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Charakterisierung einer Polyoltransporterfamilie
aus
Arabidopsis thaliana
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Yvonne-Simone Klepek
aus Fürth
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung: 10. Januar 2007
Vorsitzender der Prüfungskommission: Prof. Dr. E. Bänsch
Erstberichterstatter: Prof. Dr. N. Sauer
Zweitberichterstatter: Prof. Dr. P. Dietrich
Inhaltsverzeichnis
1
Abkürzungen ..............................................................................................................5
1 Zusammenfassung / Summary .............................................................................9
1.1 Zusammenfassung...................................................................................................................... 9
1.2 Summary .................................................................................................................................... 10
2 Einleitung ...........................................................................................................13
2.1 Transportformen des fotosynthetisch fixierten Kohlenstoffs ................................................... 13
2.2 Polyole und ihre Aufgaben im Pflanzenreich .......................................................................... 14
2.3 Pflanzliche Polyoltransporter ................................................................................................... 18
2.4 Zielsetzung dieser Arbeit ......................................................................................................... 23
3 Ergebnisse ...........................................................................................................25
3.1 Ergebnisse für AtPLT5.............................................................................................................. 25
3.1.1 Lokalisierung der Genexpression von AtPLT5 mit Hilfe von Promotor- Reportergen Pflanzen
....................................................................................................................................................... 25
3.1.1.1 Auswertung der AtPLT5-Promotor-GFP Pflanzen ............................................................ 25
3.1.1.2 Auswertung der AtPLT5-Promotor-GUS Pflanzen ............................................................ 26
3.1.2 Funktionelle Charakterisierung der Polyoltransportproteine in Saccharomyces cerevisiae 28
3.1.2.1 Heterologe Expression von AtPLT5 in Saccharomyces cerevisiae und funktionelle
Charakterisierung über Aufnahmemessungen.............................................................................. 28
3.1.2.2 Aufnahmemessungen........................................................................................................ 29
3.1.3 Heterologe Expression in Xenopus laevis Oozyten und elektrophysiologische
Untersuchungen an AtPLT5-exprimierenden Oozyten ................................................................. 34
3.1.4 Lokalisierung des AtPLT5 Proteins ...................................................................................... 37
3.1.4.1 Überprüfung der Antiseren in AtPLT5-exprimierenden Hefen .......................................... 37
3.1.4.2 Immunozytologische Analysen von AtPLT5 in Hefedünnschnitten................................... 40
3.1.4.3 Immunolokalisation von AtPLT5 in Dünnschnitten verschiedener Gewebe von Arabidopsis
thaliana col wt................................................................................................................................ 41
3.1.5 Bestimmung der AtPLT5 Transkriptmenge in verschiedenen Geweben von Arabidopsis
thaliana durch Real Time PCR...................................................................................................... 41
3.1.6 Subzelluläre Lokalisierung von AtPLT5 in Pflanzenzellen ................................................... 43
3.1.7 Physiologische Charakterisierung von AtPLT5 über Analyse einer AtPLT5 T-DNA
Insertionsmutante .......................................................................................................................... 45
3.1.7.1 Phänotypische Untersuchungen unter verschiedenen Stressbedingungen ..................... 46
3.1.7.2 Affymetrix-Chip Analysen mit salk_050162....................................................................... 48
3.2 Charakterisierung von AtPLT1 und AtPLT2 ........................................................................... 50
3.2.1 Untersuchung der zeitlichen Expression von AtPLT1 und AtPLT2 im Pollen...................... 50
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
2
3.2.2 GUS Färbung und Einbettung in Technovit von Stängelgewebe der AtPLT1- und AtPLT2-
Promotor-GUS Pflanzen............................................................................................................... 52
3.2.3 Subzelluläre Lokalisierung von AtPLT1 und AtPLT2 ........................................................... 53
3.2.4 Funktionelle Charakterisierung von AtPLT2 durch heterologe Expression in Saccharomyces
cerevisiae....................................................................................................................................... 56
3.2.4.1 Aufnahmemessungen........................................................................................................ 57
3.2.4.2 Einfluss von Kompetitoren auf die Sorbitaufnahme in YKY2 ............................................ 62
3.2.4.3 pH Abhängigkeit des AtPLT2 Transports in YKY2........................................................... 64
3.2.4.4 Einfluss der Hemmstoffe CCCP und PCMBS .................................................................. 65
3.2.4.5 Km-Wert Bestimmung für AtPLT2 für Xylit, Glukose und Sorbit ....................................... 67
3.2.5. Heterologe Expression von AtPLT1 und AtPLT2 in Xenopus laevis Oozyten und
elektrophysiologische Untersuchungen......................................................................................... 69
3.2.6. Lokalisierung des AtPLT1 und AtPLT2 Proteins ................................................................ 71
3.2.6.1 Überprüfung der Antiseren in AtPLT2-exprimierenden Hefen .......................................... 72
3.2.6.2 Immunozytologische Analysen von AtPLT1 und/oder AtPLT2 in Hefedünnschnitten ...... 73
3.2.6.3 Immunolokalisation von AtPLT1 und/oder AtPLT2 in Dünnschnitten verschiedener
Gewebe von Arabidopsis thaliana col wt....................................................................................... 74
3.2.7 RNA Interferenz für AtPLT1_2 und AtPLT1_5 ..................................................................... 75
3.3 Ergebnisse für AtPLT4.............................................................................................................. 82
3.3.1 Subzelluläre Lokalisierung von AtPLT4................................................................................ 82
3.3.2 Funktionelle Charakterisierung von AtPLT4 durch heterologe Expression in Saccharomyces
cerevisiae....................................................................................................................................... 84
3.3.2.1. Einfluss von Kompetitoren auf die Glukoseaufnahme inYKY11 ...................................... 85
3.3.2.2 Aufnahme von radioaktiven Substraten über AtPLT4 ....................................................... 87
3.3.2.3 Km-Wert Bestimmung für AtPLT4 für Fruktose und Xylit.................................................. 88
3.3.2.4 pH Abhängigkeit des AtPLT4 Transports in YKY11......................................................... 91
3.3.2.5 Einfluss der Hemmstoffe PCMBS, CCCP und DNP ........................................................ 93
3.3.3. Heterologe Expression von AtPLT4 in Xenopus laevis Oozyten ....................................... 94
3.3.3.1 Elektrophysiologische Untersuchungen an AtPLT4-exprimierenden Xenopus laevis
Oozyten ......................................................................................................................................... 94
3.3.3.2 Radioaktive Aufnahmemessungen an AtPLT4-exprimierenden Xenopus laevis Oozyten95
3.3.4. Lokalisierung des AtPLT4 Proteins ..................................................................................... 96
3.3.4.1 Überprüfung der Antiseren in AtPLT4-exprimierenden Hefen .......................................... 96
3.3.4.2 Immunozytologische Analysen von AtPLT4 in Hefedünnschnitten................................... 98
3.3.4.3 Immunolokalistaion von AtPLT4 in Dünnschnitten verschiedener Gewebe von Arabidopsis
thaliana col wt................................................................................................................................ 99
4 Diskussion ........................................................................................................101
5 Material und Methoden .....................................................................................115
5.1 Material ..................................................................................................................................... 115
5.1.1 Organismen ............................................................................................................................ 115
Inhaltsverzeichnis
3
5.1.2 Vektoren ................................................................................................................................. 117
5.1.3 Oligonukleotide....................................................................................................................... 118
5.1.4 Lösungen................................................................................................................................ 119
5.1.5 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterial ..................................................................... 123
5.1.6 Antikörper ............................................................................................................................... 125
5.1.7 Geräte..................................................................................................................................... 125
5.1.8 Software ................................................................................................................................. 126
5.1.9 Anzuchtmedien....................................................................................................................... 126
5.2 Methoden.................................................................................................................................. 126
5.2.1 Methoden zur Anzucht der verwendeten Organismen........................................................... 126
5.2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden.......................................................................... 127
5.2.3 Methoden zur Arbeit mit Bakterien ......................................................................................... 127
5.2.4 Methoden zur Arbeit mit Hefen............................................................................................... 128
5.2.5 Methoden zur Arbeit an Arabidopsis thaliana ........................................................................ 129
5.2.6 Methoden zur Arbeit mit Proteinen......................................................................................... 130
5.2.7 Mikroskopische Techniken ..................................................................................................... 130
5.2.8 Methoden zur heterologen Expression in Xenopus laevis Oozyten....................................... 131
6 Literaturverzeichnis ..........................................................................................133
7 Anhang ..............................................................................................................143
8 Lebenslauf .........................................................................................................155
9 Danksagung.......................................................................................................157
10 Publikationen ..................................................................................................158
4
Abkürzungen
5
Abkürzungen
A Adenin AB Antibiotikum Ac Acetat ADP Adenosindiphosphat AFGN Arabidopsis Functional Genomics Network AgMAT Apium graveolens Mannittransporter Akt Aktin Amp Ampicilin as antisense (Gegenstrang) AS Aminosäure(n) ATP Adenintriphosphat AtPLT Arabidopsis thaliana Polyoltransporter AtSTP Arabidopsis thaliana Monosaccharidtransporter AtSUC Arabidopsis thaliana Saccharosetransporter APS Ammoniumpersulfat BAR Bastaresistenz BASTA Handelsname für Glufosinat-Ammonium bp Basenpaar(e) BSA Rinderserumalbumin (bovine serum albumin) C Cytosin ca circa CAA Casaminoacids CaMV Cauliflower mosaic virus CCCP Carbonylcyanid-m-Chlorophenylhydrazon cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure (copy desoxy ribonucleic acid) CDS Kodierende Sequenz (coding sequence) cm Zentimeter col wt Ökotyp Columbia Wildtyp cpm counts per minute cRNA komplementäre Ribonukleinsäure (copy ribonucleic acid) d Tag(e) Da Dalton DEPC Diethylpyrocarbonat DMF N, N-Dimethylformamid DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxyribonucleic acid) DNase Desoxyribonuklease DNP 2,4-Dinitrophenol dNTP Desoxyribonukleotidtriphosphat DTT Dithiothreit E. coli Escherichia coli EDTA Ethylendiamintetraacetat EM Endomembranen ER Endoplasmatisches Retikulum EtOH Ethanol FG Frischgewicht FITC Fluoresceinisothiocyanat g Gramm gDNA genomische/chromosomale DNA x g x Erdbeschleunigung
Abkürzungen
6
G Guanin Gent Gentamycin GFP grün fluoreszierendes Protein Glk Glukose GM Gesamtmembranen GUS β-Glukoronidase GZ Geleitzellen h Stunde (hour) H+ Proton HAc Essigsäure HEPES 4-(2-Hydroxyethyl-)1-Piperazin-Ethansulfonsäure IgG Immunglobulin G IPTG Isopropyl-β-D-thiogalaktosid KAN Kanamycin Kbp Kilobasenpaare KLSM Konfokales Laserscanningmikroskop Km Michaelis-Menten Konstante k.o. knock out KT Kurztag l Liter LB Left Border Leu Leucin LT Langtag M molar (mol/Liter) m Mili µ Mikro Mat mating type MCS multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site) MdSOT Malus domestica Sorbittransporter MES 2-(N-Morpholino)- Ethansulfonsäure MFS major facilitator superfamily min Minute(n) MIPS Genkennung mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger ribonucleic acid) MSMO Musharige and Skoog Basal Salts with minimal Organics MST Monosaccharidtransporterfamilie MUG 4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronid myc-Tag Affinitäts-Etikett, Epitop des Immunglobulins 9E10 nA Nanoampere NAD Nikotinamidadenindinukleotid nm Nanometer NMG-Cl N-Methylglucamine-Chlorid nmol Nanomol nos Nopalinsynthese Nr. Nummer OD optische Dichte ORF offener Leserahmen (open reading frame) Osm Osmolarität (Osmotisch aktive Teilchen pro Liter) P Phosphat PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese p.c. gepackte Zellen (packed cells) PCMBS p-Chloromercurybenzsulfonsäure PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction) PcSOT Prunus cerasus Sorbittransporter PEG Polyethylenglykol Pen Penicillin
Abkürzungen
7
Pi Proteaseinhibitor PIG Particle Inflow Gun PIPES Piperazin-N-N’-bis(2-Ethansulfonsäure) PM Plasmamembran PmPLT Plantago major Polyoltransporter psi pound per square inch (amerik. Druckbezeichnung; 1 bar = 14,5 psi) RB Right Border Rif Rifampicin RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid) RNAi RNA-Interferenz RNase Ribonuklease ROS Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species) rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute) RT Raumtemperatur RT-PCR reverse Transkriptase-Polymerasekettenreaktion RT-Reaktion reverse Transkriptase Reaktion sec Sekunde (second) s sense (Sinnstrang) SDS Natrium-dodecylsulfat (sodium-dodecylsulfate) SE Siebelemente SEM simple and efficient method STABW Standardabweichung STP Zuckertransportprotein (sugar transport protein) Strep Streptomycin SUC Saccharosetransportprotein (sucrose carrier) SZ Schließzellen T Thymin TF Transkriptionsfaktor T-DNA Transfer-DNA TEMED N,N,N´,N´-Tetrametrylendiamin Tris Trihydroxymethylaminomethan Trp Tryptophan U Unit Enzymaktivität oder Uracil ÜN über Nacht Ura Uracil UTR nicht-translatierter Bereich (untranslated region) UV Ultraviolett vmax Maximalgeschwindigkeit Vol Volumen wt Wildtyp X-Gal 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galaktopyranosid X-Gluc 5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Glukuronid
8
Zusammenfassung / Summary
9
1 Zusammenfassung / Summary
1.1 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit stand die Charakterisierung von sechs Mitgliedern der
Monosaccharidtransporter Superfamilie (MST-like superfamily) aus Arabidopsis thaliana im
Mittelpunkt. Die sechs Proteine zeigen auffallend hohe Homologie zu bereits identifizierten
Sorbit/Mannittransportern aus Sellerie, Plantago und Sauerkirsche. Sellerie und Plantago
transportieren in ihren Leitbündeln beträchtliche Mengen an Mannit oder Sorbit, in
Sauerkirsche ist Sorbit ein primäres Photosyntheseprodukt und wird in der Frucht
angereichert. Arabidopsis transloziert im Phloem hauptsächlich Saccharose und geringe
Mengen Raffinose, aber kein Mannit oder Sorbit. In dieser Arbeit sollten die Polyltransporter
AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 und AtPLT5 bezüglich ihrer Substratspezifität und ihrer kinetischen
Eigenschaften untersucht werden. Weiterhin sollte die intrazellulare und gewebespezifische
Lokalisierung sowie letztendlich die physiologische Relevanz geklärt werden.
In den heterologen Expressionsystemen Saccharomyces cerevisiae und Xenopus laevis
Oozyten konnte für AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 und AtPLT5 ein breites Substratspektrum für
Polyole wie Sorbit, Xylit oder Inosit sowie für Hexosen wie Fruktose und Glukose und für
Pentosen wie Ribose und Xylose ermittelt werden. Auch Glyzerin und Galaktose wurde von
AtPLT1, AtPLT2 und AtPLT5 in geringen Mengen aufgenommen. Die Km-Werte lagen für
alle getesteten Substrate im mM Bereich. Für AtPLT5, später auch für AtPLT1 und AtPLT2,
konnte in Xenopus Oozyten ein Protonen-Symport Mechanismus bestätigt werden. Damit ist
AtPLT5 das erste pflanzliche Membranprotein, für das ein aktiver Transport von Ribose und
Glyzerin über die Plasmamembran gezeigt werden konnte. Ob der Substrattransport von
AtPLT4, dessen pH Optimum bei 7,0 liegt, als erleichterte Diffusion erfolgt bleibt noch zu
klären.
Aufnahmemessungen, immunozytologische Untersuchungen an AtPLT-exprimierenden
Hefen sowie transiente Expression in Arabidopsis thaliana, Tabak und Zwiebel lokalisierten
AtPLT1, AtPLT2 und AtPLT5 in der Plasmamembran. AtPLT4 konnte vor allem im ER und im
Golgi lokalisiert werden. Durch Real Time PCR und Promotor-Reportergenanalysen konnte
die Expression von AtPLT5 in Wurzeln, innerhalb der Leitbündel von jungen bzw.
seneszenten Blättern und in Blütenblättern nachgewiesen werden. In Wurzeln könnte
AtPLT5 für die Energieversorgung oder die Anreicherung von Sorbit als Osmolyt zuständig
Zusammenfassung / Summary
10
sein. Hinsichtlich des Expressionsmusters nach Wundinduktion, in seneszenten Blättern und
in Wurzeln ist von einer zentralen Rolle bei der Versorgung von Sinkgeweben mit Glukose,
Fruktose und anderen Monosacchariden auszugehen. Microarray Analysen ergaben eine
Reprimierung der Galaktinol-Synthase in AtPLT5 Verlustmutanten. Möglicherweise spielt
AtPLT5 für die Anlieferung von Edukten, die für die Raffinosesynthese benötigt werden, eine
wichtige Rollle. Die Edukte der Raffinosesynthese, Galaktose und myo-Inosit, gehören zum
Substratspektrum von AtPLT5.
AtPLT1 und AtPLT2 werden hauptsächlich im Pollen exprimiert. AtPLT2 wird im
ungekeimten sowie im gekeimten Pollen und im Pollenschlauch exprimiert, AtPLT1 wird
dagegen nur exprimiert, wenn der Pollen bereits auskeimt. Die physiologische Rolle von
AtPLT1 und AtPLT2 könnte demnach in der Versorgung des Pollenschlauches mit
Kohlenhydraten liegen, da im wachsenden Pollenschlauch eine ausreichende
Energieversorgung gewährleistet sein muss. Außerdem wurden AtPLT1 und AtPLT2 und
deren Promotoraktivitäten im Kambium von Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Durch die
hohe Zellteilungsaktivität im Kambium, werden in diesem meristematischen Gewebe
Kohlenhydrate zur Energieversorgung sowie zum Zellwandaufbau benötigt. AtPLT1 und
AtPLT2 transportieren vor allem Xylit, das für den Aufbau von Zellwandkomponenten
(Xyloglukanen) verwendet werden kann. Alle untersuchten AtPLT Verlustmutanten zeigten
unter normalen Wachstumsbedingungen sowie unter Stressbedingungen keine
phänotypischen Unterschiede im Vergleich zum Wildtyp.
1.2 Summary
The focus of the present work was the characterization of six members of the
monosaccharide transporter-like (MST-like) superfamily from Arabidopsis thaliana. The six
genes encoding putative polyol transporter show significant homology to known sorbitol and
mannitol transporters from celery, Plantago and sour cherry. Celery and Plantago transport
significant amounts of mannitol and sorbitol in their vascular bundles, in sour cherry sorbitol
is a primary photosynthetic product and accumulates in fruit. In contrast Arabidopsis
translocates mainly sucrose in the phloem and only small amounts of raffinose, but no
mannitol or sorbitol. In the present thesis the substrate specifity and the kinetic properties of
AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 and AtPLT5, their subcellular and tissue-specific localization and
ultimately their physiological relevance were to be elucidated.
Zusammenfassung / Summary
11
In the heterologous expression systems baker’s yeast and Xenopus laevis oocytes a broad
range of polyols, e.g. sorbitol, xylitol or myo-inositol, and hexoses, e.g. fructose and glucose
and pentoses, e.g. ribose, were found to be substrates for AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 and
AtPLT 5. A very low uptake rate was determined for glycerol and galactose. The Km-values
for all substrates tested were in the mM range.
For AtPLT5, AtPLT1 and AtPLT2, a proton-symport mechanism could be confirmed in
Xenopus oocytes. Thus, AtPLT5 was shown to be the first plant membrane protein to
facilitate active transport of ribose and glycerol across the plasma membrane. Consistently,
the pH-optimum for these transporters is in the acidic range. In contrast, the pH-optimum for
AtPLT4 is at pH 7.0. It is still unclear if AtPLT4 mediates facilitated diffusion.
Uptake experiments, immunocytological studies with AtPLT-expressing yeasts and transient
expression in Arabidopsis thaliana, tobacco and onion localized AtPLT1, AtPLT2 and AtPLT5
to the plasma membrane. AtPLT4 is localized to ER or Golgi apparatus. Expression of
AtPLT5 in roots, within the vasculature of young and senescent leaves, and in sepals was
demonstrated by Real Time PCR and promoter-reporter gene assays. AtPLT5 could be
responsible for energy supply and accumulation of sorbitol as osmolyte in roots. Regarding
the expression pattern after wound induction and in senescent leaves, an important role in
the supply of glucose, fructose and other monosaccharides to sink tissues can be inferred.
Microarray analysis showed the repression of a galactinol-synthase in AtPLT5-k.o. mutants.
Probably this could imply a role in the supply of major components that are required for
raffinose synthesis. Galactose and myo-inostol, the major components of the raffinose
synthesis, are also substrates for AtPLT5. AtPLT1 and AtPLT2 are expressed mainly in
pollen and in the pollen tube. AtPLT2 is expressed in ungerminated and germinated pollen
as well as in pollen tube, whereas AtPLT1 is only expressed when the pollen already started
to germinate. The physiological role of AtPLT1 and AtPLT2 is probably the supply of the
pollen tube with carbohydrates, since a sufficient energy supply must be ensured in the
growing pollen tube. Furthermore, these proteins and their promoter activities were localized
to the cambium of Arabidopsis thaliana. Due to the high cell division activity in this
meristematic tissue, carbohydrates are needed for energy supply and cell wall assembly.
The favorite substrate for AtPLT1 and AtPLT2 is xylitol, which can therefore be used for the
buildup of cell wall components like xyloglucans. Under normal growth conditions and under
stress conditions all AtPLT-k.o. mutants examined showed no differences in growth
compared to the wild type.
12
Einleitung
13
2 Einleitung
Höhere Pflanzen sind autotrophe Organismen, die durch den Prozess der Fotosynthese
Kohlenstoff in Form von CO2 fixieren und für den Aufbau organischer Verbindungen nutzen.
Dies geschieht in den chloroplastenhaltigen Mesophyllzellen grüner Blätter, die als
Sourcegewebe bezeichnet werden, da sie sich selbst und andere Gewebe mit
Kohlenhydraten versorgen können. Neben den Kohlenhydrat-synthetisierenden Geweben
gibt es die heterotrophen Sinkorgane, die auf eine externe Versorgung mit Kohlenhydraten
angewiesen sind. Dazu gehören Wurzeln, Blüten, aber auch junge Blätter, die zwar
fotosynthetisch aktiv sind, jedoch für ihre Eigenversorgung nicht in ausreichendem Maße
CO2 fixieren können (Taiz Zeiger, 1998). Um die Kohlenstoffversorgung der Sinkorgane zu
gewährleisten, verfügen Pflanzen über Leitgefäße (Phloem), das den Langstreckentransport
der Fotosyntheseprodukte von Source nach Sink bewerkstelligt. Das Phloem wird aus
Siebelementen und Geleitzellen gebildet, die durch zahlreiche Plasmodesmata miteinander
verbunden sind (Behnke, 1989). Die Siebelemente stellen die eigentlichen Leitbahnen dar
und besitzen deshalb nur noch sehr wenige Zellorganellen. Die lebenswichtige Versorgung
der Siebelemente mit Proteinen oder anderen Metaboliten übernehmen die Geleitzellen, die
in vollem Maße zur Proteinsynthese befähigt sind (Behnke, 1989). Die Beladung des
Phloems mit Stoffwechselprodukten kann entweder symplastisch oder apoplastisch erfolgen
(Turgeon, 1989; Giaquinta, 1983). Bei den symplastischen Beladern (z.B. Cucurbitaceae,
Lamiaceae) ist der Siebelement-Geleitzellenkomplex (SE/GZ) durch Plasmodesmata mit den
umliegenden Mesophyllzellen verbunden (Oparka und Turgeon, 1999). Apoplastische
Belader, z.B. Arabidopsis thaliana, besitzen einen Siebelement-Geleitzellenkomplex, der von
den umgebenden Zellen symplastisch isoliert ist und eine eigene physiologische Einheit
darstellt (Gamalei, 1998; Truernit und Sauer, 1995; Stadler und Sauer, 1996). Für diese Art
der Phloembeladung sind Transportproteine nötig, die die Kohlenstoffverbindungen, die von
den produzierenden Zellen an den Apoplasten abgegeben wurden, in die Geleitzellen
importieren (Haritatos et al., 2000).
2.1 Transportformen des fotosynthetisch fixierten Kohlenstoffs
Die am weitesten verbreitete Transportform des während der Fotosynthese fixierten
Kohlenstoffs ist Saccharose, die sich durch ihre chemisch inerte Eigenschaft hervorragend
als Transportzucker eignet. In vielen Pflanzen, wie zum Beispiel in Arabidopsis thaliana, wird
Einleitung
14
Saccharose unter Energieverbrauch durch Symport mit Protonen aktiv aus dem Apoplasten
in den Siebelement-Geleitzellkomplex transportiert (Riesmeier et al., 1992). Im Phloem von
Arabidopsis wurden neben Saccharose auch geringe Mengen Raffinose nachgewiesen
(Haritatos et al., 2000). In Cucurbitaceae, Lamiaceae oder bestimmten Scrophulariaceae
fungieren Raffinose und andere Oligosaccharide wie Stachyose und Verbaskose als
Transportzucker, die alle zur Familie der Raffinose-Oligosaccharide gehören (Oparka und
Turgeon, 1999; Zimmermann und Ziegler, 1975). Eine weitere chemisch inerte
Transportform für Kohlenhydrate stellen im Pflanzenreich Zuckeralkohole (Polyole) dar. Ihre
Eigenschaften als niedermolekulare, hochlösliche und nichtreaktive Substanzen erlauben es
den Pflanzen, diese in hohen Konzentrationen anzureichern, ohne dass sie auf den
pflanzlichen Organismus toxisch wirken (Yancey et al., 1982).
2.2 Polyole und ihre Aufgaben im Pflanzenreich
Hydroxylgruppenhaltige Zuckeralkohole wie Sorbit, Mannit, Xylit, und myo-Inosit sind die
reduzierten Formen von Aldosen. Mannit ist der Zuckeralkohol der Mannose, Sorbit der
lineare Zuckeralkohol der Glukose und myo-Inosit ist ein zyklisches Polyol, das durch
enzymatische Umsetzung aus Glukose entsteht. Polyole kommen ubiquitär in bakteriellen,
pflanzlichen und tierischen Organismen vor.
Polyole als Transportform fotosynthetisch fixierten Kohlenstoffs
Vor allem Sorbit kommt in höheren Konzentrationen in verschiedenen Rosengewächsen vor
(Gao et al., 2003). In Pfirsich (Prunus persica) beträgt die Saccharosekonzentration 140 mM,
Sorbit dagegen ist in einer Konzentration von 550 mM im Phloemsaft gemessen worden
(Moing et al., 1997). In Apfel, Aprikose oder Kirsche (alle Rosaceae) ist Sorbit ein primäres
Fotosyntheseprodukt (Noiraud et al., 2001). In Aprikosenblättern beträgt die Menge des
translozierten Sorbits 65-75% des gesamten translozierten Kohlenstoffs (Bieleski und
Redgwell, 1985).
Polyole bei Salzstress
Um das Überleben einer Art zu sichern, sind Organismen gezwungen, sich den ständig
wechselnden Umweltbedingungen anzupassen. Neben Nährstoffmangel (Stickstoff, Kalium,
Phosphat, etc.) sind für Pflanzen die häufigsten abiotischen Stressfaktoren Trockenheit,
Hitze, Kälte, extreme Lichtverhältnisse oder Versalzung der Böden. Standorte mit hohen
Salzkonzentrationen sind Extrembiotope und daher häufig artenarm. Salzpflanzen, auch als
Halophyten bezeichnet, bilden eine ökologisch abgrenzbare Gruppe unter den Höheren
Pflanzen, die vielfältige Strategien entwickelt haben, um Salzbelastungen besser stand zu
Einleitung
15
halten und sich unter diesen Bedingungen entwickeln und fortpflanzen zu können. Neben
vielfältigen Mechanismen zur aktiven Ausscheidung beispielsweise über Absalzhaare bzw. –
drüsen, ist eine interessante Anpassung an Salzstress die Akkumulation organischer
Verbindungen, so genannter Osmolyte oder kompatibler Solute. Diese Substanzen wirken
einem Wasserverlust entgegen und bewahren somit die Pflanzen vor dem Austrocknen
(Strasburger, 2002). Osmolyte besitzen ein geringes Molekulargewicht, sind bei
physiologischem pH Wert elektrisch neutral, aber polar und weisen sich durch eine hohe
Löslichkeit in Wasser aus. Die Bezeichnung kompatible Solute beschreibt die Eigenschaft
der Osmolyte, auch bei hohen zytoplasmatischen Konzentrationen nicht mit dem
Zellstoffwechsel zu interferieren. Osmolyte gehören verschiedenen Stoffklassen an, welche
charakteristisch für die unterschiedliche Salztoleranz der jeweiligen Organismen sind.
Generell können sie in zwei Gruppen eingeteilt werden:
1. Stickstoffhaltige Osmolyte: Aminosäuren wie Glyzin-Betain, Prolin
2. Hydroxylgruppenhaltige Osmolyte: Polyole und Zucker, z.B. Mannit, Sorbit, Saccharose
und Oligosaccharide der Raffinose Familie
Osmolyte können im Zytoplasma akkumuliert werden, ohne dabei toxisch auf die Zelle zu
wirken (Ramanjulu et al., 2002). Durch den intrazellulär erhöhten osmotischen Wert strömt
das Wasser passiv in die Zelle ein und wird über Wasserstoffbrückenbindungen mit den OH-
Gruppen der angereicherten Moleküle in der Zelle gehalten. Bei Wassermangel bewahren
Osmolyte somit die dreidimensionale Struktur von Proteinen, die sonst verloren ginge (Faria
et al., 2003).
Mangroven gehören zu den wenigen Gehölzen mit ausgeprägter Salzresistenz. Um den
vorherrschenden Salzgehalt in ihrem natürlichen Lebensraum tolerieren zu können, scheinen
Mangroven in erhöhtem Maße Mannit anzureichern (Jithesh et al., 2006). Auch Plantago
maritima ist an hohe Salzkonzentrationen gewöhnt: in Pflanzen, die mit Meerwasser
gegossen wurden, konnte in Stängeln und Wurzeln eine vierfache Sorbitakkumulation im
Vergleich zu den Kontrollpflanzen, die mit Leitungswasser gegossen wurden, gemessen
werden (Jefferies et al., 1979).
In Olive (Olea europaea) sind Saccharose und Mannit gleichermaßen primäre
Fotosyntheseprodukte. Nach Salzbehandlung (100 mM NaCl) konnte ein Anstieg der
Mannitkonzentration beobachtet werden. Die Mannitkonzentration lag 10-20% über der der
Kontrollpflanzen und machte in Olive ca. 40% der gesamten löslichen Kohlenhydratmenge
aus (Rejskova et al., 2006).
Einleitung
16
Ein Beispiel für eine in Mitteleuropa kultivierte, Mannit produzierende Pflanze ist Sellerie
(Apium graveolens): mit der Zunahme des Salzgehaltes im Medium stieg auch die
Mannitkonzentration an (Stoop et al., 1996). In Sellerie übernimmt Mannit die Aufgabe eines
Osmolyten, wobei der Mannitstoffwechsel auf die Bedürfnisse der Pflanze abgestimmt ist
(Stoop et al., 1996). Normalerweise werden in Sellerie Mannit und Saccharose in gleichen
Mengen synthetisiert (Davis et al., 1988). Droht die Austrocknung der Pflanze aufgrund eines
hohen Salzgehaltes im Boden, so wird in den Sourceblättern der fixierte Kohlenstoff
hauptsächlich zur Mannitsynthese verwendet, während der Aufbau von Saccharose
weitgehend gehemmt wird. Beispielsweise wird der Saccharosetransporters AgSUT1,
dessen Gen größtenteils in Sourceblättern, in jungen Blättern und in Wurzeln exprimiert wird,
bei Salzstress in Wurzeln reprimiert, so dass der Saccharosetransport unterbrochen ist und
nur noch Mannit zur Osmoregulation synthetisiert wird (Stoop und Pharr, 1994; Noiraud et
al., 2000). Liegt unter Salzstress ein Mangel an Kohlenhydraten vor, wird das zu den
Sinkorganen transportierte Mannit verstoffwechselt, um den Kohlenhydratmangel zu
kompensieren (Stoop et al., 1996).
Auch in nicht-polyolproduzierenden Pflanzen wie Tabak, Arabidopsis und Pappel (Populus
tomentosa) konnten Osmolyte die Salzresistenz tatsächlich erhöhen. Erstmals konnte dies
anhand von transgenem Tabak gezeigt werden (Tarczynski et al., 1992). Normalerweise ist
Tabak salzempfindlich. Tabak, der mit dem Enzym Mannit-1-Phosphat-Dehydrogenase
(mtlD) aus Escherichia coli (Davis et al., 1988) transformiert wurde, akkumulierte Mannit und
wuchs dadurch unter Salzbelastung wesentlich besser als der Wildtyp (Tarczynski et al.,
1992). In mtlD-transformierten Arabidopsis Pflanzen wurde unter Hochsalzbedingungen bei
mtlD Transformanden eine erhöhte Samenkeimungsrate und eine bessere
Salzverträglichkeit als bei Wildtyp Pflanzen, beobachtet (Thomas et al., 1995). Auch die
Überexprimierung von mtlD in Pappel führte zu einer gesteigerten Mannitsynthese, wodurch
transgene Pappelpflanzen 75 mM NaCl im MS-Medium tolerierten, während Wildtyppappeln
nur 25 mM NaCl vertragen konnten (Hu et al., 2005).
Polyole als Antioxidanzien
Polyole spielen auch als Radikalfänger für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) wie
Wasserstoffperoxid, Superoxid- oder Hydroxylradikale eine wichtige Rolle. Diese
aggressiven und extrem reaktionsfreudigen Sauerstoffderivate führen zu Strangbrüchen der
DNA, zur Denaturierung von Proteinen oder Destabilisierung von Membranen (Mundree et
al., 2002; Smirnoff, 1998).
Reaktive Sauerstoffspezies fallen unter anderem als Nebenprodukt einiger regulärer
Stoffwechselwege, wie etwa der Fotosynthese, an (Chen und Murata, 2002). Um sich vor
den negativen Auswirkungen dieser aggresiven Moleküle zu schützen, besitzen Pflanzen
Einleitung
17
bestimmte Enzyme wie Katalasen, Peroxidasen und Superoxiddismutasen. Als nicht-
enzymatische Antioxidanzien stehen Karotinoide, Ascorbat oder Glutathion zur Verfügung
(Mundree et al., 2002). Studien an transgenen Tabakpflanzen haben die Funktion von
Polyolen als Radikalfänger bestätigt. Mannit schützt Phosphoribulokinasen, Thioredoxin,
Ferredoxin und Glutathion vor aggresiven Radikalen (Shen et al., 1997).
Negative Umweltbedingungen wie Trockenheit, niedrige Temperatur in Verbindung mit hoher
Lichtintensität oder Luftverschmutzung begünstigen die Bildung von reaktiven
Sauerstoffspezies (Smirnoff, 1993; Wise, 1995; Melhorn et al., 1994). Auch Pathogenbefall
einer Pflanze bewirkt ein vermehrte Produktion von reaktiven Sauerstoffmolekülen, um eine
Ausbreitung der Pathogene auf andere Pflanzenteile zu unterbinden (Bolwell et al., 2002).
Polyole erleichtern die Aufnahme und Verteilung von Bor
Polyole dienen darüber hinaus der erleichterten Aufnahme und der Mobilität des
anorganischen Spurenelements Bor. Bor ist für Pflanzen lebensnotwendig, jedoch ist es im
Boden in nur sehr geringen Konzentrationen vorhanden. Symptome, die bei Bormangel
auftreten, sind beispielsweise eine gestörte Wurzelelongation oder die Inhibition der
Blattexpansion, da Bor essenziell für die Bildung der Zellwandstruktur ist. Eine reduzierte
Fertilität konnte ebenfalls beobachtet werden (Ishii et al., 2001; Dell und Huang, 1997). Bor
wird von Pflanzen passiv aus dem Boden aufgenommen und über das Xylem zu den
wachsenden Pflanzengeweben wie Blättern transportiert und dort gelagert (Brown et al.,
1999). Maßgeblich sind daran zwei Transportproteine beteiligt. BOR1 ist ein
Plasmamembranprotein in Perizykelzellen der Wurzel (Takano et al., 2002), NIP1;1 ist ein
Mitglied der major intrinsic protein Familie und wurde in der Plasmamembran von
Wurzelkortikalzellen in Arabidopsis lokalisiert (Takano et al., 2006). In den meisten
Pflanzenfamilien ist Bor ein Phloem-immobiles Element. Die Phloem-Mobilität von Bor erhöht
sich in polyolreichen Pflanzen deutlich (Bellaloui et al., 1999; Hu et al., 1997). Beispielsweise
wird Bor in Pfirsich in einem Sorbit-Bor-Sorbit-Komplex und in Sellerie in einem Mannit-Bor-
Mannit-Komplex über das Phloem transloziert. Polyole erleichtern also den Bortransport über
das Phloem, indem sie mit diesem Spurenelement einen löslichen Komplex bilden (Hu et al.,
1997).
In transgenen Tabakpflanzen konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sorbit auf
die Verteilung des Elements erheblichen Einfluss hat. Dazu wurde radioaktive Borlösung
(10B) auf die Blattoberfläche Sorbitol-6-Phosphat-Dehydrogenase exprimierender Tabak-
linien aufgetragen und die Boraufnahme des Blattes massenspektroskopisch bestimmt
(Bellaloui et al., 1999). Hohe Konzentrationen von Sorbit in Blättern korrelierten mit einer
hohen Konzentration an radioaktivem Bor. Die Komplexbildung von Sorbit mit dem
Spurenelement bewirkte eine rasche Aufnahme und Verteilung von Bor aus sich
Einleitung
18
entwickelnden Blättern über das Phloem zu meristematischem Gewebe (Bellaloui et al.,
1999).
Diese Beispiele zeigen, dass Polyole in unterschiedlichen Pflanzen vielfältige Funktionen
wahrnehmen und deshalb für ein gesundes Wachstum benötigt werden. Da Polyole nicht
membrangängig sind, müssen sie von Transportproteinen aktiv durch die Membran
geschleust werden. Zu Beginn der vorliegenden Arbeit konnten verschiedene Sorbit- und
Mannittransportproteine aus Polyol-produzierenden Pflanzen isoliert und beschrieben
werden.
2.3 Pflanzliche Polyoltransporter
Polyoltransporter aus Sellerie, Wegerich, Sauerkirsche und Apfel
Der erste Zuckeralkoholtransporter (AgMAT1; 513 AS) wurde aus Sellerie, einer Mannit
translozierenden, dikotylen Pflanze isoliert und charakterisiert (Noiraud et al., 2001). Zwei
weitere Polyoltransporter, PmPLT1 (529 AS) und PmPLT2 (530 AS), wurden aus Wegerich
(Plantago major) identifiziert (Ramsperger-Gleixner et al., 2004). Die Aminosäuresequenzen
von PmPLT1 und PmPLT2 sind zu 83% identisch, mit AgMAT1 ist PmPLT1 67,5% und
PmPLT2 65,8% identisch (Ramsperger-Gleixner et al., 2004). Wegerich gehört zu den
Sorbit- und Saccharose translozierenden Pflanzen, wobei die Sorbitkonzentration im
Phloemsaft bei etwa 300 mM und die Saccharosekonzentration bei 800 mM liegt (Lohaus et
al., 2002). In Rosaceae, vor allem in der Unterfamilie Pomoideae, ist Sorbit neben
Saccharose ein fotosynthetisches Primärprodukt. In Sauerkirsche (Prunus cerasus) wird vor
allem während der Fruchtentwicklung Sorbit eingelagert, wobei der Sorbitanteil mit
zunehmender Reifung der Früchte ansteigt (Gao et al., 2003). Aus Sauerkirsche konnten
durch Screening einer cDNA Bank zwei Polyoltransporter isoliert werden (PcSOT1 (509AS)
und PcSOT2 (538AS), deren Gene eine deutliche Homologie zu AgMAT1 aus Sellerie
aufweisen. Untereinander sind PcSOT1 und PcSOT2 zu 85% identisch in ihren kodierenden
Regionen, die Aminosäureähnlichkeit liegt bei 76% (Gao et al., 2003).
In Apfel (Malus domestica), einem weiteren Mitglied der Rosaceae, beträgt der Sorbitanteil
des gesamten translozierten Kohlenstoffs 70% (Klages et al., 2001). Watari et al., gelang es,
aus Sourceblättern des Apfels drei cDNAs, MdSOT3, MdSOT4 und MdSOT5, zu isolieren,
die für Sorbittransportproteine kodieren (Watari et al., 2004).
Aus Hydropathieanalysen der Aminosäuresequenz konnten für AgMAT1, PmPLT1, PmPLT2,
MdSOT3 und MdSOT5 12 Transmembranspannen vorhergesagt werden, wobei N- und C-
Einleitung
19
Terminus sowie der zentrale Mittelloop auf der zytoplasmatischen Seite liegen (Noiraud et
al., 2001; Ramsperger-Gleixner et al., 2004; Watari et al., 2004). Für PcSOT1, PcSOT2 und
MdSOT4 postulieren die Autoren nur 11 putative Membranspannen (6+5). Dabei soll der N-
Terminus und die zentrale Schleife auf der zytoplasmatischen und der C-Terminus auf der
extrazellulären Seite liegen (Gao et al., 2003; Watari et al., 2004). Möglicherweise könnte
dieses Ergebnis eine Fehlinterpretation der Hydropathieanalysen sein. Aufgrund ähnlicher
Sequenzmotive können alle identifizierten Polyoltransporter in die major facilitator
superfamily eingeordnet werden (Marger und Saier, 1993).
Heterologe Expression von AgMAT1 in Bäckerhefe und anschließend durchgeführte
Aufnahmemessungen mit radioaktiv markierten Substraten ergaben, dass Mannit mit hoher
Affinität (Km-WertMannit 340 µM) durch AgMAT1 transportiert wird (Noiraud et al., 2001). In
PmPLT1- bzw. PmPLT2-exprimierenden Hefen wurden die Km-Werte für Sorbit bestimmt.
Für PmPLT1 wurde ein Km-Wert von 12 mM ermittelt, der Km-Wert für PmPLT2 scheint
vermutlich um 20 mM zu liegen, jedoch konnte bei den Messungen für PmPLT2 keine
Substratsättigung erreicht werden (Ramsperger-Gleixner et al., 2004).
PcSOT1- und PcSOT2-exprimierende Hefen transportieren spezifisch Sorbit mit einem Km-
Wert zwischen 0,6 mM und 0,8 mM. Die Mannitaufnahmerate war sehr niedrig, sie betrug
nur 3% von der Sorbitaufnahmerate (Gao et al., 2003). Diese hohe Spezifität konnte weder
in Plantago noch in Sellerie beobachtet werden (Ramsperger-Gleixner et al., 2004; Noiraud
et al., 2001). Kompetitionsstudien zeigten, dass Mannit zumindest eine starke hemmende
Wirkung auf den Sorbittransport von PcSOT1 und PcSOT2 hatte (Gao et al., 2003). In
MdSOT3- und MdSOT5-exprimierenden Hefen konnte eine signifikante Sorbitaufnahme
gemessen werden. Der Km-Wert für Sorbit liegt für MdSOT3 bei 0,71 mM und für MdSOT5
bei 3,2 mM, während die Transportaktivität von MdSOT4 nur 1,5mal so hoch wie die der
Negativkontrolle war. Möglicherweise ist die schwache Sorbitaufnahme von MdSOT4 auf
eine veränderte Proteinstruktur durch die fehlende Transmembranspanne zurückzuführen
(Watari et al., 2004). Aus früheren dreidimensionalen Strukturanalysen von
Transportproteinen der MFS Familie war bekannt, dass die Durchlasspore von den
Transmembranspannen 1, 4, 7 und 10 gebildet wird und dies unmittelbaren Einfluss auf die
Substraterkennung ausübt (Hirai et al., 2002; Abramson et al., 2003; Huang et al., 2003).
Die Anwesenheit von Glukose stimulierte in Hefe die Sorbitaufnahme von PmPLT1 und
PmPLT2 durch die Anregung der Plasmamembran-ATPase, was bereits aus früheren
Studien für Saccharosetransporter bekannt war (Ramsperger-Gleixner et al., 2004; Gartz et
al., 1994; Sauer und Stolz, 1994). Die Mannitaufnahme durch AgMAT1 sowie die
Sorbitaufnahme von PcSOT1 und PcSOT2 wurde durch im Überschuss zugegebene
Einleitung
20
Glukose und andere Zuckeralkohole um ca. 40-60% inhibiert (Noiraud et al., 2001; Gao et
al., 2003). Dieses Ergebnis wurde von den Autoren als Artefakt des Hefeexpressionssystems
diskutiert, da die hefeeigene Plasmamembran-ATPase normalerweise durch Glukose
stimuliert wird und so die Substrataufnahme gesteigert wird.
Der Transport aller identifizierten Polyoltransportproteinen unterliegt einer pH Abhängigkeit,
wobei sich die Mannit bzw. Sorbitaufnahme um ca. 50% bei der Erhöhung des pH Werts von
4,5 auf 5,5 verringerte. Ebenso wurde der Mannit- bzw. Sorbittransport aller Proteine durch
den Protonenentkoppler CCCP signifikant inhibiert (Noiraud et al., 2001; Ramsperger-
Gleixner et al., 2004; Gao et al., 2003; Watari et al., 2004). Durch Expression in Xenopus
Oozyten konnte für PmPLT1 und PmPLT2 bestätigt werden, dass es sich um Protonen-
Symporter handelt (Ramsperger-Gleixner et al., 2004). Der SH-Gruppeninhibitor PCMBS
bewirkte bei fast allen Polyoltransportern keine Reduktion der Transportaktivität (Noiraud et
al., 2001; Ramsperger-Gleixner et al., 2004; Gao et al., 2003; Watari et al., 2004). Nur der
Transport von PmPLT1 wurde durch PCMBS gehemmt. Innerhalb einer extrazellularen
Schleife unterscheidet sich PmPLT1 von PmPLT2 in einem zusätzlichen Cystein Rest
(Cys61), der für die Hemmung durch PCMBS verantwortlich ist (Ramsperger-Gleixner et al.,
2004).
Northern Blot Analysen lokalisierten die AgMAT1 mRNA hauptsächlich in Sourceblättern von
Sellerie, aber auch in jüngeren Blättern und im Phloemgewebe von Petiolen war AgMAT1
mRNA nachzuweisen (Noiraud et al., 2001). Frühere Arbeiten von Stoop und Mitarbeitern
zeigten, dass Mannit in den Sourcegeweben synthetisiert wird und dann über den SE/GZ-
Komplex des Phloems zu den Orten des Verbrauchs transloziert wird. Dort kann Mannit die
Aufgaben als Osmolyt (Stoop et al., 1996) oder Antioxidanz (Shen et al., 1997) wahrnehmen.
In planta wurden PmPLT1 und PmPLT2 immunohistochemisch in den Geleitzellen des
Phloems von Sourceblättern lokalisiert. Dieser Lokalisationssort wurde auch in transgenen
Arabidopsis Pflanzen nachgewiesen (Ramsperger-Gleixner et al., 2004). Bei anderen
Vertretern der Gattung Plantago, z.B. Plantago maritima (Ahmad et al., 1979), Plantago
coronopus (Lambers et al., 1981) und Plantago lanceolata (Briens und Lahrer, 1983), wird
Sorbit bei Salzstress akkumuliert. Möglicherweise sind PmPLT1 und PmPLT2 auch in
Plantago major für eine erhöhte Salzresistenz verantwortlich.
Die in Sauerkirsche charakterisierten Sorbittransporter zeigten ein Sink-spezifisches
Expressionsmuster. PcSOT1 wird in Früchten, hauptsächlich im späten Stadium während
der Fruchtentwicklung und in jungen Blättern exprimiert. PcSOT2 hingegen wurde
vornehmlich in einem frühen Stadium der Fruchtentwicklung exprimiert, jedoch nicht in
Blättern (Gao et al., 2003). Das streng regulierte Expressionsmuster der Sorbittransporter in
Sauerkirsche geht offensichtlich mit der Fruchtentwicklung einher und lässt darauf schließen,
Einleitung
21
dass in den Sourcegeweben produziertes Sorbit über das Phloem in die Sinkgewebe gelangt
und dort gespeichert wird (Gao et al., 2003). Sorbit ist höher reduziert als Glukose und ist
daher vom Organismus nicht ohne weiteres metabolisierbar. Es dient somit als
Kohlenstoffspeicher. Die Umsetzung von Sorbit zu Glukose liefert ein Reduktionsäquivalent,
das dann für verschiedene Biosynthesewege verwendet werden kann.
Im Gegensatz zu den Polyoltransportern aus Sauerkirsche wurde die Expression aller
MdSOT RNAs in Sourceblättern und einigen Sinkorganen (Blüten, Sinkblättern und Schoten)
nachgewiesen. Northern Blot Analysen lokalisierten MdSOT3 ausschließlich in
Sourceblättern. Die stärkste Expression von MdSOT4 und MdSOT5 konnte in Blüten
detektiert werden, während in Früchten, Schoten, Sink- und Sourceblättern nur eine
schwache Expression beobachtet werden konnte. In Samen und jungen Früchten war keine
der MdSOT RNAs nachweisbar. Darüber hinaus konnte festgestellt werden, dass die
Expressionsrate von MdSOT4 und MdSOT5 in Blättern mit deren Reife zunimmt, wobei
durch in situ Hybridisierung die Transkriptionsprodukte aller MdSOTs im Phloem der
Leitbündel von Sourceblättern detektiert werden konnten (Watari et al., 2004).
Möglicherweise spielen MdSOT4 und MdSOT5 beim Import von Sorbit in Sinkblätter und
beim Export aus Sourceblätter eine zentrale Rolle.
Polyoltransporter aus Arabidopsis thaliana
Die bereits charakterisierten Polyoltransporter stammen aus Pflanzen wie Sellerie, Wegerich
oder der Familie der Rosaceae, die neben Saccharose Polyole als primäre
Fotosyntheseprodukte synthetisieren und im Phloem translozieren.
In Arabidopsis thaliana konnten im Phloem bislang keine Polyole nachgewiesen werden.
Dennoch gibt es innerhalb des Genoms von Arabidopsis thaliana sechs Gene mit
Sequenzhomologien (50-66%) zu den beschriebenen Polyoltransportern aus Sellerie und
Wegerich. Diese sechs Gene sind die Familie der AtPLTs (Arabidopsis thaliana
Polyoltransporter), deren Merkmale in Tabelle 2.1 zusammengestellt sind. Die AtPLT Familie
wird aufgrund von Sequenzhomologien der Familie der MSTs (monosaccharide
transporterlike superfamiliy) zugeordnet. In Arabidopsis thaliana zählen 53 Gene zu den
MSTs, die wiederum in 7 Familien gemeinsamen Ursprungs eingeteilt werden können.
In Abbildung 2.1 ist der phylogenetische Stammbaum der Monosaccharidtransporter und
deren Verwandten aus Arabidopsis thaliana gezeigt. Diese Transporter besitzen 12
potentielle Membranspannen und zählen zur major facilitator superfamily (MFS; Marger et
al., 1993).
Einleitung
22
Name MIPS gDNA cDNA Introns Protein kDa Isoelektrischer Punkt
AtPLT1 At2g16120 1715 bp 1536 bp 2 511 AS 54,8 9,2
AtPLT2 At2g16130 1722 bp 1536 bp 2 511 AS 55,0 9,4
AtPLT3 At2g18480 1662 bp 1527 bp 1 508 AS 54,8 9,4
AtPLT4 At2g20780 1675 bp 1581 bp 1 526 AS 56,8 5,7
AtPLT5 At3g18830 2210 bp 1620 bp 3 539 AS 58,1 9,6
AtPLT6 At4g36670 1804 bp 1482 bp 1 493 AS 52,9 9,2
Tabelle 2.1: Bezeichnung und Merkmale von AtPLT1, AtPLT2, AtPLT3, AtPLT4, AtPLT5, AtPLT6.
Abbildung 2.1: Phylogenetischer Stammbaum von 53 Zuckertransportern und deren Verwandten aus Arabidopsis thaliana. Für 52 Gene sind die MIPS Nummern angegeben, für T12H1.12 ist keine MIPS Nummer erhältlich. Zusammen bilden die Gene die monosaccharide- transporter-like-superfamily (MST-like superfamily). türkis: vakuoläre Glukosetransporter (AtVGTs); blau: Familie der Monosaccharidtransporter (AtSTPs); gelb: Vakuoläre Transporter (AttMTs); grün: early response to dehydration-Homologe (AtERD6); lila: Glukosetransporter (AtGlcTs); orange: Inosittransporter (AtINTs); (www.mpp-erlangen.de).
AtINTs
AtPLT5
AtPLT1
AtPLT2
AtPLT3
AtSTPs
AtpGlcTs
AttMTs
AtERD6-Homologe
AtPLT6
AtVGTs AtPLT4
Einleitung
23
2.4 Zielsetzung dieser Arbeit
Ziel der vorliegenden Arbeit war die Isolierung, Lokalisierung und funktionelle
Charakterisierung der Polyoltransporterfamilie aus Arabidopsis thaliana, wobei bereits erste
Ergebnisse aus einer Diplomarbeit vorlagen (Klepek, 2003).
Da Arabidopsis thaliana weder Polyole als fotosynthetische Primärprodukte synthetisiert,
noch als salzresistente Pflanze bekannt ist, stellt sich die Frage, warum Arabidopsis thaliana
sechs Gene für Polyoltransporter besitzt.
Um zu untersuchen, welche Substrate von den AtPLT Transportern akzeptiert werden und
wie deren Energetisierung vonstatten geht, sollten die AtPLT cDNAs in den heterologen
Expressionssystemen Bäckerhefe und in Xenopus sp. Oozyten exprimiert werden, um
anschließend radioaktive Aufnahmemessungen sowie elektrophysiologische Studien
durchzuführen. Was könnte die physiologische Aufgabe der transportierten Substrate und
somit der AtPLT Proteine in der Pflanze sein? Es sollte geklärt werden, ob es sich um Sink-
oder Sourcegewebespezifische Transporter handelt, die in verschiedenen Geweben
unterschiedliche Aufgaben erfüllen. Zur Visualisierung des Expressionsmusters sollten
Promotor-Reportergenassays Aufschluss geben, die gewebsspezifische bzw. zelluläre
Lokalisierung der AtPLT Proteine sollte mittels AtPLT-spezifischer Antiseren an
Methacrylatschnitten von Arabidopsis col wt Pflanzen und AtPLT-exprimierenden Hefen
untersucht werden. Transiente Expression der AtPLT cDNAs mit der Particle Inflow Gun und
Protoplastentransformation sollte zur Klärung der subzellulären Lokalisierung beitragen.
Studien an AtPLT Nullmutanten sowie RNAi Pflanzen, die mehrere der sechs Gene
herunterregulieren, sollten weitere Erkenntnisse über die physiologische Funktion der
Transporter liefern.
24
Ergebnisse
25
3 Ergebnisse
Im Rahmen zweier Diplomarbeiten (Klepek, 2003; Volke, 2005) konnten bereits wichtige
Ergebnisse zu den verschiedenen AtPLT Proteinen bezüglich Expression, Lokalisation und
funktioneller Charakterisierung erhalten werden. Vorliegende Arbeit beschäftigt sich
hauptsächlich mit AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 und AtPLT5.
3.1 Ergebnisse für AtPLT5
3.1.1 Lokalisierung der Genexpression von AtPLT5 mit Hilfe von Promotor-
Reportergen Pflanzen
Für die Lokalisierung der Expression des AtPLT5 Gens wurden transgene Pflanzen
hergestellt, die ein AtPLT5-Promotor-GFP bzw. ein AtPLT5-Promotor-GUS Konstrukt
enthielten (Klepek, 2003). Als Promotorregion wurden 1551 bp vor dem Start ATG gewählt
und aus Arabidopsis thaliana col wt amplifiziert. Für die Sequenzierung des gesamten
Arabidopsis thaliana Genoms (The Arabidopsis genome initiative, 2000) wurde der Ökotyp
Columbia Wildtyp verwendet (col wt). Bezüglich der Nukleotidsequenzen aller AtPLT Proteine
bezieht sich diese Arbeit auf die in der Datenbank erhältlichen Sequenzen (vgl. Anhang).
3.1.1.1 Auswertung der AtPLT5-Promotor-GFP Pflanzen
Für den Nachweis des GFP Proteins wurden Blätter von juvenilen AtPLT5-Promotor-GFP
Pflanzen (4-Blatt-Rosettenstadium) sowie Stängel, Blüten und Schoten erwachsener Pflanzen
mit GFP Anregungslicht bestrahlt und mikroskopisch auf GFP Signale untersucht.
Das verwendete, lösliche GFP Protein ist im Kern und im Zytosol lokalisiert. Um dieses
teilweise sehr schwache Signal von gelb-grünen Autofluoreszenzen, die für Pflanzen typisch
sind und durch phenolische Substanzen hervorgerufen werden, wurden stets Wildtyppflanzen
als Negativkontrolle mitgeführt, die keine GFP Fluoreszenz zeigten. Alle 24 unabhängigen,
transgenen Linien zeigten ein GFP Signal in den Wurzelspitzen (Abbildung 3. 1 J).
Ergebnisse
26
Von sieben Pflanzen wurden die Stängel und die Sepalen untersucht. In in fünf von sieben
Pflanzen konnte grüne GFP Fluoreszenz beobachtet werden (Abbildung 3. 1 C). In Blättern
konnte in keinem Entwicklungsstadium der 24 transgenen Linien GFP Fluoreszenz detektiert
werden. Daraufhin wurden einige Blätter durch Zuhilfenahme des konfokalen
Laserscanningmikroskop auf GFP Signale überprüft, jedoch konnte auch in diesem Fall keine
GFP Fluoreszenz identifiziert werden.
3.1.1.2 Auswertung der AtPLT5-Promotor-GUS Pflanzen
Zur Detektion der GUS Aktivität wurden Keimlinge, junge Pflanzen im 8-Blattstadium, Blätter
junger Pflanzen (Rosettenstadium) aber auch Wurzeln, Stängel, Blüten und Schoten
ausgewachsener Pflanzen in einer X-Gluc-haltigen Färbelösung 3-7 Stunden inkubiert
(5.2.7.2). Starke Blaufärbung konnte in den Wurzeln AtPLT5-Promotor-GUS Pflanzen bereits
nach 3 h nachgewiesen werden, wobei nur die Bereiche 100-300 µm hinter der Wurzelspitze
gefärbt waren Nach einer Inkubationszeit von 7 h konnte eine deutliche Blaufärbung der
Leitbündel von größeren Blättern beobachtet werden (Abbildung 3. 1 E, H). Die Expression in
den Leitbündeln der Blätter konnte in 20 von 24 untersuchten Pflanzen festgestellt werden.
Allerdings zeigten einige Pflanzen, die sich zum Zeitpunkt der Untersuchung in einem frühen
Seneszenzstadium befanden, eine deutliche Blaufärbung entlang der Mittelrippe (Abbildung 3.
1 G), andere wiederum eine stärkere Färbung der umliegenden, kleineren Leitbahnen
(Abbildung 3. 1 F). Insgesamt waren Pflanzen im frühen Stadium der Seneszenz in den
peripheren, kleineren Leitbündeln gefärbt. Die Pflanzen, die sich bereits in einem
fortgeschritteneren Seneszenzstadium befanden, trat die GUS Färbung um die Mittelrippe
herum auf. Das Expressionsmuster im Blatt geht also mit der Entwicklung einer Pflanze
einher, das mit dem Prozess der Seneszenz in Verbindung gebracht werden kann.
Die GUS Färbung von Blüten zeigte bei 50% der untersuchten Pflanzen eine Blaufärbung in
den Sepalen und entlang des Stängels (Abbildung 3. 1 A, B). Die andere Hälfte der
untersuchten Pflanzen zeigte GUS Expression an den axillaren Regionen jeder Einzelblüte
(Abbildung 3. 1 A, B, D). Ebenso war eine Färbung der Ovarien zu sehen (Abbildung 3. 1 F).
Abbildung 3. 1 K zeigt eine Nahaufnahme einer voll entwickelten Schote. Vor allem an der
Basis und an der Spitze war die blaue GUS Färbung erkennbar.
Ergebnisse
27
G
F E D
A B C
H
K
L
J I
M
Abbildung 3. 1: GUS- und GFP-Reportergen Analysen für AtPLT5.
A+B: GUS Färbung einer AtPLT5-Promotor-GUS Pflanze zeigt Blaufärbung im Stängel. C: GFP Fluoreszenz AtPLT5-Promotor-GFP Pflanze im Stängel knapp unter der Blüte. D: GUS Färbung einer erwachsenen AtPLT5-Promotor-GUS Pflanze. Das Ovar (gelber Pfeil), die Leitbündel der Sepalen sowie die axillaren Regionen von Einzelblüten sind blau (weiße Pfeile). E-H: AtPLT5-Promotor-GUS Pflanzen zeigen GUS Expression in den Leitbündeln von Blättern. E: Junges Blatt zeigt GUS Expression in allen Leitbündeln. F: Sourceblatt (frühe Seneszenz) zeigt GUS Färbung hauptsächlich in den außen liegenden, kleineren Leitbahnen. G: Seneszentes Blatt zeigt GUS Färbung hauptsächlich in der Mittelrippe. H: Nahaufnahme gefärbter Leitbündel eines Rosettenblattes im frühen Seneszenzstadium. I: Starke GUS Expression in der Wurzel, 100-300 µm hinter der Wurzelspitze. J: GFP Fluoreszenz in der Wurzelspitze bestätigt GUS Expression in I. Rechts unten im Bild: Wurzel einer Arabidopsis col wt Pflanze unter GFP Anregungslicht K: Reife AtPLT5-Promotor-GUS Schote zeigt GUS Expression an der Basis und der Spitze. L+M: GUS Expression nach Verwundung einer AtPLT5-Promotor-GUS Pflanze, Pfeile zeigen auf Schnittstellen. Größenstandards: A, B: 2 mm; C: 1 mm; D-H: 2 mm; I, J: 0, 1 mm; K, M: 1 mm; L: 1 cm.
Ergebnisse
28
3.1.2 Funktionelle Charakterisierung der Polyoltransportproteine in
Saccharomyces cerevisiae
Für die funktionelle Charakterisierung von Transportproteinen bietet sich die heterologe
Expression in Hefezellen an. Diese werden mit einem Vektor transformiert, auf dem sich unter
der Kontrolle eines starken Hefe Promotors die cDNA des zu untersuchenden Gens befindet.
Anschließend wird die Aufnahmekapazität der transformierten Zellen hinsichtlich möglicher
Substrate des Transporters getestet. Um einen Flux von Substraten zu katalysieren, muss der
Transporter in der Plasmamembran der Hefezellen lokalisiert sein. Weiterhin benötigt man für
die Auswertung der Ergebnisse eine Negativkontrolle, so kann überprüft werden, ob eine
gemessene Aufnahme auf den rekombinanten oder auf einen hefeeigenen Transporter
zurückgeführt werden kann.
allgemein:
Alle sechs AtPLT cDNAs wurden aus ganzen Arabidopsis col wt Pflanzen amplifiziert und in
die Hefeexpressionsvektoren NEV-E oder NEV-N (Sauer und Stolz, 1994) kloniert. NEV-
Vektoren ermöglichen die Expression von Genen unter Kontrolle des starken Promotors der
Plasmamembran-H+-ATPase aus S. cerevisiae (Serrano et al., 1992). Über die verwendeten
Primer (5.2.3) wurden entweder EcoRI oder NotI Schnittstellen vor das jeweilige Start-ATG
und das jeweilige Stopp-Kodon eingeführt. Aus vorangegangenen Arbeiten war bekannt, dass
gelegentlich GC-reiche Regionen vor dem Start-ATG die Expression des entsprechenden
Gens verhindern. Daher wurde über die genspezifischen Primer zusätzlich zwischen EcoRI
bzw. NotI Schnittstelle und dem Start ATG die AT-reiche Region des 5´-nichttranslatierten
Bereiches von AtSTP1 eingeführt. Diese Sequenz wurde bei der PCR mitamplifiziert und soll
die Expression des gewünschten Gens in den Hefezellen erleichtern (Stadler et al., 1995;
Ramsperger-Gleixner et al., 2004).
3.1.2.1 Heterologe Expression von AtPLT5 in Saccharomyces cerevisiae und
funktionelle Charakterisierung über Aufnahmemessungen
Um zu überprüfen, ob AtPLT5 eines der Substrate aufnimmt, das auch von AgMAT1 bzw.
PmPLT1 und PmPLT2 transportiert wird, wurde AtPLT5 in dem Hefestamm SEY2102 (Emr et
al., 1983) exprimiert. Radioaktive Aufnahmemessungen mit den AtPLT5-exprimierenden
Hefezellen (YKY1) und der Negativkontrolle (YKY4) charakterisierten AtPLT5 als Transporter
für Sorbit, aber nicht für Mannit. Weiterhin stellte sich heraus, dass unmarkierte Glukose den
Sorbittransport erheblich verringerte (Klepek, 2003). Normalerweise bewirkt Glukose eine
verstärkte Substrataufnahme in die Zellen. Dies kommt durch die Stimulierung der
Ergebnisse
29
Plasmamembran-ATPase zu Stande, was einen erhöhten Protonentransport und damit einen
verstärkten Symport der Substrate in die Zelle zur Folge hat (Riesmeier et al., 1992; Gahrtz et
al., 1994; Sauer und Stolz, 1994). Ob Glukose für AtPLT5 ebenfalls ein Substrat darstellt,
konnte damals in SEY2102 nicht bestimmt werden, da dieser Hefestamm eigene
Glukosetransportproteine besitzt. Für die Glukosemessungen musste also ein anderer
Hefestamm (EBY.VW.4000; Wieczorke et al., 1999), der keine endogenen
Hexosetransportproteine mehr besitzt, mit den Plasmiden pYK23 (sense) und pYK24
(antisense) transformiert werden (Tabelle 3. 1).
Größe der AtPLT5 cDNA
Enzym zur Klonierung in
NEV-E
Resultierender Hefeexpressions-
vektor Hefestamm
Transformierter Hefestamm
1536 bp EcoRI pYK23 (sense) pYK24 (antisense)
SEY 2102 SEY 2102
EBY.VW.4000 EBY.VW.4000
YKY1 YKY4 YKY5 YKY8
Tabelle 3. 1: Größe der AtPLT5 cDNA; verwendetes Enzym, Vektoren, Hefestämme und transformierte Hefestämme.
3.1.2.2 Aufnahmemessungen
Aufnahmemessungen mit radioaktiv markierten Substraten sollten zeigen, ob und mit welcher
Aufnahmerate YKY5 Hefen bestimmte Zucker und Zuckeralkohole transportieren. Alle
getesteten Verbindungen waren mit 14C-markiert, nur Inosit war durch Tritium radioaktiv
markiert. Die Endkonzentration der Substrate betrug bei der Aufnahmemessung-sofern nicht
anders angegeben-stets 0,1 mM. Die Zellen wurden vor den Aufnahmemessungen in Natrium-
Phosphatpuffer pH 5,0 gewaschen und auf eine Zelldichte von 10 OD/ml eingestellt (5.2.4.2).
Jede Aufnahmemessung verlief über einen Zeitraum von 10 min, wobei für die Zeitpunkte 0, 2,
4, 6, 8, 10 min jeweils ein Messwert ermittelt wurde. In Abbildung 3. 2 sind die Ergebnisse der
einzelnen Aufnahmessungen aus drei unabhängigen Messreihen dargestellt. Die
entsprechenden Messwerte sind in Tabelle 3. 2 aufgelistet. Die Ergebnisse der Messungen
sind in nmol pro Gramm Frischgewicht (FG) angegeben, wobei ein Gramm Frischgewicht
einer Zellmenge von 35,7 OD600 entspricht (10 OD600 Zellen = 28 µl packed cell volume = 28
mg). Es wurde die Aufnahme des sense Stammes YKY5 und zur Kontrolle die des antisense
Stammes YKY8 vermessen.
Ergebnisse
30
Sorbit
0
200
400
600
800
1000
1200
0 2 4 6 8 10Zeit (min)
Aufn
ahm
e (n
mol
/gFG
)
Xylose
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Glukose
0
100
200
300
400
500
600
700
0 2 4 6 8 10Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Ribose
0100200300400500600700800
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
myo -Inosit
0100200300400500600700800900
1000
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)Mannit
0102030405060708090
100
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Aufn
ahm
e (n
mol
/g F
G)
Glyzerin
0
2040
60
80
100120
140
160
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Aufn
ahm
e (n
mol
/g F
G)Galaktose
020406080
100120140160180200
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
30
Ergebnisse
31
Abbildung 3. 2: Transport von verschiedenen Substraten durch AtPLT5 in YKY5 und YKY8 Hefezellen.
Aufnahme radioaktiv markierter Zucker bzw. Zuckeralkohole (EK 0,1 mM) von AtPLT5-exprimierenden Hefen (YKY5 ) im Vergleich zur Negativkontrolle (YKY8 ). Transportkapazität wurde in Hexose-defizienten Hefestamm EBY.VW.4000 analysiert. Es sind die Mittelwerte inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen dargestellt.
Aufnahme von YKY5 (sense) und YKY8 (antisense)
Zeit in min 0 2 4 6 8 10 Sorbit sense 33,43 256,75 484,37 617,83 768,71 953,38 Sorbit antisense 3,77 4,93 6,73 5,86 3,49 13,12 Ribose sense 25,47 148,42 336,01 471,48 594,93 678,19 Ribose antisense 6,26 12,61 14,95 10,45 8,37 13,53 Xylose sense 20,37 216,45 369,06 477,88 590,65 655,26 Xylose antisense 2,76 6,39 8,41 10,87 12,07 11,09 Glukose sense 13,26 170,15 303,99 431,56 546,38 602,85 Glukose antisense 3,84 6,77 9,87 21,21 11,83 14,81 Inosit sense 47,29 303,68 528,01 692,89 784,08 875,94 Inosit antisense 32,74 185,46 324,34 396,37 422,46 502,43 Glyzerin sense 11,89 44,49 78,99 111,13 131,44 147,86 Glyzerin antisense 1,91 5,90 6,22 14,08 16,41 17,59 Galaktose sense 4,57 40,14 69,82 96,53 113,99 128,61 Galaktose antisense 1,43 3,03 4,19 3,74 4,10 5,27 Mannit sense 3,70 21,16 35,68 53,69 68,71 85,28 Mannit antisense 2,73 1,03 0,86 1,65 1,01 1,53
Tabelle 3. 2: Aufnahme unterschiedlicher Zucker bzw. Zuckeralkohole in nmol pro g FG über einem Zeitraum von 10 min. sense = YKY5; antisense = YKY8. Angegeben ist der Mittelwert aus drei unabhängigen Messreihen. Aufgrund der Übersichtlichkeit wurde auf die Angabe der Standardabweichungen verzichtet.
AtPLT5 transportiert ein breites Spektrum an Substraten, zu dem Hexosen, unterschiedliche
Polyole wie Sorbit, Inosit oder Glyzerin, aber auch Pentosen wie Ribose zählen. Abbildung 3.
2 zeigt, dass von den getesteten Verbindungen Sorbit, die reduzierte Form von Glukose, mit
Abstand am besten aufgenommen wird. Dabei konnte nach 10 min eine Aufnahme von 953,38
± 117,94 nmol pro Gramm Frischgewicht festgestellt werden. Als nächst bessere Substrate
konnten Ribose (678,19 ± 65,91 nmol/g FG nach 10 min), Xylose (655,26 ± 135,80 nmol/g FG
nach 10 min) und Glukose (602,85 ± 89,38 nmol/g FG nach 10 min) identifiziert werden
(Tabelle 3. 2). Für myo-Inosit, ein zyklisches Polyol, wurde ebenfalls durch AtPLT5
transportiert. Jedoch konnte auch ein vergleichbar hoher Transport von myo-Inosit der
Negativkontrolle festegestellt werden. Die tatsächliche Aufnahme von myo-Inosit durch YKY5
beträgt nach 10 min nicht 875,94 ± 146,28 nmol pro Gramm Frischgewicht, sondern liegt wohl
eher um die 300 nmol pro Gramm Frischgewicht. Die relativ hohe Inositaufnahme (502,43 ±
79,71 nmol pro Gramm Frischgewicht) des antisense Stammes YKY8 kann auf einen
hefeeigenen Inosittransporter zurückgeführt werden. Im Gegensatz zur Negativkontrolle
Ergebnisse
32
zeigten auch Glyzerin und Galaktose eine deutliche Aufnahme (147,86 ± 4,22 bzw. 128,61 ±
48,76 nmol/g FG nach 10 min). Eine sehr geringe Aufnahme war für Mannit festzustellen
(85,28 ± 1,28 nmol/g FG nach 10 min), die dennoch signifikant höher war, als die
entsprechende Aufnahme der Negativkontrolle (1,53 ± 0,96 nmol/g FG nach 10 min) (Tabelle
3. 2; Abbildung 3. 2).
Dieses Ergebnis veranschaulicht, dass AtPLT5 ein breites Spektrum an Substraten besitzt,
das neben Polyolen verschiedener Kettenlänge auch Pentosen wie Xylose, und Hexosen wie
Glukose beinhaltet. Zyklische Polyole wie myo-Inosit werden von AtPLT5 ebenfalls als
Substrat akzeptiert.
Km –Wert Bestimmung für AtPLT5 für Glukose
Der Km-Wert liefert Erkenntnisse über die Substrataffinität eines Transportproteins für ein
bestimmtes Substrat. Dieser Wert gibt die Substratkonzentration an, bei der eine
Reaktionsgeschwindigkeit erreicht ist, die gerade halb so groß ist wie ihr theoretischer
Maximalwert. Dazu wurden bei verschiedenen Subtratkonzentrationen die Aufnahmeraten des
Transporters getestet. Der Km-Wert für Sorbit wurde im Rahmen der Diplomarbeit ermittelt
(Klepek, 2003). Er liegt bei 0,5 ± 0,1 mM. Da aber auch für Glukose hohe Transportraten
erzielt wurden, sollte auch für dieses Substrat der Km-Wert bestimmt werden. Abbildung 3. 3
zeigt die Michaelis-Menten Auftragung und die doppelt reziproke Auftragung nach
Lineweaver-Burk für AtPLT5 für Glukose. Die dazugehörigen Werte sind in Tabelle 3. 3
zusammengefasst.
Glukosekonzentration (mM) Aufnahmerate (nmol / g FG x min)
0,1 77,94 ± 41,88 0,2 180,89 ± 69,71 0,5 300,89 ± 93,78 1 518,72 ± 107,33 2 755,22 ± 111,38 5 814,67 ± 164,76
1 / Glukosekonzentration (1 / mM) 1/Aufnahmerate (1 / (nmol / g FG x min))
10 0,0128 ± 0,0075 5 0,0055 ± 0,0023 2 0,0033 ± 0,0009 1 0,0019 ± 0,0004
0,5 0,0013 ± 0,0002 0,2 0,0012 ± 0,0002
Tabelle 3. 3: Glukoseaufnahme von AtPLT5 bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen. oben: Michaelis-Menten Darstellung; unten: Lineweaver-Burk Darstellung. Messwerte angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Ergebnisse
33
Michaelis-Menten Auftragung der Glukoseaufnahmeraten von AtPLT5 -exprimierenden Hefen
0,00
200,00
400,00
600,00
800,00
1000,00
1200,00
0 1 2 3 4 5 6
Glukosekonzentration (mM)
Auf
nahm
erat
e (n
mol
/ g F
G x
min
)
Lineweaver-Burk Auftragung der Glukoseaufnahmeraten von AtPLT5 -exprimierenden Hefen
-0,003
-0,001
0,001
0,003
0,005
0,007
0,009
-1 0 1 2 3 4 5 6
1/ Glukosekonzentration (1/ mM)
1/ A
ufna
hmer
ate
(1/ n
mol
pro
g F
G x
min
)
Abbildung 3. 3: Michealis-Menten und Linewaver-Burk Auftragung der Glukoseaufnahmerate von AtPLT5.
oben: Michaelis-Menten Darstellung der Glukoseaufnahmerate in (nmol/g FG x min) unter verschiedenen Glukose- konzentrationen. unten: Lineweaver-Burk Darstellung der Glukoseaufnahmerate AtPLT5-exprimierender Hefen. Messwerte dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Ergebnisse
34
Über doppelt reziproke Auftragung nach Lineweaver-Burk ließ sich anhand der
Geradengleichung der Km-Wert für Glukose von 1,5 mM sowie die maximale
Aufnahmegeschwindigkeit (1250 nmol/g FG x min) ermitteln (Tabelle 3. 4).
AtPLT5 Km-Wert für Glukose
AtPLT5 maximale Aufnahmegeschwindigkeit für Glukose
1,5 ± 0,8 mM 1250 (nmol/g FG x min)
Tabelle 3. 4: Km-Wert in mM von AtPLT5 für Glukose.
Experimente zur pH Abhängigkeit, Kompetition und Inhibition der Aufnahme von AtPLT5
wurden bereits in der Diplomarbeit durchgeführt (Klepek, 2003; Klepek et al., 2005).
3.1.3 Heterologe Expression in Xenopus laevis Oozyten und
elektrophysiologische Untersuchungen an AtPLT5-exprimierenden Oozyten
Untersuchungen zur Elektrogenität des Transports wurden in Oozyten des südafrikanischen
Krallenfrosches Xenopus laevis durchgeführt, da im Hefesystem nur indirekte Hinweise auf
energieabhängige Aufnahme erhalten werden können. In AtPLT5-exprimierenden Oozyten
sollten elektrophysiologischen Analysen zur Energieabhängigkeit von AtPLT5 durchgeführt
werden.
Dazu wurde AtPLT5 cDNA in den Oozytenexpressionvektor pDK148 über EcoRI kloniert und
über Restriktionsverdau überprüft. Daraufhin wurde der Vektor linearisiert und in cRNA
umgeschrieben, mit der anschließend Xenopus laevis Oozyten (NASCO) injiziert wurden
(5.2.8). Die Oozyten wurden mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik von Dietmar
Geiger in Würzburg gemessen. Abbildung 3. 4 zeigt die Einwärtsströme AtPLT5-
exprimierender Oozyten während der Perfusion mit jeweils 3 mM Sorbit, Glukose, Fruktose,
myo-Inosit, Glyzerin und Mannit bei einem extrazellulären pH Wert von 5,5. Für die Substrate
Sorbit, Glukose und Fruktose wurden die stärksten Einwärtsströme detektiert. Die Zugabe von
myo-Inosit verursachte ebenfalls einen deutlich messbaren Einwärtsstrom. In 3 mM Glyzerin
konnten hingegen nur noch geringe Einwärtsströme gemessen werden, trotzdem liegt die
Transportrate immer noch 20% über dem Hintergrundwert von -40 nA. Wenn 3 mM Mannit
zugegeben wurde, konnte nur noch ein sehr geringer Strom detektiert werden (Abbildung 3.
4). In Abbildung 3. 5 sind die normierten Werte, welche die in Hefe erhaltenen Ergebnisse
(Abbildung 3. 2) bestätigen, dargestellt. Sorbit und Glukose werden mit hoher Transportrate
aufgenommen, ebenso wie Fruktose und myo-Inosit, da hohe Einwärtsströme detektiert
werden konnten. In Hefe ist die Inositaufnahme aufgrund endogener myo-Inosit Transporter
Ergebnisse
35
schwierig nachzuweisen, da ein zu hoher Hintergrund keine klare Aussage über die
tatsächliche Transportaktivität zulässt (Tabelle 3. 2). Auch in Xenopus konnte festgestellt
werden, dass AtPLT5 in der Lage ist zwischen den beiden Polyolen Sorbit und Mannit zu
unterscheiden, da nur Sorbit Zugabe starke Einwärtsströme verursachte, während bei Mannit
Zugabe nur ein sehr geringer Strom zu messen war (Abbildung 3. 4).
Abbildung 3. 4: AtPLT5-vermittelte Einwärtsströme, gemessen nach Zugabe unterschiedlicher Zucker und Zuckeralkohole (Konzentration: 3 mM). pH Wert 5,5; Membranpotential: -60 mV; Die Substrate wurden jeweils für 20 sec zugegeben.
Abbildung 3. 5: Normierte Werte der durch AtPLT5-vermittelten Ströme. Alle Werte sind auf Sorbit normiert. Gezeigt sind die Mittelwerte dreier unabhängiger Messreihen inklusive Standardabweichung.
Nur für die Substrate myo-Inosit und Glyzerin wurde in AtPLT5-exprimierenden Xenopus
Oozyten Michaelis-Menten Kinetik bestimmt. Die Km-Werte wurden bei -60 mV und einem
Ergebnisse
36
extrazellulären pH Wert von 5,5 gemessen. Für myo-Inosit betrug der Km-Wert 3,5 ± 0,3 mM,
für Glyzerin wurde ein Km-Wert von 23,4 ± 2,3 mM erhalten (Abbildung 3. 6; Tabelle 3. 5).
Abbildung 3. 6: Michaelis-Menten Kurve für myo-Inosit (links) und Glyzerin (rechts). Ströme wurden bei einer Haltespannung von -60 mV und einem pH von 5,5 aufgenommen. Werte dargestellt als Mittelwert dreier unabhängiger Messreihen inklusive Standardabweichung.
AtPLT5 Km-Werte in Xenopus laevis myo-Inosit 3,5 ± 0,3 mM Glyzerin 23,4 ± 2,3 mM
Tabelle 3. 5: Km-Werte für AtPLT5 für myo-Inosit und Glyzerin gemessen in AtPLT5-exprimierenden Xenopus laevis Oozyten. Werte dargestellt als Mittelwert dreier unabhängiger Messreihen ± Standardabweichung.
Um das kotransportierte Ion zu identifizieren, wurden für zwei Substrate die Einwärtsströme in
verschiedenen Puffersystemen gemessen. Alle Messungen wurden bislang in Natrium-
gepufferten System durchgeführt. Als Substrate wurden Glukose und Glyzerin gewählt, die
auch in Na+-freien Puffer Einwärtsströme verursachten, die sich mit sinkenden pH Werten
erhöhten. Ebenso demonstrierten die Einwärtsströme, dass zusammen mit einem Substrat
jeweils eine positive Ladung transportiert wird. Diese Ergebnisse verdeutlichen eine
energieabhängige Transportaktivität (Abbildung 3. 7).
Demnach ist AtPLT5 ein Protonen-Symporter, der im sauren Milieu gut messbare Ströme
verursacht, während bei pH Werten größer 7 keine Ströme mehr gemessen werden konnten
(Abbildung 3. 7). Diese pH Abhängigkeiten wurden ebenfalls in AtPLT5-exprimierenden
Hefezellen beobachtet (Klepek, 2003).
I / nA I / nA
myo-Inosit (mM) Glyzerin (mM)
Ergebnisse
37
Abbildung 3. 7: pH-Abhängigkeit von AtPLT5, induziert durch Glukose und Glyzerin. A: Glukose (3 mM) vermittelte Einwärtsströme über AtPLT5, gemessen bei verschiedenen externen pH Werten. 15 s Glukose Pulse, Membranpotential -60 mV. B: Normierte Werte, der in A gemessenen AtPLT5-abhängigen Einwärtsströme bezogen auf pH 5,5. C: Glyzerin (10 mM) vermittelte Einwärtsströme über AtPLT5, gemessen bei verschiedenen externen pH Werten. 15 s Glyzerin Pulse, Membranpotential -60 mV. D: Normierte Werte, der in C gemessenen AtPLT5-abhängigen Einwärtsströme bezogen auf pH 5,5.
3.1.4 Lokalisierung des AtPLT5 Proteins
AtPLT5 ist ein 539 Aminosäuren langes Protein, mit einem errechneten Molekulargewicht von
58,1 kDa. Hydropathieanalysen weisen auf 12 transmembranale Domänen hin, demnach ist
AtPLT5 ein Mitglied der MFS Familie (major facilitator superfamily), deren gemeinsames
Merkmal 12 Transmembranspannen ist (Marger und Saier, 1993).
Die gewebsspezifische bzw. subzelluläre Lokalisierung wurde durch Immunolokalisation an
Mikrotomschnitten von Arabidopsis col wt Pflanzen bzw. AtPLT5-exprimierender Hefen mit
AtPLT5-spezifischen Antikörpern untersucht.
3.1.4.1 Überprüfung der Antiseren in AtPLT5-exprimierenden Hefen
Nach einer Epitopanalyse wurde zur Herstellung der anti-AtPLT5 Antiseren ein 17 AS langes
C-terminales Peptid ausgewählt (NH2-CEIGSNKQWKEGDTQSS-CONH2; AS: 523-539), dass
3 mM Glukose
3 mM Glyzerin
Ergebnisse
38
66 kDa
29 kDa
119 kDa
43 kDa
200 kDa
20 kDa
STD GM antisense
GM sense
148 kDa
50 kDa
36 kDa
22 kDa
16 kDa
64 kDa
98 kDa
STD EM sense
PM sense
keine Homologien zu anderen Zuckeralkoholtransportern aufwies, da diese C-terminale
Sequenz den anderen, kürzeren AtPLT Proteinen fehlte. Das synthetisch hergestellte Peptid
(5.1.6) wurde für die Immunisierung von zwei Kaninchen (K1, K2) und einem
Meerschweinchen (M) eingesetzt. Es wurde mit den Seren vom 90. Tag nach der
Immunisierung gearbeitet. Bevor Pflanzenschnitte bzw. Schnitte der eingebetteten, AtPLT5-
exprimierenden Hefen mit den Antiseren inkubiert wurden, wurden die Antiseren durch
Western Analysen mit Proteinextrakten aus AtPLT5-exprimierenden Hefen (YKY1) und aus
Kontrollhefen (YKY4) auf ihre Spezifität gegenüber dem AtPLT5 Protein getestet. Für die
Western Analysen wurden Gesamtmembranfraktionen, Endomembranfraktionen und
Plasmamembranfraktionen aus dem transgenen Hefestamm YKY1 (sense) und dem
Kontrollhefestamm YKY4 (antisense) gewonnen (5.2.4.3). Von den erfolgreichen
Aufnahmemessungen war bekannt, dass sich das AtPLT5 Protein in den Hefezellen innerhalb
der Plasmamembran befinden musste (3.1.2.2). Um die Qualität der Auftrennung der
verschiedenen Membranfraktionen zu überprüfen, wurde ein SDS-PAGE mit je 10 µg Protein
der jeweiligen Membranfraktionen durchgeführt und Coomassie Blue (Abbildung 3.8).
Abbildung 3. 8: Coomassie Blue gefärbtes SDS-PAGE der verschiedenen Membranfraktionen von AtPLT5-exprimierenden Hefen und Kontrollhefen. links: Coomassie Blue-gefärbtes SDS-PAGE der Gesamtmembranisolierung AtPLT5-exprimierender Hefen sense (YKY1) und antisense (YKY4). STD = Roti-Mark Proteinstandard (Roth, Karlsruhe). rechts: Coomassie Blue-gefärbtes SDS-PAGE der AtPLT5-exprimierenden (YKY1) Endomembran- (EM) und Plasmamembranproben (PM). Der rote Pfeil zeigt auf die Bande der Plasmamembran- ATPase. STD = Pre-stained Standard (Invitrogen, UK). Aufgetragen wurden je 10 µg Protein.
Ergebnisse
39
Die klaren Bandenmuster der verschiedenen Membranfraktionen lassen darauf schließen,
dass die Auftrennung in Endo- und Plasmamembranen sowohl in den sense (YKY1) als auch
in den antisense (YKY4) Hefen erfolgreich war und keine Proteindegradation stattgefunden
hat. Bestätigt wird dies durch die Plasmamembran-ATPase bei 119 kDa, die in der
Plasmamembranprobe zu erkennen ist (Abbildung 3.8 roter Pfeil).
Die auf Nitrocellulosemembran übertragenen Proteine (pro Spur je 10 µg) wurden in einer
1:5000 Verdünnung mit dem Antiserum αAtPLT5-K1 über Nacht inkubiert und anschließend
mit einem sekundären, Peroxidase-gekoppelten anti-Kaninchen IgG Antikörper behandelt
(5.2.6.3).
Abbildung 3. 9: Western Analysen zur Identifikation des AtPLT5 Proteins in transgenen Hefezellen. Links: Die Proteinextrakte von Gesamtmembranen YKY1 (sense; AtPLT5-exprimierende Hefen) und YKY4 (antisense; Kontrolle) wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet. Inkubation mit αAtPLT5-K1 Antiserum (1:5000) lieferte eine spezifische Bande bei ~40 kDa (Monomer). Rechts: Nach Fraktionierung in Plasmamembran- (PM) und Endomembranproben (EM), konnte der größte Teil von AtPLT5 in der PM-Fraktion detektiert werden. Eine schwächere Bande taucht bei ~80 kDa, was auf Dimerbildung von AtPLT5 hinweist (weiße Pfeile).
Das ungereinigte Kaninchenserum lieferte in den transgenen Hefen (YKY1) ein spezifisches
Signal bei ~40 kDa, bei dem es sich um das AtPLT5 Protein handelte. Im Kontrollstamm
(YKY4) war auf dieser Höhe kein Signal detektierbar (Abbildung 3. 9). Bei etwa 80 kDa ist eine
zusätzliche Bande, die dimerisierte Form des AtPLT5 Proteins, zu sehen. Dimerbildung ist ein
bekanntes Merkmal lipophiler Membranproteine (Abbildung 3. 9). Auch die Beobachtung, dass
sich das apparente Molekulargewicht (~40 kDa) um ~18 kDa von dem errechneten (58,1 kDa)
unterscheidet, ist als weiteres Charakteristikum für stark lipophile Membranproteine bekannt
(Beyreuther et al., 1980, Sauer und Stadler, 1993). Die Auftrennung der Gesamtmembranen
Ergebnisse
40
A B
D
C
E F
in eine Endomembran- und eine Plasmamembranfraktion zeigte, dass sich der
Hauptproteinanteil von AtPLT5 in der Plasmamembranfraktion befindet (Abbildung 3. 9). Die
schwächere Bande in der Endomembranspur kommt wahrscheinlich durch die unsaubere
Trennung der beiden Fraktionen bei der Präparation zustande (Abbildung 3. 9). Die anderen
schwächeren Banden werden durch die unspezifische Bindung des Antikörpers
hervorgerufen. Mit den beiden anderen Antiseren (Kaninchen 2 und Meerschweinchen)
wurden ähnliche Ergebnisse erzielt (nicht gezeigt), da aber Kaninchen 1 die stärksten Signale
lieferte, wurde dieses Serum gereinigt und nur damit weitergearbeitet.
3.1.4.2 Immunozytologische Analysen von AtPLT5 in Hefedünnschnitten
Das Antiserum αAtPLT5-K1 wurde anschließend in einer ersten Immunolokalisation mit
Dünnschnitten von AtPLT5-exprimierenden Hefezellen (YKY1) und Kontrollhefen (YKY4), die
beide in Methacrylat eingebettet wurden (5.2.7.3), getestet (Verdünnung 1:1000). Es sollte
untersucht werden, ob die Prozedur der Methacrylateinbettung Einfluß auf die Antigen-
Antikörper Reaktion hat und das Protein nach der Einbettung in Methacrylat noch detektierbar
ist. Nach Behandlung der Schnitte mit einem sekundären FITC-gekoppelten anti-Kaninchen
IgG- Antikörper (1:300) konnte nur ein Fluoreszenzsignal in den Plasmamembranen der
AtPLT5-exprimierenden Hefen erhalten werden, das in Kontrollhefen nicht zu sehen war
(Abbildung 3. 10). Somit konnte das Ergebnis, dass AtPLT5 in Hefen ein
Transmembranprotein der Plasmamembran ist, der vorher durchgeführten
Aufnahmemessungen und der Western Analysen bestätigt werden.
Ergebnisse
41
Abbildung 3. 10: Immunozytologischer Nachweis von AtPLT5 an AtPLT5-exprimierenden Hefen (YKY1, sense; D, E, F) und Kontrollhefen (YKY4, antisense; A, B, C). Das Antiserum αAtPLT5-K1 wurde in einer Verdünnung von 1:1000 eingesetzt. Die Bilder B, C, E, F wurden im FITC Anregungs-licht aufgenommen. A und D sind Überlagerungen von Durchlicht und FITC Anregungslicht. Bei C und F handelt es sich um Vergrößerungen einzelner Zellen. AtPLT5 abhängige Fluoreszenz wurde nur in den Plasmamembranen AtPLT5-exprimierender Hefen detektiert (D, E, F). Größenstandard: 2 µm.
3.1.4.3 Immunolokalisation von AtPLT5 in Dünnschnitten verschiedener
Gewebe von Arabidopsis thaliana col wt
Die gewebsspezifische Lokalisation von AtPLT5 in Arabidopsis thaliana erfolgte mit allen
ungereinigten Seren (αAtPLT5-K1; αAtPLT5-K2, αAtPLT5-M) und dem gereinigten Kaninchen
Antiserum αAtPLT5-K1, die im Western Blot und in den Hefedünnschnitten erfolgreich
getestet wurden. Dafür wurden Mikrotomschnitte von eingebetteten Stängeln, Blüten, Blättern
und Wurzeln von Arabidopsis thaliana col wt Pflanzen angefertigt und mit αAtPLT5-K1
Antikörpern, die gegen den C-Terminus von AtPLT5 gerichtet waren, behandelt (5.2.7.3,
5.2.6.5). Als Kontrollpflanzen dienten homozygote AtPLT5 T-DNA Insertionslinien, mit einer T-
DNA Insertion im 4. Exon. Später wurde gezeigt, dass durch die T-DNA Insertion der C-
Terminus von AtPLT5 nicht mehr existierte und es sich bei diesen Pflanzen um Nullmutanten
handelte (Abschnitt 3.1.7). Nach Behandlung mit dem sekundären FITC-gekoppelten
Antikörper konnte in col wt Schnitten kein spezifisches Signal erhalten werden. Dennoch
zeigten alle Seren ein starkes Signal in den Siebelementen. Diese Kreuzreaktion in den
Siebelementen ist für viele Antikörper typisch (Lauterbach, 2005). Außerdem wurde ein
ebenso starkes Fluoreszenzsignal in den Pflanzenschnitten der homozygoten AtPLT5 T-DNA
Insertionslinien detektiert (nicht gezeigt). Dass trotz der erfolgreichen Immunolokalisationen in
Hefe (hier wird AtPLT5 überexprimiert!) in Pflanzen kein spezifisches Signal detektierbar war,
lag möglicherweise an dem geringen Proteingehalt von AtPLT5 in vivo.
3.1.5 Bestimmung der AtPLT5 Transkriptmenge in verschiedenen Geweben
von Arabidopsis thaliana durch Real Time PCR
Um die gewebsspezifische Expression der Promotor-Reportergen Studien durch eine
unabhängige Methode zu bestätigen, wurden Real Time PCR Experimente durchgeführt.
Aus Arabidopsis thaliana col wt Blättern, Stängeln und Wurzeln wurde jeweils RNA isoliert und
eine Reverse Transkriptase Reaktion mit oligo-dT-Primern durchgeführt. (5.2.5). Separat dazu
wurde auch aus Wurzelspitzen (1-2 mm von der Spitze) und Streckungszonen (2-10 mm von
der Spitze) RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben.
Ergebnisse
42
Mit diesen Geweben wurde eine PCR durchgeführt. Für die Amplifizierung von AtPLT5
wurden in der PCR die genspezifischen Primer AtPLT5-5 und AtPLT5-3 verwendet. Als
Kontrolle dienten Ansätze mit Aktin Primern (AtACT1). Abbildung 3. 11 zeigt das
Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel mit den PCR Ansätzen für Aktin und AtPLT5 in
Wurzelspitzen und in Streckungszonen. In Spur 1 ist die Aktinbande und in Spur 2 die AtPLT5
RNA Menge der Wurzelstreckungszone aufgetragen. Spur 3 enthält die Aktinbande und Spur
4 die AtPLT5 RNA Menge der Wurzelspitzenfraktion. Deutlich erkennt man, dass in
Wurzelspitzen mehr AtPLT5 RNA nachweisbar ist als in den zugehörigen Streckunszonen
(Abbildung 3. 11).
Abbildung 3. 11: Kontroll PCR von Wurzelspitzen (Wsp) und dazugehörigen Streckungszonen (SZ). Die PCR wurde mit der Primerkombination AtPLT5-5 und AtPLT5-3 (Spur 2, 4) durchgeführt, als Kontrolle diente Aktin (AtACT1) (Spur 1, 3).
Zur genaueren Quantifizierung wurden mit diesen Geweben Real Time PCR Experimente mit
den Primerkombinationen AtPLT5cW3 und AtPLT5cW5 durchgeführt, die das 3. Intron des
AtPLT5 Gens überspannen, so dass eine Kontamination durch genomische DNA
ausgeschlossen werden konnte. Als interne Standards dienten Kontrollreaktionen mit ACT2
Primern (An et al., 1996) und UBQ10 Primern (Sun und Callis, 1997) (UBQ10 nicht gezeigt),
die parallel dazu angesetzt wurden. Dadurch konnten gewebespezifische Unterschiede
minimiert werden. In Abbildung 3. 12 sind verschiedene Transkriptmengen der AtPLT5 mRNA
gezeigt, die mit Hilfe des Aktinstandards (ACT2) errechnet wurden. In Blättern, Stängeln und
Wurzeln ist überall AtPLT5 mRNA nachzuweisen. In den distalen Bereichen der Wurzel fand
eine deutlich höhere AtPLT5 Expression als in den proximalen Bereichen der Wurzel statt
(Abbildung 3. 12). Diese Daten stimmen mit den Ergebnissen der Promotor-
Reportergenassays überein, die eine Expression in Blatt, Stängel und Wurzelspitzen gezeigt
hatten (Abbildung 3. 12).
1536 bp AtPLT5
390 bp AtACT1
2614 bp
4396 bp
354 bp
10496 bp
6262 bp
3673 bp
11385 bp
1804 bp 1701 bp
1915 bp 2014 bp
973 bp 1112 bp
657 bp 621bp 537 bp
SZ Wsp 1 2 3 4
Ergebnisse
43
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Blatt Stängel Wurzelges.
Wurzeltop
Wurzeltip
Rel
ativ
er m
RN
A L
evel
-
Abbildung 3. 12: Real Time RT-PCR mit unterschiedlichen Arabidopsis thaliana Geweben. Relative Transkriptmengen wurden in Blättern, Stängeln und Wurzeln, sowie in den proximalen und distalen Wurzelregionen untersucht. Die Daten wurden anhand des Aktinstandards (AtACT2) berechnet und auf die AtPLT5 mRNA Menge in Blättern normiert. Die Balken zeigen den Durchschnitt vier unabhängiger Analysen.
3.1.6 Subzelluläre Lokalisierung von AtPLT5 in Pflanzenzellen
In Hefe und in Xenopus laevis konnte gezeigt werden, dass AtPLT5 in der Plasmamembran
lokalisiert ist. Leider war es nicht möglich AtPLT5 mit Hilfe von Antikörpern in Pflanzen zu
detektieren (3.1.4.3). Eine Möglichkeit, um die subzellulare Lokalisation im pflanzlichen
System zu bestimmen, stellt die transiente Expression eines AtPLT5-GFP Fusionskonstrukts
dar, das in Pflanzenzellen eingebracht wird. Das Konstrukt wird dann für eine bestimmte Zeit
abgelesen und das Fusionsprotein ist somit detektierbar (5.2.5.5). Für AtPLT5 wurde ein
Fusionsprodukt aus AtPLT5 cDNA und GFP hergestellt, dessen Expression von einem
konstitutiv aktiven 35s Promotor getrieben wurde (pYK25). Dazu wurde AtPLT5 mittels PCR
amplifiziert, wobei über die verwendeten Primer (AtPLT5-NcoI-5’; AtPLT5-NcoI-3’) vor dem
Start-ATG und nach der letzten Aminosäure des offenen Leserahmens von AtPLT5 NcoI-
Schnittstellen eingefügt wurden. Über NcoI konnte die AtPLT5 cDNA direkt vor das GFP in
den Vektor pSO35e (Klepek et al., 2005) kloniert werden. Wichtig ist, dass durch den 3’-
Primer das Stoppkodon von AtPLT5 entfernt wird, so dass beim Übergang von AtPLT5 in das
GFP der Leserahmen gewahrt wird und das GFP Gen in frame abgelesen wird. Das
resultierende Plasmid pYK25 wurde durch Sequenzierung überprüft und nun für die
Übertragung der DNA mit Hilfe der Particle Inflow Gun (PIG) verwendet. Unter hohem Druck
wird die pYK25 DNA in wässriger Lösung mit Hilfe von Goldkügelchen in Pflanzenzellen in
geschossen (5.2.5.5.1). Mit dem Konstrukt pYK25 wurden Zwiebelepidermisgewebe und
Ergebnisse
44
Blätter von Arabidopsis thaliana col wt transient transformiert. Als Positivkontrolle wurde
pGFP-PTS (Niedermeier, 2005) gewählt. Dieser Vektor enthält zwischen 35S Promotor und
GFP eine Peroxisomen Translokationssequenz. In
Abbildung 3. 13 A ist die Überlagerung einer transient transformierten Blattepidermiszelle von
Arabidopsis col wt gezeigt. Die grüne GFP Fluoreszenz umgibt die Zelle, die Chloroplasten
und das Mesophyll leuchten in rot. In
Abbildung 3. 13 B sieht man den Einzelschnitt einer Propidiumiodid-gefärbten transformierten
Arabidopsis Epidermiszelle. Der Nukleus und die Zellwand sind in rot dargestellt, die
Chloroplasten leuchten blau (weiße Pfeile). Beide Organellen liegen innerhalb der grün
fluoreszierenden Struktur. Das GFP und das daran fusionierte AtPLT5 Protein befinden sich
demnach in der Plasmamembran.
Abbildung 3. 13 C zeigt einen Einzelschnitt einer transient transformierten
Zwiebelepidermiszelle. Der Pfeil deutet auf den rot leuchtenden Nukleus, der ebenfalls
innerhalb der grünen Linie zu sehen ist. Auf diese Weise konnte bestätigt werden, dass auch
in Pflanzenzellen AtPLT5 ein plasmamembran-lokalisiertes Transportprotein ist.
Abbildung 3. 13: Konfokale Aufnahmen von Epidermiszellen von Arabidopsis thaliana und Zwiebel, die mit dem Fusionsprodukt aus AtPLT5- und GFP cDNA transformiert wurden. A: Überlagerung mehrerer Einzelschnitte einer Epidermiszelle eines Arabidopsis Blattes. In Rot: Chlorophyllfluoreszenz der Chloroplasten des Mesophylls. Die grüne Linie markiert die Plasmamembran. B: Einzelschnitt einer Epidermiszelle eines Arabidopsis Blattes, das mit Propidiumiodid behandelt wurde. Nukleus und Zellwand in rot, die Pfeile zeigen auf Chloroplasten, die in blau dargestellt sind, liegen innerhalb der grünen GFP Fluoreszenz (Plasmamembran). C zeigt einen Einzelschnitt einer Zwiebelepidermiszelle, die mit Propidiumiodid behandelt wurde. Der Nukleus befindet sich innerhalb der grün fluoreszierenden Struktur (Plasmamembran). Größenstandards: A: 20 µm; B: 8 µm; C: 40 µm.
Ergebnisse
45
3.1.7 Physiologische Charakterisierung von AtPLT5 über Analyse einer
AtPLT5 T-DNA Insertionsmutante
Eine etablierte Möglichkeit zur Analyse der physiologischen Funktion eines Gens ist die Studie
an Pflanzen, die aufgrund genetischer Veränderungen nicht mehr in der Lage sind, das zu
untersuchende Gen zu exprimieren. Eventuelle phänotypische Veränderungen lassen dann
Rückschlüsse auf die Genfunktion zu. Im Rahmen der Diplomarbeit (Klepek, 2003) wurde
über das Salk Institut eine T-DNA Insertionsmutante (salk_050162) bestellt
(http://signal.salk.edu/cgi-bin/tdnaexpress). Als genetischer Hintergrund wird vom Salk Institut
der Ökotyp Arabidopsis col wt verwendet. In der Linie salk_050162 inserierte die T-DNA
innerhalb des 4. Exons, 244 bp vor dem Stoppkodon von AtPLT5. Der Genotyp der
salk_050162 Pflanzen wurde bereits in einer früheren Arbeit über PCR bestimmt. Es konnten
wt, heterozygote und homozygote Pflanzen identifiziert werden (Klepek, 2003). Mit einer
ausgewählten homozygoten Linie wurden anschließend weitere Versuche durchgeführt. In
Abbildung 3. 14 sind zwei Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegele dargestellt. In A wurde
überprüft, ob mit den beiden Genprimern (AtPLT5-5 und AtPLT5-3) noch ein Produkt (AtPLT5)
nachgewiesen werden konnte. Falls die T-DNA tatsächlich im 4. Exon in beiden Allelen
inseriert hatte, sollte in keinem Fall noch ein Genprodukt detektierbar sein, da herkömmliche
Polymerasen nicht gut über die T-DNA Insertion, die mehrere 1000 bp groß ist, amplifizieren
können. Das Gelfoto bestätigt, dass tatsächlich kein Produkt mehr vorhanden ist. In Abbildung
3. 14 B wurde mit der Primerkombination AtPLT5-5 und AtPLT5c32 überprüft, ob noch das
verkürzte Genprodukt vor der T-DNA Insertion vorhanden war (Abbildung 3. 14). Hier konnte
festgestellt werden, dass die T-DNA Insertion die Transkription bis zur Insertionsstelle nicht
beeinflusste.
Abbildung 3. 14: Identifikation einer T-DNA Insertionsmutante (salk_050162) für AtPLT5. links: PCR mit Primern AtPLT5-5 und AtPLT5-3 zum Nachweis der gesamten mRNA. Nur in Arabidopsis wt Pflanzen ist das Gen nachweisbar. rechts: PCR mit Primern AtPLT5-5 und AtPLT5c32 zum Nachweis der verkürzten mRNA bis zur T-DNA Insertion. In Wildtyp und auch in k.o. Mutanten ist die verkürzte AtPLT5 mRNA immer noch nachweisbar. Zur Kontrolle wurde jeweils Aktin (390 bp) mit den Primern AtACT1-5’ und AtACT1-3’ amplifiziert.
WT PLT5 Akt
k.o. PLT5 Akt
WT PLT5 Akt
k.o. PLT5 Akt
390 bp AtACT1 mRNA
1620 bp AtPLT5 mRNA
390 bp AtACT1 mRNA
A B
Ergebnisse
46
Für phänotypische Untersuchungen wurden die homozygoten Samen einer Pflanze der T1
Generation zeitgleich mit dem isogenen wt erneut ausgesät, weiter kultiviert und auf
Wachstumsveränderungen hin beobachtet. In keinem Entwicklungsstadium konnten
Veränderungen zum Wildtyp festgestellt werden (nicht gezeigt).
3.1.7.1 Phänotypische Untersuchungen unter verschiedenen
Stressbedingungen
Aus Plantago major war bekannt, dass dessen homologe Polyoltransportergene PmPLT1 und
PmPLT2 mit einer erhöhten Salztoleranz in Verbindung stehen (Benjamin Pommerrenig,
persönliche Mitteilung). Es war zwar unwahrscheinlich, dass in Arabidopsis den AtPLT Genen
eine ähnliche Funktion zugeschrieben werden könnte. Dennoch wurden 24 salk_050162
homozygote und 24 isogene wt Pflanzen parallel auf Erde ausgesät und verschiedenen
Salzstressbedingungen ausgesetzt. Acht Wochen nach Aussaat wurden je 12 Pflanzen mit 20
ml 100 mM, 200 mM 300 mM und 400 mM NaCl dreimal pro Woche gegossen und unter
Kurztagbedingungen weiter angezogen. Die Kontrollpflanzen (12 Homozygote und 12 wt)
wurden mit der gleichen Menge Leitungswasser gegossen. Nach 6 Tagen setzte bei allen
NaCl-behandelten Pflanzen eine starke Anthocyanbildung ein. Es konnte kein Unterschied im
Wachstum zwischen Wildtypen und Mutanten festgestellt werden, auch die Anthocyanbildung
war in wt und Mutante gleich stark (nicht gezeigt).
Da in der Erde das Salz akkumuliert und die finale Konzentration nur ungenau zu bestimmen
ist, wurde das Salzstressexperiment noch einmal auf Agarmedium durchgeführt. Die
verwendeten MS-Platten enthielten entweder 10 mM oder 50 mM NaCl, auf denen
nebeneinander sterilisierte Samen homozygoter salk_50162 und isogener wt Pflanzen
ausgesät wurden (je ca. 10 Stck.). Die Platten wurden unter Langtagbedingungen (16 h Licht,
8 h Dunkel) gestellt.
MS0
k.o. wt
NaCl 10 mM
k.o. wt
NaCl 50 mM
k.o. wt
Ergebnisse
47
Abbildung 3. 15: AtPLT5 Mutanten (k.o.) neben salk_050162 isogenen wt Pflanzen auf MS-Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen NaCl. links: ohne NaCl, mitte: 10 mM NaCl, rechts: 50 mM NaCl.
Abbildung 3. 15 zeigt die verschiedenen MS-Agarplatten mit sechs Wochen alten wt und
Mutanten Pflanzen. Links sieht man die Kontrollplatte, die MS-Medium ohne Salz enthielt.
Mutanten und wt wachsen hier gleich gut. Es waren keine Wachstumsveränderungen
festzustellen. In der Mitte und rechts sind Platten mit 10 mM bzw. 50 mM NaCl zu sehen.
Unter diesen Bedingungen wuchsen wt und Mutante schlechter, untereinander jedoch konnte
kein Phänotyp festgestellt werden. Der NaCl Gehalt ist zwar ausschlaggebend für das
Wachstum der Pflanzen, allerdings scheint die Konzentration an Salz nicht wichtig zu sein, da
die Pflanzen bei 10 mM und 50 mM ähnlich aussahen (Abbildung 3. 15).
Nachdem dieser Versuch keine Unterschiede im Wachstum zeigte, wurden wt Pflanzen neben
Mutanten auf MS-Medium mit Glyzerin, Sorbit und Inosit (je 10 mM oder 50 mM) ausgebracht
und in 16 h Licht inkubiert. Abbildung 3. 16 zeigt beispielhaft für Sorbit (10 mM und 50 mM),
dass sich auch bei Anwesenheit von Osmolyten keine Änderungen im Wachstum einstellten.
Platten, die Inosit oder Glyzerin enthielten, lieferten das gleiche Ergebnis (nicht gezeigt).
Abbildung 3. 16: AtPLT5 Mutanten (k.o.) neben salk_050162 isogenen wt Pflanzen auf MS- Agarplatten mit unterschiedlichen Konzentrationen Sorbit. links: ohne Sorbit; mitte: 10 mM Sorbit; rechts: 50 mM Sorbit. Zwischen Mutante und wt ist kein Unterschied im Wachstum erkennbar.
Mit weiteren 24 Pflanzen (12 Homozygoten und 12 isogenen wt) wurden
Trockenstressexperimente auf Erde durchgeführt. Acht Wochen alte Pflanzen wurden dreimal
wöchentlich mit nur 20 ml Leitungswasser gegossen. Dies führte nach einer Woche zu einer
MS0
k.o. wt
Sorbit 10 mM
k.o. wt
Sorbit 50 mM
k.o. wt
Ergebnisse
48
sehr starken Anthocyanbildung, nach neun Tagen waren alle Pflanzen vertrocknet, wobei wt
und Mutanten genauso schnell starben. Auch Trockenstress rief keine Unterschiede im
Wachstum von wt und Mutanten hervor (nicht gezeigt).
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass unter keiner der genannten
Bedingungen Auffälligkeiten oder Veränderungen im Habitus beobachtet werden konnten.
Unter keiner der beschriebenen Bedingungen ließen sich phänotypische Veränderungen der
AtPLT5 T-DNA Insertionsmutante Mutante hervorrufen.
3.1.7.2 Affymetrix-Chip Analysen mit salk_050162
Nachdem die homozygote AtPLT5 T-DNA Mutante keinerlei phänotypische Veränderungen
zeigten, sollte untersucht werden, ob es in dieser Mutante mögliche Veränderungen in der
Transkriptionsrate einzelner Gene gibt. In diesem Fall wurden die RNA Level von
homozygoten AtPLT5 Mutanten mit denen von Arabidopsis col wt Pflanzen untersucht. Die
Microarray Analysen wurden mit dem Affymetrix ATH1 Chip durchgeführt, mit dem man
gleichzeitig ca. 24.000 Gene untersuchen kann. Es sollte getestet werden, ob sich das Fehlen
des AtPLT5 Proteins auf das Expressionsverhalten anderer Gene auswirkt. Die
Probenvorbereitung wurde von Frau Dr. Inga Barth durchgeführt, die freundlicherweise die
experimentelle Durchführung übernahm. Homozygote salk_050162 Pflanzen und deren
isogene Wildtypen wurden unter identischen Bedingungen angezogen. Aus drei Wochen alten
Pflanzen wurde dreimal unabhängig RNA aus Sourceblättern isoliert. Die Chip Analysen und
deren Auswertung wurden von Prof. Dr. Jürgen Soll und Dr. Anton Schäffner in München
durchgeführt (Barth, 2005). Tabelle 3. 6 zeigt die Änderung verschiedener Transkriptmengen
in der AtPLT5 salk_050162 Mutante im Vergleich zum Wildtyp.
In Tabelle 3. 6 sind die Gene aufgelistet, die reproduzierbar in drei unabhängigen
Experimenten eine signifikante Veränderung ihres Expressionslevels im Vergleich zum
Wildtyp zeigten. Solche Änderungen im Transkriptlevel werden standardmäßig durch den
Signal Log Ratio ausgedrückt (SLR-Wert).
Es sind nur die 12 stärksten reprimierten und induzierten Gene aufgeführt, wobei insgesamt
die Anzahl der signifikant reprimierten Gene höher war, als die Zahl der induzierten.
Außerdem werden die herunterregulierten Gene doppelt so hoch reguliert als die induzierten
Gene. Insgesamt war auch ein großer Teil unter den beeinflussten Genen unbekannt, d.h.
Datenbankvergleiche lieferten keine Ergebnisse (hypothetical protein / expressed protein).
Ergebnisse
49
Tabelle 3. 6: Ergebnisse der Affymetrix Chip Analysen der 12 stärksten reprimierten bzw. induzierten Gene. In den Spalten sind die Genkennungen (Representative Public ID), der Durchschnitt der logarithmischen Expressionsveränderung (SLR-Average; Signal Log Ratio) mit Standardabweichung (SLR-STdev), der p-Wert (p-value), der Wechsel der Genregulierung (Change), die n-fache Expressionsveränderung (FC; Fold Change) und das betroffene Gen (Gene Title) angegeben. Es sind die 12 am stärksten hoch- bzw. herunterregulierten Gene der AtPLT5-k.o.Mutante aufgelistet. Die Werte sind Durchschnittswerte aus drei unabhängigen RNA Isolierungen. Die RNA wurde aus drei Wochen alten Sourceblättern gewonnen.
In der salk_050162 Mutante am stärksten reguliert ist eine putative Galaktinol Synthase, die
laut der Chip Daten 4,38 fach niedriger exprimiert wird als im Wildtyp. Das Enzym Galaktinol-
Synthase katalysiert den ersten Schritt in der Biosynthese der Raffinose-Familie
Oligosaccharide, z.B. Raffinose, aus myo-Inosit und UDP-Galaktose. Ein Seneszenz-
assoziiertes Protein wird ebenfalls auffällig um den Faktor 3,77 reprimiert. GUS Experimente
mit AtPLT5-Promotor-GUS Pflanzen lieferten ebenfalls Hinweise auf ein seneszentes
Expressionsmuster (Abbildung 3. 1). Die anderen aufgelisteten Gene konnten mit einer
physiologischen Funktion von AtPLT5 nicht unmittelbar in Verbindung gebracht werden.
At1g56600 -4,38 2,38 0,034 Down 0,048027 galactinol synthase, putative
At2g11360 -3,91 0,59 0,042 Down 0,066523 hypothetical protein
At5g23030 -3,77 0,81 0,045 Down 0,073302 senescence-associated family protein
At5g28130 -3,54 0,81 0,039 Down 0,085971 hypothetical protein
At3g31300 -3,51 0,99 0,046 Down 0,087778 hypothetical protein
At5g34920 -3,48 0,9 0,047 Down 0,089622 ---
At3g29380 -3,32 0,52 0,011 Down 0,100134 transcription factor IIB (TFIIB) family protein
At5g28470 -3,29 0,6 0,012 Down 0,102238 proton-dependent oligopeptide transport family protein
At1g24390 -3,14 0,9 0,042 Down 0,11344 hypothetical protein
At4g07840 -3,1 0,7 0,023 Down 0,116629 ---
At3g53480 -3,05 0,61 0,01 Down 0,120742 ABC transporter family protein
At4g13235 -3 0,87 0,03 Down 0,125 hypothetical protein
At4g30410 2,06 0,79 0,005 Up 4,169863 expressed protein
At1g74670 2,08 1,29 0,035 Up 4,228072 gibberellin-responsive protein, putative
At2g16660 2,09 1,09 0,017 Up 4,257481 nodulin family protein
At1g52020 2,11 1,1 0,047 Up 4,316913 hypothetical protein
At5g49560 2,17 0,55 0 Up 4,500234 expressed protein
At1g71760 2,27 0,7 0 Up 4,823231 hypothetical protein
At2g47270 2,28 0,79 0,045 Up 4,85678 expressed protein
At2g26410 2,3 1,01 0,017 Up 4,924578 calmodulin-binding family protein
At3g45920 2,39 0,53 0,036 Up 5,241574 receptor protein kinase-related
At1g02050 2,42 0,86 0,015 Up 5,35171 chalcone and stilbene synthase family protein
At1g04040 2,44 1,32 0,038 Up 5,426417 acid phosphatase class B family protein
At3g32100 2,73 0,61 0,003 Up 6,634556 hypothetical protein
Ergebnisse
50
3.2 Charakterisierung von AtPLT1 und AtPLT2
3.2.1 Untersuchung der zeitlichen Expression von AtPLT1 und AtPLT2 im
Pollen
Die Expressionsmuster von AtPLT1 und AtPLT2 waren bereits in einer früheren Diplomarbeit
untersucht worden (Volke, 2005). Dazu wurden AtPLT1- bzw. AtPLT2-Promotor-GUS und -
GFP Pflanzen hergestellt und ausgewertet. AtPLT1 Expression wurde in Pollen,
auskeimenden Pollenschläuchen, in Leitbündeln sowie in Hydathoden festgestellt. AtPLT2
wurde ausschließlich im Pollen exprimiert. Da AtPLT1 und AtPLT2 auf Proteinebene zu 93,5%
identisch sind und beide Promotoren im Pollen aktiv waren, sollte nun untersucht werden, ob
die Expression von AtPLT1 und AtPLT2 in Pollen und auskeimenden Pollenschläuchen
zeitgleich oder ggf. nacheinander stattfindet. Zur Untersuchung der Expressionszeitpunkte von
beiden Genen, wurden Pollenkörner offener Blüten von MV7A (AtPLT1-Promotor-GUS) und
MV8A (AtPLT2-Promotor-GUS) Pflanzen auf Pollenkeimungsmedium ausgebracht und über
Nacht in einer feuchten Kammer aufbewahrt (5.2.7.5). Am nächsten Tag wurden die
Objektträger mit X-Gluc-haltiger GUS Färbelösung überschichtet und bei 37°C inkubiert.
Zudem wurden Fruchtknoten transgener AtPLT1- und AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen in
Technovit eingebettet und Handschnitte davon angefertigt (5.2.7.4).
Bei den AtPLT1-Promotor-GUS Pflanzen konnte in 7 von 30 Linien eine Färbung im
Pollenschlauch beobachtet werden. Es waren nur Pollen gefärbt, die am Auskeimen waren
und die Exine bereits aufgerissen war (Abbildung 3.17 A, B roter Pfeil). In ungekeimten Pollen
zeigte keine Linie AtPLT1-Promotor Aktivität (Abbildung 3.17 A, schwarzer Pfeil). In Abbildung
3.17 C ist der blaue Pollenschlauch eines auskeimenden Pollenkorns zu sehen. Von einigen
GUS-gefärbten Pflanzen wurden Fruchtknoten gerade befruchteter Blüten in Technovit
eingebettet (5.3.7.4) und dann mit der Rasierklinge längs geschnitten. In Abbildung 3.17 D, E,
F sind Längsschnitte von Fruchtknoten dargestellt. Die blau gefärbten Bereiche kommen
durch die blauen Pollenschläuche zu Stande, die durch das Durchlassgewebe durchwachsen.
Abbildung 3.17 F zeigt einen Ausschnitt aus dem oberen Teil eines Fruchtknotens. Im Inneren
der Samenanlagen ist hier keine Blaufärbung zu erkennen.
Ergebnisse
51
Abbildung 3. 17: Ergebnisse der AtPLT1 Pollenkeimung und Fruchtknotenlängsschnitte GUS-gefärbter AtPLT1-Promotor-GUS Pflanzen. A+B: GUS Aktivität in sich gerade öffnenden Pollenkörnern (roter Pfeil) und Pollenschläuchen (B). Der geschlossene Pollen zeigt keine Blaufärbung (schwarzer Pfeil). C: Stark blaues Pollenkorn und tief blau gefärbter ausgewachsener Pollenschlauch. D: Längsschnitt eines in Technovit eingebetteten, GUS-gefärbten, transgenen Fruchtknotens. E: wie D, Blaufärbung zwischen den Samenanlagen. F: Ausschnitt aus dem oberen Teil eines Fruchtknotens, es ist keine Färbung in den Samenanlagen zu sehen. Größenstandard: A: 15 µm; B: 20 µm; C: 40 µm, D: 150 µm; E: 80 µm, F: 30 µm.
In transgenen AtPLT2-GUS Pflanzen war die Promotor-GUS Aktivität bereits in ungekeimten
Pollen erkennbar. Alle 30 Linien zeigten eine tiefe Blaufärbung, die sowohl in ungekeimten
Pollen als auch in auskeimenden Pollenschläuchen nachgewiesen werden konnte. In
Abbildung 3.18 sind Pollen dargestellt, die sich in unterschiedlichen Reifezuständen befinden.
In Bild A sind blau gefärbte, ungekeimte Pollen abgebildet. In Bild B keimen die Pollen gerade
aus, hier sind deutlich die Pollenschlauchansätze zu sehen (blauer Pfeil). Bild C stellt einen
völlig ausgekeimten Pollen dar, in dem die Blaufärbung nicht nur im Pollen selbst, sondern
auch im Pollenschlauch zu erkennen ist (Abbildung 3.18).
Abbildung 3. 18: Ergebnisse der AtPLT2 Pollenkeimung GUS-gefärbter AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen. A: GUS Aktivität geschlossener Pollenkörner. B: Blau gefärbte geschlossene Pollenkörner und blau gefärbte gerade auskeimende Pollenkörner (blauer Pfeil). C: Blaues Pollenkorn und tief blau gefärbter ausgewachsener Pollenschlauch. Größenstandards: A: 15 µm, B+C: 10 µm.
B A C
D E F
A B C A
Ergebnisse
52
3.2.2 GUS Färbung und Einbettung in Technovit von Stängelgewebe der
AtPLT1- und AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen
Mit Hilfe von Antikörpern war das AtPLT1 und/oder das AtPLT2 Protein im Kambium von
Arabidopsis thaliana col wt Pflanzen lokalisiert worden (Volke, 2005). Aufgrund der Homologie
von AtPLT1 und AtPLT2 war es nicht möglich für AtPLT1 und AtPLT2 getrennte Antiseren
herzustellen (3.2.6). Ob es sich bei dem detektierten Protein um AtPLT1 oder/und AtPLT2
handelt, sollte mit einem unabhängigen Experiment geklärt werden. Dazu wurden AtPLT1-
bzw. AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen auf GUS Aktivität im Kambium untersucht. Es wurden
Stängel der transgenen Pflanzen aus der T2 Generation in unterschiedlich große Stücke (2-10
mm) quer geschnitten und mit X-Gluc-haltiger Lösung inkubiert, durch 2,5% Glutaraldehyd
fixiert und anschließend in Technovit eingebettet. (5.2.7.4) Die eingebetteten Gewebestücke
wurden mit der Rasierklinge in dünne Scheiben geschnitten und unter dem Mikroskop
betrachtet und fotografiert. Von insgesamt je 48 Nachkommen der AtPLT1- bzw. AtPLT2-
Promotor-GUS Pflanzen konnte nur jeweils eine Pflanze identifiziert werden, die eine GUS
Aktivität im Kambium zeigte (Abbildung 3.19; Abbildung 3.20). Es ist sehr wahrscheinlich dass
es sich dabei um ein echtes Signal handelt und ein Positionseffekt ausgeschlossen werden
kann. Eventuell unterliegt die GUS Expression von AtPLT1 und AtPLT2 im Kambium einem
„Silencingeffekt“, so dass die Promotoraktivität und damit die GUS Expression nicht mehr
nachgewiesen werden kann.
Abbildung 3. 19: Stängelquerschnitte von AtPLT1-Promotor-GUS Pflanzen mit GUS Aktivität im Kambium. Mit der Rasierklinge angefertigte Stängelquerschnitte transgener AtPLT1-Promotor-GUS Pflanzen zeigen blau gefärbte Bereiche im Bereich des Kambiums. A: Übersicht eines Querschnitts. B: Nahaufnahme des Kambiums. Größenstandards: A: 120 µm; B: 25 µm.
B A
Ergebnisse
53
Abbildung 3. 20: Stängelquerschnitte von AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen mit GUS Aktivität im Kambium. Mit der Rasierklinge angefertigte Stängelquerschnitte transgener AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen zeigen blau gefärbte Bereiche im Bereich des Kambiums. A: Übersicht eines Querschnitts. B: Nahaufnahme des Kambiums. Größenstandards: A: 60 µm; B: 25 µm.
3.2.3 Subzelluläre Lokalisierung von AtPLT1 und AtPLT2
Hefeaufnahmemessungen hatten gezeigt, dass sich das AtPLT1 bzw. das AtPLT2 Protein in
Bäckerhefe in der Plasmamembranen befindet (Volke, 2005; 3.2.4). Ob diese interzelluläre
Lokalisation auch für Pflanzen zutrifft, sollte anhand der transienten Expression in vivo
nachgewiesen werden. Dafür wurden Fusionsprodukte aus AtPLT1- bzw. AtPLT2 cDNA und
GFP hergestellt. (5.2.5.5.1). In den Ausgangsvektor pSO35e (Klepek et al., 2005) wurde die
AtPLT1 cDNA vor das GFP kloniert (pMV-L; Volke, 2005). In vorliegender Arbeit wurde in
gleicher Weise die AtPLT2 cDNA in pSO35e eingebracht (pYK26). Die subzelluläre
Lokalisierung von AtPLT1 mit der Particle Inflow Gun wurde von Melanie Volke (2005)
durchgeführt. Es wurden damals Arabidopsis thaliana col wt Blätter beschossen, die eine GFP
Lokalisation in der Plasmamembran zeigten. Die Ausbeute der fluoreszierenden
Epidermiszellen war allerdings sehr gering, so dass dieses Ergebnis noch mit einer anderen,
effizienteren Methode bestätigt werden sollte. Dazu wurden Arabidopsis thaliana col wt
Protoplasten isoliert und transient mit pMV-L transformiert (5.2.5.5.2). Am Tag nach der
Transformation wurden die Protoplasten zunächst unter dem Fluoreszenzmikroskop
betrachtet und die Transformationsrate von 70% bestimmt.
B A
Ergebnisse
54
Abbildung 3. 21: Transiente Transformation zur subzellulären Lokalisierung von AtPLT1. A: Zwiebel Epidermiszelle, die mit pAF30b (Plasmamembranlokalisation = Kontrolle) beschossen wurde (PIG). Aufgrund der Überexpression von AtSUC1 ist die GFP Fluoreszenz hauptsächlich im ER zu sehen. B+C: Protoplasten von Arabidopsis Blattepidermiszellen, die mit pMV-L transient transformiert wurden. Die roten Chloroplasten befinden sich innerhalb der grün leuchtenden Struktur, die aufgrund der durchgezogenen Linie als Plasmamembran identifiziert werden kann. D: Epidermiszelle von Arabidopsis, die mit pMV-L transient transformiert wurden (PIG). Chloroplasten in rot dargestellt, Plasmamembran in grün. E: Epidermiszelle von Tabak, die mit pMV-L beschossen wurde (PIG). Die roten Chloroplasten (gelbe Pfeile) liegen innerhalb der grünen Plasmamembran. F: Transient transformierte Epidermiszelle (PIG) von Zwiebel, die die GFP Fluoreszenz aufgrund von Überexpression hauptsächlich im ER zeigt. Größenstandards: A+F: 150 µm; B: 20 µm; C: 35 µm; D: 60 µM; E: 20 µm.
Unter dem KLSM wurden einzelne transformierte Protoplasten fotografiert. Abbildung 3. 21
zeigt die Protoplasten sowie die Particle Inflow Gun Beschüsse. In Bild A sind Zwiebel
Epidermiszellen zu sehen, die mit pAF30b beschossen wurden (Feuerstein, 2006). Bei
pAF30b handelt es sich um ein Kontrollplasmid (AtSUC1-GFP), das eigentlich in der
Plasmamenbran lokalisiert ist. Auf dem Bild Abbildung 3. 21 A ist die GFP Fluoreszenz
hauptsächlich im Endoplasmatischen Retikulum zu sehen, was daran liegt, dass bei der
transienten Expression ein Plasmid (pSO35e) mit einem 35s Promotor verwendet wird. Durch
die starke Überexpression befindet sich noch ein Grossteil des Proteins im ER und ist erst
noch auf dem Weg in die Plasmamembran. Ein weiterer Grund dafür könnte die Expression
eines artfremden Gens (aus Arabidopsis) in Zwiebel sein. In B und C sind transformierte
Arabidopsis Protoplasten gezeigt, die eine eindeutige GFP Fluoreszenz in der
C
A B C
D E F
Ergebnisse
55
Plasmamembran aufweisen, was durch die durchgezogene grüne Linie dargestellt wird. Die
Chloroplasten sind in der Abbildung 3. 21 rot dargestellt. Die grüne Fluoreszenz umschließt
die roten Chloroplasten, so dass es sich bei der markierten Struktur um die Plasmamembran
und nicht um den Tonoplasten handelt (Abbildung 3. 21). In D wurde eine Arabidopsis
Epidermiszelle fotografiert, die mit pMV-L beschossen wurde (Volke, 2005). Genau wie in E,
wo es sich um Blattepidermiszellen von Tabak handelt, kann eine Plasmamembran-
fluoreszenz detektiert werden. In E sind zwei rote Chloroplasten zusehen (gelbe Pfeile), die
innerhalb der grünen Fluoreszenzlinie liegen. In F ist eine Zwiebel Epidermiszelle abgebildet.
Wie bei der Kontrolle in Bild A ist auch hier aufgrund der Überexpression hauptsächlich ER zu
sehen (Abbildung 3. 21).
Für AtPLT2 konnte das gleiche Ergebnis erzielt werden. In Abbildung 3. 22 A ist eine Zwiebel
Epidermiszelle gezeigt, in der das GFP Reportergen ebenfalls in der Plasmamembran und im
Endoplasmatischen Retikulum, der Kern ist von GFP Fluoreszenz umgeben, fluoresziert.
Außerdem liegt der Kern innerhalb der scharf markierten Struktur, wodurch eine vakuoläre
Lokalisation ausgeschlossen werden konnte. Transformierten Tabak Epidermiszellen zeigten
im Bild B GFP Fluoreszenz, die der Plasmamembran zugeordnet werden konnte, da der rote
Kern sowie die blau gefärbten Chloroplasten innerhalb der leuchtenden Linie zu finden sind
(Pfeile). Die transformierten Protoplasten bestätigten die Particle Inflow Gun Versuche. In
Abbildung 3. 22 C und D liegen die roten Chloroplasten innerhalb der grün markierten,
durchgängigen Linie, was darauf hinweist, dass AtPLT2 ein transmembranales
Plasmamembranprotein ist.
Abbildung 3. 22: Transiente Transformation zur subzellulären Lokalisierung von AtPLT2. Unter dem KLSM fotografierte Epidermiszellen von Zwiebel und Tabak, die mit dem Konstrukt AtPLT2-GFP (pYK26) transformiert waren. A wurde unter Anregungslicht mit dem konfokalen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen und zeigt die Epidermis einer Zwiebel. In grün: Plasmamembran und Endoplasmatisches Retikulum. Der gelbe Pfeil zeigt auf den Kern. B zeigt eine Epidermiszelle eines Tabakblattes, das mit Propidiumiodid behandelt wurde. Nukleus und Zellwand in rot dargestellt, die Pfeile zeigen auf die blauen Chloroplasten und den Kern. Die GFP Fluoreszenz, in grün, liegt innerhalb der Plasmamembran und des ERs. In C und D sind transient transformierte Protoplasten mit dem KLSM fotografiert worden. Die Chloroplasten sind rot gefärbt und liegen innerhalb der grünen Struktur. Die durchgängige grüne GFP Fluoreszenz in C zeigt eine eindeutige Lokalisation ausschließlich in der Plasmamembran. Größenstandards: A: 150 µM; B: 20 µM; C: 20 µM; D: 25 µM.
Ergebnisse
56
3.2.4 Funktionelle Charakterisierung von AtPLT2 durch heterologe
Expression in Saccharomyces cerevisiae
Zur funktionellen Charakterisierung und Identifizierung der Substratspezifität wurde AtPLT2 in
Saccharomyces cerevisiae exprimiert. Die 1536 bp lange AtPLT2 cDNA wurde mittels PCR
amplifizert, wodurch zusätzlich NotI Schnittstellen und der 5’-nichttranslatierte Bereich von
AtSTP1 mit eingeführt wurden (3.1.2). Die durch Sequenzanalyse überprüfte fehlerfreie cDNA
wurde in den Hefeexpressionsvektor NEV-N kloniert (Sauer und Stolz, 1994). Das Plasmid mit
der AtPLT2 cDNA in sense Orientierung wurde mit pYK34, die antisense Orientierung von
AtPLT2 cDNA mit pYK35, bezeichnet. Mit diesen Plasmiden wurden die Hefestämme
EBY.VW.4000, SEY 2102 und Y14331 (EUROSCARF) transformiert (Tabelle 3. 7). Die
Aufnahmemessungen wurden in EBY.VW.4000 durchgeführt, ein Hefestamm, der keine
endogenen Glukosetransporter mehr besitzt (Wieczorke et al., 1999). Die Messungen zur pH
Abhängigkeit sowie die Kompetitormessungen wurden zu einem früheren Zeitpunkt in
SEY2102 durchgeführt. Für die Inositaufnahme wurde der Stamm Y14331 verwendet, der
über keine endogenen Inosittransporter mehr verfügt.
A B
C D
Ergebnisse
57
Tabelle 3. 7: Größe der AtPLT2 cDNA; verwendete Hefeexpressionsvektor und Enzym, resultierende Vektoren, Hefestamm und transformierte Hefestämme.
3.2.4.1 Aufnahmemessungen
Die Transportkapazität von AtPLT2 wurde mit unterschiedlichen Substraten in einer
Endkonzentration von 0,1 mM gemessen (5.2.4.2). Alle Vebindungen waren mit 14C markiert,
nur Inosit war durch Tritium radioaktiv markiert. Abbildung 3.23 und Tabelle 3.8 zeigen, dass
AtPLT2 Hexosen wie Fruktose oder Glukose, unterschiedliche Polyole wie Sorbit, Inosit oder
Glyzerin aber auch Pentosen wie Ribose transportiert. Xylit, die reduzierte Form von Xylose,
ist das favorisierte Substrat von AtPLT2. Dabei konnte nach 10 min eine Aufnahme von 938,6
± 155,7 nmol pro Gramm Frischgewicht festgestellt werden. Fruktose wird von AtPLT2
ebenfalls effektiv transportiert. Hier wurden nach 10 min 786,4 ± 37,5 nmol/g FG gemessen.
Glukose und Sorbit wurden gut transportiert (320,4 ± 71,6 und 342,9 ± 62,7 nmol/g FG),
Ribose und Xylose, zwei Pentosen fungieren auch als Substrate für AtPLT2, nach 10 min liegt
die Aufnahme hier mit 222,2 ± 20,0 und 128,8 ± 2,9 nmol/g FG schon deutlich niedriger als für
Glukose und Sorbit. Für Saccharose konnte ebenfalls eine Aufnahme ermittelt werden (101,2
± 7,4 nmol/g FG). Wahrscheinlich beruht diese Aufnahme darauf, dass Invertasen die
Saccharose in ihre Bestandteile Glukose und Fruktose hydrolisieren. Somit spiegelt vermutlich
der gemessene Wert nicht den Saccharosetransport wider, sondern eher den der beiden
Hexosen Glukose und Fruktose. Ob Saccharose tatsächlich ein Substrat für AtPLT2 ist,
könnte in einem Invertase-defizienten Hefestamm überprüft werden. Inosit, ein zyklisches
Polyol, wurde zunächst im Hefestamm EBY.VW.4000 gemessen, wobei die antisense
Aufnahme höher lag, als die Aufnahme des AtPLT2-exprimierenden Hefestamms (nicht
gezeigt), diese Aufnahmeraten beruhen auf hefeeigene Inosittransporter, somit waren diese
Werte nicht aussagekräftig. Deshalb wurde auf einen anderen Hefestamm (Y14331)
zurückgegriffen, der über keine endogenen Inosittransporter verfügt. In Y14331 konnte eine
schwache Transportkapazität für Inosit festgestellt werden (45,4 ± 3,6 nmol/g FG nach 10 min;
Abbildung 3. 23). Sehr schwach wurden auch noch Mannit und Glyzerin über die
Hefeplasmamembran transportiert (33,9 ± 8,1 20,6 ± 3,7 nmol/g FG nach 10 min). AtPLT2
besitzt ein breites Spektrum an Substraten, dass neben Polyolen verschiedener Kettenlänge,
z.B. Xylit und Sorbit wurden auch die dazugehörigen Zucker Xylose und Glukose als
AtPLT2 cDNA
Hefeexpressionsvektor
Resultierender Hefeexpressionsvektor Hefestamm Transformierte
Hefestämme
1579 bp NEV-N (NotI) pYK34 (sense)
pYK35 (antisense)
EBY.VW.4000
SEY 2102
Y14331
YKY6 (s), YKY7 (as)
YKY2 (s), YKY3 (as)
YKY17 (s), YKY18 (as)
Ergebnisse
58
Substrate beeinhaltet. Zyklische Polyole wie Inosit stellen ebenfalls schwache Substrate für
AtPLT2 dar. Ähnliche Ergebnisse wurden bereits für AtPLT1 und AtPLT5 erhalten und
könnten ein Hinweis auf die physiologische Funktion der Polyoltransporter sein (Abbildung 3.
23).
Aufnahme von YKY6 (sense) und YKY7 (antisense)
Zeit in min 0 2 4 6 8 10 Xylit sense 12,5 304,2 537,3 730,3 863,8 938,6 Xylit antisense 3,17 1,8 1,5 1,2 2,1 2,0 Fruktose sense 14,6 242,9 428,7 541,5 708,2 786,4 Fruktose antisense 6,3 6,8 9,3 8,6 11,3 15,8 Sorbit sense 5,5 70,5 146,5 215,2 272,7 342,9 Sorbit antisense 1,1 5,5 11 7,9 9,7 12,9 Glukose sense 15,4 99,5 169,9 233,2 283 320,4 Glukose antisense 0,4 2,4 5,2 7 6,1 10,4 Ribose sense 9 67,4 119,6 159 199 222,2 Ribose antisense 1,6 1,3 1,9 0,9 2,9 2,3 Xylose sense 2,3 35,2 63,1 97,6 111,2 128,8 Xylose antisense 2,4 2,8 4,2 6,7 8,5 8,3 Galaktose sense 2,2 9,5 13,3 16 18,6 19,7 Galaktose antisense 0,5 0,8 1,9 2,3 2,1 2,5 Saccharose sense 8,7 20,7 39,8 59,1 79,5 101,2 Saccharose antisense 5,2 3,7 5,3 8,4 4,5 10,9 Mannit sense 8,5 9,7 18,8 24,9 28,4 33,9 Mannit antisense 5,9 1,9 2,5 3,1 2,9 2,8 Glyzerin sense 6,1 5,2 15,9 13,5 15,2 20,6 Glyzerin antisense 2,9 2,5 2,9 6,7 2,5 6,1 Inosit sense 2,3 13,3 21,2 31,7 36,3 45,4 Inosit antisense 5,8 7,2 10,1 12,3 16,6 19,1
Tabelle 3. 8: Aufnahme unterschiedlicher Zucker bzw. Zuckeralkohole in nmol pro g FG über einem Zeitraum von 10 min von AtPLT2-exprimierender Hefen (YKY6, YKY17) im Vergleich zur Negativkontrolle (YKY7, YKY18). Angegeben ist der Mittelwert aus drei unabhängigen Messreihen. Aufgrund der Übersichtlichkeit wurde auf die Angabe der Standardabweichungen verzichtet.
Abbildung 3. 23: Transport unterschiedlicher radioaktiv markierter Substrate von AtPLT2 in AtPLT2-exprimierende Hefezellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Aufnahme radioaktiv markierter Zucker bzw. Zuckeralkohole (EK 0,1 mM) von AtPLT2- exprimierenden Hefen (YKY6 ) im Vergleich zur Negativkontrolle (YKY7 ) in nmol pro g FG. Im inositdefizient Hefestamm Y14331 wurde die Inositaufnahme gemessen (sense YKY17 , antisense YKY18 ). Es sind die Mittelwerte dreier unabhängiger Messreihen dargestellt.
Ergebnisse
59
Xylit
0
200
400
600
800
1000
1200
0 2 4 6 8 10Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Fruktose
0100200300400500600700800900
0 2 4 6 8 10Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Sorbit
050
100150200250300350400450
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G) Glukose
050
100150200250300350400450
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Ribose
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G) Xylose
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Ergebnisse
60
Saccharose
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Galaktose
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Glyzerin
0102030405060708090
100
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Mannit
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Inosit Y14331
05
101520253035404550
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)
Ergebnisse
61
Sorbitaufnahme von YKY2
0
20
40
60
80
100
120
140
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Aufn
ahm
e (n
mol
/g F
G)
Sorbitaufnahme von AtPLT2 in AtPLT2-exprimierende Hefen; Stamm SEY
2102
Die Kompetition, Inhibition und die pH Wert Messungen wurden für AtPLT2 mit Sorbit in einem
anderen Hefestamm durchgeführt, da damals die Glukoseaufnahme der AtPLTs noch nicht
bekannt war (dafür ist EBY.VW.4000 erforderlich) und SEY 2102 standardmäßig als
Hefestamm verwendet wurde. Um die Kompetitionsstudien und die pH Wert Untersuchungen
nun vergleichen zu können ist hier noch einmal die Sorbitaufnahme von AtPLT2 in SEY2102
(YKY2) gezeigt (119,7 ± 7,8 nmol/g FG nach 10 min) (Abbildung 3.24; Tabelle 3.9).
Abbildung 3. 24: Sorbittransport von AtPLT2 in YKY2 im Vergleich zur Negativkontrolle (YKY3). Sorbitaufnahme (EK 0,1 mM) von AtPLT2-exprimierenden Hefen (YKY2 ) im Vergleich zur Negativkontrolle (YKY3 ) in nmol pro g FG. Es sind die Mittelwerte dreier unabhängiger Messreihen dargestellt.
Aufnahme von YKY2 (sense) und YKY3 (antisense)
Zeit in min 0 2 4 6 8 10 Sorbit sense 6,83 38,45 60,54 82,01 102,45 119,70 Sorbit antisense 1,19 3,31 4,29 5,05 4,92 4,75
Tabelle 3. 9: Sorbitaufnahme von AtPLT2 in YKY2 in nmol pro g FG über einem Zeitraum von 10 min. sense = YKY2; antisense = YKY3, dargestellt als Mittelwerte aus drei unabhängigen Messreihen.
Ergebnisse
62
3.2.4.2 Einfluss von Kompetitoren auf die Sorbitaufnahme in YKY2
Um den Einfluss anderer Zucker bzw. Zuckeralkohole auf den AtPLT2-katalysierten Transport
zu untersuchen, wurde eine Kompetitormessung durchgeführt (5.2.4.2). Hierzu wurde die
Aufnahme von 14C-Sorbit (Endkonzentration 0,1 mM) in Anwesenheit von nicht radioaktiv
markierten Zucker bzw. Zuckeralkohollösungen ermittelt (Endkonzentration 10 mM =
100facher Überschuss), wobei die Kompetitoren 1 min vor der Sorbitzugabe zupipettiert
wurden. Als Kontrolle wurde unmarkiertes Sorbit verwendet, welches die Aufnahme von 14C-
Sorbit stark beeinflussen sollte. Das Spektrum an Kompetitoren beinhaltete unter anderem
Verbindungen, die bereits bei AtPLT1 und AtPLT5 hemmende Wirkung zeigten. Abbildung 3.
25 veranschaulicht das Ergebnis, wobei anhand der Balken der Mittelwert von drei
unabhängigen Messreihen dargestellt ist. In Tabelle 3. 10 ist die Sorbitaufnahme in
Anwesenheit der unterschiedlichen Kompetitoren in % angegeben.
Einfluss von Kompetitoren auf die Sorbitaufnahme von AtPLT2
0
20
40
60
80
100
120
Kontro
lleSorb
it
Mannit Xyli
tDulc
it
Erythri
t
Glyzeri
nIno
sit
Palatin
it
Sacch
arose
Glukos
e
Manno
se
Xylose
Arabino
se
Ribose
Sorb
itauf
nahm
e in
%
Abbildung 3. 25: Relative Sorbitaufnahme (%) von AtPLT2 in YKY2 unter Einfluss von Kompetitoren. Kompetitoren 100 facher Überschuss. Kontrolle = 14C-Sorbit ohne Kompetitor = 100%. Messwerte dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen. Kompetitoren mit 6 C-Atomen: graue Balken, 5 C-Atomen: braune Balken, 4 C-Atome gelb, 3 C-Atome grün, Disaccharid Saccharose in pink.
Ergebnisse
63
Kompetitor Kontrolle Sorbit Mannit Xylit Dulcit Erythrit Glyzerin Inosit 1. Messung 100 25 52 18 38 30 45 26 2. Messung 100 28 95 16 75 40 67 20 3. Messung 100 29 62 18 45 23 42 22 Mittelwert 100 27,33 69,67 17,33 52,67 31 51,33 20 STABW ± 0 ± 1,7 ± 18,37 ± 0,94 ± 16,05 ± 6,98 ± 11,15 ± 2,83
Kompetitor Palatinit Glukose Mannose Xylose Arabinose Ribose Saccharose 1. Messung 91 66 43 39 26 21 68 2. Messung 88 76 39 33 29 21 80 3. Messung 66 76 33 21 21 14 55 Mittelwert 81,67 72,67 38,33 31 25,33 18,67 67,67 STABW ± 11,15 ± 4,71 ± 4,11 ± 7,48 ± 3,3 ± 3,3 ± 10,21
Tabelle 3. 10: Relative Sorbitaufnahme (%) von AtPLT2 in YKY6 unter Einfluss von Kompetitoren (100 facher Überschuss). Die Werte sind im Vergleich zur Sorbitkontrolle dargestellt. Kontrolle = 14C-Sorbitaufnahme ohne Kompetitor = 100%.
In dem oberen Balkendiagramm der Abbildung 3. 25 ist zu erkennen, dass die
Kompetitormessung mit der vorherigen Messung, bei der die Aufnahme der einzelnen
radioaktiv markierten Verbindungen untersucht wurde, weitgehend übereinstimmt. Xylit, das
von den getesteten Verbindungen die höchste Aufnahme in YKY6 zeigte, konnte die
Sorbitaufnahme in den Kompetitormessungen am stärksten hemmen. Bei Xylit-, Ribose-, oder
myo-Inositzugabe im Überschuss konnte nur noch eine Sorbitaufnahme von 17% bis 20%
ermittelt werden. Ebenfalls starke kompetitive Eigenschaften wiesen myo-Inosit, Arabinose
und Erythrit auf, die die Aufnahme von 14C-Sorbit auf 20% bis 30% reduzierten. Auch Dulcit,
der Zuckeralkohol von Galaktose, verursachte eine 50%ige Hemmung der Sorbitaufnahme.
Glukose wurde sehr gut transportiert, die Hemmung der 14C-Sorbitaufnahme durch Glukose
beträgt nur 30%. Umgekehrtes wurde für Glyzerin beobachtet: hier war die radioaktive
Aufnahme sehr schlecht, wenn unmarkiertes Glyzerin im Überschuss zugegeben wurde,
hemmt es die Sorbitaufnahme um 50%. Unmarkiertes Mannit hemmte den Sorbittransport um
30%, radioaktiv wurde es allerdings sehr schlecht transportiert (Abbildung 3.23). Für diese
Unterschiede könnten allerdings die zwei verschiedenen Hefestämme - SEY2102
(Kompetitoren) und EBY.VW.4000 (Radioaktive Aufnahme) - verantwortlich sein.
Am stärksten wurde der Sorbittransport in AtPLT2-exprimierende Hefen durch Zucker (-
alkohole) mit fünf sowie mit sechs C-Atomen (myo-Inosit, Sorbit, Xylit) beeinflusst (Abbildung
3. 25; Tabelle 3. 10).
Ergebnisse
64
pH-Abhängigkeit der Sorbitaufnahme von AtPLT2
0,00
4,00
8,00
12,00
16,00
20,00
pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7
Auf
nahm
erat
e (n
mol
/ g
FG x
min
)
3.2.4.3 pH Abhängigkeit des AtPLT2 Transports in YKY2
Zunächst sollte das pH Optimum des Sorbittransports über AtPLT2 bestimmt werden, um
Hinweise auf die Elektrogenität des AtPLT2 Transports zu erhalten. Die Hefezellen wurden
dazu vor den Aufnahmemessungen in Natrium-Phosphatpuffer mit unterschiedlichen pH
Werten (5,0; 5,5; 6,0 und 7,0) resuspendiert. 14C-Sorbit wurde in einer Endkonzentration von
0,1 mM zu den Hefezellen gegeben. In Abbildung 3.26 bzw. Tabelle 3.11 sind die Mittelwerte
von drei unabhängigen Messreihen angegeben, wobei die Aufnahme in nmol pro Gramm
Frischgewicht und Minute dargestellt ist. In Abbildung 3.27 und Tabelle 3.12 sind die
prozentualen Werte der Sorbitaufnahme in % angegeben.
Abbildung 3. 26: pH Abhängigkeit von AtPLT2 in YKY2. Gemessene Sorbitaufnahmerate (nmol/g FG min). Messwerte dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Tabelle 3. 11: Sorbitaufnahme (EK Sorbit: 0,1 mM) von AtPLT2 in YKY2 in nmol pro Gramm Frischgewicht und Minute bei unterschiedlichen pH-Werten.
pH Wert 5 5,5 6 7 Messung 1 803 543 765 540 Messung 2 945 593 600 488 Messung 3 773 743 615 338 Mittelwert 840 568 683 455 STABW ± 92 ± 104 ± 91 ± 105
Ergebnisse
65
Abbildung 3. 27: pH Abhängigkeit der Sorbitaufnahme in YKY2 über AtPLT2 in %. Sorbitaufnahme in YKY2 bei pH 5 = 100%. Messwerte dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Tabelle 3. 12: Sorbitaufnahme in YKY2 über AtPLT2 in % bei unterschiedlichen pH Werten. Für die Auswertung wurde der 8 min Wert der Sorbitaufnahme bei pH = 5,0 als 100 % festgelegt und in Relation zu den 8 min Werten der restlichen Messungen gesetzt.
Im Gegensatz zu den anderen AtPLT Proteinen besitzt AtPLT2 eine deutlich schwächere pH
Abhängigkeit. In Abbildung 3.27 ist die Sorbitaufnahme bei pH 5,0 100% gesetzt. Bei pH Wert
Erhöhung auf pH 5,5 und pH 6,0 sind maximal 20% Aufnahmeeinbußen zu verzeichnen. Erst
bei pH 7,0 macht sich eine verminderte Sorbitaufnahme um 45% bemerkbar. Eine pH Wert
Änderung hat auf den Sorbittransport von AtPLT2 nicht in dem Maße Einfluß, wie es für
AtPLT1 und AtPLT5 gezeigt worden war (Volke, 2005; Klepek, 2003).
3.2.4.4 Einfluss der Hemmstoffe CCCP und PCMBS
Entkoppler (CCCP und DNP) schleusen Protonen durch die Membran, so dass der
Protonengradient über einer Membran zusammenbricht, was sich bei H+-Symportern in einer
Reduktion der Aufnahmefähigkeit bemerkbar macht (Delrot und Bonnemain, 1981). Für
pH Wert 5 5,5 6 7 Messung 1 100 69 95 68 Messung 2 100 76 64 54 Messung 3 100 79 76 43 Mittelwert 100 75 78 55 Standardabweichung ± 0 ± 5,13 ± 12,76 ± 10,23
pH Abhängigkeit von AtPLT2
0
20
40
60
80
100
120
pH 5 pH 5,5 pH 6 pH 7
Sorb
itauf
nahm
erat
e in
%
Ergebnisse
66
Einfluss von Hemmstoffen auf die Sorbitaufnahme von AtPLT2
0
20
40
60
80
100
120
Sorbit CCCP PCMBS
Sorb
itauf
nahm
erat
e in
%
AtPLT1 und AtPLT5 wurden die Aufnahmeraten durch Entkopplerzugabe deutlich reduziert
(Volke, 2003; Klepek, 2003). Auch die Aufnahme der Polyoltransporter aus Sellerie,
Sauerkirsche und aus Plantago wurde durch Protonophore eingeschränkt (Noiraud et al.,
2001; Gao et al., 2003; Ramsperger-Gleixner et al., 2004). Da PmPLT1 einen zusätzlichen
Cysteinrest enthält, wurde PmPLT1 außerdem durch das Sulfhydrilreagenz PCMBS gehemmt.
Für AtPLT2 sollte nun der Einfluss der Inhibitoren PCMBS und CCCP, die in einer
Endkonzentration von 50 µm 1 min vor 14C-Sorbitzugabe (EK: 0,1 mM) zugegeben wurden,
getestet werden. Es wurden drei unabhängige Messreihen, jeweils zu den Zeitpunkten 0, 2, 4,
6, 8, und 10 Minuten, durchgeführt (Abbildung 3. 28).
Abbildung 3. 28: Einfluss von Hemmstoffen auf die Sorbitaufnahmerate von AtPLT2 in YKY2. Relative Sorbitaufnahme in % dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen. Die Endkonzentration 14C-Sorbit betrug 0,1 mM, die Endkonzentration der Inhibitoren 50 µm.
In Abbildung 3. 28 ist der Einfluss der Hemmstoffe CCCP und PCMBS auf den AtPLT2
Sorbittransport abgebildet, die zugehörigen Werte sind in Tabelle 3. 13 aufgelistet. Die
Aufnahme von 14C-Sorbit ohne Inhibitor wurde 100% gesetzt. Die Anwesenheit des
Protonophors CCCP beeinträchtigte den Sorbittransport zu 75%. Überraschenderweise
beeinflusste PCMBS, das Sulfhydrilreagenz, die Transportkapazität von AtPLT2 ebenfalls
deutlich. Immerhin wurde die Aufnahme von Sorbit um 40% inhibiert. Normalerweise hemmt
PCMBS nur Disaccharidtransporter, für PmPLT1 kam die Hemmung durch einen zusätzlichen
Cysteinrest zu Stande, der bei AtPLT2 nicht vorhanden ist.
Ergebnisse
67
Tabelle 3. 13: Einfluss von Hemmstoffen auf die Sorbitaufnahme in YKY2 von AtPLT. Die Konzentration an 14C-Sorbit betrug 0,1 mM, der Inhibitor wurde 50 µM zugegeben. Die relative Sorbitaufnahme ist in % dargestellt, wobei die Sorbitkontrolle (ohne Inhibitor) 100% gesetzt wurde.
3.2.4.5 Km-Wert Bestimmung für AtPLT2 für Xylit, Glukose und Sorbit
Der Km-Wert von AtPLT2 wurde bestimmt, indem Aufnahmeraten von AtPLT2 in YKY6 bei
verschiedenen Subtratkonzentrationen gemessen wurden. Als Substrat wurde Xylit gewählt,
da dieses am besten durch AtPLT2 aufgenommen wurde (Abbildung 3. 23). In Tabelle 3. 14
sind die Xylitkonzentrationen aufgelistet, die für die Km-Wert Messung verwendet wurden.
Für jede Konzentration konnte somit die Transportgeschwindigkeit (nmol/g FG x min)
errechnet werden.
Xylitkonzentration (mM) Aufnahmerate (nmol/g FG x min) 0,02 2,30 ± 0,30 0,05 5,37 ± 1,58 0,1 7,45 ± 1,31 0,5 19,46 ± 2,73 2 20,80 ± 1,28
1 / Xylitkonzentration (1/mM) 1/Aufnahmerate (1/(nmol / g FG x min)) 50 0,44 ± 0,06 20 0,20 ± 0,06 10 0,14 ± 0,03 2 0,06 ± 0,01
0,5 0,05 ± 0,00 Tabelle 3. 14: Xylitaufnahme von AtPLT2 in YKY6 bei unterschiedlichen Glukosekonzentrationen. oben: Michaelis-Menten Darstellung; unten: Lineweaver-Burk Darstellung. Messwerte angegeben als Mittelwerte ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Hemmstoff CCCP PCMBS Sorbitkontrolle Messung 1 23 72 100 Messung 2 31 46 100 Messung 3 19 56 100 Mittelwert 24,3 58 100 STABW ± 6,1 ± 13,1 ± 0
Ergebnisse
68
Michaelis-Menten Auftragung der Aufnahmerate von AtPLT2 -exprimierenden Hefen
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
Xylitkonzentration (mM)
Auf
nahm
erat
e (n
mol
/ mg
FG/ h
)
Lineweaver-Burk Auftragung der Aufnahmeraten von AtPLT2 -exprimierenden Hefen
y = 0,0079x + 0,046
-0,10
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
-20 0 20 40 60
1/Xylitkonzentration
1/Au
fnah
mer
ate
(1/ n
mol
pro
mg
FG x
h)
Abbildung 3. 29: Michealis-Menten Auftragung der gemessenen Aufnahmerate (nmol/g FG x min) von AtPLT2 in YKY6 unter verschiedenen Xylitkonzentrationen. Messwerte dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Abbildung 3. 30: Lineweaver-Burk Auftragung der Xylitaufnahmerate von AtPLT2 in YKY6. Messwerte dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung drei unabhängiger Messreihen.
Ergebnisse
69
Anhand der Michaelis-Menten Auftragung (Abbildung 3. 29) kann man sehen, dass die Kurve
bei Konzentrationen von 0 mM bis 0,5 mM steil ansteigt und ab 0,5 mM auf einem Plateau
einpendelt. Das bedeutet, dass sich die Transportgeschwindigkeit von AtPLT2 ab ungefähr
0,5 mM Xylit in der Sättigung befindet und damit maximal ausgereizt ist. Über doppelt
reziproke Auftragung nach Lineweaver-Burk (Abbildung 3. 30) ließ sich anhand der
Geradengleichung der Km-Wert für Xylit von 0,18 mM ± 0,14 mM sowie die maximale
Aufnahmegeschwindigkeit von 362,33 (nmol/g FG x min) ermitteln (Tabelle 3. 15).
AtPLT2 Km-Wert für Xylit
AtPLT2 maximale Aufnahmegeschwindigkeit für Xylit
0,18 mM ± 0,14 mM 362,33 (nmol/g FG x min) Tabelle 3. 15: Km-Wert in mM und maximale Aufnahmegeschwindigkeit in (nmol/g FG x min) von AtPLT2 für Xylit. Außerdem wurden die Km-Werte von AtPLT2 in YKY6 für Sorbit und Glukose bestimmt.
Michaelis-Menten und Lineweaver-Burk Auftragung lieferte Werte von 5,08 mM ± 0,52 mM für
Sorbit und 1,25 mM ± 0,40 mM für Glukose (Diagramme nicht gezeigt; Tabelle 3. 16). AtPLT2
besitzt also eine deutlich höhere Affinität zu Xylit als zu Sorbit und Glukose, da der Km-Wert
für Xylit deutlich niedriger liegt.
AtPLT2 Km-Wert für Sorbit
AtPLT2 Vmax Sorbit
AtPLT2 Km-Wert für Glukose
AtPLT2 Vmax Glukose
5,08 mM ± 0,52 mM 1602,50 (nmol/g FG x min) 1,25 mM ± 0,40 mM 310,33
(nmol/g FG x min) Tabelle 3. 16: Km-Werte in mM von AtPLT2 in YKY6 und maximale Aufnahmegeschwindigkeit in (nmol/g FG x min) von AtPLT2 für Sorbit und Glukose.
3.2.5. Heterologe Expression von AtPLT1 und AtPLT2 in Xenopus laevis
Oozyten und elektrophysiologische Untersuchungen
Direkte Analysen zur Energieabhängigkeit von AtPLT1 und AtPLT2 wurde wie für AtPLT5 in
Xenopus laevis Oozyten durchgeführt. Mit Hilfe elektrophysiologischer Messungen können
Ströme ermittelt werden, die während eines Transportvorgangs entstehen. Dadurch ist es
möglich die jeweiligen Ionen, die zusammen mit dem Substrat transportiert werden zu
bestimmen. Auf diese Weise kann die Vermutung eines Protonen-Symport Mechanismus
verifiziert werden. Dazu wurde AtPLT1 bzw. AtPLT2 aus dem Hefexpressionsvektor NEV-N
über NotI ausgeschnitten und in den Oozytenexpressionsvektor pDK148 (Jespersen et al.,
2002) kloniert und über Restriktionsverdau überprüft. Diese Plasmide pMVOO1 (AtPLT1-
Ergebnisse
70
cDNA) und pMVOO2 (AtPLT2 cDNA) wurden linearisiert und dann in cRNA umgeschrieben,
die anschließend in die Oozyten injiziert wurde (5.2.8).
Die elektrophysiologischen Untersuchungen an AtPLT1- und AtPLT2-exprimierenden Oozyten
wurden von Kai Konrad in Würzburg durchgeführt. Die Oozyten wurden mit der Zwei-
Elektroden-Spannungsklemm Technik gemessen (5.2.8.3). Durch die Aufnahmemessungen,
die bereits in Hefe durchgeführt wurden war bekannt, dass Xylit, Fruktose, Sorbit und Glukose
bevorzugte Substrate von AtPLT1 bzw. AtPLT2 sind.
Abbildung 3. 31: Substratspezifität von AtPLT1 in AtPLT1-exprimierenden Xenopus Oozyten. Die verschiedenen Substrate wurden 10 mM zugegeben. Externer pH Wert 5,5. Das Membranpotential lag bei -40 mV.
Abbildung 3. 31 zeigt die gemessenen Einwärtsströme, die durch 10 mM Lösungen von
Glukose, Fruktose oder Xylit ausgelöst wurden. Die Strömstärke liegt zwischen 10 nA und 20
nA, die mit negativerer Membranspannung zunimmt (Abbildung 3. 31). Man kann sehen, dass
Glukose, Fruktose und Xylit in Xenopus etwa gleich gut über AtPLT1 transportiert werden. Die
Aufnahme von Xylit wurde bei unterschiedlichen pH Werten von 4,5 bis 8,5 in 0,5 Schritten
gemessen (nicht gezeigt). Das pH Optimum von AtPLT1 und AtPLT2 liegt in Xenopus bei 6,5.
Für AtPLT2 stimmt dieser pH Bereich mit den ermittelten Werten in den AtPLT2-
exprimierenden Hefen überein (3.2.4.3). Für AtPLT1 wurde in Saccharomyces cerevisiae ein
pH Optimum bei pH 5,0 ermittelt (Volke, 2005).
Alle Messungen wurden in Natrium-gepufferten System durchgeführt. Um das kotransportierte
Ion zu identifizieren, wurden Einwärtsströme für Xylit (10 mM) in verschiedenen
Puffersystemen gemessen. Dazu wurden verschiedene Medien verwendet: zum einen wurde
30 mM KCl + 65 mM NaCl, zum anderen 95 mM KCl und 95 mM NaCl allein und 95 mM
NMG-Cl, ein nichtpermeables Molekül als Kontrolle, verwendet.
10 mM Glukose 10 mM Fruktose 10 mM Xylit
Ergebnisse
71
Abbildung 3. 32: AtPLT1-vermittelte Einwärtsströme für Xylit in verschiedenen Puffersystemen bei pH Wert 5,5. Gemessen wurde KCl und NaCl (95 mM) sowie 30 mM KCl + 65 mM NaCl und 95 mM NMGCl. Membranpotential: -40 mV; Xylit (10 mM) wurde jeweils für 30 sec zugegeben.
Abbildung 3.32 zeigt für alle Pufferlösungen gleich große Einwärtsströme. KCl und NaCl sowie
NMG-Cl verursachten keine messbaren Unterschiede. Demnach sind weder K+, Na+, noch
NMG-Kationen für die Energetisierung des AtPLT1 Transports verantwortlich. Die gemessene
Stromstärke liegt bei allen Pufferlösungen zwischen -15 bis -20 nA. Das bedeutet, dass für
AtPLT1 ein Kotransport mit Protonen in Frage kommt.
Für AtPLT2 wurden in allen elektrophysiologischen Experimenten exakt die gleichen Werte
gemessen (Daten nicht gezeigt).
3.2.6. Lokalisierung des AtPLT1 und AtPLT2 Proteins
AtPLT2 ist wie AtPLT1 512 Aminosäuren lang mit einem errechneten Molekulargewicht von
54,9 kDA. Aufgrund der Homologie der Proteine (93,5%) wurde nach einer Epitopanalyse
festgestellt, dass zur Herstellung der αAtPLT1/2 Antiseren nur ein Peptidgemisch aus AtPLT1
und AtPLT2 in Frage kommt. Es wurde ein 17 AS langes C-terminales Peptid von AtPLT1
bzw. ein 18 AS langes C-terminales Peptid von AtPLT2 ausgewählt und synthetisch
hergestellt (NH2-CKVLDKTSNTKEEAISR-CONH2; NH2-CSYTANKKNNSMSKDNEV-CONH2). Dieses Peptidgemisch wurde zur Immunisierung von zwei Kaninchen (K1, K2) und einem
Meerschweinchen (M) eingesetzt. Es wurde mit den Seren vom 90. Tag nach der
Immunisierung gearbeitet. Melanie Volke konnte mit diesen Antikörpern AtPLT1 in Hefe
Plasmamembranen lokalisieren und AtPLT1 und/oder AtPLT2 im Kambium von Arabidopsis
thaliana col wt Pflanzen detektieren (Volke, 2005).
10 mM Xylit
Ergebnisse
72
3.2.6.1 Überprüfung der Antiseren in AtPLT2-exprimierenden Hefen
Für die Western Analysen für AtPLT2 wurden Gesamtmembran-, Endomembran- und
Plasmamembranfraktionen aus AtPLT2-exprimierenden Hefen YKY6 und dem
Kontrollhefestamm (YKY7) gewonnen. Die Proteinkonzentration der einzelnen Proben wurde
nach Bradford (5.2.6.1) bestimmt. Die Qualität der Auftrennung der verschiedenen
Membranfraktionen wurde mit einem Coomassie Blue-gefärbten SDS-PAGE überprüft (nicht
gezeigt).
Zur Überprüfung der αAtPLT1/2 Antiseren wurden je 10 µg Membranprotein
gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran übertragen, die mit dem
ungereinigten Kaninchenantiserum αAtPLT1/2-K1 über Nacht in einer 1:5000 Verdünnung
inkubiert wurde. Anschließend wurde die Nitrocellulosemembran mit einem sekundären,
Peroxidase-gekoppelten anti-Kaninchen IgG Antikörper behandelt (Abbildung 3.33).
Abbildung 3. 33: Western Blot der verschiedenen Membranfraktionen von AtPLT2-exprimierenden Hefen. 10 µg Proteinextrakte von Plasmamembranen (PM), Endomembranen (EM), Gesamtmembranen (GM) von YKY6 und YKY7 wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt, auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und anschließend mit αAtPLT2-K1 (Verdünnung 1:5000) behandelt. Roter Pfeil: AtPLT2 Protein in sense Plasmamembranen detektierbar. Der blaue Pfeil zeigt auf die dimere Form des AtPLT2 Proteins bei ca. 100 kDa.
Das AtPLT2 Protein wurde in der Plasmamembranfraktion der AtPLT2-exprimierenden Hefen
(YKY5) bei ~40 kDa erkannt, wohingegen im Kontrollstamm (YKY6) kein Signal auf dieser
Höhe detektierbar war (Abbildung 3.33). Die weitere Bande bei etwa ~100 kDa (grüner Pfeil),
stellt die dimerisierte Form des AtPLT2 Proteins dar, was bereits als bekanntes Merkmal
lipohiler Membranproteine angesprochen wurde (3.1.4.1). Der Unterschied von ~15 kDa
zwischen dem apparenten (~40 kDa) und dem errechneten Molekulargewicht (54,9 kDa) ist
auf die Lipophilie von Membranproteinen und die SDS Behandlung zurückzuführen. In den
as s as s as s GM GM EM EM PM PM
200 kDa
29 kDa
43 kDa
66 kDa
119 kDa
Ergebnisse
73
Gesamtmembranfraktionen ist keine Bande bei ~40 kDa vorhanden. Wahrscheinlich ist der
Anteil von AtPLT2 im Gesamtproteingehalt zu gering, um durch den αAtPLT1/2-K1 Antikörper
detektiert zu werden. In der antisense Fraktion der Gesamtmembran sowie in den
Endomembranen sind drei prominente Banden zu sehen, bei denen es sich um
Kreuzreaktionen des Antiserums handeln könnte. Außerdem ist in dem sense Stamm der
Endomembranen eine dünne Bande bei ~40 kDa zu erkennen, was auf eine unvollständige
Trennung von Plasmamembranen und Endomembranen zu Stande kommen könnte
(Abbildung 3.33). Die schwächeren Banden, die auf dem Röntgenfilm vor allem in der sense
Fraktion der Endomembranen zu erkennen waren, sind unspezifische Banden, die
wahrscheinlich durch unspezifische Bindung des αAtPLT1/2-K1 Antikörpers hervorgerufen
wurden. Mit den Antiseren αAtPLT1/2-K2 und αAtPLT1/2-M wurden in Western Analysen
etwas schwächere Signale erhalten (nicht gezeigt), so dass nur mit αAtPLT1/2-K1
weitergearbeitet wurde.
3.2.6.2 Immunozytologische Analysen von AtPLT1 und/oder AtPLT2 in
Hefedünnschnitten
Um zu überprüfen, ob das Antiserum αAtPLT1/2-K1 in der Lage ist das AtPLT2 Protein nach
der Einbettungsprozedur der Hefen in Methacrylat zu detektieren, wurde eine erste
Immunolokalisation (Verdünnung 1:1000) mit Dünnschnitten von AtPLT2-exprimierenden
Hefezellen (YKY6) und Kontrollhefen (YKY7), die beide in Methacrylat eingebettet wurden
(5.2.7.3), durchgeführt. Nach Behandlung der Schnitte mit einem sekundären FITC-
gekoppelten anti-Kaninchen IgG Antikörper (1:300) konnte nur ein Fluoreszenzsignal in den
Plasmamembranen der AtPLT2-exprimierenden Hefen erhalten werden, das in Kontrollhefen
nicht zu sehen war (Abbildung 3.34). Somit ist es mit dem αAtPLT1/2-K1 Antiserum möglich,
AtPLT2 in methacrylateingebetteten Hefen zu lokalisieren. Außerdem beschränkte sich die
grüne Fluoreszenz auf die Peripherie der Hefezellen und so konnte das Ergebnis der vorher
durchgeführten Aufnahmemessungen und Western Analysen bestätigt werden, dass AtPLT2
in Hefen ein Transmembranprotein der Plasmamembran ist.
Abbildung 3. 34: Immunozytologischer Nachweis von AtPLT2 in Hefe. AtPLT2-exprimierende Hefen (YKY6; A, B, C) und Kontrollhefen (YKY7; D, E, F) wurden mit αAtPLT1/2-K1 Antiserum, Verdünnung 1:1000, inkubiert und unter FITC Anregungslicht fotografiert (A, D); B, E zeigt die Überlagerung von FITC Anregungslicht und Durchlicht; Durchlicht (C, F). Größenstandard: A-C: 3 µm; D-F: 10 µm.
Ergebnisse
74
3.2.6.3 Immunolokalisation von AtPLT1 und/oder AtPLT2 in Dünnschnitten
verschiedener Gewebe von Arabidopsis thaliana col wt
In einer vorangegangenen Arbeit konnte gezeigt werden, dass AtPLT1 bzw. AtPLT2 mit dem
αAtPLT1/2-K1 Antiserum in Arabidopsis col wt im Kambium von Stängelgeweben
immunozytologisch nachgewiesen werden konnte (Volke, 2005). Da mit dem αAtPLT1/2-K1
Antiserum AtPLT1 und AtPLT2 erkannt werden, sollten nun Immunolokalisationen an
homozygoten AtPLT1 T-DNA Insertionslininen Aufschluss darüber geben, ob es sich bei dem
detektierten Protein um AtPLT1 oder AtPLT2 oder beide Proteine handelt. Dafür wurden
Mikrotomschnitte von eingebetteten, homozygoten AtPLT1 T-DNA Mutanten und Arabidopsis
thaliana col wt Pflanzen angefertigt. Die Schnitte wurden mit verschiedenen
Antikörperverdünnungen behandelt. Nach Inkubation mit dem sekundären FITC-gekoppelten
Antikörper konnte in sowohl in col wt Schnitten als auch in den AtPLT1 Mutanten Schnitten ein
starkes Signal im Kambium erhalten werden (Abbildung 3.35). Demnach ist davon
auszugehen, dass sowohl AtPLT1 als auch AtPLT2 im Kambium lokalisiert sind, da in den
AtPLT1 homozygoten T-DNA Insertionslinie noch immer ein starkes Fluoreszenzsignal zu
sehen war. Da für AtPLT2 keine T-DNA Insertionslinie verfügbar ist, konnte dieses Experiment
für AtPLT2 nicht durchgeführt werden.
A B C
D E F
Ergebnisse
75
Abbildung 3. 35: Immunozytologischer Nachweis von AtPLT1 bzw. AtPLT2 in Arabidopsis thaliana. Stängelquerschnitte einer homozygoten AtPLT1 T-DNA Mutante (A, B, C) und einer Arabidopsis col wt Pflanze wurden mit einer 1:5 Verdünnung des gereinigten αAtPLT1/2-K1 Antiserums inkubiert und unter FITC Anregungslicht fotografiert (A, D); B, E zeigt die Überlagerung von FITC Anregungslicht und Durchlicht; Durchlicht (C, F). Größenstandard: A-C: 150 µm; D-F: 100 µm. In Wildtyp und in Mutanten ist ein gleich starkes Signal im Kambium sichtbar.
Eingebettete Stängelquerschnitte von Arabidopsis col wt Pflanzen sowie der homozygoten
AtPLT1 T-DNA Mutante zeigten mit dem gereinigten αAtPLT1/2-K1 Antiserum (Verdünnung
1:5) deutliche Fluoreszenzsignale im Kambium (Abbildung 3.35). Das bedeutet, dass in der
homozygoten AtPLT1 Mutante mit dem αAtPLT1/2-K1 Antiserum AtPLT2 Protein detektiert
werden kann, da das AtPLT1 Protein in der Mutante nicht mehr vorhanden ist (Volke, 2005).
Die Signalstärke unterscheidet sich in col wt Pflanzen kaum von den Mutanten. Dies legt die
Vermutung nahe, dass das AtPLT1 Protein in den col wt Pflanzen nicht den Hauptteil
ausmacht. Die Signale waren intensiver, wenn das ungereinigte αAtPLT1/2-K1 Antiserum
(1:2000) zum Einsatz kam (Daten nicht gezeigt).
3.2.7 RNA Interferenz für AtPLT1_2 und AtPLT1_5
Zum Zeitpunkt dieser Arbeit standen vom Salk Institut für vier AtPLT Gene diverse T-DNA
Insertionslinien zur Verfügung. Nur für AtPLT2 und AtPLT3 waren keine Linien erhältlich. Es
wurden im Rahmen der Diplomarbeiten von Yvonne Klepek (2003) und Melanie Volke (2005)
Genotypisierungen von putativen AtPLT1- und AtPLT5 T-DNA Insertionslinien durchgeführt.
A B C
D E F
Ergebnisse
76
AtPLT1&2 AtPLT3 AtPLT4 AtPLT5 154 bp 144 bp 184 bp 150 bp
1
2
3
4
5 7
6 8
XhoI XbaI
8HindIII KpnI
Leider zeigte keine homozygote Pflanze der untersuchten T-DNA Mutanten phänotypische
Veränderungen. Auch nicht, wenn die Pflanzen möglichen Stressbedingungen ausgesetzt
wurden (3.1.7.1). Da die AtPLT Genfamilie aus sechs Mitgliedern besteht, deren genaue
Funktion noch unbekannt ist, ist es aufgrund der überlappenden Expressionsmuster möglich,
dass diese Gene redundante Funktionen erfüllen. Möglicherweise bleibt also der knock out
eines Gens der AtPLT Familie ohne Einfluss auf das Wachstum von Arabidopsis thaliana, da
die anderen Familienmitglieder den Ausfall eines Gens kompensieren. Um einen Phänotyp zu
provozieren sollten in einem Schritt AtPLT Mehrfachverlustmutanten mittels RNA Interferenz
hergestellt werden. Bei dieser Methode löst kurze dsRNA, so genannte siRNA, eine
Degradation der komplementären mRNA aus. Dies führt zu einem posttranskriptionellen „gene
silencing“ und die Expression des Gens, von dem die mRNA transkribiert wurde, kann bis zu
90% reduziert werden (Wesley et al., 2001).
Es wurden zwei verschiedene Ansätze gewählt. Zum einen sollte ein Konstrukt hergestellt
werden, das spezifisch AtPLT1 und AtPLT2 anspricht, da diese beiden Gene zu 95% homolog
in ihren DNA Sequenzen sind. Hier war es kein Problem eine geeignete homologe Sequenz
zu finden. Ein Sequenzvergleich aller AtPLT Gene lieferte leider keine DNA Region, in der alle
Gene homolog zueinander waren, so dass mit dieser einen Sequenz (ca. 200 bp)
möglicherweise alle AtPLTs herunterreguliert werden könnten. Deshalb musste die DNA
Sequenz für das RNAi Konstrukt aus verschiedenen Bereichen einzelner AtPLT Gene
zusammengebaut werden. Diese Bereiche wiederum wurden so gewählt, dass sie noch
möglichst homolog zu anderen AtPLT Genen waren. Es sollte ein insgesamt 632 bp langes
DNA Fragment aus vier Einzelfragmenten hergestellt werden. Auf 154 bp AtPLT1&2 Sequenz
sollten 144 bp AtPLT3 Sequenz, dann 184 bp AtPLT4 Sequenz und dann 154 bp AtPLT5
Sequenz folgen. Um dieses Konstrukt herzustellen, wurde experimentell auf die so genannte
Oligo Extension Methode zurückgegriffen (5.2.2.9). Abbildung 3.36 zeigt schematisch das
Prinzip der Oligo Extension für das Konstrukt AtPLT1_5.
Abbildung 3. 36: Schematische Darstellung des Prinzips der Oligo Extension zur Herstellung eines RNAi Konstrukts für AtPLT1_5. Rot: Fragmente, die für das jeweilige Gen charakteristisch sind (bp Länge angegeben). Oligonukleotide in grün dargestellt. Gelb sind die Restriktions-schnittstellen für den Vektor pHANNIBAL (Wesley et al., 2001).
Ergebnisse
77
Bei der Oligoextension wurden Primer eingesetzt, die mindestens je 20 bp kodierende
Sequenz beider zu verbindenden DNA Fragmente enthielten. Die 5’-Primer beginnen also mit
ca. 20 bp der komplementären Sequenz des 3’-Endes des vorangehenden DNA Fragments
und enden mit mindestens 20 bp bindender Sequenz des folgenden DNA Bereichs. Bei den
3’-Primern ist es genau umgkehrt (Abbildung 3.36; Primer 2, 4, 6). Die so genannten
„Endprimer“, Primer 1 und Primer 8, enthalten anstatt der komplementären Sequenzen der
angrenzenden DNA Bereiche nur Schnittstellen für den Vektor pHANNIBAL (Abbildung 3. 36;
Wesley et al., 2001). Nun amplifiziert man in einer ersten PCR jeweils mit den
Primerkombinationen 1&2, 3&4, 5&6 und 7&8 die einzelnen DNA Fragmente AtPLT1&2,
AtPLT3, AtPLT4 und AtPLT5 (Abbildung 3. 37). Diese Reaktion wurde mit einer Proof Reading
Polymerase durchgeführt (5.2.2.4).
Abbildung 3. 37: Agarosegel der vier gereinigten Einzelfragmente. Spur 1: AtPLT1&2 (154 bp); Spur 2: AtPLT3 (144 bp); Spur 3: AtPLT4 (184 bp); Spur 4: AtPLT5 (150 bp).
Alle vier PCR-Produkte wurden über Säulchen gereinigt (5.2.2.5; Abbildung 3. 37) und
anschließend vereinigt, wobei jedes Fragment zu 20 ng in der Gesamtmischung vertreten war.
Mit dieser Gesamtmischung aus allen Fragmenten wurde nun die zweite PCR mit den
Endprimern 1 und 8 durchgeführt. Zur korrekten Anlagerung der einzelnen Fragmente muss
man in diesem Schritt einen Präzyklus durchführen: dieser besteht aus einer 4-minütigen
Annealingzeit bei 68°C und einer 4-minütigen Elongationszeit bei 68°C. Anschließend wurden
25 Zyklen durchgeführt bei denen die Zeit auf 30 Sekunden verkürzt wurde.
Abbildung 3. 38: Agarosegel des Gesamt-RNAi Konstrukts. Das Gesamtfusionsnukleotid aus den Einzelfragmenten AtPLT1&2, AtPLT3, AtPLT4 und AtPLT5 ist 632 bp lang.
100 bp
300 bp
600 bp
200 bp
500 bp
800 bp 700 bp
900 bp 1000 bp
400 bp
100 bp
300 bp
600 bp
200 bp
500 bp
800 bp
700 bp
900 bp 1000 bp
400 bp
632 bp
Ergebnisse
78
Schritt 1
ocs-Terminator AP
Intron
CaMV 35S-Promotor
Insert sense
(632 bp) Insert antisense
(632 bp)
I PstI SacI XhoI KpnI HindIII XbaI
pHANNIBAL
Schritt 2
Das Ethidiumbromid-gefärbte Agarosegel (Abbildung 3.38) zeigt das gewünschte DNA
Fragment von 632 bp. Dieses wurde anschließend gereinigt und zur Verifizierung in den pCR-
BluntII TOPO-Vektor kloniert und darin sequenziert (pYK36). Das korrekte und komplette DNA
Stück wurde danach in den Vektor pHANNIBAL umkloniert. Dieser Vektor erlaubt es, ein
PCR-Produkt eines auszuschaltenden Gens bzw. einer ganzen Genfamilie in ein „RNA
silencing“ Konstrukt zu konvertieren. Das 632 bp Fragment, wird einmal in sense und einmal
in antisense Richtung in pHANNIBAL ligiert. Die beiden Inserts werden durch ein 740 bp
großes Intron getrennt, welches eine Haarnadelschleife (ihpRNA) nach der Transkription
ausbildet. Die Expression steht unter der Kontrolle des 35s Promotors aus Blumenkohl
(CaMV). Für die Klonierung in pHANNIBAL wurde folgendermaßen vorgegangen: im ersten
Schritt wurde das Insert in antisense Richtung über HindIII und XbaI in den Vektor ligiert
(Abbildung 3.39). Im zweiten Schritt wurde das 632 bp lange Fragment über XhoI und KpnI in
sense Orientierung inseriert. Nun enthielt der resultierende Vektor pYK37 dasselbe 632 bp
lange Insert in sense und in antisense Orientierung, welche durch ein Intron voneinander
getrennt waren (Abbildung 3.39).
Abbildung 3. 39: Schematische Darstellung des Konstrukts für RNAi AtPLT1_5 in pHANNIBAL. Die Expression des Konstrukts steht unter der Kontrolle des 35s Promotors. Das Insert in sense Orientierung wurde über XhoI und KpnI in pHANNIBAL kloniert für die antisense Orientierung wurde HindIII und XbaI verwendet.
Das komplette Konstrukt wurde über SacI und SdaI aus pYK37 herausgeschnitten und in den
Pflanzentransformationsvektor pAF16 ligiert (Feuerstein, 2006) und danach Arabidopsis
thaliana col wt Pflanzen transformiert. (5.2.5.4). Eine Selektion der Samen mit Basta ergab 32
Transformanden, die vereinzelt wurden und weiter angezogen wurden. Phänotypisch konnte
Ergebnisse
79
bei den BASTA resistenten, transgenen Pflanzen jedoch keine Veränderungen festgestellt
werden. Deshalb wurde aus allen Transformanden gDNA isoliert, um die RNAi Kassette (632
bp) nachzuweisen.
Abbildung 3. 40: Nachweis der RNAi Kassette in gDNA Extrakten von RNAi1_5 Transformanden. In allen 32 Transformanden ist die 632 bp lange RNAi Kassette nachweisbar (blauer Pfeil), exemplarisch sind hier 7 Transformanden gezeigt. In col wt (gelber Pfeil) fehlt die Bande bei 632 bp. Aktin1 (390 bp; roter Pfeil) wurde als Kontrolle mitgeführt.
In allen 32 transgenen Pflanzen konnte mit den so genannten Endprimern (Primer 1 und
Primer 8; Abbildung 3.40) die gesamte RNAi Kassette (632 bp) nachgewiesen werden. Zur
Kontrolle wurde Aktin1 mitgeführt (390 bp). In untransformierten Arabidopsis col wt Pflanzen
war erwartungsgemäß keine RNAi Kassette amplifizierbar (Abbildung 3.40; gelber Pfeil).
Um Veränderungen in der Transkriptionsrate festzustellen wurde aus den 32 Transformanden
RNA aus ca. 30 mg Gewebe isoliert und in einer RT-PCR in cDNA umgeschrieben.
Anschließend wurde in einer PCR Reaktion untersucht, ob sich die mRNA der
unterschiedlichen AtPLT Gene durch das RNAi Konstrukt veränderte. Es wurden
Primerkombinationen für die Amplifikation von AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 und AtPLT5
ausgewählt, als Kontrolle diente ein PCR Ansatz mit Aktinprimern (Abbildung 3.41).
Abbildung 3. 41: Nachweis der verschiedenen AtPLT cDNAs in transgenen RNAi Pflanzen. Die PCR wurde mit Aktinprimern (390 bp) und Primer für AtPLT1 (1536 bp), AtPLT2 (1536 bp), AtPLT4 (1581 bp) und AtPLT5 (1620 bp) durchgeführt. Als Kontrolle diente nichttransformierte Arabidopsis col wt cDNA (K). Bei den transgenen Pflanzen (1-7) ist keine Regulierung der Genexpression der unterschiedlichen AtPLT Gene zu erkennen.
2614 bp
4396 bp
354 bp
10496 bp
6262 bp
3673 bp
11385 bp
1804 bp 1701 bp
1915 bp 2014 bp
973 bp 1112 bp
657 bp 621bp 537 bp
1 Std 2 3 4 Std 5 6 7 Std col wt
RNAi Kassette 632 bp
Aktin 1 390 bp
AtPLT1 1536 bp
AtPLT5 1620 bp
Aktin1 390 bp
K 1 2 3 4 5 6 7 K 1 2 3 4 5 6 7 K 1 2 3 4 5 6 7 K 1 2 3 4 5 6 7 K 1 2 3 4 5 6 7
AtPLT2 1536 bp
AtPLT4 1581 bp
Ergebnisse
80
In Abbildung 3.41 sind beispielhaft die cDNA Mengen von AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 und
AtPLT5 sieben transgener Pflanzen und einer Kontrollpflanze dargestellt. In der Aktinkontrolle
ist zu sehen, dass in allen sieben Transformanden und in der col wt Pflanze (K) die gleichen
cDNA Mengen vorhanden waren. Bei der PCR mit Primern für die AtPLT Gene ist bei keiner
Transformande eine Regulation auf mRNA Ebene zu erkennen. Alle AtPLT Gene sind gleich
stark exprimiert. Für alle anderen, untersuchten 25 Transformanden, wurde das gleiche
Ergebnis erhalten (nicht gezeigt).
RNAi für AtPLT1_2
Da für AtPLT2 keine T-DNA Insertionslinie erwerbbar war, sollte mit der Oligo Extension
Methode versucht werden AtPLT1 und/oder AtPLT2 in einem Schritt herunterzuregulieren.
Ein Sequenzvergleich von AtPLT1 und AtPLT2 ergab eine Homolgie der beiden Gene von
93,5% auf DNA Ebene. Es wurden zwei DNA Bereiche ausgewählt: Der 472 bp lange Bereich
(AtPLT1_2 RNAi_1) beinhaltete die Sequenz der AtPLT1 cDNA zwischen Basenpaar 719 und
1191. Das 252 bp lange Fragment deckte den Bereich zwischen Basenpaar 939 und 1191 ab
(AtPLT1_2 RNAi_2). Die Sequenzidentität zu AtPLT2 lag bei 96,6% bzw. 96,4%. Für die
Amplifikation der Fragmente wurden die Primerkombinationen (AtPLT1c+719f /
AtPLT1c+1191r) bzw. (AtPLT1c+939f / AtPLT1c+1191r) gewählt. Die experimentelle
Vorgehensweise (PCR und Klonierung in TOPO) orientierte sich an dem RNAi Konstrukt für
AtPLT1_5. Die RNAi Fragmente wurden über XbaI und HindIII in antisense Orientierung in
den Vektor pHANNIBAL eingeführt. Die resultierenden Vektoren wurden pMV RNAi_1.1 bzw.
pMVRNAi_2.1 genannt. In diese Vektoren wurde das jeweilige RNAi Fragment über KpnI und
XhoI in sense Orientierung kloniert (pMV RNAi 1.2 bzw. pMV RNAi 2.2). Diese Konstrukte
wurden in pAF16 eingebracht (Feuerstein, 2006), die dann zur Transformation von
Arabidopsis col wt Pflanzen verwendet wurden (pMVRNAi1.2end; pMVRNAi2.2end). Nach
Aussaat und anschließender BASTA Selektion standen für das Konstrukt RNAi_1 71 Pflanzen
zur Verfügung, bei Konstrukt RNAi_2 waren es 111 Pflanzen. Aus allen RNAi_1 Pflanzen
wurde RNA im kleinen Maßstab isoliert und damit anschließend eine RT-PCR durchgeführt.
Die Auswertung der 111 RNAi_2 Pflanzen steht noch aus. Abbildung 3.42 zeigt 11 Pflanzen
mit veränderter AtPLT2 Transkriptmenge.
Ergebnisse
81
Abbildung 3. 42: Agarosegel der cDNA für AtPLT1 und AtPLT2 sowie Aktinkontrolle in 11 RNAi Pflanzen für Konstrukt AtPLT1_2 RNAi_1. Erwartete Größen: AtPLT1 1242 bp (gelber Pfeil); AtPLT2 703 bp (roter Pfeil), Aktin 390 bp (grüner Pfeil).
In Abbildung 3.42 ist zu erkennen, dass die Aktinkontrolle sowie AtPLT1 und AtPLT2 in der
Kontrollpflanze Arabidopsis thaliana col wt vorhanden sind (Spur 1, 2, 3). Bei 320 bp kann
außerdem in jeder transgenen Pflanze Aktin nachgewiesen werden. AtPLT1 wurde über die
Primerkombination 1c_11f + 1c_1253r amplifiziert, wobei der Forward Primer spezifisch für die
AtPLT1 Sequenz ist. AtPLT2 wurde über die Primerkombination 2c_550f und 2c_1253r
vervielfältigt. Hier ist der Forward Primer intronüberlappend, so dass eine genomische
Kontamination ausgeschlossen werden konnte (siehe schematische Abbildung 3.43). In
Pflanze 9 sieht man bei der AtPLT1 Bande, dass hier außer RNA trotzdem noch genomische
DNA vorhanden ist. Bei allen anderen Pflanzen war die AtPLT2 Bande nicht detektierbar.
Möglicherweise wird AtPLT2 durch das RNAi Konstrukt „gesilenced“. Allerdings würde man
bei RNAi eher eine Herunterregulierung des gewünschten Gens erwarten, die in jeder Pflanze
unterschiedlich sein sollte. Aus Zeitgründen war es nicht mehr möglich, dieses Ergebnis mit
Real Time PCR zu bestätigen. Für AtPLT1 konnte keine Regulierung durch das RNAi
Konstrukt festgestellt werden, da sich die mRNA Mengen in der wt Kontrolle nicht von den
mRNA Mengen der Transformanden unterschieden.
Abbildung 3. 43: Schematische Darstellung der genomischen DNA von AtPLT1 und AtPLT2. oben: AtPLT1 (1715 bp), Exons in rot; Introns hellgrün. Blaue Pfeile symbolisieren die Primerbindung (1c_11f / 1c_1253r). unten: AtPLT2 (1722 bp), Exons in blau; Introns hellgrün. Blaue Pfeile symbolisieren die Primerbindung (2c_550f / 2c_1253r).
Std wt 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Std
390 bp 703 bp
1242 bp
5’- -3’ ATG TGA
Intron 1 Intron 2128 219 566 6541 1715
1c_1253r
1c_11f AtPLT1
5’- -3’ ATG TGA
Intron 1 Intron 2128 222 569 6611 1722
2c_1253r
2c_550f AtPLT2
Ergebnisse
82
3.3 Ergebnisse für AtPLT4
Ergebnisse zur Lokalisation der Expression von AtPLT4 wurden in einer vorangegangenen
Arbeit erhalten (Klepek, 2003). AtPLT4-Promotor-GFP Pflanzen und AtPLT4-Promotor-GUS
Pflanzen zeigten Promotoraktivität in Trichomen junger Blätter. An der Blattbasis war die
Fluoreszenz am stärksten, während zur Blattspitze hin die Fluoreszenz deutlich abnahm.
Optisch war demnach ein Sink/Source Übergang zu erkennen, wobei die Fluoreszenz zum
Sourcegewebe hin schwächer wurde. Ein weiterer Expressionsort von AtPLT4 waren Wurzeln,
wobei GFP Fluoreszenz und GUS Aktivität in der Wurzelspitze und der Elongationzone gleich
stark war.
3.3.1 Subzelluläre Lokalisierung von AtPLT4
Um die subzelluläre Lokalisierung von AtPLT4 zu klären, sollte die transiente Expression
eines AtPLT4-GFP Fusionskonstrukts untersucht werden. Wie für AtPLT5, AtPLT1 und
AtPLT2 wurde die AtPLT4 cDNA vor das GFP in den Vektor pSO35e kloniert. Mit dem
erhaltenen Plasmid pYK30 wurden Arabidopsis thaliana col wt Blätter sowie Tabak- und
Zwiebelblätter mit Hilfe der Particle Inflow Gun beschossen. Als Positivkontrolle für eine
Plasmamembranlokalisation wurde pYK25 (AtPLT5-GFP) gewählt (nicht gezeigt).
Abbildung 3.44 A zeigt eine Arabidopsis Epidermiszelle, in der das GFP Reportergen in der
Plasmamembran und im Endolasmatischen Retikulum fluoresziert. Das ER ist durch die
Hechtschen Fäden (rote Pfeile) gut zu erkennen. B stellt die Überlagerung mehrerer
Einzelschnitte von A dar. Hier sieht man das Netzwerk des Endoplasmatischen Retikulums.
Bei den hellgrün leuchtenden Punkten handelt es sich um Golgi Vesikel, die vor allem in B
deutlich hervorgehoben sind. In der Zwiebelepidermiszelle in C liegt der Kern (gelber Pfeil) in
der grün leuchtenden Struktur, die die Plasmamembran kennzeichnet. In D ist das ER
Netzwerk und die Hechtschen Fäden von drei transient transormierten Zwiebelepidermiszellen
zu erkennen. Transformierte Tabak Epidermiszellen zeigten ebenfalls eine Lokalisation in der
Plasmamembran und im ER. In dem Beispiel E kann die Fluoreszenz der Plasmamembran
und nicht dem Tonoplasten zugeordnet werden, da der Kern sowie die roten Chloroplasten
innerhalb der leuchtenden Linie zu finden sind (Pfeile). In D ist die Überlagerung einer
AtPLT4-GFP-exprimierenden Tabak Epidermiszelle gezeigt, bei der die diffuse Fluoreszenz
auf das Netzwerk des ERs hindeutet. Anhand dieser Aufnahmen ist eine ganz eindeutige
Lokalisation von AtPLT4 nicht möglich. Teile des Fusionsproteins sind eindeutig in der
Plasmamembran zu finden, jedoch ist auch ein großer Teil im Endoplasmatischen Retikulum
positioniert (Abbildung 3.44).
Ergebnisse
83
Abbildung 3. 44: Transiente Transformation zur subzellulären Lokalisierung von AtPLT4. Aufnahmen von Epidermiszellen Arabidopsis, Zwiebel und Tabak, die mit dem Fusionsprodukt aus AtPLT4 cDNA und GFP transformiert und unter Anregungslicht mit dem KLSM aufgenommen wurden. A+B: Arabidopsis Epidermiszelle, die mit pYK30 beschossen wurde (PIG). Die grüne Fluoreszenz befindet sich in der Plasmamembran und im Endoplasmatischen Retikulum, die roten Pfeile zeigen auf die Hechtschen Fäden des ER. In der Überlagerung in B ist eine Lokalisation im Endoplasmatischen Retikulum zu erkennen. Bei den hell leuchtenden Punkten handelt es sich um Golgi Vesikel. C+D: Zwiebelepidermiszellen; C: Optischer Einzelschnitt einer Zwiebelepidermiszelle. Der Nukleus liegt innerhalb der grün fluoreszierenden Membran (gelber Pfeil). D: Überlagerung dreier Zwiebelepidermiszellen. Hier ist das Netzwerk des ERs zu erkennen. E+F: Epidermiszelle von Tabakblättern. Plasmamembran in grün, die grün leuchtenden Punkte sind Golgi Vesikel. Chloroplasten (rot; gelbe Pfeile) befinden sich innerhalb der grün leuchtenden Struktur. Die blauen diffusen Markierungen sind Reflexionen der Epidermisoberfläche. In F ist das Netzwerk des Endoplasmatischen Retikulums sichtbar. Größenstandards: Arabidopsis A, B: 25 µm; Zwiebel C: 100 µm; D: 150 µm, Tabak E, F: 10 µm.
A B
C D
E F
Ergebnisse
84
Nachdem dieses Ergebnis in Arabidopsis, Zwiebel und in Tabak erhalten wurde, ist eine
Möglichkeit, dass durch von AtPLT4 und dem C-terminal angehängten GFP das AtPLT4
Protein an seiner nativen Proteinfaltung gehindert wird. Möglicherweise wird die Proteinfaltung
von AtPLT4 durch das 27 kDa große GFP gestört, so dass die Zielsequenz für die
Plasmamembran nicht mehr frei zugänglich ist. Außerdem ist das ER durch die
Überexpression (35S Promotor) von AtPLT4-GFP stark überlastet, so dass ein Großteil des
Fusionsproteins im ER hängen geblieben ist. Anhand dieser Bilder kann man keine klaren
Aussagen über die Lokalisation von AtPLT4 treffen. Wieviel % von tatsächlich in der
Plasmamembran lokalisiert sind, kann anhand dieser Aufnahmen nicht entschieden werden.
Ob das Endoplasmatische Retikulum der wahre Lokalisationsort von AtPLT4 ist, könnte mit
einem Konstrukt geklärt werden, das den eigenen AtPLT4-Promotor und z.B. einen kleineren
myc-Tag enthält.
3.3.2 Funktionelle Charakterisierung von AtPLT4 durch heterologe
Expression in Saccharomyces cerevisiae
Im heterologen Expressionssystem Bäckerhefe sollte anhand von Aufnahmemessungen mit
radioaktiv markierten Substraten untersucht werden, welche Substrate AtPLT4 transportiert.
Dazu wurde die 1581 bp lange AtPLT4 cDNA mittels PCR amplifizert, wodurch über die
verwendeten Oligonukleotide zusätzlich EcoRI Schnittstellen und der 5’-nichttranslatierte
Bereich von AtSTP1 mit eingeführt wurden (Stadler et al., 1995; Ramsperger-Gleixner et al.,
2004). Die durch Sequenzanalyse überprüfte fehlerfreie cDNA wurde in den
Hefeexpresionsvektor NEV-E kloniert (Sauer und Stolz, 1994). Das Plasmid mit der AtPLT4
cDNA in sense Orientierung innerhalb des Vektors NEV-E wurde mit pYK31 bezeichnet.
Respektive bezeichnet pYK31as das Plasmid, bei dem die AtPLT4 cDNA in antisense
Orientierung in NEV-E inseriert wurde (Tabelle 3. 17). Dieses Konstrukt diente bei den
späteren Aufnahmemessungen als Negativkontrolle. Mit den Konstrukten pYK31 und
pYK31as wurde der Hefestamm EBY.VW.4000 transformiert (Wieczorke et al., 1999).
AtPLT4 cDNA Hefeexpressios-
vektor Resultierender
Hefeexpressionsvektor Hefestamm
Transformierte Hefestämme
1581 bp NEV-E (EcoRI) pYK31 (sense)
pYK31as (antisense)
EBY.VW.4000
YKY11 (s),
YKY12 (as)
Tabelle 3. 17: Größe der AtPLT4 cDNA; verwendeter Hefeexpressionsvektor und Enzym, resultierende Vektoren, Hefestamm und transformierte Hefestämme.
Ergebnisse
85
Die Transportkapazität unterschiedlicher Zucker bzw. Zuckeralkohole wurde für AtPLT4
gemessen wie in 5.2.4.2 beschrieben. Bei diesem Transporter wurden zunächst die
Kompetitormessungen (Endkonzentration 10 mM) mit 14C-Glukose (Endkonzentration 0,1 mM)
durchgeführt und dann nur die Substrate radioaktiv markiert gemessen, die eine starke
Hemmung der Glukoseaufnahme verursachten.
3.3.2.1. Einfluss von Kompetitoren auf die Glukoseaufnahme inYKY11
Das Kompetitorspektrum richtete sich nach den Substanzen, die erfolgreich bei AtPLT1,
AtPLT2 und AtPLT5 getestet wurden. Die Kompetitoren wurden im hundertfachen Überschuss
zugegeben, wobei diese 1 min vor der Glukosezugabe zupipettiert wurden. Als Kontrolle
diente unmarkierte Glukose. In Abbildung 3.45 sind die Messungen grafisch dargestellt, wobei
dies die Mittelwerte dreier unabhängiger Messreihen sind. In Tabelle 3. 18 ist die
Glukoseaufnahme in Anwesenheit der unterschiedlichen Kompetitoren in % angegeben.
Einfluss von Kompetitoren auf die Glukoseaufnahme von AtPLT4
Kont
rolle
Arab
inos
eRi
bose
Fruk
tose
Xylo
se
Xylit
Inos
itSa
ccha
rose
Met
hano
lG
lyze
rinM
anni
tG
alak
tose
Eryt
hrit
Sorb
itRa
ffino
seG
luko
se
0
20
40
60
80
100
120
140
Glu
kose
aufn
ahm
e in
%
Abbildung 3. 45: Relative Glukoseaufnahme (%) von AtPLT4 in YKY11 unter Einfluss von Kompetitoren. Kompetitoren 100facher Überschuss.14C-Glukose = Kontrolle ohne Kompetitor = 100 %. Messwerte dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen. Kompetitoren mit 6 C-Atomen: graue Balken, 5 C-Atomen: braune Balken, 4 C-Atome gelb, 3 C-Atome grün, Disaccharid Saccharose in pink, Trisaccharid Raffinose in orange. 1 C Atom: hellblau.
Ergebnisse
86
Kompetitor Methanol Glyzerin Mannit Galaktose Erythrit Sorbit Raffinose Glukose
1. Messung 106,51 59,59 42,96 56,31 47,16 21,59 120,87 15,19 2. Messung 96,74 64,74 40,48 41,07 49,47 19,46 118,31 15,73 3. Messung 99,63 60,36 32,70 28,69 23,14 16,38 82,26 13,54 Mittelwert 100,96 61,56 38,71 42,03 39,92 19,14 107,15 14,82 STABW ±5,02 ±2,77 ±5,35 ±13,83 ±14,58 ±2,62 ±21,56 ±1,14
Tabelle 3. 18: Relative Glukoseaufnahme (%) von AtPLT4 in YKY11 unter Einfluss von Kompetitoren (100 facher Überschuss). Die Werte sind im Vergleich zur Glukosekontrolle dargestellt. Kontrolle = 14C-Glukoseaufnahme ohne Kompetitor = 100%.
Oben abgebildetes Balkendiagramm (Abbildung 3.45) zeigt, dass durch Zugabe von Pentosen
wie Arabinose, Ribose oder Xylose (auch Xylit) mindestens eine 85%ige Hemmung der
Glukoseaufnahme erreicht wurde. Bei Fruktose und Inosit im Überschuss konnte nur noch
eine sehr geringe Glukoseaufnahme von 10% bzw. 4% ermittelt werden. Glukose und Sorbit
wiesen ebenfalls starke kompetitive Eigenschaften auf. Die Aufnahme von 14C-Glukose wurde
durch Glukose auf 85% und durch Sorbit auf 80% reduziert. Mannit und Galaktose (beide 6 C-
Atome) sowie Erythrit mit 4 C-Atomen hemmen ebenfalls, aber nur zu 60%. Die 70%ige
Hemmung der Glukoseaufnahme durch Saccharose beruht vermutlich auf der
Invertaseaktivität des verwendeten Hefestamms. Diese Werte kommen eigentlich durch die
kompetitive Hemmung der Monosaccharide Glukose und Fruktose zustande. Methanol und
das Trisaccharid Raffinose hatten keinen Einfluss auf die Glukoseaufnahme von AtPLT4.
Glyzerin, ein Triol, lässt nur noch einen Glukosetransport von 60% zu. Auch bei AtPLT4 ist
festzuhalten, dass zwar insgesamt Pentosen, Hexosen und deren Polyole die stärksten
Kompetitoren darstellen, diese aber keineswegs die einzigen Substanzen sind, die den
Glukosetransport hemmen (Abbildung 3.45). Substanzen mit weniger Kohlenstoffatomen
können die Bindetasche von AtPLT4 besetzen, so dass dadurch der Glukosetransport über
AtPLT4 negativ beeinflusst wird.
Kompetitor Kontrolle Arabinose Ribose Fruktose Xylose Xylit Inosit Saccharose
1. Messung 100 17,17 8,13 12,86 9,89 5,12 6,28 32,99 2. Messung 100 16,32 7,49 8,82 13,41 6,99 4,42 31,70 3. Messung 100 15,02 8,40 9,13 8,97 5,86 8,01 31,77 Mittelwert 100 16,16 8,01 10,27 10,76 5,99 6,24 32,18 STABW ± 0 ±1,07 ±0,47 ±2,24 ±2,34 ±0,94 ±1,79 ±0,73
Ergebnisse
87
3.3.2.2 Aufnahme von radioaktiven Substraten über AtPLT4
Die Kompetitormessungen ergaben, dass mehrere Zucker und Zuckeralkohole für das
tatsächliche Substrat von AtPLT4 in Frage kommen. Aus kostentechnischen Gründen sowie
mangelnder Verfügbarkeit wurde die radioaktive Aufnahme für AtPLT4 nur für ein limitiertes
Set an Substanzen durchgeführt. In einer Endkonzentration von 0,1 mM wurde die Aufnahme
von Glukose, Fruktose, Sorbit und Xylit gemessen. In Abbildung 3.46 sind die Ergebnisse der
einzelnen Aufnahmessungen aus drei unabhängigen Messreihen dargestellt, die
dazugehörigen Messwerte sind in Tabelle 3. 19 angegeben.
Abbildung 3. 46: Transport unterschiedlicher radioaktiv markierter Substrate von AtPLT4 in AtPLT4-exprimierenden Hefezellen im Vergleich zur Negativkontrolle. Aufnahme radioaktiv markierter Zucker bzw. Zuckeralkohole (EK 0,1 mM) von AtPLT4-exprimierenden Hefen (YKY11 ) im Vergleich zur Negativkontrolle (YKY12 ) in nmol/mg FG. Transportkapazität wurde in Hexose-defizienten Hefestamm EBY.VW.4000 analysiert. Es sind die Mittelwerte dreier unabhängiger Messreihen dargestellt.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Aufn
ahm
e (n
mol
/g F
G)
02468
101214161820
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Aufn
ahm
e (n
mol
/g F
G)
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10
Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G)Glukose Sorbit
Xylit
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10Zeit (min)
Auf
nahm
e (n
mol
/g F
G) Fruktose
Ergebnisse
88
Aufnahme von YKY11 (sense) und YKY12 (antisense)
Zeit in min 0 2 4 6 8 10 Xylit sense 1,73 8,89 8,95 12,54 15,10 13,90 Xylit antisense 2,55 1,90 1,73 1,11 2,33 1,7 Fruktose sense 6,14 22,04 37,68 56,22 67,06 88,20 Fruktose antisense 8,25 12,29 7,09 3,39 16,65 23,75 Sorbit sense 2,25 8,84 10,05 13,36 16,47 16,13 Sorbit antisense 1,22 1,65 1,02 0,99 0,35 1,87 Glukose sense 2,39 16,19 22,23 39,49 44,39 56,46 Glukose antisense 3,45 1,11 1,98 2,67 4,32 2,88
Tabelle 3. 19: Aufnahme unterschiedlicher Zucker bzw. Zuckeralkohole über AtPLT4 in nmol pro g FG über einem Zeitraum von 10 min. sense (AtPLT4-exprimierende Hefen; YKY11); antisense (Negativkontrolle; YKY12). Angegeben ist der Mittelwert aus drei unabhängigen Messreihen. Aufgrund der Übersichtlichkeit wurde auf die Angabe der Standardabweichungen verzichtet.
AtPLT4 ist somit ein Transportprotein, das sowohl Zucker wie Glukose und Fruktose, als auch
Polyole wie Sorbit und Xylit transportiert, wobei Fruktose und Glukose deutlich besser
transportiert werden (88,20 ± 12,81 bzw. 56,46 ± 5,84 nmol/g FG in 10 min), als die beiden
getesteten Zuckeralkohole Sorbit und Xylit (16,13 ± 2,53 bzw. 13,90 ± 0,86 nmol/g FG in 10
min) (Abbildung 3.46). Die AtPLT4-exprimierenden Zellen nehmen aber deutlich unter 100
nmol/g FG radioaktive Substrate auf, was wesentlich niedriger ist als für die bisher
untersuchten AtPLT1, AtPLT2 und AtPLT5, wo die Aufnahme beispielsweise für Xylit über 800
nmol/g FG in 10 min ausmachte. AtPLT4 transportiert also ebenfalls Zucker und
Zuckeralkohole über die Hefeplasmamembran, jedoch mit deutlich geringerer Effizienz als die
bisher untersuchten AtPLT Transportproteine.
3.3.2.3 Km-Wert Bestimmung für AtPLT4 für Fruktose und Xylit
Für Fruktose und Xylit wurden die Km-Werte von AtPLT4 bestimmt. Bei verschiedenen
Substratkonzentrationen wurde die Aufnahmerate gemessen und in Michaelis-Menten
Diagramme aufgetragen (Abbildung 3.47). Lineweaver-Burk Darstellung lieferte die Km- Werte
(mM) und die Transportgeschwindigkeit (nmol/ g FG x min) (Abbildung 3.48).
Ergebnisse
89
Abbildung 3. 47: Michealis-Menten Auftragung (links) und Lineweaver-Burk Auftragung (rechts) der gemessenen Aufnahmerate (nmol/g FG x min) von AtPLT4-exprimierenden Hefen (YKY11) bei verschiedenen Fruktosekonzentrationen. Messwerte dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Abbildung 3.32: Michealis-Menten Auftragung der gemessenen Aufnahmerate (nmol/g FG x min) von AtPLT2 unter verschiedenen Xylitkonzentrationen. Messwerte dargestellt als Mittelwert ±
Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen. Abbildung 3.33: Lineweaver Burk Auftragung der Xylitaufnahmerate von AtPLT2. Messwerte dargestellt als Mittelwert ± Standardabweichung drei unabhängiger Messreihen.
Abbildung 3. 48: Michealis-Menten Auftragung (links) und Lineweaver-Burk Auftragung (rechts) der gemessenen Aufnahmerate (nmol/g FG x min) von AtPLT4-exprimierenden Hefen (YKY11) bei verschiedenen Xylitkonzentrationen. Messwerte dargestellt als Mittelwert ± Standard-abweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Michaelis-Menten Auftragung der Fruktoseaufnahmeraten von AtPLT4
exprimierenden Hefen
020406080
100120140
0 1 2 3 4 5 6
Fruktosekonzentration (mM)
Auf
nahm
erat
e (n
mol
/ g F
G x
min
)
Lineweaver-Burk Darstellung der Fruktoseaufnahmeraten von AtPLT4
exprimierenden Hefen
y = 0,0128x + 0,005
-0,03
0,01
0,05
0,09
0,13
0,17
-1 1 3 5 7 9
1/Fruktosekonzentration (1/mM)
1/A
ufna
hmer
ate
(1/n
mol
/g F
G x
min
)
Lineweaver-Burk Auftragung der Xylitaufnahemraten AtPLT4
exprimierender Hefen
y = 0,0503x + 0,0058
-0,2
-0,10
0,1
0,20,3
0,4
0,50,6
0,7
-4 -2 0 2 4 6 8 10 12
1/Xylitkonzentration (1/mM)
1/A
ufna
hmer
ate
(1/ n
mol
/g F
G x
min
)
Michaelis Menten Auftragung der Xylitaufnahmeraten AtPLT4
exprimierender Hefen
0
10
20
30
40
50
60
70
0 1 2 3 4 5 6
Xylitkonzentration (mM)
Auf
nahm
erat
e (n
mol
/g F
G x
min
)
-
Ergebnisse
90
Fruktosekonzentration (mM)
Aufnahmerate (nmol/g FG x min)
1/ Fruktosekonzentration (1/mM)
1/Aufnahmerate (1/(nmol/g FG x min))
0,05 3,377 20 0,296 0,1 7,565 10 0,1333 0,5 34,579 2 0,0290 2 82,635 0,5 0,0122 5 124,216 0,2 0,0081 Xylitkonzentration (mM)
Aufnahmerate (nmol/g FG x min)
1/ Xylitkonzentration (1/mM)
1/Aufnahmerate (1/(nmol/g FG x min))
0,05 0,724 20 1,381 0,1 2,029 10 0,509 0,5 9,507 2 0,105 2 35,126 0,5 0,0285 5 52,901 0,2 0,0190
Tabelle 3. 20: Fruktose- (oben) und Xylitaufnahme von AtPLT4 bei unterschiedlichen Konzentrationen.
AtPLT4 Km-Wert für Fruktose
AtPLT4 Vmax Fruktose
AtPLT4 Km-Wert für Xylit
AtPLT4 Vmax Xylit
2,57 mM ± 0,50 mM 200 nmol/g FG x min 8,67 mM ± 1,67 mM 172,4 nmol/g FG x min
Tabelle 3. 21: Km-Werte in mM von AtPLT4 und maximale Aufnahmegeschwindigkeit in (nmol/g FG x min) von AtPLT4 für Fruktose und Xylit.
Anhand der Michaelis-Menten Auftragungen für Fruktose und Xylit (Abbildung 3.47; 3.48)
kann man erkennen, dass bei keinem Substrat Sättigung erreicht werden konnte, da die
Kurven bei 5 mM Substratzugabe immer noch leicht ansteigen. Das bedeutet, dass die
maximale Transportgeschwindigkeit weder bei Fruktose noch bei Xylit erreicht werden konnte.
Über doppelt reziproke Auftragung nach Lineweaver-Burk (Abbildung 3.47; 3.48) ließ sich
anhand der Geradengleichung der Km-Wert für Fruktose von 2,57 mM und für Xylit von 8,67
mM ermitteln (Tabelle 3. 20; Tabelle 3. 21).
Über dies hinaus wurde auch versucht den Km-Wert von AtPLT4 für Glukose zu messen.
Jedoch lieferte die Michaelis-Menten bzw. Lineweaver-Burk Auftragung keine sinnvollen
Werte für Glukose, da selbst bei hohen Glukosekonzentrationen (20 mM) noch keine
Sättigung erreicht werden konnte (Diagramme nicht gezeigt). Der Km-Wert für Glukose liegt
mindestens bei 25 mM, eher noch höher.
Ergebnisse
91
pH Abhängigkeit AtPLT4
0
20
40
60
80
100
4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0
pH
Auf
nahm
erat
e (n
mol
/g F
W m
in)
3.3.2.4 pH Abhängigkeit des AtPLT4 Transports in YKY11
Auch für AtPLT4 sollte das pH Optimum des Glukosetransportes bestimmt werden, um
Hinweise auf die Elektrogenität des AtPLT4 Transports zu erhalten. Hierzu wurden die
Hefezellen vor den Aufnahmemessungen in Natrium-Phosphatpuffern mit unterschiedlichen
pH Werten resuspendiert. Die getesteten pH-Werte waren 5,0; 5,5; 6,0 und 7,0. 14C-Glukose wurde in einer Endkonzentration von 0,1 mM den Hefezellen zugeführt. In
Abbildung 3. 49 bzw. Tabelle 3. 22 sind die Mittelwerte von drei unabhängigen Messreihen
angegeben, wobei die Aufnahme in nmol pro Gramm Frischgewicht und Minute dargestellt ist.
Abbildung 3. 49: pH Abhängigkeit von AtPLT4 in YKY11. Gemessene Glukoseaufnahmerate (nmol/g FG min) bei unterschiedlichen pH Werten in 50 mM Natrium-Phosphatpuffer. Messwerte dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Tabelle 3. 22: Glukoseaufnahme (EK Glukose: 0,1 mM) von AtPLT4 in YKY11 in nmol pro Gramm Frischgewicht und Minute bei unterschiedlichen pH Werten.
Die pH Wert Messungen für AtPLT4 wiesen auf gänzlich andere Transporteigenschaften hin,
als für die bisher untersuchten AtPLT Proteine, die alle ein pH Optimum im Bereich 5 - 5,5
besitzen. AtPLT4 dagegen zeigt eine deutlich größere Transportaktivität um pH 7. Im sauren
pH Bereich nimmt der Glukosetransport sogar ab. Aber auch bei einer Erhöhung des pH
pH Wert 5 5,5 6 7 7,5 8 Messung 1 40,62 44,25 69,98 83,21 83,83 32,87 Messung 2 44,89 46,47 57,35 80,64 76,75 22,73 Messung 3 35,92 43,49 51,13 76,46 73,60 23,86 Mittelwert 40,46 41,64 59,43 80,12 78,06 26,48 Standardabweichung ±4,53 ±1,55 ±9,61 ±3,41 ±5,24 ±5,56
Ergebnisse
92
Werts über 7,5, nimmt die Substrataufnahme rapide ab. Demnach kann man für AtPLT4 ein
pH Optimum beschreiben, dass zwischen pH 7,0 und pH 7,5 liegt (Abbildung 3.49). Da dies
ungewöhnlich hohe pH Werte sind, sollte untersucht werden, ob möglicherweise andere Ionen
bei dem Transportprozess eine Rolle spielen. Deshalb wurden 14C-Glukose
Aufnahmemessungen (EK 0,1 mM) bei pH 7,0 im Natriumgepufferten und zum Vergleich im
Kaliumgepufferten System durchgeführt. Dazu wurden die AtPLT4-exprimierenden Hefen
(YKY11) in 50 mM des jeweiligen Puffers gewaschen und darin aufgenommen. In der
Abbildung 3.50 erkennt man, dass in der Glukoseaufnahme kein Unterschied verzeichnet
werden kann, wenn die Hefezellen vorher in verschiedenen Puffersystemen gewaschen
wurden (Tabelle 3. 23). Offensichtlich haben also weder Natrium- noch Kaliumionen auf die
Energetisierung des Transportprozesses von AtPLT4 sichtbaren Einfluss.
Abbildung 3. 50: Glukoseaufnahmerate von AtPLT4-exprimierenden Hefen (YKY11) in unterschiedlichen Puffersystemen. Gemessene Glukoseaufnahmerate (nmol/g FG min) 50 mM Natrium-Phosphatpuffer und 50 mM Kalium Phosphatpuffer bei pH 7,0. Messwerte dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Tabelle 3. 23: Glukoseaufnahmerate von AtPLT4-exprimierenden Hefen (YKY11) in verschiedenen Puffersystemen. Gemessene Glukoseaufnahmerate (nmol/g FG min) bei pH Wert 7,0 in 50 mM Natrium- bzw. Kalium- Phosphatpuffer. Messwerte dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen.
Puffer Natrium-Phosphat
Puffer pH 7,0 Aufnahmerate
(nmol/g FG x min)
Kalium-Phosphat Puffer pH 7,0 Aufnahmerate
(nmol/g FG x min) Messung 1 114,18 118,37 Messung 2 136,42 133,36 Messung 3 136,93 132,19 Mittelwert 129,18 127,97
Standardabweichung ±12,98 ±8,34
Natrium-Phosphat
Puffer pH 7,0
Kalium-Phosphat
Puffer pH 7,0
0
25
50
75
100
125
150
1
Glu
kose
aufn
ahm
erat
e (n
mol
/g F
G x
min
)
Ergebnisse
93
3.3.2.5 Einfluss der Hemmstoffe PCMBS, CCCP und DNP
Für sekundär aktive Transporter, die den Protonengradient über Plasmamembranen nutzen ist
bekannt, dass Entkoppler wie CCCP und DNP die Transportaktivität von Membranproteinen
deutlich beeinträchtigen können, da sie den Protonengradient über einer Membran
zusammenbrechen lassen (Delrot und Bonnemain, 1981). Transporter der MST Familie
reagieren normalerweise nicht auf PCMBS, eine Ausnahme stellt PmPLT1 dar, der durch
seinen zusätzlichen Cysteinrest für PCMBS eine Angriffstelle bietet (Ramsperger-Gleixner et
al., 2004). Ob AtPLT4 die gleiche Sensitivität auf unterschiedliche Hemmstoffe aufweist,
sollten folgende Messungen zeigen. Gemessen wurde die 14C-Glukoseaufnahme (EK: 0,1
mM) AtPLT4-exprimierender Hefezellen (YKY11) in Anwesenheit verschiedener Inhibitoren
(EK: 50 µm), die 1 min vor der 14C-Glukosezugabe zupipettiert wurden. Es wurden drei
unabhängige Messreihen zu den Zeitpunkten 0, 2, 4, 6, 8, und 10 Minuten durchgeführt
(Abbildung 3.51). Die Glukoseaufnahme ohne Inhibitor wurde 100 % gesetzt, die Werte der
einzelnen Messungen sind in Tabelle 3. 24 dargestellt.
Abbildung 3. 51: Einfluss von Hemmstoffen auf die Glukoseaufnahme von AtPLT4 in YKY11. Relative Glukoseaufnahme in % dargestellt als Mittelwert inklusive Standardabweichung dreier unabhängiger Messreihen. Die Endkonzentration 14C-Glukose betrug 0,1 mM, EK Inhibitoren 50 µm. Die Hefezellen wurden in 50 mM Na-Phosphatpuffer pH 5,5 resuspendiert.
Tabelle 3. 24: Einfluss von Hemmstoffen auf die Glukoseaufnahme von AtPLT4. Die Konzentration an 14C-Glukose betrug 0,1 mM, der Inhibitor wurde 50 µM zugegeben. Die relative Glukoseaufnahme ist in % dargestellt, wobei die Glukosekontrolle (ohne Inhibitor) 100 % gesetzt wurde.
Hemmstoff Glukosekontrolle PCMBS CCCP DNP Messung 1 100 68 38 62 Messung 2 100 45 39 67 Messung 3 100 70 30 65 Mittelwert 100 61 35 64 Standardabweichung ± 0 ±14 ±5 ±2
Einfluss von Inhibitoren auf die Glukoseaufnahme von AtPLT4
0
20
40
60
80
100
120
14CGlukose
PCMBS CCCP DNP
Glu
kose
aufn
ahm
e in
%
14C Glukose
Ergebnisse
94
Der 14C-Glukose Transport wird in AtPLT4-exprimierenden Hefen (YKY11) durch
Inhibitorenzugabe eingeschränkt (Abbildung 3.51). Zunächst ist es überraschend, dass das
Sulfhidrylreagenz PCMBS den Glukosetransport um ca. 40% reduziert, da bisher noch keine
Polyoltransporter aus Arabidopsis auf PCMBS empfindlich reagierte. AtPLT4 besitzt an
Position 58 einen Cysteinrest, der für die Hemmung durch PCMBS verantwortlich sein könnte.
Die Anwesenheit der Protonophore CCCP und DNP, beeinträchtigten den Glukosetransport
bei weitem nicht in dem Maße, wie es erwartet worden wäre. Normalerweise bleiben maximal
noch 20% Transportaktivität übrig (vgl. AtPLT1, AtPLT5; Klepek 2003, Volke, 2005). AtPLT4
transportiert Glukose bei CCCP Zugabe noch 40%, bei DNP Zugabe transportiert AtPLT4
sogar noch über 60 % 14C-Glukose (Abbildung 3.51; Tabelle 3. 24). AtPLT4 hat demnach
andere Transporteigenschaften wie die anderen AtPLT Proteine.
3.3.3. Heterologe Expression von AtPLT4 in Xenopus laevis Oozyten
Die umgekehrte pH Abhängigkeit von AtPLT4 in Hefe warf die Frage auf, wie der Transport
von Substraten durch AtPLT4 energetisch angetrieben wird. Ob es sich auch um einen
Protonen-Symport oder möglicherweise um einen passiven Transportmechanismus handelt
sollte in Xenopus laevis Oozyten untersucht werden. Dazu wurde AtPLT4 in den
Oozytenexpressionsvektor pDK148 (5.2.8) kloniert. Das Plasmid (pYK29) wurde mittels
Restriktionsverdau überprüft, anschließend linearisiert und in cRNA umgeschrieben, die dann
in Xenopus Oozyten injiziert wurde (5.2.8.2).
3.3.3.1 Elektrophysiologische Untersuchungen an AtPLT4-exprimierenden
Xenopus laevis Oozyten
Die elektrophysiologischen Untersuchungen an AtPLT4 wurden von Kai Konrad in Würzburg
durchgeführt. Es wurden verschiedene Substrate getestet, die bereits erfolgreich in Hefe von
AtPLT4 aufgenommen wurden und die bei den bisher untersuchten AtPLT1, AtPLT2 und
AtPLT5 detektierbare Einwärtsströme verursacht hatten. Xylit, Glukose, Fruktose und Mannit
wurde in 10 mM und 50 mM Lösungen getestet, bei denen eine pH Wert Spanne von 4,5 bis
8,5 gewählt wurde. Jedoch konnte bei keinem Substrat und keiner Konzentration unter keiner
pH Bedingung ein signifikanter Einwärtsstrom detektiert werden. Die Oozyten wurden je
zweimal mit zwei neuen AtPLT4 cRNAs injiziert, bei den Messungen konnten trotzdem keine
signifikanten Einwärtsströme detektiert werden. Zu diesem Zeitpunkt konnte noch keine
Ergebnisse
95
Aussage darüber getroffen werden, ob AtPLT4 in Oozyten überhaupt exprimiert wird. Daher
sollten in den inijzierten Oozyten radioaktive Aufnahmemessungen durchgeführt werden.
3.3.3.2 Radioaktive Aufnahmemessungen an AtPLT4-exprimierenden
Xenopus laevis Oozyten
Radioaktive Aufnahmemessungen in AtPLT4-injizierten Xenopus Oozyten, sollten weitere
Hinweise geben, ob AtPLT4 in Oozyten exprimiert wird oder der Transportprozess
möglicherweise nicht protonenabhängig ist.
Dafür wurden die Oozyten genau wie für die elektrophysiologischen Messungen mit cRNA
inijziert und 4-6 Tage bei 16°C aufbewahrt. Als Positivkontrolle dienten AtPLT1-exprimierende
Oozyten. Um die Hintergrundaktivität zu bestimmen, wurden Oozyten mit H2O injiziert. Für die
Messungen wurden die Oozyten 15 min lang in radioaktiven Zuckerlösungen inkubiert,
anschließend gewaschen und einzeln im Szintillationszähler vermessen. Als Substrate dienten 3H-Xylit und 14C-Glukose, die jeweils in physiologischen Lösungen mit pH 5,5 oder pH 7,5 mit
einer spezifischen Aktivität von 2,2 x 106 dpm in 1 mM Lösung vorlagen. Die erhaltenen
Messwerte sind in Abbildung 3.52 gezeigt:
Abbildung 3. 52: 14C-Glukoseaufnahme AtPLT1- bzw. AtPLT4-exprimierender Oozyten in cpm bei unterschiedlichen pH Werten. Die spezifische Aktivität betrug 2,2 x 106 dpm. H2O-inijzierte Oozyten dienten als Hintergrundkontrolle. Als Positivkontrolle wurden AtPLT1-inijzierte Oozyten verwendet. Es wurden jeweils 10 einzelne Oozyten im Szintillationszähler vermessen.
14C-Glukoseaufnahme AtPLT4-exprimierender Oozyten
H2O pH 5,5
H2O pH 7,5
PLT1 pH 5,5
PLT1 pH 7,5
PLT4 pH 5,5
PLT4 pH 7,5
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
cpm
Ergebnisse
96
Tabelle 3. 25: 14C-Glukoseaufnahme von H2O-injizierten, AtPLT1- bzw. AtPLT4-exprimierender Oozyten in cpm bei unterschiedlichen pH Werten. Angegeben sind die Mittelwerte 10 einzelner Oozyten ± Standardabweichung.
Abbildung 3.52 zeigt das Ergebnis einer Messreihe, deren Werte (Tabelle 3. 25) als signifikant
eingestuft wurden (T-Test, Sigma Plot). Im Szintillationszähler wurden jeweils 10 einzelne
Oozyten gemessen. Einerseits zeigt diese Messreihe, dass AtPLT4 zwar wesentlich
schlechter als AtPLT1, aber dennoch ausreichend in Oozyten exprimiert wird, da die
gemessenen cpm für AtPLT1 ungefähr 3mal so hoch waren wie für AtPLT4. Glukose wird von
AtPLT4 bei pH 7,5 besser aufgenommen als bei pH 5,5. AtPLT1, der als Positivkontrolle
verwendet wurde, zeigt erwartungsgemäß eine bessere Aufnahme bei pH 5,5. Allerdings ist
zu erwähnen, dass es trotz zahlreicher Versuche und Änderungen aller möglichen Parameter
nicht gelungen ist, diese Messung zu reproduzieren. Die Gründe hierfür konnten trotz
intensiver Bemühungen nicht ausfindig gemacht werden.
3.3.4. Lokalisierung des AtPLT4 Proteins
Nach einer Epitopanalyse wurde zur Herstellung der αAtPLT4 Antiseren ein 23 AS langes C-
terminales Peptid von AtPLT4 ausgewählt, welches keine Homolgien zu anderen AtPLT
Proteinen aufwies (NH2-CERKDGEVELGDAERLVRKEQEF-CONH2). Das AtPLT4 Protein ist
526 Aminosäuren lang mit einem errechneten Molekulargewicht von 56,8 kDa. Wie alle
anderen AtPLT Proteine wird auch AtPLT4 der MFS Familie (major facilitator superfamily)
zugerechnet, die sich durch 12 Transmembranspannen auszeichnet (Marger und Saier,
1993).
Das synthetisch hergestellte Peptid wurde für die Immunisierung von zwei Kaninchen (K1, K2)
und einem Meerschweinchen (M) eingesetzt. Es wurde mit den Seren vom 90. Tag nach der
Immunisierung gearbeitet. Bevor die Antiseren an Pflanzenschnitten angewendet wurden,
sollten sie an Hefedünnschnitten und isolierten Hefeplasmamembranen getestet werden.
3.3.4.1 Überprüfung der Antiseren in AtPLT4-exprimierenden Hefen
Aus AtPLT4-exprimierenden Hefezellen (YKY11, sense) und dem Kontrollstamm (YKY12,
antisense), wurden Gesamtmembran- Endomembran- und Plasmamembranfraktionen isoliert
cpm H2O pH 5,5
H2O pH 7,5
AtPLT1 pH 5,5
AtPLT1 pH 7,5
AtPLT4 pH 5,5
AtPLT4 pH 7,5
Mittelwert 47 46 506,3 250,1 124,4 151,4 STABW ±14,8 ±12,9 ±273,9 ±133,9 ±115,1 ±51,1
Ergebnisse
97
(5.2.4.3) und mittels Bradford Test die Proteinkonzentrationen bestimmt (5.2.6.1). Von den
verschiedenen Fraktionen wurden je 10 µg auf zwei SDS-Polylacrylamidgele aufgetragen. Um
die Qualität der Auftrennung zu beurteilen, wurde eines der Gele Coomassie Blue gefärbt
(nicht gezeigt), das andere SDS-PAGE Gel wurde für Western Analysen mit AtPLT4-
spezifischen Antiseren vorbereitet. Nach Übertragung der Proteine auf eine
Nitrocellulosemembran, wurden diese in einer 1:50.000 Verdünnung mit dem ungereinigten
Kaninchenantiserum αAtPLT4-K1 über Nacht inkubiert und anschließend mit einem
sekundären, Peroxidase-gekoppelten anti-Kaninchen IgG Antikörper behandelt (Abbildung
3.53).
Abbildung 3. 53: Western Blot der verschiedenen Membranfraktionen von AtPLT4- exprimierenden Hefen (YKY11) und Kontrollhefen (YKY12). Proteinextrakte von Plasmamembranen (PM), Gesamtmembranen (GM) und Endomembranen von YKY11 und YKY12 Zellen wurden gelelektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nitrocellulosemembran geblottet und anschließend mit αAtPLT4-K1 (Verdünnung 1:50.000) behandelt. Die Proteinmenge beträgt in jeder Spur 10 µg. Rote Pfeile: AtPLT4 Protein ist nur in sense Plasma-, Endo- sowie in Gesamtmembranen detektierbar. Grüne Pfeile zeigen auf die dimere Form des AtPLT4 Proteins bei ca. 100 kDa.
Zunächst muss man festhalten, dass das Kaninchenantiserum K1 in einer sehr hohen
(1:50.000!) Verdünnung eingesetzt wurde und, obwohl es sich um ungereinigtes Serum
handelte, sind hier keinerlei unspezifische Banden auf dem Röntgenfilm zu sehen (Abbildung
3.53) Das 23 AS lange AtPLT4 Peptid scheint also eine sehr hohe Antigenizität zu besitzen. In
allen AtPLT4-exprimierenden Membranfraktionen konnte das AtPLT4 Protein bei ~40 kDa
nachgewiesen werden, wohingegen im Kontrollstamm (YKY12) kein Signal detektierbar war
(Abbildung 3.53). Eine weitere Bande ist bei etwa ~100 kDa zusehen (grüner Pfeil), wobei es
sich um die dimerisierte Form des AtPLT4 Proteins handelt. Das apparente Molekulargewicht
(~40 kDa) unterscheidet sich um ~17 kDa von dem errechneten (56,8 kDa), was für stark
lipophile Membranproteine nach einer SDS-Behandlung typisch ist (Beyreuther et al., 1980).
In der AtPLT4-exprimierenden Gesamtmembranfraktion ist am wenigsten AtPLT4 Protein
vorhanden. Wahrscheinlich ist der Anteil an AtPLT4 im Gesamtproteingehalt sehr gering, so
200 kDa
119 kDa
66 kDa
43 kDa
29 kDa
PM PM GM GM EM EMs as as as s s
Ergebnisse
98
dass die Bande in dieser Fraktion etwas schwächer ausfällt. Auch fehlt in der
Gesamtmembran die dimerisierte Form von AtPLT4. In den sense Plasmamembranen ist die
größte Menge an AtPLT4 Protein und seiner dimeren Form zu detektieren. In den
Endomembranen der AtPLT4-exprimierenden Hefen ist aber ebenfalls ein bemerkenswerter
AtPLT4 Anteil vorhanden (Abbildung 3.53). Normalerweise erwartet man hier schwächere
Signale, die lediglich durch Kontamination durch einen schlechten pH Sprung bei der
Aufreinigung der verschiedenen Fraktionen zu Stande kommen (5.2.4.3). In diesem Fall ist
aber das Signal sehr stark, so dass man davon ausgehen kann, dass das AtPLT4 Protein
auch in anderen Membranen lokalisiert sein könnte. Diese Beobachtung konnte bereits in
transient transformierten Pflanzen gemacht werden, wo neben der Plasmamembran eine
beträchtliche Menge AtPLT4 Protein im Endoplasmatischen Retikulum und in Golgi Vesikeln
nachgewiesen wurden (Abbildung 3.53).
3.3.4.2 Immunozytologische Analysen von AtPLT4 in Hefedünnschnitten
Für die immunozytologischen Untersuchungen in Hefe wurden Dünnschnitte von AtPLT4-
exprimierenden Hefen (YKY11) und Kontrollhefen (YKY12) angefertigt, die vorher in
Methacrylat eingebettet wurden (5.2.7.3). Hiermit sollte gezeigt werden, ob mit dem sensitiven
Antiserum αAtPLT4-K1 das AtPLT4 Protein in Hefe nach Methacrylateinbettung noch
detektierbar ist. In der Immunolokalisation an Hefedünnschnitten wurde das Serum in einer
Verdünnung von 1:2000 eingesetzt. Nach Behandlung der Schnitte mit einem sekundären
FITC-gekoppelten anti-Kaninchen IgG Antikörper (1:300) wurde ein deutliches
Fluoreszenzsignal in den Plasmamembranen der AtPLT4-exprimierenden Hefen erhalten, das
in Kontrollhefen nicht zu sehen war. Circa 70% der AtPLT4-exprimierenden Zellen zeigten
diese ringförmige Fluoreszenz (Abbildung 3.54).
Abbildung 3. 54: Immunozytologischer Nachweis von AtPLT4 in Hefe. AtPLT4-exprimierende Hefen (YKY11; A-F) und Kontrollhefen (YKY12; G-I) wurden mit αAtPLT4-K1 Antiserum, Verdünnung 1:2000, inkubiert und unter FITC Anregungslicht fotografiert (A, D, G); B, E, H zeigen die Überlagerung von FITC Anregungslicht und Durchlicht; Durchlicht (C, F, I). Größenstandard: A-C: 25 µm; D-F: 5 µm; G-I: 50 µm.
Ergebnisse
99
3.3.4.3 Immunolokalistaion von AtPLT4 in Dünnschnitten verschiedener
Gewebe von Arabidopsis thaliana col wt
Für den immunozytologischen Nachweis von AtPLT4 in Arabidopsis thaliana wurden
Mikrotomschnitte von eingebetteten Arabidopsis thaliana col wt Pflanzen angefertigt. Schnitte
von Blatt- Blüten, Stängel- und Wurzelgeweben wurden mit verschiedenen
Antikörperverdünnungen 1:100, 1:500, 1:1000 1:5000 und 1:10000 der ungereinigten
Kaninchen und Meerschweinchen Seren behandelt. Nach Inkubation mit dem sekundären
FITC-gekoppelten Antikörper konnte in col wt Schnitten kein spezifisches Signal erhalten
werden (nicht gezeigt). Möglicherweise liegt in Pflanzen das AtPLT4 Protein modifiziert vor, so
dass das Epitop für αAtPLT4-K1 nicht mehr zugänglich ist. Wahrscheinlicher ist, dass in
Pflanzen die AtPLT4 Proteinkonzentration viel zu gering ist, um das Transportprotein
immunozytologisch zu detektieren. Eine Möglichkeit wäre daher, an AtPLT4-
überexprimierenden Pflanzen Immunolokalisationen mit αAtPLT4-K1 durchzuführen.
A B C
D E F
G H I
100
Diskussion
101
4 Diskussion
Arabidopsis thaliana gehört zu den Modellorganismen, für die seit dem Jahr 2000 die
gesamte Nukleotidsequenz in Datenbanken frei zur Verfügung steht (The Arabidopsis
genome initiative, 2000). AFGN (Arabidopsis Functional Genomics Network), eine
Projektgruppe die von der DFG unterstützt wird, hat sich zum Ziel gesetzt, bis zum Jahr 2010
alle 25.000 Gene von Arabidopsis thaliana und die kodierten Proteine funktionell zu
charakterisieren. Anhand von Sequenzvergleichen mit anderen Organismen konnte
aufgeklärt werden, dass in Arabidopsis ungefähr 13% aller Proteine in inter- und
intrazelluläre Transportprozesse involviert sind. Ungefähr 100-120 Gene sind am
Assimilattransport von Zuckern oder zuckerähnlichen Komponenten über Zellmembranen
beteiligt. In Abbildung 2.1 ist der phylogenetische Stammbaum der MST Superfamilie gezeigt
(monosaccharide transporter-like superfamily). Die MST Superfamilie setzt sich aus sieben
Genfamilien gleichen Ursprungs zusammen und ist nach der gut untersuchten AtSTP Familie
(14 plasmamembranlokalisierte Monosaccharidtransporter) benannt (Sauer et al., 1990;
Büttner und Sauer, 2000).
In dieser Arbeit sollten die Vertreter aus der Unterfamilie der putativen Polyoltransporter
untersucht werden, die Homologien zu bereits charakterisierten Polyoltransportern aus
anderen Pflanzen wie Sellerie oder bestimmten Rosaceen aufweisen. In Rosaceen sind
Polyole photosynthetische Primärprodukte und werden im Phloem transloziert. In Sellerie
sind sie außerdem an einer erhöhten Salzresistenz beteiligt. Für Arabidopsis thaliana konnte
kein Zuckeralkoholtransport im Phloem nachgewiesen werden und als salzresistente Pflanze
ist Arabidopsis ebenso unbekannt. Interessanterweise existieren in Arabidopsis thaliana
trotzdem sechs Gene für putative Polyoltransporter. In der vorliegenden Arbeit sollten Fakten
zur Lokalisation, Expression und Funktion gesammelt werden die zur Klärung der
physiologischen Rolle der AtPLT Familie beitragen.
Funktionelle Charakterisierung in Saccharomyces cerevisiae und Xenopus
laevis Oozyten
In Arabidopsis thaliana zählen die sechs AtPLT Proteine zur MFS Familie (major facilitator
superfamily; Marger und Saier 1993), die sich durch 12 Transmembrandomänen
auszeichnen. Durch heterologe Expression in Bäckerhefe konnten für AtPLT1, AtPLT2,
AtPLT4 und AtPLT5 Aufnahmemessungen mit radioaktiv markierten Substraten durchgeführt
werden. Für AtPLT3 und AtPLT6 blieb dieser Versuchsansatz in Hefe bislang erfolglos
Diskussion
102
(Rademacher, 2006). AtPLT1, AtPLT2 und AtPLT5 konnten zudem erfolgreich in Xenopus
laevis Oozyten exprimiert und elektrophysiologisch vermessen werden.
AtPLT5 sowie AtPLT1 und AtPLT2 sind H+-Symporter
In den heterologen Expressionssystemen Bäckerhefe und Xenopus laevis Oozyten konnten
AtPLT1, AtPLT2 und AtPLT5 als Polyol/Zyklitol/Monosaccharid-H+-Symporter identifiziert
werden (3.1.2; 3.1.3; Volke, 2005 3.2.4; 3.2.5). AtPLT5 war das erste charakterisierte
Transportprotein außerhalb der AtSTP Familie, für das gezeigt wurde, dass es die Aufnahme
von Hexosen katalysiert (Klepek et al., 2005). AtPLT5 ist in der Lage den energieabhängigen
Transport unterschiedlicher Substrate über die Plasmamembran zu bewerkstelligen. Lineare
Polyole von 3 bis 6 C-Atomen werden genauso als Substrat akzeptiert wie zyklische Polyole
oder verschiedene Pentosen und Hexosen, die als Pyranose oder Furansose vorliegen.
Beispielsweise gehören Sorbit, Glukose oder myo-Inosit zu den favorisierten Substraten von
AtPLT5, die mit eher niedriger Affinität transportiert wurden: in Hefe liegt der Km-Wert von
AtPLT5 für Sorbit bei 0,49 mM und für myo-Inosit wurde in AtPLT5-exprimierenden Oozyten
ein Km-Wert von 3,5 mM gemessen (Klepek et al., 2005). Die in Sauerkirsche gefundenen
Sorbittransporter PcSOT1 und PcSOT2 zeigen für Sorbit ähnlich niedrige Km-Werte von
0,81 mM (PcSOT1) und 0,64 mM (PcSOT2) (Gao et al., 2003). AgMAT1, der
Mannittransporter aus Sellerie, weist ähnliche Eigenschaften hinsichtlich des
Sorbittransportes auf. Der Km-Wert für Sorbit liegt bei 0,3 mM (Noiraud et al., 2001). Bei
Sellerie und Sauerkirsche wurde die Hemmung des Mannit- bzw. Sorbittransports durch
Glukose beobachtet und dieses Phänomen als Artefakt des Hefeexpressionssystems
diskutiert. In vorliegender Arbeit konnte für AtPLT5, AtPLT2 und AtPLT4 gezeigt werden,
dass die Hemmung des Sorbittransports durch Glukose kein Artefakt ist, sondern auf einer
tatsächlichen Substrataufnahme beruht. Für Glukose konnte in Hefe für AtPLT5 ein Km-Wert
von 1,5 mM, für AtPLT2 von 1,25 mM, ermittelt werden. Monosacharidtransporter, wie
beispielsweise AtSTP1, besitzen zu Glukose eine weitaus höhere Affinität im mikromolaren
Bereich (20 µM) (Sauer et al., 1990).
AtPLT Proteine sind die ersten Transportproteine für Xylit, Ribose,
Fruktose und Glyzerin
In AtPLT1- bzw. AtPLT2-exprimierenden Hefen und Xenopus Oozyten wurde Xylit mit einer
relativ hohen Affinität über deren Plasmamembranen transportiert (Volke, 2005; Abbildung 3.
23; Abbildung 3. 31). Der Km-Wert für Xylit ist für AtPLT1 0,14 mM, für AtPLT2 0,18 mM
(Volke, 2005; 3.2.4.5). AtPLT4 dagegen transportiert Xylit mit einem Km-Wert von 8,67 mM
(3.3.2.3). Trotz der hohen Affinität von AtPLT1 und AtPLT2 zu Xylit, konnten in der Literatur
keine Anhaltspunkte zu einer möglichen Funktion innerhalb des Stoffwechsels von
Diskussion
103
Arabidopsis gefunden werden. Für den Zellwandaufbau werden in der Pflanze Xyloglukane
(Hemizellulosen) benötigt. Daher wäre es denkbar, dass Xylit zu Xylose umgewandelt wird
und anschließend für den Aufbau von Xyloglukanen zur Verfügung steht. Ribose und
Fruktose, zwei Furanosen, sind weitere Substrate für AtPLT1 und AtPLT2. In Pflanzen sind
für Ribose bisher noch keine aktiven Transportproteine bekannt. Alle untersuchten
Monosaccharidtransporter (AtSTPs) transportieren Ribose mit sehr geringer Rate. Im
Vergleich zu Glukose (100%) wird Ribose von AtSTP14 lediglich zu 5% aufgenommen
(Büttner, persönliche Mitteilung). In Escherichia coli gibt es ein sehr effektives
Membranprotein für den Transport von Ribose (RbsC), das allerdings keine
Sequenzähnlichkeiten mit den pflanzlichen Zuckertransportproteinen aufweist und auch
strukturell keine Ähnlichkeiten mit den Proteinen der MST Familie hat, da das RbsC aus E.
coli aus nur 10 transmembranale Domänen besteht (Iida et al., 1984; Stewart und
Hermodson 2003). Fruktose wird in Pflanzen ebenfalls schlecht transportiert (Büttner et al.,
2000; Scholz-Starke et al., 2003). Bei den Monosachcharidtransportern beträgt die
Fruktoseaufnahmerate nur 6% der von Glukose. Nur für AtSTP6, der in Pollen exprimiert
wird, konnte in Bäckerhefe im Vergleich zu Glukose eine 50%ige Aufnahmerate gemessen
werden (Sauer et al., 1990; Tuernit et al., 1999; Büttner et al., 2000; Scholz-Starke et al.,
2003). Offensichtlich sind die Bindetaschen der anderen Monosacharidtranporter für
Furanoseringformen ungeeignet. Die untersuchten AtPLT Proteine wiesen dagegen eine
vergleichbar hohe Affinität zu Fruktose auf. Fruktose verursachte bei AtPLT1- und bei
AtPLT2-exprimierenden Xenopus Oozyten deutlich messbare H+-Einwärtströme und wurde
auch in Hefe wurde Fruktose effektiv über die Plasmamembran transportiert. Für AtPLT4
wurde in Hefe ein Fruktose Km-Wert von 2,57 mM gemessen (3.3.2.3). AtPLT Proteine
unterscheiden nicht zwischen Substraten mit Pyranose oder Furanoseringformen.
Möglicherweise sind AtPLT Proteine für den Rücktransport von Monosachchariden, vor allem
Fruktose, aus dem Apoplasten zuständig (Reinders et al., 2005). Im Apoplasten hydrolisieren
Invertasen das Disaccharid Saccharose zu Fruktose und Glukose. Zuerst wird Glukose
durch die hoch affinen AtSTPs aufgenommen und anschließend wird die Fruktose durch die
AtSTPs transportiert. In der Aufnahme von Fruktose, die im Apoplasten dann in mM
Konzentrationen vorliegt, könnten die AtPLTs den AtSTPs behilflich sein.
Nicht nur Hexosen zählen zu den Substraten der AtPLTs, auch kleine Moleküle wie Glyzerin
werden sowohl in Hefe als auch in Xenopus über die Plasmamembran transportiert. In
AtPLT5-exprimierenden Xenopus Oozyten wurde für Glyzerin ein Km-Wert von 23,4 mM
ermittelt (Abbildung 3. 6). Somit ist AtPLT5 in Pflanzen auch ein aktives Transportprotein für
Glyzerin (Klepek et al., 2005). Glyzerintransportaktivität wurde in Pflanzen von Mitgliedern
innerhalb der Aquaporinfamilie gezeigt (Weig und Jakob, 2000; Wallace und Roberts, 2004).
AtNLM1 und AtNLM2 (NOD26-like major intrinsic proteins) sind mit einer Glyzerin Permease
Diskussion
104
aus Escherichia coli (GlpF) eng verwandt (Huang et al., 2003; Sweet et al., 1990; Maurel et
al., 1994; Zardoya et al., 2002). Glyzerintransport über die pflanzliche Plasmamembran wird
von AtNLM1 und AtNLM2 in Pflanzen allerdings nicht aktiv, sondern durch den Prozess der
erleichterten Diffusion vermittelt. In Hefe wurden zwei energieabhängige Glyzerintransporter,
GUP1 und GUP2, charakterisiert, die allerdings keine Ähnlichkeiten mit Proteinen der AtPLT
Familie aufweisen (Oliveira und Lucas, 2004).
Weitere Substrate für AtPLT5, die auch in Arabidopsis vorkommen, sind Erythrit, Erythrose,
Fucose, in geringen Mengen Galaktose, Mannose oder Rhamnose (Reinders et al., 2005;
Fiehn et al., 2000). Unterschiedliche Konformationen der Moleküle spielen demnach für die
Aufnahme durch AtPLT5 keine Rolle. So katalysiert AtPLT5 den Transport von Arabinose
sowohl in D-Form als auch in L-Form (Reinders et al., 2005). Der Monosaccharidtransporter
AtSTP1 dagegen ist hochspezifisch für die L-Form von Glukose (Boorer et al., 1994).
Trotz des breiten Substratspektrums von AtPLT5 findet eine Unterscheidung zwischen
Mannit und Sorbit statt. Während AtPLT5 sowohl in Bäckerhefe als auch in Xenopus
Oozyten den Transport von Sorbit über die Plasmamembran katalysiert, war dies für Mannit
nicht der Fall (Abbildung 3.2; 3.4). AgMAT1, PmPLT1 und PmPLT2 transportieren dagegen
beide Zuckeralkohole (Noiraud et al., 2000; Ramsperger-Gleixner et al., 2004). Sorbit und
Mannit besitzen die gleiche Summenformel, sie unterscheiden sich lediglich in der Stellung
einer OH-Gruppe. Möglicherweise werden beide Substrate im aktiven Zentrum von AtPLT5
gebunden, Mannit wird aber nicht transportiert, da nur die sterische Form von Sorbit den
Transportprozess katalysiert.
Ob alle getesteten Verbindungen auch in planta Substrate für Proteine der AtPLT Familie
sind, kann noch nicht vollständig geklärt werden, da z.B. von Sorbit nur bekannt ist, dass es
nicht im Phloem von Arabidopsis vorkommt. Ob Sorbit in anderen Geweben synthetisiert
wird, wurde bisher noch nicht untersucht. Dazu müssten beispielsweise HPLC Analysen
unterschiedlicher Gewebe durchgeführt werden, mit denen man den Sorbitgehalt in den
jeweiligen Geweben bestimmen kann. Es kann auch nicht ausgeschlossen werden, ob
AtPLT5 Affinität zu anderen Substraten aufweist, da in den durchgeführten
Kompetitorstudien vor allem Hexosen und Pentosen den Transport der AtPLTs
beeinträchtigten.
AtPLT Proteine sind in ihrer pH Abhängigkeit sehr heterogen
Für AtPLT5 und AtPLT1 konnte ein pH Optimum im sauren Bereich um pH 5,0 ermittelt
werden (Klepek, 2003; Volke, 2005). Bei ansteigendem pH Wert sank die Sorbitaufnahme
rapide ab, so dass bei pH 6,0 nur noch eine kleine Resttransportaktivität verblieb. Obwohl
AtPLT2 zu AtPLT1 96% homolog auf DNA Ebene ist und die beiden Gene vermutlich durch
Genduplikation entstanden sind, konnte bei AtPLT2 keine so starke pH Abhängigkeit
Diskussion
105
festgestellt werden (Abbildung 3.26; 3.27). Die Transportrate nahm bei pH Wert Änderungen
von 5,0 auf 6,0 um nur 20% ab. Bei pH 7,0 war immerhin noch eine 50%ige Sorbitaufnahme
messbar. Durch elektrophysiologische Messungen in AtPLT1- sowie in AtPLT2-
exprimierenden Xenopus Oozyten konnte ein Protonen-Symport Mechanismus bestätigt
werden (3.2.4).
Ein interessantes Phänomen konnte bei AtPLT4 beobachtet werden: die pH Abhängigkeit
von AtPLT4 ist nämlich genau umgekehrt zu der, der bislang untersuchten
Zuckertransportern (Abbildung 3.49). Die größte Transportaktivität für AtPLT4 wurde bei pH
7,5 gemessen. Ab pH 8,0 und unter pH 7,0 nimmt der Transport ab. Hemmstoffe wie CCCP
oder DNP beeinflussten die Transporteigenschaften von AtPLT4 weniger stark, wie es für
AtPLT5 und AtPLT1 gezeigt worden war (Abbildung 3. 51; Klepek et al., 2005; Volke, 2005).
Möglicherweise unterliegt AtPLT4 einer anderen oder gar keiner Energetisierung.
Da zur Untersuchung der Energetisierung in AtPLT4-exprimierenden Xenopus Oozyten
keine AtPLT4-induzierten H+-Ströme detektiert werden konnten (3.3.3.1), wurde in AtPLT4-
exprimierenden Hefen überprüft, ob möglicherweise ein Na+/Glukose-Symport in Frage
kommt. Dies konnte aber in Aufnahmemessungen mit radioaktiver Glukose in
unterschiedlichen Puffersystemen ausgeschlossen werden (Abbildung 3.50). Na+-
Kotransporter sind untypisch für Pflanzen, die generell den Protonengradienten für den
Transport über die Plasmamembran nutzen. Na+-Symporter kommen hauptsächlich im
tierischen Bereich vor. SMIT1 und SGLT1 sind zwei tierische Na+-Symporter für myo-Inosit.
Diese beiden Proteine gehören aber nicht zur MFS Familie und haben mit dieser auch
keinerlei Gemeinsamkeiten (Kwon et al., 1992; Hediger et al., 1987; Turk und Wright, 1997;
Schneider et al., 2006).
Zur Klärung der pH Abhängigkeit wurden außerdem radioaktive Glukose-
aufnahmemessungen mit AtPLT4-exprimierenden Oozyten bei pH 5,5 und pH 7,5
durchgeführt (3.3.3.2). AtPLT1-injizierte Oozyten dienten als Positivkontrolle, die eine
deutliche Glukoseaufnahme bei pH 5,5 und eine wesentlich geringere Aufnahme bei pH 7,5
zeigten (Abbildung 3.52). Für AtPLT4 konnte bei einem Versuch mit 10 AtPLT4-injizierten
Oozyten ein signifikantes Ergebnis erhalten werden, bei dem der Glukoseinflux in die
Oozyten bei pH 7,5 stärker war als bei pH 5,5. Trotz Einstellung und Änderung
verschiedener Parameter war dieses Ergebnis nicht reproduzierbar. Warum dies so war,
kann nicht erklärt werden. Eventuell ist für AtPLT4 eine Phosphorylierung zur Aktivierung des
Transportprozesses notwendig. Dies konnte kürzlich für den Kaliumtransporter AKT1 gezeigt
werden, der erst nach Koinjektion mit CIPK23, einer Proteinkinase, die AKT1 phosphoryliert,
aktiviert wird, so dass ein Stromfluss detektiert werden konnte (Xu et al., 2006).
Phylogenetisch gesehen befindet sich AtPLT4 am weitesten von den anderen AtPLT
Proteinen entfernt, außerdem besitzt AtPLT4 einen isoelektrischen Punkt von 5,7, bei allen
Diskussion
106
anderen AtPLTs liegt der isoelektrische Punkt um 9. Aus der MFS Familie wurden bislang
nur Zuckertransportproteine charakterisiert, die einem Protonen-Symport Mechanismus
unterliegen. Ob AtPLT4 den Flux von Substraten durch erleichterte Diffusion bewerkstelligt,
bleibt zu klären und könnte in AtPLT4-exprimierenden Hefen getestet werden. Dazu müsste
man die Hefen in radioaktivem Substrat einige Zeit inkubieren und anschließend den
Substrat Efflux aus den Zellen messen. Dieses Experiment konnte leider aus Zeitgründen
nicht mehr durchgeführt werden.
Intrazellular sind die AtPLT Proteine nicht im Tonoplasten lokalisiert
In Hefe und in Xenopus erwiesen sich AtPLT1, AtPLT2 und AtPLT5 als kompetente
Transportproteine für viele verschiedene Substrate. Somit sind in diesen beiden Organismen
AtPLTs Transportproteine der Plasmamembran, was durch AtPLT-spezifische Antiseren im
Western Blot und immunozytologisch bestätigt wurde (Volke, 2005; Abbildung 3.33; 3.9).
Auch in transient transformierten Epidermiszellen von Arabidopsis, Tabak und Zwiebel
wurden die AtPLT5-GFP, AtPLT1-GFP sowie AtPLT2-GFP Fusionen eindeutig in der
Plasmamembran detektiert (Abbildung 3.13; 3.21; 3.22).
Nur für AtPLT4 wurde in Western Analysen neben den Plasmamembranen eine größere
Menge AtPLT4 Protein in den Endomembranen gefunden (Abbildung 3.53). Einerseits
könnte dies auf einer Kontamination bei der Trennung der verschiedenen Membran-
fraktionen beruhen. Western Blots mit Membranfraktionen, die aus zwei unabhängigen
Auftrennungen erhalten wurden, zeigten das gleiche Ergebnis, so dass eine Verunreinigung
der Membranfraktionen unwahrscheinlich ist. Überdieshinaus war eine derartige
Verunreinigung bei den Membranfraktionierungen von AtPLT1- bzw. AtPLT2- und AtPLT5-
exprimierenden Hefen nicht zu sehen. Zum anderen könnte es sich auch um ein
Mißtargeting von AtPLT4 in Hefe handeln. Die transiente Expression eines AtPLT4 cDNA-
GFP Konstrukts in Pflanzen zeigte ebenfalls GFP Fluoreszenz im Endoplasmatischen
Retikulum und den Golgi Vesikeln, worauf die netzartige Struktur und die zahlreichen hell
leuchtenden Punkte in Abbildung 3.44 hindeuten. Aufgrund des 27 kDa großen, C-terminal
fusionierten GFPs, könnte durch eine fehlerhafte Faltung des AtPLT4 Proteins, die
Zielsteuerung von AtPLT4 verloren gegangen sein. Allerdings wurde auch in Pflanzen ein
starker konstitutiver Promotor (35S) zur Expression der AtPLTs verwendet. Bevor
Plasmamembranproteine an ihrem Zielort gelangen, werden sie zur Prozessierung und
Modifizierung über das ER und die Golgi Vesikel geschleust. Dies würde einen Teil der GFP
Fluoreszenz in den Endomembranen erklären. Dennoch könnte es sein, dass AtPLT4
tatsächlich im ER und im Golgi funktional ist. Von Wang und Mitarbeitern wurde erst kürzlich
ein Golgi-lokalisierter Hexosetransporter SGB1 charakterisiert, der aufgrund von
Sequenzhomologien zu den plastidären Glukosetransportern der MST Superfamilie gehört
Diskussion
107
(Wang et al., 2006). Weiterhin gibt es zwei Golgi-lokalisierte Zuckernukleotidtransporter
(GONST1, GONST2), die für den GDP-Mannosetransport in Golgi Membranen
verantwortlich sind (Baldwin et al., 2001; Handford et al., 2004). GDP-Mannose wird im Golgi
Apparat für die Glykosylierung von Proteinen benötigt. In den Golgi Membranen fungiert
AtNST-KT1 als UMP-UDP-Galaktose-Antiporter, der UMP gegen UDP-Galaktose
austauscht, welche ebenfalls für die Glykosylierung verschiedener Proteine erforderlich ist
(Rollwitz et al., 2006). Für die korrekte Glykosylierung im Endoplasmatischen Retikulum wird
UDP-Glukose aus dem Zytosol benötigt, das durch den UDP-Glukose/UDP-Galaktose-
Transporter AtUTr1 zur Verfügung gestellt wird (Norambuena et al., 2002; Reyes et al.,
2006). Die entfernte Verwandtschaft von AtPLT4 zu den anderen AtPLTs sowie die hohe
kompetitive Hemmung des Glukosetransports durch Galaktose (60%; Abbildung 3.45)
könnte für eine andere Zellorganellzuordnung als die Plasmamembran sprechen.
Experimentell könnte man mit Hilfe von Antikörpern das native AtPLT4 Protein (ohne das
möglicherweise störende GFP und ohne den starken 35S Promotor)
elektronenmikroskopisch detektieren. Eine weitere Möglichkeit wäre, eine kleinere Fusion
(z.B. myc-Tag) unter dem eigenen Promotor in Pflanzen einzubringen. Aus Zeitgründen war
die Durchführung dieses Experiments leider nicht mehr möglich. Weiterhin könnten zur
subzellulären Lokalisierung Western Analysen mit AtPLT4-spezifischen Antikörpern und
fraktionierten Pflanzenmembranen durchgeführt werden.
Für AtPLT6, einem anderen Mitglied der AtPLT Familie, wurde ebenfalls eine
Endomembranlokalisation vorgeschlagen (Rademacher, 2006). Jedoch fehlt für AtPLT6, wie
für dessen engsten Verwandten AtPLT3, die funktionelle Charakterisierung in Hefe oder
Xenopus, was Aussagen über die physiologische Funktion in den Endomembranen nahezu
unmöglich macht. Anhand der bislang erhaltenen Ergebnisse zur intrazellulären
Lokalisierung in Pflanzen, ist scheinbar kein Protein der AtPLT Familie im Tonoplasten
lokalisiert.
AtPLT5 ist in Wurzeln und seneszenten Blättern für die Energieversorgung
zuständig
Der erste Polyoltransporter AgMAT1 wurde aus Phloemgewebe aus Sellerie gewonnen
(Noiraud et al., 2001). Auch PmPLT1 und PmPLT2 aus Plantago major konnten in den
Geleitzellen des Phloems immunozytologisch identifiziert werden, was den Schluß zulässt,
dass AgMAT1 und die PmPLT Proteine eine Aufgabe in der Phloembeladung mit Zuckern
oder Zuckeralkoholen wahrnehmen (Ramperger-Gleixner et al., 2004). Demgegenüber
stehen die beiden Sorbittransporter aus Sauerkirsche (PCSOT1 und PcSOT2), die während
des Reifeprozesses in Früchten exprimiert werden (Gao et al., 2003). Früchte besitzen einen
extrem hohen Sorbitgehalt und die Autoren vermuten, dass PcSOT1 und PcSOT2 für den
Diskussion
108
Sorbitimport in die Frucht verantwortlich sind. AtPLT5 wurde hauptsächlich in jungen und
seneszenten Blättern, sich entwickelnden Schoten und Wurzeln, vor allem 200 µm hinter der
Wurzelspitze, exprimiert (Abbildung 3.1). Die Streckungszone der Wurzel ist ein rasant
expandierendes Gewebe und benötigt für das Wachstum besonders viele Kohlenhydrate
(Fiehn, 2003). Außerdem könnte AtPLT5 für den Rücktransport von Kohlenhydraten aus
dem Apoplasten in die Sinkgewebe verantwortlich sein (Reinders et al., 2005). Durch die
Zellwandinvertase wird im Apoplasten Saccharose zu Fruktose und Glukose hydrolisiert. Vor
allem Glukose wird durch die AtSTPs aufgenommen. Um den Rücktransport der Fruktose zu
gewährleisten, würde eine Rolle als „Lumpensammler“ für verloren gegangene Hexosen,
insbesondere Fruktose, für AtPLT5 in Frage kommen (Tymowska-Lalanne und Kreis, 1998).
Bisher wurde auch noch nicht untersucht, ob in Arabidopsis Wurzeln die Synthese von Sorbit
stattfindet. Sorbit kann hier Funktionen als Osmolyt wahrnehmen und Wasserverlust
entgegenwirken. Dies könnte durch HPLC Messungen des Sorbitgehalts in Arabidopsis
Wurzelgewebe bestimmt werden. Für AtPLT4, dessen Promotoraktivität ebenfalls in
Sinkgeweben wie Trichomen und Wurzelspitzen nachgewiesen wurde, war eine ähnliche
Funktion in der Regulierung des osmotischen Potenzials bei Wasserstress vorgeschlagen
worden (Klepek, 2003). Weiterhin wurde AtPLT5-Promotor-GUS Aktivität in Blättern
beobachtet (Abbildung 3.1 E, F, G, H). In jüngeren Blättern war ein gleichmäßiges
Expressionsmuster von AtPLT5 zu sehen, während ältere Blätter oft unregelmäßig gefärbt
waren. Eine Möglichkeit wäre, dass AtPLT5 in frühen seneszenten Blättern für die Aufnahme
von Zuckern und damit für die Energieversorgung zuständig ist. Genevestigator, eine
Microarray Datenbank im Internet, bestätigte die Expression von AtPLT5 im seneszenten
Blatt. Das Seneszenzprogramm kann einerseits durch Dunkelheit induziert werden,
andererseits entwicklungsbedingt auftreten. Typische Symptome der Seneszenz sind eine
geringere Photosyntheserate, die durch Degradierung von Proteinen, die für den
Photosynthseseprozess benötigt werden, zu Stande kommt. Wenn Photosynthese betrieben
wird, ist fast nur Saccharose als lösliches Kohlenhydrat im Blatt nachzuweisen (Quirino et al.,
2001). Sobald in 50 Tage alten Arabidopsis Blättern der Chlorophyllabbau einsetzte, sank
der Wert für Saccharose ab, zeitgleich stiegen die Werte von Fruktose und Glukose
drastisch an, auch Galaktose, Arabinose, Fucose und Rhamnose waren vermehrt im Blatt
vorhanden (Quirino et al., 2001; Pourtau et al., 2006). Diese Zucker wurden von Reinders et
al., 2005 als Substrate für AtPLT5 identifiziert. Dass in Arabidopsis die Blattseneszenz durch
Hexoseakkumulation induziert wird, wurde anhand von Hexokinase1 Mutanten (gin2-1)
gezeigt. Hexokinase1 ist an der Hexosesignalgebung (sugar sensing) während der
Seneszenz beteiligt (Jang et al., 1997; Xiao et al., 2000). gin2-1 kann durch verminderte
Hexoseakkumulation ihr Seneszenzprogramm erst verspätet einschalteten (Moore et al.,
2003; Pourtau et al., 2006). Erwachsene Sourceblätter von AtPLT5-Promotor-GUS Pflanzen
Diskussion
109
zeigten die GUS Färbung in den Leitgeweben an den Randbereichen des Blattes (Abbildung
3.1). Das gleiche Expressionsmuster wurde für AtSFP1, ein Seneszenz-induzierter
Monosaccharidtransporter, erhalten, der in den Bereichen des Blattes exprimiert wird, in
denen Chlorophyll bereits abgebaut wird (Quirino et al., 2001). Erwachsene Sourceblätter
von AtPLT5-Promotor-GUS Pflanzen, die kurz vor der Seneszenz standen, waren nur stark
um die Mittelrippe herum gefärbt (Abbildung 3.1). Vollständig seneszente, bereits gelbe
Blätter, zeigten keine GUS Färbung mehr. Diese altersabhängige Expression von AtPLT5 in
Blättern deutet darauf hin, dass AtPLT5 vor allem in den frühen Phasen der Seneszenz aktiv
ist und für die Energieversorgung und den Rücktransport von Zuckern wie Glukose und
Fruktose oder anderen Monosacchariden ins Phloem verantwortlich ist.
AtPLT5 Promotoraktivität wurde außerdem in den Leitbündeln der Sepalen und in Schoten
detektiert. In Antheren, Petalen und in Pollen dagegen war zu keiner Zeit AtPLT5 exprimiert,
was auch mit den Daten von Genevestigator übereinstimmt. Ein ähnliches
Expressionsmuster wurde für AtPLT3 beschrieben. AtPLT3 Promotoraktivität wurde in der
Mittelrippe und in den Leitbündeln von Blättern in einem späteren Entwicklungsstadium
festegestellt, wo AtPLT3 für den Export von Stoffwechselprodukten aus alternden Gewebe
verantwortlich sein soll (Volke, 2005). Für den Import osmotisch aktiver Substanzen sollte
AtPLT3 im konnektiven Gewebe der Antheren sowie der Abszissionszone der Blüte
zuständig sein (Volke, 2005).
Für AtPLT5 konnte außerdem eine Induktion nach Verwundung beobachtet werden
(Abbildung 3.1 L, M; Reinders et al., 2005). Es ist bekannt, dass aus dem verletztem
Gewebe Oligosaccharide als Signalmoleküle entlassen werden (Leon et al., 2001). In
Karotten wurde gezeigt, dass nach Verwundung Invertasen und bestimmte Enzyme induziert
werden, die Saccharose oder andere Oligosaccharide wie Raffinose oder Stachyose
hydrolysieren (Sturm et al., 1990). Einerseits sind diese Monosaccharide Signalmoleküle
(Bishop et al., 1981), andererseits stellt ein verwundetes Gewebe auch ein extremes „Sink“
dar und muss mit Kohlenhydraten versorgt werden. Aufgrund des breiten Substratspektrums,
könnte AtPLT5 bei der Versorgung dieser verletzten Gewebe helfen, indem Monosaccharide
für den Aufbau zur Verfügung gestellt werden.
Microarray-Analysen für AtPLT5
Eine potentielle Veränderung der Genexpression einer AtPLT5 T-DNA Insertionsmutante im
Vergleich mit Wildtyppflanzen wurde durch Microarrayanalysen mit dem Affymetrix ATH1
GeneChip untersucht (Barth, 2005). Die Analysen ergaben eine signifikante
Herunterregulierung der Galaktinol-Synthase (Tabelle 3. 6). Dieses Enzym katalysiert den
ersten Schritt in der Raffinosesynthese aus UDP-Galaktose und myo-Inosit. Taji und
Mitarbeiter konnten zeigen, dass Arabidopsis Pflanzen unter Salzstress Raffinose und
Diskussion
110
Galaktinol akkumulierten (Taji et al., 2002). Galaktinol-Synthase-überexprimierende
Arabidopsis Pflanzen (AtGoLS) reicherten deutlich mehr Raffinose und Galaktinol an und
reagierten auf Trockenstress weitaus unempfindlicher als col wt Pflanzen (Taji et al., 2002).
Zwar war in AtPLT5-exprimierenden Hefen nur eine geringe Galaktoseaufnahme zu messen,
jedoch myo-Inosit, ein Edukt der Raffinosesynthese, wurde sowohl in Hefe als auch in
Xenopus über die Plasmamembran transportiert. Möglicherweise ist also AtPLT5 in
irgendeiner Form in die Raffinosesynthese unter Stressbedingungen involviert.
Zweitens war ein Seneszenz-assoziiertes Enzym herunterreguliert, was gut mit den GUS-
Expressionsdaten von AtPLT5 übereinstimmt (Abbildung 3.1). Zu den anderen signifikant
betroffenen Genen kann keine Aussage getroffen werden, da die meisten dieser Gene
lediglich mit „hypothetical-“ oder „expressed protein“ gekennzeichnet waren.
AtPLTs scheinen nicht in eine erhöhte Salzresistenz verwickelt zu sein
Für Sellerie und Plantago wurde gezeigt, dass Polyole für eine bessere Verträglichkeit von
Salzstress sorgen. Bei Behandlung von Plantago major mit 400 mM NaCl Lösung war ein
Anstieg der Expression von PmPLT1 und PmPLT2 und eine Sorbit Akkumulation (Faktor 5-
6) in Leitgewebe zu beobachten (Pommerrenig et al., eingereicht zur Begutachtung). Sorbit
wirkt als osmotisch aktive Substanz einem Wasserverlust entgegen. Bei einer AtPLT5 T-
DNA Insertionsmutante bewirkte Salzstress keinerlei Veränderungen im Phänotyp im
Vergleich zu Wildtyp Pflanzen (Abbildung 3.15). Das Wachstum von Wildtyp und Mutante auf
Substraten wie Sorbit, myo-Inosit oder Glyzerin sowie Trockenstress blieben ebenfalls ohne
phänotypische Auffälligkeiten (Abbildung 3.16). Ähnliche Ergebnisse ergab auch die Analyse
der AtPLT1- und AtPLT6 Nullmutanten (Volke, 2005; Rademacher, 2006). Aufgrund der
Studien von Taji et al., 2002 und Pommerrenig et al., 2007 würden eventuell HPLC Analysen
Aufschluss über die Zusammensetzung der Kohlenhydrate in Wildtyp und Mutanten unter
Salzstress oder anderen Stressbedingungen geben. Die HPLC Analysen konnten im
Rahmen dieser Arbeit nicht mehr durchgeführt werden, da die Ergebnisse von Pommerrenig
et al., 2007 erst zum Ende dieser Arbeit bekannt wurden.
Nur AtPLT1 und AtPLT2 sind im Pollen exprimiert und zeitlich reguliert
Aus der AtPLT Familie sind nur AtPLT1 und AtPLT2 in Pollen exprimiert, wobei in
Pollenkeimungsversuchen festgestellt wurde, dass die Expression von AtPLT1 und AtPLT2
zeitlich voneinander getrennt ist. AtPLT2 wird im reifen Pollenkorn bereits vor der Keimung
exprimiert (Abbildung 3.18), während AtPLT1-Promotoraktivität erst in auskeimenden
Pollenschläuchen auftritt (Abbildung 3.17). In ungekeimten Pollenkörnern wurde für AtPLT1
keine GUS Aktivität beobachtet. Für die Monosaccharidtransporter AtSTP2, AtSTP4,
AtSTP6, AtSTP9 und AtSTP11, ist ebenfalls ein zeitabhängiges Expressionsmuster im
Diskussion
111
Pollen beobachtet wurden. AtSTP2 wurde spezifisch im Pollen nachgewiesen, wo er
Pollenkörner mit Hexosen versorgt (Truernit et al., 1999). Zu einem späteren Zeitpunkt ist
AtSTP4 im Pollen exprimiert (Truernit et al., 1996); AtSTP6 ist nur in ausgereiften Pollen zu
finden (Scholz-Starke et al., 2003), während AtSTP9 in sich entwickelnden und reifen
Pollenkörnern sowie im keimenden Pollenschlauch aktiv ist (Schneidereit et al., 2003).
Ausschließlich im Pollenschlauch ist AtSTP11 detektierbar (Schneidereit et al., 2005).
Pollen verlieren während ihres Reifungsprozesses ungefähr 90% ihres Wassergehaltes
(Schwacke et al., 1999). Lansac et al., 1996 postulierte, dass in dieser Phase Prolin und in
manchen Pflanzen auch Betaine als Osmolyte in den Pollen eingelagert werden, um
während der Austrocknung der Pollenkörner die zellulären Funktionen aufrecht zu erhalten.
Je höher der Prolingehalt im Pollen war, desto wahrscheinlicher war das Überleben des
Pollens, da dieser durch Prolin vor dem Austrocknen geschützt war (Lansac et al., 1996). So
könnte AtPLT2 die Aufnahme von Polyolen als Osmolyte im Pollen ermöglichen, so dass
während der Pollendehydration Proteine geschützt werden und zelluläre Funktionen
aufrechterhalten werden. PhPMT1, ein Monosacchridtransporter aus Petunie, dessen Gen in
wachsenden Pollenschläuchen exprimiert wird, katalysiert dort wahrscheinlich den Import
von Fruktose und Glukose aus den stylaren Apoplasten (Ylstra et al., 1998). Saccharose
wird über das Phloem zum Stempel der Blüte transportiert und in den stylaren Apoplasten
abgegeben. Im Pollenschlauch hydrolysiert eine Invertase die Saccharose in Fruktose und
Glukose, die über die Pollenschlauchmembran durch PhPMT1 aufgenommen werden (Ylstra
et al., 1998). Analog könnte dieses Modell für AtPLT1 in Arabidopsis zutreffen. Eine andere
Möglichkeit wäre, dass AtPLT1 als Polyoltransporter osmotisch aktive Substanzen in den
symplastisch isolierten Pollenschlauch transportiert, wodurch sich dessen Turgor erhöht.
Dies würde sich positiv auf das Wachstum des Pollenschlauches auswirken, indem die
rapide Produktion von Zellwandmaterial, die mit einem hohen Energiebedarf verbunden ist,
gewährleistet wird (Stadler et al., 1999).
Die experimentell durchgeführten Expressionsanalysen für AtPLT1 bis AtPLT6 mit AtPLT-
Promotor-Reportergen Pflanzen (Volke, 2005; Klepek, 2003; Rademacher, 2006) stimmen
weitgehend mit den Microarray Analysen, die in verschiedenen Datenbanken
zusammengetragen wurden, überein. In der Datenbank Genevestigator ist die
Genexpression in den einzelnen Pflanzenteilen bzw. Entwicklungsstadien gezeigt. Für
AtPLT5 wird hier beispielsweise eine Expression im seneszenten Blatt und in Sepalen
beschrieben (siehe Anhang), die in AtPLT5-Promotor-Reportergen Pflanzen ebenfalls
detektiert werden konnte. Auch die Expressionsmuster anderer Datenbanken, wie dem
Arabidopsis eFP Browser (siehe Anhang), stimmen mit den experimentell gefundenen
Expressionsmuster im seneszenten Blatt sowie in Sepalen überein. Allerdings ist dabei
anzumerken, dass die Chip Daten aus unterschiedlichen Experimenten stammen und
Diskussion
112
untereinander nicht immer vergleichbar sind, bzw. leider nicht vollständig sind. So zeigen
AtPLT5-Promotor Reportergenpflanzen AtPLT5 Promotoraktivität in der Wurzel, die in
Genevestigator und im efP Browser nur sehr schwach als Expressionsort angegeben wird
(siehe Anhang). Für die in silico Recherche wurden folgende Internetdatenbanken verwendet: TAIR: http://www.arabidopsis.org AMPL: http://www.cbs.umn.edu/arabidopsis/, Arabidopsis eFP Browser: http://www.bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi ARAMEMNON: http://www.crombec.botanik.uni-koeln.de Genevestigator: http://www.genevestigator.ethz.ch
AtPLT1 und AtPLT2 sind im vaskulären Kambium von Arabidopsis thaliana
lokalisiert
Immunolokalisationsanalysen in Stängelquerschnitten von Arabidopsis thaliana col wt
Pflanzen und einer AtPLT1 T-DNA Insertionsmutante konnten AtPLT1 und/oder AtPLT2 im
Kambium lokalisieren (Abbildung 3.35). Beim Kambium handelt es sich um ein
meristematisches Gewebe (Lateralmeristem) mit aktiver Zellteilung, das für das sekundäre
Dickenwachstum von Dikotyledonen verantwortlich ist. Aufgrund der hohen Zellteilungsrate
sind die Zellen des Kambiums auf eine beträchtliche Menge an Kohlenstoffverbindungen
angewiesen, um ihre Energieversorgung zu gewährleisten. Einer Mannit-Dehydrogenase
(AgMTD1) aus Sellerie, die unter anderem im Kambium lokalisiert wurde und dort Mannose
durch die Oxidation von Mannit zur Verfügung stellt, wurde eine derartige Aufgabe
zugeschrieben (Stoop und Pharr, 1994; Zamski et al., 1996). Das von AtPLT1 oder AtPLT2
favorisierte Substrat Xylit könnte im Kambium für die Herstellung von Strukturpolymeren wie
Xyloglukanen, die für die Zellwandsynthese benötigt werden, verwendet werden. Dazu
müsste Xylit nur zu Xylose oxidiert werden und stünde dann für den Zellwandaufbau zur
Verfügung. Neben Xylose sind Galaktose und Arabinose, die für AtPLT5 als Substrate
identifiziert wurden, Hauptbestandteil pflanzlicher Zellwandkomponenten (Hemizellulose).
Ergänzend zu den Untersuchungen mit Antikörpern wurden Handschnitte von AtPLT1-
Promotor-GUS bzw. AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen angefertigt (Abbildung 3.19; 3.20).
Jeweils in nur einer von je 48 untersuchten Pflanzen war die GUS Aktivität im Kambium zu
sehen. Dass dieser Expressionsort auf einen Positionseffekt zurückzuführen ist, scheint
allerdings sehr unwahrscheinlich. Vielmehr ist davon auszugehen, dass die GUS Expression
unterdrückt wird oder nur nach mehrmaliger Insertion detektierbar wird. Infolgedessen
handelt es sich beim Kambium um den eigentlichen Lokalisationsort von AtPLT1 und
AtPLT2. Durch die Ähnlichkeit der Proteine ist eine redundante Funktion nicht
Diskussion
113
auszuschließen. Um das Ergebnis abzusichern, sollte mit einer AtPLT2 Verlustmutante oder
einer AtPLT2-herunterregulierten RNAi-Pflanze die Immunolokalisation wiederholt werden.
Für alle anderen AtPLT Proteine standen zwar spezifische Antiseren zur Verfügung, die alle
in Hefe erfolgreich getestet wurden, jedoch scheiterten sämtliche Versuche in Pflanzen ein
auswertbares Signal zu erhalten. Offensichtlich liegt der Proteingehalt der anderen AtPLT
Proteine in Pflanzen unter der Nachweisgrenze, oder das Epitop ist für den Antikörper nach
der Einbettungsprozedur nicht mehr erreichbar.
Ausblick
Die Gruppe der Polyol Transporter aus Arabidopsis besteht aus sechs Mitgliedern, die
teilweise redundante Funktionen aufweisen. Bei Ausfall eines Gens dieser Transporterfamilie
wird möglicherweise dessen Aufgabe von den anderen Transportern übernommen. Dies
wäre eine Erklärung dafür, dass Einzelverlustmutanten keinen veränderten Phänotyp
aufweisen. Deshalb wurden zum Ende dieser Arbeit RNAi Pflanzen hergestellt, in denen
theoretisch fünf der sechs Polyoltransporter herunterreguliert sein sollten (3.2.7). Im Rahmen
dieser Arbeit konnten nur wenige Pflanzen auf RNA Ebene untersucht werden. Dabei wurde
keine Pflanze gefunden, die in der mRNA Menge von AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 oder AtPLT5
reduziert war (Abbildung 3.41). Für diesen Ansatz müssten in der Zukunft noch weitere
Pflanzen untersucht werden, was leider aus Zeitgründen nicht mehr möglich war.
Insbesondere sollten in verschiedenen Geweben von Arabidopsis col wt und Mutanten
mittels HPLC Analysen nach Xylit, Sorbit und Fruktose gesucht werden. Gegen Ende dieser
Arbeit wurden RNAi Pflanzen generiert, die nur in der Expression von AtPLT1 und AtPLT2
betroffen sein sollten. Die Analyse von 75 selektionierten Pflanzen ergab keine
Veränderungen in der AtPLT1 mRNA Menge, jedoch war in 11 transgenen Pflanzen AtPLT2
nicht mehr detektierbar (Abbildung 3.42). Keine dieser 11 Pflanzen zeigte Auffälligkeiten im
Habitus, die Überprüfung einer möglichen Veränderung der Kohlenhydratzusammensetzung
mit Hilfe von HPLC Analysen steht allerdings noch aus. AtPLT1 und AtPLT2 sind zu 93,5%
homolog in ihren DNA Sequenzen. Es wäre sehr interessant herauszufinden, wie trotz der
Homologie der beiden Gene die unterschiedliche Expression im Pollen zu Stande kommt.
Überexpressionslinien verschiedener AtPLT Gene sowie Microarray Analysen mit
Mehrfachmutanten könnten darüber hinaus weitere Anhaltspunkte bezüglich der
physiologischen Rolle der AtPLT Familie liefern.
114
Material & Methoden
115
5 Material und Methoden
5.1 Material
5.1.1 Organismen
5.1.1.1 Bakterienstämme
Escherichia coli: Stamm Marker Referenz
DH5α F-, endA1, hsdR17(rk-, mk-), supE44, thi-1, recA1, gyrA96,relA1, f80d, lacZ[Δ]M15
Hanahan, 1983
Agrobakterium tumefaciens: Stamm Marker Plasmid Marker Referenz
GV3101 C58C1, RifR pMP90 GentR Holsters et al., 1980; Koncz und Schell, 1986
Tabelle 5.1 :verwendete Bakterienstämme
5.1.1.2 Hefestämme: Saccharomyces cerevisiae:
nicht transformiert:
Stamm Marker Referenz
EBY.VW.4000 Mata; leu2-3, 112; ura 3-52; trp 1-289; his 3-Δ1; MAL2-8c; SUC2; Δhxt 1-17 ; Δgal2 ; Δstl1; Δagt1; Δmph2; Δmph3
Boles et al., 1999
SEY 2102 Matα, ura3-52, leu2-3,112, his4-519, suc2-α9, gal2 Emr et al., 1983 Y14331 MATα, his3Δ1, leu2Δ0, ura 3Δ0, YDR497c::kam MX4 EUROSCARF
Tabelle 5.2: verwendete, untransformierte Saccharomyces cerevisiae Stämme
transformiert:
Name Ausgangsstamm Vektor Marker Insert Referenz
YKY 1 SEY2102 NEV-E URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT5 cDNA sense
Klepek et al., 2005
YKY 2 SEY2102 NEV-N URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA sense
diese Arbeit
YKY 3 SEY2102 NEV-N URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA antisense
diese Arbeit
YKY 4 SEY2102 NEV-E URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT5 cDNA antisense
Klepek et al., 2005
YKY 5 EBY.VW.4000 NEV-E URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT5 cDNA sense
diese Arbeit
YKY 6 EBY.VW.4000 NEV-N URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA sense
diese Arbeit
Material & Methoden
116
YKY 7 EBY.VW.4000 NEV-N URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA antisense
diese Arbeit
YKY 8 EBY.VW.4000 NEV-E URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT5 cDNA antisense
diese Arbeit
YKY 9 SEY2102 NEV-E URA3 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT1 cDNA sense
diese Arbeit
YKY 10 SEY2102 NEV-E URA3 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT1 cDNA antisense
diese Arbeit
YKY 11 EBY.VW.4000 NEV-E URA3 5´ UTR AtSTP1 + AtPLT4 cDNA sense
diese Arbeit
YKY 12 EBY.VW.4000 NEV-E URA3 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT4 cDNA antisense
diese Arbeit
YKY 13 SEY2102 NEV-E URA3 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT3 cDNA sense
diese Arbeit
YKY 14 SEY2102 NEV-E URA3 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT3 cDNA antisense
diese Arbeit
YKY 15 EBY.VW.4000 NEV-E URA3 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT3 cDNA sense
diese Arbeit
YKY 16 EBY.VW.4000 NEV-E URA3 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT3 cDNA antisense
diese Arbeit
YKY17 Y14331 NEV-N URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA sense
diese Arbeit
YKY18 Y14331 NEV-N URA3 5’-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA antisense
diese Arbeit
Tabelle 5.3 : Transformierte Saccharomyces cerevisiae Stämme
5.1.1.3 Pflanzen Arabidopsis thaliana: Verwendeter Wildtyp: Arabidopsis thaliana col wt Name Plasmid Transformiert durch Selektionsmarker Referenz
MV7A pMV 7A GV3101 BAR Volke, 2005 MV7B pMV 7B GV3101 BAR Volke, 2005 MV8A pMV 8A GV3101 BAR Volke, 2005 MV8B pMV 8B GV3101 BAR Volke, 2005 MV9A pMV 9A GV3101 BAR Volke, 2005 MV9B pMV 9B GV3101 BAR Volke, 2005 YK1 (AtPLT4-Promotor-GUS)
pYK9 GV3101 BAR Klepek, 2003
YK2 (AtPLT5-Promotor-GUS)
pYK10 GV3101 BAR Klepek, 2003
YK4 (AtPLT4-Promotor-GFP)
pYK12 GV3101 BAR Klepek, 2003
YK5 (AtPLT5-Promotor-GFP)
pYK13 GV3101 BAR Klepek, 2003
YK7 (RNAi 1-5) pYK38 GV3101 BAR diese Arbeit
YK8 (RNAi 1-2) pMVRNAi1.2end pMVRNAi2.2end
GV3101 GV3101
BAR BAR
diese Arbeit diese Arbeit
Tabelle 5.4: Arabidopsis thaliana Transformanden
Material & Methoden
117
5.1.1.4. Frösche Xenopus laevis Für die radioaktiven Aufnahmemessungen wurden die Xenopus laevis Oozyten (NASCO, Fort Atkinson, WI) vom Physiologischen Institut der Medizinischen Fakultät Erlangen-Nürnberg bereitgestellt.
5.1.2 Vektoren
5.1.2.1 Vektoren ohne Insert
Vektor Selektionsmarker Referenz pUC 19 AmpR Yanish-Perron et al., 1985 pCR®- Blunt II – TOPO® KanR Invitrogen life technologies pGEM®-T-Easy AmpR Promega, Madison NEV-E AmpR , URA3 Sauer und Stolz, 1994 NEV-N AmpR , URA3 Sauer und Stolz, 1994 pGPTV - BAR KanR Becker et al., 1992 pHANNIBAL AmpR Wesley et al., 2001 pAF 16 KanR Feuerstein, 2006 pDK148 KanR Jespersen et al., 2002
Tabelle 5.5 : Vektoren ohne Insert
5.1.2.2 Vektoren mit Insert
Alle Vektoren, die für die Promotor-Reportergenkonstrukte hergestellt wurden, nachzulesen in Diplomarbeit Yvonne Klepek (2003), Melanie Volke (2005). Name Ausgangsvektor Insert Referenz pYK 32 pGEM®-T-Easy 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT1 cDNA diese Arbeit pYK 33 pGEM®-T-Easy 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA diese Arbeit pYK 28 pGEM®-T-Easy 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT4 cDNA diese Arbeit pMV–Y NEV-N 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT1 cDNA
sense Diplomarbeit Melanie Volke
pMV-Y-as NEV-N 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT1 cDNA antisense
Diplomarbeit Melanie Volke
pYK 34 NEV-N 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA sense
diese Arbeit
pYK 35 NEV-N 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT2 cDNA antisense
diese Arbeit
pYK 31 NEV-E 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT4 cDNA sense
diese Arbeit
pYK 31-as NEV-E 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT4 cDNA antisense
diese Arbeit
pYK 23 NEV-E 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT5 cDNA sense
Klepek, 2003
pYK 24 NEV-E 5´-UTR AtSTP1 + AtPLT5 cDNA antisense
Klepek, 2003
pSO35e pUC 19 enh.35S Promotor + GFP Klepek et al., 2005 pGFP-PTS unbekannt enh. 35S Promotor + PTS
Signalsequenz+GFP R.Hänsch, Braunschweig
pMV-L pSO35e AtPLT1 cDNA sense Volke, 2005 pYK26 pSO35e AtPLT2 cDNA sense diese Arbeit pYK30 pSO35e AtPLT4 cDNA sense diese Arbeit pYK25 pSO35e AtPLT5 cDNA sense diese Arbeit
Material & Methoden
118
pMVOO1 pDK148 AtPLT1 cDNA sense diese Arbeit pMVOO2 pDK148 AtPLT2 cDNA sense diese Arbeit pYK 29 pDK148 AtPLT4 cDNA sense diese Arbeit pYKWÜ pDK148 AtPLT5 cDNA sense diese Arbeit pYK36 pCR®-BluntII-TOPO® RNAi 1_5 diese Arbeit pYK37 pHANNIBAL RNAi 1_5 sense+antisense diese Arbeit pYK38 pAF16 RNAi 1_5 sense+antisense diese Arbeit TOPO RNAi 1 pCR®-BluntII-TOPO® RNAi 1 diese Arbeit TOPO RNAi 2 pCR®-BluntII-TOPO® RNAi 2 diese Arbeit pMV RNAi_1.1 pHANNIBAL RNAi 1 antisense diese Arbeit pMV RNAi_2.1 pHANNIBAL RNAi 2 antisense diese Arbeit pMV RNAi 1.2 pHANNIBAL RNAi 1 sense + antisense diese Arbeit pMV RNAi 2.2 pHANNIBAL RNAi 2 sense + antisense diese Arbeit pMVRNAi1.2end pAF 16 RNAi 1 sense + antisense diese Arbeit pMVRNAi2.2end pAF 16 RNAi 2 sense + antisense diese Arbeit Tabelle 5.6: Vektoren mit Insert
5.1.3 Oligonukleotide
Alle hier nicht aufgeführten Oligonukleotide nachzulesen in Diplomarbeit Yvonne Klepek (2003), Melanie Volke (2005).
5.1.3.1 Oligonukleotide zur Amplifizierung der cDNA Name Sequenz AtPUT2-5 5‘-gacacagcggccgcaagcttgtaaaagaaatgagttcctcaggagaagaacg-3‘ AtPUT2-3 5‘-gacacagcggccgctcattgttcatcaactacttgtt-3‘ AtPUT4-5 5‘-gacacagaattcaagcttgtaaaagaaatgatgaagaatcttccggaggt-3‘ AtPUT4-3 5‘-gacacagaattctcaaaactcctgttccttgcgca-3‘ AtPUT5-5 5’-gacacagaattcaagcttgtaaaagaaatgacaggtgccacaccggaaaa-3’ AtPLT5-3 5’-gacacagaattcctacgaactttgtgtgtctcctt-3’ AtPLT5c32 5’-caacctcaacgggaatatctccg-3’ AtPLT5ci-33 5’-agtcgcaatccctccaaac-3’ AtPLT5cW5 5’-atcctccttggttatgatataggagtga-3’ AtPLT5ci53 5’-cggaagaacctctgactgga-3’ AtPLT5c52 5’-gtcggatatgctctcatgatcgc-3’ AtPLT5ci54 5’-aagcaactctccgtctcgaa-3’ AtPLT5cW3 5’-gcgatcatgagagcatatccgac-3’ AtPLT4c-3’i2 5’-aggttatcccaagcgttccttg-3’ AtPLT4c-5’i2 5’-tgctctcgtcttccagactggtg-3’
Tabelle 5.7: Oligonukleotide zur Amplifizierung der cDNA
5.1.3.2 Oligonukleotide für cDNA-GFP Fusionen in pSO35e Name Sequenz AtPLT1c+ 4f 5´-gaggcaccatggagaattcctcgggagttgaacaaggtg-3´ AtPLT1c+1533r 5’-tgcctcccatggcttgtccatccacaacttcattgtctttg-3’ AtPLT2NcoI 5’ 5’-gacacaccatgggttcctcaggagaagaacg-3’ AtPLT2NcoI 3’ 5’-gacacaccatggcttgttcatcaactacttgtt-3’ AtPLT4BamHI 5’ 5’-gacacaggatccatgatgaagaatcttccg-3’ AtPLT4BamHI 3’ 5’-gacacaggatccgaaactcctgttccttgcg-3’ AtPLT5NcoI-5 5’-gacacaccatgggaatgacaggtgccacaccggaaaa-3’ AtPLT5NcoI-3 5’-gacacaccatggaactttgtgtgtctctcctt-3’
Tabelle 5.8 : Oligonukleotide für cDNA-GFP Fusionen in pSO35e
Material & Methoden
119
5.1.3.3 Sonstige Oligonukleotide Name Sequenz Salk LBa1 5´-tggttcacgtagtgggccat-3´ Salk LBb1 5´-gcgtggaccgcttgctgcaact-3´ s_PMA1p 5’-tctctcttttatacacacattcaaaag-3’ s_PMA1t 5’-tgtgtgaagctaagagttgatgc-3’ T7 5´-gaattgtaataccactcactatag-3´ AtAct2g+846f 5’-attcagatgcccagaagtcttgtt-3’ AtAct2g+1295r 5´-gaaacattttctgtgaacgattcct-3´ AtUBQ10g-315f 5’-accgtgatcaagatgcagatctttgt-3’ AtUBQ10g-163 5’-tacggccatcctctagctgcttg-3’ pHannibal 4139f 5´-cgcacaatcccactatccttc-3´ GFP int+ rev 5´-catcctggtcgagctggac-3´
Tabelle 5.9 : sonstige Oligonukleotide
5.1.3.4 Oligonukleotide für RNAi Overlap Extension Name Sequenz RNAi_AtPLT1&2_5 5’-gacacactcgagtctagaatgacatcaaacgcgcagttg-3’ RNAi_AtPLT1&2_3’ 5’-ctatcatgagagcaaaccctataccaaggcatgctatgag-3’ RNAi_AtPLT3_5’ 5’-ctcatagcatgccttggtatagggtttgctctcatgatag-3’ RNAi_AtPLT3_3’ 5’-gcccagcaagatccctagatttatgaagtttcccaaaacagtaattcgagac-3’ RNAi_AtPLT4_5’ 5’-gtctcgaattactgttttgggaaacttcataaatctagggatcttgctgggc-3’ RNAi_AtPLT4_3’ 5’-cgcgaatgcataattgttcctcttgcactgtccactcggcctttc-3’ RNAi_AtPLT5_5’ 5’-gaaaggccgagtggacagtgcaagaggaacaattatgcattcgcg-3’ RNAi_AtPLT5_3’ 5’-gacacaggtaccaagctttccagcgagaatcccgattt-3’ AtPLT1c+719f 5’-gacacactcgagtctagaatgacatcaaacgcgcagt-3’ AtPLT1c+1191r 5’-ctgtgtggtaccaagcttacaaaagtcatcaccgtcgt-3’ AtPLT1c+939f 5’-gacacactcgagtctagaggctggactgaagtccaa-3’
Tabelle 5.10: Oligonukleotide für Herstellung der RNAi Konstrukte RNAi 1-5 und RNAi 1-2
5.1.4 Lösungen
Acrylamid-Stammlösung 30% Acrylamid; 0,8% Bisacrylamid Aufbruchspuffer 2% Triton X 100; 1% SDS; 0,1 M NaCl; (für DNA–Isolierung aus Hefe) 10 mM Tris /HCl pH 8,0; 1 mM EDTA Agrobakterien–Lysis–Puffer 50 mM Glukose; 25 mM Tris/HCl pH 5,8; 10 mM EDTA; 4 mg/ml Lysozym, vor Verwendung frisch zugeben; (bei 4°C lagern) Blockierungspuffer 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 150 mM NaCl;
(für Westernblot) 1% Magermilchpulver; 0,1% Triton100 (bei 4°C lagern) Blockierungspuffer 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 150 mM NaCl (für Immunolokalisierung) 1% Magermilchpulver (bei 4°C lagern) Bradford – Färbelösung (5 x) 0,05% Coomassie Brilliant Blue G-250; 23,5% Ethanol; 42,5% H3PO4 (85%); Rest Wasser (in dunkler Flasche bei RT lagern)
Material & Methoden
120
Carrier – DNA Heringssperma DNA, gelöst in H2O (12 mg/ml), mit Ultraschall behandelt, phenolisiert und mit Chloroform versetzt; nach EtOH–Fällung in H2O aufgenommen (10 mg/ml); Vor der Verwendung 5 min bei 95°C denaturieren Chlorix-Lösung 5 ml DanKlorix (Desinfektionsmittel); 5 ml H2O 10 µl 50% (v/v) Tween 20 Coomassie – Färbelösung 25% Isopropanol; 10% Essigsäure; 0,05% Coomassie R 250 Digestion Buffer 0,03% Pectolyase Y23; 0,75% Cellulase YC Lösen in MCP DNA – Extraktionspuffer 200 mM Tris/HCl pH 7,5/8,5; 250 mM NaCl 25 mM EDTA; 0,5% SDS Einbettungslösung 15 ml Vorbereitungslösung; 1 ml Härter II Ethidiumbromid – Stammlösung 10 mg/ml, gelöst in H2O Fixierlösung 75% (v/v) Ethanol; 25% (v/v) Essigsäure Glyzinpuffer pH 2,2/2,8 5 mM Glyzin pH 2,2/2,8; 0,5 M NaCl GUS – Färbelösung 0,5 mM Kaluimhexacyanoferrat II 0,5 mM Kaliumhexacyanoferrat III 0,1% Triton x100; 10 mM EDTA; 100 mM NaPO4– Puffer pH 7,0; vor Gebrauch 1/80 Vol. X-Gluc 40 mg/ml; gelöst in DMSO; bei –20°C lagern Hefe – Aufbruchpuffer 250 mM Saccharose; 50 mM Tris/HCl pH 7,5; 1 mM MgCl2 K3-Medium 400 mM Saccharose; 1 MS-Salze + Gamborg Vitamine (Sigma M0404); 250 mg/ml Xylose; 460 mg/ml CaCl2 ; 25 µg/l Chloramphenicol LiAc (10x) 1 M Lithiumacetat pH 7,5 mit HAc einstellen Ligationspuffer (10x) 0,5 M Tris/HCl pH 7,5; 100 mM MgCl2; 100 mM DTT Lösung I (Alkalische Lyse) 50 mM Glukose ; 25 mM Tris/HCl pH 8,0; 10 mM EDTA pH 8,0; bei 4°C lagern Lösung II (Alkalische Lyse) 0,2 M NaOH; 1% SDS; frisch ansetzen Lösung III (Alkalische Lyse) 3 M NaAc pH 4,8; bei 4°C lagern Loading Dye (10x) 60% Glyzerin; 100 mM EDTA; 0,25% Bromphenol Blau; 0,25% Xylen Cyanol LP – Mix 40% Polyethylenglycol 400; 0,1 M Lithiumacetat; (für Hefetransformation) 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 1 mM EDTA Lysis Puffer 200 mM Sorbit; 10% Ficoll; 20 mM EDTA; 10 mM HEPES; pH 8 mit KOH einstellen vor Zugabe von Ficoll; Lagern bei 4°C ; Vor Verwendung : 100 ml mit 16 mg BSA und 100 µl DTT (1 M) mischen Lysozym 10 mg/ml in Tris/HCl pH 8,0
Material & Methoden
121
MaMg-Puffer 400 mM Sorbit; 15 mM MgCl2 ; 5 mM MES-KOH pH 5,6 MCP 0,5 M Sorbitol 500 mM Sorbitol; 1 mM CaCl2 ; 10 mM MES pH auf 5,6 – 6,0 mit KOH einstellen; bei 4°C lagern Methacrylat-Mix 75 % (v/v) Butylmethacrylat; 25 % (v/v) Methylmethacrylat; 0,5% Benzoinethylether; 10 mM DTT; vor Gebrauch jeweils mit Stickstoff gesättigt NaPO4–Puffer (50 mM, pH 5,0) 3,5 ml 1M Na2HPO4; 46,5 ml 1M NaH2PO4; ad 1 Liter H2O Na+ Ringer 115 mM NaCl; 2,5 mM KCl; 1,8 mM CaCl2; 1 mM NaHCO3; 1 mM MgCl2; 10 mM HEPES pH einstellen mit NaOH oder HCl 10x ND 96 96 mM NaCl; 2 mM KCl; 1 mM CaCl2 x 2 H2O; 1 mM MgCl2 x 6 H2O; 5 mM HEPES; pH 7,4 einstellen, sterilfiltrieren, 4°C, vor Gebrauch 1 :10 verdünnen, Osmolarität auf 220 mOsm einstellen und Pen/Strep 1:100 zugeben Neutralisierungslösung 1 M Tris/HCl pH 8; 1,5 M NaCl PEG-CMS-Puffer 400 mM Sorbit; 100 mM Ca(NO3)2 ; 40% PEG 4000 pH 8,0 mit KOH einstellen Percoll pH 6 100% 500 mM Sorbit; 1 mM CaCl2; 20 mM MES in Percoll lösen Percoll pH 7,2 100% 500 mM Sorbit; 20 mM HEPES; lösen in Percoll lagern bei 4°C Percoll 25% 12,5 ml Percoll pH 7,2 100% 37,5 ml Sorbitol for Barley pH – Sprungpuffer 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 1 mM EDTA; 1 mM MgCl2 Pollenkeimungsmedium 15% Saccharose; 0,4 mM CaCl2; 0,4 mM H3BO3 0,8% (w/v) Agar Puffer PII 50 mM KaPO4- Puffer pH 6,3; 20% Glyzerin; 1 mM EDTA 2Pi (Proteaseinhibitor) 100 mM PMSF; 250 mM p-amino-Benzamidin gelöst in DMSO Propidiumiodid-Färbelösung 5 mg/ml Propidiumiodid in H2O, gesättigte Lösung im Überstand RNA Gelpuffer (10x) 200 mM MOPS (freie Säure); 50 mM Natriumacetat; 10 mM EDTA pH 8,0; pH 7,0 mit NaOH einstellen, sterilfiltrieren und lichtgeschützt aufbewahren RNA-Loading buffer (5x) 80 µl 0,5 M EDTA pH 8,0; 720 µl 37% Formaldehyd; 2 ml Glyzerin; 3,08 ml Formamid; 4 ml 10x RNA- Gelpuffer; 100 µl DEPC- H2O; Bromphenolblau Running Buffer (5x) 0,2 M MOPS pH 7,0; 50 mM NaOAc; 5 mM EDTA pH 8,0 Sammelgelpuffer 0,139 M Tris/HCl pH 6,8; 0,11% SDS; bei 4°C lagern
Material & Methoden
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SDS Laufpuffer 25 mM Tris; 0,1% SDS; 192 mM Glycin SDS Probenpuffer (4 x) 250 mM Tris/HCl pH 6,8; 20% Glyzerin 20% β-Mercaptoethanol; 8% SDS; 0,4% Bromphenolblau Sorbitol for Barley 400 mM Sorbit; 30 mM KCl; 20 mM HEPES; pH 7,2 mit KOH einstellen; vor Verwendung: 100 ml mit 100 mg BSA und 100 µl DTT (1M) mischen SSC (20x) 176,3 g NaCl/l; 88,2 g Natriumcitrat/l STET – Puffer 50 mM Tris/HCl pH 8,0 ; 50 mM EDTA; 8% Saccharose 5% Triton X-100 TAE – Puffer (50x) 2 M Tris/Acetat; 0,05 M EDTA TB – Puffer 10 mM Pipes; 55 mM MnCl2; 15 mM CaCl2; 250 mM KCl; alles außer MnCl2 mischen, pH mit HCl auf 6,7 einstellen, MnCl2 zugeben, sterilfiltrieren TBS (10x) 0,5 M Tris/HCl pH 7,5; 1,5 M NaCl TE – Puffer 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 1 mM EDTA TE/RNase 10 mM Tris/HCl pH 7,5; 1 mM EDTA; RNase A (100 µg/ml); bei 4°C lagern Trenngelpuffer (3 x) 1,126 M Tris/HCl pH 8,8; 0,3% SDS; bei 4°C lagern Vorbereitungslösung 100 ml Basislösung Technovit 7100; 1 g Härter W5-Puffer 154 mM NaCl; 125 mM CaCl2; 5 mM KCl; 5 mM Glukose; 1,5 mM MES-KOH pH 5,6 Western Transfer Puffer 20 mM Tris; 150 mM Glycin; 0,02% SDS; 20% Methanol X-Gluc Stammlösung (80x) 40 mg/ml X-Gluc gelöst in DMF Antibiotika zur Selektion transgener Organismen
Organismus Antibiotika Konzentration Gentamycin 25 µg/ml Kanamycin 50 µg/ml
Agrobakterium tumefaciens
Rifampicin 50 µg/ml Ampicillin 50 µg/ml Escherichia coli Kanamycin 50 µg/ml Kanamycin 50 µg/ml Arabidopsis thaliana Basta 12 µg/ml Penicillin 10 000 U/ml Xenopus laevis Oozyten Streptomycin 10 000 U/ml
Tabelle 5.18 : Antibiotika
Material & Methoden
123
5.1.5 Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterial
• Adhäsionsobjektträger Histobond (Marienfeld, Lauda-Königshofen) • Agar–Agar (Difco Laboratories, Detroit/USA) • Agarose, (Invitrogen, UK) • Aminosäuren (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Ammoniumpersulfat (APS) (Roth, Karsruhe) • Ampicillin (Roth, Karlsruhe) • BSA (Albumin Fraktion V),(Biolabs, Schwalbach) • Bacto®-Trypton (DIFCO LABORATORIES, Detroit) • Bacto® - Yeast Extract (DIFCO LABORATORIES, Detroit) • Big Dye Terminator RP Sequenziermix (Perkin Elmer, Überlingen) • BASTA Pflanzenschutzmittel (Hoechst Schering AgrEvo GmbH) • BSA (albumin Fraktion V (Biolabs, Schwalbach) • Calciumhypochlorid (Roth, Karlsruhe) • CCCP (Carbinylcyanid–m–Chloropphenylhydrazon), (SIGMA–ALDRICH, Deisenhofen) • Chemikalien zur Herstellung von Medien (Difco Laboratories, Detroit/USA) • Coomassie Brilliant Blue G-250 (Serva, Heidelberg) • DanKlorix, Desinfektionsmittel (Colgate-Palmolive, Hamburg) • DEPC (Diethylpyrocarbonat), (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • DMF (N, N-Dimethylformamid) (SiGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • DMSO (Dimethylsufoxid) (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • DNP (2, 4-Dinitrophenol), (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • DNase I, RNase-frei (Promega, Madison, USA) • dNTPs (Desoxynucleotidtriphosphate) (La Roche, Mannheim) • DTT (Dithiothreit) (Roth, Karlsruhe) • ExTaq Polymerase (Takara Shuzo co., Ltd., Shiga/Japan) • Faltenfilter (Ges. f. Laborbedarf mbH, Würzburg) • Filter-Tips (Roth, Karlsruhe) • FITC-Guard (Testoc Inc., Chicago/USA) • Fleischextrakt (Difco, Laboratories, Detroit/USA) • Fruktose U-14C – markiert (American Radiolabeled Chemicals, USA) • Galaktose U-14C – markiert (Amersham, USA) • Gentamycin (DUCHEFA, Haarlem, Niederlande) • Glasfritte (Schott, Mainz) • Glaskappilaren 3.5“ Drummond (Drummond Scientific, USA) • Glasperlen 0,5 mm (Braun, Melsungen) • Glukose 14C – markiert (Amersham, USA) • Glyzerin (Roth, Karlsruhe) • Goldpuder (Chempur, Karlsruhe) • IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalaktosid) (Roth, Karlsruhe) • Kanamycin (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Kollagenase (CLS Worthington, UK) • Lambda DNA (dam-, dcm-) (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) • Ligase, T4 DNA – Ligase (Roche, Mannheim) • Lumi-Light Western Blotting Substrat (Roche, Mannheim) • Lysozym (Roche, Mannheim) • Magermilchpulver Glücksklee (Nestle, Neustadt) • Makrotiterplatten (Greiner, Nürtingen) • Mannit U-14C – markiert (American Radiolabeled Chemicals, USA) • Membranfilter ME 27 (0,8 µm), (Schleicher & Schuell, Dassel) • Mikrotiterplatten (Greiner, Nürtingen) • Mikroskop Glaswaren (Roth, Karlsruhe) • mMESSAGE mMACHINE RNA Transkriptionskit (Ambion, Austin, TX) • MES (2-(N-Morpholino-)ethansulfonsäure) (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • MOPS (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • MSMO (Murashige & Skoog Minimal Organics Media) (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • myo–Inosit U-3H–markiert (American Radiolabeled Chemicals, USA)
Material & Methoden
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• NEB–Puffersystem für Restriktionsverdau (Biolabs, Schwalbach) • NEB-Taq-DNA-Polymerase (Biolabs, Schwalbach) • Nitrocellulose-Membranen (Sartorius, Göttingen) • NUCLEOBOND®- Plasmidpräparationskit AX 100 (Machery-Nagel, Düren) • NUCLEOBOND®- Säulen AX 100-Kit (Machery-Nagel, Düren) • Oligonukleotide (Interactiva, Ulm und Biomers, Ulm) • Oligo-dT-Primer (GIBCO BRL, Karlsruhe) • Penicillin (GIBCO BRL, Karlsruhe) • PCMBS (4-Chloromercuri-benolsulfonsäure) (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • PCR-Reaktionsgefäße ultradünn (Biolabs, Schwalbach) • PEG 4000 (Polyethylenglykol), (Fluka, Buchs/Schweiz) • Percoll (Pharmacia Biotech, Cambridge) • pCR®- Blunt II – TOPO® (Invitrogen, UK) • pGEM®-T-Easy Vector Kit (Promega, Madison/USA) • Phosphatase, alkalische (Roche, Mannheim) • Phytagar (Duchefa, Haarlem, Niederlande) • PMSF (Roth, Karlsruhe) • Ponceau S (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • ProLong Antifade Kit (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) • Propidiumiodid (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Proteinase K (Roche, Mannheim) • Proteinstandard Roti®-Mark (Roth, Karlsruhe) • Proteinstandard SeeBlue® Plus2 Pre-Stained Standard (Invitrogen, UK) • Pwo DNA Polymerase (Roche, Mannheim) • QIAQuick Gel Extraktion Kit (Qiagen, Hilden) • QIA Quick PCR Purification Kit (Qiagen, Hilden) • QIAquick RNeasy Plant RNA Extraction Kit (Qiagen, Hilden) • Restriktionsenzyme (Biolabs, Schwalbach) • Reverse Transkriptase, M-MuLV Reverse Transkriptase (MBI Fermentas, St. Leon-Rot) • Rifampicin (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Rinderextrakt, beef extract (Difco, Laboratories, Detroit) • RNase A (Roth, Karlsruhe) • RNase Inhibitor (MBI Fermentas, St Leon-Rot) • Roti®-Phenol (Roth, Karlsruhe) • Röntgenfilm Kodak X-OMAT AR (Integra Biosciences, Fernwald) • Saccharose U-14C–markiert (Amersham, USA) • Sandpapier K240 (oder bei Obi, Erlangen) • SDS (Serva, Heidelberg) • Sequenzier Mix (Perkin Elmer, Überlingen) • Silwet (Lehle Seeds, Round Rock, USA) • Sorbit U-14C–markiert (American Radiolabeled Chemicals, USA) • Spermidin (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Spritzenfilter (Roth, Karlsruhe) • Streptomycin (GIBCO BRL, Karlsruhe) • Superscript II Reverse Transcriptase (GIBCO BRL, Karlsruhe) • Szintillationscocktail Lumisafe™Plus (Lumac, Groningen) • T4 DNA Ligase (Roche, Mannheim) • Taq–DNA Polymerase (Qbiogene, Heidelberg, Biolabs, Schwalbach) • Technovit 7100 (Heraeus Kulzer GmbH, Werheim) • TEMED (N,N,N´,N´-Tetrametrylendiamin) (Roth, Karlsruhe) • Triton X-100 (Serva, Heidelberg) • TRIZOL® Reagent (Invitrogen life technologies, UK) • Tween 20 (Sigma-Aldrich, Deisenhofen) • Whatmanfilter (GLW, Würzburg) • X-Gal, 5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-β-D-galactopyranosid (Roth, Karlsruhe) • X-Gluc, 5-Brom-4-Chlor-3-indolyl-β-D-glucuronid (Roth, Karlsruhe) • Xylit U-3H–markiert (American Radiolabeled Chemicals, USA) • Xylose U-14C–markiert (Amersham, USA)
Material & Methoden
125
Nicht speziell genannte Chemikalien wurden von Roth, Karlsruhe bezogen
5.1.6 Antikörper
• Anti-Kaninchen IgG Peroxidase-Konjugat (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Anti-Meerschweinchen IgG Peroxidase-Konjugat (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Anti-Kaninchen IgG FITC-Konjugat (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) • Anti-Meerschweinchen IgG FITC-Konjugat (SIGMA-ALDRICH, Deisenhofen) AtPLT-spezifische Antikörper (Pineda Antikörper-Service, Berlin) • Kaninchen-Anti Peptid PLT1-4/1-7-Antikörper (NH2-CKVLDKTSNTKEEAISR-CONH2; • NH2-CSYTANKKNNSMSKDNEV-CONH2) • Meerschwein-Anti Peptid PLT1-4/1-7-Antikörper (NH2-CKVLDKTSNTKEEAISR-CONH2); • NH2-CSYTANKKNNSMSKDNEV-CONH2) • Kaninchen-Anti Peptid PLT4Cterm-Antikörper (NH2-CERKDGEVELGDAERLVRKEQEF-CONH2) • Meerschwein-Anti Peptid PLT4Cterm-Antikörper (NH2-CERKDGEVELGDAERLVRKEQEF-CONH2) • Kaninchen-Anti Peptid PLT5Cterm-Antikörper (NH2-CEIGSNKQWKEGDTQSS-CONH2) • Meerschwein-Anti Peptid PLT5Cterm-Antikörper (NH2-CEIGSNKQWKEGDTQSS -CONH2)
5.1.7 Geräte
• Absaugbank (Hölz, Wörth) • CPM2 Microforge (ALA Scientific, Japan) • Digitalkamera Nikon COOLPIX 995 (Nikon Corporation, Tokio/Japan) • General Valve Picospritzer III (Parker Instrumentation, USA) • Kaltlichquelle KL1500 LCD (Schott, Mainz) • Konfokales Laserscanningmikroskop Leica TCS SP2 (Leica, Microsystems, Bensheim) • Kühlzentrifuge Avanti J-25 (Beckman Instruments, Palo Alto/USA) • Mikroskop CCD-Kamera Color View II (Soft Imaging System, Münster) • Mikroskop mit Fluoreszenzeinrichtung, Axioskop (Zeiss, Jena) • Narashige Puller (Narashige, Tokyo, Japan) • PCR-Maschine T-Gradient (Biometra, Göttingen) • Photodokumentationssystem IP-910 (Vilber Lourmat, Torcy/Frankreich) • RotorGene 2000 (Corbett Research, Sydney, Australien) • Sequencer ABI PRISM™ 310, Genetic analyzer (Perkin Elmer, Überlingen) • SDS-PAGE Apparatur Mini-Protean II (Biorad, München) • Spektralphotometer Ultrospec 3000 (Pharmacia Biotech, Cambridge) • Stereomikroskop SMZ800 (Nikon, Japan) • Stereomikroskop Stemi SV 11 (Zeiss, Jena) • Szintillationszähler TRI-CARB 2100 TR (Packard®, Meriden) • Thermocycler T-Gradient (Biometra, Göttingen) • Thermomixer compact (Eppendorf, Hamburg) • Thermoschrank Function Line (Heraeus Instruments, Hanau) • Tischzentrifuge 5417C (Eppendorf, Hamburg) • Ultramikrotom Ultracut R (Leica, Bensheim) • Ultraschallbad Sonorex RK100 (Bandelin electronic, Berlin) • Ultrazentrifuge L 8-60 M (Beckman, München) • Videosystem für Mikroskop und Stereolupe (Zeiss, Jena) • Western-Blot Apparatur (Biorad, München) • Zellaufbruchgerät (Edmund Bühler, Johanna Otto GmbH, Bodelshausen)
Material & Methoden
126
5.1.8 Software
• Adobe Photoshop cs 8.0 (Adobe Systems, San Jose/USA) • analysis Doku 3.2 (Soft Imaging System, Münster) • Corel Graphics Suite 11 (Corel Corporation, Ottawa/Kanada) • KS200 Imaging Software (Kontron Elektronik, München) • Leica Confocal Software, 2.5 (Leica Microsystems, Bensheim) • Microsoft Office 2000 (Microsoft Corporation, Redmond/USA) • Vector NTI 5 (InforMax, Frederick/USA)
Ansonsten wurde die Standardausrüstung für mikrobiologische Laboratorien verwendet.
5.1.9 Anzuchtmedien
5.1.9.1 Anzuchtmedien für Bakterien LB-Medium, TB-Medium, SOB–Medium für Agrobakterien: YEP–Medium, YEB–Medium (siehe Meyer, 2003)
5.1.9.2 Anzuchtmedien für Hefen CAA–Medium (+ C-Quelle), YPD–Medium (siehe Meyer, 2003)
5.1.9.3 Substrat zur Anzucht von Pflanzen Bodensubstrat, MS–Medium und MS Medium für particle bombardement (siehe Feuerstein, 2006).
5.2 Methoden
5.2.1 Methoden zur Anzucht der verwendeten Organismen
5.2.1.1 Anzucht von Bakterien und Hefen Escherichia coli DH5α wurde bei 37°C in TB– bzw. LB–Medium kultiviert. Für die Herstellung von kompetenten Zellen wurde SOB–Medium verwendet. Agrobakterien und Hefen wuchsen bei 29°C. Zur Kultivierung von Agrobakterien wurde YEB bzw. YEP–Medium verwendet. Hefen wurden in CAA bzw. YPD–Medium angezogen. Bei Anzucht in Flüssigmedium wurden die Kulturgefäße bei entsprechender Temperatur geschüttelt oder gedreht, um eine optimale Durchmischung und Belüftung zu gewährleisten. Zur Selektion transgener Organismen wurden je nach Plasmid die entsprechenden Antibiotika in folgenden Konzentrationen den Medien zugesetzt: Ampicillin 50 µg/ml Kanamycin 50 µg/ml Gentamycin 25 µg/ml Rifampicin 50 µg/ml 5.2.1.2 Anzucht von Arabidopsis thaliana Arabidopsis thaliana Samen wurden auf angefeuchtetem Bodensubstrat ausgesät (siehe Feuerstein, 2005). Geerntete Samen wurden in Papiertüten im Dunkeln gelagert. Flüssigsterilisation mit Klorix (siehe Feuerstein, 2005); Selektion transgener Pflanzen (siehe Feuerstein, 2005).
Material & Methoden
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5.2.2 Allgemeine molekularbiologische Methoden
Standardmethoden wie Restriktionsverdaus, Dephosphorylierung von DNA durch Alkalische Phosphatase, Agarose-Gelelektrophorese, Ligationen etc. wurden nach Herstellerprotokollen für die entsprechenden Enzyme oder Kits oder nach Anleitungen aus dem Handbuch „Molecular Cloning, A Laboratory Manual“ von Sambrook et al., 1989 durchgeführt. 5.2.2.1 Herstellung von Dauerkulturen (siehe Meyer, 2003) 5.2.2.2 Isolierung von DNA aus Agarosegelen (QIAquick Spin Handbook) Um DNA aus Agarosegelen zu isolieren, wurde das „QIAquick Gel Extraction Kit“ zu Hilfe genommen. 5.2.2.3 Bestimmung der DNA- bzw. RNA- Konzentration (siehe Schneidereit, 2005). 5.2.2.4 Amplifizierung von DNA Fragmenten mittels PCR (siehe Volke, 2005) 5.2.2.5 DNA Reinigung und Fällung DNA wurde über QIAquick–Säulchen der Firma Qiagen gemäß dem „PCR Purification Kit Protocol“ aufgereinigt und nach Sambrook et al., 1989 gefällt. 5.2.2.6 DNA Sequenzanalyse Die DNA Sequenzierung erfolgte nach Herstellerprotokoll des Gerätes ABI PRISM 310, Perkin Elmer. Die Reaktion beruht auf der Kettenabbruchmethode durch den Einbau von fluoreszenzmarkierten Didesoxynukleotiden (Sanger et al.1977). Die Auswertung der Sequenzen erfolgte mit ABI PRISM 310 Collection and Sequencing Analysis 3.0 sowie mit Vector NTI-Suite InforMax, Bethesda, USA 5.2.2.7 Klonierung von PCR–Produkten mit dem Zero Blunt® TOPO® PCR Cloning Kit PCR–Produkte, die mit einem PWO (proof reading polymerase)/Taq–Polymerase Gemisch amplifiziert wurden, wurden direkt in den pCR ®-Blunt II-TOPO® (Invitrogen) nach Herstellerprotokoll einkloniert. 5.2.2.8 Klonierung von PCR–Produkten mit dem pGEMTM –T Easy Kit PCR Produkte, die mit Polymerasen amplifiziert wurden, die 3’-Einzel-A-Überhänge produzieren, wurden nach Angaben des Herstellers in pGEM-T Easy Vector (Promega) ligiert. 5.2.2.9 Herstellung der RNAi Konstrukte über Oligo Extension Bei der Oligoextension enthalten die Primer mindestens je 20 bp kodierende Sequenz beider zu verbindenden DNA Fragmente. Die so genannten „Endprimer“ enthalten anstatt der komplementären Sequenzen der angrenzenden DNA Bereiche nur Schnittstellen für den Vektor pHANNIBAL. In einer ersten PCR wurden die einzelnen DNA Fragmente amplifiziert. Diese Reaktion wurde mit einer Proof Reading Polymerase durchgeführt. Alle vier PCR Produkte wurden über Säulchen gereinigt und anschließend vereinigt, wobei jedes Fragment zu 20 ng in der Gesamtmischung vertreten war. Mit dieser Gesamtmischung aus allen Fragmenten wurde nun die zweite PCR mit den Endprimern 1 und 8 durchgeführt. Zur korrekten Anlagerung der einzelnen Fragmente musste man in diesem Schritt einen Präzyklus durchführen: dieser besteht aus einer 4-minütigen Annealingzeit bei 68°C und einer 4-minütigen Elongationszeit bei 68 °C. Anschließend wurden 25 PCR-Zyklen durchgeführt bei denen die Zeit auf 30 Sekunden verkürzt wurde. Das in den pCR-BluntII-TOPO-Vektor klonierte und darin sequenzierte wurde anschließend in den Vektor pHANNIBAL umkloniert: im ersten Schritt wurde das Insert in antisense Richtung in den Vektor ligiert. Dazu wurde das Fusionsnukleotid zuerst mit den Enzymen HindIII und XbaI verdaut und in pHANNIBAL ligiert (die sogenannten „innenliegenden“ Enzyme). Im zweiten Schritt wurde das durch PCR erhaltene Fusionsnukleotid mit XhoI und KpnI verdaut („außenliegende“ Enzyme) und anschließend ligiert, so dass nach dieser Ligation dasselbe Insert in sense Orientierung in pHANNIBAL inserierte. Das komplette Konstrukt wurde über SacI und SdaI aus pHANNIBAL herausgeschnitten und in den Pflanzentransformationsvektor pAF16 ligiert. Anschließend wurde das Konstrukt in Agrobakterien Stamm GV3101 eingebracht und Arabidopsis thaliana transformiert.
5.2.3 Methoden zur Arbeit mit Bakterien
5.2.3.1 Herstellung kompetenter Bakterien Die Herstellung kompetenter E.coli erfolgte nach der SEM–Methode (Inoue, et al., 1990);
Material & Methoden
128
Die Herstellung kompetenter Agrobakterien nach Höfgen und Willmitzer, 1988; (siehe Feuerstein, 2006). 5.2.3.2 Transformation von Bakterien Transformation von Escherichia coli, Agrobakterien (siehe Feuerstein, 2006) 5.2.3.3 Plasmidisolierung aus Bakterien STET–Miniprep-Plasmidisolierung aus E.coli nach Holmes und Quigley, 1981. Alternativ wurde eine modifizierte Alkalische Lyse nach Sambrook et al., 1989 verwendet. Größere Mengen Plasmid–DNA wurden unter Verwendung der NUCLEOBOND®-Säulen AX 100 (Machery–Nagel) gewonnen und Herstellerangaben verfahren.
5.2.4 Methoden zur Arbeit mit Hefen
5.2.4.1 Hefetransformation Hefen wurden nach einer modifizierten Lithiumacetat-Methode transformiert (Soni et al., 1993). (siehe Feuerstein, 2006). 5.2.4.2 Hefeaufnahmemessungen Der jeweilige AtPLT-exprimierende Hefestamm sowie ein Kontrollstamm wurde ÜN in CAA–Medium (+ C-Quelle) bis zu einer OD600 von 1 angezogen. Die Zellsuspension wurde anschließend in 50 ml Falcon Tubes aufgeteilt und bei 3.500 rpm für 5 min zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml 50 mM Na–PO4–Puffer pH 5,0 aufgenommen. Es folgte eine zweite Zentrifugation bei 3.500 rpm für 5 min. Die pelletierten Zellen wurden in Na–PO4–Puffer pH 5,0 so verdünnt, dass 20 OD Zellen pro ml vorhanden waren. Die Zellen wurden bis zur Messung auf Eis gelagert und mikroskopisch auf Kontaminationen überprüft. Vor den Aufnahmemessungen wurden folgende Vorbereitungen getroffen: Die Szintgläschen wurden beschriftet und mit je 4 ml Szintillationscocktail befüllt. Der 29°C Wasserschüttler wurde vorgewärmt. Die Membranfilter wurden in destilliertem Wasser eingeweicht. Die eingeweichten Filter wurden auf die entsprechenden Vorrichtungen der Absaugbank gelegt, die Kamine wurden aufgesetzt und zu 2/3 mit Wasser gefüllt. Für die Messung wurden 500 µl Zellen in 25 ml Erlenmeyerkolben gegeben und für ca. 3 min im Wasserschüttler vorgewärmt. Anschließend wurde die entsprechende Menge radioaktiver Zucker/Zuckeralkohole zupipettiert und sofort ein Aliquot von 50 µl entnommen (Zeitpunkt 0 min) und in einen Kamin der Absaugbank überführt. Die Flüssigkeit wurde abgesaugt, der Filter wurde einmal mit Wasser gewaschen und mit einer Pinzette in das vorbereitete Szintgläschen gegeben, sodass der Filter komplett in den Szinzillationscocktail tauchte. Die Messung verlief über 10 min, wobei alle 2 min ein 50 µl Aliquot entnommen wurde. Zur Messung der Gesamtradioaktivität (innerhalb und außerhalb der Zellen) wurden 50 µl aus dem Erlenmeyerkolben direkt in ein Szintgläschen pipettiert. Für die Bestimmung des Einflusses von Kompetitoren wurden die Zellen 1 min vor Zugabe der Radioaktivität mit dem jeweiligen Kompetitor inkubiert. Hemmstoffe wurden ebenfalls 1 min vor Messbeginn zugegeben. Die Messung erfolgte im Szinzillationszähler TRI–CARB 2100 TR. Die Auswertung der Ergebnisse wurde folgendermaßen durchgeführt: Zunächst wurde die Molarität des zugegebenen radioaktiven Substrates innerhalb des 50 µl Aliquots berechnet. Wurde z.B. das Substrat in einer Enkonzentration von 0,1 mM zugegeben, so enthielt das 50 µl Zellaliquot 5 nmol des Substrates. Diese Substratmenge entspricht dem Wert der Gesamtradioaktivität. Nun wurde die in die Zellen aufgenommene Substratmenge für die einzelnen Zeitpunkte nach folgender Gleichung ermittelt: Menge des Substrates in 50 µl Aliquot = aufgenommene Substratmenge zum Zeitpunkt X Wert der Gesamtradioaktivität zum Zeitpunkt X gemessene Radioaktivität Das Verhältnis der Substratmenge in dem 50 µl Aliquot zu der gemessenen Gesamtradioaktivität entspricht also dem Verhältnis der zum Zeitpunkt X aufgenommenen Substratmenge zu der zum Zeitpunkt X gemessenen Radioaktivität. Anschließend wurde die so ausgerechnete Substratmenge auf die im Aliquot enthaltene Zellmenge (= µl packed cells) bezogen. Hierfür wurden 500 µl Zellen in einem Hämatokritröhrchen abzentrifugiert und die µl packed cells direkt abgelesen. So konnte der
Material & Methoden
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Zellgehalt von 1,4 µl packed cells in dem 50 µl Aliquot ermittelt und die Aufnahme zum Zeitpunkt x in nmol/µl p.c. (µl packes cells) ausgedrückt werden. 1 µl packed cells entspricht einem Frischgewicht von 1 mg (x 1000 = Aufnahme in nmol/g FG). . 5.2.4.3 Plasmamembranisolierung aus Saccharomyces cerevisiae Plamamembranisolierungen aus Hefe wurden nach einem Verfahren von Dufour et al., 1988 durchgeführt (siehe Feuerstein, 2006).
5.2.5 Methoden zur Arbeit an Arabidopsis thaliana
5.2.5.1 Isolierung genomischer DNA aus Arabidopsis thaliana (siehe Schneidereit, 2005) 5.2.5.2 RNA Isolierung aus Arabidopsis thaliana Bei Arbeiten mit RNA wurde stets darauf geachtet, RNase-frei zu arbeiten und die üblichen Maßnahmen ergriffen, um eine höchstmögliche RNase-Freiheit zu gewährleisten. Isolierung (gewebsspezifischer) RNA mit TRIZOL® und RNA-Gel (Schneidereit, 2005). Für die Affymetrix Chip Analysen wurde RNA mit dem „Qiagen Plant RNeasy Kit“ gewonnen (siehe Barth, 2005). 5.2.5.3 Reverse Transkriptase PCR (RT – PCR) Für das Umschreiben von mRNA in cDNA wurde der RevertAidTM H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit von MBI Fermentas (St.Leon-Roth) verwendet und nach Herstellerprotokoll verfahren. 5.2.5.4 Stabile Transformation von Arabidopsis thaliana Die Transformation erfolgte nach dem Protokoll von Clough und Bent (1998; siehe Feuerstein, 2006) 5.2.5.5 Transiente Transformation von Pflanzen 5.2.5.5.1 Transiente Transformation von Pflanzen mit der Particle Inflow Gun Hierfür wurde ein Fusionsprodukt aus der cDNA des entsprechenden Gens und der cDNA von GFP hergestellt. Zunächst wurde die cDNA von AtPLT1-5 amplifiziert, wobei über die Primer die benötigten Restriktionsschnittstellen eingeführt wurden. Weiterhin wurde das Stoppkodon des Gens nicht mitamplifiziert, um bei der transienten Expression zu gewährleisten, dass die transformierten Zellen ein Fusionsprotein aus GFP und AtPLT1-5 herstellen. Ausgangsvektor für die anschließende Klonierung war der Vektor pSO35e (siehe Anhang). Die cDNA des Gens wurde zwischen den starken viralen 35 S Promotor und der cDNA von GFP kloniert und anschließend mittels Particle Bombardement in Pflanzen eingebracht (siehe Niedermeier, 2005). 5.2.5.5.2 Transiente Transformation von Protoplasten Zur Isolierung der Protoplasten aus Blättern von col wt Pflanzen wurde nach dem Protokoll für die Isolierung pflanzlicher Vakuolen bis zur Gewinnung der Protoplasten verfahren. Zunächst wurden Blätter von Arabidopsis thaliana col wt Pflanzen (Rosettenstadium) gesammelt. Die Unterseite der Blätter wurde mit Sandpapier (K 240) gerieben, bis die Oberfläche nass wurde. Eine Glaspetrischale wurde anschließend mit MCP (1:2 in Wasser verdünnt und mit 1 mg/ml BSA versetzt) befüllt, sodass der Boden der Schale vollständig bedeckt war. Die aufgeriebenen Blätter wurden mit der nassen Seite in die MCP-Lösung überführt, wobei die Petrischale komplett mit Blättern ausgekleidet wurde. Danach wurde die überschüssige MCP-Lösung mit der Wasserstrahlpumpe entfernt. Nach Zugabe von 10 ml Digestion Buffer wurde die Petrischale leicht geschwenkt, sodass die Enzymlösung auf die Unterseite der Blätter verteilt wurde. Die Petrischale wurde für 1,5 h bei 30 °C inkubiert. Durch Schwenken der Petrischale wurden die Protoplasten aus der Epidermis der Blätter gelöst. Anschließend wurde die Enzymlösung, die die aus der Blattepidermis isolierten Protoplasten enthielt, abgezogen und in ein 50 ml Falcon Tube überführt. Die Petrischale wurde mit 5 bis 10 ml MCP gewaschen, um die in der Schale zurückgelassenen Protoplasten aufzunehmen. Zu den gesammelten Protoplasten wurde 2 ml Percoll pH 6 100% zugegeben, wobei die Percoll-Lösung auf den Boden des Falcon-Tubes pipettiert wurde, sodass sich eine Percoll-Schicht formte. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 1500 rpm für 8 min bei RT ohne Bremse. Der Überstand wurde bis ca. 2 cm oberhalb der Protoplasten abgezogen und die
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Protoplastenschicht mit dem darunterliegenden Percoll-Kissen vermischt. Nach Zugabe von Percoll pH 6 100%, so dass die Endkonzentration der Percoll-Lösung 35 – 40% betrug, wurde die Protoplastensuspension mit 7,5 ml Percoll 25% und anschließend mit 5 ml Sorbitol for Barley vorsichtig überschichtet. Bei diesem Schritt wurde darauf geachtet, dass sich die einzelnen Lösungen nicht vermischten. Der Ansatz wurde bei 1200 rpm für 8 min zentrifugiert. Die gereinigten Protoplasten, die sich nach der Zentrifugation zwischen der Sorbitol for Barley-Lösung und der 25% igen Percoll-Lösung befanden, wurden entnommen. Anschließend wurden die Protoplasten bei 40 g für 5 min zentrifugiert und in MaMG-Puffer aufgenommen. Nachdem unter dem Mikroskop die Zellkonzentration in der Protoplastenlösung bestimmt wurde, wurde die Potoplastensuspension auf eine Dichte von 5000 Zellen/µl eingestellt. Pro Transformationsansatz wurden 300 µl Protoplastensuspension (5000 Zellen/µl) in ein Sarstedt-Röhrchen überführt und mit 50 µg des jeweiligen DNA Konstrukts versetzt. Nach Zugabe von 300 µl PEG-CMS-Puffer wurde der Ansatz solange vorsichtig gemischt bis die verklumpten Protoplasten resuspendiert waren. Der Ansatz wurde 30 min bei RT inkubiert. Anschließend wurde in vier Schritten mit 5-minütigen Abstand 600 µl W5-Puffer, 1 ml W5-Puffer, 2 ml W5-Puffer und zuletzt 4 ml W5-Puffer zupipettiert. Es folgte ein Zentrifugationsschritt bei 60 g für 5 min. Die sedimentierten Protoplasten wurden in 2 ml 400 mM Sorbit-Lösung und 500 µl W5-Puffer aufgenommen und wie zuvor sedimentiert. Das Protoplastenpellet wurde in 3 ml K3-Medium resuspendiert und in kleinen Petrischalen ÜN bei 22 °C inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Protoplasten unter dem Mikroskop betrachtet und am KLSM fotographiert. Die Transformationseffizienz lag für alle Konstrukte zwischen 40% und 70%.
5.2.6 Methoden zur Arbeit mit Proteinen
5.2.6.1 Proteinbestimmung nach Bradford (Sambrook et al., 1989) 5.2.6.2 SDS-PAGE Polyacrylamid-Gelektrophorese zur Auftrennung von Proteinen nach Laemmli (1970) Coomassie Blue Färbung siehe Feuerstein, 2006. 5.2.6.3 Western Blot (siehe Meyer, 2003) 5.2.6.4 Reinigung von Antiseren Die Affinitätsreinigung der polyklonalen αAtPLT-Peptidantikörper gegen den N-Terminus der jeweiligen AtPLT Proteine aus Kaninchen und Meerschweinchen wurde von Herrn Dr. Pineda in Berlin durchgeführt. Zur Anreicherung des αAt-PLT5 Peptidantikörpers wurde das Kaninchen Antiserum gegen Plasmamembranen der AtPLT5-exprimierenden Hefe YKY1 gereinigt (siehe Meyer, 2003). 5.2.6.5 Immunolokalisierung (siehe Feuerstein, 2006).
5.2.7 Mikroskopische Techniken
5.2.7.1 Untersuchung transgener Promotor-GFP Pflanzen (siehe Schneidereit, 2005). 5.2.7.2 GUS Färbung transgener Promotor-GUS Pflanzen (siehe Schneidereit, 2005) 5.2.7.3 Einbettung von Pflanzengewebe oder Hefen in Methacrylat und Herstellung von Dünnschnitten Pflanzengewebe wurden nach Stadler und Sauer (1996) eingebettet; Hefen nach Meyer, 2003. 5.2.7.4 Einbettung von Pflanzengewebe in Technovit Quergeschnittene Stängel (2-10 mm) transgener AtPLT1- sowie AtPLT2-Promotor-GUS Pflanzen wurden wie in 5.2.7.2 beschrieben mit X-Gluc-haltiger Lösung behandelt und bei 37°C inkubiert. Nach diesem Inkubationsschritt wurde zur Fixierung die Färbelösung durch 2,5%ige Glutaraldehylösung ersetzt. Nach einer Inkubation von 2 h bei RT wurde die Glutaraldehydlösung verworfen und die Gewebestücke drei Mal mit destilliertem Wasser gewaschen. Zur Entfärbung wurden die Proben für 48 h bei 37°C inkubiert. Um die Gewebeproben zu entwässern wurden diese zunächst in 90% EtOH für 30 min und anschließend in 100% EtOH für 2 h (nach 1 h gewechselt) stehen gelassen. Es folgte
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eine 2 stündige Infiltration der Proben in einer Lösung bestehend aus 100% EtOH und Vorbereitungslösung (Verhältnis 1:1). Danach wurden die Proben in reiner Vorbereitungslösung für 12 h inkubiert. Für die Einbettung wurde die Einbettungslösung in PCR Cups vorgelegt, die Gewebestücke überführt und ausgerichtet. Nach 4 h bei RT war der in der Einbettungslösung enthaltene Kunststoff auspolymerisiert. Mit der Rasierklinge konnte man nun die eingebetteten Gewebestücke in hauchdünne Scheiben quer schneiden und unter dem Mikroskop betrachten. 5.2.7.5 Auskeimung von Pollen auf Pollenkeimungsmedium Warmes Pollenkeimungsmedium (10 mg Low Melting Agar + 1 ml Pollenkeimungspuffer in 95°C gelöst) wurde deckend auf Objektträger (50°C vorgewärmt) gegossen. Diese wurden in eine feuchte Kammer gelegt, bis das Medium fest geworden war. Pollen von Arabidopsis-Blüten (T2 Generation) wurden gleichmäßig auf die Oberfläche des Mediums getupft und ÜN bei 29°C in einer feuchten Kammer inkubiert, bis die Pollen ausgekeimt waren. 5.2.7.6 Färbemethoden für die konfokale Mikroskopie (siehe Lauterbach, 2005). 5.2.7.7 Fluoreszenzmikroskopie und Bildbearbeitung (siehe Lauterbach, 2005).
5.2.8 Methoden zur heterologen Expression in Xenopus laevis Oozyten
5.2.8.1 Präparation und Synthese der cRNA Zunächst wurde die jeweilige AtPLT cDNA in den Oozytenvektor pDK148 kloniert. Im Falle von AtPLT5 und AtPLT4 geschah dies über EcoRI, AtPLT1 und AtPLT2 wurden über NotI kloniert. Für die Expression in Oozyten wurde 10 µg Plasmid DNA mite dem Restriktionsenzym XhoI linearisiert und mittels Standardgelelektrophorese überprüft. Nach Proteinase-K-Verdau, Phenol/Chloroform-Extraktion, Isopropanolfällung und Waschen mit 70% Ethanol wurde die linearisierte cDNA mit Hilfe des mMESSAGE mMACHINE RNA Transcription Kits (Ambion, Austin, Texas) in cRNA transkribiert. Die Qualität der cRNA wurde mittels Gelelektrophorese überprüft und die Konzentration auf 1 µg/µl eingestellt. 5.2.8.2 Behandlung der Oozyten und anschließende Injektion mit cRNA Die Entnahme der Oozyten wurde im Physiologischen Institut der Medizinischen Fakultät Erlangen-Nürnberg durchgeführt. Hierzu wurden die Krallenfrösche (NASCO, Fort Atkinson, WI) narkotisiert und auf Eis operiert. Die entnommenen Ovarlappen wurden in eine Glaspetrischale (hitzesterilisiert) überführt und unter der Stereolupe mit einer Pinzette getrennt, so dass nur noch 5-8 reife Oozyten zusammenhingen. Anschließend wurden die Oozyten (Stadium V oder VI) im Falcon Tube jeweils 5x mit frischer Ca2+-freien 1xND 96 (eingestellt auf 220 mOsm, pH 7,4) Lösung gewaschen. Zur Kollagenasebehandlung (50 mg; 480 U/ml, CLS Worthington) wurden die Oozyten in einem Glaspetrischälchen mit 5 ml ND 96 bei 120 rpm bei RT für 1,5 – 2 h leicht geschüttelt. Anschließend wurden die Oozyten im Falcon Tube mit 1xND 96 5mal gewaschen. Danach wurden die Oozyten in 30 ml frische ND 96 Lösung in eine Glaspetrischale überführt und sortiert. Die guten Oozyten wurden mit einer gekürzten, gebogenen und rundgeschmolzenen Pasteurpipette in frisches ND 96 Pen/Strep (100 U/ml) überführt und ein paar Stunden bis zur Injektion bei 17°C stehen gelassen. Die Injektion der Oozyten erfolgte ca. 24 h nach der Operation. Für die Injektion wurden zunächst Glaskapillaren (3.5“Drummond #3-000-203-G/X, Drummond Scientific Company) zu Mikropipetten ausgezogen, unter dem Mikroskop abgebrochen und an einem Heizdraht angeschmolzen und ausgezogen, so dass die Kanülen einen Öffnungsdurchmesser von etwa 10 µm aufwiesen. In diese Kanülen wurde mit Hilfe des Picospritzers (General Valve TM PicospritzerTM III, USA) 1µl cRNA aufgesaugt. Mittels eines Druckstosses von 40 psi (1psi= 6,89 kPa) wurde 5 ms lang ca. 50 nl cRNA in die Oozyten injiziert. Maximal 20 injizierte Oozyten wurden in einer Well einer 6-Well-Platte in ND 96 Lösung Pen/Strep inkubiert. Die Lösung wurde täglich ausgetauscht und auslaufende, löchrige oder tote Oozyten aussortiert. Die Radioaktivmessungen erfolgten 6 Tage nach der Injektion. 5.2.8.3 Elektrophysiologische Messungen an Oozyten Die elektrophysiologischen Messungen wurden von Dietmar Geiger und Kai Konrad in Würzburg durchgeführt. Oozyten wurden in 100 mM KCl Lösung (Tris/MES Puffer pH 5,5 oder 7,5) inkubiert. Die Standard Lösungen enthielten 10 mM Tris. pH 5,5, 100 mM KCl, 1 mM CaCl2 und 1 mM MgCl2. Die Osmolarität wurde auf 220 mOsm/kg mit Saccharose eingestellt. Gleichgewichtsströme wurden mit
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Einfachspannungspulsprotokollen aufgenommen. Ausgehend von der Haltespannung -20 mV wurden 500 ms Testströme von 40 bis -140 mV aufgenommen. 5.2.8.4 Radioaktive Aufnahmemessungen an Oozyten Die radioaktiven Aufnahmemessungen wurden in 6-Well-Platten bei Raumtemperatur durchgeführt. Hierzu wurden die injizierten Oozyten in 1 ml Na+-Ringer 2 min vorinkubiert, bevor sie mit einer rundgeschmolzenen Pasteurpipette in 500 µl radioaktive Na+-Ringer Glukose Lösung überführt wurden. Die spezifische Aktivität betrug 2,2 x 106 dpm in 1 mM Glukose. Nach 15 min wurden die Oozyten 4mal in je 1 ml in Na+-Ringer Lösung mit 10 mM nichtradioaktiver Glukose je 1 min gewaschen, um die Aufnahme zu stoppen. Die Oozyten wurden dann 30 min in 2% SDS-Lösung lysiert, anschließend wurde 4 ml Szintillationscocktail zugegeben und im Szintillationszähler gemessen.
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142
Anhang
143
7 Anhang
Vektoren für die transiente Expression in Pflanzenzellen
pMV L16006 bp
AtPLT1cDNA
GFP
enh 35Sp
NosT
BamHI (5995)
Not I (2264)
Xho I (5967)
EcoRV (5835)
Kas I (2703)
Sca I (3449)
XbaI (1448)
Acc65I (5986)
Van 91I (974)
Aos I (2684)
Aos I (3707)
Hin dIII (534)
Hin dIII (5177)
Nco I (1)
Nco I (1540)
Sma I (1139)
Sma I (5992)
Xma I (1137)
Xma I (5990)
PciI (2396)
PciI (4818)
Apa LI (2761)
Apa LI (3258)
Apa LI (4504)
EcoRI (8)
EcoRI (214)
EcoRI (2542)
BspHI (2985)
BspHI (3090)
BspHI (4098)
Sac I (1271)
Sac I (2275)
Sac I (5984)
pSO35e4467 bp
GFP
enh 35Sp
NosT
BamHI (3054)
EcoRI (4068)
Hin dIII (2236)
Nco I (3066)
Not I (3790)
Sma I (3051)
Xho I (3026)
Xma I (3049)
EcoRV (2894)
Kas I (4229)
Sca I (508)
Acc65I (3045)
Aos I (766)
Aos I (4210)
PciI (1877)
PciI (3922)
Sac I (3043)
Sac I (3801)
pYK256092 bp
GFP
enh 35Sp
GFPi&r
pHANNIBAL+4139f
rev
NosT
BamHI (6081)
EcoRI (2628)
SmaI (6078)
XmaI (6076)
HindIII (925)HindIII (5263)
NcoI (1)
NcoI (1626)
ApaLI (2847)
ApaLI (3344)
ApaLI (4590)
AvaI (507)
AvaI (537)
AvaI (1307)
AvaI (1548)
AvaI (1569)
AvaI (6053)
AvaI (6076)
pYK306053 bp
GFP
GFPi&r
pHANNIBAL+4139f
rev
NosT
EcoRI (2601)
SmaI (6051)
XmaI (6049)
KasI (2762)
KpnI (6049)
XhoI (6026)
BamHI (1)
BamHI (1587)
HindIII (1155)
HindIII (5236)
NcoI (377)
NcoI (1599)
SacI (2334)
SacI (6043)
ApaLI (752)
ApaLI (2820)
ApaLI (3317)
ApaLI (4563)
AvaI (45)
AvaI (618)
AvaI (1462)
AvaI (6026)
AvaI (6049)
pYK266002 bp
GFP
enh 35Sp
GFPi&r
pHANNIBAL+4139f
rev
NosT
BamHI (5991)
KasI (2699)
KpnI (5986)
EcoRI (211)
EcoRI (2538)
HindIII (531)
HindIII (5173)
NcoI (1)
NcoI (1536)
SmaI (1136)
SmaI (5988)
XmaI (1134)
XmaI (5986)
SacI (2271)
SacI (5980)
XhoI (448)
XhoI (5963)
ApaLI (2757)
ApaLI (3254)
ApaLI (4500)
AvaI (448)
AvaI (618)
AvaI (1134)
AvaI (5963)
AvaI (5986)
Anhang
144
Vektoren für Expression in Xenopus laevis Oozyten
pMVOo16644 bp
eGFP
Neo
AtPLT1 cDNApA
pA
CMV
SV40
EM7
f1
ColE1
3'UTR
5'UTR
Not I (1)
Not I (5086)
Sac I (4873)
Sac I (6373)
pMVOo26644 bp
eGFP
Neo
AtPLT2 cDNApA
pA
CMV
T7
SV40
EM7
f1
ColE1
3'UTR
5'UTR
Sac I (4873)
Not I (1)
Not I (5086)
pYK296693 bp
AtPLT4cDNA
BamHI (6271)
ApaLI (768)
ApaLI (4899)
PstI (3596)
PstI (6551)
SmaI (2601)
SmaI (6268)
XmaI (2599)
XmaI (6266)
EcoRI (2)
EcoRI (1604)
EcoRI (6277)
HindIII (8)
HindIII (1171)
HindIII (6289)
NcoI (393)
NcoI (2485)
NcoI (2705)
NcoI (3975)
NcoI (5908)
AvaI (61)
AvaI (634)
AvaI (1478)
AvaI (2599)
AvaI (6266)
AvaI (6593)
pWÜ6726 bp
AtPLT5cDNA
ApaLI (3708)
BamHI (5080)
NotI (53)
EcoRI (1)
EcoRI (5086)
PstI (275)
PstI (2405)
SmaI (1410)SmaI (5077)
XmaI (1408)
XmaI (5075)
HindIII (13)
HindIII (5092)
HindIII (6023)
NcoI (1294)
NcoI (1514)
NcoI (2784)
NcoI (4717)
AvaI (317)
AvaI (1408)
AvaI (5075)
AvaI (5605)
AvaI (5635)
AvaI (6405)
AvaI (6646)
AvaI (6667)
Anhang
145
Vektoren für RNAi Konstrukte
Vektoren für heterologe Expression in Saccharomyces cerevisiae
pHanni_RNAi_1 s+as6768 bp
APr
pdk-Intron 2
AtPLT1RNAi 1
AtPLT1 2 RNAi 1 sense
SHE040
SHE083pHa+4139f
35S-Promotor (E1)
3'-Ende Intron
5'-Ende Intron
ocs-Terminator
Sac I (4914)
Xho I (6275)
Kpn I (1)
Sda I (2003)
Xba I (1280)
Xba I (6281)
Hin dIII (802)
Hin dIII (6759)
pYK238814 bp
AtPLT5cDNA
s PMA1p Primer
s PMA1t - Primer
pMA1-Prom
pMA1-Term
BamHI (7556)
ClaI (7753)
NcoI (3302)
PstI (7578)
SmaI (7553)
XmaI (7551)
EcoRI (1)
EcoRI (1642)
ApaLI (5128)
ApaLI (5625)
ApaLI (6871)
HindIII (705)
HindIII (1636)
HindIII (2411)
HindIII (7586) AvaI (61)
AvaI (82)
AvaI (323)
AvaI (1093)
AvaI (1123)
AvaI (4250)
AvaI (7551)
pHanni_RNAi_2 s+as6328 bp
APr
pdk-Intron 2
ATPLT1 2 RNAi 2 as
AtPLT1 2 RNAi 2 sense
35S-Promotor (E1)
3'-Ende Intron
5'-Ende Intron
ocs-Terminator
Sac I (4694)
Xho I (6055)
Kpn I (1)
Sda I (1783)
Xba I (1060)
Xba I (6061)
Hin dIII (802)
Hin dIII (6319)
pYK348728 bp
AtPLT2cDNAs PMA1p - Primer
s PMA1t Primer
PMA1-Prom
PMA1-Term
BamHI (5913)
ClaI (6110)
EcoRI (8499)
NcoI (1659)
PstI (5935)
SmaI (5910)
SmaI (7578)
XmaI (5908)
XmaI (7576)
NotI (1)
NotI (7170)
ApaLI (3485)
ApaLI (3982)ApaLI (5228)
HindIII (768)
HindIII (5943)
HindIII (8179)
HindIII (8722)
AvaI (2607)
AvaI (5908)
AvaI (7576)
AvaI (8092)
AvaI (8262)
pYK318775 bp
AtPLT4cDNA
s PMA1p Primer
s PMA1t - Primer
pMA1-Prom
pMA1-Term
BamHI (7517)
ClaI (7714)
PstI (7539)
SmaI (7514)
XmaI (7512)
EcoRI (1)
EcoRI (1603)
NcoI (1212)
NcoI (3263)
ApaLI (837)
ApaLI (5089)
ApaLI (5586)
ApaLI (6832)
HindIII (434)
HindIII (1597)
HindIII (2372)
HindIII (7547) AvaI (127)
AvaI (971)
AvaI (1544)
AvaI (4211)
AvaI (7512)
pMVRNAi_1.2 6768 bp
pMVRNAi_2.2 6328 bp
Anhang
146
Sequenz des ORF für AtPLT1 aus Arabidopsis thaliana; 1536 bp 0001 ATGAATTCCT CGGGAGTTGA ACAAGGTGTT GTGATTGCGG AGTCAGAGCC 0051 ACCGAGGGGG AATAGAAGCC GATATGCTTT TGCTTGTGCA ATCTTAGCCT 0101 CCATGACTTC TATCATCCTT GGTTACGACA TTGGAGTGAT GAGTGGAGCT 0151 TCAATTTTCA TAAAAGACGA TTTGAAACTG TCTGATGTAC AACTTGAGAT 0201 TCTTATGGGA ATTCTAAACA TCTACTCTCT GGTCGGTTCC GGCGCAGCTG 0251 GTAGAACTTC TGATTGGCTC GGAAGACGAT ATACAATAGT GTTGGCAGGA 0301 GCCTTCTTCT TTTGCGGAGC CCTACTAATG GGCTTTGCCA CAAACTACCC 0351 TTTCATAATG GTTGGCCGTT TTGTAGCCGG TATCGGTGTT GGTTATGCTA 0401 TGATGATTGC GCCTGTTTAC ACCGCTGAAG TCGCTCCCGC CTCTTCCCGA 0451 GGCTTCCTTA CCTCTTTCCC TGAGATTTTT ATCAATATTG GTATACTTTT 0501 GGGATACGTA TCCAATTACT TCTTCTCCAA GCTTCCCGAG CACCTCGGAT 0551 GGAGGTTCAT GTTAGGTGTA GGAGCGGTTC CCTCGGTGTT CCTAGCCATT 0601 GGAGTGTTGG CAATGCCGGA GTCTCCTCGG TGGCTCGTCC TTCAGGGTCG 0651 TCTCGGGGAT GCTTTTAAAG TCCTTGACAA AACCTCCAAC ACCAAAGAAG 0701 AAGCTATCTC TAGGCTCGAT GACATCAAAC GCGCAGTTGG AATCCCCGAT 0751 GATATGACAG ACGATGTTAT AGTCGTTCCG AATAAAAAGA GCGCTGGAAA 0801 AGGCGTGTGG AAGGACCTTC TCGTTCGACC AACCCCGTCC GTTCGACACA 0851 TCCTCATAGC ATGCCTTGGT ATTCATTTCG CCCAGCAAGC CTCTGGAATT 0901 GATGCGGTTG TGCTTTACTC TCCGACAATC TTCTCAAAGG CTGGACTGAA 0951 GTCCAAGAAT GACCAGCTCT TGGCTACGGT CGCTGTCGGA GTTGTCAAGA 1001 CTCTCTTCAT CGTGGTAGGG ACTTGTGTGG TGGATCGGTT CGGACGTCGT 1051 GCCTTGTTGC TTACGAGTAT GGGCGGAATG TTTCTTTCCT TGACCGCACT 1101 TGGAACTAGT CTCACGGTGA TCAACAGGAA CCCCGGGCAA ACACTCAAGT 1151 GGGCTATAGG GCTCGCCGTT ACGACGGTGA TGACTTTTGT GGCAACATTC 1201 TCAATAGGTG CAGGCCCCGT GACGTGGGTC TACTGCTCAG AGATATTCCC 1251 TGTGAGGCTA AGAGCTCAAG GGGCAAGTTT AGGAGTGATG TTGAATAGAC 1301 TAATGAGTGG TATTATTGGA ATGACATTCC TATCTCTTTC TAAAGGTCTC 1351 ACCATCGGCG GTGCGTTCCT TCTATTCGCC GGAGTTGCTG CCGCCGCATG 1401 GGTCTTCTTC TTCACTTTCC TCCCGGAGAC ACGTGGTATA CCTCTAGAGG 1451 AGATGGAGAC TCTCTTCGGG AGCTACACCG CAAACAAGAA GAATAATTCT 1501 ATGAGCAAAG ACAATGAAGT TGTGGATGGA CAATGA Sequenz des ORF für AtPLT2 aus Arabidopsis thaliana; 1536 bp 0001 ATGAGTTCCT CAGGAGAAGA ACGAGGTGTT GTTGTTGCCG AGTCCGAGCC 0051 GCCAAGAGGG AATAGAAGCC GATTTGCTTT TGCTTGTGCA ATCTTAGCCT 0101 CCATGACTTC TATCATCCTT GGTTATGATA TTGGAGTGAT GAGTGGAGCT 0151 GCAATTTTCA TAAAAGACGA TTTGAAGCTG TCGGACGTAC AACTTGAGAT 0201 TCTTATGGGA ATTCTAAATA TCTATTCTCT GATCGGTTCA GGAGCAGCTG 0251 GAAGAACTTC CGATTGGATC GGAAGACGAT ATACCATAGT GTTGGCAGGA 0301 TTCTTCTTCT TTTGTGGAGC CCTACTAATG GGTTTTGCCA CTAACTATCC 0351 TTTCATTATG GTCGGCCGTT TTGTAGCCGG TATCGGTGTC GGTTACGCTA 0401 TGATGATTGC GCCTGTTTAT ACCACGGAAG TCGCTCCAGC CTCTTCTCGA 0451 GGCTTCCTTA GCTCTTTCCC TGAGATATTT ATCAACATTG GTATACTATT 0501 GGGATACGTA TCCAATTACT TCTTCGCCAA GCTTCCAGAG CACATTGGAT 0551 GGAGGTTCAT GTTAGGTATT GGAGCTGTGC CCTCAGTGTT TCTAGCCATT 0601 GGAGTGTTGG CAATGCCCGA GTCTCCACGG TGGCTCGTCA TGCAGGGTCG 0651 TCTAGGGGAC GCTTTTAAAG TCCTTGACAA AACCTCAAAC ACCAAAGAAG 0701 AAGCCATCTC AAGGCTCAAT GACATCAAAC GCGCAGTTGG AATCCCCGAT 0751 GATATGACAG ACGATGTTAT AGTCGTTCCG AATAAAAAGA GCGCTGGAAA 0801 AGGCGTGTGG AAGGACCTTC TCGTTCGACC AACCCCGTCC GTTCGACACA 0851 TCCTCATAGC ATGCCTTGGT ATCCATTTCT CCCAGCAAGC CTCCGGAATT 0901 GATGCTGTCG TGCTTTACTC TCCGACCATC TTCTCAAGGG CTGGACTGAA 0951 GTCCAAGAAT GACCAGCTCT TGGCTACGGT CGCTGTCGGA GTTGTCAAGA 1001 CTCTCTTCAT CGTAGTAGGA ACTTGTTTGG TGGACCGGTT TGGACGTCGT 1051 GCCTTGTTGC TTACGAGTAT GGGTGGAATG TTTTTTTCCT TGACCGCCCT 1101 TGGAACTAGT CTCACGGTGA TCGACAGGAA CCCCGGGCAA ACACTCAAGT
Anhang
147
1151 GGGCTATAGG GCTCGCCGTT ACGACGGTGA TGACTTTTGT CGCAACATTC 1201 TCATTAGGTG CAGGCCCCGT GACGTGGGTC TACGCCTCAG AGATATTCCC 1251 CGTGAGGCTA AGAGCGCAAG GAGCAAGTTT GGGAGTGATG TTGAATAGAC 1301 TAATGAGTGG TATTATAGGA ATGACATTCC TATCTCTTTC TAAGGGTCTC 1351 ACCATCGGTG GTGCATTCCT TCTCTTCGCC GGAGTTGCGG TTGCCGCGTG 1401 GGTCTTCTTC TTCACTTTCC TCCCGGAGAC ACGTGGTGTG CCTTTAGAAG 1451 AAATAGAGAG TCTCTTCGGG AGCTACAGCG CAAACAAAAA GAACAATGTT 1501 ATGAGCAAAG GGAAACAAGT AGTTGATGAA CAATGA Sequenz des ORF für AtPLT4 aus Arabidopsis thaliana; 1581 bp 0001 ATGATGAAGA ATCTTCCGGA GGTTGGTAAT GGCGGTGGCT CGGGTTTTCC 0051 GGCGGTCTCT GTCGGAAATA AGAAGAATAA GTATCAGAGA ATGGACTCCG 0101 ACGCGGAGGA ATCGCAGAAT CATCGTGAAG CAGAGGCTAG AAACAGTAGA 0151 ACCAGAAAAT ACGTTATGGC TTGTGCCTTT TTTGCATCCT TGAACAATGT 0201 TCTTCTCGGC TACGATGTTG GGGTAATGAG CGGTGCGGTG TTGTTCATAC 0251 AGCAGGATCT CAAAATAACG GAGGTGCAGA CGGAAGTGCT CATTGGTAGC 0301 CTTAGCATCA TCTCACTCTT TGGCAGCTTA GCCGGCGGCA GAACCTCTGA 0351 CTCTATCGGT AGAAAATGGA CCATGGCCTT GGCTGCTCTC GTCTTCCAGA 0401 CTGGTGCTGC CGTGATGGCT GTCGCTCCGT CTTTCGAGGT TTTGATGATA 0451 GGGAGAACTT TAGCCGGCAT TGGGATTGGG CTTGGTGTCA TGATCGCTCC 0501 TGTCTACATC GCCGAGATAT CCCCCACCGT AGCTAGAGGA TTTTTCACTT 0551 CGTTCCCTGA GATCTTCATA AATCTAGGGA TCTTGCTGGG CTATGTTTCG 0601 AACTACGCTT TCTCGGGGCT TTCCGTGCAT ATCAGCTGGA GGATCATGCT 0651 TGCAGTTGGG ATTCTTCCTT CGGTGTTCAT AGGATTTGCG CTGTGTGTGA 0701 TCCCTGAGTC GCCGAGGTGG CTGGTGATGA AAGGCCGAGT GGACAGTGCA 0751 CGAGAGGTGC TCATGAAAAC GAATGAGCGA GATGACGAAG CGGAAGAGCG 0801 GCTTGCAGAG ATACAACTGG CGGCTGCACA TACAGAAGGC AGCGAGGACA 0851 GGCCCGTGTG GCGTGAGCTT CTTAGCCCAT CTCCTGTTGT ACGGAAAATG 0901 CTGATTGTTG GATTTGGAAT CCAGTGTTTC CAGCAGATCA CAGGAATTGA 0951 CGCCACAGTC TACTATAGTC CAGAGATCCT GAAAGAGGCT GGGATACAAG 1001 ACGAGACCAA ACTGCTCGCT GCAACTGTCG CTGTTGGTGT CACGAAAACA 1051 GTGTTCATAC TATTTGCCAC CTTCCTGATT GATAGTGTTG GCCGGAAACC 1101 GCTGCTTTAT GTGAGCACAA TAGGAATGAC TCTGTGTCTC TTTTGTCTAA 1151 GCTTTACGCT CACATTCCTC GGCCAAGGAA CGCTTGGGAT AACCTTGGCG 1201 CTTCTCTTTG TTTGTGGAAA CGTTGCCTTC TTCTCCATAG GAATGGGACC 1251 TGTTTGCTGG GTCTTGACAT CAGAGATCTT TCCATTACGA TTAAGAGCCC 1301 AGGCATCTGC GCTTGGGGCG GTTGGGAACA GGGTGTGCAG CGGTCTGGTG 1351 GCCATGTCCT TCCTCTCTGT GTCACGTGCC ATCACTGTTG GAGGAACCTT 1401 CTTCGTTTTC TCCCTCGTGT CTGCACTCTC AGTTATCTTC GTGTATGTGC 1451 TAGTCCCCGA GACAAGCGGG AAGTCACTGG AGCAGATAGA GTTGATGTTT 1501 CAGGGTGGGC TGGAAAGAAA AGACGGTGAA GTTGAGCTTG GAGATGCTGA 1551 GCGTCTTGTG CGCAAGGAAC AGGAGTTTTG A Sequenz des ORF für AtPLT5 aus Arabidopsis thaliana; 1620 bp 0001 ATGACAGGTG CCACACCGGA AAACCGAACG GCCCCGTCGC CACCACCGGT 0051 GAAACATGTG CCGGAGTCAG TTCTGCCGGC TAAACCACCA AAGAGGAACA 0101 ATTATGCATT CGCGTGTGCT ATCTTAGCTT CCATGACTTC TATCCTCCTT 0151 GGTTATGATA TAGGAGTGAT GAGTGGAGCA ATGATTTATA TAAAGAGAGA 0201 TTTGAAGATT AATGATTTAC AAATCGGGAT TCTCGCTGGA AGCCTCAACA 0251 TCTATTCACT TATAGGATCT TGCGCCGCCG GAAGAACCTC TGACTGGATT 0301 GGTCGGCGTT ACACTATCGT GTTGGCTGGA GCCATATTCT TCGCCGGAGC 0351 TATCCTTATG GGATTGTCCC CTAACTACGC TTTCCTCATG TTCGGAAGGT 0401 TCATCGCCGG TATCGGCGTC GGATATGCTC TCATGATCGC ACCAGTTTAT 0451 ACCGCCGAAG TCTCTCCGGC ATCTTCCCGC GGCTTCCTCA ATTCCTTCCC 0501 CGAGGTGTTT ATCAACGCCG GAATTATGCT CGGGTACGTA TCAAATCTGG 0551 CTTTCTCGAA CTTGCCGTTG AAGGTAGGAT GGAGACTGAT GCTCGGAATC 0601 GGAGCCGTAC CTTCCGTGAT ACTCGCTATC GGCGTTCTCG CTATGCCGGA 0651 ATCTCCACGG TGGCTCGTTA TGCAAGGCCG TCTCGGTGAT GCCAAGCGCG 0701 TTCTGGACAA AACCTCTGAT TCCCCCACCG AAGCAACTCT CCGTCTCGAA
Anhang
148
0751 GACATCAAAC ACGCCGCTGG TATTCCCGCC GATTGCCACG ACGACGTCGT 0801 TCAGGTGTCG AGGAGGAACA GTCATGGAGA AGGAGTTTGG AGAGAGCTTT 0851 TAATCCGACC AACACCAGCC GTGCGTCGTG TTATGATCGC CGCAATCGGA 0901 ATCCATTTCT TCCAGCAAGC TTCCGGTATC GACGCGGTGG TTCTCTTCTC 0951 ACCGCGAATT TTCAAAACCG CCGGACTCAA AACCGATCAC CAACAGCTTC 1001 TAGCGACTGT AGCAGTAGGA GTAGTGAAGA CATCATTCAT ACTAGTCGCC 1051 ACTTTCTTAC TCGACAGAAT CGGGAGAAGA CCATTGCTTC TAACCAGCGT 1101 AGGAGGAATG GTACTATCTC TAGCAGCGTT AGGGACTTCT CTAACGATTA 1151 TAGACCAGTC AGAGAAGAAA GTGATGTGGG CTGTGGTTGT AGCTATAGCT 1201 ACGGTGATGA CTTATGTAGC TACGTTTTCG ATAGGAGCTG GACCGATAAC 1251 TTGGGTTTAT AGCTCGGAGA TATTCCCGTT GAGGTTGAGA TCACAGGGCT 1301 CGAGTATGGG TGTGGTGGTG AACAGAGTGA CTAGTGGTGT GATCTCGATA 1351 TCGTTTCTTC CAATGTCGAA AGCGATGACT ACTGGTGGAG CGTTTTACTT 1401 GTTTGGAGGG ATTGCGACTG TGGCTTGGGT TTTCTTTTAC ACTTTCTTGC 1451 CGGAGACGCA AGGGAGGATG CTTGAGGATA TGGATGAGCT TTTCAGTGGT 1501 TTCAGGTGGA GAGATTCCAA GAGTAAGCCT AAGGGTAACC CCGAGAAGAC 1551 GGTACCGAAT CCCGAGGTTG AGATTGGATC AAACAAGCAG TGGAAGGAAG 1601 GAGACACACA AAGTTCGTAG Peptidsequenzen von AtPLT1, AtPLT2, AtPLT4 und AtPLT5
AtPLT1 (At2g16120); Peptidsequenz, 511 Aminosäuren 001 MNSSGVEQGV VIAESEPPRG NRSRYAFACA ILASMTSIIL GYDIGVMSGA 051 SIFIKDDLKL SDVQLEILMG ILNIYSLVGS GAAGRTSDWL GRRYTIVLAG 101 AFFFCGALLM GFATNYPFIM VGRFVAGIGV GYAMMIAPVY TAEVAPASSR 151 GFLTSFPEIF INIGILLGYV SNYFFSKLPE HLGWRFMLGV GAVPSVFLAI 201 GVLAMPESPR WLVLQGRLGD AFKVLDKTSN TKEEAISRLD DIKRAVGIPD 251 DMTDDVIVVP NKKSAGKGVW KDLLVRPTPS VRHILIACLG IHFAQQASGI 301 DAVVLYSPTI FSKAGLKSKN DQLLATVAVG VVKTLFIVVG TCVVDRFGRR 351 ALLLTSMGGM FLSLTALGTS LTVINRNPGQ TLKWAIGLAV TTVMTFVATF 401 SIGAGPVTWV YCSEIFPVRL RAQGASLGVM LNRLMSGIIG MTFLSLSKGL 451 TIGGAFLLFA GVAAAAWVFF FTFLPETRGI PLEEMETLFG SYTANKKNNS 501 MSKDNEVVDG Q*
AtPLT2 (At2g16130); Peptidsequenz, 511 Aminosäuren 001 MSSSGEERGV VVAESEPPRG NRSRFAFACA ILASMTSIIL GYDIGVMSGA 051 AIFIKDDLKL SDVQLEILMG ILNIYSLIGS GAAGRTSDWI GRRYTIVLAG 101 FFFFCGALLM GFATNYPFIM VGRFVAGIGV GYAMMIAPVY TTEVAPASSR 151 GFLSSFPEIF INIGILLGYV SNYFFAKLPE HIGWRFMLGI GAVPSVFLAI 201 GVLAMPESPR WLVMQGRLGD AFKVLDKTSN TKEEAISRLN DIKRAVGIPD 251 DMTDDVIVVP NKKSAGKGVW KDLLVRPTPS VRHILIACLG IHFSQQASGI 301 DAVVLYSPTI FSRAGLKSKN DQLLATVAVG VVKTLFIVVG TCLVDRFGRR 351 ALLLTSMGGM FFSLTALGTS LTVIDRNPGQ TLKWAIGLAV TTVMTFVATF 401 SLGAGPVTWV YASEIFPVRL RAQGASLGVM LNRLMSGIIG MTFLSLSKGL 451 TIGGAFLLFA GVAVAAWVFF FTFLPETRGV PLEEIESLFG SYSANKKNNV 501 MSKGKQVVDE Q* AtPLT4 (At2g20780); Peptidsequenz, 526 Aminosäuren 001 MMKNLPEVGN GGGSGFPAVS VGNKKNKYQR MDSDAEESQN HREAEARNSR 051 TRKYVMACAF FASLNNVLLG YDVGVMSGAV LFIQQDLKIT EVQTEVLIGS 101 LSIISLFGSL AGGRTSDSIG RKWTMALAAL VFQTGAAVMA VAPSFEVLMI
Anhang
149
151 GRTLAGIGIG LGVMIAPVYI AEISPTVARG FFTSFPEIFI NLGILLGYVS 201 NYAFSGLSVH ISWRIMLAVG ILPSVFIGFA LCVIPESPRW LVMKGRVDSA 251 REVLMKTNER DDEAEERLAE IQLAAAHTEG SEDRPVWREL LSPSPVVRKM 301 LIVGFGIQCF QQITGIDATV YYSPEILKEA GIQDETKLLA ATVAVGVTKT 351 VFILFATFLI DSVGRKPLLY VSTIGMTLCL FCLSFTLTFL GQGTLGITLA 401 LLFVCGNVAF FSIGMGPVCW VLTSEIFPLR LRAQASALGA VGNRVCSGLV 451 AMSFLSVSRA ITVGGTFFVF SLVSALSVIF VYVLVPETSG KSLEQIELMF 501 QGGLERKDGE VELGDAERLV RKEQEF* AtPLT5 (At3g18830); Peptidsequenz, 539 Aminosäuren 001 MTGATPENRT APSPPPVKHV PESVLPAKPP KRNNYAFACA ILASMTSILL 051 GYDIGVMSGA MIYIKRDLKI NDLQIGILAG SLNIYSLIGS CAAGRTSDWI 101 GRRYTIVLAG AIFFAGAILM GLSPNYAFLM FGRFIAGIGV GYALMIAPVY 151 TAEVSPASSR GFLNSFPEVF INAGIMLGYV SNLAFSNLPL KVGWRLMLGI 201 GAVPSVILAI GVLAMPESPR WLVMQGRLGD AKRVLDKTSD SPTEATLRLE 251 DIKHAAGIPA DCHDDVVQVS RRNSHGEGVW RELLIRPTPA VRRVMIAAIG 301 IHFFQQASGI DAVVLFSPRI FKTAGLKTDH QQLLATVAVG VVKTSFILVA 351 TFLLDRIGRR PLLLTSVGGM VLSLAALGTS LTIIDQSEKK VMWAVVVAIA 401 TVMTYVATFS IGAGPITWVY SSEIFPLRLR SQGSSMGVVV NRVTSGVISI 451 SFLPMSKAMT TGGAFYLFGG IATVAWVFFY TFLPETQGRM LEDMDELFSG 501 FRWRDSKSKP KGNPEKTVPN PEVEIGSNKQ WKEGDTQSS*
Anhang
150
Anhang
151
Aminosäuresequenzvergleich bisher charakterisierter Polyoltransporter
1 50 AtPLT5 (1) -----MTGATPENRTAPSPPPVKH---VPESVLPAKPPKRNNYAFACAIL PcSOT1 (1) -----MTDRRAQDNAVSGQPLLK------------KKPKRNLYAIGCAIL PcSOT2 (1) -----MADRRAEYNAVVSGQPQKN---IADFDPP-GKPKRNKYAFACAIL AgMAT1 (1) --------MITGEVSVDSYDTNK----------P--KPKRNKYAFACALL PmPLT2 (1) MNSEHHNSGGLASFSVDAGKSQKPDAASVLDTLPKKPVTRNKYALAISIL PmPLT1 (1) -MTADHQKSSVASFAVSSGDAGKLGLSSTLDTLPKKPLKRNKYALAISIL Consensus (1) M A AV SG QK LP KPPKRNKYAFACAIL 51 100 AtPLT5 (43) ASMTSILLGYDIGVMSGAMIYIKRDLKINDLQIGILAGSLNIYSLIGSCA PcSOT1 (34) ASMTSILLGYDIGVMSGASIYIQKDLKISDVEVEILIGILNLYSLIGSAA PcSOT2 (42) ASMTSILLGYDIGVMSGAVIYIKKDLKVSDVEIEVLVGILNLYSLIGSAA AgMAT1 (31) ASMNSILLGYDTGVLSGASIYIKEDLHFSDVQIEIIIGIINIYSLLGSAI PmPLT2 (51) ASMTSVLLGYDTGVMSGATLYIKDDLKISDVQVELLVGTINIYSLVGSAV PmPLT1 (50) ASMTSVLLGYDCGVMSGATQFIQEDLIITDVQVELLVGTINIYSLVGSAV Consensus (51) ASMTSILLGYDIGVMSGASIYIKKDLKISDVQIEILVGIINIYSLIGSAA 101 150 AtPLT5 (93) AGRTSDWIGRRYTIVLAGAIFFAGAILMGLSPNYAFLMFGRFIAGIGVGY PcSOT1 (84) AGRTSDWIGRRYTIVFAGAIFFTGALLMGLATNYAFLMVGRFVAGIGVGY PcSOT2 (92) AGRTSDWIGRRYTIVLAGAIFFAGALLMGFAPNYAFLMFGRFVAGIGVGY AgMAT1 (81) AGRTSDWIGRRYTMVLAGIIFFLGAIFMGLATNFAFLMFGRFVAGIGVGY PmPLT2 (101) AGRTSDWVGRRYTIVFASVVFFVGAILMGIATNYVFLMAGRFVAGIGVGY PmPLT1 (100) AGRTSDWVGRRYTIVFASTIFFLGAILMGFATNYAFLMVGRFVAGIGVGY Consensus (101) AGRTSDWIGRRYTIVLAGAIFFLGAILMGLATNYAFLMFGRFVAGIGVGY 151 200 AtPLT5 (143) ALMIAPVYTAEVSPASSRGFLNSFPEVFINAGIMLGYVSNLAFSNLPLKV PcSOT1 (134) ALMIAPVYNAEVSPASSRGALTSFPEVFVNIGILLGYVANYAFSGLPIDL PcSOT2 (142) ALMIAPVYTAEVSPASSRGFLTSFPEVFINAGILFGYVSNYGFSKLPTHL AgMAT1 (131) AMMIAPVYTAEVAPSSSRGFLTSFPEVFINSGVLLGYVSNFAFAKCPLWL PmPLT2 (151) ALMIAPVYAAEVAPASCRGFLTSFPEVFINFGVLLGFVSNYAFAKLPLKL PmPLT1 (150) ALMIAPVYAAEVAPASCRGFLTSFPEVFINFGVLLGYVSNFAFAKLPLTL Consensus (151) ALMIAPVYTAEVAPASSRGFLTSFPEVFINAGILLGYVSNYAFAKLPL L 201 250 AtPLT5 (193) GWRLMLGIGAVPSVILAIGVLAMPESPRWLVMQGRLGDAKRVLDKTSDSP PcSOT1 (184) GWRLMLGVGVFPSVILAVGVLSMPESPRWLVMQGRLGEAKQVLDKTSDSL PcSOT2 (192) GWRLMLGVGAIPSIFLAIGVLAMPESPRWLVMQGRLGDARKVLDKTSDSL AgMAT1 (181) GWRIMLGIGAFPSVALAIIVLYMPESPRWLVMQGRLGEARTVLEKTSTSK PmPLT2 (201) GWRMMLGVGAIPAVFLAIGVIYMPESPRWLVLQGRLGDARRVLDKTSDSL PmPLT1 (200) GWRMMLGVGAVPSVLLGVGVLYMPESPRWLVLQGRLGDAKKVLDKTSDSL Consensus (201) GWRLMLGVGAIPSVILAIGVLYMPESPRWLVMQGRLGDAKKVLDKTSDSL 251 300 AtPLT5 (243) TEATLRLEDIKHAAGIPADCHDDVVQVSRRNSHGEGVWRELLIRPTPAVR PcSOT1 (234) EEAQLRLADIKEAAGIPEHCVEDVVQVP-KHSHGEEVWKELLLHPTPPVR PcSOT2 (242) EESKLRLGEIKEAAGIPEHCNDDIVEVK-KRSQGQEVWKQLLLRPTPAVR AgMAT1 (231) EEAHQRLSDIKEAAGIDKDCNDDVVQVP-KRTKDEAVWKELILHPTKPVR PmPLT2 (251) EESKLRLADIKEAAGIPEDCNDDFVQVQ-KHSQGQGVWRELLLHPTKPVL PmPLT1 (250) EESKLRLADIKEAAGVPLDCHDEIVQVQ-KRSQGQGVWKELLLHPTKPVL Consensus (251) EEAKLRLADIKEAAGIPEDCNDDVVQV KRSQGQGVWKELLLHPTPPVR 301 350 AtPLT5 (293) RVMIAAIGIHFFQQASGIDAVVLFSPRIFKTAGLKTDHQQLLATVAVGVV PcSOT1 (283) HILIAAIGFHFFQQLSGIDALVLYSPRIFEKAGITDSSTLLLATVAVGFS PcSOT2 (291) HILMCAVGLHFFQQASGIDAVVLYSPRIFEKAGITNPDHVLLCTVAVGFV AgMAT1 (280) HAAITGIGIHFFQQACGIDAVVLYSPRIFEKAGIKSNSKKLLATIAVGVC PmPLT2 (300) HILICGVGIHFFQQGIGIDSVVLYSPRIYDRAGITDTSDKLLATIAVGIS PmPLT1 (299) HILICGVGIHFFQQGIGIDSVVLYSPRIYEKAGIKNTSDKLLATIAVGVS Consensus (301) HILICAIGIHFFQQASGIDAVVLYSPRIFEKAGIT TS KLLATIAVGVS 351 400 AtPLT5 (343) KTSFILVATFLLDRIGRRPLLLTSVGGMVLSLAALGTSLTIIDQSEK-KV PcSOT1 (333) KTIFTLVAIGFLDRVGRRPLLLTSVAGMIASLLCLGTSLTIVDHETE-KM
Anhang
152
PcSOT2 (341) KTVFILVATFMLDRIGRRPLLLTSVAGMVFTLACLGLGLTIIDHSGE-KI AgMAT1 (330) KTVFILISTFQLDKIGRRPLMLTSMGGMVIALFVLAGSLTVINKSHH-TG PmPLT2 (350) KTFFILITTFYVDRFGRRFLLLVSCAGVALSMFALGTVLTIIDRNPDAKQ PmPLT1 (349) KTFFILITTFFVDRFGRRPLLLTSCAGVALSMFALGTSLTIIDRNPDGNI Consensus (351) KTVFILIATFFLDRIGRRPLLLTSVAGMVLSLFALGTSLTIIDRS D KI 401 450 AtPLT5 (392) MWAVVVAIATVMTYVATFSIGAGPITWVYSSEIFPLRLRSQGSSMGVVVN PcSOT1 (382) MWASVLCLTMVLAYVGFFSIGMGPIAWVYSSEIFPLKLRAQGCSMGTAVN PcSOT2 (390) MWAIALSLTMVLAYVAFFSIGMGPITWVYSSEIFPLQLRAQGCSIGVAVN AgMAT1 (379) HWAGGLAIFTVYAFVSIFSSGMGPIAWVYSSEVFPLRLRAQGCSIGVAVN PmPLT2 (400) TGVLVLVVLLTMVIVGFFSMGLGPIAWVYSSEIFPLKLRAQGCGLGVAMN PmPLT1 (399) KGLLIFAVILTMAIVGFFSMGLGPIAWVYSSEIFPLKLRAQGCSMGVAMN Consensus (401) MWALVLAI LVMAYVGFFSIGMGPIAWVYSSEIFPLKLRAQGCSMGVAVN 451 500 AtPLT5 (442) RVTSGVISISFLPMSKAMTTGGAFYLFGGIATVAWVFFYTFLPETQGRML PcSOT1 (432) RIMSGVLSMSFISLYKAITMGGTFFLYAGIATVGWVFFYTMLPETQGRTL PcSOT2 (440) RVVSGVLSMTFISLYKAITIGGAFFLFAAIAAVGWTFFFTMLPETQGRTL AgMAT1 (429) RGMSGIIGMTFISMYKAMTIGGAFLLFAVVASIGWVFMYTMFPETQGRNL PmPLT2 (450) RFMSGVILMSFISLYKEITIGGSFFLFGGITTLGWIFFFTLFPETRGRTL PmPLT1 (449) RFMSGVILMSFISLYKAITIGGAFFLFGGITTVAFIFFYTLFPETQGRTL Consensus (451) RVMSGVISMSFISLYKAITIGGAFFLFAGIATVGWVFFYTMLPETQGRTL 501 549 AtPLT5 (492) EDMDELFSGFRWRDSKSKPKGNPEKTVPNPEVEIGSNKQWKEGDTQSS- PcSOT1 (482) EDMEVLFGKFWRWREGYALLRNKRAVVC--------------------- PcSOT2 (490) EDMEVLFGKFYRWRKANALLKQKKQVDHGDGNNNPNNPQIQLGTKGQAN AgMAT1 (479) EEIELLFGSYFGWRKTLKDLKAKEAAEAKSRESEV-------------- PmPLT2 (500) EEMEGLFGTFFKWRTTMKELDAKKRSGTDGA------------------ PmPLT1 (499) EEMEELFGTFFSWRTRMKELDAKKKTGSEAT------------------ Consensus (501) EDMEVLFGTFFRWRT MKELKAKKKT Gelb. Identische Aminosäuren Blau: Aminosäuren in mehr als 50% identisch Grün: schwach verwandte Aminosäuren
Expressionsmuster von AtPLT1 und AtPLT2
Anhang
153
Expressionsmuster von AtPLT5
Datenbank Genevestigator® - Expressionsprofil
154
Lebenslauf
155
8 Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name: Yvonne-Simone Klepek
Geburtsdatum: 26.März 1978
Geburtsort: Fürth i. Bayern
Staatsangehörigkeit: deutsch
Familienstand: ledig
Schulbildung:
09/1984 - 07/1988 Grundschule Erlangen-Eltersdorf
09/1988 - 07/1998 Emmy-Noether-Gymnasium Erlangen Abschluss: Allgemeine Hochschulreife
Universitätsstudium:
11/1998 – 07/1999 Studium der Biologie und Chemie für das Lehramt an Gymnasien an der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg 07/1999 – 08/2003 Studium der Biologie an der Friedrich-Alexander- Universität Erlangen-Nürnberg Abschluss: Diplom-Biologin Univ. 07/2002 – 06/2003 Diplomarbeit am Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Thema: „Isolierung, Lokalisierung und funktionelle Charakterisierung pflanzlicher Polyoltransporter aus Arabidopsis thaliana“
Seit 08/2003 Dissertation am Lehrstuhl für Molekulare Pflanzenphysiologie der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
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An dieser Stelle möchte ich allen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Herrn Prof. Dr. Norbert Sauer danke ich für sein Engagement bei der AFGN, die das Polyoltransporterprojekt finanziell ermöglicht und gefördert haben. Weiterhin danke ich ihm für sein reges Interesse am Fortgang der Arbeit, seinen wissenschaftlichen Rat, für die Freiheit bei der Gestaltung dieser Arbeit sowie das Vertrauen mir Praktikanten und Diplomanden zur Seite zu stellen. Außerdem war es eine wissenschaftlich interessante Erfahrung dieses junge Forschungsgebiet in Montpellier und Dabringhausen vorstellen zu dürfen. Vielen Dank! Frau Prof. Dr. Petra Dietrich danke ich für die Übernahme des Zweitgutachtens sowie die Möglichkeit, in Ihrer Arbeitsgruppe alles über Oozyten und RNA-Injektion zu lernen. Nicht unerwähnt dürfen in diesem Zusammenhang Herr Dr. Ulrich Hammes, und zwei Mitarbeiter vom Lehrstuhl Physiologie der Medizinischen Fakultät, Frau Dr. Limin Yang und Herr Dr. Robert Rauh, bleiben. Für die Durchführung der elektrophysiologischen Messungen an AtPLT 1, 2, 4 & 5 danke ich Herrn Dr. Dietmar Geiger, Herrn Kai Konrad und Herrn Prof. Dr. Rainer Hedrich der Universität Würzburg. Frau PD Dr. Ruth Stadler gilt mein besonderer Dank, die über Jahre hinweg immer ein offenes Ohr für meine Forschung hatte, nicht zuletzt, weil Sie mir im Schreibzimmer einfach nicht entkommen konnte. Außerdem möchte ich mich bei ihr, Herrn Dr. Christian Lauterbach und Herrn Dr. Stefan Hoth sehr für die Mühen am konfokalen Mikroskop bedanken. Frau Dr. Inga Barth danke ich nicht nur für die Durchführung der Microarray Analysen. Für die alltägliche Hilfe im Labor danke ich vor allem Frau Dr. Andrea Feuerstein, Frau Carola Schröder, Frau Anja Schillinger und Frau Jennifer Tebart, von denen ich viele Kniffe und Tricks lernen durfte. Sehr wichtig waren mir Frau Melanie Volke, die mir durch ihre Arbeit an AtPLT1 einen großen Teil abgenommen hat und die durch ihr wissenschaftliches Gespür viele neue Ideen und Anregungen mitbrachte. Natürlich darf auch Frau Svenja Rademacher nicht fehlen, die schon im Praktikum Wertvolles zum AtPLT Thema beigetragen hat. Weiterhin danke ich allen anderen MPPlern, insbesondere dem Upper Outpost, für die große Hilfsbereitschaft und die angenehme Zeit, auch außerhalb des Labors. Vor allem aber möchte ich Frau Christa Helmers und Frau Angelika Wolf erwähnen, die uns allen das Leben ein wenig einfacher machen! Ein weiterer, ganz besonderer Dank gilt Frau Dr. Christel Krüger, Herrn Dr. Felix Kuphal, Herrn Dr. Dirk Mielenz und vor allem Herrn Dr. Golo Henning, deren wertvolle Tipps und aufmunternden Worte in allen Lebenslagen eine unentbehrliche Hilfe waren. Von ganzem Herzem danke ich Frau Dr. Magda Petenyi für das Halten und das Aushalten. Ein riesengroßes Dankeschön geht an meine Familie, die immer hinter mir standen und mich in allen Entscheidungen stets unterstützt haben. Besonders herzlich möchte ich mich abschließend bei Herrn Hans-Jörg Schindler bedanken, der mit dem richtigen Impuls zum Abschluß dieser Arbeit beigetragen hat.
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Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht: Klepek, Y.S., Geiger, D., Stadler, R., Klebl, F., Landouar-Arsivaud, L., Lemoine, R., Hedrich,
R., and Sauer, N. (2005). Arabidopsis POLYOL TRANSPORTER5, a new member of the
monosaccharide transporter-like superfamily, mediates H+-Symport of numerous substrates,
including myo-inositol, glycerol, and ribose. Plant Cell 17: 204-218.
