Chapter 8. 정제된 DNA 조작 - webbuild.knu.ac.krwebbuild.knu.ac.kr/~app-mic/resources/lecture... · Chapter 8. 정제된DNA 조작 3. Ligation–DNA 분자의결합-ligation:

Chapter 8. 정제된 DNA 조작

- DNA 정제 후 클로닝을 위한 효소적 절단과 연결 필요 -> restriction enzyme, ligase가 중요

1. DNA 조작효소 범위

- 촉매반응에 따라 5 분류

1. Nuclease : 핵산분자의 절단, 단편화

2. Ligase : 핵산분자의 연결

3. Polymerase : DNA 사슬 합성

4. Modifying enzyme : 화학기능기의 첨가, 제거

5. Topoisomerase : closed circle DNA에 supercoiling 도입, 제거

1) Nuclease

- phosphodiester 결합 가수분해

- exonuclease : DNA 분자의 말단에서 nucleotide 하나씩 제거

- endonuclease : DNA 분자 내부에서 절단


☞ nucleases- exonuclease vs endonuclease


☞ exonucleases

- Bal31 :

- 이중가닥의 양가닥 분해

- Alteromonas espejiana

- 생성물 : 짧아진 DNA 단편

- exonuclerase III :

- 이중가닥의 한가닥만 절단

- E. coli

- 생성물 : 한가닥 DNA


☞ endonucleases

- S1 endonuclease

- 한가닥만을 절단

- Aspergillus oryzae

- 생성물 : 짧아진 DNA 단편

- DNase I :

- 한가닥, 이중가닥 분자 모두 절단

- 암소췌장에서 분리

- DNA 내부의 어떠한 phophsdiester 결합도 공격

- mononucleotide, 아주 짧은 oligonucleotide의 혼합물

생성

- 제한효소

- 제한된 숫자의 특별한 인식부위만 절단


2) Ligase

- 불연속의 한가닥 DNA 파손을 복구


3) Polymerase

- primer가 있을 때만 작용

- 네 가지 종류의 polymerase

(1) DNA pol-I

- E. coli

- 짧은 한가닥 지역(혹은 nick)에서

새로운 가닥 합성

- polymerase 와 nuclease의 이중 역할

- 각 활성은 효소분자의 다른 부분에 의해 통제

(2) Klenow fragment

- DNA pol-I의 첫 323 아미노산 제거

- nuclease 활성 없음

- nick 의 채움만 가능

(3) Taq polymerase

- Thermus aquaticus(Thermophilic bacteria)

- PCR에 이용

(4) Reverse transcriptase

- RNA를 template로 이용 상보적 DNA 합성 -> cDNA


4) DNA 변형효소

- 특별한 화학기를 첨거하거나 제거 함으로 DNA 분자를 변형

(1) alkaline phosphatase : DNA 분자의 5’ 말단에 존재하는 인산기 제거

(2) polynucleotide kinase : alkaline phosphatase의 반대역할

(3) terminal deoxynucleotidyl transferase : DNA 분자의 3’말단에 하나 그 이상의 deoxynucleotide 첨가


2. DNA 절단효소들 : restriction enzyme

- 유전자클로닝을 위해 DNA 분자의 정확하고 재현성있는 절단이 필요

- 각 벡터분자는 새로운 DNA 삽입을 위해 하나의 위치에서 절단되어야 함

- 각 벡터분자는 정확하게 같은 위치에서 절단되어야 함

- 클로되는 DNA분자는 대형 DNA 분자로부터 최소한의 크기로 절단되어야 함


1) 제한효소의 발견

- bacteriophage에 면역성을 갖는 bacteria 발견

- phage DNA 복제완료 전 bacteria 가 phage DNA 파괴

- 자신의 DNA에는 절단효소의 활동을 막는 부가적 methylation 존재

- 대부분의 bacteria에 의해 효소생성-> 1200종 이상 발견

- type I, I, III -> type II : 유전자클로닝에 가장 중요


2) Type II 제한효소

- 각 효소는 DNA 분자 절단에 필요한 특별한 recognition sequence (restriction site, RS) 필요

- 대부분 제한효소는 hexanucleotide RS를 인식 -> 4, 5, 8 개로 이루어진 것도 존재

- a family of related sites의 어느 하나의 DNA를 절단하는 경우도 있음 -> HinfI , GANTC


3) Blunt end vs Sticky end

- RS의 이중가닥 절단 -> blunt end 형성

- RS 내 둘 혹은 네개의 nucleotide를 엇갈리게 절단

-> sticky end 형성

- 서로 다른 RS를 가진 제한효소가 동일한 sticky end를

만들 수 있음 -> 서로 다른 DNA 단편이 연결 가능


4) DNA 분자에서 인식 염기배열의 빈도수

- RS는 DNA 분자를 따라 균등한 간격으로

나열돼 있지 않음

- 실험적인 방법으로 숫자를 파악


5) 실험실에서 제한효소에 의한 절단

ex) Bgl II로 λ phage DNA 절단

- 효소활성에 필요한 조건 충족 필요

- pH 7.4

- 이온강도(NaCl 농도)

- Mg+2 : 모든형태의 type II 효소활성에 필수

- 효소안정제 : DTT 등

- 효소에 맞는 buffer용액 사용 필수

- 효소농도 : 처리하려는 DNA 농도에 따라 결정

- 1unit -> 1시간당 1µg DNA 절단에 필요한 양

- 항온온도 : 일반적으로 37℃

- 반응 완료 후 enzyme killing

- 70℃ 가온

- 페놀추출

- EDTA 처리 : Mg+2 이온 chelation


6) 제한효소 절단 결과의 분석

(1) gel electrophoresis에 의한 부자들의 분리

- DNA 상의 음전하를 이용 gel 상에서 전기영동으로 이동

- agarose, polyacryl amide

(2) 젤 상에서 DNA 분자 확인

- EtBr 염색 후 자외선 조사 -> 25ng 이상의 농도에 적당

- 32P 동위원소 이용 film에 노출


☞ 방사성 표지법

- nick translation : DNA Pol I 이용

- 대부분의 정제된 DNA에 절단분자 약간포함

- end-filling 법 : sticky end를 가진 DNA에 표지

- Klenow fragment 이용


7) DNA 분자크기 측정

- 이동거리를 분자량과 연결

D = a – b(logM), D: 이동거리, M: 분자량

- 표준 제한 절단 단편 이용

ex) λphage의 Hind III 절단 -> 8단편으로 절단


8) DNA 분자의 다른 제한부위 위치 확인

- 제한지도를 이용하여 어떤 제한효소가 각 유전자를 포함하는 DNA 단편을 얻을 수 있는가를 확인


3. Ligation –DNA 분자의 결합

- ligation : 벡터분자와 클론DNA의 결합

- 인접하는 두 nucleotide 사이의 phosphodiester 형성

- ligase의 활성기작

- 단가닥 불연속의 복원

- 두 개의 DNA 분자 결합

- 같은 분자의 양끝을 결합

- sticky end는 ligation 효율을 높힘

-> 두 말단의 contact chance가 높아짐

-> blunt end의 경우 고농도 DNA를 사용해야 함


☞ Blunt end 분자의 결합

- 벡터분자 : enzyme에 의한 sticky end 보유 용이

- cloned DNA의 경우 일반적으로 blunt end를 가짐

- blunt end에 sticky end 도입을 위한 방법 3가지

1) Linker 이용

- linker : 알려진 sequence를 갖는 짧은 ds DNA 단편

- linker 내에 restriction site 포함

- ligase를 이용 blunt end에 부착

- cloned DNA 내에 동일 RS를 가질 때는?


2) Adaptor 이용

- adaptor : sticky end를 갖는 짧은 ds DNA 단편

- adaptor 분자 사이의 dimer 형성 -> blunt end 형성

- adaptor 분자의 5’ end를 –OH로 변형

-> ligase에 의한 연결 불가

-> DNA 분자에 adaptor 연결 후

polynucleotide kinase 처리 -> 5’-P로 변형


3) Homopolymer tailing 이용

- terminal transferase : blunt end에 poly(dN) tail 붙임

- 벡터와 DNA에 상보적 tailing 부착

- 두 tailing의 사이즈가 다를 수 있음

- Klenow polymerase -> ligase 처리로 연결

- tail size 20개 이상일 경우 안정한 염기쌍 형성

-> 숙주 내 효소에 의한 연결도 가능

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