Universidad Autónoma “Benito Juárez” De Oaxaca

Facultad de Odontología

Bioquímica

Cinética Enzimática

mayo de 2010

GENERALIDADES

as ENZIMAS son catalizadores proteicos que aceleran la velocidad de una reacción. Actúan en condiciones muy

suaves, a temperatura por debajo de 70°C,L con un PH de +- 7.

Tienen un alto Grado De Especificidad, solamente catalizan la reacción en que participa un sustrato o un grupo de sustratos con ciertas características químicas y geométricas comunes.

Sustrato es una molécula sobre la que actúa una enzima

El sustrato se une al sitio activo de la enzima, y se forma un complejo transformado en enzima-sustrato.

El sustrato por acción de la enzima es producto y es liberado del sitio activo, quedando libre para recibir otro sustrato.

ESPECIFICIDAD, SITIO ACTIVO Y GRUPOS CATALÍTICOS

Las enzimas se unen a los sustratos por medio de interacciones hidrofóbicas y electrostáticas, puentes de hidrógeno y fuerzas de van der Waals.

Los residuos de aminoácidos de la enzima que participan en la interacción con el sustrato están alejados unos de otros; pero como resultado de la unión del plegamiento de la proteína, se agrupan para formar el sitio activo de la enzima. Algunos residuos participan solo en la unión del sustrato y definen una región del sitio activo que se llama sitio de fijación o de unión de los sustratos.

Los catalíticos (residuos), se encargan de la transformación del sustrato en producto. Normalmente, el número de residuos que intervienen en la unión del

sustrato es mayor que el de residuos catalíticos.

Debido al plegamiento de la proteína, su localización se encuentra en los surcos o huecos de la superficie de la encima.

COMPLEJO ENZIMA-SUSTRATO

La unión del sustrato a la enzima se puede explicar por medio de dos mecanismos:

Modelo De La Llave Y La Cerradura

Considera que el sitio activo de la enzima está preformado, de tal manera que los residuos de aminoácidos mantienen una posición fija y complementaria a los grupos del sustrato.

La lisozima presente en las lagrimas es capaz de hidrolizar uno de los polisacáridos presentes en las paredes bacterianas, es uno de los pocos casos que se adapta a este modelo.

Modelo Del Ajuste Inducido

Se propone que al interactuar el sustrato con la enzima se inducen cambios conformacionales en ésta, que dan lugar a la formación del sitio activo.Se ha dicho que la enzima asemeja a un guante vacio, y la presencia del sustrato equivale a introducir la mano en el guante, con lo que da la forma precisa al sitio activo.

NOMENCLATURA DE LAS ENZIMAS

El sistema de nomenclatura de la Unión Internacional de Bioquímica (UIB) clasifica a las enzimas con base en la reacción química que catalizan.

Liasas Catalizan la rotura de enlaces de C-C, C-O, C-N, C-S, formando doble enlace.Desidratasa, Anhidrasa carbónica.

Isomerasas

Catalizan las interconversiones de un isómero óptico.Fosofoglucomutasa, Isomerazas.

Ligasas Utiliza la energía de la Hidrólisis del ATP, para formar un enlace entre dos moléculas separadas Piruvato carboxilasa, DNA ligasa

Oxidorreductasas

Catalizan la transferencia de electrones o átomos entre diferentes sustratos.Deshidrogenasas, Peroxidasas

Transferasas

Catalizan la transferencia de otros grupos de electrones, con C, N, P, S, de un sustrato a otro.Hexocinasa, Transaminasa

HidrolasasCatalizan la ruptura de un enlace por medio de la introducción de una molécula de agua.Fosfatasa alcalina, Tripsina, Amidasas

CINÉTICA ENZIMÁTICA

VELOCIDADES INÍCIALES

Antes de comenzar con el estudio de la cinética enzimática es conveniente aclarar el significado de VELOCIDAD INICIAL de una reacción.

Se muestra la aparición del Producto (P) en Función del Tiempo (t). En los primeros minutos, la formación del producto es lineal. En esta región se obtiene la velocidad inicial de reacción.

En tiempos más largos se desvía, se puede deber a que la concentración de sustrato disminuye en forma apreciable, a que la enzima se inhibe con el producto conforme pasa el tiempo.

Por tanto, cuando se realiza un estudio de cinética enzimática, es fundamental que las velocidades que se obtienen sean las iníciales.

ORDEN DE LA REACCIÓN

Segundo Orden La velocidad Inicial en una reacción en que participan 2 reactantes depende de la concentración de cada uno de ellos y de su tendencia inherente a reaccionar.

Si se mantienen constantes las condiciones de la reacción, pero se duplica la concentración de uno de los reactantes. Ocurre lo mismo en la velocidad de reacción si se duplica la concentración del otro reactante.

Se trata de un caso en que la velocidad de reacción es proporcional a la concentración de las dos reactantes.

Primer Orden

La velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de solamente uno de los reactantes y su tendencia inherente a reaccionar.En el caso, en que una reacción se descompone en 2 productos; o bien, una reacción en la que uno de los reactantes es el agua y el otro esta disuelto en el agua.

La adición de más reactantes disuelto en el agua aumentará proporcionalmente la velocidad de reacción. Orden Cero

Tiempo

Prod

ucto

(P)

Pendiente a t = 0

Se refiere las que la velocidad de la reacción es independiente de la concentración de reactantes.

MODELOS EN CINÉTICA ENZIMÁTICA

Con el modelo se puede predecir el comportamiento de la enzima en otras condiciones experimentales.

MODELO CINÉTICO DE MICHAELIS-MENTEN

En este modelo se inicia con la suposición de que las reacciones catalizadas por una enzima procede en dos etapas.

Para explicar la relación observada entre la velocidad inicial (v0) y la concentración inicial de sustrato ([S]0) Michaelis y Menten propusieron que las reacciones catalizadas enzimáticamente ocurren en dos etapas:

~En la primera etapa se forma el complejo enzima-sustrato (ES).~En la segunda, el complejo enzima-sustrato da lugar a la formación del producto (P), liberando el enzima (E) libre:

Se puede distinguir entre enzima libre (E) y enzima unido al sustrato (ES), de forma que la concentración total de enzima, [ET], (que es constante a lo largo de la reacción) es:

[ET] = [E] + [ES]

Como [E] = [ET] - [ES], resulta que: v1= k1[S] [ET] - k1 [S] [ES]

Este modelo cinético adopta la hipótesis del estado estacionario, según la cual la concentración del complejo enzima-sustrato es pequeña y constante a lo largo de la reacción (Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formación del complejo enzima-sustrato (v1) es igual a la de su disociación (v2+ v3):

v1 = v2 + v3

Además, como [ES] es constante, la velocidad de formación de los productos es constante:

v = v3 = k3 [ES] = constante.

Como v1=v2+v3, podemos decir que:

k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que:

Siendo:

En donde la expresión (k2+k3)/k1 se ha sustituido por KM, o constante de Michaelis-Menten.

Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formación del producto es:

v =v3 = k3 [ES] =

Para cualquier reacción enzimática, [ET], k3 y KM son constantes. Vamos a considerar dos casos extremos:

• A concentraciones de sustrato pequeñas ([S] << KM), v = (k3 [ET]/KM) [S].

Como los términos entre paréntesis son constantes, pueden englobarse en una nueva constante, kobs, de forma que la expresión queda reducida a: v = kobs [S], con lo cual la reacción es un proceso cinético de primer orden.

• A concentraciones de sustrato elevadas ([S] >> KM), v = k3 [ET].

La velocidad de reacción es independiente de la concentración del sustrato, y por tanto, la reacción es un proceso cinético de orden cero. Además, tanto k3

como [ET] son constantes, y nos permite definir un nuevo parámetro, la velocidad máxima de la reacción (Vmax): Vmax = k3 [ET], que es la velocidad que se alcanzaría cuando todo el enzima disponible se encuentra unido al sustrato.

Si introducimos el parámetro Vmax en la ecuación general de la velocidad, (la fórmula recuadrada anteriormente), obtenemos la expresión más conocida de la ecuación de Michaelis-Menten:

Hay enzimas que no obedecen la ecuación de Michaelis-Menten.

Se dice que su cinética no es Michaeliana. Esto ocurre con las enzimas alostéricos, cuya gráfica v frente a [S] no es una hipérbola, sino una sigmoide (Figura).

En la cinética sigmoidea, pequeñas variaciones en la [S] en una zona crítica (cercana a la KM) se traduce en grandes variaciones en la velocidad de reacción.

GRÁFICA DE LINEWEAVER-BURK

Se emplea como herramienta gráfica para calcular los parámetros cinéticos de una enzima.

Su utilidad consiste en que el recíproco de la cinética de Michaelis-Menten es fácilmente representable y que de él emanan mucha información de interés.

Cuyo recíproco es:

La representación gráfica de Lineweaver-Burk permite identificar el KM y Vmax; el punto de corte con el eje de ordenadas es el equivalente a la inversa de Vmax, y el de abscisas es el valor de -1/Km.

INHIBICIÓN

Los inhibidores son moléculas que interactúan con la enzima y disminuye su actividad catalítica.

Tienen gran importancia desde un punto de vista médico, debido a que un buen porcentaje de los medicamentos trabajan como inhibidores de alguna actividad enzimática. Su importancia industrial radica en su uso como pesticidas e insecticidas.

Dentro del campo de la investigación, como herramientas que se usan para indagar el orden de los componentes de una vía metabólica o una estructura y el mecanismo de reacción de una enzima.

Conviene pensar en los inhibidores como herramientas poderosas de gran utilidad y no como moléculas que estorban en un ensayo enzimático.

INHIBICIÓN COMPETITIVA

La característica más importante de este tipo de inhibición es que el sustrato y el inhibidor son mutuamente excluyentes.

Generalmente, se encuentra que el inhibidor es una molécula con estructura similar a la del sustrato.

Sin embargo también se puede dar el caso de que el inhibidor sea estructuralmente diferente al sustrato y que, al interactuar con otro sitio diferente de la enzima, induzca un cambio conformacional que modifique el sitio para el sustrato.

INHIBICIÓN NO COMPETITIVA

Es un tipo de inhibición que reduce la tasa máxima de una reacción química (Vmax) sin cambiar la afinidad aparente de unión del catalizador por el sustrato.La inhibición no competitiva normalmente se aplica a enzimas, y difiere de la inhibición competitiva en que el inhibidor siempre se une a la enzima por un sitio diferente al centro activo de la enzima.

Esto afecta a la tasa de la reacción catalizada por la enzima ya que la presencia del inhibidor produce un cambio en la estructura y la forma de la enzima.

En este tipo de inhibición, no hay competición entre en inhibidor y el sustrato, así que incrementar la concentración del sustrato no produce un aumento de la tasa de actividad enzimática.

INHIBICIÓN ACOMPETITIVA

En la inhibición acompetitiva, el inhibidor sólo se une al complejo enzima – sustrato, y no a la enzima libre.

La adicción de más sustrato a la reacción da lugar a un aumento de la velocidad de reacción, pero no hasta el grado que se observa en las reacciones sin inhibir. La inhibición acompetitiva suele observarse en las reacciones en las que las enzimas unen más de un sustrato.

INHIBICIÓN IRREVERSIBLE

Los inhibidores irreversibles normalmente se unen covalentemente a la enzima, con frecuencia a una cadena lateral del lugar activo.

EFECTO DEL PH

El pH no afecta la actividad enzimática directamente sino que modifica la concentración de protones.

Los protones además de alterar la estructura de la enzima y el sustrato, pueden participar también en la reacción como sustrato o producto. En esos casos, la concentración de protones afecta directamente la velocidad de la reacción.

Cualquier cambio brusco de pH, sabiendo que las enzimas son proteínas, puede alterar el carácter iónico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando así las propiedades catalíticas de una enzima.

A pH alto o bajo se puede producir la desnaturalización de la enzima y en consecuencia su inactivación.

La concentración de ion hidrógeno afecta a las enzimas de diversas formas.

En primer lugar la actividad catalítica está relacionada con el estado iónico del lugar activo. Las variaciones de la concentración de ion hidrógeno pueden afectar a la ionización de los grupos de lugar activo.

En segundo lugar, los cambios de los grupos ionizables pueden alterar la estructura terciaria de la enzima. Los cambios drásticos del pH frecuentemente conducen a la desnaturalización. La mayoría de las enzimas son activas dentro de un intervalo estrecho de PH. Por esta razón. Los seres vivos emplean amortiguadores para regular estrechamente el pH. El valor de pH al que la actividad de una enzima es máxima se denomina pH óptimo, y varía considerablemente según la enzima.

Efecto De La Temperatura

Cuando se estudia la velocidad de una reacción química en función de la temperatura, y en ausencia de una enzima, se observa un incremento de la velocidad conforme se aumenta la temperatura. Se debe a dos razones:

a. Al incremento en el número de choques por unidad de tiempo, debido al aumento en la energía cinética de las moléculas con la temperatura.

b. Al aumento en el número de moléculas con la energía de activación adecuada para que el choque entre los reactivos sea productivo.

Cuando la reacción está catalizada por una enzima, es más complejo, y presenta un aumento de la actividad.

El aumento inicial en la velocidad se debe las dos razones expuestas. Sin embargo conforme la temperatura aumenta, la energía térmica de la cadena polipeptídica crece y predomina sobre las fuerzas que mantienen la estructura nativa de la enzima.

Debido a la acción conjunta de los factores se produce un máximo en el patrón de actividad contra Temperatura.

A la temperatura asociada a este máximo de actividad, se le ha llamado, erróneamente temperatura óptima.

COOPERATIVIDAD Y ALOSTERISMO

Existen enzimas que no se ajustan al modelo de Michaelis-Menten y que presentan el fenómeno de cooperatividad. Esta puede ser Positiva o Negativa.

El origen de la cooperatividad en un sistema enzimático se encuentra en las interacciones que existen entre los diferentes sitios de unión de la enzima.

Cuando los ligandos son idénticos, la cooperatividad es homotrópica y, si son diferentes, es heterotrópica.

La cooperatividad positiva, la unión de un ligado facilita la interacción de la enzima con el siguiente ligando; en la cooperatividad negativa, la unión de un ligando disminuye la afinidad de la enzima por la unión con el siguiente ligando.

Generalmente, las enzimas que presentan el fenómeno de cooperatividad tienen además del sitio activo en donde se une el sustrato, otros sitios, llamados alostéricos.

Una de las principales ventajas que aparecen con la cooperatividad positiva es el incremento de la respuesta de la proteína a los cambios en la concentración de sustrato.