1

MOLEKULARNA BIOLOGIJA EUKARIOTA

UVOD

Prisustvo ili odsustvo nukleusa je osnova za fundamentalnu klasifikaciju ivih

organizama. One elije koje sadre nukleus nazivaju se eukariotima dok se one koje ga

nemaju nazivaju prokariotima. Termini bakterija i prokariot su termini koji se esto koriste

kao sinonimi. Veina prokariota ive kao jednoelijski organizmi iako neki formiraju lance ili

grupacije ili se ak organizuju u multicelularne strukture. Svi kompleksniji multicelularni

organizmi, ukljuujui biljke, ivotinje i gljive, su formirani od eukariotskih elija. Mnogi

jednoelijski organizmi od kvasaca do ameba, su takoe eukarioti. elije koje poseduju

nukleus, takoe, poseduju i druge, razliite organele koje se ne mogu nai kod prokariota.

U poslednjih desetak godina je poela veoma intenzivno da se razvija molekularna

biologija viih eukariota, i to zahvaljujui saznanjima molekularne biologije prokariota kao i

razvoju novih molekularno biolokih tehnika. Molekularni mehanizmi vitalnih procesa u ivoj

eliji kao to su npr. replikacija DNK, transkripcija, translacija, regulacija ekspresije gena,

reparacija DNK su u velikoj meri razjanjeni kod bakterija. Kao osnovni model sistem za

molekularno bioloka istraivanja u poslednjih 50 godina koriena je bakterija Escherichia

coli (E.coli). injenica da su bakterije haploidni organizmi te se svaka mutacija uvek i

eksprimira, da imaju manji genom od npr. genoma oveka, kao i injenica da ih je jako lako

kultivisati u laboratorijskim uslovima inila je da prvi model sistem u istraivanjima u ovoj

oblasti budu ba bakterije.

Otkrie restrikcionih enzima uinilo je moguim analiziranje DNK, kloniranje eljenog

gena u plazmid ili lambda fag i analizu istog gena ili njegovog produkta u raznim mutantima

E.coli. Saznanja dobijena u zadnjih par desetina godina omoguila su istraivanja u oblasti

molekularne biologije eukariota koja su mnogo kompleksnija. Takodje, otkrie novih tehnika

kao to su Lanana reakcija polimeraze (engl.Polymerase chain reaction-PCR), analiza

diferencijalne ekspresije gena ( engl.differential display), konstrukcija transgenih ivotinja i

biljaka omoguilo je ekstenzivna istraivanja u domenu molekularne biologije eukariota koja,

pre otkria ovih tehnika, nisu, fiziki bila mogua. Uglavnom su istraivanja u ovoj oblasti bila

ograniena na citogenetske i populaciono genetike studije. Tek od nedavno su otvorene

mogunosti veoma precizne analize molekularno biolokih procesa kod viih eukariota.

Najvie ekspimenata je uradjeno na kvascu kao model sistemu, jednoelijskom eukariotskom

organizmu, i ta saznanja su u mnogome pomogla u razvoju molekularne biologije viih

eukariota.

Nukleus je informativni deo elije

Nukleus je obavijen sa dve membrane i sadri DNK koju ine ekstremno dugi polimeri

nukleotida. Ovi gigantski molekuli udrueni sa proteinima u hromatin, mogu se videti

svetlosnim mikroskopom (kada postanu kompaktni pre elijske deobe), i tada su oznaeni

kao hromozomi. Veina elija svakog organizma sadri po 2 kopije svakog hromozoma, pri

emu je jedna kopija nasleena od majke a druga od oca. Ovakve elije se nazivaju

diploidnim elijama, dok jajne elije i elije spermatozoida imaju samo po jedan set

hromozoma i nazivaju se haploidnim elijama. U patolokim stanjima kao to je npr. Daunov

sindrom postoje tri kopije hromozoma 21 (trizomija hromozoma 21).

2

Broj hromozoma u diploidnim elijama eukariota se razlikuje od vrste do vrste (Tabela

1) i nije u korelaciji sa sloenou organizma.

Tabela 1. Broj hromozoma u diploidnim elijama eukariota:

Organizam broj hromozoma

ovek 46

pas 78

pacov 42

urka 82

aba 26

vinska muica 8

kraba 254

pasulj 14

krompir 48

kvasac 34

zelene alge 20

Diploidne elije oveka sadre 46 hromozoma razliite duine, a svaki sadri izmeu

48 i 240 miliona baznih parova DNK. DNK jednog organizma sadri informaciju za sve RNK i

proteine koji su neophodni za strukturu i funkciju elije.

Struktura eukariotskog hromozoma

Nukleus tipine elije oveka je dijametra 5-8 m i sadri DNK duine oko 2m, to bi

bio ekvivalent teniskoj lopti koja sadi 20 km ekstremno tankog konca. Ta 2m dugaka DNK

u nukleusu svake elije oveka spakovana je na veoma poseban nain ali opet tako da DNK

ostaje pristupana za sve enzime i druge proteine neophodne za transkripciju, replikaciju

DNK, reparaciju DNK i rekombinaciju. DNK molekuli su u nukleusu rasporeeni u

hromozome. Svaki hromozom je sainjen od jednog enormno velikog molekula DNK i

proteina koji savijaju i pakuju tanak konac DNK u mnogo kompaktniju strukturu. Kompleks

DNK i proteina naziva se hromatin. Mnogi proteini tesno vezani sa DNK ukljueni su u

pakovanje DNK, ali hromozomi takoe sadre i proteine koji su ukljueni u regulaciju genske

ekspresije, replikaciju DNK, reparaciju DNK i rekombinaciju DNK. Stanje kondenzovanosti

hromozoma varira u odnosu na elijski ciklus, to je posledica ekspresije razliitih gena tj.

potrebe elije za produktima (proteinima i RNK) razliitih gena u razliitim fazama elijskog

ciklusa. Veoma kondenzovani hromozomi u eliji koja se deli nazivaju se mitotskim

hromozomima, dok se hromozomi u relaksiranoj fazi nazivaju interfaznim hromozomima.

Nukleozomi su osnovna jedinica hromatinske strukture

Kompleks DNK i proteina u nukleusu naziva se hromatin. Hromatin postoji u razliitim

strukturama tokom razliitih faza elijskog ciklusa. U interfaznim nukleusima hromatin je u

relaksiranom stanju, to omoguava pristup molekulu DNK raznim enzimima i drugim

proteinima neophodnim za ekspresiju genau i replikaciju DNK. U interfazi se vri priprema

hromozoma za ulazak u mitozu pri emu se hromatin kondenzuje zadobijajui veoma

3

kompaktnu strukturu tako da se u zavrnoj fazi formiraju visoko kondenzovani mitotiki

hromozomi.

Prvi i osnovni nivo pakovanja hromatina, nukleozom, opisan je 1974 godine. Kada se

razbiju interfazni nukleusi, gde je hromatin u relaksiranom stanju, i kada se sadraj prouava

pod elektronskim mikroskopom vidi se da se veina hromatina nalazi u formi perlica

nanizanih na koncu. Konac ini DNK, a svaka perlica predstavlja nukleozom koji se sastoji

od kompleksa proteina 1,65 puta obmotanog molekulom DNK.

Struktura nukleozoma je odreena u eksperimentima u kojima je vrena digestija

hromatina mikrokokalnom nukleazom koja see dvolananu DNK. Nakon digestije

nukleazama, DNK izmedju perlica odnosno nukleozoma isezava na elektronskim

mikrografijama tj. biva degradirana tretmanom nukleazama. Individualni nukleozom ini

kompleks od 8 histonskih proteina (po dva molekula od svakog histona: H2A, H2B, H3, i H4)

kao i dvolanana DNK od 146 bp. Dvolanani heliks DNK je obavijen oko histonskog

oktamera. Formiranje nukleozoma predstavlja prvi nivo pakovanja ime se DNK prevodi u

hromatin, to smanjuje duinu DNK za jednu treinu inicijalne duine.

Histoni su mali proteini i sadre veliki procenat pozitivno naelektrisanih aminokiselina

(posebno lizina i arginina). Ovo pozitivno naelektrisanje omoguava histonima da se tesno

priljube uz negativno naelektrisanu DNK, nezavisno od same sekvence DNK. Histoni mogu

biti ekstrahovani iz hromatina pomou 0,5 M rastvora NaCl koji interferira sa elektrostatikim

interakcijama uspostavljenim izmeu histona i DNK. Nukleozomi su rasporedjeni du

molekula DNK na oko 200 nukleotidnih parova (146 nukleotidnih parova DNK je obmotano

oko histonskog oktamera i proseno oko 50 bp ini golu DNK izmedju susednih

nukleozoma). Histoni su prisutni u enormnim koliinama u elijama (oko 60 miliona molekula

svakog tipa po eliji), a njihova totalna masa u hromatinu je gotovo identina masi DNK.

Histoni koji ulaze u sastav nukleozoma predstavljaju najkonzervisanije, do sada poznate,

eukariotske proteine. Tako u sekvenci H4 histona graka i krave, vrsta koje su divergirale pre

1,2 milijardi godina, postoje samo razlike u dve aminokiseline. Nedavno su histoni

otkriveni kod arhea koje su filogenetski veoma udaljene od eukariota. Ova ekstremna

evolutivna konzerviranost odraava vitalnu ulogu histona u formiranju hromatina. Histon H1

pokazuje najveu varijabilnost izmeu vrsta.

Hromozom ima nekoliko nivoa DNK pakovanja

U ivim elijama hromatin se jako retko nalazi u relaksiranoj formi. Nukleozomi se

meusobno pakuju u mnogo kompaktniju strukturu koja na elektronskim mikrografijama ima

izgled vlakna debljine od oko 30 nm. Pakovanje nukleozoma u ovu kompaktniju strukturu

posredovano je petim tipom histona H1. Molekularni mehanizam daljeg pakovanja ove

strukture od 30 nm nije jo uvek sasvim poznat ali je verovatno da ova struktura prvo formira

petlje, koje daljim pakovanjem formiraju visoko kondenzovani mitotiki hromozom.

Kondenzovanje mitotikog hromozoma (tj. njegovo tesno pakovanje), ima za posledicu

zaustavljanje sinteze RNK, zato to DNK postaje nepristupana za RNK polimerazu i druge

proteine neophodne za transkripciju.

4

Modifikacije histona

Histoni podleu posttranslacionim kovalentnim modifikacijama koje ukljuuju

metilaciju, acetilaciju i fosforilaciju specifinih argininskih, histidinskih, lizinskih, treoninskih i

serinskih ostataka. Ove modifikacije, od kojih su mnoge reverzibilne, smanjuju pozitivno

naelektrisanje histona i na taj nain menjaju histon-DNK interakcije to je od ogromnog

znaaja u regulaciji ekspresije gena. Smanjenje pozitivne are histona smanjuje jainu

interakcije histoni-DNK te tako ini dostupnom DNK koja sada moe biti target za

transkripciju, replikaciju DNK, itd. Uprkos velikoj evolucionoj stabilnosti histona, njihov stepen

modifikacija je veoma razliit izmeu vrsta, tkiva i stadijuma elijskog ciklusa, to opet

potvruje ulogu ovih modifikacija u regulaciji aktivnosti gena.

Mnogi, ako ne svi eukarioti, imaju genetiki razliite podtipove histona H1, H2A, H2B i

H3 ija se sinteza pali ili gasi za vreme specifinih stadijuma embriogeneze kao i u toku

razvia posebnih elijskih tipova. Varijacija u aminkoiselinskoj sekvenci ovih podtipova je

zapravo jako mala za H2A, H2B i H3 dok je ekstenzivnija za H1. ta vie, eritriodne elije

embriona pileta sadre H1 varijantu koja se toliko razlikuje od adultnog H1 da je mnogi

nazivaju H5 histonom (ptiiji eritrociti za razliku od sisarskih sadre nukleus). Modifikacija

histona je najverovatnije u vezi sa elijskom diferencijacijom, ali priroda ove veze jo uvek

nije poznata.

Roditeljski nukleozomi, nakon DNK replikacije distribuiraju se izmedju erki elija

In vivo replikacija eukariotske DNK deava se istovremeno sa pakovanjem u

hromatin. Na osnovu brojnih eksperimentalnih dokaza utvreno je da roditeljski oktameri

ostaju tesno vezani sa DNK za vreme replikacionog procesa umesto da bivaju disocirani sa

roditeljske DNK. Prema tome, nukleozom se ili otvara da bi dozvolio prolaz replikacionoj

viljuci ili se roditeljski histonski oktameri na neki nain prebacuju na novosintetisani heliks

DNK odmah iza replikacione viljuke.

5

ORGANIZACIJA GENOMA EUKARIOTA

Vii organizmi su izgraeni od velikog broja razliitih tipova elija koje se razlikuju ne

samo po obliku, strukturi i funkciji, ve i po proteinima koje sintetiu. Svaka elija sadri

identinu DNK ali su razliiti geni eksprimirani u eliji jetre u odnosu na npr., neuron ili

miine elije zahvaljujui emu ove elije mogu obavljati svoje specifine funkcije.

Diferencijacija elija je posledica precizne vremenske i prostorne regulacije ekspresije gena.

Paradoks C-vrednosti (C-vrednost=koliina DNK u haploidnom genomu)

Bilo bi logino oekivati da je bioloka sloenost organizma posledica vee koliine

DNK. ta vie, veruje se da bioloka sloenost organizma mora reflektovati genetiku

sloenost. Meutim ono to je poznato kao paradoks C-vrednosti je injenica da mnogi

organizmi imaju neobino visoke C vrednosti to ne odgovara njihovoj morfolokoj

kompleksnosti. Tako npr. genomi nekih vrsta riba i gutera su 10 do 15 puta vei od sisarskih

genoma, a ne moe se rei da su ribe i guteri morfoloki kompleksniji od sisara. Koliina

DNK prisutna u sisarskoj eliji je samo 800 puta vea od koliine DNK u bakteriji E.coli. 98%

humanog genoma je nepoznate funkcije. Naime, samo 2% humanog genoma ine geni, a o

ulozi ostatka DNK se veoma malo zna. Uloga ove nekodirajue DNK izgleda da je veoma

znaajna s obzirom da se prenosi iz generacije u generaciju.

Ve je u poslednjih 20 godina poznato da transpozoni mogu da uveaju genom dajui

repetativne DNK sekvence a tek od nedavno je postalo jasno da transpozoni mogu uzeti

uea i u znaajnom gubitku DNK. Studije iz 1998 god. sugeriu da je kukuruz koristio

amplifikaciju retrotranspozona da bi duplirao veliinu genoma sa 1.2 milijarde do 2.4 milijarde

baznih parova to se odigralo pre milion do 3 miliona godina. Ove promene se mogu odigrati

veoma brzo na evolutivnoj skali.

ak i veoma srodni organizmi se razlikuju po stepenu transpozon-posredovanih

izmena genoma. Ovaj fenomen moe pomoi u razumevanju paradoksa C vrednosti. Biljke

npr. pokazuju varijacije od 1000 puta u veliini genoma poevi od 125 miliona baznih

parova Arabidopsisa do ekstravagantnog genoma ornamentalnog ljiljana (Fritillaria) koji

sadri 120 milijardi baznih parova, to je 40 puta vie u odnosu na genom oveka. Postoje

nagovetaji da uslovi sredine mogu uticati na aktivnost transpozona, to moe pomoi

organizmu da se adaptira na promene spoljne sredine.

Veliko je pitanje ta restrukturiranje genoma donosi kao prednost datom organizmu.

Mali genomi se bre mogu replicirati to rezultira u brem elijskom ciklusu i kraem

vremenu generacije. Istraivanja obavljena 2000. godine sugeriu, sa druge strane, da i

veliki genomi mogu imati svoju prednost. ulman sa saradnicima je sakupljao primerke

divljeg pretka kultivisanog jema iz razliitih mikroklima u jednom kanjonu planine Karmel u

Izraelu. Pratili su sadraj odreenog tipa transpozona (BARE-1) i nali da ima tri puta vie

ovih retrotranspozona u biljkama koje rastu na vrhu kanjona u poreenju sa onima koje rastu

blizu dna kanjona. Ovi podaci sugeriu da biljke koje ive na veim visinama gube

retrotranspozone sporije u poreenju sa biljkama koje ive nie. injenica da biljke na vrhu

kanjona zadravaju vie kopija retrotranspozona sugerie, po ulmanu, da ovi elementi daju

biljci neku selektivnu prednost. ulman i saradnici predpostavljaju da vei genomi, nastali

prisustvom veeg broja retrotranspozona, mogu pomoi biljci da preivi stresne uslove visine

6

i sue tako to e uticati na fizioloku maineriju koja omoguava biljkama da trae ili zadre

vodu.

Druga grupa naunika sa Stanford univerziteta dola je do slinih podataka pokazavi

da UV zraenje moe aktivirati odreene mutatorske transpozone u polenu kukuruza. Ovo

sugerira da sunevo svetlo (prisutnije na vrhu kanjona nego na dnu u gornjem sluaju) moe

takoe biti sredinski faktor ukljuen u restrukturiranje genoma.

Tipovi sekvenci u eukariotskom genomu:

Struktura genoma viih eukariota je izuzetno sloena i vie od 90% genoma ne kodira

proteine. Genom ine razliiti tipovi transpozona, pseudogeni, kompletne ili delimine kopije

viralnih genoma, familije slinih ali ne identinih gena, tandemski ponovljene nizovi identinih

gena, itd. Na osnovu strukture i funkcije sekvence eukariotskog genoma se mogu podeliti na

sledee kategorije:

1. Geni

a) Usamljeni geni (unikalne sekvence)

b) Tandemski ponovljeni nizovi gena

c) Familije gena

2. Ponovljene sekvence

a) umereno ponovljene sekvence - mobilni genetiki elementi

b) visokorepetativne i tandemski ponovljene sekvence

Usamljeni protein kodirajui geni

Usamljeni protein kodirajui geni se nalaze u po jednoj kopiji po haploidnom genomu.

Oko 40% protein kodirajuih gena spada u ovu kategoriju.

Tandemski ponovljeni nizovi gena

Ogroman zahtev elije za molekulima ribozomskih RNK (rRNK) i transportnih RNK

(tRNK) moe biti zadovoljen samo kroz ekspresiju viestrukih kopija istog gena. Histoni,

glavni proteini hromatina, su neophodni u velikim koliinama prilikom replikacije DNK, tako

da su njihovi geni, takoe, prisutni u velikom broju kopija, i predstavljaju jedini gene za

proteine organizovane na takav nain. Tandemski ponovljeni nizovi gena se razlikuju od

dupliciranih gena genskih familija zato to viestruke identine kopije gena kodiraju za

identine funkcionalne RNK ili proteine. Najee se ponovljeni nizovi gena ponavljaju po

principu glava-rep.

Organizacija gena za ribozomske RNK

Ribozomska RNK je glavni proizvod transkripcije i ini oko 80 do 90% ukupne mase

elijske RNK, kako kod prokariota tako i kod eukariota.

Genom E. coli, koji sadri sve gene u po samo jednoj kopiji, ima ak 7 kopija gena za

rRNK i tRNK, kako bi bilo mogue formiranje 15 000 ribozoma, koliko je neophodno za brzu

sintezu proteina. Tokom ranog embrionalnog razvia oveka, mnoge embrionalne elije se

dele svakih 24 sata i sadre 5 do 10 miliona ribozoma. Da bi se sintetisalo dovoljno molekula

7

rRNK za formiranje ovolikog broja ribozoma potrebno je najmanje 100 kopija gena za rRNK,

koje e imati najvii nivo ekspresije, tako da veliki broj RNK polimeraza mora transkribovati

svaku kopiju gena za rRNK u isto vreme. Zaista, svi eukarioti, ukljuujui i kvasca, sadre 100

i vie kopija gena za sve vrste molekula rRNK (18S, 28S, 5,8S i 5S).

18S, 5,8S i 28S rRNK su kodirane velikim brojem identinih gena koji se tandemski

ponavljaju na jednom ili nekoliko lokusa u genomu. Regioni DNK sa genima sa rRNK se

esto oznavaju i kao rDNK. Kvantitativna analiza radioaktivno obeleene rRNK koja

hibridizuje sa odgovarajuom nuklearnom DNK (rDNK) pokazuje da rRNK geni mogu biti

locirani na nekoliko hromozoma, a da broj kopija varira od 50 do 10 000 po haploidnom

genomu to se razlikuje izmeu vrsta. Kod niih eukariota broj tandemski ponvljenih nizova

gena iznosi od 100 do 200, dok je kod viih eukariota nekoliko stotina, a kod nekih biljnih

vrsta ak i preko 5 000. U genomu oveka postoji oko 300 kopija gena za rRNK koje

mapiraju na kratkih ruicama 5 akrocentrinih hromozoma (13, 14, 15, 21 i 22). Na svakom

akrocentrinom hromozomu se nalazi oko 60 kopija i izraunato je da oko 0,4% genoma

oveka zauzma rDNK.

Geni za 18S, 5.8S i 28S rRNK se karakteriu osobinama koje su zajednike za sve

eukariote (slika 1). Prvo, svaki lokus sa rRNK genima je organizovan u duge tandemske

nizove koji se puno puta ponavljaju i tako da se deo koje se tanskribuje (transkripciona

jedinica) naizmenino smenjuje sa regionima (graninicima) koji se ne transkribuju (eng.

nontranscribe spacers). Duina graninika koji se ne transkribuju iznosi oko 2 kb kod abe i

oko 30 kb kod oveka. Drugo, transkripciona jedinica je organizovana na isti nain:

posmatrano u 5'3' smeru rasporeeni su gen za 18S, gen za 5,8S i gen za 28S rRNK.

Tree, geni za pojedinane rRNK su meusobno razdvojeni graninicima koji se transkribuju

(eng. transcribe spacers). Ovakav segment ini transkripcionu jedinicu koja daje pre-rRNK

duine 7,9 kb kod abe i 13,7 kb kod oveka. Specifinom posttranskripcionom obradom

pre-rRNK nastaju zrele rRNK. Razlike u duini transkripcione jedinice rRNK gena izmeu

razliitih vrsta potiu od razlika u duini transkribovanih graninika. Ovi graninici se u

posttranskripcionoj obradi pre-rRNK uklanjaju i brzo degraduju i smatra se da su potrebi za

pravilan folding rRNK, a nisu vie potrebni nakon to je folding zavren. U tandemskim

nizovima gena za rRNK transkripciona jedinica je identina kao sve druge kopije, dok

graninici koji se ne transkribuju, a nalaze se izmeu regiona koji se transkribuju, se mogu

razlikovati. Graninici koje se ne transkribuju sastoje se iz kratkih ponovljenih jedinica iji broj

varira, tako da se duine individualnih graninikamogu razlikovati.

Region u nukleusu u kome se deava sinteza rRNK ima karakteristian izgled i

oznaen je kao nukleolus, u kome se razlikuju nukleolarni organizator i fibrilarno jezgro

okrueno granularnom korom. Odreeni hromozomski region koji asocira sa nuklolusom

predstavlja nukleolarni organizator. Svaki nuklolarni organizator odgovara grupi tandemski

ponovljenih gena za rRNK na jednom hromozomu. Fibrilarno jezgro ine rRNK koje se

sintetiu sa tandemski ponovljenih gena aktivnou RNK polimeraze I, dok granularni

korteks ine ribonukleoproteinske partikule nastale asocijacijom obraenih zrelih rRNK i

ribozomskih proteina sintetisanih u citoplazmi. Dakle koncentracija tandemski ponovljenih

gena za rRNK, zajedno sa veoma intenzivnom transkripcijom i obradom pre-rRNK, kao i

deliminim formiranjem ribozomskih subjedinica je odgovorna za formiranje karakteristine

morfologije nukleolusa koja se vidi svetlosnim i elektronskim mikroskopom je rezultat obrade

pre-rRNK i formiranja ribozomskih subjedinica.

8

Slika 1. Organizacija gena za rRNK.

Organizacija gena za 5S rRNK

5S rRNK se sintetie odvojeno od ostalih rRNK. Geni koji kodiraju 120 nukleotida

dugu 5S rRNK, takoe, su organizovani kao tandemski ponovljeni nizovi koji sadre nekoliko

stotina do nekoliko stotina hiljada tandemskih ponovaka na jednom ili vie hromozoma. Ovi

geni su potpuno odvojeni od tandemski ponovljenih gena za druge tipove rRNK. Kod

Xenopus laevis, organizma kod koga je 5S rRNK najbolje okarakterisana, ponovljeni blok

ine 5S rRNK gen, pseudogen (segment 101bp duine 5S rRNK koji se ne transkribuje) i

jedan netranskribovani deo varijabilne duine od oko 400 bp. Kod penice postoje dve

glavne varijante ponovljenih gena za 5S rRNK duine 410 i 500 bp, a slina heterogenost

postoji i kod lana gde dve glavne varijante iaju duinu od 340 i 360 bp. U okviru svake od njih

gen za 5S rRNK zauzima 118 bp. 5S rRNK geni se transkribuju van nukleolusa RNK

polimerazom III. Nakon transkripcije 5S rRNK se transportuje u nukleolus radi inkorporacije u

veliku ribozomsku subjedinicu.

Organizacija gena transportne RNK

Geni za tRNK se, takoe, nalaze u viestrukim ponovljenim nizovima (vie stotina

gena za svaku tRNK vrstu po haploidnom genomu) ali organizacija ovih, oko 60 tipova gena,

je uglavnom malo poznata. Transkribuje ih RNK polimeraza III.

Organizacija gena za male nuklearne RNK

Male nuklearne RNK (snRNK) predstavljaju bitne konstituente nukleusa viih

eukariota i, takoe, su kodirane viestrukim kopijama identinih gena. Obino su geni za

snRNK tandemski ponovljeni i sadre samo jedan tip gena za odreenu snRNK. Ovi geni su

okrueni relativno konzerviranim sekvencama DNK, graninicima, dugim od 800 bp do 45

Kb, to se razlikuje izmeu vrsta. Na primer, lokus RNU2 koji kodira U2 snRNK kodoveka je

9

organizovan kao skoro perfektan tandemski niz koji sadri 5 do 22 kopije jedinice koja se

ponavlja, a ija jeduina 5,8 kb.

Kod ljudi i ostalih sisara pseudogeni za snRNK se nalaze u 10 puta veem broju u

odnosu na funkcionalne gene. Na primer, postoji 30 funkcionalnih gena za U1 snRNK na

hromozomu 1 kod oveka i oko 500 do 1 000 pseudogena za U1 snRNK. Neki pseudogeni

se razlikuju od funkcionalnih gena za samo jedan nukleotid i imaju homologne graninike

dok, drugi poseduju samo deo sekvence U1 snRNK, a ostatak DNK nema nikakve

homologije sa funkcionalnim genima. Ovih 500 do 1 000 pseudogena nalazi se razbacano po

celom genomu. Nedavno je pokazano da je broj pseudogena za U6 snRNK ak i vei.

Organizacija histonskih gena

Histoni su primarne proteinske komponente hromatina. Iako je na poetku smatrano

da su uglavnom ukljueni u pakovanju DNK kod eukariota, danas je poznato da imaju vanu

ulogu u ekspresiji gena zahvaljujui njihovim postranslacionim modifikacijama (epigenetika

regulacija). elija ima potrebu za koordinisanom sintezom ogromne koliine svkog tipa

histona tokom relativno kratke S faze elijskog ciklusa (oko 108 molekula u elijama sisara),

kao i za brzim organizovanjem roditeljskih i novosintetisanih histona u cilju formiranja

hromatina. Ovo je mogue zahvaljujui postojanju ponovljenih setova histonskih gena. Kod

veine organizama histonski geni su jedini geni koji kodiraju proteine a nalaze se u velikom

broju identinih ili skoro identinih kopija. Histonski geni spadaju u retke eukariotske gene

koji ne sadre introne.

Visoka potreba za histonima H2A, H2B, H3, H4 i H1 tokom S faze postie se

koordinisanom ekspresijom viestrukih kopija histonskih gena prisutnih kod svih metazoa.

Kod sisara postoji oko 75 razliitih histonskih iRNK. Geni koji kodiraju ove transkripte su

grupisani zajedno u genomima svih ispitivanih eukariotskih vrsta, i ove grupe gena tipino

sadre viestruke kopije gena koji kodiraju pet razliitih histona.

Histonski geni su organizovani u ponovljene setove (kvintete) sainjene od 5 razliitih

histonskih gena razdvojenih segmentima koji se ne transkribuju. Raspored gena i smer

transkripcije u kvintetima je evolutivno veoma dugo ouvan. Netranskribovane sekvence

izmeu gena veoma mnogo variraju izmeu vrsta, ali i izmeu ponovljenih kvinteta istog

genoma.

Kod razliith vrsta eukariota postoje dva tipa grupisanih gena histona: tandemski

ponovljeni setovi gena, u kojma jedinica ponavljanja sadri jednu kopiju svakog od pet

histonskih gena (slika 2), i "zbrkani" (eng. jumbled) setovi gena, u kojima ne postoji identian

raspored pet histonskih gena i u kojima pojedinani geni za svaku vrstu histona nisu

identini. Na primer, genom abe sadri tandemski ponovljne setove gena za histone, dok

genomi dok ptice i sisari imaju "zbrkane" setove histonskih gena.

Slika 2. Organizacija histonskih gena kod D. melanogaster.

10

Ne postoji korelacija izmeu veliine genoma i ukupnog broja histonskih gena. Na

primer, ptice i sisari imaju 10 do 20 kopija seta od 5 histonskih gena, vinska muica ima oko

100 (duine oko 5 kb), a morski je nekoliko stotina kopija. Dakle broj setova histonskih gena

u genomu D. melanogaster je nekoliko puta vei od broja setova histonskih gena kod sisara,

a njen genom je oko 20 puta manji od genoma sisara. Ovo znai da D. melanogaster ima

mnogo vie histonskih gena nego to je potrebno za elijski ciklus somatskih elija, sa

njihovm relativno dugom S fazom. Meutim, ovoliki broj histonskih gena bi mogao biti

potreban za kraj oogeneze kako bi obezbedio dovoljan broj histonskih proteina za rano

embrionalno razvie. Alternativno, svaki pojedinani gen bi mogao biti eksprimiran na

relativno niskom nivou. U oba sluaja, tandemski ponovljena organizacija gena obezbeuje

da se sintetie jednaki broj svake histonske iRNK, to ujedno daje i jedno od najverovatnijih

objanjenjenja zato je ovakva genomska organizacija histonskih gena zadrana tokom

evolucije.

Jedan od moguih razloga zato se setovi histonskih gena fiziki odravaju zajedno

tokom evolucije jeste da omogue definisanje nuklearnih subdomena u kojim se deava

efikasna sinteza histonskih iRNK. Naime fizika povezanost ponovljenih setova histonskih

gena omoguava da se oni dovedu do Kajalovih tela (eng. Cajal body), odnosno nukearnih

domena koji su specifino obogaeni faktorima neophodnim za ekspresiju histonskih gena. U

elijama sisara i u oocitama abe Kajalova tela sadre U7 snRNP, koja je neophodna za

specifinu obradu 3'-kraja histonskih iRNK, koje su jedine eukariotske iRNK koje ne sadre

poli-A rep. Kajalova tela, slino nuklearnim pegama (eng. nuclear speckles) sadre faktore

splajsovanja, i/ili imaju ulogu kao zalihe faktora za obradu ili predstavljaju sama mesta

obrade. Kajalova tela kod kimenjaka su, takoe, mesta sazrevanja snRNA i asembliranja

snRNP. Nalaze se na nekoliko mesta u nukleusu, ukljuujui i mesto koje je u blizini

histonskih gena u elijama sisara i u oocitama aba. U nukleusima elija D. melanogaster

postoji samo jedno Kajalovo telo i odvojeno telo, oznaeno kao telo hsitonskog lokusa (eng.

histone locus body, HlB). Smatra se da u ovim elijama Kajalovo telo ima funkciju u

sazrevanju snRNK, dok je HlB asocirano sa setovima histonskih gena i obradom histonske

pre-iRNK. Oba tela se nalaze u blizini nukleolusa i esto su blizu jedno drugom, ali se ne

preklapaju.

Pored ponovljenih setova histonskih gena za histone H2A, H2B, H3, H4 i H1, postoje

i geni za nekoliko varijantnih histona koji se ekprimiraju tokom celog elijskog ciklusa i ije

iRNK imaju poli-A repove. Glavne varijante histona jezgra su H3.3 i H2A.Z, koji markiraju

aktivne gene i prisutni su kod svih vieelijskih organizama.

11

Familije gena

Intenzivna istraivanja u otkrivanju sekvenci gena i proteina pokazala su da su mnogi

proteini viih organizama kodirani homolognim, ali ne i identinim genima, koji su tokom

evolucije nastali duplikacijom. Grupa gena koja je nastala duplikacijom predakog gena i

daljim promenama u sekvenci naziva se familija gena. lanovi familije gena mogu biti

grupisani zajedno na jednom hromozomu, obino na udaljenosti od 5 do 50 kb, ili mogu biti

rasporeeni na razliitim hromozomima, a nekada su u okviru jedne familije gena prisutna

oba tipa organizacije. Najee, familije gena sadre od nekoliko do 30 lanova, a postoje i

primeri sa nekoliko stotina lanova.

Inicijalni dogaaj koji omoguava postojanje srodnih sekvnci u genomu je

duplikacija, koja podrazumeva stvaranje kopije neke sekvence u genomu. Tandemska

duplikacija, pri kojoj duplikati ostaju zajedno, moe nastati usled greaka tokom

rekombinacije ili replikacije. Razdvajanje duplikata se moe desiti translokacijom, koja

premeta deo DNK sa jednog hromozomana drugi. Duplikat na novom mestu moe nastati i

transpozicijom koja je asocirana sa kopiranjem regiona DNK koji se nalazi u blizini

transpozona. Duplikacijom moe biti obuhvaen celi gen, grupa egzona ili pojedinani

egzoni. U sluaju duplikacije celog gena nastaju dve kopije gena ije se aktivnosti ne

razlikuju, ali one, obino, divergiraju jer vremenom akumuliraju razliite promene u sekvenci

(mutacije). Geni koji su nastali duplikacijom i zauzimaju razliite pozicije u genomu poznati

su i pod nazivom paralogni geni.

Familije gena se znaajno razlikuju u stepenu slinosti sekvence DNK izmeu

lanova, od onih koje se sastoje od skoro identinih lanova, do onih u kojima je slinost u

sekvenci DNK ograniena samo na delove koji kodiraju neki proteinski domen ili

karakteristine aminokiselinske motive. Na osnovu stepena srodnosti lanova, razlikuju se

sledee vrste familija gena: klasine familije gena, koje kodiraju proteine skoro identine

sekvence, familije gena koje kodiraju proteine sa velikim visoko-konzervisanim domenima i

familije gena koje kodiraju proteine sa veoma kratkim konzervisanim aminokiselinskim

motivima. Neki lanovi familija gena su vremenom postali nefunkcionalni jer je usled brzog

akumuliranja mutacija dolo do znaajne divergancije sekvencene, tako da predstavljaju

pseudogene ili genske fragmente.

Proteini kodirani lanovima neke familije gena predstavljaju familije proteina. Ukoliko

su kodirani klasinim familijama gena obino imaju srodne ili ak identine osobine i funkcije,

a eksprimiraju se u razliitim fazama razvia ili u razliitim tipovima elija. Proteini kodirani

lanovima gena koji imaju srodne samo neke egzone, mogu imati i razliite funkcije.

Danas, 10 godina nakon sekvnciranja genoma oveka i intenzivnog razvoja genomike

i proteomike, poznato je da genom oveka ima oko 21 000 gena, a da je proteom svih

plancentalnih sisara, ukljuujui i oveka, veoma slian. Kod ovih vsta, oko dve treine gena

koji kodiraju proteine su ortolozi (homologni geni razliitih vrsta koji potiu od zajednikog

predakog gena i po definicji zadravaju istu funkciju tokom evolucije), a najvei broj ostatka

pripada genskim familijama koje podleu regularnim duplikacijma i divergancijama. Stvaranje

evoluciono potpuno novih proteina je veoma retko.

12

Klasine familije gena

lanovi klasinih familija gena odlikuju se visokim stepenom homologije skevence

celog gena ili samo egzona. Ovakve sekvence su evoluciono i funkcionalno veoma srodne.

Knjiki primer za klasinu familiju gena je drevna familija globinskih gena, iji

proteinski produkti u ivotinjskom carstvu obavljaju transport kiseonika kroz krv. Postoje dve

familije globinskih gena, familija gena za globine i familija gena za globine. Obe familije

sadre po nekoliko gena koji kodiraju proteinske komponente hemoglobina. Geni jedne

globinske familije se eksprimiraju odreenim redolsedom u razliitim fazama razvia, tako da

su u eritrocitima embriona i adultne jedinke prisutni razliiti tipovi hemoglobina (slika X).

Prvi hemoglobin koji se sintetie u embrionu oveka je Hb1 predstavljen tetramerom

globina 22 ( zeta, epsilon). Osam nedelja nakon zaea, embrionalni globini bivaju

zamenjeni i globinima, koji formiraju fetalni hemoglobin, HbF. Globin se postepeno

zamenjuje globinom nekoliko nedelja pre roenja deteta. Adultni hemoglobin oveka, HbA,

ini tetramer i globina, 22. U krvi odrasle individue normalno je prisutno 97% HbA, 2%

HbA2 (izgraenog iz tetramera 22, pri emu je varijanta globina ) i 1% HbF.

Embrionalni i fetalni hemoglobin imaju vei afinitet za kiseonik, u odnosu na adultni, to je

neophodno za dobijanje kiseonika iz majine krvi. Familije globinskih gena su primer za

razvojnu kontrolu ekspresije gena, u kojoj se razliiti geni sukcesivno ukljuuju i iskljuuju

kako bi dali alternativne proizvode koji obavljaju istu funkciju u razliito vreme.

Geni za globine organizovani su u dve familije, i , koje se nalaze na razliitim

hromozomima. U genomu oveka familija globinskih gena nalazi se na hromozomu 16, dok

se familija globinskih gena nalazi na hromozomu 11. Kod oveka i mnogih drugih sisara,

raspored gena u okviru jedne familije odgovara njihovom redosledu eksprimiranja u procesu

razvia (slika 3). Suprotno, kod mia adultni globinski geni se nalaze pre embrionalnih.

Slika 3. i familija globinskih gena i espresija globinskih gean tokom razvia. i globinski geni su organizovani u posebne klastere (grupe) koje ukljuuju funkcionalne gene i pseudogene.

globinski loklus se prostire na preko 50 Kb i sadri 5 funkcionalnih gena i jedan

pseudogen. Geni globinskog lokusa navedeni po redosledu su: embrionalni , dva fetalna G i A, i dva adultna i . Izmeu gena A i nalazi se pseudogen . Geni G i A su

duplicirani geni za globine koji se razlikuju po tome da li na poziciji 136 sade glicin ili

13

alanin, redom. Pseudogen je netranskribovana relikvija stare duplikacije gena , koji ima

75% homologije sa genom . Osim navedenih gena globinski blok sadri i osam kopija Alu

sekvenci kao i dve kopije sekvenci iz familije Kpn (6Kb dugake umereno ponovljene DNK;

naziv su dobile po tome to veina od 10 000 lanova ove familije kod primata sadri

sekvencu koju prepoznaje restrikcioni enzim KpnI).

Alfa globinski blok zauzima preko 28Kb i sadri tri funkcionalna gena i 4 pseudogena:

embrionalni gen, pseudogen , dva pseudogena (2 i 1), dve kopije (1 i 2)

gena koje se neznatno razlikuju u sekvenci, a koje kodiraju identine polipeptide, i najzad

gen , nepoznate funkcije. Ovaj blok, takoe, sadri i tri Alu sekvence. Dva ili vie identina

gena, kao to su 1 i 2, prisutna na istom ili razliitim hromozomima u genomu su oznaeni

kao nealelske kopije ili nealelski geni.

Sekvence koje kodiraju proteine predstavljaju

14

Za razliku od sisara, kod kvasca samo jedan jedini aktinski gen zadovoljava sve potrebe

jednoelijskog organizma za ovim proteinom.

Kod sisara, ostali dobro izueni proteini kodirani familijama gena su albumin i

-fetoprotein (glavne komponente krvne plazme), serin proteaze, interferoni i imunoglobulini.

Familije gena za receptore mirisa, proteinske kinaze ili imunoglobuline su primeri familija

gena sa po nekoliko stotina lanova.

Familije gena koje kodiraju proteine sa dugim visoko-konzervisanim domenima

lanovi nekih familija gena dele sekvence za visoko-konzervisane aminokiselinske

domene, u kojima postoji posebno izraena homologija, dok je slinost u ostalom delu

kodirajue sekvence, kao i prosena slinost razliitih lanova familije sasvim mala. Ovakve

familije gena obino kodiraju transkripcione faktore, koji imaju vanu ulogu u ranom razviu,

a konzervisana sekvenca kodira proteinske domene koji se specifino vezuju za DNK ciljnih

gena (tabela 1).

HOX (eng. Homeobox) familija gena sadri 39 gena i oko 60 gena siroadi. Geni

siroad (eng. orphan genes) su geni koji imaju ogranienu filogenetsku distribuciju, tako da

ili nemaju otrologe kod drugih organizama, ili su njihovi ortolozi ogranieni na blisko srodne

vrste.

U genomu oveka postoje etri grupe HOX gena koje mapiraju na razliitim

hromozomima: grupa HOXA mapira na hromozomu 7, grupa HOXB na hromozomu 17,

grupa HOXC na hromozomu 12 i grupa HOXD na hromozomu 7 (slika 5). Pojedinani geni iz

grupe pokazuju veu slinost sa parnjakom iz druge grupe, u odnosu na ostale gene iz iste

grupe. Proteini HOX se odlikuju homoeodomenom od 60 amiokiselina. Njihova funkcija je da

kontroliu anteriorno-posteriornu osu i segmentaciju tokom razvia ("pattern" determiniui

geni koji odreuju plan organizma) (slika X).

Slika 5. Familija HOX gena oveka, i plan organizma koji odreuju.

PAX (eng. paired box) familija gena sadri 9 lanova koji se odlikuju

visoko-konzervianim DNK vezivnim domenom dugakim oko 130 aminokiselina. Proteini

15

PAX su transkripcioni regulatori sa vanom ulogom u formiranju tkiva i organa tokom

embrionalnog razvia. Nakon roenja, veina gena PAX se inaktivira, ali u nekim tkivima oni

ostaju aktivni i pomau regeneraciju tkiva i tite eliju od smrti usled elijskog stresa.

SOX (eng. SRY-related HMG-box genes) familija gena obuhvata 20 lanova, a prvi

otkriven je bio gen SRY, gen sisara koji mapira na Y hromozomu i odreuje pol. Homologija

izmeu ovih gena je ograniena na region koji kodira DNK vezivni domen oznaen kao

HMG. Proteini SOX su transkripcioni regulatori koji aktiviraju ili reprimiraju ekspresiju ciljnih

gena. Imaju kljunu ulogu u razliitim procesima razvia, kao to su rana embriogeneza,

gastrulacija, neuronalna indukcija, formiranje razliitih tikiva i organa, odreivanje sudbine i

diferencijacija mnogih tipova elija.

TBX (eng. T-box) familija gena sadri najmanje 17 lanova koji dele slian segment,

T-box, koji kodira DNK vezivni domen duine oko 170 aminokiselina. Proteini TBX su

transkripcioni regulatori vani za embrionalno razvie. Naroito su znaajni za normalno

razvie ruku i aka i srca.

FOX (eng. Forkhead box) familija gena ima oko 45 lanova kojima je zajedniko da

kodiraju domen forkhead, sekvencu od 80 do 100 aminokiselina koja je DNK vezivni domen.

Domen forkhead se naziva i "krilati" (eng. winged) heliks usled izgleda petlji u strukturi

proteina koja je nalik na leptira. Proteini FOX su transkripcioni regulatori ukljueni u procese

rasta elije, proliferacije i dugovenosti, a mnogi su vani i za embrionalno razvie. Gen

FOXP2 je vaan za procese u razviu koji dovode do razvoja govora i jezika.

Tabela 1. Primeri familija gena koje kodiraju proteine sa dugim visoko-konzervisanim domenima kod

oveka

Gene family Number of genes Sequence motif/domain

Homeobox genes

30 HOX genes (see Figure 14.5) plus ~60 30 gena homeobox genes

Homeobox specifies a homeodomain of ~60 amino acids. A wide variety of different subclasses have been defined

PAX genes 9 Paired box encodes a paired domain of ~130 amino acids; PAX genes often have in addition a type of homeodomain known as a paired-type homeodomain

SOX genes ~15 SRY-like HMG box which encodes a domain of ~70 amino acids

TBX genes ~15 T-Box which encodes a domain of ~170 amino acids

Forkhead domain genes

~45 The forkhead domain is about 110 amino acids long

POU domain genes

~15 The POU domain is ~150 amino acids long,

POU familija gena se sastoji od oko 15 lanova kojima je zajedniki segment koji

kodira domen POU dugaak oko 150 aminokiselina. Proteini familije POU su transkripcioni

faktori, od kojih su mnogi vani za razvie. Prvi geni ove familije koji su otkriveni, Pit1 i Oct2,

odgovorni su za aktivaciju ekspresije gena koja odreuje fenotip hipofize i limfocita. Najvei

broj lanova POU familije se eksprimira u adultnom mozgu, ali i tokom razvia nervnog

sistema.

Mutacije u razliitim lanovima familija HOX, PAX, SOX, TBX i FOX dovode do bolesti

koje se karakteriu nekompletnim razvojem tkiva u kojim se specifian gen eksprimira. Na

primer, mutacije u genu HOXD13 uzrokuju sinpolidaktiliju, dok su mutacije u genu FOXP2

povezane sa razvojnim poremeajima u govoru i jeziku kod osoba normalne inteligencije,

bez bilo kakvog znaajnog senzornog ili neurolokog poremeaja, a koje imaju znaajne

tekoe da steknu sposbnost ekspresivnog i/ili receptinog jezika. Ovaj poremeaj se

nasleuje na autozomno dominantan nain.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/n/hmg/A1680/figure/A1702/?report=objectonly

16

Familije gena koje kodiraju proteine sa veoma kratkim konzervisanim

aminokiselinskim motivima

Za lanove nekih familija gena se na osnovu sekvence DNK ne moe ba zakljuiti

da su srodni, ali oni kodiraju proteine koji se karakteriu zajednikom optom funkcijom. Ove

familije gena se definiu preko funkcionalno srodnih proteina koji imaju veoma kratke

konzervisane aminokiselinske motive.

Familija gena DEAD boks obuhvata nekoliko gena koji kodiraju proteine sa

funkcijom RNK helikaza i karakteriu se prisustvom osam kratkih konzervisanih motiva

aminokiselina, meu kojima je i sekvenca Asp-Glu-Ala-Asp, nazvana DEAD boks na osnovu

jednoslovnih oznaka za navedene aminokiseline (slika 6). RNK helikaze su enzimi koji tope

sekundarne strukture RNK i/ili otklanjaju proteine vezane za RNK. lanice familije DEAD

boks i srodne familije DExD boks koriste energiju hidrolize ATP-a da obave svoje funkcije.

Uestvuju u skoro svim koracima biogeneze iRNK: transkripciji, splajsovanju, editovanju,

transportu iz nukleusa u citoplazmu, remodelovanju iRNP, kao i u incijaciji translacije.

Familija gena ponovljenih WD motiva kodira regulatorne proteine. Obino se

karakteriu sa etri do osam tandemski ponovljenih motiva, fiksirane duine (27 do 45

aminokiselina), oznaenih kao centralno jezgro, koje sadri male konzervisane motive

aminokiselina ukljuujui i WD (Try-Asp) motive (slika 6). Proteini ove familije imaju

regulatornu funkciju u razliitim procesima u eliji: regulaciji elijske deobe, transkripciji,

prenosu signala kroz membrane, modifikacijama RNK.

Slika 6. Neke familije gena se definiu preko funkcionalno srodnih proteina koji imaju veoma konzervisane karatke motive aminokiselina: konsenzusni motivi familije DEAD boks (a) i familije ponovljenih WD motiva (b).

Familija gena ponovljenih ankirin motiva se karakterie sekvencama za tandemski

ponovljene motive dugake 33 aminokiselinska ostatka u kojim se odreena aminokiselina

nalazi na nekoliko pozicija. Proteini ove familije obavljaju razliite funkacije, ali su obino

ukljueni u interakcijama protein-protein.

Familija gena domena LIM kodira karakteristian domen duine 56 aminokiselinskih

ostataka koji je bogat cisteinom, i ukljuen je u interakcije protein-proetin.

17

Evolucija familija gena

Tokom evolucije familije gena su nastale duplikacijom u razliitim periodima, to se

ogleda u stepenu slinosti sekvence izmeu lanova jedne familije. Na osnovu stepena

slinosti u sekvenci izmeu dva gena moe se odrediti vreme kada se duplikacija desila.

Uopteno, slinija skevenca izmeu gena znai da potiu od predakog gena koji je postojao

u skorijoj prolosti u odnosu na predaki gen onih gena koji se danas vie razlikuju u

sekvenci. Usled genske konverzije mogu nastati sline ili identine kopije gena, u kojem

sluaju se na osnovu stepena slinosti u sekvenci ne moe odrediti vreme kada se

duplikacija desila. Duplikacija gena moe nastati usled greaka pri rekombinaciji (nejednaka

rekombinacije), greaka u replikaciji ili transpozicijom. Nastali duplicirani geni mogu

divergirati u razliite funkcionalne gene ili jedna kopija moe postati neaktivna.

U sluaju duplikacije celog gena, koja ukljuuje duplikaciju svih egzona i svih introna,

moe doi do nakupljanja mutacija u jednoj kopiji, a da ne doe do negativne selekcije. Ova

kopija moe zatim evolurati do neke nove aktivnosti: stei novu funkciju ili se moe

eksprimirati u razliito vreme ili mesto u odnosu na prvu kopiju. Na slici 7 je sumirana brzina

opisanih dogaaja. Postoji oko 1% verovatnoe da e dati gen podlei dulikaciji u periodu od

milion godina. Nakon duplikacije gena, razlike se akumuliraju kao rezultat deavanja razliitih

mutacija u svakoj kopiji. Pojedinane mutacije se akumuliraju brzinom od oko 0,1% za milion

godina.

Slika 7. Nakon duplikacije gena, u nastalim kopijama se akumuliraju razlike. Gen moe stei razliitu funkciju ili jedna od kopija moe postati neaktivna.

Nakon duplikacije gena i akumulacije razlika u sekvenci, moe se desiti da obe kopije

budu neophodne, ili da se jedna od kopija eliminie. U prvom sluaju, usled nastalih razlika

kopije gena kodiraju proteine sa razliitim funkcijama, ili se kopije gena eksprimiraju u

razlliitom tkivu ili vremenu. Ukoliko obe kopije nisu potrebne, jedan od gena e biti

18

eliminisan jer su se u njemu nakupile tetne mutacije. Za nastanak nefunkcinalne kopije

gena potrebno je oko 4 miliona godina. Sluajnost je kojae kopija postati neaktivna.

Analize genoma oveka pokazuju da oko 5% genoma predstavlja duplikacije

odreenih segmenata DNK duine 10 do 300 kb. One su nastale relativo skoro, to znai da

nije bilo dovoljno vremena za diverganiciju, koja bi eliminisala njihovu srodnost. Geni u ovim

duplikacijama bi mogli biti posebno interesantni upravo zbog implikacije da su skoro

evoluirali, i da su zbog toga mogli biti zanajni za skoriji evolucioni razvoj (na primer

razdvajanje oveka od majmuna).

Evolucija globinskih gena

Na osnovu organizacije pojedinanih globinskih gena razliitih vrsta mogue je pratiti

evoluciju sadanjih grupa globinskih gena. Funkcionalni globinski geni kod svih vrsta imaju

istu optu strukturu, sastoje se iz tri egzona i dva introna (slika 4). Smatra se da su svi i

globinski geni nastali duplikacijom, transpozicijom i mutacijama predakog gena koji je imao

tri egzona. Zajedniko poreklo sa globinskim genima imaju i geni za mioglobin i

leghemoglobin. Mioglobin je monomerni protein koji vezuje kiseonik i eksprimira se u

miinim lijama kimenjaka. Njegova aminokiselinska sekvenca ukazuje na zajedniko

poreklo sa globinskim genima. Leghemoglobin je monomerni protein koji vezuje kiseonik i

karakteristian je za mahunaste biljke. On takoe deli zajedniko poreklo sa drugim

proteinim koji vezuju hem. Zajedno, globini, mioglobin i leghemoglobin predstavljaju

superfamiliju globina, grupu familija gena koje vode poreklo od dalekog zajednikog

predakog gena. Sadanje shvatanje evolucije superfamilije globinskih gena je prikazanona

slici 8.

Gen za leghemoglobin biljaka je najverovatnije najsliniji predakom genu. Za razliku

od gena za mioglobin i globine, sdari tri introna, od kojih se prvi i poslednji nalaze nalaze na

mestima koja je homologna lokaciji dva introna u genima za mioglobin i globine (slika 8).

Centralni intron u genu za leghemoglobin razdvaja dva egzona, koja zajedno odgovaraju

sekvencu centralnog egzona u genima za mioglobin i globine. Smatra se da je centalni

egzon u genima za mioglobin i globine nastao fuzijom dva centralna egzona u predakom

genu, iako se ne moe potpuno iskljuiti mogunost da je jedan centralni egzon postojao u

predakom genu, koji je u sluaju leghemoglobina razdvojen insercijom introna tokom

evolucije biljaka.

Na osnovu sekvence mioglobina zakljuuje se da je on divergirao pre oko 800 miliona

godina. Neke primitivne ribe imaju samo jedan gen za globine, koji je divergirao tokom

evolucije pre nego to su se globinski geni duplicirali i divergirali u i varijante. Smatra se

da se to desilo pre oko 500 miliona godina, tokom evlucije koljoriba (Osteichthyes). Sledei

korak u evoluciji globinskih gena je predstavljen formiranjem zajednikog klastera i

globinskih gena, kakvu situaciju danas imamo kod X. laevis. Klaster globinskih gena aba

sadri i i globinske gene, kako larvalnog tako i adultnog stadijuma, tako da se smatra da

su ovi klasteri globinskih gena nastali duplikacijom vezanih parova i globinskih gena,

praene divergncijom individualnih kopija, a da se kasnije desila duplikacija kompletne grupe

globinskih gena. S obzirom da i kod ptica i sisara postoje odvojeni klasteri i globinskih

gena, njhovo fiziko razdvajanje, verovatno transpozicijom, se desilo pre nego to su ptice i

sisari divergirali od zajednikog pretka preko oko 270 milona godina. U okviru obe grupe

19

globinskih gena dalje su se deavale promene koje su dovele do divergenicije individualnih

gena u klasterima.

Slika 8. Evolucija superfamilije gloinskih gena: a) Svi geni superfamilije globina su evoluirali odserijom duplikacija, mutacijama i transpozicijom jednog predakog gena; b) gen za leghemoglobin ima jedan intron vie u odnosu na ostale gloinske gene, koji sekvencu gena za centralni domen proteina razdvaja na dva egzona;c) Na osnovu divergencije dva gena, koja se ogleda u procentu nesinonimnih supstitucija, moe se izraunati vreme kada su se geni razdvjili i napraviti.

Sekvence homolognih gena razliitih vrsta (ortologa) se razlikuju po nesinonimnim

(kada mutacija dovodi do promene aminokiseline) i/ili sinonimnim supstitucijama (kada

mutacija ne utie na sekvencu proteina). Sinomnimne substitucije se deavaju 10 puta ee

u odnosu na nesinonimne. Evoluciona divergencija dva proteina se meri procentom pozicija

na kojm su se desile nesinonimne supstitucije.

Brzina kojom se akumuliraju mutacije je karakteristina za svaki protein, pre svega u

zavisnosti kolika je njegova fleksiblinost da primi promene. U okviru jedne vrste, protein

20

evoluira mutacionim supstitucijama, koje su praene njihovom eliminacijom ili fiksacijom u

genskom poolu vrste. Treba imati u vidu da kada se ispituje genski pool neke vrste, detektuju

se varijante koje su "preivele". Kada su prisutne mnogobrojne varijante, one mogu biti

stabilne (jer nemaju selektivnu prednost) ili mogu biti prolazne jer su u procesu eliminacije.

U procesu specijacije, kada se jedna vrsta razdvoji na dve nove, svaka ima svoj

genski pool, koji evoluiraju nezavisno jedan od drugog. Poreenjem odgovarajuih proteina

dve vrste, detektuju se razlike koje su se akumulirale izmeu njih od vremena kada su

divergirale. Neki proteini su visoko-konzervisani i pokazuju malu razliku izmeu vrsta ili

razlike uopte nema. Ovo ukazuje da su skoro sve promene u takvim proteinima tetne i

podleu negativnoj selekciji.

S obzirom da se mutacije akumuliraju sa manjom ili veom brzinom nakon

razdvajanja gena, divergencija izmeu bilo kojeg para gena je proporcionalna vremenu kada

su se oni razdvojili. Razlika izmeu proteinski produkata takvih gena se izraava procentom

nesinonimnih supstitucija, odonso procentom pozicija na kojima se razlikuju aminokisleine

izmeu njih, to je poznato kao divergencija. Na osnovu poznavanja prosene uestalosti

nesinonimnih supstitucija tokom vremena, mogue je na osnovu broja utvrenih

nesinonimnih supstitucija izmeu dva ispitivana proteina izraunati kada su oni razdvojili u

prolosti.

Da li su pseudogeni bivi geni koji su mutirali i postali nefunkcionalni ili su to geni koji

evoluiraju u nove, budue gene?

Pseudogeni su kopije gena koje su pretrpele promene u sekvenci DNK i, uslovno

reeno, postale nefunkcionalne. Nastaju duplikaciojm gena (konvencionalni pseudogeni) ili

od iRNK koje su prepisane sa funkcionalnih gena, reverznom transkripcijom prevedene u

DNK i reintegrisane u genom (obraeni pseudogeni).

Konvencionali pseudogeni uglavnom zadravaju optu egzon-intron strukturu

funkcionalnog gena. Oni su inaktivirani mutacijama koje spreavaju bilo koji korak u

ekspresiji gena. Mutacije mogu onemoguiti transkripciju, splajsovanje, promeniti

egzon-intron granice, ili dovesti do stvaranja prevremenog stop kodona. Nakon duplikacije

gena, ako se jedna kopija inaktivira mutacijom, ona dalje bez ometanja moe akumulirati

nove mutacije, tako da pseudogeni obino sadre vei broj inaktivirajuih mutacija (slika X).

Pseudogeni koji predstavljaju neaktivne verzije sadanjih aktivnih gena prisutni su u mnogim

familijama gena, ukljuujui globinske, imunoglobinske, familiju histokompaibilnih antigena, i

obino su locirani u samom klasteru gena, najee izmeu aktivnih gena.

Ako su pseudogeni "mrtvi krajevi" evolucije, jednostavno neeljeni pratioci

rearaniranja funkcionalnih gena zato su jo uvek prisutni u genomu? Da li obavljaju neku

funkciju ili su potpuno bezkorisni, u kojem sluaju ne bi trebao da postoji selektivni pritisak za

njihovo zadravanje. ;eutim, trbalo bi se podsetiti da mi vidimo one gene koji su preiveli do

danas i prisutni su u populacijama. S obzirom da je genom veoma dinamian, mnogi

pseudogeni su u prolosti verovatno eliminisani. Njihvoa eliminacija se mogla iznenada desiti

delcijom sekvence ili su oni akumulirali toliko mutacija da se odreeni pseugoen vie ne

prepozanje kao originalnei lan neke familije gena (to je verovatno krajnja sudbina svih

psedogena koji nisu iznenada eliminisani). Mehanizmi koji su odgovorni za duplikacije,

delecije i rearaniranje klastera gena deluju na sve skevnence koje se prepoznaju klao

21

lanovi familije, bez obzira da li su oni funkcionalni ili ne, a selekciji je ostavljeno da napravi

diskriminaciju izmeu nastalih produkata ovih procesa.

Procenjuje se da genom oveka sadri oko 20 000 pseudogena. Interesantno je da su u

postgenomskoj eri opisani primeri da molekul RNK, prepisan sa pseudogena, regulie

ekspresiju homolognog gena koji kodira protein. Jo uvek nije poznato koliki procenat

pseudogena nosi genetiku informaciju za ovakve regulatorne molekule RNK. Iz ovakvih

razloga pseudogene bi trebalo a priori posmatrati kao "mrtve krajeve" evolucije, iako veliki

broj to definitivno jesu.

Slika 9. ft pseudogen globinskog klaster kunia ima istu organizaciju egzona i introna koa funkcionalni 1 gen, ali su se u njemu akumulirale mnoge inaktivirajue mutacije: delecija jednog baznog para na poziciji kodona 20 dovodi do mutacije kojamenja fazu iranja i dovodi nizvodno do stvaranja prevremenog stop kodona; nekoliko takastih mutacija se akumuliralo u poslednjim kodonima koji kodiraju aminokiseline koje su visoko-konzervisane u globinima; nijedan od dva introna vie ne poseduje prepoznatljiva mesta splajsovanja; usled mutacija u uzovodnom 5'-regionu ne dolazi do njegove transkripcije.

Nejednaki krosing over dovodi do rearaniranja u familijma gena

U klasterima identinih ili srodnih gena esto se deavaju rearanmani, to se moe

uoiti poreenjem na primer, globiskog klastera izmeu razliitih vrsta sisara (slika X). Geni

u globinskom klasteru razliitih vrsta sisara imaju istu funkciju i svi imaju istu optu

organizaciju, ali svaki gen je razliite duine. Takoe, postoje i razlike u ukupnom broju

globinskih gena prisutnih u klastrima razliitih vrsta, kao i razlike u broju i strukturi

pseudogena u njima. Sve ove promene su se desile nakon radijacije sisara, pre oko 85

miliona godina. Na osnovu ovog primera se moe zakljuiti da je rearaniranje gena u

klasterima jednako vaan faktor evolucije familija gena kao i akumuliranje takstih mutacije u

individualnim genima. Nejednaki krosing over se smatra glavnim mehanizmom koji dovodi do

reorganizacije gena.

22

Slika 10. Klasteri globinskih gena su prisutni kod svih kimenjaka i meusobno se razlikuju poduini pojedinanih gena, broju i rasporedu gena i pseudogena koji sdare. Ovakva organizacija globinskih klastera kod razliitih vrsta ukazuje da su mehnaizmi koji dovode do reorganizacije gena u klasterima jednako veni evolucioni faktoi kao i akumuliranje takastih mutacija u pojednanim genima.

Nejednaki krosing over (poznat i kao nereciprona rekombinacija) se deava kao

rezultat sparivanja izmeu dva mesta koja nisu homologna. Obino se homologna

rekombinacja deava izmeu sekvenci koje su tano sparene izmeu dva molekula DNK.

Meutim, u regionima homolognih hromozoma gde postoje dve kopije nekog gena

(nealelskih gena) ili tandemski ponovljene sekvence moe se desiti pogreno sparivanje,

usled ega dolazi do nejednakiog krosing overa, rekombinacije izmeu dva mesta koja nisu

homologna. Osobina koja ovaj dogaaj ini moguim je postojanje ponovljenih sekvenci i

nealalskih gena. Nejednaki korosing over omoguava da da se jedna kopija ponovljene

sekevnce sa jednog hromozoma pogreno spari sa neodgovarajuom kopijom drugog

hromozoma (slika 11). Nakon rekombinacije broj ponovljenih sekvenci u jednom

rekombinovanom hromozomu se poveava, a u drugom smanjuje. Zapravo, jedan

rekombinovani hromozom nosi deleciju (kontrakciju), a drugi duplikaciju (ekspanziju). Ovaj

mehanozam je odgovoran za evoluciju klastera gena i regiona sa visoko-ponovljenom DNK.

Slika 11. Nejednaki krosing over dovodi do pogrenog sparivanja regiona koji sadre ponovljene motive DNK. Ponovljeni motiv DNK na slici je ABC, i peti motiv crvenog hromozoma se sparuje sa treim crnog hromozoma. U regionu sprivanja dva hromozma jedinice ABC jednog hromozoma se sparuju sa jednicama ABC drugog hromozoma. Usled nekednakog krosing overa nastaju rkombinovani hromozomi sa 10 i 6 jedinica ABC, umesto sa po 8, koliko je bilo u originalnim.

23

U klasterima gena, pogreno sparivanje izmeu neaelskih gena dovodi do

nejednakog krosing overa. Nejdenaki krosing over u klasterima gena ima dve posledice,

promenu broja gena u rekombinovanim hromozomima i moguu promenu sekvence gena.

Naime, broj nelaleksih gena se na jednom hrmozomu smanjuje, a na drugom poveava

(slika 12). Ako se rekombincaija desi u okviru samog gena (a ne izmeu gena), rezultat

nejdenskog krosingovra zavisi da li su geni koji se rkombinuju identini ili slini. Ako su

nealelski geni koji su pogreno spareni potpuno homologni, nee doi do promene sekvence

u niti jednom od njih. Meutim, nejednaki korosing over moe dase desi i ako su sekvence

gena sline, mada je verovatnoa manja nego kada su identini. U ovom sluaju svaki od

rekombinovanih gena ima sekvencu kojase razlikuje od skvence originalnih.

Slika 12. Nejednakim krosing overom (nerecipronom rekombinacijom) moe se promeniti broj gena u genskom klasteru. Ako se gen 1 jednog hromozma pogreno spari sa genom 2 drugog hromozoma, presotale kopija gena se ne mogu meusobno spariti. Rekombinacijm izmeu pogreno sparenih gena nastaje jedan hromozom sa jednom (rekombinovanom) kopijom gena i jedan hromozom sa tri kopije gena ( jednom rekombinantnom i po jednom od oba roditelja).

Da li e hromozomi nastali nejednakim krosing overom imati selektivnu prednost ili ne

zavisi od posledica promena u sekvancama rekombinovanih gena kao i od promene broja

kopija gena. Smetnja nejednakom krosing overu je diskontinuirana struktura gena. U sluaju

globinskih gena, odgovoarajui egzoni susednih genskih kopija su dovoljno sline da bi

mogle da podr\e sparivanje, ali su sekvence introna znaajno razliite. Ovo ogranienje u

sparivanju egzona, znaajno smanjuje kontinuiranu duinu DNK koja moe biti sparena, to

24

smanjuje uestalost nejednakog krosing overa. Na ovaj nain divergaencija izmeu introna bi

mogla pojaavati stabilnost klastera gena ometajui deavanje nejednakog krosing overa.

Talasemije su autozomno recesivne bolesti izazvane mutacijama koje redukuju ili

spreavaju sinterezu gena ili globinskog klasetra. Deavanje krosing overa u globinskim

genima oveka je upravo otkriveno prirodom nekih hromozoma asociranih sa talasemijama.

Mnoge od najteih oblika talasemija su rezultat delecije dela jednog od klastera globinskih

gena (slika 13). U barem nekim sluajevima, krajevi delecije se nalaze u regionima koji su

homologni, to se upravo i oekuje ako su nastale nejdnakim krosing overom.

Varijacije u broju gena u globinskom klasteru se relativno este, to ukazuje da je

nejdnaki krosing over u ovom lokusu dovoljno est. Deavaju se ee nego u gobinskom

klasteru, a razlog za to su verovatno krai introni u globinskim genima, koji kao takvi

predstavljau manju smetnju za nejednaki krosing over. Kompletna delecija globinskog

klastera dovodi do hydrops fetalis, koji je fatalan pre roenja ili na samom roenju, a

podrazumeva abnormalo nakupljanje tenosti na nekoliko mesta u telu fetusa ili

novoroeneta.

Slika 13. Delecije globinskih gena u i klasterima uzrokuju razliite tipove talasemija. Beli pravougaonici oznaavaju deletirane regione usled nejednakog krosing overa sa natpisi iznad njih oznake za odreeni tip delecije.

Na osnovu razlika u grupama globinskih gena kod razliitih vrsta, moe se zakljuiti

da je duplikacija, nastala uglavnom nejednakim krosing overom, (nekada) praena

promenama u sekvenci bila vana odlika evolucije svake grupe gena. Talasemini hromozmi

oveka pokazuju da nejednaki krosing over nastavlja da se deava u obe grupe globinskih

gena. Svaki takav dogaaj dovodi do stvaranja kako duplikacije tako i delecije, koje imaju

odreene sudbine u populacijama. Delecije se, u principu, mogu desiti i usled rekombinacije

homolognih sekvenci istog hromozoma, kada se ne stvara odgovarajua duplikacija.

25

Uloga nejednakog krosing overa i genske konverzije u nastanku i odravanju

identinih sekvenci tandemski ponovljenih grupa gena

Nedostatak detektabilnih varijacija u sekveci molekula rRNK ukazuje da su sve kopije

svakog gena identine, ili da eventualno postoje razlike koje su ispod detektabilnog nivoa

(

26

paradoks multigenskih familija i bio je prvi opisani primer "udruene" evolucije, po kome

sekvence tandemski ponovljenih gena pokazuju tendenciju da evoluiraju zajedno, a ne da

divergiraju akumulacijom razliitih mutacija.

Udruena evolucija tandemski ponovljenih gena je posledica nejednakog krosing

overa i genske konverzije, procesa koji mogu dovesti do homogenizacije sekvence,

odnosno zadravanja iste sekvence u brojim kopijama gena. Nejednaki krosing over u okviru

dugih tandemski ponovljenih nizova, kao to su geni za rRNK, moe dovesti do irenja neke

nasumine varijante sekvence kroz populaciju gena procesom koji je analogan genetikom

driftu u popualaciji organizama. Genska konverzija podrazumeva direknu konverziju jedne

sekvence u druge, kada se sekvence spare za vreme mitoze ili mejoze.

Kada hromozom nosi nealelske gene, moe doi do nejednakog krosingovera

izmeu homolognih segmenata pogreno sparenih (eng. "missaligned"" ili mispairing")

hromozoma, tako segment sa tandemski ponovljenim genima na jednom hromozomu postaje

dui, a na drugom krai, odnosno nastali hromozomi sadre manji i vei broj ponovljenih

jedinica u odnosu na originalne. Kod gena za rRNK, u okviru jedinice koja se ponavlja

postoje variranja u duini graninika koji se ne transkribuju dok su sekvence transkripcionih

jedinica identine. Meutim, bez obzira na varijacije u duini, sekvence graninika koje se ne

transkribuju su meusobno homologne. Razlog za to je to se graninici koji se ne

transkribuju sastoje iz nekoliko ponovljenih regiona, tako da varijacije u njihovoj duini potiu

od razlika u broju ponovljenih regiona. Upravo ove razlike u duini graninika koji se ne

transkribuju, a koji se sastoje iz vie tipova ponovljenih regiona, ukazuju da se esto deava

nejednaki krosing over. Nejednakim krosing overom menja se ukupna duina grupe

tandemski ponovljenih gena, ali ne i osobine pojedinanih jedinica koje se ponavljaju. Zato

mehanizmom nejednakog krosing overa stalno dolazi do kontinuiranih kontrakcija i

ekspanizija tandemski ponovljene grupe gena (promene broja ponvaljajuih jedinica), a

istovremeno se spreava akumulacija promena (mutacija) u kopijama samih transkripcionih

jedinica, odnosno omoguava se njihova homogenizacija.

Model fiksacije krosing overom predvia da je kompletna grupa tandemski

ponovljenih gena podloena rearaniranju mehanizmom nejednakog krosing overa. Ovaj

model moe objasniti udruenu evoluciju ponovljenih gena, ako nejednaki krosing over

omoguava da svi ponovljeni geni fiziki nastanu od jedne kopije. Tandemska organizacija

omoguava esto pogreno sparivanje gena ije su sekvence identine, ali se nalaze na

razliitim mestima u okviru ponovljenog niza. Kontinuiranim kontrakcijama i ekspanzijama,

odnosno smanjenjem ili poveanjem broja ponovljenih jedinica, mogue je da su sve

ponovljene jedinice u nizu nastale od male proporcije ponovljenih jedinica koje su bile

prisutne u predakom nizu. Razliite duine graninika koji se ne transkribuju u genima za

rRNK su u skladu sa idejom da se nejednaki krosing over deava u okviru ovog graninika

ije se ponovljene jedinice mogu pogreno spariti. Ovo ujedno objanjava homogenost

izmeu transkripcionih jedinica i istovremenu varijabilnost u graninicima. Kada se

individuana ponvaljajua jedinica amplifikuje unutar klastera transkripciona jedinica postaje

podlona selekciji, dok graninici ne, i oni mogu akumulirati promene.

Nejednakim krosing overom nastaju rekombinacioni produkti sa razliitim brojevim

jedinica koje se ponavljaju. U jednom sluaju, tandemski ponovljeni niz e biti dui, a u

drugom krai (slika 11). Ako je nejednaki krosing over est, grupe tandemski ponovljenih

gena e biti podlone kontinuiranim ekspanzijama i kontrakcijama.

27

Nejedanaki krosing over moe dovesti i do toga da se odreena jedinica ponavljanja

rairi du grupe ponovljenih gena (slika 14). Pretpostavimo da se grupa gena inicijalno

sastoji od pet jedinica ponavaljanja, oznaenih sa po jednim slovom "abcde". Razliite

jedinice ponavljanja su toliko srodne da se moe doi do pogrenog sparivanja prilikom

rekombinacije. Zatim, serijom nejednakih rekombinacionih dogaaja, veliina ponovljenog

regiona se poveava ili smanjuje, i istovremeno jedna jedinica ponavljanja ("b") se iri i

zamenjuje druge jedinice ponavljanja. Model fiksacije krosing overom predvia da e bilo

koja sekvenca DNK koja nije pod selektivnim pritiskom biti zadrana u seriji identinih

ponovljenih jedinica generisanih na ovaj nain. Treba imati na umu da je proces fikasacije

krosing overom mnogo bri u odnosu na uestalost mutacija, tako da se nove mutacije koje

nastaju u ponovljenim jedinicama se ili eleiminiu (ako se takvi ponovci izgube) ili se brzo

raire po celoj grupi. Model fikasacije krosing overom ima dve posledice: kontinuiranu

promenu duine tandemski ponovljenoih nizova i homogenizaciju jedinica koje se u okviru

njih ponvaljaju.

Slika 14. Nejednaka rekombinacija omoguava da odreena jedinica koja se ponavlja (jedinica "b") okupira kompletnu grupu gena. Brojevi oznaavaju broj ponovljenih jedinica u svakom koraku.

28

Mehanizam genske konverzije podrazumeva da jedan lan tandemski ponovljene

grupe gena koriguje susedni, tako da dolazi do promene sekvence u lanu koji se koriguje,

dok sekvenca drugog koji slui kao matrica za korigovanje ostaje nepromenjena. Dakle,

smatra se da genska konverzija efikasno konvertuje sekvencu jednog nealelskog gena u

sekvencu drugog.

Jo jedno interesantno pitanje, na koje jo nemamo odgovor, je kako korektivni

mehanizmi, koji gene za rRNK u okviru jedne grupe (klastera) odravaju konsatantnim,

deluju na grupe gena za rRNK rasporeene na razliitim hromozomima? ak i multigenske

familije koje nisu tandemski ponovljene uspevaju da ouvaju homogenost. Tako npr. osam

identinih gena koji kodiraju tirozin tRNK u kvascu su locirani na osam razliitih hromozoma i

uspeno sadravaju homogenost. Ovih osam gena oigledno koevoluira: njihove sekvence

se istovremeno menjaju. Do danas nije jasno kako osam gena razbacanih na osam

hromozoma medjusobno komunicira?

29

Retrotranspozoni bez dugakih terminalnih ponovaka (SINE i LINE)

Retrotranspozoni bez dugih terminalnih ponovaka (eng. long terminal repeats, LTR)

obuhvataju kratke rasute elemente po genomu (eng. short interspersed elements, SINE) i

dugake rasute elemente po genomu (eng. long interspersed elements, LINE). Elementi L1 i

Alu su se toliko umnoili tokom poslednjih 80 miliona godina evolucije primata da danas

zauzimaju jednu treinu genoma oveka (slika 15). Iako dugo posmatrani kao DNK "smee"

(eng. "junk" DNA), danas je poznato da svoj efekat na genom ostvaruju na mnogo razliitih

naina: stvaraju insercione mutacije, dovode do genomske nestabilnosti, inciraju

rekombinaciju, utiu na promene u ekpresiji gena, ali doprinose i genetikim inovacijama

(stvaranju novih funkcionalnih gena). Skevenciranje genoma oveka i ostalih primata

omoguilo je da se bolje razume stepen i sloenost doprinosa koji su proli i dananji

retrotranspozoni bez LTR-ova imali u oblikovanju genoma oveka tokom evolucije. Meutim,

i dalje postoji debata meu naunicima o tome da li su ovi elementi intraelijski "paraziti" koji

napadaju genom domaina i koriste elijske resurse, ili ih elija tolerie zbog povremenih

pozitivnih uticaja na evoluciju genoma.

Slika 15. a) Sadraj transpozona u genomu oveka; b) element L1; c) element Alu.

Alu elementi

Alu elementi pripadaju retrotranspozonima SINE. Sa jedan milion kopija, koje okupiraju oko

10,5% genoma oveka, Alu elementi su najuspeniji retrotranspozoni koji su "okupirali" na

genom kroz kontinuiranu transpoziciju u poslednjih 65 miliona godina. Procenjuje se da se

prilino jedna insercija Alu elementa deava kod svake dvadesete roene osobe. Ime su

dobili po tome to sadre restirkciono mesto za enzim Alu I.

Alu elementi su dugaki oko 300 bp i odlikuju se dimernom strukturom nastalom

fuzijom dva monomera (ruica) koji potiu od 7SL RNK (male RNK koja je komponenta

ribonukleoproteinske partikule za prepoznavanje signalnog peptida, esencijalanog za

translokaciju novosintetisanih proteina kroz membrane endoplazmatinog retikuluma kod

viih eukariota). Monomeri su razdvojeni linker regionom bogatom adeninskim ostacima.

5'-monomer sadri unutranji promotor za Pol III sastavljen od elemenata A i B. Na samom

3'-kraju sadri rep bogat adeninskim ostacima duine oko 100 bp. Alu elementi se

transkribuju sa Pol III na strogo regulisan nain brojnim cis i trans faktorima. Ne poseduju

signal za terminaciju transkripcije sa Pol III, tako da se proces nastavlja nizvodno od Alu

elemenata, sve dok se na naie signal za terminaciju. Alu elementi ne kodiraju proteine, tako

30

da predstavljaju neautnomne transpozibilne elemente koji unamljuju maineriju za

retrotranspoziciju kodiranu elementima L1. Zbog ove osobine ih zovu i "parazti parazita.

Alu elementi su meusobno veoma sline i pokazuje u proseku 80 do 90% homologije sa

svojom konsenzusnom sekvencom. Alu elementi se najee nalaze u intronima, 3'

netranslatiranim regionima gena kao i u intergenskim regionima. Pokazano je da se Alu

sekvence preferencijalno akumuliraju u regionima genoma bogatim genima.

SINE elementi u genomu mia su B1 element, zastupljen sa 550 000 kopija, i B2

element, zastupljen sa 350 000 kopija, tako da zajedno zauzimaju oko 5% genoma. B1 i B2

elementi, kao i Alu, pripadaju retrotranspozonima SINE. B1 SINE potiu od 7SL RNK, dok B2

SINE potie od tRNK. B1 su dugaki oko 135 nukleotida i odgovaraju levoj ruici elementa

Alu. B2 su dugaki oko 200 nukleotida. Kao i Alu, B1 i B2 SINE sadre promotorske

elemente za Pol III (A i B boksove).

Prisustvo ovih elemenata u ogromnom broju kopija koje se odravaju milionima

godina, moe da ukae da one imaju neku funkciju i da daju neku selektivnu prednosti

genomu domainu. Otkrie da se ovi elementi transkribuju sa Pol III i da se broj njihovih Pol

III transkripata znaajno poveava u uslovima elijskog stresa, dovelo je do pretpostavke da

su SINE RNK funkcionalne. Poslednjih godina pokazano je da se ovi elementi transkribuju i

sa Pol II, kada predstavljaju samo delove Pol II transkripata. Postoji sve vie dokaza da Pol

III SINE i Pol II transkripti koji sadre SINE uestvuju u kontroli ekspresije gena na vie

razliitih naina: represija transkripcije, kada kao trans faktori stupaju u dirketnu intrkciju sa

Pol II, invertovane Alu sekvence u Pol II transkriptima su mesta editovanja A-u-I, i kada se to

desi u 3'-UTR-u transkripta on biva zadran u nukleusu i njegova ekspresija se reprimira,

utiu na altrnativno splajsovanje kroz posedovanje potencijalnih 5'- i 3'- mesta splajsovanja.

Funkcije Alu, B1 i B2 Pol III transkripata

U elijama oveka Alu RNK se eskprimiraju na niskom nivou, ali u uslovima

fiziolokog stresa, kao to su toplotni stres, virusna infekcija, poveanje koncentracije

etanola, izlaganje UV svetlu i gama radijaciji, nivo Alu RNK se znaajno i prolazno poveava.

Pokazano je da poveanje nivoa Alu RNK u uslovima toplotnog stresa korelie sa

remodelovanjem hromatina, ime se verovatno poveava dostupnost unutranjih Alu

promotorskih elemenata. Poveanje nivoa Alu RNK u uslovima nekih virusnih infekcija

vezano je za poveanu aktivnost transkripcionog faktora TFIIIC, koji se vezuje za

promotorski element B boks. U navedenim tipovima fiziolokog stresa dolazi i do poveanja

nivoa B1 i B2 RNK kod mia. Tako je pokazano da se maksimalno poveanje nivoa B1 i B2

RNK kod mia deava 1 do 3 sata nakon stresa izazvanog toplotom. Nakon uzimanja

etanola nivo ovih RNK kod mia se takoe poveava, a sa smanjenjem koncentracije etanole

u periodu oporavka od oka, smanjuje se i nivo ekspresije B1 i B2 elemenata.

Izgleda da u uslovima fiziolokog stresa Alu, B1 i B2 RNK vezuju proteinsku kinazu

koje se aktivira sa dvolananom DNK (PKR) i negativno je reguliu. PKR ima vanu ulogu u

odbrani od virusa koju ostvaruje fosforilacijom eIF2, to vodi do globalne inhibicije

translacije u eliji.

Pol II sintetie sve iRNK u elijama eukariota, delujui orkestrirano sa optim

transkripcionim faktorima da bi pokrenula transkripciju sa odreenog promotora.

Transkripcija pomou Pol II je visoko regulisana transkripcionim regulatorima, regulatornim

elementima DNK i strukturom hromatina. Odnedavno je poznato da u regulaciji transkripcije

31

sa Pol II vanu ulogu imaju nekodirajue RNK (eng. non-coding RNA, nc-RNK).

Transkripciona represija sa Alu i B2 RNK je bila meu prvim opisanim primerima u kojima in

trans regulatornu funkciju u transkripciji pomou Pol II imaju nc-RNK.

U uslovima toplotnog oka, dolazi do poveanja ekspresije SINE RNK, dok se opti

nivo transkripcije sa Pol II smanjuje. Na primer, smanjuje se ekspresija gena kuepazitelja.

Meu retkim genima ija se ekpresija u ovim uslovima znaajno poveava spadaju geni za

proteine toplotnog stresa. Alu i B2 RNK su izgleda odgovorne za optu transkripcionu

represiju gena kuepazitelja tokom odgovora na toplotni ok. Ovu funkciju ostvaruju kao

trans faktori koji asmbliraju sa Pol II na promotorima i potencijalno reprimiraju transkripciju

(slika 16). Pokazano je da se u in vitro uslovima Alu i B2 RNK direktno vezuju za Pol II.

Slika 16. In trans represija Pol II transkripcije pomou Alu RNK. Nakon toplotnog oka, sinteza B1 i B2 RNK u elijama mia i Alu RNK u elijama oveka, pomou Pol III, se poveava. Nastale SINE RNK inhibiraju transkripciju gena kuepazitelja kroz dirkektnu intrakciju sa Pol II.

Funkcija Alu RNK koje su deo Pol II transkripata (iRNK)

Analiza distribucije Alu elemenata u genomu pokazuje da skoro 75% gena koji

kodiraju proteine sadre Alu insercije sa preferncijalnom lokalizacijom u intronima i

3'-UTR-ovima. Kao rezultat ovakve lokalizacije. Alu elementi su prisutni u transkriptima koje

sintetie Pol II. Za ovakeve Alu RNK je pokazano da intenzivno podleu editovanju A-u-I,

doprinosei nuklearnoj retenciji transkripta i utiavanju ekspresije gena. Ovakve Alu RNK

uestvuju i u modulaciji alternativnog splajsovanja.

Promenom skevence RNK u odnosu na sekvencu DNK, mainerija za editovanje

RNK ima mogunost da znaajno povea diverzitet proteoma. Specifini tip editovanja RNK,

koji je neophodan za normalno razvie kimenjaka, je dezaminacija adenozina u inozin

(A-u-I) u okviru dvolnane RNK. Ovaj proces katalizuju enzimi adenozin dezaminaze koje

deluju na RNK (ADAR1-3). ADAR1 i ADAR2 se eksprimiraju u svim tkivima, dok se ADAR3

specifino eksprimira u mozgu. Editorska aktivnost ADAR3 jo nije potvrena. Promena A u I

za posledicu ima da mainerije za translaciju i splajsovanje I prepoznaju kao G, to moe

dovesti do promene znaenja kodona i stvaranja novih mesta splajsovanja. Pored ovoga

editovanje A-u-I moe promeniti stabilnost RNK stvaranjem destabilizujueg wobble para I-U

i stabilizujueg para I-C.

Genomske analize u kojima je poreena sekvenca ogromnog broja cDNK sa

sekvencom genomske DNK su pokazale da su Alu elementi primarni targeti editovanja A-u-I.

Procenjeno je da se 90% editovanja A-u-I deava u Alu elementima prepisanim u Pol II

32

transkriptima. U okviru 1 400 gena detektovano je ak 14 000 mesta editovanja, koje se

deava vie puta u okviru jednog Alu elementa.

Supstrati za ADAR enzime su bazno spareni A u dvolnanim regionima RNK. Alu

elemnti postaju supstrati za editovanje enzimima ADAR, jer u transkriptu susedni Alu

elementi suprotnih orjentacija mogu meusobno da se spare i formiraju dovoljno dugaku

dvolananu RNK u samom transkriptu, koju kao svoj supstrat prepoznaje ADAR, i obino

edituje vei broj A (slika 17).

Slika 17. Alu RNK u Pol II transkriptima su spstrat za editovanje A-u-I. Dva susedna elementa Alu invertovanih orjentacija u 3'-UTR-u, formiraju karakteistinu skundarnu strukturu sa dugim dvolananim regionom, koji je idealni supstrat za dezaminaciju A-u-I katalizovanu enzimima ADAR. Editovani dupleks Alu vezuje protein p54nrb, usled ega se transkript zadrava u nukleusu.

Znaaj ove vrste editovanja jo nije potpuno razjanjen. Za sada se zna da editovanje

Alu sekvenci u 3'-UTR-ovima Pol II transkripata moe dovesti do reprimiranja ekspresije

gena usled nuklearne retencije transkripta. Za inozine u dvolnaanom editovanom regionu

iRNK, sa visokom specifinou vezuje se protein p54nrb.

Postoji ideja da bi i Alu RNK i Pol III, takoe mogle biti supstrat za A-u-I editovanje.

Stvaranjem veeg broja produkata od pre-iRNK prepisane sa jednog gena, alternativno

splajsovanje znaajno poveva diverzitet transkriptoma i proteoma. Preko 90% gena u

genomu oveka podlee alternativnom splajsovanju, u najveem broju sluajeva na tkivno

specifian nain. Alu sekvence u molekulima pre-iRNK doprinose alternativnom splajsovanju.

ak se smatra da su ovakve Alu sekvence bile glavna pokretaka snaga evolucije oveka,

jer su upravo one omoguile da se oprobavaju razliite forme proteina, od kojih su opstale

one sa selektivnom prednou.

Konsenzusna sekvenca Alu RNK sadri vei broj potencijalnih 5'- i 3'-mesta

splajsovanja, kako u sense tako i u antisense lancu (slika 18). Alu sekvnca koja se nalazi u

intronu pre-iRNK ima potencijal da postane deo egzona, ugranjom jednog dela Alu

sekvence u zrelu iRNK (slika 18). Interesantno je da se geni koji sadre Alu element u

33

intronima predominantno altrnativno splajsuju dajui izoformu sa i bez dela sekvence Alu.

Jedna od pre-iRNK koja je dobro pruan primer za ovakvo altenativno splajsovanje je

ADAR2 pre-iRNK. Kao rezultat alternativnog splajsovanja nastaje proteinksa izoforma koja

ima dodatnih 40 aminokiselina.

Slika 18. Alu sekvence u iRNK i alternativno splajsovanje. a) Shematski prikaz potencijalnih mesta splajsovanja. Strelice iznad elementa ALu oznavaju potencijalna 5'-mesta splajsovanja, a ispod 3'-mesta splajsovanja. b) Egzonizacija Alu RNK, do koje je dolo nakon prepoznavanja mesta splajsovanja u elementu Alu.

Poreenjem zastupljenosti editovanja u razliitim tkivima pokazano je da je ono retko

(1%) u krvi, miiima i pankreasu, da je zastupljeno sa 8,2% u prostati, 12,8% u timusu, i

generalno tri puta ee u modanom u odnosu na ostala tkiva. Editovanje A-u-I je mnogo

zastupljenije kod oveka u odnosu na mieve, i 90% ovog poveanja vezano je za editovanje

Alu elemenata u Pol II transkriptima.