Centralna dogma biologije

Tijek informacija

Razvrstavanje i usmjeravanje proteina, kako?

prokariot eukariot

❖ jezgrina ovojnica

❖ endoplazmatskiretikulum (ER)

❖ Golgijev kompleks

❖ lizosomi

❖ vezikule

❖ vakuole

SUSTAV ENDOMEMBRANA I UNUTARSTANIČNI TRANSPORT

•Eukariotske stanice - razvijen unutarnji membranski sustav

• uzimanje makromolekula iz izvanstaničnog prostora (endocitoza)

• probavljanje pomoću hidrolitičkih enzima u lizosomima

• izlučivanje produkata metabolizma (metaboliti) iz stanice (egzocitoza)

• prijenos novosintetiziranih proteina, ugljikohidrata i lipida unutar stanice –biosintetsko-sekretorni put (modifikacija molekula)

• povezanost ER i plazmatske membrane

SUSTAV ENDOMEMBRANA I UNUTARSTANIČNI TRANSPORT

Endoplazmatski retikulum•Hrapavi i glatki ER

•Prolaz proteina kroz membranu ERa

•Vektorski transport proteina, signalni peptid

•Glikozilacija proteina

•Sinteza lipida

•Do 50% ukupnih membrana (najveći organel)

Endoplazmatski retikulum (ER)

• membranske cjevčice (tubuli) i vrećice (cisterne)

• membrane ER se nastavljaju na jezgrinu ovojnicu i razdvajaju unutrašnjost cisterni od citosola

• selektivni prijenos molekula između citosola i lumena ER

• sinteza lipida i proteina - transmembranski proteini i lipidi većine staničnih organela koji pripadaju sustavu endomembrana i plazmatske membrane, asimetrija membrana, pravilna orijentacija proteina u membrani

•sinteza lipida koji grade membrane mitohondrija i peroksisoma

•svi proteini koji se izlučuju iz stanice zajedno s proteinima koji ostaju u ER, GK ili lizosomima ulaze prvo u lumen ER

tubuli

vrećice

Hrapavi ER

- na vanjskoj strani membrane ER (okrenute prema citosolu) nalaze ribosomi

Uloge hrapavog ER

❖ sinteza i usmjeravanje proteina (brže nego g. Brown)

❖Glikozilacija proteina

❖Provjera kvalitete smatanja proteina

Dvije vrste proteina

• Transmembranski proteini – ugrađuju se u membranu ER ili se ugrađuju u staničnu membranu ili membranu drugih organela

• Proteini topivi u vodi – prolaze kroz membranu ER i ulaze u lumen ER i odlaze u druge organele ili se izlučuju iz stanice (sekretorni proteini)

Proteini se usmjeravaju prema membrani ER istom vrstom signalnih sekvenci i prenose se kroz membranu istim mehanizmom

Za jednu mRNA može se vezati mnogo ribosoma

Quo vadis, protein?

Vezanje ribosoma i unos proteina

•Kotranslacijski proces – sinteza proteina na ribosomu koji je vezan za membranu ER (rER) - unos proteina započinje prije završetka sinteze cijelog polipeptida

•Da li će ribosomi biti vezani za membranu ili slobodni u citosolu određeno je vrstom proteina koji se treba sintetizirati, odnosno ER signalnom sekvencom (mRNA nosi slijed nukleotida koji kodira proteine sa signalnom sekvencom) – direktno vezanje ribosoma za vanjsku membranu rER

•Signalna sekvenca se nalazi na N-kraju proteina

Najvažnija biosintetska uloga ER –vezanje šećera za proteine odnosno posttranslacijska modifikacija proteina

Glikozilacija proteina – prijenos prekursor oligosaharida (N-acetilglukozamin, manoza i glukoza –ukupno sadrži 14 šećera) na proteine u ER

Veže se na N-kraj proteina za aminokiselinu asparagin – prijenos kataliziran membranskim enzimom oligosaharil transferaza (aktivno mjesto u membrani okrenuto prema lumenu ER

Glikozilacija proteina u ER

Vezanje oligosaharida na asparagin

prek

urso

r

Smatanje i dorada proteina

Šaperoni – proteini koji sudjeluju u pravilnom smatanju proteina: HSP70, BiP

Disulfid izomeraza (PDI) – katalizira oksidaciju slobodnih sulfidril skupina na cisteinima stvarajući disulfidne (S-S) veze

Proteini ERa – posjeduju signal od 4 aminokiseline na C-kraju

Uloga ER proteina: katalizatori koji pomažu pri namatanju i proteini koji su ušli u lumen ER poprimaju pravilne konformacije

Glatki ER

-sudjeluje u odvijanju različitih metaboličkih procesa uključujući sintezu lipida, metabolizam ugljikohidrata i detoksifikaciju (lijekovi, otrovi i sl.)

-mjesto formiranja i odvajanja transportih vezikula koje prenose novosintetizirane proteine i lipide do GA

❖ sinteza lipida

-sinteza fosfolipida, ceramida, kolesterola, steroida i drugih lipida

Steroidi su spolni hormoni (sinteza iz kolesterola) koje izlučuju spolne žljezde (testisi i ovariji su bogati glatkim ER)

Većina membranskih lipida se sintetizira u ER

-Većina svih najznačajnijih vrsta lipida – fosfolipidi i kolesterol

-Fosfatidilkolin (lecitin) –sinteza je katalizirana enzimima u membrani ER

Sinteza se odvija na citosolnoj strani membrane ER –prijelaz fosfolipida na stranu membrane okrenutu prema lumenu ER odvija se pomoću enzima skramblaze

U membrani ER fosfolipidi su jednako zastupljeni na obje strane membrane – fosfolipidi mogu mijenjati stranu pomoću translokatora skramblaze i ABC transportera – ciljani a ne spontani flip-flop.

Stanice jetre – hepatocite – razvijen glatki ER – mjesto sinteze lipoproteinskih čestica koje prenose lipide krvožilnim sustavom do različitih dijelova tijela

U membrani glatkog ER nalaze se:

- enzimi koji sudjeluju u sintezi lipidnih komponenti lipoproteina

- enzimi koji sudjeluju u detoksifikaciji od spojeva topivih u lipidima ili drugih štetnih tvari – citokrom P450 (57 gena u ljudskom genomu) - enzimi kataliziraju niz reakcija u kojima se u vodi netopivi lijekovi ili metaboliti modificiraju i postaju topivi u vodi i izlučuju se mokraćom (nema nagomilavanja štetnih tvari u stanicama)

Fiziološke uloge glatkog ER-a

❖ detoksifikacija

Uključuje dodavanje hidroksilne skupine na neku tvar čime dolazi do povećanja topivosti i olakšanog transporta štetnih tvari iz stanice (organizma)

- barbiturati (lijekovi), alkohol, droga i sl. metaboliziraju se pomoću glatkog ER u stanicama jetre

Povećane količine lijekova (i alkohola) potiču proliferaciju glatkog ER čime dolazi do povećanja tolerantnosti na lijekove (veće doze potrebne za postizanje odgovarajućeg učinka)

Enzimi reagiraju na više toksičnih tvari, te proliferacija ER nastala kao reakcija na jednu tvar povećava tolerantnost na druge tvari.

• Mišićne stanice – razvijen specijaliziran glatki ER –sarkoplazni retikulum – uzima kalcij iz citosola pomoću Ca2+-ATPaze – crpljenje i otpuštanje kalcija uzrokuje kontrakcije ili relaksacije miofibrila u mišićima.

❖ rezervoar Ca2+

• Uloga ER većine eukariotskih stanica -crpljenje kalcija iz citosola – ispuštanje ili crpljenje kalcija povezano je s odgovorom stanice na podražaj – kalcij je sekundarni glasnik u putu prijenosa signala – da bi odgovor stanice bio brz koncentracija kalcija u citosolu mora biti niska – izrazito male promjene koncentracije kalcija u citosolu koje nastaju uslijed ispuštanja kalcija iz ER uzrokuju brz i buran odgovor stanice na podražaj

• Visoka količina kalcija u lumenu ER održavana je prisutnošću velike količine proteina koji vežu kalcij

Hrapavi ER

• Sinteza proteina

• Glikozilacija proteina

• Kontrola kvalitete smatanja proteina

• Transport proteina izvan stanice

Glatki ER

• Sinteza lipida

• Detoksifikacija otrova

• Skladište Ca2+

Summa summarum

Prijenos tvari kojima se stanica hrani i koje izlučuje odvija se transportnim vezikulama

Biosintetsko-sekretorniput – ER, Golgijevkompleks (GK), lizosomi, površina stanice

Povratni put – plazmatskamembrana, lizosomi, GK i ER

Biosintesko-sekretorni i endocitički prijenos tvari – komunikacija između staničnih odjeljaka putem transportnih vezikulaBiosintesko-sekretorni putMolekule proteina i lipida se transportiraju od ER do plazmatskemembrane ili do lizosoma (preko kasnih endosoma), u transport je uključen GAEndocitički putUnos molekula u stanicu od plazmatske membrane preko ranih endosomado lizosoma, u transport nekih molekula uključen je GA

Molekularni mehanizam membranskog transporta i održavanje razlika između staničnih odjeljaka

Kontinuirana razmjena tvari između više od 10 kemijski različitih, membranom odvojenih staničnih odjeljaka.

Kako odjeljci zadržavaju specijalizirane značajke?

Molekularni biljezi na površini membrana okrenutoj prema citosolu usmjeravaju transport i vezanje vezikula za odgovarajući odjeljak.

pupanje

https://www.youtube.com/watch?v=wfzUq3SLLnk

Vezikule se razlikuju prema proteinskom omotaču koji pokriva citosolnu stranu membrane

•Tri vrste obavijenih vezikula: COPII- i COPI-obavijene vezikule i vezikule obavijene klatrinom

Sadržaj vezikula razlikuje se obzirom na sadržaj transmembranskih receptora koji zadržavaju specifičan skup proteina unutar vezikula

Slika 13-5Alberts 2008

COPI- i COPII-obavijene vezikule (Coat Protein)

•COPII-obavijene vezikule: transport od ER prema GA

• COPI-obavijene vezikule: transport od GA prema ER

Fuzija vezikula nakon odvajanja od ER i put prema GA

Tubularni klasteri – pupanje novih vezikula – COPII-obavijene vezikule fuzioniraju – tubularni klasteri – pomiću se pomoću mikrotubula do GA

COPI-obavijene vezikule sudjeluju u pupanju vezikula – povratni put vezikula od GA do ER

Mikrotubule su željezničarske pruge po kojima „hodaju” spojene veikule

GOLGIJEV APARAT

1. Otkriće (Camillo Golgi 1898. svjetlosna mikr. → bojanjesrebrnim solima, neuroni, 1950.→ EM snimke

2. Uloga: modifikacija glikoproteina, metabolizam lipida isinteza mnogih polisaharida, sinteza sfingomijelina,sortiranje proteina

3. Transport proteina od GA - u transportnim vezikulamaobavijene klatrinom

Shema strukture Golgijevog aparata

endoplazmatski retikulum

stanična membrana

Broj cisterni (4-10) ovisi o tipu stanice a GA je izrazito razvijen u sekretornim stanicama, npr. tankog crijeva

Modifikacija N-vezanih oligosaharidnih lanaca u GA

Osnovni dio, isti u svim N-glikanima (A)

Oligosaharidi vezani za N-kraj proteina se modificiraju:

Manozni oligosaharidi – bez dodatka novih šećera – sadrže dva N-acetilglukozamina i mnogo ostataka manoze (C)

Kompleksni oligosaharidi – dodavanje novih šećera u GA (B)

Edward Scissorhands

Modifikacija O-vezanih oligosaharidnih lanaca u GA

Proteoglikani – oligosaharidi vezani za OH na aminokiselinama serin i treonin – O-vezana glikozilacija –katalizirana enzimom glikozil transferaza – koristi šećere iz lumena GA – do 90% mase su ugljikohidrati

13-29, Alberts 2008Stanica tankog crijeva – luči mukus pun proteoglikana

Dva važeća modela kako proteini prolaze kroz Golgijev aparat

13-29, Alberts 2008

http://www.youtube.com/watch?v=rvfvRgk0MfA

Klatrinske jamice na citosolnojstrani membrane

Pupanje i odvajanje vezikule obavijene klatrinomispunjene npr. LDL česticama s kolesterolom

Klatrinom obavijene vezikule

•Transport od GA prema plazmatskoj membrani i nazad, prema endosomima i od plazmatske membrane prema lizosomima

• Klatrin – složena struktura, stvara karakterističnu površinu vezikule

• Adaptin –povezuje klatrinski omotač i transmembranske receptore - 4 vrste adaptina (svaki sadrži specifičan set receptora)

• transmembranski receptori (selekcija topivih proteina unutar vezikula)

Klatrin Adaptin

Sastavljanje i rastavljanje klatrina na površini vezikuleklatrinski omotač stvara se tijekom pupanja vezikule – adaptini povezuju klatrin i transmembranske receptore – stvaranje selektivne površine i sadržaja vezikule – protein dinamin odgovoran za odvajanje vezikule – odmah nakon formiranja vezikula klatrinski omotač se odvaja od površine vezikule

izvan stanice

Lizosomi

1. Što su lizosomi?

2. Koja je njihova uloga?

Lizosomi su organeli omeđeni membranom, a sadrže enzime – kisele hidrolaze (nukleaze, proteaze, glukozidaze, lipaze, fosfataze, sulfataze, fosfolipaze)

Lizosomi imaju ulogu razgradnje tvari koje se unose u stanicu, kao i razgradnje staničnih dijelova.

Kako to da enzimi ne razgrade i sam lizosom?

Što se događa s lizosomom u hipotoničnoj otopini?

O čemu ovisi aktivnost enzima?

Membrana je s unutarnje strane izrazito glikozilirana.

Lizosomi pucaju, hidrolitički enzimi ne rade u neutralnom pH

Lizosomi su bezbojni, kojom reakcijom ga možemo vizualizirati u stanici?

Kisela fosfataza – biljeg za prepoznavanje lizosoma. Glutaraldehidfiksira enzim na mjestu gdje se prirodno nalazi, inkubacija sa supstratom za kiselu fosfatazu u prisustvu olovnih iona –> crni talog

Kako glasi ta reakcija?

Višestruki metabolički putevi donose tvari na razgradnju

egzocitoza

fagocitoza

autofagija

endocitoza

Lizosomi i bolesti u ljudi

• nasljedne bolesti – promjene u metabolizmu lizosoma uslijednedostatka pojedinog enzima

•Pompe bolest – oštećenje jetre uslijed nagomilavanja glikogena;nedostaje enzim u lizosomu koji razgrađuje polisaharide

•Tay-Sach bolest – oštećenje mozga uslijed nagomilavanja lipida;nedostaje enzim u lizosomu koji razgrađuje glikolipide

•Liječenje

• IV unošenje enzima koji nedostaju zajedno s adaptormolekulama koje pronalaze enzime pomoću kojih hidrolitičkienzim može ući u stanicu i spojiti se s lizosomom

• Genska terapija lentivirusima – ugradnja funkcionalnogproteina u DNA stanica

Vakuola

•središnja vakuola u biljaka; obavijena tonoplastom

sadrži hidrolitičke enzime i djeluje kao lizosom

autofagija organela

ALI, pohranjuje organske tvari i proteine

sadrži pigmente

spremište za ione kalija i klora

regulacija pH citoplazme, niži pH u vakuoli

odlagalište nepoželjnih produkata

tonoplast

Summa summarum Endomembrana i transporta

Peroksisomi

Organeli koji sadrže oksidativne enzime, katalaze, oksidazu D-aminokiselina, i oksidazu urične kiseline u visokim koncentracijama

Peroksisomi potječu od predačkog organela u kojem su se odvijali svi oksidativni procesi predačke eukariotske stanice

Služili su za smanjenje količine kisika u stanicama (visoka koncentracija kisika toksična za stanicu) i za odvijanje korisnih oksidativnih reakcija

Glavne funkcije peroksisoma:

Enzimi koriste kisik za odvajanje vodikovih atoma sa organske molekule u oksidativnoj reakciji u kojoj kao produkt nastaje H2O2

Razgradnja masnih kiselina na manje molekule koje se prenose do mitohondrija gdje se koriste za stanično disanje - oksidacija masnih kiselina - -oksidacija – nastaje acetil CoA

• u biljnim stanicama odvija se samo u peroksisomima, u animalnim stanicama u peroksisomima i mitohondrijima

Katalaze – koriste H2O2 za oksidaciju drugih supstrata (fenola, mravlje kiseline, formaldehida i alkohola) peroksidativnom reakcijom – kao produkt reakcije nastaje H2O

• Katalaze – smanjuju količinu H2O2 u stanici

• Jetra i bubrezi – stanice sadrže mnogo peroksisoma – detoksifikacija od toksičnih molekula (25% alkohola oksidira u acetaldehid)

RH2 + O2 → R + H2O2

H2O2 + R’H2 → R’ + 2H2O

Slika 12-33 Alberts 2008, model nastajanja i diobe peroksisoma

Kratka signalna sekvenca usmjerava proteine u peroksisome

Ulazna signalna sekvenca - kratka sekvenca od 3 aminokiseline na C-kraju ili na N-kraju peroksisomalnih proteina

Topivi receptor proteini u citosolu kao i receptori na membrani peroksisoma prepoznaju signal – peroksini (32 poznata)

Glioksisomi – specijalan oblik peroksisoma u biljaka i nekih gljiva

•u tkivima koja pohranjuju masti (sjemenke koje kliju)sadrže enzime koji potiču pretvorbu masti u šećere

• Preko oksidacije masnih kiselina i glioksilatnog ciklusa

http://www.biologyexams4u.com/2012/04/glyoxysomes.html

B Morriswood, and G Warren Science 2013;341:1465-1466

Dva modela kako proteini i lipidi prolaze kroz Golgijev aparat

Signalne sekvence se razlikuju u slijedu aminokiselina ali svaka ima 8 ili više nepolarnih aminokiselina u sredini.

Kako SRP specifično veže različite signalne sekvence?

mjesto vezanja signalne molekule – hidrofobni džep (bogat aminokiselinom metionin koja ima fleksibilne lance koji osiguravaju plastičnost potrebnu za vezanje različitih hidrofobnih signalnih sekvenci )

dokaz – proteaze ne djeluju na proteine sintetizirane u lumenu mikrosoma (degradiraju proteine koji se sintetiziraju na slobodnim ribosomima u uvjetima in vitro)

- signalna hipoteza – vodeća sekvenca na N-kraju proteina predstavlja signalnu sekvencu – usmjerava sekretorni protein prema translokatoru (pora u membrani ER kroz koju se odvija prijenos proteina) – signalna sekvenca se odvaja od polipeptidnog lanca prije završetka sinteze cijelog proteina pomoću signalne peptidaze

❖ metabolizam ugljikohidrata

Primjer regulacije šećera u krvi

U stanicama jetre glatki ER ima ulogu u metabolizmu ugljikohidrata

1. Stanice jetre pohranjuju ugljikohidrate u obliku glikogena (polisaharid)

2. Hidrolizom glikogena oslobađa se glukoza iz stanica jetre

3. Prvi produkt hidrolize glikogena je glukoza-fosfat, ionski oblik šećera koji ne može izaći iz stanica jetre

4. Enzim u membrani glatkog ER odvaja fosfat od glukoze koja tada nesmetano izlazi iz stanice

Translokator – Sec61 kompleks – tri do četiri proteinska kompleksa koji se sastoje od transmembranskih proteina

- vezanjem ribosoma središnji otvor translokatora i tunel u velikoj podjedinici ribosoma kroz koji izlazi rastući polipeptidni lanac tvore zajedničku strukturu tako da polipeptidni lanac ne može pobjeći iz ER

- pora se zatvara pomoću proteina u lumenu ER ili uslijed rearanžmana proteinskih kompleksa translokatora

- signalna sekvenca predstavlja okidač za otvaranje pore

- nakon odvajanja signalne sekvence od SRPa i kada polipeptid dosegne dovoljnu dužinu, signalna sekvenca se veže za poru (translokator) i otvara je – drugo prepoznavanje signalne sekvence od strane translokatora (prvo prepoznavanje od strane SRP)

Signalne sekvence otkrivene 1970tih – istraživanje sekretornih proteina koji su prolazili kroz ER prije izlaska iz stanice

– u uvjetima in vitro na izoliranim ribosomima sintetizirani su sekretorni proteini koji su bili dulji za dodatak na N-kraju proteina (amino-kraj proteina).

- na mikrosomima sintetizirani su proteini normalne duljine