4.! สเปกโทรโฟโตมิเตอร

4.1.คำนำ

สเปกโทรโฟโตเมตรีเปนวิธีการวิเคราะหสารโดยวัดปริมาณแสงที่สารนั้นดูดกลืนไว (ในบทนี้จะใชคำวา “แสง” แทนคลื่นแมเหล็กไฟฟา ไมวาจะมีความยาวคลื่นในชวงที่ตามองเห็นหรือไม) เครื่องมือที่เราใชวัดปริมาณการดูดกลืนแสง เรียกวา “สเปกโทรโฟโตมิเตอร” ซึ่งทำงานโดยปลอยลำแสงจากแหลงกำเนิดไปยังสารที่ตองการศึกษา แสงสวนหนึ่งจะถูกสารนั้นดูดกลืนไว ในขณะที่แสงสวนที่เหลือจากการดูดกลืนจะผานออกมา และผานตอไปยังตัวรับสัญญาณของเครื่อง ซึ่งจะวัดปริมาณแสงที่ตกถึง แลวรายงานคาโดยเปรียบเทียบกับปริมาณแสงตั้งตน

ในบทเรียนนี ้ เราจะศึกษาหลักการและขั้นตอนการวัดการดูดกลืนแสงภายใตเงื่อนไขที่เหมาะสม เพ่ือประโยชนทั้งในการวิเคราะหเชิงคุณภาพและเชิงปริมาณ ในฐานะผูใชงาน เราควรทราบวิธีการที่ถูกตองในการวัดการดูดกลืนแสง ตลอดจนทราบวาการนำคาที่วัดไดไปใชประโยชนนั้น มีขอจำกัดหรือเงื่อนไขอยางไรบาง

4.2.สเปกตรัมการดูดกลืนแสง

การดูดกลืนแสงเกิดขึ้นเมื่อโฟตอนซึ่งเปนอนุภาคของแสงไปกระทบโมเลกุลของสารและถายเทพลังงานที่มีอยูใหแกสารนั้น สารชนิดหนึ่งดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นตางๆ กันไดมากนอยไมเทากัน การวัดการดูดกลืนแสงใหมีความไวสูงสุดและคลาดเคลื่อนนอยที่สุด ตองใชแสงที่มีความยาวคลื่นเพียงคาเดียว โดยเปนความยาวคลื่นที่สารนั้นสามารถดูดกลืนไดดีที่สุด

V 0.2

รูป 4.1 สเปกตรัมการดูดกลืนแสงของดีเอ็นเอและโปรตีนชีวโมเลกุลทั้งสองชนิดสามารถดูดกลืนแสงไดดีที่สุดที่ความยาวคลื่นตางกันแมจะอยูในชวงเหนือมวง (อัลตราไวโอเลต) เชนเดียวกัน นอกจากนั้นความสามารถในการดูดกลืนแสงยังไมเทากันแมจะกำหนดใหมีจำนวนโมลของสารเทากัน โดยดีเอ็นเอ (calf thymus DNA) สามารถดูดแสงเหนือมวงที่ความยาวคลื่น 260 นาโนเมตรไดมากกวาโปรตีนดูดแสงที่ความยาวคลื่น 280 นาโนเมตร โดยที่คาการดูดกลืนแสงบนแกนตั้งแบงเปนชองละเทาๆ กัน (linear axis)

สเปกตรัมดูดกลืน (absorption spectrum) ของสารชนิดหนึ่ง หมายถึงกราฟที่แสดงคาการดูดกลืนแสงของสารชนิดนั้นที่ความยาวคลื่นชวงหนึ่ง ขอมูลสำคัญที่เราไดจากสเปกตรัมดูดกลืน คือ ความยาวคลื่นที่สารชนิดหนึ่งสามารถดูดกลืนแสงไดมากที่สุด คาความยาวคลื่นนี้เขียนแทนดวย

λmax (อานวา แลมบดาแม็กซ หรือ แลมบดาซับแม็กซ) นิยมแสดงดวยหนวยเปนนาโนเมตร (1 nm

เทากับ 10-9 m) แลมบดาแม็กซเปนคาคงที่ ขึ้นกับชนิดของสาร

รูปที่ 4.1 แสดงสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของดีเอ็นเอและโปรตีน บนแกนตั้งของกราฟ แสดงปริมาณการดูดกลืนแสงโดยไมระบุรายละเอียด แตสามารถเปรียบเทียบคาที่พล็อตบนแกนได เมื่อพิจารณาสเปกตรัมของโปรตีนที่อยูดานลาง ในชวงความยาวคลื่น 200 ถึง 300 นาโนเมตร ซึ่งเปนชวง “เหนือมวง” หรือ “อัลตราไวโอเลต” (ultraviolet) ที่มีความยาวคลื่นสั้นกวาความยาวคลื่นของแสงที่มองเห็นไดเพียงเล็กนอย จะพบวาความยาวคลื่นที่วัดการดูดกลืนแสงไดสูงสุดคือ 280 นาโนเมตร อันเปนผลมาจากการดูดกลืนแสงของทริปโตเฟน (tryptophan) ซึ่งเปนกรดอะมิโนชนิดหนึ่งที่พบในโปรตีนทั่วไป

2

รูป 4.2 วงลอสีของแสงแมสีของแสง มีที่มาจากเซลลรับแสงชนิดโคน (cone) ในเรตินา ซึ่งไวตอสีแดง เขียว และน้ำเงิน ถาฉายแสงสีแดงกับแสงสีเขียวลงบนฉากขาว เราจะเห็นเปนสีเหลือง ถาฉายแสงสีเขียวกับแสงสีน้ำเงินลงไปซอนกันบนฉากขาว เราจะเห็นเปนสีน้ำเงินแกมเขียว หรือเขียวแกมน้ำเงิน (cyan) แตถาเราฉายแสงสีน้ำเงินกับแสงสีแดงลงไปบนฉากขาว เราจะเห็นเปนสีมวงแดง (magenta)

โปรตีนและกรดนิวคลีอิกเปนชีวโมเลกุลขนาดใหญที่ดูดกลืนแสงในชวงอัลตราไวโอเลตซึ่งอยูนอกชวงความยาวคลื่นของแสงที่มองเห็นไดดวยตาเปลา สารละลายของชีวโมเลกุลเหลานี้จึงไมมีสี สารละลายของสารอื่นที่มีสีก็เพราะดูดกลืนแสงในชวงความยาวคลื่นของแสงที่มองเห็นได คือตั้งแต 400 ถึง 700 นาโนเมตร เชน สารละลายดางทับทิมดูดกลืนแสงที่มีความยาวคลื่น 525 นาโนเมตร ซึ่งมีสีเขียว ไดดีที่สุด เหตุที่สารละลายดางทับทิมปรากฎเปนสีมวง ก็เนื่องมาจากแสงสีเขียวถูกดูดกลืน ทำใหเหลือเพียงแสงสีน้ำเงินและแสงสีแดงในสัดสวนเทากัน เมื่อผสมกันจึงทำใหตาคนเรามองเห็นเปนสีมวง (magenta) ดังแสดงในวงลอสีของแสงในรูปที ่4.2 ตามหลักการนี้ถือวาแมสีของแสงม ี3 สี คือ แดง เขียว และน้ำเงิน ซึ่งแทนดวยวงกลมในรูป แสงปกติเชนแสงอาทิตยที่เราเห็นเปนสีขาวเปนผลมาจากแมสีของแสงทั้งสามสีผสมกันอยูในปริมาณเทา ๆ กัน เมื่อใดที่เราดึงแสงสี หนึ่งสีใดหรือแสงสองสีออกไป แสงที่เหลืออยูจึงปรากฎใหเห็นเปนสี

นอกเหนือไปจากการดูดกลืนแสงแลว ยังมีปรากฎการณใกลเคียงที่ควรทราบ คือ การวาวแสง (fluorescence) ซึ่งเกิดเมื่อโมเลกุลของสารซึ่งไดรับพลังงานไปจากโฟตอน ถายทอดพลังงานบางสวนกลับคืนออกมาในรูปของแสงที่มีความยาวคลื่นยาวกวาแสงที่ถูกดูดกลืนไปในตอนตน สารที่มีคุณสมบัติวาวแสงไมเหมาะจะนำมาใชในการวิเคราะหดวยวิธีวัดการดูดกลืนแสง เนื่องจากการวาวแสงจะไปรบกวนการวัดความเขมของแสงที่ตกถึงตัวรับสัญญาณ ยกเวนถาใชเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอรชนิดพิเศษ ที่สามารถปรับเลือกความยาวคลื่นได ทั้งของแสงขาเขา ซึ่งสองเขาไปยังสาร

3

รูป 4.3 แผนภาพการวัดการดูดกลืนแสง

เมื่อแสงที่มีความเขมคาหนึ่ง ซึ่งแสดงดวยขนาดของลูกศร ( I0 ) เดินทางผานสารละลายเปน

ระยะทางหนึ่ง ( l ) แสงสวนหนึ่งจะถูกดูดกลืนไว ทำใหแสงที่ผานออกมาและตรวจวัดได มีความ

เขมของแสงลดลง ( I )

ตัวอยางที่อยูในคิวเว็ตต (cuvette) และของแสงขาออก ซึ่งผานออกมาจากคิวเว็ตต โดยจะตองตั้งคาความยาวคลื่นทั้งของแสงขาเขาและขาออกใหตรงกัน

4.3.ปริมาณการดูดกลืนแสง

เมื่อเราวัดการดูดกลืนแสงดวยเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร ปริมาณที่วัดไดจะมีสองคา คือความเขมของแสงที่ผานไปถึงตัวรับสัญญาณ (I ) ซึ่งจะมีคามากหรือนอยขึ้นกับวาแสงถูกดูดกลืน

ไปเทาใด และความเขมของแสงตั้งตน ( I0 ) ซึ่งมีคาคงที่ ดังแสดงในรูปที่ 4.3

ปริมาณความเขมแสงชนิดแรกที่เราใชรายงานการดูดกลืนแสง คือ อัตราสวนของความเขมแสงที่เหลือจากการดูดกลืน ( I ) ตอความเขมแสงตั้งตน ( I0 ) อัตราสวนนี้เรียกวา ความสงผาน หรือ

ทรานสมิตแตนซ (transmittance, T ) ซึ่งมีคาอยูระหวาง 0 กับ 1 โดยที่

Z T = II0

Z (4-1)

ในความเปนจริง เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรจะรายงานคานี้เปนรอยละของการสงผาน หรือ เปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซ (percent transmittance, %T ) โดยที่

Z %T =T ×100 หนวยเปน % Z (4-2)

4

นอกจากนี ้ เรายังนิยมใชสวนกลับของอัตราสวนขางตนในการรายงานคาการดูดกลืนแสงอีกดวย อัตราสวนนี้ไดจากการนำปริมาณแสงตั้งตน (I0 ) ไปหารดวยปริมาณแสงที่เหลือผานไปถึงรับ

สัญญาณ ( I ) ในทางปฏิบัต ิ เราไมนิยมแสดงปริมาณการดูดกลืนแสงดวยอัตราสวนนี้โดยตรง แต

จะใชคาลอการิทึมฐานสิบของอัตราสวนนี้แทน คาลอการิทึมที่ไดเรียกวา แอบซอรแบนซ (absorbance, A ) โดยที่

Z A = log10I0IZ (4-3)

โดยเมื่อพิจารณาสมการ (4.1), (4.2) และ (4.3) จะเห็นไดวา

Z A = - logT = log10100%T

= 2 − log10 %T Z (4-4)

ในการใชสัญลักษณแทนคาแอบซอรแบนซ นิยมระบุความยาวคลื่นของแสงที่ใชวัดกำกับไวดวยเพ่ือใหเกิดความชัดเจน เชน A260 หมายถึง คาแอบซอรแบนซที่วัดไดเมื่อใชแสงที่มีความยาว

260 นาโนเมตร เปนตน

เมื่อแทนคา II0= T จากสมการ (4-1) เขาในสมการที่ (4-3) แลวทำ antilog สมการ (4-3)

ทั้งสองขาง เราจะเห็นไดวาทรานสมิตแตนซมีความสัมพันธกับแอบซอรแบนซดังนี้

Z T =10-A Z (4-5)

4.4.กฎของเบียร

เราไดทราบแลววาความสามารถของสารในการดูดกลืนแสงจะขึ้นกับความยาวคลื่น ตอไปเราจะพิจารณาวา ณ ความยาวคลื่นคาหนึ่งนั้น การดูดกลืนแสงกับปริมาณของสารมีความสัมพันธกันอยางไร

กฎของเบียร (Beer’s Law) เปนหลักการที่อธิบายความสามารถในการดูดกลืนแสงของสาร มีสาระสำคัญคือ คาแอบซอรแบนซแปรผันโดยตรงกับปริมาณของสารที่แสงมีปฏิสัมพันธดวย ทั้งนี้มีเงื่อนไขวาแสงนั้นตองเปนแสงเอกรงค (มีความยาวคลื่นคาเดียว)

5

กฎของเบียรเรียกอยางเต็มยศวา กฎของเบียร-แลมเบิรต (Beer-Lambert Law) หรือ

กฎของแลมเบิรต-เบียร (Lambert-Beer Law) หรือกฎของเบียร-แลมเบิรต-บูแกร (Beer-Lambert-

Bougeur Law) เนื่องจากสมการนี้มีประวัติการพัฒนาอันยาวนาน โดยเมื่อ ค.ศ. 1729 โจฮานน

ไฮนริช แลมเบิรด (Johann Heinrich Lambert) อางอิงงานของปแอร บูแกร (Pierre Bouguer นัก

ฟสิกสและคณิตศาสตรฝรั่งเศส) วาเมื่อความเขมขนของสารคงที ่ จะไดความสัมพันธสองขอคือ

หนึ่ง ความเขมแสงที่ถูกดูดกลืนขึ้นกับชนิดของสาร ความยาวคลื่น และความหนาของสาร สอง มี

ความสัมพันธแบบเลขชี้กำลัง (exponential) ระหวางความเขมของแสงที่สงผานกับความหนาของ

สาร ตอมาใน ค.ศ. 1852 ออกัส เบียร (August Beer) ไดเพิ่มความสัมพันธที่ความหนาคงที่ วา

สัมประสิทธิ์ของการดูดกลืนแสงขึ้นกับความเขมขนของสาร

การที่แสงจะมีปฏิสัมพันธกับอนุภาคของสาร ซึ่งนำไปสูการถายทอดพลังงานใหแกสารไดมากหรือนอย ยอมขึ้นกับวาบนเสนทางที่แสงเดินทางผาน แสงมีโอกาสกระทบกับอนุภาคของสารนั้นมากหรือนอยเพียงใด ปจจัยหลักที่เก่ียวของจึงมีอยูสองประการ คือ ความเขมขนของสารซึ่งเปนจำนวนอนุภาคตอหนึ่งหนวยปริมาตร และระยะทางที่แสงเดินทางผานไปในหมูอนุภาคนั้น กฎของเบียรกลาววา การดูดกลืนแสงซึ่งวัดและรายงานเปนคาแอบซอรแบนซแปรผันโดยตรงกับปริมาณทั้งสองนี้

Z แอบซอรแบนซ ∝ (ความเขมขน) X (ระยะผานของแสง)Z (4-6)

ถาเราใชสัญลักษณ c แทนความเขมขนของสารที่ดูดกลืนแสง มีหนวยเปนโมลตอลิตร

(mol • L−1) หรือโมลาร (M ) และกำหนดใหระยะทางที่แสงเดินทางผานสารละลายมีคาคงที่

เทากับเสนผาศูนยกลางภายใน (หรือความกวางตามแนวที่แสงผาน) ของภาชนะที่ใชบรรจุสารละลายซึ่งเรียกวา คิวเวตต (cuvette) หรือเซลล (cell) และแทนระยะทางนี้ดวยสัญลักษณ l

มีหนวยเปนเซนติเมตร (cm ) แลว เราจะสามารถแสดงความสัมพันธที่เปนไปตามกฎของเบียรในรูป

ของสมการไดวา

Z A = εcl Z (4-7)

โดยให ε (เอปสิลอน) เปนคาคงที่สำหรับความสัมพันธแบบแปรผันโดยตรง (proportionality

constant)

6

ถาเราแทนคา A จากสมการที่ (4-7) ลงในสมการที่ (4-5) จะไดความสัมพันธ

Z T =10-εcl Z (4-8)

และเมื่อแทนคา T จากสมการ (4-8) เขาในสมการที่ (4-2) ก็จะไดความสัมพันธ

Z %T =10-εcl × 100 หนวยเปน % Z (4-9)

Zเอปสิลอนเปนสัญลักษณที่ใชแทนคาสภาพดูดกลืนแบบโมลาร หรือ โมลารแอบซอรพทิวิต ี (molar absorptivity) หรือที่สมัยกอนเรียกวา โมลาร เอ็กซติงชัน โคอิฟเชียน (molar extinction coefficient) มีหนวยเปน M −1cm−1 เนื่องจากแอบซอรแบนซซึ่งเปนคาลอการิทึมไมมีหนวย หนวย

ของโมลารแอบซอรพทิวิตี จึงเปนสวนกลับของความเขมขน (c ซึ่งมีหนวยเปน M ) และระยะทาง (l

ซึ่งมีหนวยเปน cm)

Zโมลารแอบซอรพทิวิตีเปนคาสัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสงที่อิงกับโมลาริตี ในการแสดงสัมประสิทธ์ิการดูดกลืนแสงที่อางอิงกับความเขมขนในระบบอื่น เรานิยมใชสัญลักษณที่แตกตางออกไปจาก ε เพ่ือใหเกิดความชัดเจน เชน ในกรณีที่บอกความเขมขนของสารในหนวยเปอรเซ็นต

โดยมวลตอปริมาตร (percent by weight per volume, %w/v) นิยมใชสัญลักษณ E1cm1% ซึ่งเปนคา

แอบซอรแบนซของสารละลายความเขมขนเทากับ 1%w/v เมื่อวัดในเซลลขนาด 1 เซนติเมตร

Zสมการที ่ (4-7) และ (4-8) แสดงความสัมพันธระหวางการดูดกลืนแสงกับตัวแปรสำคัญ คือ ความเขมขนและระยะทาง ซึ่งเปนไปตามกฎของเบียร แตในทางปฏิบัติเรามักกำหนดใหตัวแปรตัวใดตัวหนึ่งมีคาคงที่ แลวจึงวัดแอบซอรแบนซหรือคาเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซซึ่งเปนเปลี่ยนแปลงไปตามคาของตัวแปรที่เหลือ

Zกราฟในรูปที ่ 4.4 แสดงการดูดกลืนแสงที่วัดไดซึ่งผันแปรไปตามระยะทางที่แสงเดินทางผานโดยความเขมขนคงที ่ จะเห็นไดวากราฟของเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซเปนเสนโคงแบบเลขชี้กำลัง (exponential) ในขณะที่กราฟของแอบซอรแบนซเปนเสนตรง ซึ่งนำไปใชประโยชไดสะดวกกวา

7

รูป 4.4 ความสัมพันธระหวางการดูดกลืนแสงกับระยะทาง ซึ่งเปนไปตามกฎของเบียรภาพบน (ก) แสดงความสัมพันธระหวางเปอรเซนตทรานสมิตแตนซ (%T) กับระยะทาง (l) สวนภาพลาง (ข) แสดงความสัมพันธระหวางแอบซอรแบนซ (A) กับระยะทาง

4.5.ความสำคัญของคาโมลารแอบซอรพทิวิตี

โมลารแอบซอรพทิวิตีบอกถึงความสามารถในการดูดกลืนแสง ซึ่งเปนสมบัติเฉพาะของสารชนิดหนึ่งๆ ณ ความยาวคลื่นคาหนึ่ง และจะไมเปลี่ยนแปลงตราบเทาที่เราควบคุมสภาวะแวดลอม เชน pH ของสารละลาย ชนิดของตัวทำละลาย และอุณหภูมิ ใหคงที ่ โมลารแอบซอรพทิวิตีชวยใหเราหาความเขมขนของสารจากแอบซอรแบนซไดอยางงายดาย

โดยหลักการแลว หากเราทราบคาโมลารแอบซอรพทิวิตีของสารชนิดหนึ่งที่ความยาวคลื่นหนึ่ง เราก็สามารถหาความเขมขนของสารนั้น โดยวัดคาแอบซอรแบนซของสารนั้นที่ความยาวคลื่นนั้น แลวหาความเขมขนจากสมการ (4-7)

8

Z c = Aεl

Z (4-10)

ในทางปฏิบัติ เรามักจะเริ่มตนดวยการสรางกราฟแสดงความสัมพันธระหวางแอบซอรแบนซที่วัดไดกับความเขมขนของสารที่ทราบคาแนนอน กราฟนี้มีลักษณะเหมือนกราฟในรูปที ่ 4.4 ข. เรียกวากราฟมาตรฐาน (standard curve หรือ calibration curve) จากนั้นจึงหาโมลารแอบซอรพทิวิตี จากความชันของกราฟ ซึ่งมีคาเทากับผลคูณของโมลารแอบซอรพทิวิตีกับระยะทาง (εl ) แต

เนื่องจากเสนผาศูนยกลาง (หรือความกวาง) l ของคิวเวตตมาตรฐานมีคา 1 เซนติเมตร จึงดูเสมือน

กับวาโมลารแอบซอรพทิวิตีมีคาตัวเลขเทากับความชัน (slope) ของกราฟมาตรฐาน เพียงแตตองเพ่ิม

cm-1 ตอทายหนวยของ ε เปน M −1cm−1 เทานั้น

Zε = slope of standard curvel

มีหนวยเปน

1Mcm

หรือ M -1cm-1 Z (4-11)

อันที่จริง แทนที่เราจะตองสรางกราฟมาตรฐานขึ้นเอง เราอาจจะใชคาโมลารแอบซอรพทิวิตี ตามทฤษฎี หรือที่มีผูทำการทดลองและตีพิมพไวกอนแลวก็ได แตมีเงื่อนไขวาเราตองควบคุมปจจัยแวดลอมในการวัดใหเหมือนกับปจจัยแวดลอมที่ใชในการหาคาโมลารแอบซอรพทิวิตีนั้นดวย ในทางปฏิบัต ิ เนื่องจากการควบคุมดังกลาวทำไดยาก เราจึงนิยมหาคาโมลารแอบซอรพทิวิตีภายใตเงื่อนไขในการวัดแตละครั้ง และนำไปใชหาปริมาณสารเฉพาะในคราวนั้น

อยางไรก็ด ี คาโมลารแอบซอรพทิวิตีตามทฤษฎี หรือคาที่มีการรายงานไวก็ยังมีประโยชน เพราะชวยใหทราบวาเราตองการใชสารในปริมาณขั้นต่ำเทาใดจึงจะสามารถวัดแอบซอรแบนซไดนาเชื่อถือ เราสามารถวัดการดูดกลืนแสงของสารที่มีโมลารแอบซอรพทิวิตีสูงใหมีความแมนยำไดสะดวกกวาสารที่มีโมลารแอบซอรพทิวิตีต่ำ

สมมติวาเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรที่เราใชสามารถวัดแอบซอรแบนซไดแมนยำเฉพาะในชวง 0.1 – 1 และเรามีสารนี้ในปริมาณจำกัด เชน สามารถเตรียมสาร 1 มิลลิโมลารได 3 มิลลิลิตร ซึ่งเปนปริมาตรขั้นต่ำ หากเราใชเซลลซึ่งมีเสนผาศูนยกลางภายในเทากับ 1 เซนติเมตรในการวัด เราสามารถคำนวณไดวา สารนี้ควรมีโมลารแอบซอรพทิวิตีขั้นต่ำเปนเทาใด จึงจะวัดคาไดแมนยำโดยหาโมลารแอบซอรพทิวิตีจากสมการที่ (4-7)

Z ε = AclZ (4-12)

9

เมื่อแทนคา A = 0.1 , c = 0.001M และ l = 1cm ลงในสมการ (4-12) จะไดคำตอบวา สารนี้ควร

มีโมลารแอบซอรพทิวิตีไมนอยกวา 100 M-1 cm-1 จึงจะวัดแอบซอรแบนซไดประมาณ 0.1 ซึ่งเปนคาแอบซอรแบนซขั้นต่ำสำหรับการวัดที่นาเชื่อถือ (ในหัวขอ 4.7 เราจะไดเห็นวา ถาแอบซอรแบนซมีคานอยกวา 0.1 หมายความวาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของคาความเขมขนที่อานไดจากกราฟมาตรฐานจะมีคาสูงกวารอยละ 2.5 ซึ่งเริ่มจะไมเปนที่พึงประสงคสำหรับการวัดที่ตองการความนาเชื่อถือ)

4.6.การเบี่ยงเบนจากกฎของเบียร

การเบี่ยงเบนจากกฎของเบียร หมายถึงปรากฎการณที่เกิดขึ้นเมื่อคาการดูดกลืนแสงที่วัดไดไมสัมพันธกับความเขมขนหรือระยะทางที่แสงเดินทางผานในลักษณะที่ควรจะเปน กลาวคือ ไมเปนเสนตรงในกรณีที่วัดการดูดกลืนแสงดวยคาแอบซอรแบนซ หรือไมเปนเสนโคงแบบเลขชี้กำลัง (exponential) ในกรณีที่วัดการดูดกลืนแสงดวยคาเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซ รูปที ่ 4.5 แสดงใหเห็นการเบี่ยงเบนในทางลบ แตโดยทั่วไปการเบี่ยงเบนอาจเกิดไดทั้งในทางลบและทางบวก

สาเหตุที่ทำใหเกิดการเบี่ยงเบนจากกฎของเบียรสามารถจำแนกไดโดยสังเขป ดังนี้

4.6.1. ขีดจำกัดของเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร

การเบี่ยงเบนจากกฎของเบียรซึ่งเก่ียวของกับขีดจำกัดของเครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร มักจะมีที่มาจากสองกรณีไดแก แสงที่ใหสารดูดกลืนนั้นประกอบดวยความยาวคลื่นมากกวาหนึ่งคา (polychromaticity) หรือมีแสงสวนเกินสะทอนหรือรั่วผานไปถึงตัวรับสัญญาณ (stray lights)

ขีดจำกัดในกรณีแรกเปนเรื่องปกติของเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรทั่วไป คือการขาดความสามารถในการจำแนกแสงจากแหลงกำเนิดไดละเอียดจนมีคาความยาวคลื่นเพียงคาเดียวได แสงที่เดินทางผานไปถึงสารละลายจึงไมใชแสงเอกรงค (monochromatic light) ซึ่งมีความยาวคลื่นเพียงคาเดียวตามทฤษฎี แตเปนแสงตลอดชวงความยาวคลื่นชวงหนึ่ง (โดยทั่วไปเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรราคาถูกมีปญหาการจำแนกความยาวคลื่นมากกวาเครื่องราคาแพง) ทำใหคาแอบซอรแบนซ ที่วัดไดมีคาสูงหรือต่ำไปจากคาที่ควรเปน และเกิดการเบี่ยงเบนขึ้นในทางบวกหรือทางลบ

สำหรับแสงสวนเกินซึ่งสะทอนไปถึงตัวรับสัญญาณนั้น ทำใหเกิดการเบี่ยงเบนจากกฎของเบียร โดยทำใหอานคาแอบซอรแบนซไดนอยกวาที่ควรเปน เนื่องจากแสงสวนนี้ไมไดเกิดจากการดูดกลืนแสง แตผานไปถึงตัวรับสัญญาณซึ่งจะอานคารวมไปกับแสงสวนที่เหลือจากการดูดกลืนแสง จึงเปนเหตุใหเกิดการเบี่ยงเบนในทางลบได ปญหาแสงสวนเกินี้จะพบมากเวลาใชแสงที่ความยาวคลื่นใกลกับขีดจำกัดที่เครื่องนั้นจะสามารถใหกำเนิดได หรือไมก็เกิดจากแสงภายนอกที่รั่ว

10

เขาไปถึงตัวรับสัญญาณ เชนในขณะที่วัดการดูดกลืนแสงโดยลืมปดฝาสีดำบนตัวเครื่องที่ครอบหลอดคิวเวตตไวใหสนิท

การเบี่ยงเบนที่เกิดจากขีดจำกัดของเครื่องมือทั้งสองกรณีขางตนนี้เปนปจจัยภายนอก ไมขึ้นกับสารที่วัด เรามีวิธีตรวจสอบวาเกิดการเบี่ยงเบนในลักษณะดังกลาวหรือไม โดยดูจากกราฟที่แสดงความสัมพันธระหวางคาแอบซอรแบนซกับระยะทาง โดยใหความเขมขนคงที ่ (กราฟ ข. ในรูปที่ 4.4) ถากราฟที่ไดเปนเสนตรงก็สามารถสรุปไดวา เครื่องมือที่เราใชวัดนั้นทำงานไดตามปกต ิ และการวัดของเรายังอยูภายในขอบเขตที่เครื่องมือวัดทำงานไดดี

4.6.2. สมดุลยเคมี

ภายใตสภาวะที่พอเหมาะ สารบางชนิดสามารถเกิดปฏิกิริยาเคมีซึ่งนำไปสูการเบี่ยงเบนจากกฎของเบียรได เชน การแตกตัว (dissociation) การรวมตัว (association) การเกิดสารประกอบเชิงซอน (complex formation) หรือการเกิดพอลิเมอร (polymerization)

Zปฏิกิริยาเหลานี้ลวนเกี่ยวของกับสถานะของสารมากกวาหนึ่งสถานะ และสารในแตละสถานะก็อาจมีความสามารถในการดูดกลืนแสงไดไมเทากัน ปริมาณสารในแตละสถานะนั้นจะมากหรือนอยเพียงใดยอมขึ้นกับคาคงที่สมดุล (equilibrium constant) ของปฏิกิริยา แตเมื่อความเขมขนของสารเปลี่ยนแปลงไป หรือเมื่อเงื่อนไขที่มีอิทธิพลตอสมดุลเคม ี เชน คา pH เปลี่ยนแปลงไป สัดสวนของสารในสถานะตาง ๆ เหลานี้จะเปลี่ยนแปลงตามไปดวย ทำใหคาการดูดกลืนแสงที่วัดไดไมสอดคลองกับคาที่ควรจะเปน

4.6.3. ความเขมขนสูง

ในการอธิบายความสัมพันธระหวางการดูดกลืนแสงที่เราวัดไดกับปริมาณสารโดยใชกฎของเบียรนั้น เราใชสมมติฐานวาการดูดกลืนแสงนั้นขึ้นกับปจจัยหลักเพียงสามประการ คือ ความเขมขนของสาร ระยะทางที่แสงเดินทางผาน และคาโมลารแอพซอรทิวิต ี สวนปจจัยอื่น เชน อุณหภูมิ ตัวทำละลาย ฯลฯ นั้นเราถือวาไมมีผลโดยตรง เนื่องจากมีคาคงที่ตลอดการวัด

อยางไรก็ดี เมื่อสารละลายมีความเขมขนสูง ปจจัยประการหนึ่งซึ่งจะเริ่มมีคาไมคงที ่ คือ ดัชนีหักเหแสง (refractive index) ของสารละลาย ย่ิงความเขมขนสูงก็จะทำใหวัดคาแอบซอรแบนซไดนอยกวาที่ควรเปนและเกิดเปนการเบี่ยงเบนในทางลบ การหลีกเลี่ยงสามารถทำไดโดยใชสารละลายที่มีความเขมขนนอยกวา 0.01 โมลารในการวัด นอกจากนี ้ เรายังสามารถเลือกใชชวงความเขมขนที่เหมาะสมไดโดยดูจากกราฟมาตรฐานระหวางคาแอบซอรแบนซกับความเขมขน โดยชวงที่เหมาะสมนั้น คือ ชวงความเขมขนที่ใหกราฟเปนเสนตรง

11

รูป 4.5 การเบี่ยงเบนจากกฎของเบียรคาที่วัดไดจริงแสดงโดยเสนประ เปรียบเทียบกับคาที่ควรวัดไดหากความสัมพันธเปนไปตามกฎ ซึ่งแสดงดวยเสนทึบ

การเบี่ยงเบนจากกฎของเบียรเปนสาเหตุหลักที่อาจกอใหเกิดความผิดพลาดขึ้นในการวัดคาแอบซอรแบนซ นอกจากนี้ยังมีปจจัยอื่นที่ลวนมีผลกระทบตอคาการดูดกลืนแสงที่เราวัดได เราสามารถหลีกเลี ่ยงผลอันไมพึงปรารถนานี้ไดโดยการวัดแอบซอรแบนซของสารละลายที่มีองคประกอบทุกอยางเหมือนกับสารละลายที่เราตองการวัดยกเวนสารที่เราสนใจ สารละลายนี้เรียกวา แบลงก (blank) เมื่อเราวัดการดูดกลืนแสงของสารที่เราสนใจไดแลว จึงนำคาที่ไดนั้นมาลบออกดวยคาการดูดกลืนแสงของแบลงกที่ความยาวคลื่นเดียวกัน ก็จะไดคาการดูดกลืนแสงที่เปนผลมาจากสารที่เราสนใจเทานั้น ตัวอยางเชน ในการวัดการดูดกลืนแสงของสารละลายดางทับทิม การที่เราใชน้ำกลั่นเปนแบลงกแลวนำคาที่วัดไดไปหักลบออกจากคาการดูดกลืนแสงของสารละลายดางทับทิมในน้ำกลั่นก็เพ่ือหักคาการดูดกลืนแสงของน้ำกลั่นออกไป เหลือแตคาการดูดกลืนแสงของดางทับทิมลวนๆ (ที่แตกตัวอยูในรูปของสารละลายในน้ำ) เทานั้น

สิ่งสำคัญประการสุดทายที่ผูศึกษาควรใสใจ คือ การศึกษาใหเขาใจหลักการทำงานของเครื่องมือตลอดจนปฏิบัติตามขั้นตอนการใชงานที่ผูผลิตเครื่องมือนั้นแนะนำไวอยางเครงครัด เพ่ือหลีกเลี่ยงเงื่อนไขที่อาจกอใหเกิดการเบี่ยงเบน หรือเกิดความผิดพลาดอื่น ๆ ในการวัดได

4.7.ความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขน

ความคลาดเคลื่อน (error) ในสวนของคาความเขมขนที่เราไดมาดวยวิธีวัดการดูดกลืนแสงนั้นจะมีมากหรือนอยเพียงใด ยอมขึ้นกับความคลาดเคลื่อนของคาแอบซอรแบนซที่เราวัด

12

ความคลาดเคลื่อนในการลากเสนตรงผานจุดขอมูลในกราฟมาตรฐานซึ่งจะมีผลตอคาความชัน และคาโมลารแอพซอรทิวิตี (ε ) ตามลำดับ

ในปฏิบัติการนี ้ เราจะพิจารณาเฉพาะความคลาดเคลื่อนอันเนื่องมาจากการวัดแอบซอรแบนซ โดยเราจะเรียกความคลาดเคลื่อนของตัวแปรตัวใดตัวหนึ่งวาความคลาดเคลื่อนสัมบูรณ ซึ่งมีหนวยเดียวกับตัวแปรนั้น ในที่นี้เราจะสมมุติให dc เปนความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของความเขมขนที่

อานไดจากกราฟมาตรฐาน (ใชหนวยตาม c คือโมลตอลิตรหรือโมลาร) นอกจากนั้น เราจะสมมุติให

dA เปนความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของแอบซอรแบนซที่อานไดจากเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร (ใช

หนวยตาม A คือไมมีหนวย) และให dT เปนความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของทรานสมิตแตนซที่อาน

ไดจากเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรเชนกัน (ใชหนวยตาม T คือไมมีหนวย) แลวถาเราหารคา

ความคลาดเคลื่อนสัมบูรณนี้ดวยตัวแปรของมันเอง ผลที่ไดเรียกวาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธ ในที่นี้

เราจึงเรียก dcc

วาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขน เรียก dAA

วาความคลาดเคลื่อน

สัมพัทธของแอบซอรแบนซ และเรียก dTT

วาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของทรานสมิตแตนซ

โปรดสังเกตวาความคลาดเคลื่อนสัมบูรณมีหนวยเหมือนตัวแปรของมัน แตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธไมมีหนวย

เมื่อนิยามความคลาดเคลื่อนสัมบูรณและความคลาดเคลื่อนสัมพัทธแลว ก็ไมเปนเรื่องยาก ที่จะพิสูจนความสัมพันธระหวางความคลาดเคลื่อนสัมพัทธทั้งสาม จนไดออกมาเปนสมการแมบทของความคลาดเคลื่อนวา

Zdcc= dA

A= −

1lnT

dTT

Z (4-13)

สมการ (4-13) แสดงใหเห็นวา ความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนที่อานไดจากกราฟมาตรฐาน มีคาเทากับความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของแอบซอรแบนซที่วัดไดจากเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร และยังมีคาผกผันกับลบลอการิธึมธรรมชาติของทรานสมิตแตนซ คูณกับความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของทรานสมิตแตนซอีกดวย

เราอาจจะคาดเดารูปรางของความสัมพันธไดกอนที่จะนำสมการที ่ (4-13) ไปวาดเปนกราฟดู

จริงๆ ดวยการพิจารณาพจนขวามือสุด ซึ่งเปนผลคูณระหวาง - 1lnT

กับ dTT

ในชวง 0 ≤ T ≤ 1 จะ

พบวา

13

รูป 4.6 ความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนแสดงความสัมพันธระหวางเปอรเซนตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนกับแอบซอรแบนซ (ก) และกับเปอรเซนตทรานสมิตแตนซ (ข)

- 1lnT

มีคาเพ่ิมขึ้นตามT โดยเพ่ิมขึ้นชาๆ เมื่อ T มีคานอย แตเพ่ิมขึ้นเร็ว เมื่อ T มีคามาก

dTT

มีคาลดลงสวนทางกับ T โดยลดลงเร็วเมื่อ T มีคานอย แตลดลงชาเมื่อ T มีคามาก

ดังนั้น ผลคูณของ - 1lnT

กับ dTT

ซึ่งก็คือกราฟของ dcc

ไมวาแกนนอนของกราฟจะเปน A

ดังแสดงไวในรูปที่ 4.6 ก หรือแกนนอนของกราฟจะเปน T หรือ %T ดังแสดงไวในรูปที่ 4.6 ข

ก็ตาม จึงลดลงอยางรวดเร็วเมื่อ A มีคานอย (dTT

ชนะ- 1lnT

) และเพ่ิมขึ้นอยางรวดเร็วเมื่อ A มี

คามาก (- 1lnT

ชนะdTT

) ทำใหกราฟความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนที่อานไดจากกราฟ

มาตรฐาน มีรูปทรงเปนรูปกระทะหงาย หรือที่ฝรั่งเรียกวารูปตัวยู (U)

ในทางทฤษฎี เราสามารถคำนวณ ตำแหนงของกนกระทะไดจากสมการที่ (4-13) โดยอาศัยหลักการวา ที่จุดต่ำสุดของกราฟ ความชัน (slope) ของกราฟเมื่อแกนนอนเปน T จะตองเทากับศูนย

Z

ddT(T ilnT ) = 0

T 1T

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟+ lnT = 1+ lnT = 0

lnT = −1

Z

14

Z T = e−1 = 12.71

= 0.368 Z (4-14)

แทนคา T จากสมการ (4-14) ลงในสมการ (4-5) จะได

Z A = - log(0.368) = 0.434 Z (4-15)

ดังนั้น การที่เราวัดแอบซอรแบนซของสารตัวอยางไดคาอยูบนกราฟมาตรฐาน (เชนระหวาง 0.1 ถึง 1.0) ไมไดเปนการรับประกันวาความคลาดเคลื่อนของความเขมขนที่อานไดจากกราฟมาตรฐานจะมีคานอยที่สุด ถาหากเราตองการใหคาความเขมขนที่อานไดจากกราฟมาตรฐานมีคาต่ำที่สุดเทาที่เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรของเราจะสามารถทำได เราจะตองปรับความเขมขนของสารตัวอยาง (เชนเจือจางลงถาสารตัวอยางมีความเขมขนมากเกินไป) เพ่ือใหไดคาแอบซอรแบนซเทากับ 0.434 หรือใกลเคียงคานี้ที่สุด

เมื่อปรับความเขมขนของสารตัวอยางใหไดคาแอบซอรแบนซเทากับหรือใกลเคียง 0.434

ที่สุดแลว ความคลาดเคลื่อนของคาความเขมขนที่อานไดจากกราฟมาตรฐานก็จะขึ้นอยูกับคา dTT

ซึ่งเรียกวาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของทรานสมิตแตนซ ซึ่งถาหากเราคูณทั้งเศษและสวนดวยตัวเลข 100 ก็จะเห็นไดวาคานี้เทากับความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของเปอรเซนตทรานสมิตแตนซ d%T%T

นั่นเอง เมื่อแทนคาเขาในสมการที่ (4-13) จึงได

Zdcc= dA

A= −

1lnT

dTT

= −1lnT

d%T%T

Z (4-16)

คา d%T หรือความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของเปอรเซนตทรานสมิตแตนซ ซึ่งมีหนวยเปน %

เปนคาคงตัวที่สามารถหาดูไดจากเอกสารขอกำหนด (Specifications) ที่ติดมากับตัวเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร เชน เครื่องรุนที่ราคาถูกสำหรับนักเรียนใชอาจมี d%T เทากับ ±1% หรือ ±0.5% แต

เครื่องรุนราคาแพงสำหรับงานวิจัยอาจมี d%T เทากับ ±0.005% เปนตน

ในที่นี้เราจะลองแทนคา T = 0.368 จากสมการที่ (4-14) และ d%T เทากับ ±0.5% เขาไป

ในสมการที่ (4-13) เพ่ือหาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนที่อานไดจากกราฟมาตรฐาน ที่จุดต่ำสุดของกนกระทะ คือจุดที่แอบซอรแบนซเทากับ 0.434 หรือเปอรเซนตทรานสมิตแตนซเทากับ 36.8 % โปรดสังเกตวาเวลาแทนคาความคลาดเคลื่อนที่มีเครื่องหมาย ± เปนธรรมเนียม

ปฏิบัติในวิชาวิทยาศาสตรวา เราจะดึงเครื่องหมาย ± ออกเสียกอนในขณะคำนวณ

15

Zdcc= −

1lnT

d%T%T

= −1

ln 0.368( )0.50036.8

= 0.0136 ≈ 1.4%Z (4-17)

คาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธ dcc

≈ 1.4% ดังกลาวนี้ ก็คือคาที่อานไดจากแกนตั้งของกราฟ

ในรูป 4.6 ทั้ง ก และ ข ที่จุดต่ำสุดหรือกนกระทะของเสนกราฟนั่นเอง

ในทางปฏิบัต ิ เราหาคาความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของความเขมขนที่อานไดจากกราฟมาตรฐาน (dc ) ไดโดยแทนคา lnT = 2.303logT = −2.303A เขาไปในสมการที่ (4-16)

Zdcc= −

1lnT

d%T%T

=1

2.303A⎛⎝⎜

⎞⎠⎟d%T%T

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟=0.434 × d%T

A⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

1%T

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟Z (4-18)

เนื่องจากในกราฟมาตรฐาน เราลากเสนตรงตามกฎของเบียร และสามารถคำนวณหาความชันของเสนตรงนี ้คือ εl ไดอยูแลว เราจึงแทนคา A = εcl จากสมการที่ (4-7) ลงในสมการที่ (4-18)

แลวคูณดวย c ทั้งสองขาง ก็จะไดความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของความเขมขนที่อานไดจากกราฟ

มาตรฐาน

Z dc = 0.434 × d%Tεl

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

1%T

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

หนวยเปนโมลารZ (4-19)

นี่คือสมการสำหรับใชวิเคราะหขอมูลที่ไดจากการทดลองจริงในหองปฏิบัติการ อยางไรก็ตาม หากเราลืมวัดคา %T คือวัดเฉพาะคา A เพ่ือจะนำไปทำกราฟมาตรฐาน เราก็ยังสามารถหา dc ไดโดย

เปลี่ยน %T ในสมการที่ (4-19) ใหเปน A จากความสัมพันธ T =10-A ตามสมการ (4-4) แทนคา

%T =100T =100 × 10-A = 10010A

ลงในสมการที่ (4-19)

Z dc = 0.434 × d%T100εl

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟10A หนวยเปนโมลารZ (4-20)

โปรดสังเกตวา วงเล็บทางดานขวาของสมการ (4-19) และของสมการ (4-20) ตางเปนคาคงที่ เนื่องจาก d%T ขึ้นอยูกับรุนของเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรที่ใช ซึ่งในการทดลองที ่ 4.8.3 จะ

กำหนดใหมีคาเทากับ ±0.5% และ εl มีคาเทากับความชันของกราฟมาตรฐาน ซึ่งมีคาคงที่ในการ

ทดลองหนึ่งๆ สวน 1%T

หรือ 10A ขึ้นอยูกับความโปรงแสงหรือทึบแสงของสารตัวอยางในแตละ

16

หลอด ตัวอยางเชน ถา d%T = 0.5% และความชันของกราฟมาตรฐานมีคาเทากับ 2,500 M-1

ความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของความเขมขนจะมีคาเทากับ

dc = 0.434 × d%Tεl

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

1%T

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟=0.434 × 0.52,500M −1

1%T

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟=8.68 ×10−5

%TZ (4-20)

สมมุติวา %T ของสารตัวอยางมีคา 63% ความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของความเขมขน (dc )

จะมีคา 8.68 ×10−5

63= 1.37 ×10−6M เปนตน

อนึ่ง เมื่อเราทราบความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของความเขมขนแลว เราสามารถหาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนได โดยนำความเขมขนของสารที่ศึกษาในหลอดนั้นๆ ซึ่งอานคาไดจากกราฟมาตรฐานและมีหนวยเปนโมลาร ไปหารคาความคลาดเคลื่อนสัมบูรณซึ่งก็มีหนวยเปน

โมลารเชนกัน ไดผลเปนความคลาดเคลื่อนสัมพัทธ dcc

ซึ่งไมมีหนวย แตเรานิยมคูณ dcc

ดวย 100

เพ่ือบอกคาเปนรอยละ (เปอรเซนต) ตัวอยางเชนถาสารตัวอยางในยอหนากอนมีความเขมขนที่อาน

จากกราฟมาตรฐาน 8.1× 10-5M ความคลาดเคลื่อนสัมพัทธจะมีคา 1.37 ×10−6M8.1×10−5M

×100

=1.7% เปนตน การคำนวณหาความคลาดเคลื่อนสัมบูรณและสัมพัทธของความเขมขนดังกลาวนี้

นิสิตจะได ทดลองทำในการทดลองที่ 4.8.3

4.8.การทดลองเรื่องสเปกโทรโฟโตเมตรี

กอนทำการทดลอง ใหนิสิตเตรียมเขียน flowchart ขั้นตอนของการทดลองมาจากบาน และเตรียมมาสอบ Quiz สั้นๆ กอนทำการทดลอง จากนั้น นิสิตจะไดฟงการบรรยายสรุปโดยอาจารยผูประสานงานประจำการทดลอง และการซักซอมจากอาจารยผูควบคุมกลุม แลวจึงเริ่มทำการทดลอง

การทดลองท่ี 4.8.1 สเปกตรัมการดูดกลืนแสงของสารละลายดางทับทิม

ในการทดลองนี้เราจะวัดคาแอบซอรแบนซของสารละลายดางทับทิม โดยใชแสงความยาวคลื่นในชวง 450 – 600 นาโนเมตร เพ่ือใหทราบวาสารละลายดางทับทิมสามารถดูดกลืนแสงที่ความยาวคลื่นตาง ๆ ไดดีมากนอยตางกันเพียงใด และดูดกลืนแสงไดดีที่สุดความยาวคลื่นเทาใด

17

ในการวัดการดูดกลืนแสงของสารละลายแบลงกและสารละลายดางทับทิม เราสามารถนำคิวเวตต 2 หลอดที่มีความสามารถในการดูดกลืนแสงใกลเคียงกันมาใช ในกรณีที่เราไมแนใจวาคิวเวตตทั้งสองหลอดมีความสามารถในการดูดกลืนแสงใกลเคียงกันหรือไม ก็สามารถตรวจสอบได โดยเปรียบเทียบคาแอบซอรแบนซของสารละลายดางทับทิมที่วัดไดเมื่อใชคิวเวตตแตละหลอด

หากคาแอบซอรแบนซที่วัดไดแตกตางกันมาก ใหนำคิวเวตตหลอดที่วัดคาแอบซอรแบนซ ไดนอยกวา (AL) ไปใชใสสารละลายแบลงก และนำคิวเวตตหลอดที่วัดคาแอบซอรแบนซไดสูงกวา (AH) ไปใชใสสารละลายดางทับทิม คาแอบซอรแบนซของสารละลายดางทับทิมที่วัดไดจะมีคาเทากับ AH / AL เทาของคาที่ควรเปน เมื่อวัดคาแอบซอรแบนซดวยวิธีนี้จนไดครบตามตองการแลว จึงนำคาที่ไดตั้งแลวหารดวยอัตราสวนเพ่ือแกไขใหคาที่ไดมีความถูกตอง อัตราสวนนี้เรียกวาคาตัวแก (correction factor) อยางไรก็ตาม ในทางปฏิบัต ิแมจะใชคิวเวตตราคาถูกสำหรับนักเรียนใช ก็ไมเคยพบวาคาแอบซอรแบนซของทั้งสองหลอดมีความแตกตางกันเกินกวาเลขทศนิยมตำแหนงสุดทาย (ตำแหนงที่สามในกรณีเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรแบบแอนาล็อก หรือตำแหนงที่สองในกรณีสเปกโทรโฟโตมิเตอรแบบติจิตัล) เราจึงจะทำการทดลองโดยไมตองแกไขคาแอบซอรแบนซ

วัสดุและอุปกรณ

1. สารละลายดางทับทิม 3.00 x 10-4 M

2. เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร (สเปกโทรนิก 20)

วิธีทำการทดลอง

1. ตรวจสอบความสามารถในการดูดกลืนแสงของคิวเวตต

1. เปดเครื่อง รอใหเครื่องพรอมวัดอยางนอย 20 นาที

2. ปรับปุมตั้งคาความยาวคลื่นใหเทากับ 525 นาโนเมตร

3. ในกรณีใชเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรแบบแอนาล็อก ใหปรับปุมควบคุมสัญญาณ (ปุมลางซาย) จนอานคาแอบซอรแบนซได A = ∞ หรืออานคาเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซได %T = O ถาใชเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรแบบดิจิตัล ใหขามขอนี้ไปยังขอ 4 เลย

4. นำคิวเวตตมา 3 หลอด ใสน้ำกลั่น 4 มิลลิลิตรลงในหลอดที ่ 1 และใสสารละลายดางทับทิม (0.05 กรัม/ลิตร) ลงในหลอดที่ 2 และ 3 หลอดละ 4 มิลลิลิตร

18

5. ใสหลอดที ่ 1 ลงในเครื่อง ปรับปุมควบคุมแสง (ปุมลางขวา) ใหอานคาแอบซอรแบนซไดเทากับศูนย หรืออานคาเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซไดเทากับ 100%

6. นำหลอดที่ 1 ออก และใสหลอดที่ 2 ลงไปแทน อานและบันทึกคาแอบซอรแบนซ

7. นำหลอดที่ 2 ออก และใสหลอดที่ 3 ลงไปแทน อานและบันทึกคาแอบซอรแบนซ

ถาคาที่ไดใกลเคียงกัน ใหเลือกใชหลอดใดหลอดหนึ่งสำหรับใสสารละลายแบลงก ซึ่งก็คือน้ำกลั่นในที่นี้ และใชอีกหลอดหนึ่งสำหรับใสสารละลายดางทับทิม

ถาคาที่ไดแตกตางกัน ใหใชหลอดที่วัดคาแอบซอรแบนซไดนอยกวาใสน้ำกลั่น และใชหลอดที่วัดคาไดสูงกวาใสสารละลายดางทับทิม

2. หาสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของสารละลายดางทับทิม

1. ปรับปุมตั้งคาความยาวคลื่นใหเทากับ 450 นาโนเมตร

2. ในกรณีใชเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรแบบแอนาล็อก ใหปรับปุมควบคุมสัญญาณ (ปุมลางซาย) จนอานคาแอบซอรแบนซได A = ∞ หรืออานคาเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซได

%T = 0 ถาใชเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอรแบบดิจิตัล ใหขามขอนี้ไปยังขอ 3 เลย

3. เทสารละลายดางทับทิมออกจากคิวเวตตหลอดที่เลือกไวใชสำหรับแบลงก ลางทำความสะอาด แลวใสน้ำกลั่น 4 มิลลิลิตรลงไปแทน ใสคิวเวตตสำหรับแบลงกนี้ลงในเครื่องปรับปุมควบคุมแสงใหอานคาแอบซอรแบนซไดเทากับศูนย หรืออานคาเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซไดเทากับ 100%

4. นำคิวเวตตสำหรับแบลงกออก และใสคิวเวตตสำหรับสารละลายดางทับทิมลงไปแทน อานและบันทึกคาแอบซอรแบนซ

5. ทำการทดลองขั้นตอนที ่1. – 4. ซ้ำโดยเปลี่ยนความยาวคลื่นเปน 475, 500, 525, 550, 575 และ 600 นาโนเมตรตามลำดับจนครบ บันทึกคาความยาวคลื่นและคาแอบซอรแบนซที่อานไดลงในตาราง แลวนำไปเขียนกราฟสเปกตรัมการดูดกลืนแสงของสารละลายดางทับทิม โดยพล็อตคาความยาวคลื่นบนแกนนอน และคาแอบซอรแบนซบนแกนตั้ง และหาคา λmax จากกราฟ

19

การทดลองท่ี 4.8.2 การพิสูจนกฎของเบียร

จากกฎของเบียร การดูดกลืนแสงซึ่งวัดเปนแอบซอรแบนซ (A ) แปรผันโดยตรงตามความ

เขมขนของสารละลาย (c ) เมื่อใชแสงที่มีความยาวคลื่นคงที่ ณ คาหนึ่ง ในการทดลองนี้เราจะนำ

สารละลายดางทับทิมที่ความเขนขนตาง ๆ (standard samples) มาวัดการดูดกลืนแสง จากนั้นนำผลที่ไดไปเขียนกราฟมาตรฐานระหวางแอบซอรแบนซกับความเขมขน เพ่ือนำไปใชหาความเขมขนของสารละลายดางทับทิมที่ไมทราบความเขมขน (unknown samples) ถาความสัมพันธเปนไปตามกฎของเบียร กราฟที่ไดจะเปนเสนตรง

วัสดุและอุปกรณ

1. สารละลายดงทับทิม 6.50 x 10-4 M

2. เครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร

วิธีทำการทดลอง

1. สรางกราฟมาตรฐานของสารละลายดางทับทิมซึ่งเตรียมโดยการเจือจางแบบอนุกรม

1. เตรียมหลอดทดลองขนาด 15 มิลลิลิตร จำนวน 9 หลอด เขียนหมายเลขกำกับบนหลอดเรียงตามลำดับ 1 – 9 จากนั้นจึงเตรียมปเปตตชนิดเซโรโลจิคัลแบบเปาออกขนาด 5 มิลลิลิตร จำนวน 2 อัน และทำดังนี้

2. เติมสารละลายดางทับทิม 0.1 กรัม/ลิตร จากบิวเรตตสวนกลางที่จัดไวมาประมาณ 10 มิลลิลิตร ลงในหลอดที่ 1

3. ใชปเปตตอันที่ 1 ดูดน้ำกลั่นลงในหลอดทดลองที่ 2 – 5 หลอดละ 5 มิลลิลิตร

4. เจือจางสารโดยใชปเปตตอันที่ 2 ดูดสารละลายดางทับทิม จากหลอดที ่ 1 มา 5 มิลลิลิตร ปลอยสารละลายนี้จากปเปตตลงในหลอดที่ 2 แลวผสมใหเขากันโดยใชปเปตตดูดสารละลายขึ้นแลวปลอยกลับ ทำสลับกันเชนนี้สองถึงสามครั้ง หรือจนไดสารละลายที่ผสมกันเปนเนื้อเดียว

5. ใชปเปตตอันที่ 2 ดูดสารละลายจากหลอดที ่ 2 มา 5 มิลลิลิตร แลวปลอยลงในหลอดที่ 3 ผสมสารละลายใหเขากัน ดวยวิธีขางตน แลวทำตอไปโดยวิธีในขอ 4. จนถึงหลอดที่ 5

20

6. นำสารละลายดางทับทิมในหลอดที่ 1–5 ซึ่งเปนสารละลายมาตรฐาน (standard samples) ไปวัดเปอรเซนตทรานสมิตแตนซ และแอบซอรแบนซที่ความยาวคลื่น 525 นาโนเมตรโดยใชน้ำกลั่นเปนแบลงก บันทึกคาเปอรเซนตทรานสมิตแตนซ และแอบซอรแบนซที่วัดได จากนั้นจึงเขียนกราฟแสดงความสัมพันธระหวางแอบซอรแบนซ กับความเขมขนของสาร และนำผลที่ไดไปวิจารณกฎของเบียร ในการวัดนี้ ใหวัดในคราวเดียวกันกับที่วัดแอบซอรแบนซของสารละลายดางทับทิมที่กำหนดให (unknown) ในหลอดที่ 6 ถึง 9 ดังจะกลาวในหนาถัดไป

2. วัดความเขมขนของสารละลายตัวอยาง

1. นำหลอดทดลองหลอดที ่ 6 และ 8 จากขอ 1. ขางตนไปรับสารละลายดางทับทิมที่ไมทราบความเขมขน (unknown samples) ประมาณ 15 มิลลิลิตร จำนวน 2 ตัวอยางจากอาจารยผูควบคุม

2. เตรียมสารละลายในหลอดที ่ 7 ใหมีความเขมขนเปนครึ่งหนึ่งของสารละลายในหลอดที ่ 6 และเตรียมสารละลายในหลอดที ่ 9 ใหมีความเขมขนเปนครึ่งหนึ่งของสารละลายในหลอดที่ 8

3. วัดแอบซอรแบนซ ของสารละลายดางทับทิมในหลอดที ่ 6 – 9 โดยใชน้ำกลั่นเปนแบลงก นำคาที่บันทึกไดไปใชหาคาความเขมขนจากกราฟมาตรฐานแลวบันทึกผล

การทดลองท่ี 4.8.3 การหาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขน

Z การหาคาความเขมขนดวยวิธีวัดการดูดกลืนแสง ยอมมีความผิดพลาดเกิดขึ้นไดซึ่งเปนผลจากขอจำกัดของเครื่องมือ ความคลาดเคลื่อนนี้จะมากหรือนอยขึ้นกับความเขมขนของสารละลายที่กำลังวัด เปอรเซ็นตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธที่แปรผันตามคาความเขมขนจึงเปนขอมูลที่เราควรทราบเพ่ือหลีกเลี่ยงการวัดสารละลายที่มีความเขมขนในชวงที่มีความคลาดเคลื่อนสูง

วิธีคำนวณ

1. ใชขอมูลจากการทดลองที่ 4.8.2 มาคำนวณหาเปอรเซ็นตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนของสารละลายดางทับทิมมาตรฐาน (หลอดที่ 1 ถึง 5) โดยกำหนดใหความคลาดเคลื่อนของเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซ หรือ d%T มีคาเทากับ ±0.5% แลว

บันทึกผลลงในตาราง

21

2. เขียนกราฟระหวางเปอรเซ็นตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนของสารละลายดางทับทิมมาตรฐานกับเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซ และเขียนกราฟระหวางเปอรเซ็นตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนของสารละลายดางทับทิมมาตรฐานกับแอบซอรแบนซ

บรรณานุกรม

Anonymous. 2010. On-line Learning by Division of Chemistry School of Science

and Mathematics Sheffeld Hallem University. เขาถึงไดที่ : http://

www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/ เมื่อ มกราคม 2553

Ayres, G. H. 1949. Evaluation of accuracy in photometric analysis. Anal. Chem.

21(6):652-657.

Dartmouth. 1997. ChemLab: On-line Learning by Dartmouth College. Copyright

1997-2001. เขาถึงไดที่ http://www.dartmouth.edu/~chemlab/, http://

www.dartmouth.edu/~chemlab/techniques/buret.html และ http://

www.dartmouth.edu/~chemlab/techniques/spectrometerD.html เมื่อ มกราคม

2553

Dyer, J. R. 1965. Applications of Absorption Spectroscopy of Organic

Compounds. Englewood Cliffs, NJ:Prentice-Hall, Inc.

Eckschlager, K. 1969. Errors, Measurement and Results in Chemical Analysis.

London:Van Nostrand Reinhold Co.

Freifelder, D. (1982) Physical Biochemistry-Applications to Biochemistry and

Molecular Biology. 2nd ed. W.H. Freeman & Co. New York.

Hamill, W. H. and R. R. Williams, Jr. 1959. Principles of Physical Chemistry.

Englewood Cliffs, NJ:Prentice-Hall, Inc.

Hogness, T. R., F. P. Zscheile, Jr., and A. E. Sidwell, Jr. 1937. Photoelectric

spectrophotometry - An apparatus for the ultraviolet and visible spectral

22

regions: Its construction, calibration and application to chemical problems.

J. Phys. Chem. 41:379.

Kolthoff, I. M. and E. B. Sandell. 1943. Textbook of Quantitative Inorganic

Analysis, 3rd Ed. NY:The Macmillan Company. Chapter XLI: Colorimetry and

Spectrophotometry, pp. 613-641.

Murphy, C. J. Undated. SCCC104 & SCCC104L Laboratory Manual เขาถึงไดที่

http://www.chem.sc.edu/people/documents/murphy/

SCCC104labmanual1.pdf เมื่อมกราคม 2553

Pecsok, R. L., L. D. Shields, T. Cairns and I. G. McWilliam (1976) Modern

Methods of Chemicals Analysis. 2nd ed. John Wiley & Son.

Robyt, J. F. and B. J. White. 1987. Biochemical Techniques: Theory and

Practice. Monterey, CA:Brooks/Cole Publishing Co.

ThermoSpectronic 2002. Spectronic Educator Spectrophotometer Operator’s

Manual. ThermoSpectronic, Inc.

Svehla, G., A. Pall, and L. Erdey. 1963. Improved method for error calculation of

quantitative spectrophotometric measurements. Talanta 10:719-726.

Twyman, F. and G. F. Lothian. 1933. Proc. Phys. Soc. (London) 45:643.

23

บันทึกผลการทดลอง

การทดลองท่ี 4 สเปกโทรโฟโตเมตรี

วัน ………….. ที่ ………………………………….

ชื่อ ……………………….…………………..รหัส……………….สังกัด……………………….ตู……

ชื่อผูรวมปฏิบัติการ ……………………….……………….กลุม…...อาจารยผูควบคุม.………………

วัตถุประสงคของการทดลอง

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

ผลการทดลองท่ี 4.8.1

1. การตรวจสอบความสามารถในการดูดกลืนแสงของคิวเวตต

Z แอบซอรแบนซของคิวเวตตหลอดที่ 2 เทากับ ………………..

Z แอบซอรแบนซของคิวเวตตหลอดที่ 3 เทากับ ………………..

Z นิสิตเลือกคิวเวตตหลอดใดมาใสแบลงก ………………..

Z เนื่องจาก ……………………………………………………………………………………….

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

24

2. สเปกตรัมการดูดกลืนแสงของสารละลายดางทับทิม

ความยาวคลื่น λ (nm) แอบซอรแบนซ A

450

475

500

525

550

575

600

เขียนกราฟระหวางแอบซอรแบนซกับความยาวคลื่น

ความยาวคลื่นที่ดางทับทิมดูดแสงไดดีที่สุด คือ ……….

25

ผลการทดลองท่ี 4.8.2

1. การพิสูจนกฎของเบียร-แลมเบิรต และการหาความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขน

หลอด %T A525 ความเขมขน(M)

dc = 0.434 × d%Tεl

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

1%T

⎛⎝⎜

⎞⎠⎟

เมื่อd%T = ±0.5%

(M)

dcc× 100

(%)

1

2

3

4

5

1.1 เขียนกราฟมาตรฐานของสารละลายดางทับทิม และหาคาความชัน (slope) ซึ่งมีคาเทากับ εl

ความชันของกราฟมาตรฐานมีคาเทากับ ……………………………………………………………..

26

ผลการทดลองเปนไปตามกฎของเบียรหรือไม ………………………………………………………..

เพราะ ………………………………………………………………………………………………….

…………………………………………………………………………………………………………..

…………………………………………………………………………………………………………..

คาความเขมขนในชวงที่กราฟเปนเสนตรง คือ …………………………………………………………

1.2 เขียนกราฟแสดงความสัมพันธระหวางเปอรเซนตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนกับเปอรเซนตทรานสมิตแตนซ และกราฟแสดงความสัมพันธระหวางเปอรเซนตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนกับแอบซอรแบนซ

ความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนมีคานอยที่สุดที่ชวงแอบซอรแบนซเทากับ ………………

ความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนมีคานอยที่สุดที่ชวง %T เทากับ ………………………

27

2. การหาความเขมขนของสารละลายดางทับทิมตัวอยาง

หลอดท่ี ตัวคูณการเจือจาง(ปริมาตรสุดทายตอปริมาตรตั้งตน)

A525 ความเขมขน(M)

เปอรเซนตความคลาดเคลื่อน

สัมพัทธ (%)

ความคลาดเคลื่อนสัมบูรณของ

ความเขมขน (M)

6

7

8

9

อานคาจากกราฟในบันทึกผลการทดลองขอ 1.2

ในการตอบใหใชเปอรเซนตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธประกอบการตัดสินใจ

ความเขมขนของสารละลายดางทับทิมตัวอยางZ Z Z ความคลาดเคลื่อนสัมบูรณ

Z ตัวอยางที่ 1 มีความเขมขน …………………………… ± …………………….. โมลาร

Z ตัวอยางที่ 2 มีความเขมขน …………………………… ± …………………….. โมลาร

28

คำถาม

1. สเปกตรัมการดูดกลืนแสงมีความสำคัญตอการหาปริมาณสารดวยวิธีวัดการดูดกลืนแสงอยางไร

2. เพราะเหตุใดสารที่มีคุณสมบัติเรืองแสงจึงไมสามารถนำมาใชศึกษาดวยวิธีวัดการดูดกลืนแสง

3. คาแอบซอรแบนซและคาเปอรเซ็นตทรานสมิตแตนซสัมพันธกับการดูดกลืนแสงอยางไร

4. เพราะเหตุใดคาโมลารแอพซอรทิวิตีที่มีการรายงานไว กับคาที่เราหาไดจากกราฟมาตรฐานจึงมักไมตรงกัน

5. จากกราฟมาตรฐานที่ไดจากการทดลอง จงคำนวณหาคา E1cm1% และคาโมลารแอพซอรพทิวิตี

ของสารละลายดางทับทิมที ่ 525 นาโนเมตร (กำหนดใหดางทับทิมมีมวลเชิงโมเลกุลเทากับ 158.04 กรัมตอโมล)

6. ถาทานตองการวัดการดูดกลืนแสงของสารละลายดางทับทิมที่ความยาวคลื่น 525 นาโนเมตร ใหไดคาแอบซอรแบนซอยางนอย 0.100 จะตองเตรียมสารละลายดางทับทิมใหมีความเขมขนอยางนอยเทาใด

7. เพราะเหตุใดจึงไมควรใชสารละลายความเขมขนสูงในการวัดการดูดกลืนแสงเพ่ือหาปริมาณ

8. การหาเปอรเซ็นตความคลาดเคลื่อนสัมพัทธของความเขมขนมีประโยชนอยางไร

9. จงพิสูจนสมการ (4-13) ซึ่งเปนสมการแมบทของความคลาดเคลื่อน, dcc= dA

A= −

1lnT

dTT

10. ตามปกติในการทดลองทางวิทยาศาสตร เรามักทำการทดลองหลายครั้ง แลวนำคาที่วัดไดมาหาคาเฉลี่ย เพราะเหตุใดเราจึงไมหาคาเฉลี่ยในการทดลองหาความเขมขนของสารละลายดางทับทิมตัวอยาง (การทดลองที่ 4.8.2 ขอ 2)

11. ในการคำนวณหา dc เราอาจจะคำนวณจากคาแอบซอรแบนซตามสมการที ่ (4-20) ก็ไดเพ่ือ

ความสะดวก แทนที่จะคำนวณจาก %T ตามสมการที่ (4-19) ซึ่งทำใหเราตองบันทึกทั้งคา A

และ %T ในทุกหลอดที่ทำกราฟมาตรฐาน อยางไรก็ตามความสะดวกที่เราไดรับนี้ตองซื้อมา

ดวยความคลาดเคลื่อนของ dc ที่ไมเทากันตลอดยานของแอบซอรแบนซ จงแสดงวาในชวง

0.10 < A <1.00 ความคลาดเคลื่อนในตัวเลขหลักนอยที่สุด (least significant digit) ของ A

มีคาอยูระหวาง 1.8 ถึง 0.2 เทาของความคลาดเคลื่อนในตัวเลขหลักนอยที่สุดของ %T และที่

A ≈ 0.36 ความคลาดเคลื่อนในตัวเลขหลักนอยที่สุดของ A จะมีคาเทากับความคลาดเคลื่อน

ในตัวเลขหลักนอยที่สุดของ %T

29

12. ตัวเลขบอกความเปนกรดเปนดางมีนิยามวา pH = − log H +⎡⎣ ⎤⎦ ซึ่งมีรูปสมการคลายคลึงกับ

นิยามของแอบซอรแบนซ A= − logT ตามสมการที่ (4-4) ดังนั้น pH ควรจะมีความคลาด

เคลื่อนของการวัด เปนกราฟรูปโคงกระทะหงายเหมือนกราฟในรูป 4-6 ดวยหรือไม เพราะเหตุใด

30