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BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 1 de 26
Contrôle du métabolisme
2. Régulation de voies métaboliques
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 2 de 26
Contrôle des voies métaboliques
Il y a deux sortes de contrôle métabolique :
1) Contrôle intrinsèque (ou interne) qui implique la régulation de l'activité
enzymatique par des concentrations des métabolites (allostérie)
• Ceci représente la forme de contrôle la plus souvent rencontrée chez les
procaryotes
Dans les organismes multicellulaires, le métabolisme doit répondre à des
besoins de l'organisme entier et donc un niveau de contrôle supplémentaire doit
être ajouté
2) Contrôle extrinsèque à travers des hormones et stimulation nerveuse
• Ces types de signaux agissent généralement par des seconds messagers
pour cibler les activités des enzymes
➢ cAMP, Ca2+, inositol 1,4,5-P, diacylglycerol
Contrôle du flux métabolique
Expérimentalement, il a été constaté que les vitesses de synthèse et
dégradation de chaque intermédiaire d'une voie métabolique (exemple : la
glycolyse) sont arrangées de façon à maintenir chaque intermédiaire à une
concentration constante. Le flux (taux), J, des intermédiaires est constant.
Dans un système ouvert comme un organisme vivant, selon Prigogine un
expert en système thermodynamique de non-équilibre, le flux constant représente
l'efficacité thermodynamique maximale.
Génération du flux
Les voies métaboliques consistent en une série d'étapes. Le flux de
métabolites étant constant à travers une série de réactions, il suffit de considérer le
flux dans une seule étape réactionnelle.
Le flux de métabolites J dans une seule réaction est la différence entre la
vitesse de la réaction en avant, vf et celle du retour vr, donc
J = vf - vr
À l'équilibre, il n'y a pas de flux, J = 0, même si vf et vr sont très larges.
Quand la réaction est très loin de l'équilibre, vf - vr > 0, le flux dépend
essentiellement de la réaction direction avant et J vf.
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 3 de 26
Le flux à travers une voie à l’état stationnaire est constant et il est déterminé
par l'étape ou les étapes les plus lentes ou vitesse limitante. Par conséquent, le
contrôle du flux dans une voie métabolique exige que
1) l'étape contrôlant le flux réponde au besoin métabolique de l'organisme.
2) les changements en flux, répondant au besoin métabolique de l'organisme,
soient communiqués à travers la voie.
La vitesse des réactions enzymatiques varie avec le flux
Le schéma d’une réaction, A ⇌ B, qui est catalysée enzymatiquement et qui
répond à un changement de flux dans la réaction, S A, qui la précède est :
• Le flux, J, à travers la réaction A ⇌ B doit être identique à celle de
l'étape limitante précédente et est égal à vf - vr.
Si le flux de l'étape limitante augmente par J, l'augmentation doit être
communiquée à l'étape suivante par une augmentation en vf (vf) afin de rétablir
l'état stationnaire, donc J = vf .
La réponse du système au changement fractionnel en flux est obtenue
ensuite par manipulation algébrique en divisant l’équation précédente par J
et en la multipliant par vf/vf ; donc
• Ce résultat décrit de façon explicite la relation entre le changement
fractionnel de flux, J / J, à travers l’étape limitante, et vf /vf, le
changement fractionnel de la vitesse de la réaction suivante
rf
f
f
ff
f
f
vv
v
v
v
J
v
v
v
J
J
S P A ⇌ B vf
vr
J J
vitesse limitante
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 4 de 26
Dans les conditions physiologiques, on a souvent [A] < KM, donc l’équation
Michaelis-Menten devient :
A
A donc , et
f
f
M
f
MAXf
M
f
MAXf
v
v
K
AVv
K
AVv
Dans ce cas le changement fractionnel en vitesse est égal au changement
fractionnel en concentration de substrat
Le lien entre le changement fractionnel en flux et le changement fractionnel en
concentration de substrat qui est nécessaire à communiquer ce changement en flux
est donc :
rf
f
vv
v
A
A
J
J
La quantité, vf / (vf - vr), représente la sensibilité du changement fractionnel
en flux par rapport au changement fractionnel en concentration de substrat. Elle
indique la réversibilité de la réaction et détermine si la réaction est proche du point
d'équilibre.
Dans une réaction irréversible, vr 0 donc vf / (vf - vr) 1. La réaction
répond donc de façon presque directe à un changement fractionnel en flux
par un changement fractionnel en substrat.
Au fur et à mesure que la réaction approche l’équilibre, vf s’approche de vr et
vf / (vf - vr) ∞. La réaction répond donc à un changement fractionnel en
flux par un changement fractionnel en concentration plus petite vu le grand
facteur de sensibilité.
Par conséquent, la capacité d’une réaction à communiquer le changement en
flux augmente au fur et à mesure que la réaction atteint l’équilibre.
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 5 de 26
Étape limitante du contrôle du flux métabolique
Le flux métabolique à travers une voie est dépendant des vitesses des étapes
les plus lentes. Les produits de l'étape limitante, par définition, sont enlevés avant
que la réaction puisse produire un équilibre. Cette réaction est donc loin de
l'équilibre et possède une enthalpie libre très négative.
Dans le régime d’une réaction loin de son équilibre (vf >> vr), le changement
fractionnel du flux, J/J, n'est pas très sensible au changement fractionnel en
changement de concentration, [A]/[A].
On a constaté expérimentalement dans certaines voies que le flux varie par
des facteurs atteignant plus de 100 tandis que les variations en [substrat] sont
moins importantes.
Près de l’équilibre, il existe la possibilité que des changements en [substrat]
puissent communiquer des changements importants en flux à d'autres étapes
réactionnelles dans la voie. Mais puisque les étapes limitantes sont loin de
l'équilibre, il doit exister d'autres mécanismes qui gèrent le flux de l'étape
limitante
➢ En effet, la variation seule en substrat liée à une étape limitante
n’explique pas les faits expérimentaux.
Le flux à travers une étape réactionnelle limitante d'une voie peut être
affecté par plusieurs mécanismes :
1) le contrôle allostérique
2) la modification covalente - interconversion des enzymes
3) les cycles de substrat
4) le contrôle génétique
Les mécanismes 1-3 répondent rapidement à des stimuli externes (secondes à
minutes).
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 6 de 26
Détection des mécanismes contrôlants
1) Identification de l’étape limitante d'une voie.
• Il s’agit de la comparaison entre les G′s, mais pas les G0′s, des
réactions afin de déterminer lesquelles influencent l'équilibre; l'équilibre
est atteint si G′ ≈ 0. Il faut mesurer in vivo les concentrations des
réactants de l’enzyme pour cette fin.
• Mesure expérimentale de l'effet d'un inhibiteur de la réaction spécifique
sur le flux de la voie.
➢ Le plus similaire le changement fractionnel de l'activité de l'enzyme
inhibée et le changement fractionnel du flux indiquent que l'enzyme
en question est contrôlante.
2) Détermination in vitro des effecteurs allostériques d'une enzyme catalysant
une réaction limitante.
3) Validation expérimentale in vivo de la concentration des régulateurs
possibles d’une enzyme afin de déterminer si les changements en
concentration sont cohérents avec le mécanisme de contrôle proposé.
Amplification du signal et son contrôle
Une facette importante des voies métaboliques est l’amplification du signal
et le contrôle de ceci. Le signal initial peut être un changement en concentration de
substrat ou d'autres ligands.
Il y a deux sortes de mécanisme d'amplification du signal :
i) Cycles de substrats (aussi connu sous le nom de cycles futiles)
Considérons les réactions suivantes catalysées par les enzymes Ei:
Si les enzymes, E2 et E-2, sont actifs en même temps, le résultat est un cycle
futile apparent.
A B C D ⇌ ⇌ E1
E2
E-2
E3
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 7 de 26
Exemple - le cycle futile entre D-fructose-6-P et D-fructose 1,6-P
La réaction est catalysée par 6-phosphofructokinase (PFK-1) et la réaction
par fructose-bisphosphatase (FBPase-1 ≡ F16Pase).
Si les deux enzymes sont actifs en même temps, il y a une hydrolyse de
l'ATP.
• L'importance de ce cycle est que les deux réactions peuvent être
contrôlées séparément et donc, le flux à travers cette étape est :
J = vnet = vréaction 1 - vréaction 2
Ce type de contrôle dans une voie métabolique la rend plus sensible et plus
précise.
Afin de montrer ceci, il faut noter que les réactions 1 et 2 sont fortement
influencées par [AMP].
Une augmentation de 4 X en [AMP] change l'activité maximale de PFK (vf)
de 10% à 90% et en même temps décroît l'activité de F16Pase (vr) de 90% à
10%.
D-fructose-6-P ⇌ ⇌
D-glucose-6-P D-fructose 1,6-P triose-P
Mg2+
ATP ADP
Pi H2O
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 8 de 26
Puisque l'activité totale de PFK est dix fois plus grande que celle de F16Pase
in vivo, si l’activité totale de PFK est 100 unités arbitraires, l’activité
maximale de F16Pase est donc 10 unités.
Par contre, à faibles [AMP], les activités de PFK sont à 10% maximales
tandis que celles de F16Pase sont à 90% maximales.
➢ Le flux aux [AMP] faibles est donc :
Jfaible = vf (faible) - vr (faible) = 10 - 9 = 1.
➢ Aux [AMP] hautes, le flux devient :
Jhaute = vf (haute) - vr (haute) = 90 - 1 = 89.
Le cycle de substrat peut donc amplifier l’effet de [AMP] sur la vitesse nette de
la phosphorylation de F6P.
Sans le cycle de substrat, l’augmentation de quatre fois en [AMP] augmente
le flux net d'un facteur 9.
Avec le cycle de substrat, la même augmentation en [AMP] provoque un
changement de Jhaute/Jfaible = 89 / 1 ≈ 90 en flux net.
Il faut noter que si un cycle de substrat possède une fonction régulatrice, ceci
n’a pas comme but d’augmenter le flux maximal dans une voie, mais plutôt de
minimiser le flux d’une voie.
Le cycle de substrat est le prix que les cellules de muscle doivent payer
pour être capables de changer de façon rapide, passant d'un état de repos où
le recyclage est maximal à un état d'activité maximale où le recyclage est
nettement moindre.
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Le diabète et les cycles de substrats
Le diabète est l’une des maladies les plus répandues dans le monde entier, et
l'incidence de cette maladie continue à se développer. Le diabète noninsuline-
dépendant, ou le type 2, représente 90% de tous les diabétiques et est estimé pour
affecter environ 6% de la population des Etats-Unis. Les caractéristiques de la
maladie incluent l’hyperglycémie de jeûne et les niveaux exagérés de glucose. Les
complications du diabète type 2 incluent la rétinopathie, la néphropathie, la
neuropathie, et la maladie cardiaque coronarienne et sont censées être déclenchées
par la glycation excessive de protéine (modification protéique par réaction avec de
glucose), qui résulte en des niveaux excessifs du glucose en circulation.
Des études cliniques ont été effectuées pour définir le défaut primaire qui
cause les niveaux de jeûne élevés de glucose sanguin observés dans les diabétiques
de type 2. Les résultats ont suggéré que le rendement hépatique excessif de glucose
soit une cause principale. Le rendement hépatique de glucose dérive de la
dégradation du glycogène hépatique (glycogénolyse) et de la synthèse du glucose
des fragments 3-carbones tels que le pyruvate (gluconéogenèse). Le flux
gluconéogénique s'est avéré excessif dans les diabétiques de type 2.
La gluconéogenèse est une voie fortement réglée et bien comprise. La
fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase-1) est une enzyme exprimée principalement
dans le foie et le rein et est l'une des enzymes limitantes du flux gluconéogénique
hépatique.
Dans le diabète, le manque (type 1) ou la résistance (type 2) à l'insuline
modifie le patron d'expression génique dans le foie, tel que chacun des trois
enzymes contrôlant la gluconéogenèse (PEPCK, FBPase-1, et G6Pase)
est « upregulated ». Le diabétique surexprime ces enzymes gluconéogéniques, tout
en « downregulating » l'expression des gènes glycolytiques des enzymes opposés
(voir la figure de la voie Embden-Meyerhof-Parnas du métabolisme intermédiaire
hépatique sur la page suivante). Par conséquent, les cycles de substrats sont
rétablis pour augmenter la production nette de glucose (gluconéogenèse) aux
dépens de l'utilisation de glucose (glycolyse) ou du stockage (glycogenèse).
L'activité F16BPase du foie a été montrée pour être élevée dans les modèles
animaux insuline-déficients et insuline-résistants du diabète, accentuant
l'importance de cet enzyme dans la régulation du glucose sanguin et faisant de lui
une cible pour l'inhibition par une drogue.
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 10 de 26
Voie du métabolisme intermédiaire hépatique
Les cycles de substrats
Glucose
Glucose 6-P
Glu-6-Pase GK
PFK-1 FBPase-1
Fructose 1, 6-P2
PK
Lactate, alanine
Pyruvate
PEP
OAA
PEPCK
Fructose 6-P
Les niveaux d’expression des enzymes contrôlant la gluconéogenèse et les
enzymes opposés dans les cycles de substrat sont modifiés chez le diabétique.
Les flèches bleues montrent l’augmentation en [enzymes], les rouges une
diminution en [enzymes]. Il y a une production excessive de glucose hépatique.
Abréviations :
GK, glucokinase ; OAA, oxaloacétate ;
PEP, phosphoénol-pyruvate ; PEPCK, PEP carboxykinase ;
PFK-1, phosphofructokinase ; Pi, phosphate inorganique ;
PK, pyruvate kinase
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 11 de 26
ii) Cycle interconvertible
Il s’agit d’un contrôle de l'activité enzymatique par une modification covalente
qui est réversible.
Un cycle interconvertible peut donner lieu à une grande amplification du
signal initial à condition que les activités des enzymes qui catalysent les
modifications soient rigoureusement contrôlées.
• Le meilleur exemple est celui de phosphorylase où il s'agit de la
conversion de la forme inactive b à la forme active a.
• Les séquences d'événements qui donnent lieu à la modification phos b en
a peuvent être retracées jusqu'à la surface des cellules.
Ces événements peuvent être renversés par des activités des phosphatases
qui elles-mêmes sont sujettes à des régulations.
Amplification d'un signal métabolique, cycle interconvertible
La glycogène synthase et la glycogène phosphorylase sont interconverties de
façon enzymatique entre deux formes cinétiques et allostériques différentes par une
série de réactions connues sous le nom de cascades cycliques.
L'interconversion entre les formes enzymatiques moins actives et plus
actives implique des réactions distinctes en modification covalente de ces enzymes
et qui elles-mêmes sont catalysées de façon enzymatique.
Mécanisme d’activation par phosphorylation
Liaison
hormonale
Activation de
l’adenylate cyclase
[cAMP] ↑
Dégradation
de glycogène
Activation de la
cAMP-dependante
protéine kinase
Conversion de la
phosphorylase b en
phosphorylase a
Activation de la
phosphorylase
kinase
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 12 de 26
Exemple : Contrôle de la
glycogenèse en muscle
par modification
réversible
R2C2
cAMP-dependante
protéine kinase
(inactif)
2C
cAMP-dependante
protéine kinase
(actif)
⇌ cAMP
+ R2(cAMP)4
ATP ADP
Pi H2O
ATP ADP
Pi H2O
ATP ADP
Pi H2O
ATP ADP
Pi H2O
(αβγδ)4
phosphorylase
kinase b
(αβγδ)4
phosphorylase
kinase a
Autres
kinases
Glycogène
phosphorylase
b
Glycogène
synthase a
Phosphoprotéine
phosphatase 1
(inactif)
Phosphoprotéine
phosphatase
inhibiteur-1 b
Système de phosphorylation
Système de déphosphorylation
Ca2+
Glycogène
phosphorylase
a
Glycogène
synthase b
Phosphoprotéine
phosphatase
inhibiteur-1 a
Phosphoprotéine
phosphatase
inhibiteur-1 a
P P
P P
P
P
Phosphoprotéine
phosphatase-1
(actif)
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 13 de 26
Puique les enzymes responsables des modifications et des démodifications sont
elles-mêmes modifiées de façon catalytique par d'autres enzymes, ceci mène aux
avantages suivants :
1) Réponse à un grand nombre de stimuli allostériques différents
2) Plus de souplesse en ce qui concerne le contrôle
3) Potentiel énorme en amplification dans leurs réponses à des variations en
[effecteur]
(a) F et R sont les enzymes de modification et de démodification respectivement. Elles sont
transformées de façon allostérique de leurs conformations inactives à leurs conformations
actives par la liaison de leurs effecteurs respectifs, e1 et e2. L’enzyme cible, E, est plus actif
dans la forme modifiée, Ea, que dans la forme non-modifiée, Eb. (b) Les réactions décrivant
l’interconversion entre les formes actives et inactives de l’enzyme cible, E.
Exemple d’une amplification par une cascade enzymatique monocyclique
a)
b)
Moins actif
Plus actif
Moins actif
Plus actif
Moins actif
Plus actif
ATP + + + ADP
+ + +
kf
K1
ATP ADP
H2O
OH
Eb
e1 F ⇌ F • e1
K2
e2 R ⇌ R • e2
Pi
F • e1
OH
Eb ⇌
OH
Eb• ATP • F • e1 F • e1 Ea
P
+
R • e2 Ea
P Kr
⇌ Ea • R • e2
P kr
R • e2
OH
Eb Pi
Ea
P
Kf
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 14 de 26
Cette amplification découle du fait que les enzymes qui modifient et
démodifient les enzymes cibles sont elles-mêmes sujettes à des contrôles
allostériques et qu’un petit changement en concentration d’un effecteur allostérique
de l'enzyme de modification va provoquer un changement important dans la
concentration de l’état modifié et va activer l'enzyme cible.
Le mécanisme d’amplification le plus simple implique une cascade
enzymatique monocyclique montrée par la figure de la page précédente.
La cascade sert à amplifier un changement relativement petit en [e1],
l'effecteur allostérique de l'enzyme de modification F, dans un plus grand
changement en [Ea] / [E]T, la fraction de l'enzyme E sous forme active.
• La réaction de déphosphorylation dans la cascade permet d’amplifier la
sensibilité d'un système à l’effecteur allostérique.
Le traitement mathématique d'une cascade monocyclique est, de façon
générale, assez compliqué et il est résumé par :
Cette relation en (a) possède la même forme que l'équation Michealis-
Menten en (b) qui décrit l'effet de [substrat] sur la vitesse, vo / [E]T d’une réaction
enzymatique.
(a) Relation entre la fraction de l’enzyme totale, ET, en état plus actif,
[Ea], et la concentration de l’effecteur e1, [e1]. Les symboles sont définis par
rapport à la cascade monocyclique décrite précédemment. (b) Relation
Michaelis-Menten de l’enzyme, E, en présence de son substrat, S. Les
symboles sont définis par rapport une réaction unimoléculaire.
(b)
11
f
Tf
22r
2Tr
22r
2Tr
1
f
Tf
22r
2Tr
f
Tf
T
a
eK
K
Fk
eKK
eRk
eKK
eRk
e
K
Fk
eKK
eRk
K
Fk
E
E
][][
][
][][
][(a)
][
][
][
20
SK
Sk
E
v
MT
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 15 de 26
Le KM apparent qui est défini par l’équation représente par analogie, le KM, dans la
réaction enzymatique qui correspond à la concentration du substrat où la vitesse est
de la moitié maximale, et donc ici représente la [e1] exigée pour que la moitié d’E
soit dans la forme active
Cette équation démontre que la conversion de l’enzyme, E, en état moitié
plus actif dépend d’une série de constantes incluant K1 qui est la constante
de dissociation de l’effecteur, e1, avec l’enzyme F.
• La concentration de e1 afin de convertir la moitié F en forme active est K1
puisque [e1] = K1 lorsque [F·e1] = [F]
L'amplification de l'effet allostérique d'un effecteur e1 correspond à une
situation où un petit effet sur l'enzyme F provoque un plus grand effet sur l'enzyme
E.
Donc ça prend moins de e1 pour convertir E dans sa forme active par rapport
à la conversion de F en sa forme active
Si on définit facteur d'amplification A par le ratio entre K1 (concentration de e1
pour convertir 50% FT en forme plus active) et Kmapp (la concentration apparente de
e1 pour convertir 50% ET en forme active), on obtient la relation suivante :
2
221 1eRkK
eKKFk
K
KA
Trf
rTf
app
M
En substituant les constantes de vitesse et d’équilibre ainsi que les
concentrations pour les valeurs suivantes – arbitraires, mais réalistes : kf =
2kr, Kr = 2Kf, [F]T = 2 [R]T et K2 = 2e2 on a :
25
][
][241
22][221
2
2
2
22
eKRk
eKRk
eRkK
eeKRkA
fTr
fTr
Trf
fTr
• Avec ce choix de paramètres, il y a une amplification de 25 fois de l'effet
de e1 sur E par l’intermédiaire de F; l’amplification sera encore plus
grande s'il y a plus de différence entre les paramètres d'avant et de retour.
1
22
2
22
2
][][
][
K
K
Fk
eKK
eRk
eKK
eRk
K
f
Tf
r
Tr
r
Tr
app
M
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 16 de 26
Il faut noter que s'il s'agit d'une cascade bicyclique, l'amplification sera
encore plus importante.
Les activités de la glycogène synthase et celle de la glycogène
phosphorylase sont toutes deux contrôlées par des cascades bicycliques.
F1 et F2 sont les enzymes de modification tandis que R1 et R2 les enzymes de
démodification. F1, R1 et R2 sont transformés de façon allostérique de leurs
conformations inactives à leurs conformations actives par la liaison de leurs
effecteurs respectifs, e1, e2 et e3. L’enzyme cible, E, est plus actif dans la forme
modifiée, Ea, que dans la forme non-modifié, Eb.
Exemple d’une amplification par une cascade enzymatique bicyclique
ATP
ATP
ADP
H2O
ADP
e1 F1 ⇌ F1 • e1
e2 R1 ⇌ R1 • e2
Pi
R2 ⇌ R2 • e3
H2O Pi
e3
F2a
P OH
F2b
OH
Eb
P
Ea
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 17 de 26
Exemple récapitulatif : La glycogenèse hépatique et musculaire
La signalisation physiologique est enclenchée par l’epinéphrine
• la voie de signalisation dépend du récepteur « GPCR » adrénergique β2
➢ la voie contient sept étapes distinctes de signalisation dont cinq sont
des étapes d’amplification
• par ce fait, à partir d’une molécule d’epinéphrine des centaines de
millions de molécules de glucose-6-P sont générées
- voir l’insertion bas-gauche de la figure
Le mécanisme d’amplification consiste en :
A. La liaison par
l’hormone au
récepteur
B. L’interaction
du récepteur
avec protéine
Gs, catalyse
d’échange de
GTP – GDP et
activation Gsα
C. La liaison de
GTP-Gsα active
l’adenylate
cyclase
D. [cAMP]
augmente et par
conséquent
activant la protéine kinase A (PKA)
E. La phosphorylation de phosphorylase kinase (PK) par PKA
F. Ca2+ stimule la PK complétant ainsi son activation
G. PK à son tour phosphoryle la phosphorylase b, produisant ainsi la
phosphorylase a
H. La phosphorylase a dégradé le glycogène en glucose-1-P, qui est converti en
Glucose-6-P
À noter que chaque réaction est réversible, cAMP est dégradé par PDE (Ca/CM
dépendante) tandis que la protéine phosphatase 1 (PP1) inactive la PK et la
phosphorylase a
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 18 de 26
Dans le cas de la stimulation expérimentale par l'hormone adrénaline, le
changement en [cAMP] est très faible.
Cependant, chaque molécule de protéine kinase A peut activer un grand
nombre de molécules de phosphorylase kinase et donc un très grand nombre
de molécules de phosphorylase va rapidement hydrolyser le glycogène.
• On estime que 50% de phosphorylase b est convertie en phos a avec une
augmentation de seulement 1% dans [cAMP] et ceci se fait 2 secondes
après l'addition de l'hormone.
Critères de contrôle des voies métaboliques
Il y a plusieurs critères qui aident à détecter de façon expérimentale les
enzymes susceptibles d’être des points de contrôle d’une voie métabolique :
I. L'activité de l'enzyme en question dans un lysat approprié.
Les conditions de l'essai doivent correspondre à celles retrouvées in vivo.
Principe : Contrôle par l'enzyme présent en faible activité totale tandis que les
enzymes présents en hautes activités totales sont probablement moins contrôlants.
• Exemple : l’hexokinase et la 6-phosphofructokinase ont des activités
«faibles» dans un lysat tandis que le triose phosphate isomérase possède
une «haute» activité.
II. Pour décider si une réaction est à l'équilibre in vivo, il faut mesurer les
concentrations intracellulaires des métabolites en question et comparer le
rapport de concentrations Γ par rapport à la constante d’équilibre, Keq.
Aux fins de comparaison, Keq doit être déterminée pour des conditions
présentes dans la cellule. Donc des conditions de pH et de force ionique
physiologique et la température correspondante in vivo
• Pour la réaction catalysée par la 6-phosphofructokinase
Mg2+
F6P + ATP ⇌ FBP + ADP
Le rapport des concentrations intracellulaires est :
Γ = [FBP][ADP] / [F6P][ATP]
= 20 µM x 1.3 mM / 90 μM x 11.5 mM = 0.025
➢ La constante d’équilibre par contre est ~ 1200 dans les conditions
physiologiques, ce qui suggère que la réaction soit très loin de
l'équilibre in vivo
BCM 2505 Enzymologie Contrôle métabolique page 19 de 26
Figure. Les variations en pourcentage
de 13 métabolites glycolytiques du
cerveau de souris pendant les 25
premières secondes après la
décapitation. L’âge des souris étaient de
10 jours et elles ont été anesthésiées par
phénobarbital. Les valeurs sont basé sur
les moyennes de huit souris à temps
zéro et de quatre souris à chaque
intervalle de temps suivant.
Ref : Lowry OH et al. Effect of
ischemia on known substrates and
cofactors of the glycolytic pathway in
brain. J Biol Chem.1964; 239:18-30.
• Par contraste, la réaction catalysée par l’adenylate kinase
Mg2+
ATP + AMP ⇌ 2 ADP
Γ = [ADP]2 / [ATP][AMP] = 1.32 / 11.5 x 0.17
Γ = 0.85 et la constante d'équilibre = 0.44 pour cette réaction.
➢ Donc la réaction est proche de l'équilibre.
La problématique dans cette approche, c’est la mesure précise des
concentrations intracellulaires.
L’approche expérimentale, actuellement, ne peut pas tenir compte des
variations en concentrations de métabolites entre les compartiments cellulaires
et ayant d’équilibres différents dans ces compartiments cellulaires.
III. Détermination des points de contrôle par perturbation de la voie métabolique
Dans ce cas, le système biologique est perturbé (inhibiteur, activateur, anoxie,
etc.) et les changements de concentration des métabolites sont mesurés.
Le théorème de «cross-over» (croisement) indique que suivant une perturbation
d'une voie métabolique, les variations en concentrations de métabolite, avant et
après une enzyme de contrôle, ont des signes différents.
• Par exemple dans le cas d'anoxie du cerveau de souris, il y a une réduction
en glucose-6-P et fructose-6-P et une augmentation dans les concentrations
de Fru-P2 et triose phosphates.
➢ Donc «cross-over» entre Fru-6-P et Fru-P2 démontrant que l'anoxie a
activé la PFK-1 puisque les concentrations de ses substrats sont réduites
et les concentrations de ses produits sont augmentées.
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IV. Par modelage mathématique, afin de reproduire une valeur expérimentale
Il s’agit de déterminer d’abord tous les paramètres cinétiques pour les
substrats, les produits et les inhibiteurs des enzymes dans une voie.
Ensuite les équations de vitesses décrivant la variation de la concentration de
chaque métabolite avec le temps dans une voie sont résolues de façon simultanée
afin de calculer les concentrations de tous les métabolites en fonction du temps.
Cette approche a été utilisée avec succès pour modeler les concentrations de
métabolites dans la voie glycolytiques chez les érythrocytes.
Avec les puissances des moyennes de calcul toujours croissantes, cette
approche est en train de se répandre pour traiter les voies métaboliques plus
compliquer et en interaction avec d’autres voies.
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Exemples de contrôle métabolique
Régulation de la glycolyse : Il y a deux points majeurs de contrôle
correspondant aux réactions catalysées par l’hexokinase et la 6-
phosphofructokinase.
Il y a également la possibilité que les réactions catalysées par la pyruvate
kinase et celle de l’aldolase ne sont pas à l'équilibre in vivo. Cependant, l’activité
de la pyruvate kinase est très élevée dans le muscle, laissant entrevoir son pouvoir
régulateur.
Cas de la régulation par l'activité de 6-phosphofructokinase (PFK-1)
Le comportement cinétique de l'enzyme est le suivant :
À des concentrations faibles de F6P, les hautes concentrations
physiologiques d'ATP sont inhibitrices – voir (a).
L'inhibition se fait à travers la liaison de l’ATP à un site distinct du site actif
impliquant une inhibition allostérique et en stabilisant l’état T.
Par contre, le F6P se lie à l’état R de préférence; donc la courbe de vitesse à
faible [ATP] est hyperbolique – voir (b).
Cette inhibition à haute [ATP] est augmentée par le citrate, mais
contrecarrée par AMP, ADP, Pi et F-1,6-P
• Ces derniers composés s’accumulent lors de la dégradation d'ATP.
v0
(a)
[ATP]
Haute [F6P]
Faible [F6P] + AMP
Faible [F6P]
Faible [ATP]
Haute [ATP] inhibitrice
[F6P]
v0
[ ] physiologique
(b)
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Hypothèse 1 Selon les données, l'interprétation la plus simple suggère que la
[ATP] contrôle l'activité de 6-phosphofructokinase et par conséquent le flux dans
la voie glycolytique.
➢ Donc lorsque [ATP] est élevée, l'enzyme est plutôt inhibée et la
production de l'ATP décroît.
Ceci prédit qu'il y a des changements importants de l'ATP in vivo afin
d'expliquer les changements de l'activité enzymatique.
• Cependant les mesures des [ATP] des muscles du vol d'une mouche
(«calliphore») n'ont démontré qu'une légère baisse en
concentration d’ATP (~10%) même si le flux de métabolites
augmente 100x.
➢ Conclusion : La variation en ATP n'est pas
suffisante pour expliquer l'augmentation importante dans le
flux métabolique.
Hypothèse 2 Il était suggéré que les effets de l'ATP puissent être contrecarrés
par les métabolites ADP et AMP.
Ces métabolites sont liés par la réaction catalysée par l’adenylate kinase, à
l'équilibre in vivo
Mg2+
ATP + AMP ⇌ 2 ADP
Puisque [ATP] > [ADP] et [AMP] in vivo, un petit changement en ATP
produit un grand changement en ADP et AMP
Les changements en AMP augmentent par 2.5x dans les muscles en vol chez
cette mouche
• La nouvelle suggestion est donc que l'activité PFK est contrôlée par une
combinaison des changements en ATP, AMP, ADP et autres métabolites
comme Pi
➢ Malheureusement le comportement cinétique de l'enzyme rend cette
suggestion peu probable
Hypothèse 3 Une autre interprétation des données a été basée sur la notion du
cycle des substrats.
Lorsque le muscle est en repos, la [AMP] est faible. Dans ces conditions, la
vitesse de transformation de F6P en FBP, catalysée par PFK, est basse et elle est
opposée à la conversion de FBP en F6P, catalysée par fructose-bisphosphatase
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➢ Résultat : un flux net faible à travers la voie.
Cependant quand le muscle doit travailler, [ATP] ↓ et [AMP] ↑, dans ce cas,
la PFK est activée et la fructose-bisphosphatase devient inhibée.
• Ceci permet un flux net important qui, à partir d'une augmentation de
[AMP] 2.5x, peut augmenter le flux 250x, selon les calculs en utilisant
les données physiologiques.
Révision Contrôle du flux glycolytique par la fructose-2,6-bisphosphate
À partir de 1980, il était devenu évident que la régulation par les nucléotides
adénines n'était pas suffisante pour expliquer le flux glycolytique lorsque la
compartimentalisation et l'état de protonation étaient pris en considération
La découverte du fructose-2,6-bisphosphate (F26P) comme régulateur de
l'activité de PFK-1 surtout dans le foie a attiré beaucoup l’attention.
• Le F26P active la PFK-1 à des niveaux de concentration de 0.1 μM
➢ L'activation est synergique avec AMP.
• Le F26P est aussi un inhibiteur puissant de FBPase-1 du foie et agit d'une
façon synergique avec AMP dans l'inhibition
La synthèse (à partir de F6P) et la dégradation du F26P (en F6P) sont
catalysées par une activité kinase et une activité phosphatase présente dans la
même enzyme et appelée PFK-2/FBPase-2.
Ces activités sont contrôlées par la phosphorylation réversible impliquant la
protéine kinase A et la protéine phosphatase 2A.
• En raison de ses actions antagoniques sur les enzymes PFK-1 et FBPase-
1, le F26P joue un rôle crucial dans le contrôle des voies hépatiques
opposées, soient la glycolyse et la gluconéogenèse.
• Voir la figure suivante résumant le rôle de F26P dans le foie
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Voie du métabolisme intermédiaire hépatique
Régulation des activités de PFK-2/FBPase-2
Abréviations :
Gly-3-P, glyceraldehyde-3-P ; OAA, oxaloacétate ;
PEP, phosphoénol-pyruvate ; PEPCK, PEP carboxykinase ;
Pi, phosphate inorganique ; PK, pyruvate kinase
PKA, protéine kinase A ; PP2A, protéine phosphatase 2A
La régulation des activités de la cible PFK-2/FBPase-2, de 6-phospho-fructo-1-
kinase (PFK-1) et de fructose-1,6-bisphosphatase (FBPase-1), aussi bien que la
régulation de PFK-2/FBPase-2 lui-même par l'intermédiaire des effecteurs et
de la modification covalente sont montrées.
Glucose
Glucose 6-P
Glu-6-Pase GK
PFK-1 FBPase-1
Fructose 1 6-P2
Fructose 2 6-P2
K K K K
B B B B
Fructose 6-P
PKF-2/FBPase-2
PKA Citrate Gly-3-P
PEP
Gly-3-P Pi
PP2A
+
+
-
PK
Lactate, alanine
Pyruvate
PEP
OAA
+
PEPCK
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Dans le foie, [F26P] mais pas celle d’ATP, d’AMP ou du citrate module la
production de glucose hépatique (≡ HGP) à travers un mécanisme de
phosphorylation réversible montré dans la figure ci basse.
C terminus
Protéine kinase A Protéine phosphatase 2A
HGP
[F-2,6-P2 ]
1B
K
La phosphorylation de Ser32 (indiqué par le cercle jaune) active la bisphosphatase
et inhibe la kinase. La déphosphorylation du même résidu produit les effets
opposés. Le rapport d’activité kinase/bisphosphatase (K/B) module le niveau
hépatique de fructose-2,6-bisphosphate (F26P) comme indiqué, qui à son tour gère
la production hépatique de glucose (HGP). Le glucagon stimule la protéine kinase
A cAMP dépendante, et le glucose stimule la protéine phosphatase 2A xylulose-5-
P dépendante.
N t
erm
inu
s
1B
K
HGP
[F-2,6-P2 ] P
P
K
K ≡ kinase B ≡ Bisphosphatase
K
K
K
B
B
B
B
Régulation des activités enzymatiques bifonctionnelles de la PFK-2/FBPase-2
par phosphorylation réversible
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La présence de F26P indique que le niveau de glucose est haut et que la
gluconéogenèse est arrêtée
La présence de glucagon provoquera une chute de [F26P] et par conséquent
favorise la gluconéogenèse
Son rôle de stimulateur puissant de la glycolyse est cohérent avec la
présence de la F26P dans tous les tissus dépendants de la glycolyse.
➢ Le système enzymatique bifonctionnel, PFK-2/FBPase-2, est trouvé
dans pratiquement chaque tissu ou cellule eucaryote étudiée.
• Diverses isoformes de cette enzyme sont exprimées de façon
différentielle dans des tissus.
Dans le cœur, la concentration de F26P devient élevée lors de
l’augmentation de la charge de travail, ou après stimulation avec de
l'adrénaline ou de l'insuline.
• Ces facteurs augmentent les niveaux de F26P en activant la kinase de
PFK-2/FBPase-2 à travers un mécanisme impliquant la phosphorylation
de trois résidus conservés (Ser466, Thr475, et Ser483) par des protéine
kinases spécifiques.
La position de PFK2/FBPase2 dans la voie glycolytique
lui confère un fort pouvoir de régulation