai Wilson, a minha sogra Elvira Beatriz e ao meu sogro José Márcio.
VII
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus por ter permitido a realização deste trabalho e por
me dar forças para suportar as tempestades e enfrentar os obstáculos.
Ao meu filho Henrico, razão da minha existência, amor eterno, por ter
enxugado minhas lágrimas em diversos momentos só com um abraço
apertado, por ter aplacado alguns momentos de angústia ao longo desses
quatro anos só com um beijo e um “Eu te amo mamãe”. Por ter sido paciente e
compreensivo nas minhas ausências e por sempre me receber com um sorriso
inigualável.
Ao meu companheiro de todas as horas Márcio de Oliveira Ribeiro (Big)
pelo apoio em todos os meus projetos, por todo o amor dedicado a nossa
família, por sempre manter a serenidade diante dos apertos da vida e me
encorajar nas horas de dúvida.
Ao meu pai Wilson Alberto Aguiar, por sempre estar ao meu lado,
incondicionalmente, mesmo ás vezes não estando ciente do quão isso é
importante na minha vida.
Aos meus, sogro José Márcio Cavalcanti Ribeiro e sogra Elvira Beatriz
de Oliveira Ribeiro, por ocuparem posição de pais em minha vida, sempre
VIII
dispostos em ajudar e em acalentar. Saber que podia contar com vocês foi
imprescindível para a realização desse trabalho.
A minha orientadora Profa. Dra. Paola Pereira das Neves Snoeck por se
doar aos seus orientados transmitindo seus conhecimentos, por prezar pela
excelência e por enriquecer esse trabalho.
A minha co-orientadora Profa. Dra. Larissa Pires Barbosa por ceder
equipamentos e reagentes, além de conhecimento técnico e amizade ao longo
de nove anos.
Aos meus colegas de pós-graduação que fizeram ou fazem parte do
Laboratório de Reprodução Animal da UESC, em especial: a Maíra Corona da
Silva por todo o apoio, amizade nos momentos difíceis e pelos bons momentos
que dividimos; a Tainá Hortência Oliveira Pessoa por ter sido uma amiga
presente e com quem eu podia contar, além de ter me recebido em sua casa
sempre de braços abertos (serei eternamente grata!); a Celso Henrique Souza
Costa Barros (Celsão) e a William Morais Machado (Wil) por me auxiliarem nos
experimentos, a presença de vocês foi imprescindível para a realização desse
trabalho; a Ivan de Paula Fernandes e Marcelo Pereira pelos momentos e
risadas compartilhadas, além da amizade que ficará para a vida toda.
Aos discentes orientados de PIBIC e PIBIT do Laboratório de
Reprodução Animal da UESC: Ana Carolina Almeida Dias, Bruno Souza Malta,
Lorena Matos Cortês Alves, Dandara Vale Sobral, Clatiane Santos Bispo e Iure
Prates, por toda a colaboração, dedicação, responsabilidade e presteza
durante os experimentos, tenham certeza que vocês foram peça chave e
extremamente importantes para que eu conseguisse finalizar esse trabalho.
Espero que eu tenha conseguido colaborar para a formação de vocês. Sou-
lhes eternamente grata!
Ao meu amigo Antonio de Oliveira Leite Filho (Leitinho) por sempre estar
disponível para me auxiliar na parte experimental de campo, por ceder
equipamentos e animais sob sua responsabilidade e pela amizade de sempre!!
Sem a sua ajuda tudo teria sido muito mais difícil!! Muitoooo Obrigada!!
Ao proprietário do Haras Pamplona Luiz Pedro Rodrigues Irujo por nos
permitir desenvolver as atividades experimentais nas dependências da sua
propriedade e por ceder os animais para os experimentos.
IX
Aos funcionários do Haras Pamplona por sempre estarem disponíveis,
trabalhando com alegria e assim tornarem nossa jornada mais leve!!
Aos amigos que compõem os grupos de WhatsApp “Nárnia” e
“Bagaceira”, por sempre me incentivarem e me fortalecerem nos momentos de
tristeza e desânimo, além de dividirem muitas gargalhadas nos momentos de
alegria. Vocês fizeram a diferença!!!
A Universidade Federal do Recôncavo da Bahia por me possibilitar
cursar o Doutorado para que eu pudesse voltar melhor capacitada para a sala
de aula e assim pudesse contribuir para a formação dos nossos discentes do
curso de Medicina Veterinária.
Aos que por algum motivo, conscientes ou não, conseguiram de alguma
forma me atrapalhar nesse percurso, pois dele estou saindo muito mais
fortalecida!!!!
A Rosiléia Silva Souza, por ter plantado em mim a primeira semente
para a investigação desse assunto em equinos, por ter me auxiliado com
conhecimentos técnicos e pela amizade de longas datas.
A Marciane da Silva Maia (Embrapa), André Mariano Batista (UFRPE),
Candice Nóbrega Carneiro (UFRB), Caline Gomes Ferraz (UFRB) e Sildivane
Valcácia Silva (UFPB) por terem me auxiliado com esclarecimentos e sanado
minhas dúvidas ao longo dessa jornada. Vocês foram luz no meu caminho!
X
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não é senão uma gota de
água no mar, mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”
Madre Teresa de Calcutá.
XI
DIFERENTES ASSOCIAÇÕES ENTRE TROLOX ® E ÁCIDO
DOCOSAHEXAENOICO NA CONGELAÇÃO E REFRIGERAÇÃO DE SÊ MEN
DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR
RESUMO
Objetivou-se avaliar o efeito de diferentes concentrações de ácido docosahexaenoico (DHA), isolado ou associado a diferentes concentrações de Trolox® na congelação e refrigeração de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador. No primeiro experimento foram congelados 16 ejaculados para testar o efeito dos seguintes diluidores: D1) BotuCrio® (BC; controle); D2) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 30 µM de Trolox® (BCDHA30T); D3) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 40 µM de Trolox® (BCDHA40T); D4) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 50 µM de Trolox® (BCDHA50T). Os diluidores testados preservaram igualmente vários parâmetros de movimento espermático, o percentual de hiperativos, a integridade funcional, a integridade da cromatina, a atividade mitocondrial alta e intermediária e a peroxidação lipídica (P>0,05). Embora, tenha sido observada superioridade do diluidor BCDHA40T sobre o diluidor controle em preservar a velocidade curvilinear, a velocidade linear progressiva e a velocidade média do trajeto (P<0,05). Houve menor percentual de móveis nas amostras criopreservadas em BCDHA30T do que no diluidor controle (P<0,05). Houve menor percentual de espermatozoides com membrana estruturalmente íntegra nas amostras criopreservadas em BCDHA50T do que o diluidor controle (P<0,05). No segundo experimento foram congelados 12 ejaculados para testar o efeito dos seguintes diluidores: D1) BotuCrio® (BC; controle); D2) BC + 30 ngmL-1 de DHA (BC30DHA); D3) BC + 40 µM de Trolox® (BC40T); D4) BC40T + 50 ngmL-1 de DHA (BC40T50DHA); D5) BC40T + 70 ngmL-1 de DHA (BC40T70DHA); D6) BC40T + 90 ngmL-1 de DHA (BC40T90DHA). Os diluidores testados preservaram de forma semelhante vários parâmetros de movimento espermático, a integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas, a integridade da cromatina, a atividade mitocondrial alta e intermediária (P>0,05). O percentual de espermatozoides móveis e com velocidade linear progressiva e média do trajeto foi maior nas amostras criopreservadas no diluidor controle e BC30DHA do que nos diluidores contendo BC40T adicionados de DHA (P<0,05). No terceiro experimento foram refrigerados dez ejaculados para testar o efeito dos seguintes diluidores: D1) BotuSêmen® (BS; controle); D2) BS + 30 ngmL-1 de DHA (BS30DHA); D3) BS30DHA + 40 µM de Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50 ngmL-1 de DHA (BS50DHA); D5) BS50DHA + 40 µM de Trolox®
(BS50DHA40T). Após 48 horas de refrigeração a 5oC foram avaliados vários parâmetros de viabilidade espermática e foi possível perceber que todos os diluidores testados preservaram igualmente vários parâmetros de movimento espermático e integridade estrutural e funcional das membranas espermáticas (P>0,05). No entanto, o BS50DHA foi superior ao BS30DHA40T em preservar a velocidade curvilinera e linear progressiva e foi superior ao BS30DHA40T e BS50DHA40T em preservar a velocidade média do trajeto e o índex de oscilação (P<0,05). Nenhum diluidor proposto maximizou o efeito do diluidor
XII
controle nas condições experimentais aqui testadas. A adição de Trolox® em diluidores contendo DHA só foi eficiente em melhorar os parâmetros de velocidade espermática no primeiro experimento. Não é necessário o uso de Trolox® para controlar a lipoperoxidação em diluidor contendo DHA.
Palavras-chave: Antioxidante. Ácidos graxos. Membrana espermática. BotuCrio®. BotuSêmen®.
XIII
DIFFERENT ASSOCIATIONS BETWEEN TROLOX ® AND DOCOSAHEXAENOIC ACID IN FREEZING AND COOLING OF SEM EN OF
STALLION OF THE MANGALARGA MARCHADOR BREED
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effect of different concentrations of docosahexaenoic acid (DHA), isolated or associated with different concentrations of Trolox® on the freezing and cooling of semen from Mangalarga Marchador stallions. In the first experiment, 16 ejaculates were frozen to test the effect of the following extenders: D1) BotuCrio® (BC; control); D2) BC + 50 ngmL-1 DHA + 30 µM Trolox® (BCDHA30T); D3) BC + 50 ngmL-1 DHA + 40 µM Trolox® (BCDHA40T); D4) BC + 50 ngmL-1 DHA + 50 µM Trolox® (BCDHA50T). The extenders tested also preserved several parameters of spermatic movement, the percentage of hyperactive, functional integrity, chromatin integrity, high and intermediate mitochondrial activity and lipid peroxidation (P>0.05). Although, it was observed superiority of the extender BCDHA40T on the control extender in preserving curvilinear velocity, progressive linear velocity and average path velocity (P<0.05). There was lower percentage of motility in the cryopreserved samples in BCDHA30T than in the control extenders (P<0.05). There was a lower percentage of spermatozoa with structurally intact membrane in the cryopreserved samples in BCDHA50T than the control extenders (P<0.05). In the second experiment, 12 ejaculates were frozen to test the effect of the following extenders: D1) BotuCrio® (BC; control); D2) BC + 30 ngmL-1 DHA (BC30DHA); D3) BC + 40 µM Trolox® (BC40T); D4) BC40T + 50 ngmL-1 DHA (BC40T50DHA); D5) BC40T + 70 ngmL-1 DHA (BC40T70DHA); D6) BC40T + 90 ngmL-1 DHA (BC40T90DHA). The extenders tested similarly preserved several parameters of sperm movement, structural and functional integrity of sperm membranes, chromatin integrity, high and intermediate mitochondrial activity (P>0.05). The percentage of moving spermatozoa with progressive and average linear velocity of the trajectory was higher in the cryopreserved samples in the control extenders and BC30DHA than in the extenders containing BC40T added DHA (P<0.05). In the third experiment, ten ejaculates were refrigerated to test the effect of the following extenders: D1) BotuSêmen® (BS; control); D2) BS + 30 ngmL-1 DHA (BS30DHA); D3) BS30DHA + 40 µM Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50 ngmL-1 DHA (BS50DHA); D5) BS50DHA + 40 µM Trolox® (BS50DHA40T). After 48 hours of cooling at 5ºC, several parameters of sperm viability were evaluated and it was possible to observe that all the extenders tested also preserved several parameters of sperm movement and structural and functional integrity of the spermatic membranes (P>0.05). However, the BS50DHA was superior to the BS30DHA40T in preserving the curvilinear and linear progressive velocity and was superior to the BS30DHA40T and BS50DHA40T in preserving the average path velocity and the oscillation index (P<0.05). No proposed extenders maximized the effect of the control extenders under the experimental conditions tested herein. The addition of Trolox® in extenders containing DHA was only efficient in improving the sperm velocity parameters in the first experiment. Trolox® is not required to control lipoperoxidation in extenders containing DHA.
XIV
Keywords: Antioxidant. Fatty acids. Spermatic membrane. BotuCrio®. BotuSêmen®.
XV
LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1 Ilustração de vistas ampliadas de um espermatozoide equino
14
2 Ilustração ampliada da Fig. 1, mostrando vista sagital medial e parcialmente cortada de espermatozoide equino
14
3 Modelo do “mosaico fluido” da membrana plasmática, uma combinação fluida de fosfolipídeos, colesterol e proteínas.
15
4
Diferentes conformações espaciais do ácido docosahexaenoico
32
5 Incorporação do DHA ao fosfolipídeo e a associação desse fosfolipídeo com o colesterol, que também inclui as proteínas transmembranas com alta afinidade pelo DHA
33
XVI
LISTA DE TABELAS
ARTIGO CIENTÍFICO I Tabela Página
1 Parâmetros de viabilidade espermática no sêmen equino criopreservado em diluidor acrescido de DHA e diferentes concentrações de Trolox®.
50
2 Parâmetros de cinética espermática após 60 e 120 minutos de TTR do sêmen equino criopreservado em diluidor contendo DHA e Trolox®.
51
ARTIGO CIENTÍFICO II
Tabela Página
1 Parâmetros de viabilidade espermática no sêmen equino criopreservado em diluidor com ou sem Trolox® e diferentes concentrações de DHA.
71
ARTIGO CIENTÍFICO III
Tabela
Página
1 Parâmetros de viabilidade espermática após 48 horas de armazenamento e refrigeração de sêmen em diluidor BotuSêmen®, com ou sem Trolox®, e diferentes concentrações de DHA.
91
2 Parâmetros de cinética espermática após o TTR Lento do sêmen equino refrigerado e armazenado por 48 horas em diluidor contendo DHA e Trolox® (avaliação após 120 minutos de incubação).
94
XVII
SUMÁRIO
Pag.
1 INTRODUÇÃO.............................................................................. 10
2 OBJETIVO GERAL.. ..................................................................... 11
3 REVISÃO DE LITERATURA ........................................................ 11
3.1 ESTRUTURA DO ESPERMATOZOIDE E DA MEMBRANA PLASMÁTICA................................................................................
11
3.2 CRIOPRESERVAÇÃO E LESÕES ESPERMÁTICAS.................. 19
3.3 SUBSTÂNCIAS CRIOPROTETORAS.......................................... 23
3.4 ESTRESSE OXIDATIVO NO ESPERMATOZOIDE....…………… 24
3.5 RADICAIS LIVRES E ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO...........................................……………………………..
26
3.6 ÁCIDOS GRAXOS POLI-INSATURADOS (PUFAs)..................... 29
3.6.1 Ácido Docosahexaenoico (DHA)................................................... 31
3.7 ANTIOXIDANTES......................................................................... 35
3.7.1 Vitamina E..................................................................................... 37
4 ARTIGO CIENTÍFICO I: EFEITO DA ASSOCIAÇÃO DO TROLOX® E ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO NA CONGELAÇÃO DE SÊMEN DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR............................... ....................
41
4.1 INTRODUÇÃO.............................................................................. 43
4.2 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 44
4.3 RESULTADOS.............................................................................. 49
4.4 DISCUSSÃO................................................................................. 51
4.5 CONCLUSÃO................................................................................ 55
REFERÊNCIAS............................................................................. 56
5 ARTIGO CIENTÍFICO II: EFEITO DO TROLOX® ASSOCIADO OU NÃO AO ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO EM DILUIDOR DE CONGELAÇÃO DE SÊMEN DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR............................... ....................
64
5.1 INTRODUÇÃO.............................................................................. 66
5.2 MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 67
5.3 RESULTADOS............................................................................. 71
5.4 DISCUSSÃO................................................................................. 72
XVIII
5.5 CONCLUSÃO.............................................................................. 76
REFERÊNCIAS............................................................................. 77
6 ARTIGO CIENTÍFICO III: EFEITO DO ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO E DO TROLOX ® NO DILUIDOR DE REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR............................... ....................
84
INTRODUÇÃO.............................................................................. 86
MATERIAL E MÉTODOS.............................................................. 87
RESULTADOS E DISCUSSÃO.................................................... 90
CONCLUSÃO.............................................................................. 94
REFERÊNCIAS............................................................................. 94
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................... ........................... 98
REFERÊNCIAS............................................................................ 100
ANEXOS....................................................................................... 117
10
1 INTRODUÇÃO
O agronegócio equino movimenta anualmente R$16,15 bilhões e gera
610 mil empregos diretos e 2.430 mil empregos indiretos, sendo responsável
por três milhões de postos de trabalho. O número de animais que compõem o
rebanho nacional é superior a cinco milhões, considerando todas as
modalidades de criação. É notório que mesmo com a aquisição de máquinas
mais sofisticadas e ferramentas tecnológicas, o cavalo continua sendo decisivo
para o desenvolvimento de atividades pecuárias e agrícolas na maior parte das
propriedades nacionais, indicando para a sociedade brasileira a força da
atividade como geradora de renda e de postos de trabalho (MAPA, 2016).
Nesse contexto, as biotécnicas da reprodução vêm fornecendo meios
para o crescimento e desenvolvimento desse rebanho. Dentre essas, a
criopreservação do sêmen se destaca por maximizar o potencial reprodutivo do
macho, embora interfira na qualidade seminal, pois no processo de
refrigeração, congelação e descongelação ocorre o estresse físico e químico
na estrutura espermática. Os processos de criopreservação também estão
associados ao surgimento de espécies reativas de oxigênio (ROS) que
acarretam o estresse oxidativo (CHATTERJEE et. al, 2001).
É sabido que a raça Mangalarga Marchador possui indivíduos com
variada resistência espermática (ALVARENGA et al., 2005), apresentando
maior proporção de garanhões com baixa capacidade de criopreservação do
sêmen (GOMES et al., 2002).
O espermatozoide é particularmente susceptível ao estresse oxidativo,
tendo em vista que sua membrana contém altas quantidades de ácidos graxos
poli-insaturados (PUFAs), sendo estes protagonistas na melhoria da fluidez e
outras funções celulares, embora também sejam alvos da lipoperoxidação.
A adição de PUFAs ao sêmen equino, especialmente o ácido
decosahexanoico, importante ácido graxo poli-insaturado da membrana
espermática (AITKEN et al., 2006), pode ser uma alternativa para manter a
qualidade espermática durante os processos de criopreservação, pois permite
aumentar a fluidez da membrana. Por outro lado, essa suplementação com
PUFAs poderia aumentar a susceptibilidade dos espermatozoides a
peroxidação lipídica e ao estresse oxidativo. Por isso, como alternativa para
11
minimizar esse efeito, os diluidores seminais podem ser suplementados com
antioxidantes tanto enzimáticos como não enzimáticos, tendo em vista que
durante a espermiogênese ocorre expressiva redução do citoplasma do
espermatozoide, limitando a quantidade dessa substância intracelular,
principalmente os de ação enzimática. A adição de antioxidantes deve ser
realizada utilizando diferentes concentrações e ou combinações, pois a
presença de quantidade moderada de ROS é fundamental para o desempenho
de várias funções celulares, o que requer que essa suplementação seja
realizada de forma criteriosa (NICHI, 2009).
2 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito de diferentes concentrações de ácido decosahexaenoico
associado ou não ao antioxidante Trolox®, sobre os espermatozoides de
garanhões Mangalarga Marchador submetidos à congelação e refrigeração.
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 Estrutura do espermatozoide e da membrana plas mática
O espermatozoide é uma célula haplóide carente de citoplasma e
outras organelas, com exceção do núcleo, acrossoma e mitocôndrias
(MEDEIROS et al., 2002). Apresentam-se como células relativamente simples,
compostas basicamente por uma cabeça e um flagelo. No entanto, também são
extremamente sofisticados e adaptáveis para alcançar seu maior objetivo que é
o da fertilização do oócito, sendo exigida uma série de funções altamente
coordenadas na esfera celular e molecular para o seu sucesso (VARNER et al.,
2015).
O espermatozoide da espécie equina é altamente especializado, como
o de todas as espécies de mamíferos (MEYERS, 2009). Compondo a cabeça
do espermatozoide temos o núcleo, onde fica alojado o seu DNA, o acrossoma
na região anterior subjacente e pequena quantidade de citoplasma. Ainda pode
ser subdividido em uma região acrossomal, segmento equatorial, região pós-
acrossomal e anel posterior, servindo para demarcar a junção entre a cabeça e
o flagelo. O anel posterior é o local de ancoragem da membrana plasmática ao
invólucro nuclear e funciona separando hermeticamente a matriz citoplasmática
12
da cabeça e da cauda (também denominada de flagelo). O flagelo pode ser
subdividido em uma peça de conexão, uma peça central (ou peça intermédia),
uma peça principal e uma peça final ou terminal (Figura 1) (VARNER et. al.,
2015).
A cabeça tem um formato achatado que se assemelha a uma raquete,
com dimensões aproximadas de 5,8 a 7,0 µm de comprimento e 2,9 a 3,9 µm
de largura. Seu flagelo apresenta comprimento de 9,8 a 10,5 µm de peça
intermediária, 43,8 a 67,0 µm de peça principal e 2,79 µm na peça terminal
(CUMMINS; WOODALL, 1985).
O acrossoma é uma organela localizada na parte frontal da cabeça do
espermatozoide, estrutura semelhante a um capuz e originária do complexo de
Golgi da espermátide. Sua membrana é anatomicamente dividida em: interna e
externa. A membrana acrossomal interna está em estreita aposição ao
invólucro nuclear, enquanto que a membrana acrossomal externa está
subjacente à membrana plasmática, ambas convergindo na altura do segmento
equatorial. No espermatozoide após passar pelo processo de maturação
espermática no epidídimo, o acrossoma contém um abundante aporte de
moléculas ativas, incluindo uma variedade de receptores de proteínas, bem
como enzimas hidrolíticas e glicolíticas, também chamada de matriz
acrossomal, consideradas imprescindíveis para adesão e penetração da zona
pelúcida (BUFFONE et al., 2008).
Algumas dessas enzimas foram descritas em outras espécies, mas
ainda não confirmadas em garanhões como a: proacrosina-acrosina,
hialuronidase, β-galactosidase, proteinases, neuraminidases, esterases,
arilsulfatase, fosfolipases A e C, assim como numerosas fosfatases, as quais
são liberadas na reação acrossômica por exocitose, facilitando a fusão da
membrana acrossomal externa com a membrana plasmática, permitindo a
liberação de enzimas sobre a zona pelúcida do oócito a ser fertilizado
(MEYERS, 2009).
O núcleo ocupa a maior parte da cabeça e carrega o material genético
paterno. Possui cromatina (DNA associado a proteínas) altamente condensada
que ocupa um volume aproximado de apenas 5 a 10% do que ocuparia em
uma célula somática. O DNA está intimamente associado com proteínas
nucleares de baixo peso molecular, de pH básico e ricas em arginina e cisteína,
13
denominadas de protaminas, que formam complexos estáveis por pontes
dissulfeto intra e inter moleculares, resultando na compactação e estabilização
do DNA. Esta compactação é necessária para proteger os cromossomos
durante a sua inóspita jornada ao longo do trato reprodutivo feminino (VARNER
et. al., 2015).
A cauda do espermatozoide compreende quatro regiões: colo, peça
intermédia, peça principal e peça terminal. A cauda permite que o
espermatozoide se movimente em direção á tuba uterina para encontrar o
oócito, mais precisamente na ampola, local de fecundação. O colo inclui o
capítulo e as colunas segmentares. O capítulo é o limite cranial do flagelo na
fossa de implantação, zona de ligação com a cabeça, composto por proteínas
ricas em pontes dissulfeto. A fossa de implantação pode sofrer um desvio
abaxial, causando um desvio da cauda e um consequente movimento circular
ou semicircular que, dependendo do grau, é aceitável na espécie equina. As
colunas segmentares são a origem das nove fibras densas que conferem
rigidez e resistência ao flagelo. As fibras rodeiam o axonema central, composto
por nove pares de microtúbulos circundando um par central, o que resulta
numa disposição 9 + 2. O axonema, na região da peça intermédia, encontra-se
rodeado por uma camada de mitocôndrias que são encarregadas da produção
energética. Na peça principal, essa estrutura é envolta apenas pela bainha
fibrosa. A disposição microtubular se mantém apenas em metade da peça
terminal. Esta arquitetura permite um movimento ondulatório do
espermatozoide, através da contração sequencial de cada um dos pares
(Figuras 1 e 2)(MEYERS, 2009).
14
Figura 1 – Ilustração mostrando vistas ampliadas de um espermatozoide equino, representado por uma vista não cortada (centro), uma vista central sagital (esquerda) e uma vista parcialmente cortada (direita). As várias divisões longitudinais do espermatozoide são representadas como cabeça e cauda (flagelo), este último por peça intermédia, peça principal e terminal. Sendo a. acrossoma, b. membrana plasmática, c. núcleo, d. mitocôndria, e. axonema f. fibras externas densas, g. bainha fibrosa, h. microtúbulos axonêmicos. Fonte: Varner et. al. (2007).
Figura 2 - Ilustração ampliada da Fig. 1, mostrando vista sagital medial e parcialmente cortada de espermatozoide equino, sendo a. membrana plasmática, b. acrossoma, c. membrana acrossomal externa, d. membrana acrossomal interna, e. envelope nuclear, f. pós lâmina acrossomal, g. núcleo, h. lâmina basal e capítulo subjacente, i. centríolo proximal, j. coluna segmentada, k. fibras externas densas, l. duplas exteriores do axonema, m. par central de microtúbulos dentro do axonema, n. mitocôndria. Fonte: Varner et. al. (2007). O conhecimento sobre a membrana plasmática dos
espermatozoides é o ponto inicial para o êxito nos processos de manipulação
15
do sêmen, principalmente tratando-se de espécies como a equina e a suína, as
quais possuem células com baixa resistência à manipulação extracorpórea
(VALE; SILVA, 2001).
A estrutura básica da membrana plasmática de qualquer célula é o
mosaico fluido, constituído por dupla camada lipídica entremeada por
moléculas de proteína e que define os seus limites (Figura 3). Neste modelo, os
lipídeos e proteínas são organizados através de forças não covalentes de
características hidrofílicas ou hidrofóbicas. Os fosfolipídeos têm uma camada
hidrofílica externa e uma cadeia de ácidos graxos que se estende para o
interior da membrana. Esta organização lamelar faz com que as cadeias de
ácidos graxos promovam uma barreira hidrofóbica na qual a água e moléculas
dissolvidas nela passam apenas com dificuldade (SINGER; NICOLSON, 1972).
Nos mamíferos essa bicamada lipídica é constituída de PUFAs, em particular o
DHA (GHOLAMI et al., 2010).
Figura 3. O modelo do mosaico fluido da membrana plasmática a descreve como uma combinação fluida de fosfolipídeos, colesterol e proteínas. Os carboidratos ligados aos lipídeos (glicolipídeos) e às proteínas (glicoproteínas) se distribuem a partir da superfície voltada para fora da membrana. Fonte: https://openstax.org/details/biology
A membrana plasmática tem uma espessura média de 50 Å e
característica semipermeável (MCINTOSH, 1999). As moléculas de lipídeos e
proteínas se apresentam em forma de arranjos formados por uma dupla
camada sem geometria fixa, demonstrando ser uma estrutura dotada de fluidez
(QUINN, 1989). Essa apresentação permite um movimento lateralizado no
mesmo folheto dos componentes da membrana, podendo ser influenciado por
alguns fatores como os fenômenos fisiológicos relacionados à fertilização, entre
16
eles a capacitação espermática e a reação acrossômica (FLESCH; GADELLA,
2000). Possui também um papel indispensável no isolamento da célula do meio
externo e na mediação das reações entre o meio externo e interno, controlando
o fluxo de água e eletrólitos, sendo metabolicamente ativa e impermeável a
maioria das moléculas por conta da sua composição (COOPER; HAUSMAN,
2007).
O transporte de moléculas é feito através de canais ou poros formados
pelas proteínas, existindo pouco ou nenhum transporte de moléculas
hidrofílicas em regiões da membrana sem poros ou canais. Mudanças na
conformação da membrana, que podem ser ocasionadas pelo resfriamento, e
que resultam em arranjos anormais dos fosfolipídeos e proteínas, permitem
rápida passagem de moléculas que normalmente passariam através da
membrana em menor velocidade (AMANN; PICKETT, 1987).
Embora seja contínua sobre a superfície dos espermatozoides, a
natureza da membrana plasmática difere regionalmente (FLESCH; GADELLA,
2000). A sua composição lipídica é característica para cada reino, espécie,
tecido e organela de cada tipo celular (SCOTT, 1973), assim como proteínas e
carboidratos podem diferir entre a cabeça e cauda do espermatozoide.
Algumas das proteínas que a compõem auxiliam na formação de canais
iônicos, poros, receptores ou componentes de transdução de sinal, constituindo
no seu total cerca de 50% do peso molecular da membrana (MEYERS, 2009).
A manutenção de concentrações adequadas intra e extracelulares
de íons como sódio, potássio, cálcio e magnésio são regulados por bombas
iônicas protéicas presentes nas membranas, e que dependem de ATP
intracelular para atuar (AMANN; PICKETT, 1987).
Ao longo da formação e desenvolvimento dos espermatozoides
ocorrem mudanças tanto na forma quanto na composição da membrana
plasmática. Na maturação epididimária ocorrem, além de modificações
estruturais, como a translocação e a perda da gota citoplasmática, a
modificação da composição lipídica e protéica das membranas dos
espermatozoides (VARNER et. al., 2007).
As principais classes lipídicas que fazem parte da membrana
plasmática são os fosfolipídeos, glicolipídeos e o colesterol. Em maior
proporção estão os fosfolipídeos que possuem um grupamento polar
17
(hidrofílico) composto por um aminoácido, um fosfato e um glicerol ligado a dois
ácidos graxos, formando uma cauda dupla de hidrocarbonetos de característica
hidrofóbica (QUINN, 1989). Por esse motivo, os lipídeos se juntam
direcionando as caudas, formada pelas cadeias de ácidos graxos, para a parte
interna da bicamada, permitindo que a região polar seja voltada para os meios
extracelular e citosólico (SINGER; NICOLSON, 1972). A composição lipídica da
membrana do espermatozoide dos equinos é de 57% de fosfolipídeos, 37% de
colesterol e 6% de glicolipídeos (COOPER; HAUSMAN, 2007).
Os carboidratos da membrana constituem 2 a 10% do seu peso e são
açúcares aderidos externamente a glicolipídeos e glicoproteínas, sendo
importantes no reconhecimento intercelular (STILLWELL, 2013).
A temperatura e a solução em que a membrana plasmática está
inserida determinam a sua integridade estrutural; assim, em temperatura
corporal a membrana está na forma fluida. Essa característica é decorrente da
ampla mobilidade lateral dos fosfolipídeos, apesar desses não possuírem a
mesma facilidade de se movimentarem entre as faces externa e interna da
bicamada lipídica (COOPER; HAUSMAN, 2007).
A fluidez da membrana plasmática é determinada por sua composição
lipídica. Lipídeos com cadeias lineares saturadas apresentam maior coaptação
entre si, assumindo formas mais densas e apresentando maior temperatura de
fusão; já cadeias lineares insaturadas proporcionam menor temperatura de
fusão. Porções de membrana que possuem maior relação entre colesterol e
fosfolipídeos, principalmente se forem poli-insaturados, são mais resistentes a
mudanças de temperatura (STILLWELL, 2013). Os coelhos e humanos
possuem uma maior proporção colesterol:fosfolipídeos (0,99 e 0,88,
respectivamente), o que contribui para uma maior resistência ao choque pelo
frio comparado ao equino que possui menores valores (0,36) junto com o suíno
(0,26), fato que os torna menos resistentes (MOCÉ; GRAHAM, 2006).
O fosfolipídeo que possui a amina colina ligada ao grupo fosfato, a
fosfatidilcolina, é o mais comumente encontrado na membrana plasmática,
embora outros tipos de fosfolipídeos se diferenciem entre si, tanto na
composição da cabeça polar quanto no tipo de ácido graxo que compõe a
porção apolar, de forma que ainda encontramos outros como a
18
fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, fosfatidilinositol e esfingomielina (PARKS;
LYNCH, 1992).
A proporção de fosfolipídeos que compõem a membrana plasmática
do espermatozoide equino corresponde a 23,2% de fosfatidilcolina, 8% de
fosfatidiletanolamina, 7,5% de fosfatidilserina, 6,4% de esfingomielina, 6,2% de
seminolipídeo, 2,5% de fosfatidilglicerol e 1,5% de fosfatidilinusitol (GADELLA
et al., 2001). O ácido graxo mais abundante na membrana plasmática do
espermatozoides equinos é o ácido docosopentanoico (49,9%) seguido pelo
ácido palmítico (17%) (MACÍAS GARCÍA et al., 2011).
As moléculas maiores, responsáveis pelo formato convexo da
membrana plasmática, em sua maioria se localizam anexas ao folheto externo
da bicamada lipídica, já a fosfatidilserina e a fostatidiletanolamina têm
predileção pelo folheto interno (MARTIN; PAGANOT, 1987). A que tem menor
afinidade pelos fosfolipídeos é a esfingomielina, sendo mais afim a proteínas
plasmáticas (QUINN, 1989).
O glicocálix, uma espécie de malha composta por moléculas de
carboidratos frouxamente entrelaçadas, que protege a célula como uma
vestimenta, pode ter a sua composição modificada de acordo com as
características do meio em contato com o espermatozoide (AMANN; GRAHAM,
2011). Assim, tanto a porção polar dos fosfolipídeos quanto das proteínas
podem se apresentar ligadas a esses carboidratos, o que aumenta a
complexidade dos receptores celulares e, por apresentar carga negativa,
favorece a interação com outras proteínas presentes no plasma seminal
(HAMMERSTEDT et. al., 1990).
Os fosfolipídeos, diante de uma redução da temperatura, assumem
uma forma cônica denominada “hexagonal II” ou micela invertida, na qual as
extremidades hidrofóbicas são externas e as hidrofílicas internas. Para muitos
lipídeos, a formação dessa micela invertida é transitória na ocorrência da
transição da fase fluida para a fase cristalina; entretanto, para certos
fosfolipídeos, esta estrutura persiste. Fato que gera um aumento da
permeabilidade dessa membrana com a formação de canais que permitem a
entrada de íons e pequenas moléculas, gerando desestabilização da
membrana e, assim, causando danos irreparáveis na célula (WATSON, 1995).
19
A composição da membrana plasmática determina a temperatura da
transição de fase, ou seja, uma maior quantidade de PUFAs mantém esta
estrutura no estado líquido-cristalino em temperaturas mais baixas em relação
às membranas com conformação mais rígida. A adição de lipídeos no diluidor
promove a incorporação destes na membrana (NASIRI et. al., 2012; TOWHIDI;
PARKS, 2012) e pode melhorar os parâmetros de qualidade espermática
(TAKAHASHI et al., 2012).
Espécies que apresentam maior proporção de
fosfatidilcolina:fosfatidiletanolamina são mais resistentes e as que possuem
maior quantidade de proteínas são menos resistentes ao choque térmico, esta
sensibilidade é influenciada pela classe de fosfolipídeos e a quantidade de
proteínas presentes na membrana plasmática (PARKS; LYNCH, 1992).
Em geral, a membrana plasmática dos mamíferos possui em torno de
70% de fosfolipídeos, 25% de lipídeos neutros e 5% de glicolipídeos, embora
possam existir diferenças consideráveis entre as espécies (FLESCH;
GADELLA, 2000).
O colesterol funciona como um estabilizador de membrana (MOCÉ
et al., 2010; STILLWELL, 2013), situa-se entre as caudas dos fosfolipídeos que
compõem a bicamada lipídica e reduz a formação da fase hexagonal do tipo II
através de seu efeito condensador, diminuindo a área ocupada por moléculas
que apresentam essa tendência, como a fosfatidiletanolamina. O colesterol
apresenta um aumento de afinidade pelos fosfolipídeos que contêm ácidos
graxos saturados e diminuição da afinidade por aqueles insaturados
(WASSALL; STILLWELL, 2009).
As diferenças na quantidade de colesterol podem afetar a fertilidade
e a capacidade do ejaculado de um garanhão de suportar o processo de
refrigeração e congelação (YANAGUIMACHI, 1994). Durante a refrigeração e o
reaquecimento do sêmen, ocorrem alterações nas associações lipídeo-lipídeo e
lipídeo-proteína da membrana, que podem prejudicar seu funcionamento
(PARKS; GRAHAM, 1992).
3.2 Criopreservação e lesões espermáticas
Além das diferenças individuais, algumas raças como o Mangalarga
Marchador podem demonstrar maior sensibilidade à criopreservação. Em um
20
estudo avaliando o efeito do processo de refrigeração de sêmen sobre a
qualidade espermática, os exemplares da raça Mangalarga Marchador
mostraram maior sensibilidade quando comparado aos da raça Quarto de
Milha, tanto no armazenamento a 5°C quanto a 15°C, nos momentos 12 e 24
horas, apresentando maior sensibilidade nos parâmetros de motilidade total,
motilidade progressiva e na velocidade média do trajeto (FARRÁS et. al.,
2014).
Constatou-se que existe um fator racial influenciador da resistência
espermática também ao processo de congelação. A raça Mangalarga
Marchador tem mostrado piores resultados na criopreservação quando
comparadas a cavalos de salto, a exemplo do Hanoveriano, Holsteiner e
Trackenner, além dos Quartos de Milha. Assim, a maioria dos animais desta
raça é considerada “maus congeladores”, isto é, garanhões que apresentam
motilidade total abaixo de 30% após a descongelação do sêmen (GOMES et
al., 2002).
Os danos que os espermatozoides sofrem durante a criopreservação
podem ser ultra-estruturais ou físicos, bioquímicos ou funcionais. Os protocolos
de criopreservação são feitos para minimizar tais efeitos negativos (ALMEIDA,
2006).
Em temperaturas mais baixas ocorre uma diminuição da
movimentação lateral dos lipídeos no folheto da membrana plasmática. Isso se
dá em decorrência da força de atração de Van Der Walls que aproxima ainda
mais os ácidos graxos, dando início à transição de fase entre o estado líquido
cristalino e o estado gel (AMANN; GRAHAM, 2011).
O entrave das técnicas da criopreservação não está na habilidade
espermática em manter-se viável à temperatura de -196ºC, mas sim nos danos
que a célula sofre durante a refrigeração, a congelação e a descongelação,
principalmente entre -15° e -60ºC, faixa de temperatura que os
espermatozoides têm que passar duas vezes, uma no processo de congelação
e outra na descongelação (AMANN; PICKETT, 1987).
Quando a célula espermática é submetida ao frio e atinge a
temperatura de 19ºC, os lipídeos que apresentam a transição de fase com
temperaturas mais altas começam a mudar de estado físico. Aqueles
fosfolipídeos que têm como característica uma menor afinidade pelo arranjo em
21
dupla camada lipídica e, assim associam-se com proteínas, aproximam-se,
podendo alterar sua apresentação, resultando em modificações da capacidade
funcional da membrana plasmática. Essas associações lipoproteicas vão
agregando cada vez mais lipídeos conforme a temperatura diminui, finalizando
com toda a membrana plasmática em estado gel à temperatura de 8ºC
(HAMMERSTEDT et. al., 1990).
Dentre as lesões que a refrigeração pode ocasionar estão: a queda da
motilidade espermática, o movimento anormal do espermatozoide e a lesão na
membrana plasmática e em outros componentes celulares (AURICH, 2005).
Nas temperaturas de refrigeração rápida do sêmen equino, entre 20° e
5ºC, há a predisposição do espermatozoide ao choque térmico. Especialmente
nessa faixa de temperatura o sêmen deve ser resfriado lentamente
(MCKINNON, 1996), visto que a faixa de temperatura em que os
espermatozoides são mais sensíveis é entre 19 e 8ºC, visando um menor dano
na membrana plasmática (MORAN et al., 1992).
Curvas de refrigeração mais rápidas que -0,9ºC/min (VARNER et al.,
1988) e mais lentas que -0,05ºC/min (DOUGLAS-HAMILTON et al., 1984)
influenciam de forma negativa a motilidade espermática. Uma taxa de
refrigeração mais lenta parece proporcionar um tempo maior para a
reorganização dos lipídeos da membrana plasmática, desta forma, há a
recomendação do uso de uma taxa de -0,05°C/min entre as temperaturas de
19 e 8°C (SQUIRES et al., 1999).
Segundo Squires et al. (1999) há uma queda de 50% da taxa
metabólica a cada 10ºC reduzidos, consequentemente o sêmen conservado a
15ºC utiliza cerca de 25% da sua capacidade metabólica, enquanto a
conservação a 5ºC reduz este gasto para valores próximos de 8%. No entanto,
ocorre uma perda da motilidade e viabilidade entre a faixa de temperatura de
zero a 2ºC, em decorrência de uma menor atividade principalmente de algumas
proteínas estruturais no que tange a circulação de nutrientes e produtos tóxicos
do interior da célula (MORAN et al., 1992; AMANN; GRAHAM, 2011).
Os espermatozoides serão submetidos ao choque térmico se a
refrigeração for realizada de forma inadequada durante a criopreservação, fato
que irá induzir danos celulares irreversíveis como: movimentos anormais,
diminuição da motilidade, lesões do acrossoma e da membrana plasmática,
22
redução do metabolismo celular e perda de componentes celulares. O primeiro
choque térmico pelo qual os espermatozoides passam durante o processo de
congelação ocorre durante a redução de temperatura entre 37°C e 5°C
(GRAHAM, 1996).
A criopreservação possui várias etapas que podem ser danosas aos
espermatozoides tais como: a alternância da temperatura, o estresse osmótico
e tóxico causado pela presença dos crioprotetores e a formação e dissolução
de gelo no ambiente extracelular. O espermatozoide deve manter sua
integridade para que seja possível a fecundação, para isso são condições
básicas: o metabolismo energético, a motilidade progressiva e a integridade da
região acrossomal e das suas proteínas de membrana (ALMEIDA, 2006).
Os processos de criopreservação podem induzir a reação acrossômica
precoce em decorrência da desestabilização da membrana plasmática
espermática, principalmente pelo efluxo de cálcio que favorece a fusão entre a
membrana plasmática e a porção interna da membrana acrossomal externa,
fato que diminui a vida útil do espermatozoide no trato reprodutivo feminino e a
fertilidade na inseminação artificial (WATSON, 1995).
O ponto de congelação de uma solução é determinado pela
concentração de partículas solutas contidas nela (AMANN; PICKETT, 1987). A
água pura congela e cristais de gelo são formados a 0°C e à medida que isso
acontece, os espermatozoides ficam retidos em canais de solvente que se
formam e permanecem líquidos. Este processo resulta no aumento da
concentração dos solutos no meio que permanece descongelado. Com o início
da congelação, ocorre o efeito de solução, que gera progressivamente um
gradiente osmótico, que força a água a sair dos espermatozoides,
desidratando-os e aumentando a concentração dos eletrólitos intracelulares
(MAZUR, 1970).
Uma alta concentração de solutos pode causar desidratação
espermática, levando a deformações celulares, danos na estrutura da
membrana, desnaturação de proteínas, deslocamento de proteínas de
membrana e desarranjos nas estruturas do citoesqueleto (GRAHAM, 1996).
Nos protocolos de congelação, o uso de uma curva lenta torna os
espermatozoides suficientemente desidratados e reduz a formação de grandes
cristais de gelo no meio intracelular. Porém, este processo resulta em alta
23
concentração de solutos no meio intracelular, que causam danos à célula. No
caso inverso, com o uso de uma curva moderadamente rápida (-25 a -
40°C/min), a água do compartimento intracelular não congela e se difunde para
fora da célula devido à alta concentração de soluto no meio extracelular. Este
processo resultará em desidratação celular. Os espermatozoides começam a
apresentar mudanças biofísicas na membrana plasmática em temperaturas
abaixo de -20°C e em temperaturas abaixo de -60°C sofrem efeitos de
descompensação iônica e dos lipídeos causadores de choque térmico
(GRAHAM, 1996).
3.3 Substâncias crioprotetoras
Independente da técnica de congelação utilizada é imprescindível
lançar mão de crioprotetores a fim de proteger os espermatozoides de injúrias
(ALVARENGA et al., 2005). No entanto, a sua adição aos diluidores gera
estresse osmótico aos espermatozoides, tendo em vista que a grande maioria
dos crioprotetores intracelulares eleva a osmolaridade da solução (SANTOS,
2003).
A ocorrência de uma variação do volume celular, pela entrada e saída
do crioprotetor e da água é uma das principais causas de inviabilidade
espermática após a descongelação. Assim, a alta permeabilidade de alguns
tipos de crioprotetores é desejável visando minimizar o choque osmótico
(GOMES et al., 2002).
Existem dois grandes grupos em que podemos distribuir as
substâncias crioprotetoras, são esses: os intracelulares e os extracelulares. O
primeiro atravessa a membrana plasmática e age no meio intracelular, são as
pequenas moléculas como o etilenoglicol, glicerol, propilenoglicol,
dimetilsulfóxido, acetamida e outras amidas. Já o segundo grande grupo é
composto por grandes moléculas que não atravessam a membrana plasmática
e podem ser proteínas como as contidas no leite e na gema de ovo, açúcares e
polímeros sintéticos. Os crioprotetores intracelulares possuem propriedades de
ligação com a molécula da água, ou seja, os agentes têm estruturas que
promovem ligações de hidrogênio com a molécula da água que mudam a
orientação desta nos cristais de gelo, aumentam a viscosidade da solução de
congelação, consequentemente, reduzem o ponto de congelação da mesma,
24
promovendo um ambiente menos nocivo para as células espermáticas. Além
disso, também agem prevenindo a exposição a altas concentrações de
eletrólitos, através da ligação aos próprios eletrólitos ou pela substituição
parcial pela água (HUBÁLEK, 2003).
Os crioprotetores extracelulares são responsáveis por um mecanismo
de proteção no meio externo. Alguns atuam através de um efeito osmótico,
induzindo a saída da água da célula para prevenir a formação de cristais de
gelo no meio intracelular e outros atuam melhorando a estabilidade da
membrana plasmática (AMANN; PICKETT, 1987).
Os crioprotetores mais utilizados na composição dos diluidores de
congelação de sêmen de garanhões são o glicerol e a gema de ovo (CLULOW
et al., 2007). Por possuir lipoproteínas de baixa densidade, a gema de ovo,
quando adicionada ao diluidor seminal, contribui para manter a pressão
colóide-osmótica do meio e auxilia na estabilização da membrana espermática
durante a congelação e descongelação (FOULKES, 1977).
3.4 Estresse oxidativo no espermatozoide
Estudos apontam que as espécies reativas de oxigênio (ROS)
desempenham um papel importante na função espermática e que a sua
produção ou degradação em desequilíbrio são causadores do estresse
oxidativo, promovendo danos ao espermatozoide. Diversos mecanismos têm
sido propostos para explicar a geração de ROS no meio seminal, estes podem
aparecer em decorrência do metabolismo oxidativo e da presença de
espermatozoides anormais ou danificados que podem aumentar
indesejadamente a sua concentração (BALL; VO, 2001).
Esse desequilíbrio, entre a produção e a eliminação das ROS, culmina
em peroxidação de grande quantidade de lipídeos insaturados de membrana,
diminuição da motilidade espermática, retardo na fusão da membrana
acrossomal e danos no DNA (AITKEN, 1995). Por outro lado, muitos processos
bioquímicos, a exemplo da defesa contra microorganismos patogênicos,
crescimento celular e maturação espermática de mamíferos, necessitam de
algumas ROS em concentrações reduzidas (LAMIRANDE; GAGNON, 1993).
25
Na lipoperoxidação (LPO) ocorre a deterioração oxidativa de lipídeos
poli-insaturados (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015). É uma reação em cadeia
que ocorre em etapas: iniciação, propagação e terminação.
A LPO se inicia pela ligação a um lipídeo por qualquer espécie que
tenha reatividade suficiente para abstrair um átomo de hidrogênio de um grupo
metileno (-CH2-), etapa chamada de iniciação, onde se tem a formação de um
radical centrado no carbono metilênico (-·CH-) pela retirada do seu H·,
provocando um desemparelhamento de elétrons neste mesmo carbono. Assim,
a ação mais provável deste novo radical será combinar-se com o O2
produzindo novos radicais, ainda mais reativos. A próxima fase é chamada de
propagação da peroxidação onde ocorre a formação de novos compostos pela
combinação do radical de carbono com o O2, os radicais peroxil ou radical
peróxido (LOO•), os quais reagirão com outros lipídeos adjacentes (reação em
cadeia). Esta combinação do radical peroxila com um átomo de hidrogênio
abstraído de outra molécula gera hidroperóxidos de lipídeos (LOOH) ou apenas
peróxidos (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015). Por fim, a cadeia de terminação
ocorre apenas quando há a reação de dois radicais peroxilas, formando
carbonilas, alcoóis e oxigênio singlete, uma espécie excitada de O2 com alta
capacidade oxidante (FRANKEL, 1991).
Tem-se verificado que o espermatozoide é particularmente
susceptível ao ataque das ROS (JONES; MANN, 1977). Devendo-se tal fato a
parca quantidade de citoplasma no espermatozoide, assim a quantidade de
antioxidantes é também menor, principalmente os tipos enzimáticos (VERNET
et. al., 2004). Somado a isso, a elevada quantidade de PUFAs na sua
membrana plasmática, sendo 49,9 % de ácido docosopentanoico seguido de
17% de ácido palmítico, promove a sua fluidez, essencial para os eventos
relacionados á fertilização, no entanto essa característica o torna ainda mais
vulnerável (AGARWAL; SAID, 2003).
Os ácidos graxos formados por cadeias de átomos de carbono
ligados a hidrogênio com um grupo carboxila terminal (COOH), apresentam
insaturações decorrentes de ligações duplas entre carbonos, fato que os dota
de certa fluidez. As ROS oxidam preferencialmente as ligações carbono-
hidrogênio no grupo metileno (CH2) adjacente à ligação dupla. Após iniciado, o
26
processo oxidativo se intensificará, pois se torna autocatalítico, levando à
formação de hidroperóxidos e produtos secundários (DIX; AIKENS, 1993).
O teste do ácido tiobarbitúrico (TBA) é a técnica mais rotineiramente
utilizada para medir a lipoperoxidação. É um método espectrofotométrico que
mensura a concentração dos produtos da lipoperoxidação. Na etapa de
iniciação da lipoperoxidação há um excesso de hidroperóxidos de lipídeos na
membrana espermática, que ao se decompor formam vários aldeídos, entre
eles o malonaldeído. O produto final medido é o malonaldeído (MDA) ou
substâncias reativas do ácido tiobarbitúrico – TBARS (SANOCKA; KURPISZ,
2004).
3.5 Radicais livres e Espécies Reativas de Oxigênio
Um radical livre é qualquer átomo, molécula ou íon que possui um ou
mais elétrons livres na sua órbita externa. São substâncias altamente instáveis,
com meia-vida curta e quimicamente muito reativas e, por apresentarem esses
elétrons desemparelhados na última camada, costumam se ligar a outro elétron
em busca da estabilidade, independente de ser uma molécula, uma célula ou
tecido orgânico. Os compostos costumam, ao doar um elétron, tornarem-se
oxidados e ao receberem um elétron tornarem-se reduzidos, esse tipo de
reação é conhecido como de oxiredução (FERREIRA; MATSUBARA, 1997).
Um elétron desemparelhado pode se ligar a átomos isolados
(hidrogênio ou íons metálicos), ou ainda, com moléculas (açúcares, proteínas,
lipídeos, DNA) resultando num processo de relevância biológica (SLATER,
1984). Concomitante a isso, os radicais livres já foram relacionados a várias
doenças humanas e participam como componentes fundamentais em muitas, o
que mostra a importância do dano oxidativo (HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2015).
É na mitocôndria que a geração de radicais livres tem início através do
metabolismo oxidativo. No processo de geração de energia pode ocorrer a
perda de prótons, que serão usados para a produção de ROS ou para as
espécies reativas de nitrogênio. Outras substâncias reativas também podem
ser formadas, no entanto podem não ser consideradas radicais livres por não
terem elétrons desemparelhados na última camada (SILVA, 2006), a exemplo
do H2O2 capaz de atravessar a membrana nuclear e induzir danos na molécula
de DNA por meio de reações enzimáticas (LIOCHEV, 2013), este é importante
27
porque participa das reações que produzem o radical OH-, seja via reação de
Fenton ou de Haber-Weiss (MISRA et al., 2009).
Devido a sua configuração eletrônica, o oxigênio, principal oxidante em
virtude do metabolismo aeróbico, tende a receber um elétron de cada vez, o
que acarreta na formação de compostos intermediários altamente reativos
(ROS). Assim, as ROS são todos os radicais e não radicais derivados do
oxigênio. O primeiro composto obtido é o radical superóxido, formado quando o
O2 sofre a redução univalente isoladamente. Esse radical é pouco reativo e,
portanto, não é altamente citotóxico. As ROS na dose certa são importantes em
diversas funções fisiológicas ligadas a reprodução, principalmente a
capacitação espermática, a reação acrossomal e a interação do oócito com o
espermatozoide (BURNAUGH et. al., 2007). Caso contrário, quando as ROS
estão em quantidades excessivas e o sistema antioxidante não é capaz de
neutralizá-las, são capazes de causar prejuízos na motilidade e na viabilidade
espermática (AITKEN et al., 2014; VARNER et. al., 2015).
A relação entre a produção de ROS e a fertilidade ainda apresenta
fatores a serem descobertos. No entanto, Varner et. al. (2015) mencionaram
que quando o espermatozoide é submetido ao armazenamento, a presença
das ROS resulta em danos irreversíveis causados pelo estresse oxidativo,
tanto no DNA como na diminuição da funcionalidade espermática devido à
redução extracelular de antioxidantes que protegeriam essa célula da ação dos
radicais livres.
O ânion superóxido (O2-), primeiro radical livre formado pelo
metabolismo oxidativo, é rapidamente dismutado em peróxido de hidrogênio
(H2O2) e possui meia-vida curta (BURNAUGH et. al., 2007). Possui pouca
permeabilidade nas membranas plasmáticas, tornando-se prejudicial somente
no compartimento onde é produzido. A sua produção nos espermatozoides se
dá a partir de uma enzima dependente de cálcio do tipo NADPH oxidase
específica para essa célula chamada NOX5, presente na mitocôndria, também
pode ser encontrada na membrana plasmática e com grandes concentrações
na região acrossomal (SABEUR; BALL, 2007).
O H2O2 não possui nenhum elétron desemparelhado, assim não é
classificado como um radical livre, porém possui grande reatividade,
favorecendo a ocorrência de danos celulares no espermatozoide. É uma
28
molécula mais estável e mais permeável que o O2-, por esse fato perpassa
pelas membranas mais facilmente (BAUMBER et al., 2000), assim não fica
somente limitada ao compartimento em que foi produzido.
A produção de H2O2 pode acontecer pela redução espontânea do
radical hidroperoxil (HO2). O HO2 é a forma protonada do radical superóxido e
possui uma ação oxidante mais severa, tendo predileção por agir nas
moléculas de PUFAs (BIELSKI et. al., 1983). Outra forma de geração do H2O2
se dá pela ação da enzima superóxido dismutase que catalisa a reação
química envolvendo o O2- e H+, gerando H2O2 e O2 (NORDBERG; ARNÉR,
2001; SILVA, 2006).
O H2O2 também dá origem a outros compostos reativos como o ácido
hipocloroso (HOCl) e o radical hidroxila (OH-) (NORDBERG; ARNÉR, 2001). Os
neutrófilos são os responsáveis pela maior produção do HOCl pela ação da
enzima mieloperoxidase, ativada pelo complexo NADPH. Na ocorrência de
inflamações no trato genital masculino, esse composto ataca as duplas
ligações dos PUFAs que estão ligados aos fosfolipídeos da membrana
(ARNHOLD et al., 2001).
O radical OH- é formado pela reação de Fenton a partir do H2O2,
catalisada por íons metálicos como Fe2+ ou Cu+ geralmente ligados a proteínas
ou outras moléculas (NORDBERG; ARNÉR, 2001). A lipoperoxidação (LPO),
depois de iniciada na presença do OH-, segue uma reação em cascata,
necessitando da presença do íon Fe2+ (BALL; VO, 2002).
Outros exemplos de radicais livres oriundos do oxigênio são os
radicais peroxil (ROO). A forma mais simples destes radicais é hidroperoxil
(HOO) que tem papel na peroxidação de ácidos graxos. Os radicais livres
podem desencadear reações em cadeia de LPO, retirando um átomo de
hidrogênio de um carbono de metileno de cadeia lateral. O radical lipídico então
reage com oxigênio para produzir ROO. O ROO então inicia uma reação em
cadeia e transforma os PUFAs em hidroperóxidos lipídicos. Os hidroperóxidos
lipídicos são muito instáveis e facilmente decompostos em produtos
secundários como os aldeídos e malondialdeídos (MDAs). A LPO desestabiliza
as membranas celulares e leva ao rearranjo das estruturas da membrana
(BIRBEN et al., 2012).
29
A oxidação dos ácidos graxos pode ser enzimática ou não
enzimática. A primeira gera compostos específicos com função anti-
inflamatória que podem estar ligados aos mecanismos de proteção mediados
por DHA (KASUGA et al., 2008). Por outro lado, a oxidação não enzimática
promovida por espécies reativas gera uma série de compostos, muitos deles
ainda pouco estudado. Os lipídeos poli-insaturados como o DHA, são
susceptíveis á oxidação, gerando uma série de produtos oxidados, entre esses
os hidroperóxidos (LOOH), que sendo mais polares podem modificar a
estrutura e a função das membranas e consequentemente serem deletérios
para as células (YIN et al., 2005).
3.6 Ácidos graxos poli-insaturados (PUFA)
Os ácidos graxos são constituintes estruturais das membranas
celulares, com funções energéticas e de reservas metabólicas, além de
formarem hormônios e sais biliares. Alguns são sintetizados pelo organismo,
outros não. Os ácidos graxos cuja biossíntese é deficitária são denominados de
essenciais, são esses: o ácido linolênico (ω-3) e o ácido linoléico (ω-6). Para
suprir a demanda orgânica, os mesmos devem ser obtidos em quantidades
suficientes via alimentação (VALENZUELA; NIETO K., 2003).
O ω-3 e o ω-6 são considerados precursores dos PUFAs de cadeia
longa: o ácido araquidônico (AA), o ácido eicosapentaenoico (EPA), e o ácido
docosahexaenoico (DHA). Em particular o DHA (22: 6n-3) e o EPA (20: 5n-3),
são compostos orgânicos especialmente importantes para a maioria dos
animais, agindo em uma série de processos fisiológicos importantes. São
PUFAs com uma ligação dupla no terceiro átomo de carbono do final da cadeia
de carbono e desempenham um papel importante na funcionalidade dos
espermatozoides e na resistência ao frio (FAIR et al., 2014; TOWHIDI; PARKS,
2012).
Os vertebrados devem obter EPA e DHA diretamente da dieta ou,
indiretamente, consumindo seu precursor molecular, o PUFA de cadeia curta ω-
3, ácido alfa linolênico (ALA, 18: 3n-3) e, em seguida, converter ALA em EPA e
DHA. A capacidade de qualquer espécie animal em converter ALA para o EPA
bioativo e DHA depende da disponibilidade de EPA e DHA em sua dieta
(TWINING et al., 2016).
30
Em mamíferos, a composição da membrana espermática é
caracterizada por uma alta proporção de ácido graxo ω-3 (PARKS; LYNCH,
1992; DÍAZ et al., 2016). É bem conhecido que os espermatozoides estão
expostos a numerosos fatores prejudiciais durante o processo de congelação e
descongelação. O sucesso nesses procedimentos depende em grande parte
da resistência da membrana a esses fatores (WATSON, 2000), que estão
associados a uma perda ou diminuição da motilidade, viabilidade, capacidade
de fertilização e a um fenômeno comumente conhecido como "choque frio"
(HOLT et. al., 1992).
Os PUFAs são incorporados as células testiculares por difusão passiva
através da bicamada lipídica e/ou transporte facilitado de proteínas, mediado
pela glicoproteína CD36, que é amplamente expressa nas células de Sertoli.
Os lipídeos são essenciais para as funções das células de Sertoli e também
são utilizados para formação da membrana das células germinativas (RATO et
al., 2014).
Os PUFAs são especialmente importantes no espermatozoide por sua
alta concentração na membrana plasmática, o que torna os espermatozoides
altamente susceptíveis ao estresse oxidativo. A função destes na constituição
da membrana espermática e na fecundação foi confirmada em diversos
trabalhos com diferentes espécies (LEAT et al., 1983; LANGLAIS; ROBERTS,
1985; LADHA, 1998).
Somado a isso, estudos indicam que a composição lipídica da
membrana espermática de diversas espécies influencia a resistência ao
choque frio na criopreservação (PARKS; LYNCH, 1992).
O DHA é o PUFA mais importante para o espermatozoide, atuando na
fluidez da membrana espermática e na regulação da espermatogênese
(OLLERO et al., 2000; GHOLAMI et al., 2010).
Nichi (2009) considera que a alta quantidade de PUFAs na
membrana espermática favorece a uma maior susceptibilidade a ação
prejudicial das ROS e estresse oxidativo, sendo assim possível inferir que um
tratamento com o propósito de alterar o perfil lipídico seminal ou espermático
também seria capaz de causar enorme impacto para essas células de forma
que, quando esses PUFAs fossem incorporados à membrana espermática, isso
aumentaria a sua susceptibilidade ao ataque das ROS, o que poderia ser
31
evitado pela inclusão de substâncias antioxidantes aos diluidores seminais.
Além disso, na possibilidade da não incorporação dos ácidos graxos a
membrana plasmática, as células espermáticas seriam poupadas dos ataques
dos ROS, já que os PUFAs permaneceriam no meio extracelular gerando um
aumento da quantidade de substrato para a ação destas neste local.
3.6.1 Ácido Docosahexaenoico (DHA)
O DHA é um PUFA da série n-3 essencial (NAKAMURA; NARA, 2003),
possui 22 átomos de carbono e seis duplas ligações na cauda hidrocarbonada
e pode ser rapidamente incorporado nas membranas celulares, aumentando
sua fluidez pela formação de domínios mais desordenados (WASSALL;
STILLWELL, 2009).
O fígado é considerado o seu principal local de síntese (SCOTT;
BAZAN, 1989), que se dá de forma geral pela dessaturação do ácido α-
linolênico a 18:4n-3 (cis-6,9,12,15-18:4) pela ação da enzima ∆6-dessaturase
que insere uma dupla ligação na posição 6. A partir daí a enzima elongase
alonga a sua cadeia carbônica a 20:4n-3 (cis-8,11,14,17-20:4) que em seguida
é convertida a 20:5n-3 (cis-5,8,11,14,17- 20:5, ácido eicosapentaenoico, EPA)
pela ∆5-dessaturase e posteriormente alongado a 22:5n-3 (cis-5,8,11,14,17-
22:5) no retículo endoplasmático. Neste local, o ácido graxo 22:5n-3 sofre
adição de 2 carbonos formando 24:5 (cis-9,12,15,18,21-24:5), o qual é
convertido a 24:6 (cis-6,9,12,15,18,21-24:6) pela ação de uma ∆6-dessaturase
(KIM, 2007).
Em um estudo utilizando fibroblastos de pacientes com problemas na
oxidação mitocondrial e peroxissomal de ácidos graxos, foi observado que os
peroxissomos e não as mitocôndrias estão relacionados à formação do DHA.
De forma que em mamíferos, o DHA é sintetizado através de etapas adicionais
envolvendo reações de alongamento, dessaturação e por fim encurtamento da
cadeia nos peroxissomos (FERDINANDUSSE et al., 2001). Deste modo, a
partir da formação de 24:6n-3, este segue para os peroxissomos onde é
convertido a DHA pela remoção de dois carbonos da cadeia por β-oxidação. O
DHA formado é transferido de volta ao retículo endoplasmático e rapidamente
incorporado aos fosfolipídios de membrana por nova esterificação ou por
reação de deacilação-reacilação (KIM, 2007).
32
A molécula do DHA possui uma alta versatilidade em sua conformação
espacial em virtude da presença de seis duplas ligações. Os PUFAs se
apresentam em forma de “U”, e possuem uma área tridimensional maior que o
ácido graxo saturado, porém, quando comparado a um ácido graxo mono-
insaturado, essa área torna-se menor devido à disposição em “L” deste último.
O fato dos PUFAs, em especial o DHA, não apresentar uma forma fixa favorece
a fluidez da membrana plasmática por possuir essa flexibilidade na sua
conformação (Figura 4) (GAWRISCH et. al., 2003).
Figura 4. Diferentes conformações espaciais do ácido docosahexaenoico. Fonte: Garwisch et al. (2003)
O DHA apresenta afinidade por proteínas estruturais quando
incorporado na membrana plasmática e, em torno dessas proteínas, formam-se
domínios ricos em DHA. No entanto, este possui parca afinidade pelo
colesterol. Assim, o aumento da quantidade de DHA no meio pode mudar a
composição lipoproteica da membrana plasmática, influenciar na temperatura
de transição de fase, na permeabilidade, na fusão entre membranas e na
inversão dos fosfolipídeos entre os folhetos da membrana plasmática (flip-flop)
(STILLWELL; WASSALL, 2003).
O DHA é prontamente incorporado em uma variedade de células,
principalmente em fosfolipídeos da membrana plasmática (ZEROUGA et al.,
1996) e mitocôndria (TAHIN et. al., 1981; STILLWELL et al., 1997). No entanto,
não é distribuído igualmente em todas as classes de fosfolipídeos, é
incorporado, principalmente, em aminofosfolipídeos, sendo a maior parte em
fosfatidiletanolamina e em menor proporção na fosfatidilserina (MARSZALEK;
LODISH, 2005).
Na figura 5, podemos observar que após a adição de DHA na dieta
(MCLENNAN et al., 1993) ou após incubação de células de tumor cultivadas
33
com esse ácido graxo (ZEROUGA et al., 1996), o DHA demonstrou ser
inicialmente incorporado na fosfatidiletanolamina com quantidades menores em
fosfatidilcolina e outras classes de fosfolípideos (STUBBS; SMITH, 1984;
ROBINSON et al., 1993).
Figura 5. Incorporação do DHA ao fosfolipídeo e a associação desse fosfolipídeo com o colesterol, que também inclui as proteínas transmembranas com alta afinidade pelo DHA. Fonte: Adaptada de Stillwell e Wassal (2013).
O colesterol modula propriedades físicas das membranas, fato bem
documentado nas compostas por cadeias com radical acila, derivados da
oxidação dos ácidos graxos (FINEGOLD, 1992). Mas pouco se sabe em
membranas contendo o DHA. Na membrana plasmática da maioria das células
animais, o maior lipídeo polar não é um fosfolípideo, mas sim o colesterol.
Nessas membranas, as moléculas de DHA devem ser expostas ao colesterol e
a interação com essas pode afetar profundamente a sua estrutura e função.
Existe uma forte correlação entre as várias propriedades das membranas e a
presença do colesterol (SHINITZKY, 1984). Como exemplo, em membranas
sinápticas, os PUFAs e o colesterol são os principais determinantes da
organização molecular da membrana (HIBBELN, 1995).
Há a presença de altas concentrações de DHA em espermatozoides
de bovinos (NEILL; MASTERS, 1972) e relatos de que na cauda do
espermatozoide de primatas há 99% de DHA, pois esta região está
34
provavelmente ligada à necessidade de uma maior fluidez e flexibilidade,
devido ao seu movimento flagelar (CONNOR et al., 1998).
Em um estudo com adição in vitro de óleo de peixe, rico em DHA, ao
diluidor de congelação de sêmen em quatro raças diferentes de suínos, os
autores concluíram que a adição foi eficaz em preservar melhor a integridade
da membrana plasmática e a motilidade progressiva pós-descongelação. Além
disso, melhorou a fluidez de membrana, o que pode ser explicado por uma
possível incorporação do DHA livre do diluidor na membrana plasmática,
aumentando assim a sua fluidez e tornando-a mais criotolerante durante o
processo de congelação (KAEOKET et al., 2010).
Diversos estudos relatam as vantagens da suplementação com DHA
na manutenção da qualidade seminal de várias espécies como a humana
(SAFARINEJAD et al., 2010), a bovina (GHOLAMI et al., 2010), os roedores
(rato) (ROQUETA-RIVERA et al., 2010), a suína (MITRE et al., 2004) e a
equina (HARRIS et al., 2005). Além disso, o DHA foi reconhecido como
elemento principal nos fosfolipídeos de espermatozoides em humanos
(SAFARINEJAD, 2011) e em ruminantes (ESMAEILI et al., 2014; FAIR et al.,
2014).
O estabelecimento da correlação entre uma maior quantidade de
ácidos graxos e motilidade, viabilidade e fluidez mostra a importância de se
estudar de forma abrangente o perfil desses compostos nas diversas espécies.
A correlação entre uma menor quantidade de lipídeos totais nos
espermatozoides de caprino e infertilidade foi relatada anteriormente (AM-IN et
al., 2011). Assim, os ácidos graxos presentes nos espermatozoides de cada
espécie podem influenciar seus parâmetros espermáticos (ESMAEILI et al.,
2015).
Em dois trabalhos semelhantes, onde foi testada a adição de DHA
isoladamente ou em conjunto com vitamina E ao diluidor de congelação de
sêmen na espécie bovina, foi relatada a incorporação deste ácido graxo, por
meio da análise das mudanças na composição lipídica da membrana
plasmática do espermatozoide por cromatografia gasosa e melhor conservação
da qualidade seminal pós-descongelação quando os dois compostos foram
associados (NASIRI et. al., 2012; TOWHIDI; PARKS, 2012). Os maiores
valores de motilidade e membranas plasmáticas íntegras podem ser explicados
35
pela incorporação do DHA, fato que pode ter aumentado a flexibilidade da
membrana e protegido os espermatozoides dos efeitos deletérios da
congelação (NASIRI et. al., 2012).
É importante frisar que a associação de um PUFA com um antioxidante
se mostra importante devido à susceptibilidade ao ataque das ROS nas duplas
ligações do DHA (TOWHIDI; PARKS, 2012).
3.7 Antioxidantes
Um antioxidante é qualquer substância que retarda ou previne
significantemente a oxidação de um substrato. Exercendo proteção através da
prevenção de sua ocorrência, da interceptação de substâncias oxidativas
formadas e do reparo das reações de oxidação depois de ocorridas (SALEH;
AGARWAL, 2002).
A sua primeira linha de defesa é a prevenção da formação de ROS,
através do controle da quelação de metais de transição que ao se soltarem dos
produtos da redução do oxigênio, produzem oxidantes secundários ainda mais
reativos, como o radical hidroxila nas reações de oxidação (HALLIWELL,
1991).
A interceptação das ROS se baseia na quebra da reação em cadeia
que ocorre com os radicais livres para a formação de produtos oxidantes. Esta
quebra promovida por certos antioxidantes, como por exemplo, o α-tocoferol,
deve resultar em produtos finais não radicais, ou seja, sem elétrons
despareados (SIES, 1993).
O reparo dos danos provocados por agentes oxidantes pode ocorrer
em alguns casos, no entanto, no espermatozoide este mecanismo de defesa se
torna impossível, pois este não possui os sistemas de enzimas citoplasmáticas
necessárias a esta função, tendo em vista o pouco conteúdo citoplasmático
existente. Estas características aliadas à grande quantidade de PUFAs em sua
membrana fazem do espermatozoide uma célula especialmente susceptível à
oxidação lipídica (ALVAREZ et. al., 1987; AITKEN et al., 1989).
Os antioxidantes que representam a defesa dos organismos contra as
ROS são divididos em dois tipos principais: enzimáticos e não enzimáticos. Os
enzimáticos são enzimas produzidas pelo próprio organismo e atuam primeiro
evitando o acúmulo do ânion superóxido e do peróxido de hidrogênio. Dentre
36
esses antioxidantes enzimáticos, os mais importantes são: o superóxido
dismutase (SOD), a catalase (CAT) e a glutationa peroxidase (GPx). Os
antioxidantes não-enzimáticos são obtidos a partir da dieta, podendo ser
divididos ainda em hidrofílicos (glutationa, vitamina C, indóis, catecóis) e
lipofílicos (bioflavonas, vitamina A, vitamina E) (AITKEN, 1995).
No meio extracelular, o espermatozoide é protegido pelo plasma
seminal que contém redutores de ROS, tendo em vista que esta célula é pobre
em citoplasma e deficiente em enzimas antioxidantes (DONNELLY et. al.,
1999), tais como superóxido dismutase (ALVAREZ et. al., 1987), sistema
glutationa peroxidase / glutationa redutase (CHAUDIERE et. al., 1984) e
catalase (JEULIN et al., 1989). Além destes, existem no plasma seminal outros
antioxidantes não enzimáticos, tais como: o ascorbato (FRAGA et al., 1991),
urato (THIELE et al., 1995), α-tocoferol (AITKEN; CLARKSON, 1988), piruvato
(DE LAMIRANDE et al., 1997), glutationa (LENZI et al., 1994), taurina e
hipotaurina (ALVAREZ; STOREY, 1983).
Os antioxidantes enzimáticos atuam em cascata, sendo que a
superóxido dismutase ativa a dismutase do ânion superóxido (O2-), provocando
a formação do peróxido de hidrogênio (H2O2). Este, por sua vez, pode ser
eliminado pela catalase ou pela glutationa peroxidase (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2015), evitando a formação do radical hidroxila (OH-), a ROS
mais prejudicial ao espermatozoide (HALLIWELL, 1991).
Uma possível causa para os diferentes resultados, tanto favoráveis
quanto desfavoráveis, relacionadas aos tratamentos de amostras de sêmen
com antioxidantes é a diversidade de concentrações utilizadas nos
experimentos. A produção de ROS por espermatozoides difere entre as
espécies e é um processo fisiológico importante para a regulação da taxa de
hiperativação, para a reação acrossômica e para a fusão do espermatozoide
com o oócito, assim a quantidade suficiente de antioxidante para controlar a
ação das ROS também difere entre as espécies (KODAMA et. al., 1996; DE
LAMIRANDE et al., 1997; SENGOKU et al., 1998).
A influência do H2O2 e do O2- na capacitação espermática equina foi
avaliada quando incubaram espermatozoides na presença do sistema xantina-
xantina oxidase (X-XO, gerador de H2O2 e do O2). As ROS geradas pelo
sistema X-XO promoveram a capacitação espermática e a adição de catalase
37
ou SOD não permitiu o aumento do número de espermatozoides com reação
acrossomal precoce, indicando a participação de ambas na capacitação
espermática nessa espécie (BAUMBER et al., 2003).
O armazenamento por longos períodos através das técnicas de
criopreservação, apesar de diminuir o metabolismo celular é acompanhado de
uma maior geração de ROS e, sem uma proteção adequada via antioxidantes,
pode lesionar irreversivelmente o DNA e à funcionalidade do espermatozoide.
De forma que, a busca por um antioxidante eficaz se faz necessária para
proteger os espermatozoides frente aos efeitos nocivos do estresse oxidativo
(VARNER et. al., 2015).
3.7.1 Vitamina E
É uma substância considerada essencial, derivada do ácido
homogentísico, encontrada em diversos vegetais, como a soja e o milho,
podendo se acumular no tecido adiposo dos animais. É um composto
lipossolúvel descoberto em 1922 por Evans e Bishop (NIKI; TRABER, 2012). A
forma mais abundante e eficaz da vitamina E é o alfa tocoferol, podendo ser
encontrado no soro e nas hemácias (CHOW, 1975); e no plasma seminal
(AGARWAL et. al., 2003; CONTRI et al., 2011). Pode auxiliar na estabilização
da membrana plasmática, conferindo um aspecto mais organizado (HOWARD
et. al., 2011).
O alfa tocoferol tem afinidade por uma proteína carreadora (α-
tocoferol transfer protein), as outras formas de tocoferol possuem metabolismo
mais rápido, o que explica a maior biodisponibilidade do alfa tocoferol
comparado com as demais formas. Existem oito formas de vitamina E, sendo
essas: α, β, γ e δ tocoferóis e α, β, γ e δ tocotrienóis. Os tocoferóis e
tocotrienóis apresentam composição semelhante, possuindo uma cadeia lateral
hidrocarbonada na posição dois do anel 6-cromanol. Nos tocoferóis essa
cadeia hidrocarbonada é saturada, porém, nos tocotrienóis é insaturada (RIZVI
et al., 2014).
Divide-se a molécula da vitamina E em duas partes: um anel cromanol,
também chamado de cabeça croman (hidrofílica) e uma cauda de
hidrocarbonetos (hidrofóbica), que serve para fixá-la na membrana lipídica. O
grupo –OH presente no anel cromanol é o responsável por sua propriedade
38
antioxidante. É conhecida como o principal antioxidante lipofílico que protege
os ácidos graxos poli-insaturados dos tecidos contra a peroxidação
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).
O alfa tocoferol atua na membrana plasmática, como um antioxidante
lipossolúvel, prevenindo a reação oxidativa em cadeia (MATÉS, 2000). É
capaz de neutralizar de forma satisfatória os radicais peroxil, alcoxil e outros
compostos lipídicos reativos impedindo assim a propagação da reação em
cadeia iniciada na lipoperoxidação (WAYNER et al., 1987).
As ROS são produzidas na parte hidrofóbica da membrana plasmática
e se ligam ao oxigênio, originando o radical peroxil. Este radical oxida os ácidos
graxos e forma o hidroperóxido, esses são hidrofílicos, por isso migram para a
superfície para interagir com a água, provocando a ruptura da membrana. Os
tocoferóis se fazem presentes na dupla camada lipídica das membranas
celulares e atuam removendo os radicais peroxil antes que estes oxidem os
ácidos graxos. A sua ação é potencializada pela 27 glutationa-peroxidase que
converte peróxidos orgânicos e peróxidos de hidrogênio em álcoois e água
evitando a lesão na célula (BUETTNER, 1993).
A vitamina E é capaz de se relacionar com a membrana plasmática
através de sua cadeia hidrocarbonada e conferir proteção com maior eficiência,
evitando, assim, o ataque dos ROS às duplas ligações dos PUFAs da
membrana (TRAN et al., 1996).
A vitamina E perde seu efeito antioxidante após a sua neutralização,
quando se transforma em alfa tocoferil. No entanto, há um efeito sinérgico com
outras substâncias, podendo fazer a reciclagem do alfa tocoferil em alfa
tocoferol, tais como a vitamina C (PACKER et. al., 1979) e a coenzima Q10
(BOWRY et al., 1995).
Os trabalhos relacionados na literatura com os efeitos da Vitamina E e
sua função antioxidante no sêmen são feitos tanto através da suplementação in
vivo, quanto pela adição in vitro. Há estudos que relacionam a ingestão oral de
Vitamina E com um incremento na qualidade seminal em humanos (KOBORI et
al., 2014), touros (VELASQUEZ-PEREIRA et al., 1998) e equinos (CONTRI et
al., 2011).
Quando a adição da vitamina E é feita no diluidor de congelação, o
mesmo proporciona aumento na motilidade e viabilidade espermática após a
39
descongelação do sêmen em bovinos (NASIRI et. al., 2012; TOWHIDI; PARKS,
2012). Já na espécie equina foi observada uma maior quantidade de estruturas
íntegras e diminuição da lipoperoxidação após a descongelação
(VASCONCELOS FRANCO et al., 2013).
Em estudos com sêmen refrigerado da espécie equina, por até 96 h,
em diluidor contendo Vitamina E, não foi encontrada diferença nas variáveis de
motilidade e integridade da membrana plasmática (BALL et al., 2001). No
entanto, em outro trabalho, foi relatado que mesmo não havendo melhora na
motilidade espermática, foi possível observar um decréscimo na
lipoperoxidação com a adição da Vitamina E no diluidor de sêmen equino
refrigerado por até 48 h (ALMEIDA; BALL, 2005).
Várias apresentações de vitamina E têm sido empregadas nos
trabalhos com preservação seminal, tanto a forma lipossolúvel (alfa tocoferol)
(CEROLINI et al., 2000) como a hidrossolúvel (Trolox®) (PEÑA et al., 2003).
O Trolox® (6-hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchroman-2-carboxylic acid) é
um análogodo do alfa tocoferol hidrossolúvel que, devido à sua solubilidade em
água, apresenta potente propriedade antioxidante (WU et al., 1991). Tem sido
relatado como um excelente inibidor da lipoperoxidação e empregado em
meios diluidores, por distribuir-se nas duplas camadas de lipídeos das
biomembranas, envolvendo o OH- fenólico e removendo os radicais peroxil
(ALBERTINI; ABUJA, 1999), tendo como resultados positivos o aumento da
motilidade pós-descongelação e a diminuição de estresse oxidativo induzido
pela adição de ferro e ácido ascórbico (ONDEI et al., 2009; MAIA et al., 2010;
SICHERLE et al., 2010).
O Trolox® se apresenta mais eficiente do que outros antioxidantes
lipossolúveis, a exemplo da vitamina E, pois possui uma estrutura cromanol,
que lhe concede a atividade antioxidante e ao grupo carboxila, que tem
moderado efeito hidrossolúvel, além de ser distribuído em ambas às fases da
bicamada lipídica das biomembranas, sendo um excelente protetor contra a
lipoperoxidação. Aliado a isso, esse antioxidante pode ser adicionado
diretamente à membrana lipídica sem o uso de solventes ou outros métodos de
extração, fato que o torna viável em pesquisas com sistemas biológicos
naturais ( BARCLAY; ARTZ; MOWAT, 1995).
40
Por outro lado, a capacidade de neutralização do radical hidroxila pelo
Trolox® é menor quando se usa altas concentrações, assumindo assim o papel
de oxidante e não de antioxidante. O mecanismo envolvido nesta menor
capacidade antioxidante quando em altas concentrações pode estar
relacionados à sua reação com o radical hidroxila e outros radicais de oxigênio
produzidos na presença de H2O2 e Cu2+ e assim promovendo à formação de
muitos radicais ao mesmo tempo. Por essa razão, nem sempre é verdade que
o uso de maiores concentrações de antioxidantes aumentaria
proporcionalmente a sua capacidade antioxidante. Os benefícios oriundos do
uso de um antioxidante parecem ser alcançados apenas dentro de um
intervalo. Assim, os efeitos do Trolox® em diferentes estudos poderiam ser
diferentes por causa das diferentes doses utilizadas (CAO; CUTLER, 1993).
41
4 ARTIGO CIENTÍFICO I
EFEITO DA ASSOCIAÇÃO DO TROLOX ® E ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO
NA CONGELAÇÃO DE SÊMEN DE GARANHÕES DA RAÇA MANGALA RGA
MARCHADOR
42
Artigo redigido segundo as normas da Journal of Equine Veterinary Science, ISSN 0737-0806, ranqueada como B2 pelo QUALIS – CAPES quadriênio 2013-2016, Fator
de impacto 2016: 0.882.
Efeito da associação do Trolox® e Ácido docosahexaenoico na congelação de sêmen
de garanhões da raça Mangalarga Marchador
Cristiane Silva Aguiara, Celso Henrique Souza Costa Barrosa, William Morais
Machadoa, Ivan Bezerra Allamana, Antônio de Oliveira Leite Filhob, Larissa Pires
Barbosac, Paola Pereira das Neves Snoecka,�
aUniversidade Estadual de Santa Cruz, UESC, Ilhéus-BA, e-mail: [email protected]
b Médico Veterinário Autônomo, Feira de Santana-BA, email: [email protected]
cUniversidade Federal do Recôncavo da Bahia, UFRB, Cruz das Almas-BA, email: [email protected]
�Autor para correspondência: Paola Pereira das Neves Snoeck, Departamento de
Ciências Agrárias e Ambientais, Universidade Estadual de Santa Cruz, UESC, Rodovia
Jorge Amado, KM 16, Salobrinho, CEP 45.662-900, Ilhéus, Bahia, Brasil.
Endereço de email: [email protected]; [email protected] (P.P.N Snoeck).
RESUMO
Objetivou-se avaliar o efeito do Trolox® e do ácido docosahexaenoico (DHA) na congelação de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador. Para tanto foram congelados 16 ejaculados nos seguintes diluidores: D1) BotuCrio® (BC; Controle); D2) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 30 µM de Trolox® (BCDHA30T); D3) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 40 µM de Trolox® (BCDHA40T); D4) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 50 µM de Trolox® (BCDHA50T). Todos os diluidores testados foram semelhantes em preservar diferentes parâmetros de viabilidade espermática (P>0,05). Entretanto, os espermatozoides criopreservados em BCDHA40T apresentaram maiores velocidades que os espermatozoides congelados no diluidor controle (P<0,05). A concentração de 30 µM de Trolox® foi ruim para a motilidade e a concentração de 50 µM de Trolox® não foi adequada para preservar a integridade estrutural das membranas em diluidor contendo DHA quando comparado ao diluidor controle (P<0,05). O uso do Trolox® em diluidores de congelação contendo DHA não maximizou o efeito do diluidor controle,
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exceto os parâmetros de velocidade dos espermatozoides e preservou igualmente diferentes parâmetros de viabilidade espermática. Keywords: antioxidante, ácidos graxos, lipoperoxidação, criopreservação.
1. Introdução
Dentre as raças nacionais, a Mangalarga Marchador é conhecida por possuir indivíduos
que possuem variada crioresistência de seus espermatozoides [1], prevalecendo uma
maior quantidade de garanhões com baixa capacidade para a criopreservação [2,3]. Os
esforços para otimizar essa biotecnologia do sêmen se concentram na modificação dos
diluidores objetivando aumentar a longevidade do ejaculado preservado [4].
O estresse oxidativo gerado no processo de criopreservação e a adição de antioxidantes
aos meios de congelação de sêmen, como forma de proteger o espermatozoide dos
danos induzidos pelos radicais livres tem sido demonstrado em diversos estudos. Os
danos induzidos pela produção de radicais livres englobam alterações na motilidade, na
viabilidade, na produção de energia e na integridade do DNA espermático. Os
antioxidantes utilizados agem interrompendo a reação em cadeia da lipoperoxidação das
membranas espermáticas, em diversas espécies de animais [5].
Os trabalhos têm demonstrado que o alfa tocoferol é capaz de cessar a reação em cadeia
da lipoperoxidação em biomembranas, protegendo a célula de danos na membrana
plasmática e acrossomal [6–8]. O Trolox® é um análogo do alfa tocoferol hidrossolúvel,
que devido a essa característica possui potente propriedade antioxidante [9].
Quantidades insuficientes de antioxidantes no meio diluidor podem facilitar a
lipoperoxidação e danificar os espermatozoides, que são particularmente vulneráveis
[10], visto que os ácidos graxos poli-insaturados (PUFAS) são abundantes em sua
membrana plasmática, a exemplo do ácido docosahexaenoico (DHA), que lhes
conferem fluidez necessária para que ocorram os eventos de fusão das membranas na
fertilização. A oxidação desses ácidos graxos na membrana plasmática do
espermatozoide diminui a sua fluidez, aumenta a sua permeabilidade e
consequentemente diminui a sua capacidade de fertilização [11].
No entanto, maiores quantidades de PUFAs na membrana plasmática tem sido
positivamente correlacionada com a integridade de membrana após a descongelação
[12] e também com aumento da capacidade antioxidante [13]. Ainda assim, a associação
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de um PUFA com um antioxidante é importante devido à susceptibilidade das duplas
ligações do DHA á ação das espécies reativas de oxigênio (ROS) [14].
Considerando que a associação do Trolox® e do DHA pode melhorar o efeito de
diluidores seminais durante a congelação, incrementando os parâmetros de viabilidade
espermática, objetivou-se avaliar o efeito da associação do Trolox® e do DHA na
congelação de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador.
2. Material e Métodos
2.1 Aspectos éticos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal
CEUA/UESC da Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, Brasil com o
número de protocolo 004/16.
2.2 Reagentes e soluções
Todos os reagentes utilizados foram puros para análise e adquiridos da empresa Sigma-
Aldrich® (St. Louis, MO, USA).
O DHA e o Trolox® foram adicionados aos diluidores de sêmen após o preparo de uma
solução estoque. A solução estoque de DHA foi calculada considerando seu peso
molecular de 328,49 g/mol e diluída em 100 mL de solução de etanol a 0,05% (76,1058
x 10-4mol/L). A solução estoque de Trolox® foi preparada e diluída em soluçao de Tris-
ácido cítrico [9], considerando seu peso molecular de 250,29 g/mol (a 10mM; 0,0125g
de Trolox em 5mL de Tampão Tris).
Os grupos experimentais foram: D1) BotuCrio® (BC; controle); D2) BC + 50 ngmL-1 de
DHA + 30 µM de Trolox® (BCDHA30T); D3) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 40 µM de
Trolox® (BCDHA40T); D4) BC + 50 ngmL-1 de DHA + 50 µM de Trolox®
(BCDHA50T).
2.3 Local, animais e coleta
O experimento foi realizado em haras localizado no município de Cabaceiras do
Paraguaçu, Bahia, Nordeste, Brasil (latitude 12°32′9″S, longitude 39°11′27″W, altitude
210m). O local possui clima tropical, pluviosidade média anual de 932 mm e
temperatura média anual de 23,2 ºC. As análises seminais foram realizadas no
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Laboratório de Reprodução Animal da UESC. O experimento foi realizado entre
outubro e novembro de 2016.
Foram utilizados quatro garanhões da raça Mangalarga Marchador, com idades entre 5 e
7 anos, com escore da condição corporal 4. Antes do início do experimento, todos os
garanhões foram submetidos ao esgotamento das suas reservas espermáticas
extragonadais, por meio de coletas de sêmen seriadas, por sete dias, com vagina
artificial modelo Botucatu® (Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) e auxílio de uma fêmea
em estro como manequim. O ejaculado de cada garanhão foi coletado quatro vezes, em
dias alternados, com intervalo de 48 horas entre as coletas, obtendo-se 16 ejaculados.
2.4 Processamento do sêmen
Após a coleta, o sêmen foi filtrado em filtro de nylon (Minitub®, Alemanha) para
remoção da fração gel e os ejaculados avaliados macro e microscopicamente segundo o
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal antes da congelação. A concentração
espermática foi aferida por câmara de Neubauer, após diluição de 1:20 em solução de
citrato de sódio formolizado a 4%. Somente os ejaculados com motilidade mínima de
60 %, vigor espermático de 3 e 70 % de espermatozoides morfologicamente normais
foram congelados [15].
Após coleta e avaliação, o sêmen foi diluído v:v (sêmen:diluidor) em meio à base de
leite desnatado (BotuSêmen®, Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) e centrifugado a
600xg por 10min [16]. O sobrenadante foi descartado e o pellet foi diluído conforme os
grupos experimentais supracitados.
O sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,25 mL, na concentração de 100x106
espermatozoides móveis por mL. As palhetas foram seladas com álcool polivinílico e
congeladas em sistema automatizado (TK4000®, TK Tecnologia em congelação,
Uberaba, Brasil). A curva de resfriamento utilizada foi de -0,5°C por minuto de 20,5ºC
até 5°C, em seguida as amostras permaneceram em equilíbrio por 20 minutos na
temperatura de 5oC e foram congeladas com uma taxa de -25 ºC/min até -140ºC para
depois serem imersas em nitrogênio líquido (-196ºC) e armazenadas em botijão
criogênico.
O sêmen foi avaliado pelo teste de termoresistência lento (TTR) por um tempo de 120
minutos. Uma palheta de cada tratamento foi descongelada e o seu conteúdo total foi
transferido para microtubos de polietileno, que já se encontravam aquecido em banho
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seco a 37ºC. As amostras foram mantidas nestas condições e avaliadas nos tempos 5, 60
e 120 minutos quanto aos parâmetros de movimento espermático como segue abaixo.
2.5 Análises do sêmen após descongelação
O movimento espermático das amostras descongeladas foi avaliada por um sistema
computadorizado Sperm Class Analyser® (Microptics S.L, v.5.2, Barcelona, Espanha).
Os padrões utilizados para o ajuste do equipamento foram: 25 imagens/segundo com 25
Hz; tamanho de partícula capturado entre 4 e 75 µm/m2; espermatozoides considerados
imóveis <10 µm/s, lentos <45 µm/s, médios de 45 a 90 µm/s e rápidos acima de 90
µm/s. Foram avaliados os seguintes parâmetros: Motilidade Total (MT), Motilidade
Progressiva (MP), Linearidade (LIN), Retilinearidade (STR), Índice de Oscilação
(WOB), Hiperativos expressos em porcentagem (%); Velocidade Curvilinear (VCL),
Velocidade Linear Progressiva (VSL) e Velocidade Média do Trajeto (VAP), expressas
em micrômetros por segundos (µm/s); Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça
Espermática (ALH), expressa em micrômetros (µm); e Frequência do Batimento
Flagelar Cruzado (BCF), expressa em Hertz (Hz).
A integridade estrutural das membranas, plasmática e acrossomal, foram avaliadas
utilizando um microscópio fluorescente (400X; Olympus® CX 31) após a coloração do
espermatozoide com corantes fluorescentes diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e
iodeto de propídio (IP) de acordo com o método de Harrison e Vickers [17]. A
coloração com CFDA foi avaliada usando o conjunto padrão de filtro de fluoresceína,
enquanto a coloração com IP foi avaliada usando o conjunto padrão de filtros de
rodamina. Foram analisados 200 espermatozoides por amostra.
A integridade funcional da membrana plasmática foi avaliada utilizando o teste
hiposmótico (HOST) com 50 µL da amostra diluída em 500 µL de uma solução de
sacarose a 100 mOsmol/L. Após a diluição, as amostras foram primeiro incubadas em
banho seco a 37°C durante 30 minutos e posteriormente foram fixadas com 250 µL de
solução de citrato de sódio formolizado a 4% e 200 células foram avaliadas usando um
microscópio de contraste de fase (1000x; Olympus® CX 31).
A porcentagem de células reativas ao HOST foi calculada da seguinte forma: HOST% =
% de alterações na região da cauda após o HOST - % de alterações na região da cauda
antes do HOST, de acordo com o método de Melo e Henry [18]. As alterações de cauda
antes do teste foram analisadas por meio da técnica de preparação úmida, diluindo uma
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amostra de sêmen em solução de citrato de sódio formolizado a 4% para posterior
avaliação das alterações morfológicas espermáticas usando um microscópio de contraste
de fase (1000x; Olympus® CX 31). Foram avaliados 200 espermatozoides.
A integridade da cromatina espermática foi avaliada utilizando a técnica da
metacromasia induzida pelo azul de toluidina [19]. Foram confeccionados esfregaços
com uma alíquota de 10 µL da amostra, secados em temperatura ambiente e fixados por
1 min em solução de Carnoy (3:1, 75 mL de álcool 100 % + 25 mL de ácido acético) e
em seguida em álcool a 70 % por 3 min. Procedeu-se á hidrólise com ácido clorídrico
4N por 15 minutos, lavagem em água destilada e secagem em temperatura ambiente.
Para a coloração do esfregaço foi depositado 20 µL da solução de azul de toluidina a
0,025 % (0,00125 g de azul de toluidina em 5 mL de solução de McIlveine, pH 4,0)
entre lâmina e lamínula e avaliadas 500 células em microscopia de contraste de fase
(1000x; Olympus® CX 31). Os espermatozoides foram classificados: com cromatina
compacta (região da cabeça corada em azul claro) e com cromatina descompactada
(região da cabeça corada em azul escuro ou violeta).
A atividade mitocondrial foi avaliada por meio da coloração de 3,3’- diaminobenzidina
(DAB) segundo a técnica de Hrudka [20], sendo que 20 µL da amostra foram incubados
com 20 µL de DAB (1mg/mL de PBS) a 37ºC por 60 minutos, na ausência de luz. Após
a incubação foram feitos esfregaços, fixados em formol a 10 % por 10 minutos, lavados
em água destilada e secados ao ar sob proteção da luz. Foram avaliadas 200 células em
microscópio de contraste de fase (1000x; Olympus® CX 31). As células foram
classificadas de acordo com o nível de deposição do corante na peça intermediária (PI).
Na classe I, os espermatozoides apresentavam a PI totalmente corada (alta atividade
mitocondrial); na classe II, os espermatozoides apresentavam mais de 50 % da PI corada
(atividade mitocondrial intermediária); na classe III, apresentavam menos de 50 % da PI
corada (baixa atividade mitocondrial) e na classe IV, não apresentavam coloração
(atividade mitocondrial inexistente).
O nível de lipoperoxidação foi medido usando o ensaio do ácido tiobarbitúrico (TBA)
de acordo com o método descrito por Buege e Aust [21]. As substâncias reativas ao
ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram medidas no sêmen imediatamente após a
descongelação (lipoperoxidação espontânea) ou após incubação com 0,24 mM de
FeSO4 a 37°C em banho-maria por 15 minutos (lipoperoxidação catalisada pelo ferro ou
lipoperoxidação induzida). Na análise da lipoperoxidação espontânea, o conteúdo de
48
uma palheta de sêmen de 0,25 mL foi adicionado de 0,25 mL de tampão de ácido Tris-
cítrico (Tris-hidroximetil-aminometano 1,8184 g + ácido cítrico mono-hidratado 0,9901
g + água destilada até 50 mL, com pH 7,4) para obtenção de um volume final de 0,5
mL. Em seguida, foi adicionado 1 mL do reagente TBA (ácido tricloracético 15%
peso:volume, ácido clorídrico 0,25 N, ácido tiobarbitúrico 0,375 % peso: volume, em
água destilada qsp para 100 mL), depois foi adicionado 1 % (15µL, v:v) da solução
BHT (hidroxitolueno butilado) a 50 mM. A mistura foi fervida durante 15 minutos e
depois resfriada num banho de gelo picado. Após o resfriamento, a suspensão foi
centrifugada a 1200 g durante 15 minutos. O sobrenadante foi então separado, mantido
num banho de gelo e a absorvância foi medida a 546 nm a 25°C.
O controle positivo dessa reação é a análise da lipoperoxidação induzida ou catalisada
por ferro que visa medir o potencial de uma amostra para gerar radicais livres, para tal,
procedeu-se da seguinte forma: em uma segunda amostra (250 µL de sêmen + 250 µL
de tampão Tris) adicionou-se 50 µL sulfato ferroso heptahidratado (0,013 g de FeSO4 +
20 mL de água destilada a 2,4 mM) e 10 µL de solução de ácido ascórbico 50 mM
(0,08806 g de ácido L-ascórbico + 10 mL de água destilada). A amostra foi incubada
em banho-maria a 37°C por 15 minutos, em seguida procedeu-se segundo descrito para
a avaliação da lipoperoxidação espontânea.
A análise da lipoperoxidação foi realizada utilizando um espectrofotômetro (Bio-2000
IL, Bioplus Ltd., São Paulo, BR). A concentração de TBARS foi determinada
comparando a absorvância da amostra a 546 nm com uma curva padrão criada a partir
de equivalentes de malondialdeído (MDA) gerados pela hidrólise catalisada por ácido
de 1,1,3,3-tetrametoxopropano. Os resultados foram expressos em nmol de TBARS/mL.
2.6 Análises estatísticas
O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, considerando o garanhão como
um bloco. Foi utilizada análise de variância para testar as diferenças entre os
tratamentos. Para comparação entre médias foi utilizado o teste de Tukey, com nível de
significância de 5%. Todos os pressupostos foram testados e quando violados foi
utilizada a transformação boxcox (y' = \frac{y^{\lambda} - 1}{\lambda}) por meio da
função “boxcox” do pacote MASS versão 7.3-41 [22]. As variáveis transformadas no
primeiro experimento foram: DAB I, III e VI. Todas as análises foram feitas com o
auxílio do R Core Team [23]. Os dados foram apresentados em forma de média, mesmo
os transformados.
49
3. Resultados
O diluidor contendo DHA e 30 µM Trolox® foi pior em preservar a motilidade total do
que o diluidor controle (P<0,05). A velocidade curvilinear, a velocidade linear
progressiva e a velocidade média do trajeto foram maiores no diluidor contendo DHA e
40 µM Trolox® do que no diluidor controle (P<0,05). Os espermatozoides
criopreservados em diluidores contendo DHA e diferentes concentrações de Trolox®
tiveram maior amplitude de deslocamento lateral de cabeça do que os espermatozoides
criopreservados no diluidor controle (P<0,05). Os quatro diluidores testados
preservaram de maneira semelhante (P>0,05) a integridade funcional da membrana
plasmática, a integridade da cromatina e a atividade mitocondrial alta e intermediária.
Os espermatozoides congelados em diluidor contendo DHA e 30 ou 40 µM Trolox®
apresentaram menor percentual de células com baixa atividade mitocondrial comparado
ao diluidor controle (P<0,05). O diluidor com DHA que continha a maior concentração
de Trolox® testada (50 µM) foi inferior ao controle em preservar a integridade estrutural
das membranas espermáticas (P<0,05, Tab.1).
Todos os diluidores testados controlaram a lipoperoxidação espontânea de forma
semelhante (P>0,05). Entretanto, para a lipoperoxidação induzida, os tratamentos com
DHA e Trolox® em todas as concentrações usadas reduziram a produção de TBARS
comparados com o controle (P<0,05, Tab. 1).
50
Tabela 1. Parâmetros de viabilidade espermática no sêmen equino criopreservado em diluidor acrescido de DHA e diferentes concentrações de Trolox®.
Parâmetros Diluidor P-valor BC BCDHA
30T BCDHA
40T BCDHA
50T EPM
MT(%) 40,60a 28,40b 34,30ab 35,00ab 2,85 0,04 MP (%) 8,10 6,90 8,80 8,70 1,14 0,61 VCL (µm/s) 31,60b 35,20ab 37,70a 35,80ab 1,27 0,01 VSL (µm/s) 12,70b 14,30ab 16,30a 14,50ab 0,94 0,08 VAP (µm/s) 17,20b 19,20ab 21,20a 19,40ab 0,95 0,04 LIN (%) 39,10 40,40 41,00 39,80 1,28 0,75 STR (%) 73,70 73,80 75,50 74,80 1,23 0,71 WOB (%) 53,30 54,70 54,70 54,00 0,89 0,65 ALH (µm) 2,50b 2,70a 2,70a 2,70a 0,05 0,00 BCF (Hz) 13,00 12,50 12,70 12,40 0,29 0,48 Hiperativos (%) 0,50 0,50 0,60 0,50 0,12 0,93 CFDA+ (%) 38,80a 32,90ab 33,40ab 31,80b 1,86 0,05 HOSTr (%) 35,40 24,10 28,60 25,10 3,26 0,07 DNAc (%) 84,30 85,00 85,20 84,30 1,60 0,97 DNAd (%) 15,70 15,00 14,80 15,70 1,60 0,97 DABI (%) * 76,30 82,00 79,00 78,90 5,73* 0,46 DABII (%) 8,10 6,00 3,90 5,00 1,21* 0,10 DABIII (%) * 5,20a 2,30b 2,30b 2,50ab 0,65* 0,00 DABIV (%) * 10,50 9,40 10,7 9,10 3,76* 0,12 TBARSe (nMol/mL)
0,14 0,07 0,04 0,06 0,05 0,43
TBARSc (nMol/mL)
0,52a 0,03b 0,09b 0,00b 0,02 0,00
D1) BotuCrio® (BC; controle); D2) BC + 50 ngmL-1 de DHA (BCDHA) + 30 µM de Trolox® (BCDHA30T); D3) BCDHA + 40 µM de Trolox® (BCDHA40T); D4) BCDHA + 50 µM de Trolox® (BCDHA50T). Motilidade Total (MT); Motilidade Progressiva (MP); Velocidade Curvilinear (VCL); Velocidade Linear Progressiva (VSL), Velocidade Média do Trajeto (VAP); Linearidade (LIN); Retilinearidade (STR); Índex de Oscilação (WOB); Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH), Hiperativos; Frequência do Batimento Flagelar Cruzado (BCF). Espermatozoides com membrana plasmática e acrossomal estruturalmente íntegras (CFDA+). Espermatozoides reativos, com membrana funcional pelo teste hiposmótico (HOSTr). Cromatina Compactada (DNAc); Cromatina Descompactada (DNAd). Alta atividade mitocondrial (DAB I); Atividade mitocondrial intermediária (DAB II); Baixa atividade mitocondrial (DABIII); Atividade mitocondrial inexistente (DAB IV). Concentração de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em lipoperoxidação espontânea (TBARSe) e lipoperoxidação catalisada por FeSO4 (TBARSc). abAs letras sobrescritas indicam diferenças dentro da linha (P<0,05). *As inferências para tais variáveis foram feitas após transformação.
Os diluidores testados preservaram de maneira semelhante vários parâmetros de
movimento espermático (móveis, VCL, VSL e VAP) ao longo de duas horas de TTR
para avaliação da longevidade espermática (P>0,05). Entretanto, foi possível notar que
aos 60 minutos de TTR, a ALH dos espermatozoides criopreservados em BCDHA50T
estava menor do que nas amostras criopreservadas no diluidor controle (P<0,05; Tab. 2).
51
Tabela 2. Parâmetros de cinética espermática após 60 e 120 minutos de TTR do sêmen equino criopreservado em diluidor contendo DHA e Trolox®. Parâmetros aos 60 min
Diluidor P-valor BC BCDHA30T BCDHA40T BCDHA50T
MT(%) 20,20 23,00 22,40 22,10 0,80 VCL (µm/s) 30,90 32,40 33,00 31,00 0,60 VSL (µm/s) 12,80 13,20 13,70 13,50 0,90 VAP (µm/s) 17,10 17,50 18,10 17,30 0,80 ALH (µm) 2,60a 2,60ab 2,50ab 2,40b 0,00 Parâmetros aos 120 min
BC BCDHA30T BCDHA40T BCDHA50T
MT(%) 11,20 11,40 13,70 11,40 1,00 VCL (µm/s) 28,50 28,40 29,40 24,90 0,10 VSL (µm/s) 11,80 11,50 12,10 10,20 0,20 VAP (µm/s) 15,80 15,40 16,30 14,00 0,20 ALH (µm) 2,10 2,10 2,20 2,00 0,80 D1) BotuCrio® (BC; controle); D2) BC + 50 ngmL-1 de DHA (BotuDHA) + 30 µM de Trolox® (DHA30T); D3) BotuDHA + 40 µM de Trolox® (DHA40T); D4) BotuDHA + 50 µM de Trolox® (DHA50T). Motilidade Total (MT); Velocidade Curvilinear (VCL); Velocidade Linear Progressiva (VSL), Velocidade Média do Trajeto (VAP); Amplitude do Descolamento Lateral da Cabeça (ALH). abAs letras sobrescritas indicam diferenças dentro da linha (P<0,05).
4. Discussão
Há relatos na literatura de resultados superiores de motilidade com a adição do
antioxidante Trolox® em diluidores de congelação de sêmen de garanhões férteis e
subfertéis [24]. Outros autores já indicaram uma relação inversa entre a taxa de
lipoperoxidação e motilidade espermática, bem como a constatação de maiores
quantidades de antioxidantes nos espermatozoides com melhor qualidade de movimento
[25,26], visto que os produtos da lipoperoxidação afetam a integridade mitocondrial e o
suprimento de energia para o movimento [27], fatos que explicam em parte esses
benefícios. Nota-se que a associação do antioxidante Trolox® e do ácido graxo DHA,
mesmo este presente em dose fixa, foi positiva para a melhoria da motilidade, visto que
a incorporação do DHA na membrana plasmática é responsável por aumentar sua
flexibilidade e proteger os espermatozoides dos efeitos deletérios da congelação [28].
Neste ínterim, já foram identificadas várias moléculas importantes envolvidas na
incorporação de DHA nas membranas celulares e na produção de glicerofosfolipídeos
contendo DHA como LPAAT3, Mfsd2a e AdipoR1 [29–32]. No entanto, ainda seguem
obscuras as formas de regulação da incorporação de DHA e as funções exatas do DHA
em glicerofosfolipídeos de membrana [33].
No entanto, no diluidor acrescido de DHA associado a 30 µM de Trolox®, a motilidade
total apresentou menores valores em relação ao controle, segundo Wassal e Stillwell
[34] ocorre alteração na proporção de ω-6:ω-3 após a incorporação do DHA nas
membranas espermáticas a partir da sua adição aos diluidores [14] e também de
52
PUFA:ácidos graxos saturados [28], refletindo na melhoria da fluidez e
consequentemente da motilidade [35]. Considerando que todos os tratamentos, exceto o
controle, continham concentrações iguais de DHA e variadas de Trolox®, a menor
concentração de Trolox® (30 µM) apresentou menor desempenho neste quesito. Há
relatos controversos na literatura sobre os benefícios da adição do alfa tocoferol aos
diluidores seminais. Em alguns estudos esse antioxidante melhorou a motilidade dos
espermatozoides equino [20], ovino [36] e suíno [37], ou não teve nenhum efeito sobre
a motilidade dos espermatozoides ovino [38] e equino [39]. Outros autores sinalizaram
uma relação inversa entre a taxa de lipoperoxidação e a motilidade espermática,
apontando os benefícios do uso do alfa tocoferol através da detecção de grandes
quantidades destes nos espermatozoides com maior motilidade [26].
Em um estudo avaliando a adição de Trolox® (50, 100, 150 e 200 µM Trolox®/108
espermatozoides) no diluidor antes da congelação de sêmen de ovinos, os autores
observaram que uma concentração de 150 µM ou superior a esta apresentou um efeito
deletério sobre a motilidade progressiva do espermatozoide [40].
Então, os benefícios oriundos do uso de um antioxidante parecem ser obtidos apenas
dentro de um determinado intervalo. O que também pode ser explicado pelo fato de que
a capacidade de neutralização do radical hidroxila pelo Trolox® diminui quando este
está em altas concentrações, neste caso ele passa a atuar como um oxidante. Então o
mecanismo envolvido na diminuição da sua capacidade antioxidante quando em altas
concentrações podem estar relacionados à sua reação com o radical hidroxila e outros
radicais de oxigênio produzidos na presença de H2O2 e Cu2+ e assim conduzindo à
formação de muitos radicais ao mesmo tempo. Considerando esses pontos, nem sempre
é verdade que o uso de mais antioxidantes aumentariam proporcionalmente a sua
capacidade antioxidante [41].
A suplementação com DHA aumentou a qualidade seminal em humanos [42], suínos
[43], equinos [44], camundongos [45] e bovinos [46]. Kaeoket [47] testaram a inclusão
de níveis de óleo de peixe como fonte de DHA (0; 0,13; 0,29 e 0,45g) no diluidor
seminal de suínos e constataram uma maior viabilidade, motilidade progressiva e
integridade acrossomal nos grupos suplementados quando comparado com o grupo
controle. Em um estudo que testou a inclusão de DHA (0; 1; 10 e 100 ngmL-1) e
vitamina E (0; 0,2 e 0,4 mmol) no diluidor para criopreservação de sêmen de touros foi
observado que a concentração de 100 ngmL-1 diminuiu a qualidade seminal pós-
53
descongelação, fato que não ocorreu com as menores concentrações testadas pelos
autores [14]. Dessa forma, observa-se que o uso do DHA isolado apresenta resultados
positivos, no entanto na associação com o alfa tocoferol os resultados podem ser
dependentes das concentrações utilizadas.
O estudo da integridade de membrana evidenciou percentuais menores de células
íntegras nas amostras criopreservadas no diluidor com maior dose de antioxidante
testada (50µM) quando comparada com o diluidor controle. O acrossoma comumente
sofre alteração estrutural determinada por elevada concentração de ROS. Por outro lado,
sob determinadas condições, algumas substâncias a princípio usadas como
antioxidantes, podem também apresentar efeito oxidante dependendo de alguns fatores
já mencionados. Os tocoferóis podem reduzir Fe (III) a Fe2+, Cu2+ e a Cu+, que exercem
efeito pro-oxidativo [48], assim o uso da vitamina E como antioxidante pode ser
favorável ou desfavorável, dependendo rigorosamente da sua concentração in vitro [49].
Provavelmente a concentração de 50 µM de Trolox® se comportou como oxidante nas
condições desse estudo. Ou, de alguma forma, não preservou adequadamente a
integridade estrutural da membrana.
Somado a isso, Nichi [50] afirma que a concentração do antioxidante estudado
influencia nos resultados, pois concentrações abaixo das necessárias seriam
insuficientes e concentrações altas podem ser deletérias, considerando o papel
fisiológico das ROS em importantes processos. De modo que o tratamento antioxidante
em concentrações excessivas pode bloquear importantes funções fisiológicas da célula,
sendo importante avaliar diferentes concentrações de um antioxidante.
Os diluidores testados preservaram de modo semelhante a integridade funcional e mais
de 80% dos espermatozoides com a cromatina compacta, a despeito de haver relatos de
que a redução da temperatura durante o resfriamento e a congelação acarretem prejuízos
nessas estruturas [51]. Sabe-se também que o estresse oxidativo está entre as principais
causas de fragmentação do DNA, fato que pode culminar em infertilidade [52]. O
sêmen de garanhão com mais de 30% de espermatozoide com DNA fragmentado tem
menor potencial fértil do que o sêmen de reprodutores com um percentual menor que
15% de espermatozoides fragmentados [53]. Em uma pesquisa correlacionando
fragmentação de DNA e fertilidade de garanhões, os animais com alto desempenho
reprodutivo foram capazes de fertilizar e resultar em uma taxa de prenhez por ciclo
estral de 82% quando apresentavam 12% de fragmentação de DNA, enquanto que os
54
animais com baixo desempenho reprodutivo apresentavam 39% de taxa de prenhez por
ciclo estral quando 25% de seus espermatozoides tinham DNA fragmentado [54]. Em
nosso estudo a fragmentação de DNA foi inferior a 20% nas amostras criopreservadas
nos diferentes diluidores. A alta porcentagem de cromatina descompactada detectada em
espermatozoides pode representar um dos maiores fatores limitante da sua habilidade
fertilizante, assim é de grande importância a integridade do seu DNA como expressão
do seu potencial de fertilidade [55].
As mitocôndrias são a principal fonte de ATP no espermatozoide e se localizam na peça
intermediária [56]. Cerca de 60% do ATP gerado é consumido como força motriz,
enquanto que o restante é consumido na fosforilação e desfosforilação dos substratos
[57]. Todos os tratamentos preservaram de modo semelhante a atividade mitocondrial
alta e intermediária, esse fato é importante pois uma das vias de alteração da motilidade
pela presença de níveis excessivos de ROS pode ser a alteração na função mitocondrial
[58].
Em um trabalho com animais da espécie ovina, os autores constataram um bom
rendimento da atividade mitocondrial ao utilizar o Trolox® como antioxidantes no meio
diluidor, fato importante para a proteção de alguns compartimentos celulares. Neste
caso, as mitocôndrias preservadas responsáveis pelo aporte energético e geradora da
motilidade possuem uma forte correlação com espermatozoides com alto potencial de
membrana mitocondrial com capacidade de fecundação [59]. Tal fato pode explicar o
comportamento do diluidor controle em apresentar maior percentual de espermatozoides
com baixa atividade mitocondrial, menores velocidades (VCL, VSL e VAP).
Não houve diferença entre os tratamentos na avaliação da peroxidação lipídica
espontânea. No entanto, a adição do Trolox® promoveu uma redução na formação do
TBARS na análise da lipoperoxidação catalisada por FeSO4. Nesta, não foram
observadas quantidades detectáveis de TBARS no diluidor que continha 50 ngmL-1 de
DHA e 50 µM de Trolox®, sendo esta a maior concentração de Trolox®, e os demais
diluidores apresentaram baixos valores de TBARS quando comparados com o diluidor
controle, demonstrando que as concentrações de Trolox® propostas foram capazes de
controlar a lipoperoxidação como esperado.
No estudo da lipoperoxidação catalisada por ferro, considerada uma condição de
estresse oxidativo, os diluidores que continham Trolox® foram mais efetivos na redução
das quantidades de TBARS do que no diluidor controle, possivelmente pela inibição da
55
propagação em cadeia da lipoperoxidação semelhante a Vitamina E [60]. O efeito
antioxidante do Trolox® guarda semelhança com o da Vitamina E, ambos atuam na
remoção dos radicais peroxil, interrompendo a reação em cadeia da lipoperoxidação
[61]. Ambos têm a mesma capacidade de absorção desses radicais devido à sua mesma
estrutura funcional [62], pois neutralizam dois radicais peroxil por molécula [63]. No
entanto, comparações entre medidas de lipoperoxidação em diferentes estudos são
difíceis devido a uma grande variedade de metodologias, concentrações espermáticas
nas amostras, diluidores utilizados e a variação individual entre animais e espécies [64].
Maia et al. [65] avaliaram a lipoperoxidação espontânea e induzida por ferro, em
amostras de sêmen de carneiros Santa Inês, congelado no diluidor Tris-gema adicionado
ou não do antioxidante Trolox® e, observaram que a concentração de substâncias
reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS), geradas na lipoperoxidação espontânea, não
diferiu entre as amostras congeladas com ou sem antioxidante. Não obstante, quando a
lipoperoxidação foi induzida pelo ferro (FeSO4), a concentração de TBARS foi maior
no sêmen congelado sem antioxidante (3,4 ± 0,17 nmol/108 espermatozoides) do que na
presença de Trolox® (2,07 ± 0,17 nmol/108 espermatozoides). Assim, os autores
concluíram que em situação de estresse oxidativo, o Trolox® foi capaz de inibir a
propagação da lipoperoxidação no sêmen ovino durante um ciclo de congelação e
descongelação, fato que corrobora com os nossos achados em sêmen de equino, quando
a presença do Trolox® nos diluidores foi capaz de manter a lipoperoxidação em níveis
mais baixos do que o diluidor controle.
Não houve diferença no TTR para as variáveis de cinética espermática avaliadas no
tempo de 120 minutos, exceto para ALH aos 60 minutos de avaliação, este parâmetro
apresentou maior valor nos espermatozoides criopreservados no diluidor controle e
menor no diluidor com a maior concentração de Trolox®. A ALH está correlacionada
com a capacidade de penetração na zona pelúcida do oócito, sendo assim um dos
parâmetros que influencia na fertilização [66].
5. Conclusão
A adição de Trolox® e DHA, embora não tenha maximizado o efeito crioprotetor do
diluidor controle, garantiu espermatozoides mais velozes. O uso do Trolox® em
56
diluidores de congelação contendo DHA, nas concentrações estudadas, preservou
satisfatoriamente diferentes parâmetros de viabilidade espermática.
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64
5 ARTIGO CIENTÍFICO II
EFEITO DO TROLOX® ASSOCIADO OU NÃO AO ÁCIDO
DOCOSAHEXAENOICO EM DILUIDOR DE CONGELAÇÃO DE SÊMEN DE
GARANHÕES DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR
65
Artigo redigido segundo as normas da Animal Reproduction, ISSN 1984-3143 (online), ranqueada como B2 pelo QUALIS – CAPES quadriênio 2013-2016, Fator de impacto
(2017): 0,906.
Efeito do Trolox® associado ou não ao Ácido docosahexaenoico em diluidor de
congelação de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador
Cristiane Silva Aguiara, Celso Henrique Souza Costa Barrosa, William Morais
Machadoa, Ivan Bezerra Allamana, Antônio de Oliveira Leite Filhob, Larissa Pires
Barbosac, Paola Pereira das Neves Snoecka,�
aUniversidade Estadual de Santa Cruz, UESC, Ilhéus-BA, e-mail: [email protected]
b Médico Veterinário Autônomo, Feira de Santana-BA, email: [email protected]
cUniversidade Federal do Recôncavo da Bahia, UFRB, Cruz das Almas-BA, email: [email protected]
�Autor para correspondência: Paola Pereira das Neves Snoeck, Departamento de
Ciências Agrárias e Ambientais, Universidade Estadual de Santa Cruz, UESC, Rodovia
Jorge Amado, KM 16, Salobrinho, CEP 45.662-900, Ilhéus, Bahia, Brasil.
Endereço de email: [email protected]; [email protected] (P.P.N Snoeck).
RESUMO
Objetivou-se avaliar o efeito do Trolox® associado ou não ao ácido docosahexaenoico (DHA) na congelação de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador. Foram congelados 12 ejaculados nos seguintes diluidores: D1) BotuCrio® (BC; Controle); D2) BC + 30 ngmL-1 de DHA (BC30DHA); D3) BC + 40 µM de Trolox® (BC40T); D4) BC40T + 50 ngmL-1 de DHA (BC40T50DHA); D5) BC40T + 70 ngmL-1 de DHA (BC40T70DHA); D6) BC40T + 90 ngmL-1 de DHA (BC40T90DHA). Nota-se que todos os diluidores que continham 40 µM de Trolox® isolado ou associado a concentrações igual ou superiores a 50 ngmL-1 de DHA não foram eficientes em preservar parâmetros de movimento espermático importantes quando a congelação de sêmen foi não automatizada (P<0,05). O diluidor contendo 30 ngmL-1 de DHA na ausência de Trolox® foi semelhante ao controle para preservar a motilidade e a velocidade dos espermatozoides e ambos foram superiores aos demais diluidores testados (P<0,05). O uso do Trolox® em diluidores de congelação contendo DHA, nas concentrações estudadas, preservou diferentes parâmetros de viabilidade espermática,
66
entretanto, não é indicado por alterar negativamente parâmetros cinéticos importantes para a fertilidade. Não é necessário o uso de Trolox® para controlar a lipoperoxidação em diluidor contendo DHA. Keywords: antioxidante, ácidos graxos, espermatozoide, criopreservação, equino.
1. Introdução
A composição fosfolipídica da membrana plasmática do espermatozoide deve ser
considerada como um fator determinante na qualidade do sêmen, principalmente em
relação a sua crioresistência (Garcia et al., 2011).
Como parte integrante da membrana plasmática, os ácidos graxos poli-insaturados ω-3,
incluindo docosahexaenoico (DHA, 22: 6n-3), possuem uma dupla ligação no terceiro
segmento do final da cadeia de carbono, a partir do grupo metila, desempenhando um
papel importante na funcionalidade dos espermatozoides e no seu comportamento frente
às mudanças térmicas (Towhidi and Parks, 2012; Fair et al., 2014), na permeabilidade á
água e outras moléculas, na manutenção da fluidez e nas fases de transição na bicamada
lipídica (Samadian et al., 2010).
Em mamíferos, a composição da membrana espermática é caracterizada por uma alta
proporção de ácidos graxos ω-3 (Parks and Lynch, 1992; Díaz et al., 2016). Em equinos
há relatos contraditórios quanto a sua composição, neste o ácido graxo predominante é o
pentanóico (22:5ω3) quando comparado ao DHA (Parks and Lynch, 1992; García et al.,
2011). No entanto, num estudo mais recente foi encontrada uma maior quantidade do
DHA em relação ao ácido pentanóico nos glicerofosfolipídios dos espermatozoides
(Wood et al., 2016).
Uma elevação no aporte de ácidos graxos ω-3 disponível para ser incorporado pela
membrana plasmática de mamíferos pode torná-la mais susceptível a lipoperoxidação
(Sikka, 2004), ocasionando perda de suas funções (Christova et. al., 2004). Assim,
visando à redução desses danos causados pela elevada concentração das espécies
reativas ao oxigênio, alguns pesquisadores têm adicionado substâncias antioxidantes em
amostras de sêmen de várias espécies, inclusive equinos (Bruemmert et al., 2002;
Almeida and Ball, 2005).
A vitamina E (α-tocoferol e seus derivados), incluindo o Trolox®, sua versão
hidrossolúvel, protegem as células da lipoperoxidação, in vivo e in vitro (Sikka, 2004).
67
Considerando que o uso associado do Trolox® e DHA podem melhorar o desempenho
de diluidores seminais durante a congelação, melhorando os parâmetros de viabilidade
espermática, objetivou-se avaliar diferentes combinações de DHA associado ou não ao
Trolox® em diluidor de congelação sobre os espermatozoides de garanhões da raça
Mangalarga Marchador.
2. Material e Métodos
2.1 Aspectos éticos
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal
CEUA/UESC da Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, Brasil com o
número de protocolo 004/16.
2.2 Reagentes e soluções
Todos os reagentes utilizados foram puros para análise e adquiridos da empresa Sigma-
Aldrich® (St. Louis, MO, USA).
O DHA e o Trolox® foram adicionados aos diluidores de sêmen após o preparo de uma
solução estoque. A solução estoque de DHA foi calculada considerando seu peso
molecular de 328,49 g/mol e diluída em 100 mL de solução de etanol a 0,05% (76,1058
x 10-4mol/L). A solução estoque de Trolox® foi preparada e diluída em soluçao de Tris-
ácido cítrico (Maia et al., 2010), considerando seu peso molecular de 250,29 g/mol (a
10mM; 0,0125g de Trolox em 5mL de Tampão Tris).
Os grupos experimentais foram: D1) BotuCrio® (BC; Controle); D2) BC + 30 ngmL-1
de DHA (BC30DHA); D3) BC + 40 µM de Trolox® (BC40T); D4) BC40T + 50 ngmL-1
de DHA (BC40T50DHA); D5) BC40T + 70 ngmL-1 de DHA (BC40T70DHA); D6)
BC40T + 90 ngmL-1 de DHA (BC40T90DHA).
2.3 Local, animais e coleta
O experimento foi realizado em haras localizado no município de Cabaceiras do
Paraguaçu, Bahia, Nordeste, Brasil (latitude 12°32′9″S, longitude 39°11′27″W, altitude
210m). O local possui clima tropical, pluviosidade média anual de 932 mm e
temperatura média anual de 23,2 ºC. As análises seminais foram realizadas no
Laboratório de Reprodução Animal da UESC. O experimento foi realizado em maio de
2017.
68
Foram utilizados quatro garanhões da raça Mangalarga Marchador, com idade variando
de 5 a 7 anos, com escore da condição corporal 4. Antes do início do experimento, todos
os garanhões foram submetidos ao esgotamento das suas reservas espermáticas
extragonadais, por meio de coletas de sêmen seriadas, por sete dias, com vagina
artificial modelo Botucatu® (Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) e auxílio de uma fêmea
em estro como manequim. Cada garanhão foi coletado três vezes, a cada 48 horas,
obtendo-se 12 ejaculados.
2.4 Processamento do sêmen
Após a coleta o sêmen foi filtrado em filtro de nylon (Minitub®, Alemanha) para
remoção da fração gel e os ejaculados avaliados macro e microscopicamente segundo o
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal antes da congelação. A concentração
espermática foi aferida por câmara de Neubauer. Somente os ejaculados com motilidade
mínima de 60 %, vigor espermático de 3 e 70 % de espermatozoides morfologicamente
normais foram congelados (CBRA, 2013).
Após coleta e avaliação, o sêmen foi diluído v:v (sêmen:diluidor) em meio à base de
leite desnatado (BotuSêmen®, Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) e centrifugado a
600xg por 10min (Papa et. al., 2005). O sobrenadante foi descartado e o pellet foi
rediluído em diluidor de congelação conforme os tratamentos supracitados.
O sêmen diluído foi envasado em palhetas de 0,25 mL, na concentração de 100x106
espermatozoides móveis por mL. As palhetas foram seladas com álcool polivinílico,
refrigeradas e submetidas a uma curva de congelação convencional, não automatizada.
As palhetas foram colocadas em uma estante no interior de um refrigerador doméstico a
5ºC utilizando tempo de resfriamento de 20 minutos, sem nenhum tipo de proteção para
evitar o choque térmico (Papa et. al., 2005), depois as palhetas foram colocadas
horizontalmente em uma estante metálica dentro de uma caixa de isopor térmica,
contendo nitrogênio líquido no seu interior, deixando as palhetas a uma distância de três
centímetros acima da coluna líquida durante 20 minutos. A congelação foi finalizada
pela imersão das palhetas no nitrogênio líquido (-196ºC) e armazenamento em botijão
criogênico. Após a descongelação a 46ºC por 15 segundos (Papa et. al., 2005), as
amostras foram incubadas a 37ºC e avaliadas.
2.5 Análises do sêmen após descongelação
69
O movimento espermático das amostras descongeladas foi avaliada por um sistema
computadorizado Sperm Class Analyser® (Microptics S.L, v.5.2, Barcelona, Espanha).
Os padrões utilizados para o ajuste do equipamento foram: 25 imagens/segundo com 25
Hz; tamanho de partícula capturado entre 4 e 75 µm/m2; espermatozoides considerados
imóveis <10 µm/s, lentos <45 µm/s, médios de 45 a 90 µm/s e rápidos acima de 90
µm/s. Foram avaliados os seguintes parâmetros: Motilidade Total (MT), Motilidade
Progressiva (MP), Linearidade (LIN), Retilinearidade (STR), Índice de Oscilação
(WOB), Hiperativos expressos em porcentagem (%); Velocidade Curvilinear (VCL),
Velocidade Linear Progressiva (VSL) e Velocidade Média do Trajeto (VAP), expressas
em micrômetros por segundos (µm/s); Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça
Espermática (ALH), expressa em micrômetros (µm); e Frequência do Batimento
Flagelar Cruzado (BCF), expressa em Hertz (Hz).
A integridade estrutural das membranas, plasmática e acrossomal, foram avaliadas
utilizando um microscópio fluorescente (400X; Olympus® CX 31) após a coloração do
espermatozoide com corantes fluorescentes diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e
iodeto de propídio (IP) (Harrison and Vickers, 1990). A coloração com CFDA foi
avaliada usando o conjunto padrão de filtro de fluoresceína, enquanto a coloração com
IP foi avaliada usando o conjunto padrão de filtros de rodamina. Foram analisados 200
espermatozoides por amostra.
A integridade funcional da membrana plasmática foi avaliada utilizando o teste
hiposmótico (HOST) com 50 µL da amostra diluída em 500 µL de uma solução de
sacarose a 100 mOsmol/L. As amostras diluídas foram primeiro incubadas em banho
seco a 37°C durante 30 minutos e posteriormente foram fixadas com 250 µL de solução
de citrato de sódio formolizado a 4% e 200 células foram avaliadas usando um
microscópio de contraste de fase (1000x; Olympus® CX 31).
A porcentagem de células reativas ao HOST foi calculada de acordo com o método de
Melo e Henry (Melo and Henry, 1999). HOST% = (% de alterações na região da cauda
após o HOST) - (% de alterações na região da cauda antes do HOST). As alterações de
cauda antes do teste foram analisadas por meio da técnica de preparação úmida,
diluindo uma amostra de sêmen em solução de citrato de sódio formolizado a 4% para
posterior avaliação das alterações morfológicas espermáticas usando um microscópio de
contraste de fase (1000x; Olympus® CX 31). Foram avaliados 200 espermatozoides.
70
A integridade da cromatina espermática foi avaliada utilizando a técnica da
metacromasia induzida pelo azul de toluidina (Naves et al., 2004). Foram
confeccionados esfregaços com uma alíquota de 10 µL da amostra, secados em
temperatura ambiente e fixados por 1 min em solução de Carnoy (3:1, 75 mL de álcool
100 % + 25 mL de ácido acético) e em seguida em álcool a 70 % por 3 min. Procedeu-
se á hidrólise com ácido clorídrico 4N por 15 minutos, lavagem em água destilada e
secagem em temperatura ambiente. Para a coloração do esfregaço foi depositado 20 µL
da solução de azul de toluidina a 0,025 % (0,00125 g de azul de toluidina em 5 mL de
solução de McIlveine, pH 4,0) entre lâmina e lamínula e avaliadas 500 células em
microscopia de contraste de fase (1000x; Olympus® CX 31). Os espermatozoides foram
classificados em: com cromatina compacta (região da cabeça corada em azul claro) e
com cromatina descompactada (região da cabeça corada em azul escuro ou violeta).
A atividade mitocondrial foi avaliada por meio da coloração de 3,3’- diaminobenzidina
(DAB) segundo a técnica de Hrudka (Hrudka, 1987), sendo que 20 µL da amostra foram
incubados com 20 µL de DAB (1mg/mL de PBS) a 37ºC por 60 minutos, na ausência de
luz. Após a incubação foram feitos esfregaços, fixados em formol a 10 % por 10
minutos, lavados em água destilada e secados ao ar sob proteção da luz. Foram
avaliadas 200 células em microscópio de contraste de fase (1000x; Olympus® CX 31).
As células foram classificadas de acordo com o nível de deposição do corante na peça
intermediária (PI). Na classe I, os espermatozoides apresentavam a PI totalmente corada
(alta atividade mitocondrial); na classe II, os espermatozoides apresentavam mais de 50
% da PI corada (atividade mitocondrial intermediária); na classe III, apresentavam
menos de 50 % da PI corada (baixa atividade mitocondrial) e na classe IV, não
apresentavam coloração (atividade mitocondrial inexistente).
2.6 Análises estatísticas
O delineamento experimental foi em blocos ao acaso, considerando o garanhão como
um bloco. Foi utilizada análise de variância para testar as diferenças entre os
tratamentos. Para comparação entre médias foi utilizado o teste de Tukey, com nível de
significância de 5%. Todos os pressupostos foram testados e quando violados foi
utilizada a transformação boxcox (y' = \frac{y^{\lambda} - 1}{\lambda}) por meio da
função “boxcox” do pacote MASS versão 7.3-41 (Venables and Ripley, 2002). As
variáveis transformadas no experimento foram: DAB VI, Rápidos e Médios. Todas as
71
análises foram feitas com o auxílio do R Core Team (2016) (Statistical and Computing,
2016). Os dados foram apresentados em forma de média, mesmo os transformados.
3. Resultados
Foram observadas diferenças entre os diluidores em preservar determinados parâmetros
do movimento espermático. O diluidor controle e o contendo 30 ngmL-1 de DHA
preservaram melhor a motilidade, a VSL e a VAP do que os demais diluidores testados
(P<0,05). Além disso, resultaram em amostras com elevado percentual de
espermatozoides hiperativos quando comparado aos diluidores contendo o antioxidante
Trolox® (P<0,05). O percentual de espermatozoides com baixa atividade mitocondrial
foi maior nas amostras criopreservadas em diluidor com Trolox® e com Trolox®
associado com concentrações de DHA superiores a 50 ngmL-1 (P<0,05, Tab. 1).
Tabela 1. Parâmetros de viabilidade espermática no sêmen equino criopreservado em diluidor com ou sem Trolox® e diferentes concentrações de DHA. Parâmetros Diluidores
P-valor BC 0T
0DHA
BC 0T
30DHA
BC 40T
0DHA
BC 40T
50DHA
BC 40T
70DHA
BC 40T
90DHA
EPM
MT(%) 47,40ab 48,10a 24,00c 22,90c 24,60bc 21,80c 5,49 0,00 MP (%) 4,40a 4,20a 1,20b 0,90b 1,10b 1,00b 0,54 0,00 VCL (µm/s) 24,50 24,70 17,80 17,80 18,30 16,00 2,95 0,20 VSL (µm/s) 10,00a 9,50a 6,00b 6,00b 6,20b 5,60b 1,22 0,00 VAP (µm/s) 15,10a 14,90a 9,50b 9,70b 9,70b 9,00b 1,76 0,00 LIN (%) 33,60 31,90 25,00 24,90 25,00 23,20 4,36 0,40 STR (%) 54,30 52,90 46,80 45,60 46,40 41,10 7,15 0,80 WOB (%) 51,30 50,00 39,80 40,70 39,90 37,50 6,41 0,50 ALH (µm) 2,20 2,30 2,00 2,00 2,00 1,70 0,29 0,70 BCF (Hz) 6,30 6,00 5,80 5,40 5,80 4,50 1,10 0,90 Hiperativos (%) 1,70a 1,70a 0,60b 0,60b 0,60b 0,70b 0,22 0,00 CFDA+ (%) 24,30 21,40 19,00 22,50 20,10 17,10 3,50 0,80 HOSTr (%) 26,10 26,20 21,20 20,10 26,00 19,30 2,63 0,20 DNAc (%) 80,50 82,90 82,20 81,40 80,40 83,50 2,63 1,00 DNAd (%) 19,50 17,10 17,80 18,60 19,60 16,50 2,62 0,90 DABI (%) 84,30 85,40 80,90 83,30 82,50 80,90 1,55 0,30 DABII (%) 10,50 9,50 12,10 10,30 10,40 12,50 1,19 0,50 DABIII (%) 3,80b 4,10b 6,30a 4,70b 5,30a 5,20a 0,59 0,10 DABIV (%) * 1,50 1,20 1,50 1,70 1,80 1,50 0,30* 0,80 D1) BotuCrio® (BC; controle); D2) BC + 30 ngmL-1 de DHA (BC30DHA); D3) BC + 40 µM de Trolox® (BC40T); D4) BC40T + 50 ngmL-1 de DHA (BC40T50DHA); D5) BC40T + 70 ngmL-1 de DHA (BC40T70DHA); D6) BC40T + 90 ngmL-1 de DHA (BC40T90DHA). Motilidade Total (MT); Motilidade Progressiva (MP); Velocidade Curvilinear (VCL); Velocidade Linear Progressiva (VSL), Velocidade Média do Trajeto (VAP); Linearidade (LIN); Retilinearidade (STR); Índex de Oscilação (WOB); Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH), Hiperativos; Frequência do Batimento Flagelar Cruzado (BCF). Espermatozoides com membrana estrutural íntegra (CFDA+). Espermatozoides reativos com membrana funcional pelo teste hiposmótico (HOSTr). Cromatina Compactada (DNAc); Cromatina Descompactada (DNAd). Alta atividade mitocondrial (DAB I); Atividade mitocondrial intermediária (DAB II); Baixa atividade mitocondrial (DABIII); Atividade mitocondrial inexistente (DAB IV). abAs letras sobrescritas indicam diferenças dentro da linha (P <0,05). *As inferências para tais variáveis foram feitas após transformação.
72
4. Discussão
A adição do Trolox® associado ao DHA em diluidor de congelação de sêmen equino
teve efeito negativo sobre a cinética espermática quando o diluidor foi acrescido de
concentrações superiores a 50 ngmL-1 de DHA associado a 40 µM de Trolox® e também
no diluidor contendo apenas 40 µM de Trolox®. De uma forma geral, a inclusão de
Trolox® aos diluidores acrescidos ou não de DHA não apresentou capacidade para
preservar os parâmetros de motilidade e velocidade espermática.
Pode-se encontrar na literatura uma gama de resultados quando se adiciona o alfa
tocoferol aos diluidores seminais, tanto favoráveis como desfavoráveis. Relatos
mencionam um efeito positivo na motilidade de equino (Ball et al., 2001), ovino (Sarlos
et al., 2002) e suíno (Breininger et al., 2005), ou sem efeito em ovinos (Upreti et al.,
1997) e equino (Ball et al., 2001). Por outro lado, outro autor aponta detecção de
grandes quantidades de alfa tocoferol nos espermatozoides com maior motilidade (Kao
et al., 2008). Esperava-se que o Trolox® maximizasse a ação dos diluidores de
congelação de sêmen com ou sem DHA sobre os espermatozoides, por meio de sua ação
antioxidante e consequentemente controle da lipoperoxidação, no entanto, isso não foi
observado. De forma que o baixo desempenho em relação aos parâmetros de
movimento espermático observados em nossos estudos, apesar de possível e já relatados
em outros trabalhos, pode ser atribuída as concentrações utilizadas, composição do
diluidor e a forma de criopreservação seminal.
Um dos fatores que contribuem para a ineficiência de um antioxidante é a ausência de
um estresse oxidativo suficiente para sobrepujar os mecanismos antioxidantes do meio,
isto é, no tratamento de amostras que não estejam sofrendo estresse oxidativo esses
podem não surtir o efeito desejado (Nichi, 2003). Isso ficou claro, pois todos os
diluidores que tiveram na sua composição Trolox® isoladamente ou associado a
concentrações de DHA superiores a 50 ngmL-1 não foram eficientes para manter
adequadamente os parâmetros de movimento espermático quando a curva de congelação
utilizada foi manual, neste caso o sistema antioxidante do diluidor controle pode ter sido
suficiente para manter o estresse oxidativo em níveis baixos, por isso não sendo
possível observar os benefícios da adição do Trolox®.
Ao se avaliar a adição de Trolox® em diluidor de sêmen ovino antes da congelação nas
concentrações de 50, 100, 150 e 200 µM Trolox®/108 espermatozoides foi constatado
73
que a concentração de 150 µM e 200 µM Trolox® teve um efeito deletério sobre o
movimento espermático (Sicherle et al., 2006).
A curva de congelação utilizada pode ter influenciado negativamente os resultados de
movimento espermático observadas em amostras criopreservadas na presença de
Trolox®. A taxa de refrigeração foi muito rápida, pode não ter sido suficiente para os
espermatozoides se adaptarem a redução de temperatura e garantir uma fase de transição
da membrana plasmática adequada o que resultou em baixo percentual de
espermatozoides progressivamente móveis. Além disso, a curva de congelação foi de
aproximadamente -70°C/min e feita de forma manual colocando as palhetas diretamente
no vapor de nitrogênio, com um menor controle da temperatura comparado com a
automatizada. Em uma pesquisa comparando duas curvas de congelação de sêmen
equino, uma automatizada (-25ºC/min) e outra não automatizada (-70°C/min), os
autores relataram um melhor desempenho da motilidade total e progressiva, bem como
da integridade e funcionalidade da membrana plasmática nas amostras congeladas na
curva automatizada, sugerindo que esse fato se deve a uma maior precisão no controle
do decréscimo de temperatura, resultando em menores danos espermáticos e controle do
choque térmico (Terraciano et al., 2008). A composição dos meios diluidores possui
grande influência sobre a sobrevivência espermática durante a criopreservação, pois há
uma importante interação entre os componentes do meio e as curvas de
refrigeração/congelação utilizadas (Chaveiro et al., 2006).
A hipótese deste experimento de que a associação entre o alfa tocoferol e o DHA
pudesse melhorar as características seminais durante a congelação, através do aumento
da fluidez da membrana proporcionada pela incorporação do DHA junto à proteção
antioxidante do alfa tocoferol, não se confirmou. Talvez, os componentes que foram
adicionados ao diluidor (DHA e Trolox®) necessitem de um maior tempo de contato
com os espermatozoides durante o resfriamento para garantir maior sobrevivência
espermática após a criopreservação, principalmente maior percentual de células com
motilidade e velocidade para chegar ao sítio de fertilização e fertilizar o gameta
feminino. Porém, a curva de resfriamento não permitiu uma maior interação.
Estudos demonstram que a incorporação do DHA é dose-dependente do tempo
(Browning et al., 2012; Calder, 2014), mas o padrão preciso depende da localização
específica (Frank Thies et al., 2001 a; b). De forma que os lipídeos plasmáticos
incorporam DHA mais rapidamente do que as células sanguíneas, enquanto entre os
74
glóbulos sanguíneos, os leucócitos demonstraram incorporar DHA mais rapidamente do
que os eritrócitos (Katan et al., 1997; Browning et al., 2012).
A adição isolada do DHA na concentração de 30 ngmL-1 ao diluidor controle de
congelação de sêmen equino resultou em melhores resultados de movimento
espermático quando comparado aos diluidores com Trolox® ou com Trolox® e DHA em
concentrações iguais ou superiores a 50 ngmL-1. Entretanto, é importante salientar que
essa inclusão não maximizou o efeito do diluidor controle. Embora, já tenha sido
relatado que a suplementação com DHA, oral ou no diluidor, aumenta a qualidade
seminal em humanos (Safarinejad et al., 2010), suínos (Mitre et al., 2004), equinos
(Harris et al., 2005), camundongos (Roqueta-Rivera et al., 2010) e bovinos (Gholami et
al., 2010). Ocorre incorporação das moléculas de DHA nas membranas espermáticas a
partir da sua adição aos diluidores, o que altera a proporção de ω-6:ω-3 (Towhidi and
Parks, 2012; Wassall and Stillwell, 2009) e também de PUFA:ácidos graxos saturados
(Nasiri et al., 2012), refletindo na melhoria da fluidez e flexibilidade (Wassall and
Stillwell, 2009), e consequentemente resultando em um efeito benéfico para motilidade
(Connor et al., 1998). Além disso, concentrações abaixo do ideal de DHA são
encontradas em espermatozoides com qualidade inferior de movimento (Safarinejad et
al., 2010).
Em um estudo sobre lipidômica do espermatozoide equino verificou-se que estes eram
ricos em diacilglicerofosfolipídeos, particularmente a fosfatidilcolina e a
fosfatidiletanolamina, esses em conjunto com seminolipídeos são essenciais na
membrana plasmática e no desempenho de suas funções, no entanto baixos níveis de
DHA resultam em limitada substituição dos ácidos graxos em vários
glicerofosfolipídeos que são essenciais para as funções espermáticas, sendo o DHA
capaz de fazer a remodelação dos glicerofosfolipídeos e diacilglicerofosfolipídeos. Os
autores apontam para outro aspecto importante que é a disponibilidade limitada de
Omega 3 em relação aos altos níveis de Omega 6 em sêmen dessa espécie, o que vai
influenciar nas substituições dos ácidos graxos dos glicerofosfolípideos de éter e diacil,
com substituições de Omega 6 superiores ao de Omega 3, fato que ocorre como
conseqüência de um suprimento limitado de Omega 3 nos espermatozoides para a
remodelação lipídica em sn-2 do esqueleto de glicerol dos glicerofosfolipídeos.
Considerando esses fatos, há uma probabilidade de que com a suplementação do ácido
75
docosahexaenóico ocorra uma alteração na remodelação dos glicerofosfolipídeos de éter
e diacilglicerofosfolipídeos em espermatozoides desta espécie (Wood et al., 2016).
Variações nos níveis de DHA ligados aos glicerofosfolipídeos de membrana podem
afetar propriedades biofísicas como sua fluidez e flexibilidade, fato que interfere na
motilidade espermática, por outro lado a alta incorporação de DHA é relatada como
facilitadora da conformação da membrana em processos tais como fusão e fissão
(Barelli e Antonny, 2016). Comparado com outras funções biológicas dos PUFAs, os
mecanismos de incorporação do DHA em membranas ainda permanece obscuro. Várias
moléculas importantes envolvidas na incorporação de DHA nas células e a produção de
glicerofosfolipídeos contendo DHA foram identificadas, incluindo LPAAT3, Mfsd2a e
AdipoR1 (Nguyen et al., 2014; Rice et al., 2015; Iizuka-Hishikawa et al., 2017; Shindou
et al., 2017). No entanto, questões muito básicas ainda permanecem sem elucidação, por
exemplo, como a forma de incorporação de DHA é regulada e as funções precisas do
DHA em glicerofosfolipídeos de membrana (Hishikawa et al., 2017).
Percebe-se que os resultados sobre o efeito do DHA apresentados na literatura ainda são
controversos, havendo assim a necessidade de mais estudos com diferentes
concentrações e suas associações, buscando aumentar a viabilidade dos espermatozoides
equino criopreservados. Quando o sêmen de touros foi submetido a tratamentos com
DHA (0; 1; 10 e 100 ngmL-1) e alfa tocoferol (0; 0,2 e 0,4 mmol) em diluidor de
congelação, ocorreu uma diminuição da qualidade seminal pós-descongelação com o
uso da concentração de 100 ngmL-1, fato que não ocorreu com as demais concentrações
utilizadas (Towhidi e Parks, 2012). Em suínos, quando foi realizada a inclusão de DHA
através da utilização do óleo de peixe (0; 0,13; 0,29 e 0,45g) no diluidor, observou-se
maior viabilidade, motilidade progressiva e integridade acrossomal nos grupos
suplementados quando comparado com o grupo controle.
O DNA, a integridade funcional da membrana, a LIN, a STR e a BCF foram
preservados de forma semelhante em todos os tratamentos propostos. Torna-se de
grande importância a integridade do seu DNA como expressão do seu potencial de
fertilidade, pois porcentagens demasiadas de cromatina descompactada detectada em
espermatozoides pode apontar para problemas na fertilização (Fraser, 2004).
Embora já tenha sido relatado que a redução da temperatura durante o resfriamento e a
congelação acarretam fragmentação do DNA (Mccarthy e Meyers, 2011), os diluidores
76
propostos no presente estudo preservaram a integridade estrutural da membrana
plasmática e acrossomal, bem como a integridade funcional e mais de 80% dos
espermatozoides com a cromatina compacta. A manutenção da integridade de
membrana pós-descongelamento foi correlacionada com a porcentagem de ácidos
graxos insaturados presentes nesta (Macías García et al., 2011), pois estes possuem
capacidade de melhorar a fluidez das membranas dos espermatozoides. Enquanto as
gorduras saturadas de cadeia longa aumentam a rigidez da membrana, a poli-insaturação
dos ácidos graxos torna a membrana flexível e fluida, mais próximo do fisiológico
(Flesch e Gadella, 2000). O DHA é de especial interesse porque com 22 carbonos e seis
ligações duplas é o mais insaturado e um dos ácidos graxos mais longos que compõem o
núcleo hidrofóbico da membrana. Por outro lado, o sêmen de garanhão com mais de
30% de espermatozoide com DNA fragmentado tem menor potencial fértil do que o
sêmen de reprodutores com um percentual menor que 15% de espermatozoides
fragmentados (Evenson e Jost, 2001). Em nosso estudo a fragmentação de DNA foi
inferior a 20% nas amostras criopreservadas nos diferentes diluidores.
Mitocôndrias preservadas são responsáveis pela sustentação da produção de energia
espermática, refletindo na qualidade da motilidade e oferecendo forte correlação com
espermatozoides que possuem alto potencial de membrana mitocondrial com
capacidade de fecundação (Brito, 2015). No presente estudo não foram encontradas
diferenças entre os diluidores testados em preservar os espermatozoides classificados na
categoria com atividade mitocondrial alta e intermediária. No entanto, as amostras
criopreservadas no diluidor controle, no contendo 30 ngmL-1 de DHA e no acrescido da
associação de 50 ngmL-1 de DHA e 40 µM de Trolox® apresentaram menor percentual
de espermatozoides com baixa atividade mitocondrial. Grande parte da geração de
energia com produção de ATP pela fosforilação oxidativa em espermatozoides da
espécie equina acontece na mitocôndria (Gibb et al., 2014).
5. Conclusão
O uso do Trolox® em diluidores de congelação contendo DHA, nas concentrações
estudadas, preservou diferentes parâmetros de viabilidade espermática, entretanto, não é
indicado por alterar negativamente parâmetros cinéticos importantes para a fertilidade
quando a curva de refrigeração e congelação são muito rápidas.
77
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84
6. ARTIGO CIENTÍFICO III
EFEITO DO ÁCIDO DOCOSAHEXAENOICO E DO TROLOX ® NO
DILUIDOR DE REFRIGERAÇÃO DE SÊMEN DE GARANHÕES DA R AÇA
MANGALARGA MARCHADOR
85
Artigo redigido segundo as normas da Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, ISSN 1678-4162, ranqueada como A2 pelo QUALIS – CAPES quadriênio
2013-2016, Fator de impacto 2016: 0.1321.
Efeito do Ácido docosahexaenoico e do Trolox® no diluidor de refrigeração de
sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador
[Effect of Docosahexaenoic acid and Trolox® in extenders for semen refrigeration of
the stallion Mangalarga Marchador breed]
C.S.Aguiar1*, C.H.S.C.Barros1, W.M.Machado1, L.P.Barbosa2, I.B.Allaman3,
P.P.N.Snoeck1
1Programa de Pós-Graduação Ciência Animal (PPGCA), Departamento de Ciências
Agrárias e Ambientais, Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus, BA,
Brasil.
2Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas da Universidade Federal do
Recôncavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas, BA, Brasil.
3Departamento de Ciências Exatas e Tecnológicas, Universidade Estadual de Santa
Cruz (UESC), Ilhéus, BA, Brasil.
*E-mail: [email protected]
RESUMO
Objetivou-se avaliar o efeito do ácido docosahexaenoico (DHA), associado ou não ao Trolox®, na refrigeração de sêmen de garanhões da raça Mangalarga Marchador. Para tanto foram refrigerados dez ejaculados para testar o efeito dos seguintes diluidores: D1) BotuSêmen® (BS; controle); D2) BS + 30 ngmL-1 de DHA (BS30DHA); D3) BS + 30DHA + 40 µM de Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50 ngmL-1 de DHA (BS50DHA); D5) BS + 50DHA + 40 µM de Trolox® (BS50DHA40T). Após 48 horas de refrigeração foram avaliados os parâmetros de movimento espermático, a integridade estrutural e funcional da membrana plasmática e a longevidade espermática pelo teste de termoresistência. Todos os diluidores testados preservaram de forma semelhante a motilidade, a linearidade (LIN), a retilinearidade (STR), a amplitude do deslocamento lateral da cabeça (ALH), a frequência do batimento flagelar cruzado (BCF), o percentual de hiperativos, a integridade estrutural e funcional da membrana espermática (P>0,05). No entanto, o diluidor BS50DHA foi superior ao BS30DHA40T em preservar a VCL e VSL e foi superior ao BS30DHA40T e BS50DHA40T em preservar a
86
velocidade média do trajeto (VAP) e o índex de oscilaçao (WOB) (P<0,05). Concluímos que o uso do Trolox® em diluidores utilizados para refrigeração de sêmen equino contendo DHA nas doses estudadas não é indicado por alterar parâmetros de movimento espermático importantes para garantir bons resultados de fertilidade. Palavras-chave: antioxidante, ácidos graxos, espermatozoide, criopreservação, equino.
ABSTRACT
The objective of this study was to evaluate the effect of docosahexaenoic acid (DHA), associated or not with Trolox®, on the cooling of semen from Mangalarga Marchador stallions. For this purpose, ten ejaculates were refrigerated to test the effect of the following extenders: D1) BotuSêmen® (BS; control); D2) BS + 30 ngmL-1 DHA (BS30DHA); D3) BS + 30DHA + 40 µM Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50 ngmL-1 DHA (BS50DHA); D5) BS + 50DHA + 40 µM Trolox® (BS50DHA40T). After 48 hours of cooling, the parameters of sperm movement, structural and functional integrity of the plasma membrane and sperm longevity were evaluated by the thermoresistance test. All extenders tested similarly preserved motility, linearity (LIN), rectilinearity (STR), amplitude of lateral head displacement (ALH), frequency of cross flagellar beating (BCF), percentage of hyperactive, a structural and functional integrity of the sperm membrane (P> 0.05). However, the BS50DHA extenders was superior to BS30DHA40T in preserving VCL and VSL and was superior to BS30DHA40T and BS50DHA40T in preserving mean path velocity (VAP) and oscillation index (WOB) (P <0.05). We conclude that the use of Trolox® in extenders used for cooling equine semen containing DHA at the doses studied is not indicated because it changes important sperm movement parameters to guarantee good fertility results. Key words: antioxidant, fatty acids, spermatozoa, cryopreservation, equine.
INTRODUÇÃO O uso do sêmen refrigerado e transportado em caixas isotérmicas é uma prática
corriqueira na indústria equina em várias partes do mundo, auxiliando na difusão da
técnica de inseminação artificial (IA) (Loomis, 2006), tendo em vista que a IA com
sêmen congelado nesta espécie encontra fatores limitantes na sua rotina. Um dos
principais fatores está relacionado à própria espécie, pois muitos garanhões possuem
características seminais desfavoráveis pós-descongelação (Alvarenga e Carmo, 2007),
sendo o uso do sêmen refrigerado a maneira mais viável de maximizar o aproveitamento
destes animais (Vidament et al., 1997).
Um dos prejuízos decorrentes do processo de criopreservação é o estresse oxidativo. Os
espermatozoides são susceptíveis a lesões peroxidativas por serem possuidores de
grande quantidade de ácidos graxos poli-insaturados em sua membrana. A geração de
espécies reativas de oxigênio (ROS) é induzida por essas lesões lipoperoxidativas,
87
grandes responsáveis por inviabilizar os espermatozoides para o processo de fertilização
do ovócito (Alvarez et al., 2006), em decorrência da diminuição da motilidade, de
lesões na membrana plasmática e de fragmentação do DNA e, por conseguinte queda da
fertilidade (Gibb et. al., 2014; Varner et. al., 2015).
No entanto, o acréscimo de ácidos graxos poli-insaturados na membrana plasmática
pode beneficiar a motilidade e demais parâmetros do espermatozoide durante seu
armazenamento refrigerado (Takahashi et al., 2012), a exemplo DHA, que ao ser
adicionado ao diluidor é incorporado pela membrana plasmática do espermatozoide
(Nasiri et. al., 2012; Towhidi e Parks, 2012). No entanto, as duplas ligações encontradas
nesses ácidos graxos são facilitadoras da lipoperoxidação iniciada principalmente pelo
radical hidroxila, levando a uma reação em cascata (Ball e Vo, 2002), que pode
ocasionar alteração da fluidez da membrana plasmática e comprometer a fecundação
(Sanocka e Kurpisz, 2004).
A membrana plasmática e acrossomal são protegidas pelo alfa tocoferol que é capaz de
cessar a reação em cadeia da lipoperoxidação em biomembranas (Sikka, 2004). O
Trolox®, seu análogo hidrossolúvel, possui potente propriedade antioxidante (Wu et al.,
1991).
Assim, espera-se que a associação do DHA com o antioxidante Trolox® possa melhorar
a resistência dos espermatozoides durante a refrigeração e transporte. Por isso,
objetivou-se avaliar o efeito de duas diferentes concentrações de DHA, associado ou
não a uma concentração fixa de Trolox® sobre os espermatozoides refrigerados de
garanhões da raça Mangalarga Marchador.
MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética na Experimentação Animal
CEUA/UESC da Universidade Estadual de Santa Cruz, Ilhéus, Bahia, Brasil com o
número de protocolo 004/16.
Todos os reagentes utilizados foram puros para análise e adquiridos da empresa Sigma-
Aldrich® (St. Louis, MO, USA).
O experimento foi realizado em haras localizado no município de Itabuna, Bahia,
Nordeste, Brasil (latitude 14º47'08"S, longitude 39°16′49″W, altitude 54m e área
443km2, mesoregião geográfica Sul Baiano) em agosto de 2017. O local possui clima
88
tropical chuvoso, bioma mata atlântica, pluviosidade média anual de 1.300mm e
temperatura média anual de 23,6ºC, umidade acima de 80% (Anuário Estatístico de
Itabuna, 2016). As análises seminais foram realizadas no Laboratório de Reprodução
Animal da Universidade Estadual de Santa Cruz.
Foram utilizados dez garanhões saudáveis da raça Mangalarga Marchador com idade
variando de 7 a 9 anos, com escore da condição corporal 3,5. Cada garanhão foi
coletado duas vezes com intervalo de uma hora com vagina artificial modelo Botucatu®
(Botupharma, Botucatu, SP, Brasil), com temperatura interna entre 42 e 45ºC e auxílio
de uma fêmea em estro como manequim. O primeiro ejaculado de cada garanhão foi
descartado e o segundo submetido ao processo de refrigeração para minimizar possíveis
variações de qualidade espermática, tendo em vista que nem todos os garanhões
estavam sob o mesmo regime de coleta de sêmen (Bedford-Guaus, 2012).
A fração gel do ejaculado de todos os garanhões, quando presente, foi removida com o
auxílio de um filtro de nylon (Minitube®, Alemanha) e o volume do ejaculado
mensurado em proveta graduada. Todos os ejaculados foram avaliados macro e
microscopicamente segundo o CBRA (2013) antes da refrigeração. Somente os
ejaculados com motilidade mínima de 70%, vigor espermático de 3 e 70% de
espermatozoides morfologicamente normais foram refrigerados (CBRA, 2013).
O DHA e o Trolox® foram adicionados aos diluidores de sêmen após o preparo de uma
solução estoque. A solução estoque de DHA foi calculada considerando seu peso
molecular de 328,49 g/mol e diluída em 100 mL de solução de etanol a 0,05% (76,1058
x 10-4mol/L). A solução estoque de Trolox® foi preparada e diluída em soluçao de Tris-
ácido cítrico (Maia et al., 2010), considerando seu peso molecular de 250,29 g/mol (a
10mM; 0,0125g de Trolox em 5mL de Tampão Tris).
O sêmen a ser refrigerado foi dividido e diluído (sêmen:diluidor) para concentração de
50x106 espermatozoides/mL nos seguintes diluidores a 37ºC: D1) BotuSêmen® (BS;
controle); D2) BS + 30 ngmL-1 de DHA (BS30DHA); D3) BS + 30DHA + 40 µM de
Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50 ngmL-1 de DHA (BS50DHA); D5) BS+ 50DHA
+ 40 µM de Trolox® (BS50DHA40T). Após a diluição, a motilidade e o vigor de todas
as amostras foram avaliadas para verificar se o processo não havia acarretado nenhum
prejuízo aos espermatozoides.
89
Após a diluição, as amostras de sêmen de cada garanhão foram acondicionadas em
tubos cônicos de centrifugação de 15 mL em um sistema de armazenamento e transporte
do tipo BotuFLEX® (Botupharma, Botucatu, SP, Brasil) e lacrado por um período de 48
horas. A temperatura final do armazenamento do sêmen refrigerado adotada no sistema
isotérmico BotuFLEX® foi 5°C e queda de aproximadamente 0,5ºC/min, para isso,
foram utilizados dois gelos recicláveis próprios da caixa térmica e uso de tubo extra
contendo água para garantir o volume máximo de líquido (200mL) em seu interior,
preconizado pelo fabricante.
Transcorrido o período de 48 horas, as amostras foram retiradas da BotuFLEX® e
colocadas em banho seco à temperatura de 37°C para avaliação dos parâmetros de
movimento espermático, morfologia espermática, integridade estrutural e funcional da
membrana plasmática. O movimento espermático foi avaliado após cinco e 120 minutos
de incubação por um sistema computadorizado e os padrões utilizados do programa
Sperm Class Analyser® (Microptics S.L, v.5.2, Barcelona, Espanha) foram: 25 imagens
/ segundo com 25 Hz; tamanho de partícula capturado entre 4 e 75 µm/m2;
espermatozoides considerados imóveis <10 µm/s, lento <45 µm/s, médios de 45 a 90
µm/s e rápido acima de 90 µm/s. Foram avaliados os seguintes parâmetros: Motilidade
Total (MT), Motilidade Progressiva (MP), Linearidade (LIN), Retilinearidade (STR),
Índice de Oscilação (WOB) e Hiperativos expressos em porcentagem (%); Velocidade
Curvilinear (VCL), Velocidade Linear Progressiva (VSL) e Velocidade Média do
Trajeto (VAP), expressas em micrômetros por segundos (µm/s); Amplitude do
Deslocamento Lateral da Cabeça Espermática (ALH), expressa em micrômetros (µm); e
Frequência do Batimento Flagelar Cruzado (BCF), expressa em Hertz (Hz).
A integridade estrutural da membrana plasmática e acrossomal foi avaliada utilizando
um microscópio fluorescente (400X; Olympus® BX 31) após a coloração do
espermatozoide com corantes fluorescentes diacetato de carboxifluoresceína (CFDA) e
iodeto de propídio (IP) (Harrison e Vickers, 1990). A coloração com CFDA foi avaliada
usando o conjunto padrão de filtro de fluoresceína, enquanto a coloração com IP foi
avaliada usando o conjunto padrão de filtros de rodamina. Foram analisados 200
espermatozoides por amostra.
A integridade funcional da membrana plasmática foi avaliada utilizando o teste
hiposmótico (HOST) com 50 µL da amostra diluída em 500 µL de uma solução de
sacarose a 100 mOsmol/L. As amostras diluídas foram primeiro incubadas em banho
90
seco a 37°C durante 30 minutos e posteriormente foram fixadas com 250 µL de solução
de citrato de sódio formolizado a 4%. Foram avaliadas 200 células usando um
microscópio de contraste de fase (1000x; Olympus® BX 31). A porcentagem de células
reativas ao HOST e funcionalmente íntegras foi calculada de acordo com o método de
Melo e Henry (1999): HOST% = % de alterações na região da cauda após o HOST - %
de alterações na região da cauda antes do HOST. A morfologia espermática foi avaliada
por meio da técnica de preparação úmida, em amostras fixadas em citrato de sódio
formolizado a 4%, após o processo de refrigeração. Foram avaliadas 200 células usando
um microscópio de contraste de fase (1000x; Olympus® BX 31) para identificar as
alterações de cauda existentes antes de submeter às amostras ao HOST.
O desenho experimental foi em blocos ao acaso, considerando o garanhão como um
bloco. Foi utilizada análise de variância para testar as diferenças entre os tratamentos.
Todos os pressupostos foram testados e quando violados foi utilizada a transformação
boxcox (y' = \frac{y^{\lambda} - 1}{\lambda}) por meio da função “boxcox” do pacote
MASS versão 7.3-41 (Venables e Ripley, 2002), quando não, foram utilizados os testes
de Tukey e Friedman. As variáveis transformadas foram: Motilidade Progressiva depois
do resfriamento, hiperativos, VCL e ALH. Todas as análises foram feitas com o auxílio
do R Core Team (2016) (Statistical Computing, 2016).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi possível observar que após a diluição e antes da refrigeração do sêmen, todos os
diluidores testados preservaram de forma semelhante a motilidade total (P>0,05). O
diluidor controle preservou a motilidade progressiva de maneira superior ao diluidor
adicionado de 30 ngmL-1 de DHA e 40 µM de Trolox® e foi possível notar que o vigor
espermático foi superior nas amostras diluídas em diluidor adicionado de 50 ngmL-1 de
DHA do que neste mesmo diluidor acrescido de 40 µM de Trolox® (P<0,05).
Todos os diluidores preservaram de forma semelhante a motilidade total e progressiva, a
LIN, a STR, o ALH, a BCF e hiperativos, além da integridade estrutural e funcional das
membranas após 48 horas de armazenamento e refrigeração (P>0,05). No entanto, o
diluidor adicionado de 50 ngmL-1 de DHA foi superior ao adicionado de 30 ngmL-1 de
DHA e 40 µM de Trolox® em preservar a VCL e VSL dos espermatozoides (P<0,05) e
superior ao diluidor adicionado de 30 ngmL-1 e 50 ngmL-1 de DHA contendo 40 µM de
Trolox® para preservar a VAP e WOB (P<0,05; Tab. 1).
91
Tabela 1. Parâmetros de viabilidade espermática após 48 horas de armazenamento e refrigeração de sêmen em diluidor BotuSêmen®, com ou sem Trolox® e diferentes concentrações de DHA.
Parâmetros Diluidores EPM P-valor BS 0DHA 0T
BS 30DHA 0T
BS 30DHA 40T
BS 50DHA 0T
BS 50DHA 40T
MT (%) 23,0 20,6 30,8 28,2 29,7 3,1 0,1 MP (%) * 4,7 4,1 3,2 6,9 6,8 0,2 0,3 VCL (µm/s) * 36,2ab 35,1ab 28,9b 39,5a 33,2ab 0,0 0,0 VSL (µm/s) 14,6ab 14,3ab 9,6b 19,3a 13,4ab 1,5 0,0 VAP (µm/s) 22,0ab 21,2ab 14,6b 26,0a 18,0b 1,9 0,0 LIN (%) 41,1 41,0 35,0 48,4 39,8 3,0 0,1 STR (%) 68,3 68,4 66,1 72,8 72,8 2,6 0,3 WOB (%) 60,2ab 59,8ab 52,3b 65,8a 54,5b 2,5 0,0 ALH (µm) * 3,3 2,8 3,1 2,6 2,8 0,8 0,1 BCF (Hz) 10,7 9,5 10,7 8,2 9,6 0,7 0,1 Hiperativos (%)* 2,4 2,8 3,1 2,6 2,8 0,1 0,4 CFDA+ (%) 33,9 30,7 34,0 35,0 40,0 2,3 0,1 HOSTr (%) 14,1 20,9 22,6 18,2 21,7 3,1 0,3 D1) BotuSêmen® (BS) (controle); D2) BS + 30 ngmL-1 de DHA (BS30DHA); D3) 30DHA + 40 µM de Trolox® (BS30DHA40T); D4) BS + 50 ngmL-1 de DHA (BS50DHA); D5) 50DHA + 40 µM de Trolox® (BS50DHA40T). Parâmetros avaliados pelo SCA® após a refrigeração: Motilidade Total (MT); Motilidade Progressiva (MP); Velocidade Curvilinear (VCL); Velocidade Linear Progressiva (VSL), Velocidade Média do Trajeto (VAP); Linearidade (LIN); Retilinearidade (STR); Índex de Oscilação (WOB); Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH), Hiperativos; Frequência do Batimento Flagelar Cruzado (BCF). Espermatozoides com membrana estrutural íntegra (CFDA+). Espermatozoides reativos ao teste hiposmótico e funcionalmente íntegros (HOSTr). ab As letras sobrescritas indicam diferenças dentro da linha (P <0,05).*Variáveis transformadas por meio da função Box Cox.
Nota-se que para garantir melhor VCL e VSL, o diluidor pode ter na sua formulação a
adição de 50 ngmL-1 de DHA. Já é sabido que o DHA tem a capacidade de remodelar os
glicerofosfolipídeos da membrana plasmática e que estes juntos com os seminolipídeos
são essenciais para várias funções do espermatozoide equino como: motilidade, ligação
com a zona pelúcida e fertilização (Wood et al., 2016). O sêmen que apresenta
espermatozoides com maior velocidade produz mais de 50% de oócitos fertilizados do
que sêmen com espermatozoides com baixa velocidade, que a taxa de fertilização de
oócito é menor que 50% (Verstegen et al., 2002)
Nota-se que o vigor antes do resfriamento apresentou o mesmo comportamento, com
melhor resultado para o tratamento com 50 ngmL-1 de DHA na ausência do
antioxidante, indicando que essa combinação de DHA e Trolox® não foi favorável para
esse parâmetro que avalia a intensidade do movimento espermático.
A VAP e o WOB foram melhores preservados nas amostras refrigeradas em diluidor
contendo 50 ngmL-1 de DHA sem Trolox® do que nas amostras com menor ou a mesma
quantidade de DHA associado com Trolox®. Este antioxidante parece não ser eficiente
para preservar determinados parâmetros de movimento espermático quando associado
com o DHA. Além disso, nas condições deste estudo, a inclusão de Trolox® não foi
92
favorável para parâmetros de velocidade associados à fertilização, pois a habilidade do
espermatozoide em percorrer o trato reprodutivo da fêmea e penetrar no oócito depende
da resistência exercida pela secreção ali presente e do potencial hidrodinâmico
permitido pela curvatura flagelar. As propriedades cinemáticas definem a sua força de
propulsão, fato associado ás diferenças na eficiência de migração entre espermatozoides
de alguns machos (Cox et al., 2006).
O tratamento do sêmen com alfa tocoferol, combinado ou não com o DHA, foi descrito
para algumas espécies domésticas, tais como caprina (Ansari et al., 2012), bovina
(Nasiri et al., 2012), equina (Almeida e Ball, 2005; Sabatini et al., 2012), suína (Jeong
et al., 2008), canina (Michael et al., 2007), ovina (Upreti et al., 1997; Towhidi et al.,
2013), para espécies de primatas não humanos Macaca mulatta (Mccarthy e Meyers,
2011) e Alouatta caraya (Carvalho, 2016) e em humanos (Donnelly et al., 1999) com
resultados diversos, tanto favoráveis como desfavoráveis ao seu uso. Esses efeitos
contraditórios podem estar relacionados, em primeiro lugar, com as diferenças de
susceptibilidade à peroxidação lipídica da membrana dos espermatozoides entre as
espécies, principalmente relacionadas a diferenças nos conteúdos antioxidantes e/ou na
composição do plasma seminal. O dano oxidativo provavelmente afeta de forma
diferente as diversas estruturas dos espermatozoides e isso pode variar entre as espécies.
Por outro lado, a ação do alfa tocoferol pode variar com a dose considerada de radicais
hidroxílicos presentes e, de fato, pode se comportar como um estimulador de oxidação
ao invés de um antioxidante (Cao e Cutler, 1993).
A capacidade de neutralização do radical hidroxila pelo Trolox® diminui quando este é
usado em altas concentrações. Então, o mecanismo envolvido na diminuição da sua
capacidade antioxidante quando em altas concentrações pode estar relacionado à sua
ligação com os radicais hidroxila e outros radicais de oxigênio produzidos na presença
de H2O2 e Cu2+ e assim conduzindo à formação de muitos outros radicais. Percebe-se
que os efeitos benéficos de um antioxidante parecem acontecer respeitando um
determinado intervalo. Existem diversos tipos de radicais produzidos no sêmen e a
proteção antioxidante contra estes pode não estar relacionada positivamente com suas
concentrações (Cao et al., 1993).
A inclusão de DHA e Trolox® em diferentes combinações não maximizou o efeito
crioprotetor do diluidor controle sobre vários parâmetros de viabilidade espermática:
motilidade, LIN, STR, ALH, BCF, hiperativos, estruturalmente e funcionalmente
93
íntegros. É sabido que garanhões com boa qualidade seminal e boa resistência ao
processo de criopreservação respondem de forma semelhante a diferentes tipos de
diluidores e, isso pode explicar um pouco os nossos resultados, tendo em vista que os
reprodutores utilizados apresentavam sêmen de ótima qualidade antes da refrigeração.
Além disso, Elhordoy et al. (2008) chamaram atenção para o fato de que a
suplementação oral de DHA só resultou em aumento da produção diária de
espermatozoides, bem como melhoria da qualidade seminal frente ao processo de
refrigeração e congelação em garanhões com baixa qualidade de sêmen e considerados
“bad freezers”.
Depois que as amostras ficaram 120 minutos no TTR lento não foi percebido
superioridade de um diluidor sobre o outro, exceto para VSL e VAP (Tab. 2). Estes
parâmetros apresentaram maiores valores nas amostras refrigeradas no diluidor com 50
ngmL-1 de DHA e menores no diluidor que continha Trolox® (P<0,05). A motilidade
espermática e a sua capacidade de produzir energia na forma de ATP são atributos
importantes dessa célula que garantem o potencial fertilizante da amostra (Layek et al.,
2016).
A motilidade pode ser influenciada positivamente pela adição de DHA ao meio, pois é
sabido que a incorporação deste ácido graxo na membrana plasmática proporciona uma
alteração de sua composição através do incremento da proporção entre ω-3:ω-6
(Wassall e Stillwell, 2009; Towhidi e Parks, 2012), favorecendo a sua fluidez e
melhorando a motilidade e intensidade do movimento (Connor et al., 1998). Assim, a
adição do DHA ao diluidor, apesar de não maximizar o efeito do diluidor controle,
manteve a VSL e a VAP com valores superiores aos diluidores contendo DHA e
Trolox®, mesmo após duas horas de TTR e depois de ser submetido a 48 h de
armazenamento e refrigeração.
Por outro lado, os menores valores de velocidade espermática encontrados nas amostras
contendo Trolox® podem ser devido ao fator concentração utilizada, que pode ter
influenciado na sua capacidade de neutralização do radical hidroxila, estando essa
diminuída quando em altas concentrações de Trolox® (Cao et al., 1993).
94
Tabela 2. Parâmetros de cinética espermática após o TTR Lento do sêmen equino refrigerado e armazenado por 48 horas em diluidor contendo DHA e Trolox® (avaliação após 120 minutos de incubação).
Parâmetros Diluidores EPM P-valor BS 0DHA 0T
BS 30DHA 0T
BS 30DHA 40T
BS 50DHA 0T
BS 50DHA 40T
MT(%) * 14,9 17,0 18,4 19,6 16,2 1,4 0,1 MP(%) * 1,5 3,1 2,2 4,8 1,6 0,5 0,4 VCL (µm/s) i 16,5 20,3 15,6 25,3 16,5 1,4 0,1 VSL (µm/s) i 7,7ab 10,1ab 5,4b 11,2a 6,1ab 0,4 0,0 VAP (µm/s) i 11,0ab 13,7ab 7,8b 16,5a 8,8b 0,7 0,0 LIN (%) i 26,9 29,7 21,0 25,6 22,1 1,3 0,1 STR (%) * 41,6 44,4 41,5 39,9 41,1 4,9 1,0 WOB (%) * 38,4 40,1 30,0 38,0 32,0 4,3 0,2 ALH (µm) * 1,5 1,4 1,7 1,5 1,6 0,2 0,3 BCF (Hz) * 4,9 5,5 6,5 4,9 5,8 0,7 0,1 Hiperativos (%)* 0,8 1,3 1,1 2,0 1,1 0,2 0,7 D1) BotuSêmen® (BS) (controle); D2) BS + 30 ngmL-1 de DHA (30DHA); D3) 30DHA + 40 µM de Trolox® (30DHA40T); D4) BS + 50 ngmL-1 de DHA (50DHA); D5) 50DHA + 40 µM de Trolox® (50DHA40T). Parâmetros avaliados pelo SCA®: Motilidade Total depois do TTR (MT); Motilidade Progressiva depois do TTR (MP); Velocidade Curvilinear (VCL); Velocidade Linear Progressiva (VSL), Velocidade Média do Trajeto (VAP); Linearidade (LIN); Retilinearidade (STR); Índex de Oscilação (WOB); Amplitude do Deslocamento Lateral da Cabeça (ALH), Hiperativos; Frequência do Batimento Flagelar Cruzado (BCF). abAs letras sobrescritas indicam diferenças dentro da linha (P <0,05). iTeste de Tukey. *Teste de Friedman.
CONCLUSÃO A inclusão de DHA e Trolox® não maximizou o efeito do diluidor controle no processo
de refrigeração de sêmen de garanhões Mangalarga Marchador. O uso do Trolox® em
diluidor de refrigeração de sêmen contendo DHA nas doses estudadas não é indicado
por alterar negativamente parâmetros de movimento espermático importantes para a
fertilidade.
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98
7. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os diluidores testados nesta pesquisa não maximizaram o potencial
crioprotetor dos diluidores rotineiramente utilizados nos processos de
refrigeração (BotuSêmen®) e congelação (BotuCrio®) de sêmen equino no
Brasil.
Buscamos adicionar substâncias como o DHA e Trolox® na tentativa de
desenvolver um diluidor com melhores resultados na congelação e refrigeração
de sêmen de garanhões Mangalarga Marchadores, pois somos cientes da
sensibilidade dessa raça aos processos de criopreservação. Foi possível
perceber que o uso do Trolox® nas concentrações propostas como alternativa
antioxidante não se mostrou favorável em diluidores contendo DHA,
principalmente na preservação de determinadas características de movimento
espermático associadas á fertilização quando o sêmen foi congelado com
protocolo de refrigeração e congelação usando curvas muito rápidas. Além
disso, possuir motilidade progressiva, retilínea e rápida é um dos primeiros
requisitos para uma amostra de sêmen ser considerada apropriada para uso na
inseminação artificial. O uso de Trolox® associado ao DHA comprometeu esses
parâmetros de qualidade espermática em sistemas de criopreservação menos
controlados. Por isso, nas condições estudadas não indicamos o uso desta
associação.
No entanto, foi possível perceber que os diluidores contendo apenas
DHA nas concentrações de 30 e 50 ngmL-1 preservaram parâmetros cinéticos
espermáticos de forma semelhante aos diluidores controle. Isso é indicativo
que o DHA é uma substância que atua na célula, principalmente garantindo
velocidade. Assim, o DHA se mostra uma substância favorável para ser
adicionada a diluidores de sêmen de garanhões. Entretanto, nossos resultados
indicam que serão necessários maiores estudos sobre o papel de outras
concentrações de DHA isolado ou associado a outros antioxidantes na
criopreservação de sêmen equino, bem como a sua utilização em garanhões
que apresentem baixa qualidade seminal, considerados “bad-coolers” e “bad-
freezers”.
99
Também devemos salientar que os níveis de lipoperoxidação se
mantiveram semelhantes nos diluidores contendo DHA, quando isolado ou
associado ao Trolox® (dados não apresentados na tese). Uma das indicações
do uso do antioxidante em diluidores contendo DHA seria para minimizar a
lipoperoxidação pelo aumento de PUFAs. Isso não foi evidenciado nas
concentrações de DHA estudadas. Contudo, é interessante pesquisar outros
antioxidantes, bem como concentrações diversas desses capazes de
potencializar o efeito do DHA na célula.
100
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117
ANEXOS
ANEXO 1 – CERTIFICADO DA CEUA
118
ANEXO 2 – ANÁLISE DE VARIÂNCIA DOS DADOS EXPERIMENT AIS
EXPERIMENTO 1
TTR 5 MINUTOS
Motilidade Total
Motilidade Progressiva
Rápidos
Médios
Lentos
VCL
VSL
119
VAP
LIN
STR
WOB
ALH
BCF
Hiperativos
120
Íntegros (CFDA)
HO reativos
Cromatina Compactada
Cromatina descompactada
DAB I
DAB II
DAB III
121
DAB IV
TTR 60 MINUTOS
Motilidade total
VCL
VSL
VAP
ALH
122
TTR 120 MINUTOS
Motilidade total
VCL
VSL
VAP
ALH
TBARSE
TBARSC (Transformada pela função Box Cox)
123
EXPERIMENTO 2
Motilidade progressiva
Rápidos
Médios
Lentos
VCL
VSL
124
VAP
LIN
STR
WOB
ALH
BCF
Hiperativos
125
Íntegros
HO reativo
Cromatina compactada
Cromatina descompactada
DAB I
DAB II
126
DAB III
DAB IV
EXPERIMENTO 3
TTR 5 MINUTOS
Motilidade total antes da refrigeração
Motilidade progressiva antes da refrigeração
Vigor antes da refrigeração
Motilidade total após a refrigeração
127
Motilidade progressiva após a refrigeração
Rápidos
Médios
Lentos
VCL
128
VSL
VAP
LIN
STR
WOB
ALH
129
BCF
Hiperativos
Íntegros
HO reativos
EXPERIMENTO 3
TTR 120 MINUTOS
VCL
130
VSL
VAP
LIN
Análise de variância não paramétrica de Friedmam
131
ANEXO 3 – LINKS COM AS INSTRUÇÕES PARA SUBMISSÃO DO S
ARTIGOS
Artigo Científico I - Journal of Equine Veterinary Science
http://www.j-evs.com/content/authorinfo
Artigo Científico II – Animal Reproduction
http://cbra.org.br/br/publicacoes/animal-reproducti on/instrucoes-ar/
Artigo Científico III - Arquivo Brasileiro de Medic ina Veterinária e Zootecnia (Brazilian Journal of Veterinary and Animal Sciences)
http://www.scielo.br/revistas/abmvz/iinstruc.htm
