Celluláris és Molekuláris Élettan

Doktori Program

AZ AT1A-ANGIOTENZINRECEPTOR INTERNALIZÁCIÓJÁNAK

MECHANIZMUSA

Gáborik Zsuzsanna

Témavezető:

Dr. Hunyady László, egyetemi docens

Semmelweis Egyetem

Élettani Intézet

Budapest

2001

2

ÖSSZEFOGLALÁS

Az angiotenzin II fő élettani hatásait közvetítő AT1-angiotenzinreceptor a G-fehérjéhez

kapcsolt receptorok családjába tartozik. E receptorok érzékenységének szabályozásában

több párhuzamos folyamat is szerepet játszik. A receptor aktiválódását követően a

molekula foszforilálódik és deszenzitizálódik. A receptor érzékenységének helyreállítása

(a reszenzitizáció) a receptor internalizációját követően jön létre. Mindkét folyamatban

fontos szerepe van a ß-arresztineknek, melyek a foszforilált receptort szétkapcsolják a

G-fehérjétől, majd a deszenzitizált receptort klatrin burkos gödröcskékhez irányítják.

Kísérleteinkben kimutattuk, hogy COS-7 sejtekben expresszált AT1-receptor karboxi-

terminális régiójának eltávolítása nem befolyásolta a receptor jelátvitelét, annak

ellenére, hogy a receptorendocitózis sebességének jelentős csökkenését eredményezte.

Munkacsoportunk korábbi adatai arra utaltak, hogy a receptor ezen régiójának agonista

hatására történő foszforilációja feltétele a receptor endocitózisának. Az AT1-receptor a

hormon legtöbb célsejtjében a klatrin mediált endocitózis útján kerül felvételre, azonban

a ß-arresztinek szerepe a folyamatban vitatott volt. Kimutattuk, hogy a ß-arresztin-1

csökkent receptor affinitású (V53D), és a klatrinkötő régió eltávolításával nyert (1-349)

mutánsait CHO sejtekben expresszálva az AT1A-receptor endocitózisának gátlását

okozták. A dinamin GTP-áz deficiens (K44A) mutánsának expresszálása szintén a

receptorendocitózis sebességének csökkenését okozta CHO sejtekben. A

receptorendocitózis folyamata nem volt sejtfüggő, ugyanis hasonló gátlást tapasztaltunk

COS-7 és HEK-293 sejtekben is. Ez a gátló hatás fiziológiás angiotenzin II

koncentrációknál jól kifejezett volt. Az agonista koncentráció növelésével azonban

csökkent az agonista kötött receptorok közül az endocitózisra kerülők hányada. A 30

nM angiotenzin II koncentráció által indukált receptorendocitózis sebességét a ß-

arresztin-1(1-349) és a dinamin-2(K44A) mutánsok expressziója nem csökkentette

tovább. Vad típusú ß-arresztin expressziója azonban részben helyreállította a receptor

endocitózisát. Adataink azt mutatják, hogy fiziológiás angiotenzin II koncentrációknál

az AT1-receptor endocitózisa döntően ß-arresztin- és dinamin-függő mechanizmussal

történik. Magas agonista koncentrációknál azonban az endogén ß-arresztin és egyéb, a

klatrin mediált endocitózisban szerepet játszó fehérjék mennyisége limitálhatja a

receptorendocitózis sebességét.

3

SUMMARY

The AT1 angiotensin receptor, which mediates the major physiological actions of

angiotensin II, is a member of the G protein-coupled receptor (GPCR) family. The

responsiveness of these receptors are regulated by multiple mechanisms. Agonist

induced activation of GPCRs followed by phosphorylation and desensitization of the

receptor. Resensitization of many GPCRs requires the agonist-induced endocytosis of

the receptor. ß-arrestins have multiple functions since these molecules bind to the

phosphorylated receptor and uncouple it from G-protein, and at the same time they also

target the desensitized receptor to clathrin-coated pits.

Although deletion of the C-terminal tail did not inhibit the signaling of the AT1 receptor

expressed in COS-7 cells, but impaired the endocytosis of the receptor. These findings

are in good accordance with studies that agonist-induced phosphorylation of the receptor

regulates its internalization kinetics. Several studies have suggested that agonist-induced

endocytosis of the AT1 receptor occurs via clathrin-coated pits, but the involvement of

ß-arrestins in the receptor internalization process is controversial. In our experiments

overexpression of ß-arrestin-1(V53D) mutant, which has reduced ability to bind to

GPCRs, and ß-arrestin-1(1-349), in which the clathrin and the AP-2 binding domains

are deleted, exerted inhibitory effects on the endocytosis of the AT1 receptor.

Coexpression of GTPase-deficient (K44A) mutant forms of dynamins also inhibited the

endocytosis of the AT1-receptor in CHO cells. Similar results were obtained in COS-7

cells and HEK-293 cells. These inhibitory effects were only observed at physiological

angiotensin II concentration. Studies on the angiotensin II concentration-dependence of

the AT1-receptor endocytosis showed that at higher agonist concentrations its rate

constant was reduced, and the inhibitory effects of dominant negative ß-arrestin and

dynamin constructs were abolished. Furthermore, overexpression of wild-type ß-arrestin

partially rescued the impaired internalization kinetics of the AT1 receptor at 30 nM Ang

II concentration. These data indicate that endocytosis of the AT1 receptor is ß-arrestin

and dynamin-dependent at physiological hormone concentration, but other mechanisms

may dominate at higher agonist concentrations, since the ß-arrestin mediated pathway

becomes saturated at high levels of receptor occupancy.

4

PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK

Az értekezés alapját képező közlemények:

I. Gáborik, Zs.; Mihalik, B.; Jayadev, S.; Jagadeesh, G.; Catt, K.J.; Hunyady, L.:

Requirement of membrane-proximal amino acids in the carboxyl-terminal tail for

expression of the rat AT1a angiotensin receptor. FEBS Lett. 428:147-151, (1998).

IF: 3,581.

II. Gáborik, Zs.; Szaszák, M.; Szidonya, L.; Balla, B.; Paku, S.; Catt, K.J.; Clark, A. J.

L.; Hunyady, L.: ß-arrestin- and dynamin-dependent endocytosis of the AT1 angiotensin

receptor. Mol. Pharmacol. 59: 239-247, (2001). IF: 5,465

Az értekezéshez kapcsolódó egyéb közlemények:

III. Hunyady, L.; Ji, H.; Jagadeesh, G.; Zhang, M.; Gáborik, Zs.; Mihalik, B.; Catt,

K.J.: Dependence of AT1 angiotensin receptor function on adjacent asparagine residues

in the seventh transmembrane helix. Mol. Pharmacol. 54:427-434, (1998). IF: 5,428.

IV. Smith, R.D.; Baukal, A.J.; Zolyomi, A.; Gaborik, Zs.; Hunyady, L.; Sun, L.;

Zhang, M.; Chen, H.-C.; Catt, K.J.: Agonist-induced phosphorylation of the endogenous

AT1 angiotensin receptor in bovine adrenal glomerulosa cells. Mol. Endocrinol. 12:634-

644, (1998). IF: 7,853.

V. Fierens, F.L.P.; Vandeheyden, P.M.L.; Gáborik, Zs.; Minh, T.L.; De Backer, J.-P-;

Hunyady, L.; Ijzerman, A.; Vauquelin, G.: Lys199 mutation of the human angiotensin

type 1 receptor differentially affects the binding of surmountable and insurmountable

non-peptide antagonists. J.Renin-Angiotensin-Aldosterone System 1:283-288, (2000).

VI. Hunyady, L.; Catt, K.J.; Clark, A.J.L.; Gáborik, Zs.: Mechanisms and functions of

AT1 angiotensin receptor internalization. Regul. Pept. 91: 29-44, (2000). IF: 1,827.

VII. Hunyady, L., Gáborik, Zs., Vauquelin, G., Catt, K.J.: Structural requirements for

signalling and regulation of AT1-receptors. J.Renin-Angiotensin-Aldosterone System

2:S16-S23, (2001).

5

TARTALOMJEGYZÉK

Összefoglalás 2

Summary 3

Publikációs jegyzék 4

Tartalomjegyzék 5

Rövidítések, jelölések 6

Bevezetés 7

Célkitűzések 9

Irodalmi háttér 10

Az angiotenzin II receptorok áttekintése 10

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szerkezeti és működésbeli hasonlósága 12

A receptorendocitózis 14

A receptorinternalizáció molekuláris mechanizmusa 14

Az AT1-angiotenzinreceptor endocitózisa 20

Módszerek 23

Eredmények 27

A receptor karboxi-terminális régiójának szerepe a receptorműködés

szabályozásában 27

Az AT1-receptor internalizációjának mechanizmusa 29

Megbeszélés 41

A karboxi-terminális régió a receptorfehérje expressziójában és a receptor

endocitózisában játszik szerepet 41

Az AT1-receptor endocitózisának mechanizmusa 42

Az endocitózis klatrin-burkolt vezikulákon keresztül történik 42

A receptorendocitózisban részt vesznek a ß-arresztin és dinamin fehérjék 43

Az AT1-receptor endocitózisát befolyásolja az agonista koncentrációja 44

Köszönetnyilvánítás 49

Irodalomjegyzék 50

Publikációk különlenyomatai 61

6

RÖVIDÍTÉSEK, JELÖLÉSEK

Ang II Angiotenzin II

Fluo-Ang II Fluorenszceinnel jelzett Ang II

AT1-R egyes típusú angiotenzin II receptor

AT2-R kettes típusú angiotenzin II receptor

G-fehérje GTP-kötő fehérje

IP3 inozitol-triszfoszfát

IP2 inozitol-biszfoszfát

ke endocitotikus sebességi állandó (perc-1)

7TM-receptor hét transzmembrán domént tartalmazó receptor

CHO kínai aranyhörcsög ovárium eredetű sejtvonal

HEK-293 humán embrionális vese eredetű sejtvonal

COS-7 majomvese eredetű sejtvonal

GRK G-fehérjéhez kapcsolt receptor kináz

MAPK mitogén aktivált protein-kináz

PKC protein-kináz C

AP-2 adapter fehérje-2

Ábrajelölések:

Az értekezés végén található két saját közlemény ábráira a közleményt jelölő római

számmal és a közlemény eredeti ábraszámozásával hivatkozom. Az értekezés saját

ábráit arab számokkal jelöltem.

7

BEVEZETÉS

A vérkeringés és a só-vízháztartás szabályozásában alapvető szerepet játszó renin-

angiotenzin rendszer meghatározó effektor molekulája az oktapeptid angiotenzin II,

mely a vérben keringő angiotenzinogénből renin és angiotenzin konvertáló enzim

hatására keletkezik. Az Ang II a keringő hormon hatása mellett egyes szövetekben

parakrin módon, a központi idegrendszerben pedig neurotranszmitterként is kifejti

hatását. A szövetekben az Ang II élettani és terápiás szempontból fontos hatásait

sejtfelszíni receptorok közvetítik, melyeknek emberben két típusa különíthető el: az

egyes (AT1) és a kettes típusú (AT2) angiotenzinreceptor. Az ismert élettani hatások

többsége az AT1-receptoron keresztül jön létre, mely a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok

családjába tartozik. Az ebbe a családba tartozó több ezer receptor olyan különböző

ingerek és molekulák felismerésében és jeltovábbításában vesz részt mint a fény,

illatanyagok, Ca2+-ion, feromonok, hormonok és neurotranszmitterek. A receptorok

közös szerkezeti jellemzője, hogy 7 transzmembrán (7TM) hélixből és az azokat

összekötő extra- és intracelluláris doménekből épülnek fel. A receptor aktivációja során

a transzmembrán hélixek orientációja megváltozik, ez a konformációváltozás közvetíti a

jelet a sejt belseje felé. Az aktivált receptorok heterotrimer G-fehérjéken keresztül

különböző jelátviteli utakat aktiválnak a sejtben, köztük enzimek, ioncsatornák és

transzportfolyamatok működését befolyásolják. Egyes adatok arra utalnak, hogy a 7TM-

receptorok egy része G-fehérjéktől független növekedési és differenciálódási hatások

közvetítésében is szerepet játszik.

A 7TM-receptorok aktiválódását a jelátviteli folyamat beindulása mellett a receptor

működését szabályozó folyamatok aktiválódása is kíséri. Az agonistakötést követően a

receptorok rövid időn belül deszenzitizálódnak. Számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor

esetében kimutatták, hogy ezt részben a receptor foszforilációja okozza. A receptor

foszforilációjának egy további következménye, hogy az aktivált receptorok

endocitózisra kerülnek. A 7TM-receptorok internalizációja döntő részben klatrinnal

burkolt vezikulák segítségével történik. Az internalizáció során az endocitotikus

vezikulákba jutott receptorokról a savas pH hatására leválik az agonista, a receptort

intracelluláris foszfatázok defoszforilálják, így az újra aktiválható állapotban

visszajuthat a sejtmembránba vagy lizoszómális degradációra kerül. A receptorok

8

endocitózisa csökkenti a sejtfelszíni receptorszámot, ezért sokáig ezt a folyamatot a

hormon hatására létrejövő deszenzitizáció egyik részjelenségének gondolták. Az

internalizáció mechanizmusának megértése viszont világossá tette, hogy az esetek nagy

részében olyan receptor kerül felvételre a sejtbe, amely a G-fehérjétől szétkapcsolt,

deszenzitizált állapotban van. Ennek következtében mai elképzeléseink szerint a

receptorinternalizáció fő funkciója, hogy lehetővé teszi a deszenzitizált receptorok

reszenzitizációját és visszajutását a plazmamembránba, és ezáltal hozzájárul a receptor

érzékenységének helyreállításához. Míg ezek a receptorok érzékenységét és sejten belüli

elhelyezkedését befolyásoló folyamatok az aktivációt követően rövid időn belül

kialakulnak, tartósan fennálló ingerlés a sejtben található receptorok számának

csökkenését, down-regulációját okozza. Mindezek a jelenségek nagymértékben

befolyásolják a terápiásan alkalmazott receptor ligandok hatékonyságát és az

alkalmazhatóság időtartamát.

Számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében a molekula karboxi-terminális

régiójának agonista kötést követő foszforilációja fontos szerepet játszik a receptor

endocitózisában. Elsőként a ß2-adrenerg receptor esetében írták le, hogy a foszforilált

receptorhoz kötődő ß-arresztin fehérjék amellett, hogy az aktivált receptort

szétkapcsolják a G-fehérjétől, és ezáltal a receptort deszenzitizálják, a receptor

endocitózisában is fontos szerepet játszanak, mert e molekulák képesek kötődni a

receporhoz és a klatrin burok komponenseihez, és ezáltal adapter fehérjeként

működhetnek a receptorinternalizáció során. A ß-arresztinek adapter fehérje funkcióját

később más receptorok endocitózisában is sikerült kimutatni. Azonban néhány receptor,

köztük az AT1-angiotenzinreceptor esetében az irodalmi adatok ellentmondóak voltak a

receptorendocitózis mechanizmusával kapcsolatban. Kísérleteink kezdetekor az AT1-

receptor endocitózisának molekuláris mechanizmusáról, a szükséges struktúrális

elemekről, valamint a résztvevő fehérjékről kevés és részben ellentmondó ismeret állt

rendelkezésre, mert az endogén AT1-receptorokon végzett vizsgálatok eredményei arra

utaltak, hogy az internalizáció klatrin-mediált mechanizmussal történik [1;VI].

Expresszált receptorokon végzett vizsgálatok azonban azt mutatták, hogy a folyamat ß-

arresztin és dinamin-independens, és ez alapján felvetődött a klatrin-independens

folyamatok lehetséges szerepe [2].

9

CÉLKITŰZÉSEK

A 7TM-receptorok családjába tartozó AT1-angiotenzinreceptor aktivációját követő

folyamatokban főként a receptor intracelluláris régióinak szerepét valószínűsítik.

Kísérleteink első felében a receptor karboxi-terminális régiójában a membránközeli

aminosavak szerepét vizsgáltuk a receptor aktiválódását követő folyamatokban.

Munkacsoportunk korábbi adatai arra utaltak, hogy a receptor foszforilálódik a karboxi-

terminális régió szerin és treonin aminosavain és ez a foszforiláció feltétele a receptor

endocitózisának. Szintén ismert volt, hogy az endogén AT1-receptor főleg klatrinnal

burkolt vezikulák révén kerül felvételre, de ennek mechanizmusára és az adapter

fehérjék szerepére vonatkozóan ellentmondóak voltak az irodalmi adatok. Kísérleteink

második felében a receptor endocitózisának mechanizmusát vizsgáltuk, ezen belül a

következő kérdésekre kerestünk választ:

1. A tranziensen expresszált AT1-receptor CHO sejtekben is klatrin mediált útvonalon

kerül-e felvételre?

2. Kimutatható-e a ß-arresztin fehérjék szerepe az AT1-receptor endocitózisának

folyamatában CHO sejtekben?

3. Van-e szerepük a klatrinnal burkolt vezikulák lefűződésében szerepet játszó dinamin

GTP-ázoknak az AT1-receptor internalizációjában CHO sejtekben?

4. Hasonló mechanizmussal jön-e létre az internalizáció egyéb (pl. COS-7 és HEK-293

sejtekben?

5. Befolyásolja-e az agonista koncentrációja a receptorendocitózis mechanizmusát az

általunk használt tranziens expressziós rendszerben?

10

IRODALMI HÁTTÉR

Az angiotenzin II receptorok áttekintése

Az angiotenzin II egy oktapeptid hormon (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe), mely

fontos szerepet játszik a szervezet vérkeringésének és só-vízháztartásának

szabályozásában. A renin hatására felszabaduló angiotenzin I-ből az angiotenzin

konvertáló enzim hasítja le a biológiailag aktív angiotenzin II-t. Az Ang II a keringő

hormon hatásán kívül egyes szövetekben parakrin hatásokat is közvetít, és a központi

idegrendszerben neurotranszmitterként is szerepet játszhat. Az Ang II a célszervek

sejtjeinek felszínén található receptoraihoz kötődve intracelluláris jelátviteli utakat indít

be, melyek azonnali válaszokat (aldoszteronszekréció, vazokonstrikció,

szomjúságérzet), valamint hosszútávú növekedési és proliferációs folyamatokat

szabályoznak. A renin-angiotenzin rendszer terápiás jelentőségét alátámasztják az

angiotenzin konvertáló enzim gátlókkal és az AT1-receptort blokkoló vegyületekkel

elért kedvező eredmények a magasvérnyomás és más keringési betegségek kezelésében.

Az AT1- és AT2-angiotenzinreceptorok jellemzése

Az Ang II sejtfelszíni receptorainak két altípusa különíthető el emberben: az egyes

típusú (AT1) és a kettes típusú (AT2) angiotenzinreceptor [3;4]. Az AT1 és AT2-

receptorok a 7 transzmembrán hélixet tartalmazó receptorok családjába tartoznak,

amelyeknek közös jellemzője, hogy heterotrimer GTP-kötő fehérjéken keresztül fejtik ki

hatásaikat. Az Ang II mindkét receptorhoz hasonlóan nagy affinitással kötődik, de az

AT1 és AT2-receptorok farmakológiailag a típusspecificitást mutató nem-peptid

antagonista kötésük alapján elkülöníthetőek. A receptorokat később molekuláris

biológiai módszerekkel is azonosították, az AT1-receptor (AT1-R) emlősökben 359, az

AT2-receptor (AT2-R) 363 aminosavból álló glikozilált fehérje. A két receptor

egymással 32-34 % homológiát mutat [5-7]. A szerkezeti homológia ellenére a

receptorok funkciója teljesen eltérő. Szöveti eloszlásukra jellemző, hogy az AT1-

receptor található meg a hormon ismert célszerveiben, míg az AT2-R a magzati

szövetekben, agyban és a reproduktív szervekben expresszálódik nagyobb

mennyiségben [3;4]. Az AT1-R aktivációja Gq-fehérjén keresztül intracelluláris Ca2+-jel

kialakulásához és PKC aktiválódásához vezet, valamint sejtnövekedési és

11

differenciálódási hatásai is ismertek, az AT2-R pedig a legtöbb sejtben növekedést gátló

hatásokat közvetít, tirozin-foszfatázokat aktivál és apoptózist indukál [4]. További

különbség, hogy míg az AT1-R szabályozásában fontos szerepet játszik a receptor

endocitózisa [8;VI], addig endogén és expresszált AT2-receptorral végzett kísérletek azt

mutatták, hogy ez a receptor nem kerül felvételre a sejtbe agonista hatására [9;10].

Mivel az ismert élettani hatások döntő többsége az AT1-receptorokon keresztül jön létre

a továbbiakban ezzel a receptorral kívánok foglalkozni.

1. ábra A patkány AT1A-angiotenzinreceptor aminosav szekvenciája. Piros színnel az értekezésben

tárgyalt aminosavakat jelöltem. Zöld szín jelöli azokat az aminosavakat, amelyekre, mint irodalmi

adatokra hivatkozom az értekezésben. Az ábrán fekete alapon a 7TM-receptorok rodopszin családjában

kb. 500 szekvencia vizsgálata alapján legalább 85%-ban konzervált aminosavak vannak feltüntetve [179].

Az aminosavakat egybetűs kódjukkal jelöltem.

NH2 E.C.

I.C.COOH

MN L AA S SG D EK II RDD QP C

GAK

YSHR

FI

N

VPI

ML T

SIY

VFIGV IF G

SVV

L

IV IYF

M KY

KL

70LDA

TVS A V

L L F

LAN

CFL

L TL L

LPV A W

C

ATY

YEM

WRGF

P

LHN

D R

AI KS AS

FSV

YLNS V

AL L

F

LC TIS

YL

A

VH

I

MP S RKRL

RT

M

WA

VLK A

TVI C

I IML

ALS

PLVI AR H

N

G

C

VYF

EI

TNN I

TAFV

YE

HRS

LTSN

IP

TL

LP

Y

G

NKL G L

FG IF

FL

I LI

T S

WILT

RLAK

EYKK

A KQIP

KN

D DN

PW

IR F I

A M II

F F FL V

SF

I Q HV

F T FD L

ILV

LQ

HIVG KCD

DSI

DVI

C F E V EK P A S

SAK SS M R YPSDN TLS M K TS SLS S SH PKAK YIP LLK

LQ

KYF

FK

K

F

L N PY

A M PT

CITI

A Y FI

G KL

LFG

CN N

309

315319

12

Az AT1 -angotenzinreceptor általános jellemzése

Az AT1-receptornak rágcsálókban további két, egymással 90 % homológiát mutató

altípusa (AT1A és AT1B) ismeretes [5;11;12]. Az AT1A altípus főként érfal

simaizomsejtekben, májban, vesében, tüdőben és a központi idegrendszerben fordul elő,

míg az AT1B altípus dominál a mellékvesében és a hipofízisben. Más emlősökben nem

található meg e két AT1-R altípus megfelelője, és az eddigi adatok alapján az AT1A és

AT1B altípusok között sincs jelentős farmakológiai és funkcionális különbség [4]. A

patkány érfal simaizomsejtből származó AT1A-R aminosav szekvenciája az 1. ábrán

látható.

Az AT1-R klasszikus jelátviteli útján Gq/11 családba tartozó heterotrimer G-fehérjék

aktiválásán keresztül foszfolipáz C-ß1 enzimet aktivál, ami foszfatidilinozitol-4,5-

biszfoszfát hasításával inozitol-1,4,5-triszfoszfát (IP3) és diacil-glicerol (DAG)

keletkezéséhez vezet. A másodlagos hírvivők keletkezése intracelluláris Ca2+-jel

kialakulását és protein-kináz C aktivációját eredményezi. A receptor jelátvitelében a

klasszikus G-fehérjén keresztül létrejövő hatások mellett egyre több alternatív jelátviteli

útvonal szerepét írták le, többek között intracelluláris tirozin-kinázok, foszfolipáz C-�1,

JAK-STAT útvonal és Akt/protein-kináz B aktiválását, valamint a kis G-fehérjék közül

a Rho, Ras és Rac aktivitásának szabályozását [4;13-17]. A jelátviteli utak aktivitását

hasonlóan más 7TM-receptorokhoz szabályozza a receptor gyors deszenzitizációja,

valamint hosszú távon a receptorszám down-regulációja a sejtben [8;18-22].

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szerkezeti és működésbeli hasonlósága

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok szerkezete

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok a membránreceptorok legnépesebb családját

alkotják, gerincesekben a családnak több mint 1000 tagja ismert, a receptorokat kódoló

gének a genom több, mint 1%-át teszik ki. A receptorok olyan különböző ingerek és

molekulák által közvetített jelek továbbításában vesznek részt mint a fény, illatanyagok,

Ca2+-ion, különböző szerkezetű hormonok és neurotranszmitterek. A transzmitterek

széles skálája ellenére a családba tartozó receptorok szerkezete nagyfokú homológiát

mutat. A hét 20-25 hidrofób aminosavból álló transzmembrán �-hélixet három

intracelluláris (IC1, IC2, IC3) és három extracelluláris (EC1, EC2, EC3) hurok

13

kapcsolja össze. A receptorok aminoterminális része extracellulárisan található, míg a

karboxi-terminális régió a citoplazmában van. A rodopszin kristályszerkezetének

megismerése kapcsán a közelmúltban vált világossá, hogy e karboxi-terminális régió

kezdeti szakaszán egy nyolcadik �-hélix található [23]. A szekvenciákban tapasztalható

eltérések mellett a receptorok N-terminális extracelluláris és C-terminális intracelluláris

doménjük, valamint az intracelluláris hurkok hosszában térnek el egymástól. A

receptorok szekvencia homológiája alapján eddig hat különböző receptorcsaládot

találtak [24]. Az 1-es családba tartozik a legtöbb eddig megismert 7TM-receptor, mint a

rodopszin, adrenerg és AT1-receptorok. A receptorok aminosav szekvenciájában

található különböző mértékben konzervált elemek legtöbbször fontos szerepet játszanak

a receptor működésében.

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok működésének és szabályozásának jellemzői

A családba tartozó receptorok agonista kötésének, aktiválódásának és G-fehérje

kötésének közös struktúrális jellemzői vannak. A kisméretű ligandok, köztük az Ang II

is, a receptor transzmembrán hélixei által képzett hidrofób ligandkötő zsebbe kötődnek

be, míg a nagyobb méretű ligandok ezen felül az extracelluláris hidrofil hurkokhoz és az

N-terminális régióhoz is kötődnek [25-27]. Az agonista kötődése stabilizálja a receptor

aktív konformációját, a membránhélixek orientációjának megváltozása közvetíti a jelet

a sejt belseje felé [27]. A receptor G-fehérje kötésben a második és harmadik

intracelluláris hurok aminosavainak szerepét írták le a legtöbb receptor esetében,

valamint néhány receptor esetében a karboxi-terminális régió szerepét is valószínűsítik

[25;28;29]. A receptor aktív konformációja fokozza a G-fehérje �-alegységén a GDP-

GTP cserét, a GTP kötött G� disszociál a ß� alegységről és a receptorról, és a szabad,

GTP-t kötő � és ß� alegységek enzimek és ioncsatornák aktivitását befolyásolják. Az

agonista kötését követően a jelátvitel másodperceken-perceken belül deszenzitizálódik,

ennek egyik oka a receptor foszforilációja másodlagos hírvivők által aktivált kinázok

vagy specifikus receptor kinázok által [30-32]. Ezt szinte azonnal követi a receptorok

endocitózisa.

14

A receptorendocitózis

Számos sejtfelszíni receptor képes a membránról lefűződő vezikulák révén a sejt

belsejébe kerülni, ezt a folyamatot nevezzük receptorendocitózisnak [33;34]. A sejtek

ezen az úton vesznek fel különböző tápanyagokat, hormonokat, növekedési faktorokat,

de egyes vírusok is ezen az úton jutnak be a sejtbe. A legtöbb tápanyagot kötő receptor,

mint például az LDL és transzferrin receptorok, konstitutív internalizációval kerülnek

felvételre, függetlenül a ligand kötésétől. A hormon és növekedési faktor receptorok

endocitózisát azonban a specifikus agonista kötése indítja be [33;34].

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisa

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisát először béka vörösvérsejteken írták le,

ahol megfigyelték, hogy a sejtfelszíni ß2-adrenerg receptorok száma agonista hatására

csökken és ezzel párhuzamosan nő az intracellulárisan található receptorok száma [35].

Az endocitózissal bejutott receptorok mennyiségét a hidrofób és hidrofil ligandok

segítségével mért kötés különbségéből lehetett meghatározni [36]. Később a ß2-adrenerg

receptor intracelluláris vezikulákban történő megjelenését immunhisztokémiai

vizsgálatokkal és GFP-vel (zöld fluoreszcens fehérje) jelölt receptor élő sejtben történő

vizsgálatával egyaránt igazolták [37;38]. A továbbiakban számos 7TM-receptor

endocitózisát kimutatták hasonló vizsgálatokban [39-42].

A receptorinternalizáció molekuláris mechanizmusa

A receptorendocitózis mechanizmusa

Az endocitózis történhet klatrinnal burkolt [33] vagy burok nélküli vezikulákkal [43], és

kaveolák segítségével [44]. A klatrin-mediált endocitózis szerepe jól ismert a tápanyag

receptorok és a növekedési faktor receptorok endocitózisában, valamint a szinaptikus

vezikulák újrafelvételében [45]. Az eddigi kutatások eredményei azt mutatják, hogy a

7TM-receptorok endocitózisának is ez a fő mechanizmusa [46]. Néhány esetben

azonban a 7TM-receptorok endocitózisában a kaveolák [47;48] és a nem burkolt

vezikulák szerepét is leírták [49;50], de a pontos mechanizmus még tisztázásra vár.

Több 7TM-receptor esetében is felvetették, hogy a receptorok aktiválódásuk során a

kaveolákba helyeződnének át [51-53], az A1 adenozinreceptor esetében azonban ennek

15

ellenkezőjét tapasztalták [54]. Újabb adatok szerint a plazmamembrán

koleszterintartalmának megváltoztatásával befolyásolni lehet az ETA-endothelinreceptor

endocitózisában részt vevő endocitotikus útvonalak arányát [55].

Legtöbb adat a klatrin-mediált endocitózisról áll rendelkezésre, melynek legfontosabb

összetevője a 190kDa molekulatömegű klatrin. Három-három klatrin nehézlánc és a

hozzá szorosan kötődő klatrin könnyűlánc összekapcsolódva háromágú strukturát,

klatrin triszkeliont hoz létre. Ezek in vitro és in vivo képesek oligomerizálódni,

létrehozva egy öt és hatszögekből álló hálózatos szerkezetet [56]. Ez a klatrinból álló

háló veszi körül a lefűződő vezikulát, így az elektronmikroszkóposan jól elkülöníthető a

nem burkolt vezikuláktól. A klatrin burokban számos más fehérje is található, többek

között az adapter protein (AP) komplexek. Ezek szerepe egyrészt a klatrin rögzítése a

membránhoz másrészt a tápanyag és növekedési faktor receptorokhoz kötődve azokat a

klatrinnal borított gödröcskék területére irányítják [33;56;57]. A 7TM-receptorok

esetében az AP komplexek mellett egy másik adapter fehérje, a ß-arresztin szerepét is

valószínűsítik a receptor klatrin burokhoz kapcsolásában [58;59].

A különböző G-fehérjéhez kapcsolt receptorok klatrin-mediált endocitózisában azonban

jelentős eltérések mutatkozhatnak. Különbözhet a receptorendocitózis sebessége,

például az A1 adenozinreceptor lassan internalizál (t1/2�90 perc), míg az A3 receptor

jóval gyorsabban (t1/2�19 perc) [48;60]. Ezek a különbségek a receptorendocitózis

kinetikájában tükrözhetik a különböző endocitotikus utakat, vagy a receptorok eltérő

affinitását az endocitotikus út adapter fehérjéihez. A transzferrin és a ß2-adrenerg

receptor esetében kimutatták, hogy bár mindkettő endocitózisa klatrin-mediált,

nagyrészt elkülönült vezikulákkal kerülnek felvételre, amelyek hőmérséklet

érzékenysége és ß-arresztin tartalma eltérő [61]. Különböző lehet a receptorok

endocitózisának foszforiláció függése [62-64], valamint, hogy mennyire érzékenyek az

endocitotikus út különböző fehérjéinek, mint ß-arresztin, dinamin vagy a GIT1, az ADP

ribozilációs faktor GTP-áz aktiváló fehérjéjének jelenlétére és mennyiségére [48;65-67].

A foszforiláció szerepe a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisában

Számos 7TM-receptor esetében leírták, hogy a receptor foszforilációja specifikus

receptor kinázok (GRK) által, a receptor homológ deszenzitizációján túl a receptor

16

internalizációjában is szerepet játszhat [63;68-71]. A receptorok a harmadik

intracelluláris hurok régióban és a karboxi-terminális régióban található szerin és treonin

aminosavakon foszforilálódnak [30;72]. Ezeknek a szekvenciáknak a jelenléte

szükséges az m1, m2 és m3 muszkarinos Ach-receptorok [73], a �-opioid receptor [74]

és az AT1-R (IV.) endocitózisához. További vizsgálatok arra engedtek következtetni,

hogy a GRK-ok internalizációt elősegítő hatása a ß-arresztinek jelenlététől függ [59]. A

ß2-adrenerg receptor internalizációjának mértéke különböző sejttípusokban a GRK2 és a

ß-arresztin expressziós szintjével mutat összefüggést és a két fehérje szinergista módon

szabályozza a receptor endocitózisát [71]. A jelenlegi ismeretek alapján a receptor

foszforilációja fokozza a ß-arresztin fehérjék affinitását a receptorhoz és ezáltal segíti

elő a receptor endocitózisát [75;76].

A ß-arresztinek mint adapter fehérjék szerepe a receptorinternalizációban

Az arresztin fehérjéket először a retina pálcikáiban írták le, mint a rodopszin

deszenzitizációjában szerepet játszó fehérjéket [77]. Az arresztinek a foszforilált

receptorhoz kötődve fizikailag megszüntetik a receptor-G-fehérje kapcsolatot

[30;32;78]. A továbbiakban a ß2-adrenerg receptor deszenzitizációjában is azonosítottak

hasonló fehérjét, amit ß-arresztinnek neveztek el [79]. Az arresztin családnak jelenleg

négy tagját ismerjük, közülük a vizuális arresztinek kizárólag a retina fotoreceptoraiban

expresszálódnak. A ß-arresztin-1 és ß-arresztin-2 azonban a retinán kívül minden

sejtben expresszálódik, és a deszenzitizációban játszott szerepük mellett a 7TM-

receptorok endocitózisában is részt vesznek adapter fehérjeként [59]. Ezt a funkciót az

teszi lehetővé, hogy a molekula N-terminális régióján keresztül képes az aktivált

receptorhoz, karboxi-terminális részén keresztül pedig a klatrinburok komponenseihez

kötődni, s ezáltal a receptort a klatrin-burkos gödröcskék területére irányítja [58]. A ß-

arresztin N-terminális régiójában található az aktivált receptort felismerő domén (24-

180), egy másodlagos receptorkötő domén (180-330), és egy foszfát-szenzor domén

[32]. A ß2-adrenerg receptor foszforilációja a ß-arresztin kötését 10-30-szorosára növeli

in vitro [75]. A molekula a karboxi-terminális részén rendelkezik egy klatrin-kötő

régióval, mely homológiát mutat az AP-2 megfelelő régiójával [30;80;81]. Újabb adatok

azt mutatják, hogy a C-teminális régió struktúrái a klatrintól függetlenül kötődnek az

AP-2 ß2-adaptin alegységéhez is [82;83]. Ezek a szakaszok a vizuális arresztinekből

17

hiányoznak [30]. A ß-arresztinek szerepét elsőként a ß2-adrenerg receptor

internalizációjában mutatták ki, a ß-arresztinek domináns-negatív pontmutánsainak

endocitózist gátló hatása alapján [59]. Ezeket a csökkent receptorkötő képességű az 53-

as (ß-arresztin-1) vagy 54-es (ß-arresztin-2) pozíciójú valin helyett aszparaginsavat

tartalmazó mutáns ß-arresztin fehérjéket elterjedten használják a 7TM-receptorok

endocitózisának vizsgálatában [2;41;84-87]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorokat az

alapján, hogy endocitózisuk gátolható-e domináns-negatív ß-arresztinnel két csoportba

osztották, arresztin-dependens és -independens receptor internalizációs mechanizmusról

beszélve [2;84;88]. Korai kísérletek alapján az AT1-R endocitózisát is az arresztin-

independens endocitózisok közé sorolták [2]. A 7TM-receptorok ß-arresztin függő

endocitózisához szükség van a dinamin GTP-ázok működésére is, de a ß-arresztintől

független internalizációs folyamatok egy része dinamintól független mechanizmussal is

létrejöhet [48;88;89].

A receptorinternalizáció szerepe a receptor érzékenységének szabályozásában

A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisának eredetileg a receptorok

deszenzitizációjában tulajdonítottak szerepet [36;90]. Az utóbbi időben megjelent

közlemények azonban új megvilágításba helyezték a receptorendocitózis szerepét a

receptorok szabályozásában. A receptorok agonista indukált homológ deszenzitizációja

az agonista kötését követően másodpercek-percek alatt bekövetkezik és mai ismereteink

szerint ezt elsősorban a receptor GRK hatására létrejövő foszforilációja okozza

[31;48;91;92]. Amint a fentiekből kitűnik a 7TM-receptorok nagy részénél a receptor

deszenzitizációját majd internalizációját egyaránt a ß-arresztinek kötődése hozza létre.

Ennek következtében olyan receptorok kerülnek felvételre, melyek a G-fehérjéktől már

szétkapcsolt állapotban vannak, ezért az internalizáció jelentősége a receptor

deszenzitizációja szempontjából nem számottevő. Ezzel szemben a

receptorinternalizáció fontos szerepet játszhat a receptor érzékenységének

helyreállításában, a reszenzitizációban, mert az endocitózis során a foszforilált receptor

intracelluláris kompartmentekbe jut, ahol savanyú foszfatázok defoszforilálják [93]. A

ß2-adrenerg receptorok esetében kimutatták, hogy az internalizációs vezikulákban a

receptorok kisebb mértékben foszforiláltak mint a sejtfelszíni receptorkészlet [93;94]. A

defoszforilált receptor visszajuthat a sejtmembránba és ott újra képes agonistát kötni és

18

aktiválni a jelátvitelt [32;95]. Egyre több adat bizonyítja a receptorendocitózis szerepét a

receptorok reszenzitizációjában. Közvetlen bizonyítékot jelentett, hogy a

receptorendocitózis gátlása specifikus gátlószerekkel megakadályozta a receptorok

reszenzitizációját, anélkül, hogy befolyásolta volna a receptorok jelátvitelét vagy

deszenzitizációját [96;97]. A ß2-adrenerg receptor internalizációra nem képes

mutánsainak jelátvitele és deszenzitizációja normális volt, a receptor reszenzitizációja

azonban szintén gátolt volt [98]. Az endocitózis szerepét a receptor reszenzitizációjában

számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében bizonyították [96;97;99-101].

2. ábra A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok endocitózisának lehetséges mechanizmusa és szerepe a

receptor érzékenységének szabályozásában. A 7TM-receptorok endocitózisának valószínűsített

folyamatát ábrázolja a ß2-adrenerg receptor endocitózisa alapján [32]. Az agonistakötést követően a

receptorokat G-fehérjéhez kapcsolt receptor kinázok (GRK) foszforilálják, ez elősegíti a ß-arresztinek

kötődését a receptorhoz, mely fehérjék az aktivált receptort szétkapcsolják a G-fehérjétől, és ezáltal a

receptort deszenzitizálják. A ß-arresztin fehérjék emellett a receptort a klatrin burokhoz irányítják és így

az aktivált receptorok endocitózisra kerülnek. Az internalizáció során az endocitotikus vezikulákba jutott

receptorokról a savas pH hatására leválik az agonista, a receptort intracelluláris foszfatázok

defoszforilálják, így a receptor újra aktiválható állapotban visszajuthat a sejtmembránba vagy lizoszómális

degradációra kerül. A: agonista, P: foszfátcsoport.

19

Dinamin GTP-ázok szerepe a receptorendocitózisban

Az endocitotikus vezikula képződésének utolsó lépése a vezikula leválása a

plazmamembránról, ebben a folyamatban fontos szerepe van 100 kDa molekulatömegű

GTP-áz fehérjének, a dinaminnak. E fehérje szerepét eredetileg a Drosophila

melanogaster hőmérsékletszenzitív shibire mutánsaiban írták le, ahol azt figyelték meg,

hogy a szinaptikus vezikulák lefűződése károsodott a dinamin GTP-kötő doménjének

mutációja következtében [102;103]. Emlősökben a dinamin három izoformáját írták le,

melyek közül a dinamin-1 csak neurális szövetekben, a dinamin-2 minden szövetben

expresszálódik, a dinamin-3 pedig a testisben, valamint szintén neurális szövetekben

fordul elő [104;105].

A dinamin nyugalomban homotetramerek formájában található meg a sejtben, de

megfelelő felszín jelenlétében a tetramerek spirál vagy gyűrű alakban összekapcsolódva

szupramolekuláris struktúrákat alkotnak [106-109], ezek a struktúrák in vivo is

megfigyelhetőek a klatrinnal burkolt gödröcskék nyaka körül [110;111]. Az összeépülés

nagymértékben növeli a dinamin GTP-áz aktivitását, ami szükséges a vezikulák

lefűződéséhez [112]. A vezikulák leválásának pontos mechanizmusa még nem ismert, a

dinamin szerepére vonatkozóan eddig három modell született. Kettő szerint a dinamin

spirál GTP hidrolízis hatására bekövetkező konformációváltozása közvetlenül felelős a

vezikula lehasadásáért, a spirálnak a vezikula nyaka körüli összeszorulása, vagy a spirál

megnyúlása révén [113;114]. A harmadik modell szerint a dinamin további effektor

molekulák működését szabályozva vesz részt a folyamatban [115;116]. A dinamin N-

terminális részén található a GTP-áz domén, az ebben létrehozott Lys44�Ala (K44A)

mutáció nagymértékben csökkenti a molekula GTP-áz aktivitását, ezért ha ezt a mutáns

fehérjét sejtekben expresszáljuk akkor az endogén fehérje funkciójának gátlásán

keresztül domináns-negatív módon gátolja az endocitózist [117;118]. A dinamin-1 ezen

mutánsát használták számos G-fehérjéhez kapcsolt receptor esetében a fehérje

endocitózisban betöltött szerepének vizsgálatára [2;41;89;119;120].

20

3. ábra ß-arresztin és dinamin fehérjék felépítése. A: A ß-arresztin fehérjék szerkezetének sematikus

képén a számozás az aminosav pozíciókat jelöli. A fehérje doménjeinek elhelyezkedése a következő: R1:

N-terminális regulátor domén (1-24 aminosavak); A: receptor aktivációt felismerő régió (24-180 as); P:

foszfát-szenzor régió (163-180 as); S: másodlagos receptorkötő régió (180-330 as); R2: C-terminális

regulátor domén (330-404); klatrin kötő régió 374-419 as és ß2-adaptin 378-410 [32]. A V53D a

Val53�Asp mutáció helyzetére utal, a 349-es pozíció a deléció helyét jelöli a ß-arresztin-1(1-349)

mutánsban. B: a dinamin molekuláris felépítésében az ábrán jelölt régiók a következőek: GTP-áz domén

1-299 as, PHD: pleksztrin-homológia domén (521-622 as), GED: GTP-áz effektor domén (623-745),

PRD: prolin gazdag domén (746-864 as) [105]. A K44A jelzés a Lys44�Ala mutáció helyzetét jelöli.

Az AT1-angiotenzinreceptor endocitózisa

Az AT1-receptor endocitózisának mechanizmusa

Az Ang II felvételét a sejtekbe több mint 25 évvel ezelőtt írták le endothel és

simaizomsejtekben [121;122]. Későbbiek során kimutatták, hogy a ligand a receptor

kötés után a plazmamembrán burkos gödröcskéiben koncentrálódik és rövid időn belül

endocitózisra kerül, majd a bejutott vezikulák endoszómákkal fuzionálnak és a ligand

lizoszómaszerű kompartmentekben tűnik fel [10;123;124]. A receptor endocitózisát

számos, az AT1-receptort expresszáló sejtféleségben leírták [124-132], és a morfológiai

adatok többsége azt mutatta, hogy a receptor burkos vezikulákkal kerül felvételre.

Elektronmikroszkópos vizsgálatokkal igazolták, hogy patkány érfal simaizom és

B dinamin

0 600400200 800

K44A

PHDGTP-áz PRDGED

����-arresztin

4003002001000

V53Dklatrin kötő régió

AP-2 kötő régió

349

A SPR1 R2

21

glomerulosa sejtekben a bekerült AT1-R a klatrin-burkos gödröcskékben és

vezikulákban található [124;126]. A klatrin mediált útvonal gátlása K+-deplécióval vagy

fenilarzén-oxid kezeléssel számos sejtben gátolta a receptor internalizációját, többek

között simaizom, glomerulosa és vese epithel sejtekben [8;125;128;133;134;VI].

Későbbi vizsgálatok HEK-293 sejtekben a receptor kolokalizációját mutatták ki

transzferrin receptorral [10]. Az AT1A-receptort stabilan expresszáló CHO sejtvonalban

a receptor endocitózisa szintén gátolható volt hiperozmotikus szacharóz kezeléssel

[135]. Polarizált sejtekben végzett kísérletek viszont azt mutatták, hogy az AT1-receptor

endocitózisának több útja is lehetséges egyazon sejtben. Vese proximális tubulussejtben

és stabilan transzfektált LLPCKC14 sejtekben a receptorendocitózis kinetikája és

mechanizmusa különböző volt az apikális és bazolaterális membránban. Az endocitózis

gyorsabb volt az apikális membránban, valamint fenilarzén-oxid kezeléssel és tirozin-

kináz inhibitorokkal gátolható volt, míg a bazolaterális membránban expresszálódó

receptorok endocitózisát nem befolyásolták ezek a kezelések [130;131;133]. A kaveolák

lehetséges szerepét is felvetették a receptor endocitózisában, ugyanis szacharóz

grádienses vizsgálatokban az AT1-R a kaveolinnal azonos frakcióban jelent meg,

valamint a kaveolin fehérje és a receptor koimmunprecipitálhatóságát agonista függőnek

találták [53]. Annak megállapítása, hogy a kaveolák milyen százalékban vesznek részt

az AT1-R internalizációjában további vizsgálatokat igényel.

Az AT1-receptor endocitózisának struktúrális követelményei

Az AT1-R klónozása lehetővé tette a vad típusú és mutáns receptorok vizsgálatát olyan

sejtvonalakban, amelyek nem rendelkeznek endogén AT1-receptorokkal. Ezek a

kísérletek azt mutatták, hogy az AT1-R Ang II hatására számos sejttípusban gyorsan

felvételre kerül, a t1/2 kevesebb, mint 10 perc [10;136-139]. Az AT1-R endocitózisát

peptid antagonisták is indukálják, azonban a nem peptid antagonista losartan, illetve

candesartan nem kerül felvételre a sejtbe [135;140;VI], ami arra utal, hogy a receptor

jelátvitelhez és endocitózishoz vezető aktív konformációi nem egyeznek meg teljesen.

Ezt támasztják alá azok a kísérletek, amelyekben a receptor bizonyos mutációi

szelektíven befolyásolták a jelátvitel és az endocitózis folyamatát. A második TM

hélixben található Asp74 szubsztitúciója gátolta a G-fehérje aktivációt, de az

internalizációt csak minimális mértékben csökkentette [137;141]. A receptor karboxi-

22

terminális részén található szerin és treonin aminosavak eltávolítása az internalizációt

jelentős mértékben gátolta míg a jelátvitelt nem befolyásolta [136]. A karboxi-terminális

régió szerin és treonin aminosavainak szerepe valószínűsíti a receptorfoszforiláció

jelentőségét a receptorendocitózis folyamatában. Voltak korai adatok, amelyek azt

mutatták, hogy a receptor agonista hatására foszforilálódik receptor kinázok és PKC

által [21;142-144]. Számos adat azonban arra utal, hogy a PKC hatására bekövetkező

foszforilációnak nincsen szerepe a receptor endocitózisában [145;146]. Ezzel szemben

az AT1-R receptor-kinázok hatására történő foszforilációja nagy valószínűséggel fontos

szerepet játszik a receptor internalizációjának szabályozásában, ugyanis kimutatták,

hogy azok a szerin és treonin aminosavak, melyek szerepet játszanak az AT1-R

endocitózisában, Ang II-vel történő stimulációt követően foszforilálódnak [147;148].

Ugyanakkor leírták, hogy az AT1-R internalizációja a ß-arresztin2 (V54D) és a dinamin-

1(K44A) mutánsaival nem gátolható HEK-293 sejtekben. Vad típusú ß-arresztin

expressziója azonban fokozta a receptorendocitózist HEK és COS-7 sejtekben és ez a

növekedés gátolható volt domináns-negatív dinaminnal [2]. Ezen adatok alapján arra a

következtetésre jutottak, hogy az AT1-R ß-arresztintől és dinamintól független úton

kerül felvételre, de nagy mennyiségű ß-arresztin jelenlétében a ß-arresztin- és dinamin-

dependens útat is tudja használni internalizációja során. Később azonban Zhang és

munkatársai azt találták, hogy az AT1-receptort expresszáló HEK-293 sejtekben

agonista stimuláció hatására a ß-arresztin diffúz citoplazmatikus lokalizációja

megváltozik és a fehérje a plazmamembránhoz lokalizál [2]. Ez arra utalt, hogy az AT1-

R interakcióba tud lépni a ß-arresztinnel és valószínűsítette a fehérje funkcióját a

receptor működésében.

23

MÓDSZEREK

Receptor mutánsok létrehozása

A patkány érfal simaizomból származó 1A típusú angiotenzin II receptort kódoló

cDNS-t pcDNA3 eukarióta expressziós vektorba építettük be, mely tartalmazza a

plazmid baktériumban történő fenntartásához és sokszorosításához, egyszálú DNS

templát készítéséhez és a receptorfehérje eukarióta sejtekben történő expressziójához

szükséges szabályozó elemeket. A receptor cDNS-ben a mutációkat irányított

mutagenezissel, Kunkel féle módszer segítségével hoztuk létre [149]. A módszer

lényege, hogy az AT1A-receptor cDNS-t tartalmazó plazmidról mutáns baktériumok és

helper fág segítségével olyan egyszálú DNS templátot készítettünk, mely random

előfordulási helyeken timin bázisok helyett uracilt tartalmazott. Erről a templátról a

tervezett mutációt tartalmazó primerrel DNS-polimeráz és DNS-ligáz segítségével

kétszálú DNS molekulát hoztunk létre, amelyet baktériumokba juttattunk. A

baktériumokban működő repair mechanizmus a két DNS szál közötti eltérést kijavítja,

melynek során az uracil tartalmú templát felhasználása jelentősen növeli az általunk

tervezett mutáns DNS-t tartalmazó baktérium kolóniák előfordulási valószínűségét. A

baktériumokból kolóniákat szelektáltunk, melyekből plazmidot izoláltunk és a mutációs

primerrel bevitt restrikciós hely segítségével azonosítottuk a mutáns cDNS-eket.

Valamennyi előállított mutáns AT1-R szekvenciáját szekvenálással ellenőriztük. A vad

típusú és mutáns dinamin fehérjéket kódoló cDNS-eket Dr. Kazuhisa Nakayama

(Tsukuba Science City, Ibaraki, Japán), a ß-arresztin-1 cDNS-eket Dr. Marc G. Caron

(Durham, Észak-Karolina, USA) és Dr. Stephen S. G. Ferguson (London, Ontario,

Kanada) bocsátotta rendelkezésünkre.

Mutáns és vad típusú fehérjék expressziója

A mutáns és vad típusú receptorok működésének vizsgálatához a fehérjéket

sejtkultúrában fenntartott COS-7, CHO-K1 és HEK-293 sejtekben expresszáltuk. A

COS-7 és HEK sejteket DMEM, a CHO sejteket Ham’s F-12 médiumban növesztettük,

amely 10% borjúszérumot, 100 IU/ml penicillint és 100 �g/ml streptomycint, és

NaHCO3-ot tartalmazott. A 24 lyukú lemezeken tenyésztett sejteket 48 órával a

24

kísérletek előtt transzfektáltuk a receptor cDNS-eket, valamint dinamin vagy ß-

arresztin1 cDNS-eket tartalmazó plazmidokkal Lipofektamin (Life Technologies) vagy

FuGENE (Roche Diagnostics) segítségével. A tanszfektálást követően a sejtek

tranziensen expresszálják a receptort és a vizsgálni kívánt egyéb fehérjéket, ami

lehetőséget teremt a receptor működésének vizsgálatára emlős sejtekben. A fehérjék

expressziója a transzfekciót követő második napon volt maximális, ezért kísérleteinket

minden esetben ekkor végeztük.

Kötési vizsgálatok

A mutáns és vad típusú angiotenzinreceptorok ligandkötési sajátosságait és a sejtfelszíni

expresszált receptorok mennyiségét 125I-dal jelzett �Sar1,Ile8 ]Ang II (peptid antagonista)

kötés alapján határoztuk meg. A sejtekhez azonos mennyiségű jelzett és növekvő

mennyiségű nem jelzett ligandot adtunk Hepessel pufferolt, 1 mg/ml BSA-t tartalmazó

DMEM vagy F-12 médiumban, majd 4 °C-on 6 órán át inkubáltuk. A sejtek PBS-es

(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM NaHPO4, 1,8 mM KH2PO4, pH: 7,4) mosása után

a kötött radioaktivitást �-számlálóval határoztuk meg. Az így nyert leszorítási görbék

Scatchard analízisével meghatároztuk az egyes mutáns receptorok ligandkötésének

affinitását és a sejt felszínén expresszált receptorok számát.

Inozitol-foszfát válasz mérése

A mutáns angiotenzinreceptorok jelátviteli folyamatot aktiváló képességének

hatékonyságára az Ang II hatására létrejövő inozitol-foszfát válasz alapján

következtettünk. A transzfektált sejteket a kísérleteket megelőzően 18-24 óráig 3H-

inozitol jelenlétében inkubáltuk 20 �Ci/ml myo-[2-3H]inozitolt (Amersham), 2,5 %

borjúszérumot, 100 IU/ml penicillint és 100��g/ml streptomycint tartalmazó

médiumban. Az ily módon előjelzett sejteket 30 percig előinkubáltuk 10mM LiCl

jelenlétében a inozitol-foszfát átalakulások minimalizálása érdekében [150]. A sejtekhez

LiCl-t tartalmazó Hepessel pufferolt médiumban 1�M Ang II adtunk és 20 percig

inkubáltuk 37 °C. 10 %-os perklórsavval történő leállítást követően a mintákból az

inozitol-foszfátokat tartalmazó vízoldékony frakciót kivontuk, majd az inozitol-

foszfátokat ioncserélő Dowex oszlop segítségével elválasztottuk. Az 1 M-os

25

ammónium-formiáttal eluálható inozitol-bisz- és inozitol-triszfoszfátokat tartalmazó

frakció radioaktivitását mértük szcintillációs számláló segítségével. Az így kapott

inozitol-foszfát válasz nagyságát a sejtfelszíni expresszált receptorok száma is

befolyásolja, ezért a kapott inozitol-foszfát válaszokat az expresszált receptorok száma

alapján normalizálva is feltüntettük [151].

A receptorinternalizáció mérése

A receptorinternalizáció kinetikájának meghatározásához a sejtekhez 125I-dal jelzett Ang

II-t adtunk Hepessel pufferolt médiumban 250 �l térfogatban, majd a sejteket 37 °C-on

inkubáltuk az ábrákon feltüntetett ideig. Az internalizáció leállításához a mintákat jégre

tettük és kétszer 1 ml jéghideg PBS-sel mostuk. A sejt felszínén kötött ligandot a kötés

pH érzékenysége alapján savas mosófolyadékban (15 mM NaCl, 50 mM ecetsav, 0,5

ml) történő inkubálással (10 perc) távolítottuk el. Ezután a sejteket SDS/NaOH

keverékével szolubilizáltuk az intracelluláris radioaktivitás méréséhez. Az

internalizációt az egyes időpontokban mért intracelluláris specifikus kötés és a teljes

(extracelluláris + intracelluláris) kötés hányadosaként adtuk meg. Az internalizáció

kinetikáját jellemző endocitotikus sebességi állandót (ke) az első 5 perc mérési

eredményei alapján számítottuk Wiley és Cunningham által kidolgozott algoritmusok

felhasználásával [152]. Ez az állandó azt mutatja meg, hogy az agonistát kötött

receptorok mekkora hányada kerül endocitózisra 1 perc alatt.

A gáltószeres vizsgálatokban a gátlószereket tartalmazó médiumban előinkubáltuk a

sejteket 37 °C-on, majd az internalizációs kísérleteket is ugyanebben a médiumban

végeztük el. A szacharózt 0,45 M koncentrációban adtuk a médiumhoz.

Konfokális mikroszkópos vizsgálatok

A mikroszkópos vizsgálatokhoz a sejteket fedőlemezen növesztettük és 48 órával a

vizsgálatok előtt transzfektáltuk. A kísérletek előtt a sejtekhez 50 nM fluoreszceinnel

jelzett Ang II-t (Fluo-Ang II) (NEN Life Science Products) és 25 ng/�l Alexa-Fluor 594-

gyel konjugált transzferrint (Molecular Probes) adtunk Hepessel pufferolt F-12

médiumban majd 37 °C-on inkubáltuk. A képek elkészítéséhez egy Olympus BH2-es

mikroszkópra felépített Bio-Rad MRC-1024 pásztázó lézer konfokális rendszert

26

használtunk. A Fluo-Ang II-t 488 nm-en az Alexa-Fluor 594 fluorofórt 564 nm-en

gerjesztettük argon/kripton lézerrel. A fluorofórok által emittált fényt egy 522/32 nm-es

és egy 605/32 nm-es filter segítségével detektáltuk. A regisztrált képeket “Confocal

Assistant” szoftver segítségével dolgoztuk fel.

Western blot analízis

A dinamin és ß-arresztin-1 fehérjék expresszióját Western blot analízissel ellenőriztük.

48 órával a transzfekció után a 24 lyukú lemezen tenyésztett sejteket 200�l Laemmli

pufferben vettük fel, ami tartalmazott proteáz inhibitorokat (leupeptint, aprotinint,

pepstatint, benzamidint és tripszin-kimotripszin inhibitort 10�g/ml-es koncentrációban).

Homogenizálás és centrifugálás után a felülúszó fehérjéit 8%-os denaturáló

poliakrilamid gélen elektroforézissel választottuk el, majd nedves blottolással

nitrocellulóz membránra blottoltuk. A membrán festéséhez anti-dinamin-1 és anti-

dinamin-2 (Santa Cruz Biotechnology), valamint anti-ß-arresztin (Transduction

Laboratories) egér monoklonális elsődleges antitesteket és tormaperoxidázzal konjugált

anti-egér IgG másodlagos antitestet (Pierce Chemical) használtunk. A Western blot

reakciók detektálása SuperSignal West Pico detektáló kittel (Pierce Chemical) történt.

Az expresszált dinaminok mennyiségének meghatározásához azonos összfehérje

mennyiséget tartalmazó sejtlizátumokat futtatunk meg, majd a dinamin-1 és-2 ellenes

elsődleges antitestekkel festett Western blottokról készült filmeket denzitometráltam a

Bio-Rad Multi-Analyst program segítségével. A denzitometrálás kalibrálásához

előzőleg 1-5-szörös mennyiségű sejtlizátumot futtattunk meg és az immunreakció után

vizsgáltuk a denzitometrálás linearitását és megbízhatóságát.

27

EREDMÉNYEK

A receptor karboxi-terminális régiójának szerepe a receptorműködés

szabályozásában

A karboxi-terminális régió nem szükséges a receptor inozitol-foszfát válaszának

kialakuláshoz.

A karboxi-terminális intracelluláris régió membránközeli struktúráinak szerepét deléciós

mutáns receptorok segítségével vizsgáltuk. A régió membránhoz közeli részén a Lys308,

Phe309, Lys310, Lys311, Glu315 és Tyr319 aminosavakat kódoló bázishármasokat

stopkodonra cseréltük. Az 1. ábra mutatja a mutációk elhelyezkedését. Az így kapott

mutáns receptorok jelölésében a stopkodonnal helyettesített aminosav pozíciója

szerepel, az ettől C-terminálisan elhelyezkedő aminosavakat ezek a mutáns receptorok

nem tartalmazták. A receptorok működését COS-7 sejtekben vizsgáltuk. A receptorok

szerkezeti épségét és a sejtfelszíni expresszió mértékét [Sar1, Ile8]Ang II kötésük alapján

ellenőriztük. A karboxi-terminális régió eltávolítása nem befolyásolta a receptor peptid

antagonista iránti affinitását, egyik mutáns receptor Kd-je sem tér el szignifikáns

mértékben a vad típusú receptorétól (Kd (nM): AT1: 2,6 ± 0,6; 319: 2,2 ± 0,5; 315 1,9

± 0,2; 311 2,2 ± 0,1; 310 2,3 ± 0,3; 309 1,9 ± 0,3, n=3). A sejtfelszínen expresszált

receptorok számát azonban a karboxi-terminális régió deléciója jelentős mértékben

csökkentette (I/2. ábra). A továbbiakban vizsgáltuk a mutáns receptorok jelátvitelt

aktiváló képességét. A COS-7 sejtekben expresszált receptorok inozitol-foszfát válasza

az I/3. ábrán látható. A deléciós mutáns receptorok inozitol-foszfát válasza a vad típusú

receptorhoz képest jelentős csökkenést mutatott, azonban ezeknél a mutánsoknál a

receptor expressziós szintje is csökkent volt. Korábbi adatok azt mutatták, hogy a

kísérletekben használt expressziós rendszerben a sejtfelszínen található receptorok

számával egyenesen arányosan változik a maximális válasz amplitudója [151]. Ennek

alapján a receptor válaszkészségének megítéléséhez figyelembe kell venni a sejtfelszíni

receptorok számát. Az I/3. ábra B része mutatja a receptorok számával normalizált

inozitol-foszfát választ a vad típusú receptor válaszának százalékában. Jól látható, hogy

a mutáns receptorok inozitol-foszfát válaszának csökkent mértéke a csökkent sejtfelszíni

28

receptorszámnak a következménye, mivel a normalizált válasz a vad típusú

receptoréhoz képest nem mutat csökkenést.

Ezek az adatok arra utalnak, hogy a karboxi-terminális régióban található aminosavak

nem szükségesek a receptor - G-fehérje kapcsoláshoz, de szerepük van a

receptorfehérje megfelelő sejtfelszíni expressziójában. Több 7TM-receptor esetében

kimutatták, hogy a 7. transzmembrán hélix és a citoplazmatikus farki régió határán

található konzervált aminosavak szükségesek a receptorfehérje megfelelő

expressziójához [153-155]. Pontmutáns receptorok segítségével mi is megvizsgáltuk

ezen konzervált fenilalanin és a lizin aminosavak tényleges szerepét a folyamatban. Az

I/4A ábra mutatja, hogy a fenilalanin és a körülötte elhelyezkedő pozitív töltésű lizin

aminosavak alanin helyettesítése a receptor sejtfelszíni expresszióját nagymértékben

csökkentette, ami alátámasztja ezen aminosavak szerepét a receptorfehérje megfelelő

kifejeződésében vagy a sejtmembránba történő kihelyeződésében.

A karboxi-terminális régió szerepe a receptor internalizációjában

A deléciós és pontmutáns receptorok internalizációját is megvizsgáltuk. Az I/4B ábrán

látható, hogy a karboxi-terminális régió teljes eltávolításával nyert 309 mutáns

receptor internalizációjának sebessége jelentős mértékben csökkent. A membrán-

proximális régióban létrehozott pontmutációk azonban nem befolyásolták a receptor

internalizációját. Adataink arra utalnak, hogy a karboxi-terminális régió receptor

internalizációban szerepet játszó struktúrái disztálisan helyezkednek el. Ezek a

megfigyelések összhangban vannak azokkal az irodalmi adatokkal, melyek szerint a C-

terminális régió disztálisabb részein található szerin és treonin aminosavakban gazdag

szekvencia szükséges az AT1-R internalizációjához [136;138;139;156]. A 2-adrenerg

receptorról kimutatták, hogy specifikus G-fehérjéhez kapcsolt receptor kinázok

segítségével foszforilálódik a C-terminális régió szerin és treonin aminosavain és ez a

foszforiláció elősegíti ß-arresztin fehérjék kötődését a receptorhoz [75;79;94;157;158].

Kevin J. Catt munkacsoportjával végzett kollaborációs munka keretein belül elvégzett

kísérleteinkben sikerült kimutatni, hogy az endogén AT1-es angiotenzinreceptor

szarvasmarha mellékvesekéreg glomerulosa sejtekben agonista kezelés hatására

foszforilálódik �IV�. Későbbi kísérletek azt is igazolták, hogy az Ang II hatására történő

29

foszforiláció kb. 50 %-áért a Ser335 és/vagy Thr336 aminosavak foszforilációja felelős.

Miután e két aminosav jelenléte fontos az AT1-R internalizáció kialakulása

szempontjából is, ezért valószínűsíthető, hogy a receptor internalizációjának kinetikáját

a receptor foszforilációja befolyásolja [147;148]. A receptor internalizációjának és

foszforilációjának kapcsolata felvetette annak a lehetőségét, hogy az AT1-R

internalizációjában is szerepet játszik az ß-arresztin mint adapter fehérje.

Az AT1-receptor internalizációjának mechanizmusa

Az AT1-receptor internalizációjának jellemzése

Az AT1-R agonista stimulálás hatására igen rövid időn belül felvételre kerül a sejt

belsejébe, amit egyrészt a ligandkötés savérzékenysége alapján radioaktívan jelzett

liganddal, másrészt konfokális mikroszkópiával fluoreszcensen jelzett ligand

segítségével követtünk. Korai kísérletekben a receptorinternalizáció gátlószer

érzékenysége, valamint morfológiai, elektronmikroszkópos eredmények azt mutatták,

hogy ez a folyamat klatrinnal burkolt vezikulákban történik �VI�. Azonban ennek

ellentmondó irodalmi adatok is megjelentek [53]. Annak eldöntésére, hogy az AT1-R az

általunk vizsgált sejtekben klatrin mediált úton kerül-e felvételre gátlószeres

vizsgálatokat végeztünk. A klatrin-burkos vezikulákban történő endocitózis gátlására

elterjedten használják a hiperozmotikus kezelést, a hiperozmózist 0,3 vagy 0,45 M

szacharóz adásával hozzák létre. Ez a kezelés abnormális klatrin polimerizációhoz

vezet, aminek következtében üres klatrin hálózatok jönnek létre [159]. Az AT1-receptort

tranziensen expresszáló CHO sejteket 30 percig inkubáltuk 0,45 M szacharózt

tartalmazó F-12 médiumban a kísérlet előtt. Az internalizációs kísérletet ugyanebben a

médiumban végeztük. A II/1. ábrán látható a receptor internalizációs kinetikája a

kontroll és a kezelt sejtekben. Jól látható, hogy kontroll sejtekben az agonista

internalizációjának kinetikája 37 °C-on igen gyors. A hiperozmotikus kezelés a receptor

endocitózisát majdnem teljesen megszüntette. A receptorendocitózis sebessége jól

jellemezhető az endocitotikus sebességi állandóval (ke), amely megadja, hogy az

agonistát kötött receptorok mekkora hányada kerül felvételre 1 perc alatt. Ez az érték

kontrol sejtekben 0,44 ± 0,03 perc-1 volt, ami a hiperozmotikus kezelés hatására 0,009 ±

30

0,003 perc-1 értékre, azaz kb. 2 %-ára csökkent (n=3). Ez a nagymértékű gátlás arra

utal, hogy a receptor endocitózisában a klatrin-mediált út döntő szerepet játszik.

Ennek megerősítésére megvizsgáltuk a receptor endocitózisát konfokális mikroszkóppal

is. A transzferrin receptorról régóta ismert, hogy klatrinnal burkolt vezikulákkal jut be a

sejtbe. A klatrin-burkos vezikulákból kialakuló korai endoszómák csak azonos úton

bekerült endoszómákkal fúzionálnak a sejten belül, ennek következtében a transzferrin

csak a klatrin-mediált úton bejutó receptorokkal mutat kolokalizációt az endoszómákban

[160;161]. Ezért a receptor-mediált endocitózis vizsgálatában elterjedten használják a

klatrin mediált útvonal jelzésére a transzferrin receptorral történő kolokalizáció

kimutatását az endocitotikus vezikulákban [10;37;40;162;163]. Az AT1-R endocitózisát

fluoreszceinnel jelzett Ang II segítségével követtük, míg a transzferrin receptort Alexa

Fluor 594-el konjugált transzferrin segítségével tettük láthatóvá. A fedőlemezen

növesztett sejteket 48 órával a transzfekciót követően vizsgáltuk. 50 nM Fluo-Ang II-vel

és 25 µg/ml Alexa-transzferrinnel stimuláltuk a sejteket Hepessel pufferolt médiumban.

A Fluo-Ang II-t 488 nm-es hullámhosszon gerjesztettük argon/kripton lézerrel és a

kibocsátott fluoreszcenciát 502/32 nm-es emissziós filterrel detektáltuk. Az Alexa 594-

transzferrint 564 nm-en gerjesztettük és 605/32 nm-es szűrővel detektáltuk. A 4. ábra

első paneljén a Fluo-Ang II endocitózisa látható 35 perces 37 °C-os inkubálás után, a

második panelen a transzferrin endocitózisa látható ugyanabban a sejtben. A harmadik

panelen az első két panel egymásra vetítéséből kapott kép látható. A két ligand

kolokalizációja már 5 perces 37 °C-os inkubálás után is látható, de igazán kifejezetté 30

perc inkubálás után válik. Az ábrán a nyilak azokat a vezikulákat jelölik, amelyek

mindkét ligandot tartalmazzák, és ezért a harmadik képen sárga színben jelennek meg.

Eredményeink alátámasztják, hogy az AT1-R klatrin-burkos vezikulákon keresztül kerül

felvételre CHO sejtekben, és ez felvetette azt a kérdést, hogy a dinamin és az ß-arresztin

molekulák részt vesznek-e ebben a folyamatban. További kísérleteinkben ezt a kérdést e

fehérjék domináns-negatív mutánsainak segítségével vizsgáltuk.

31

4. ábra Ang II és transzferrin kolokalizációjának kimutatása konfokális mikroszkóppal CHO

sejtekben. Fedőlemezen tenyésztett CHO sejteket 48 órával a kísérletek előtt transzfektáltunk AT1-R cDNS-

sel. A kísérletek előtt a sejtekhez 50nM Fluo-Ang II-t és 25ng/µl Alexa Fluor 594-transzferrint adtunk

Hepessel pufferolt F-12 médiumban, majd 37 °C-on inkubáltuk 35 percig. A fluorofórokat 488/564 nm-en

gerjesztettük argon/kripton lézerrel. Az első panelen zöld színnel a Fluo-Ang II fluoreszcenciája látható,

amit 522/32 nm-es szűrővel detektáltunk. A második panelen ugyanazon sejtben látható a transzferrinnek

megfelelő Alexa Fluor 594 fluoreszcencia, amit 605/32 nm-es filter segítségével detektáltuk. A harmadik

panelen a két kép egymásra vetítésével nyert kép látható. A nyilak azokat a vezikulákat jelölik amelyek

mindkét ligandot tartalmazzák, ezért a kolokalizációs ábrán sárga színben jelennek meg.

Sejt: CHO COS-7 HEK-293

Ang II konc. 0,2 nM 30 nM 0,03 nM 0,03 nM 0,03 nM

pcDNA3 0,39 ± 0,02 (6) 0,06 ± 0,01 (6) 0,48 ± 0,02 (15) 0,25 ± 0,02 (9) 0,48 ± 0,03 (6)

dinamin-1 � � 0,33 ± 0,01 (3) 0,23 ± 0,02 (3) 0,37 ± 0,05 (3)

dinamin-2 0,26 ± 0,01 (3) 0,05 ± 0,01 (3) 0,25 ± 0,02 (3) 0,23 ± 0,02 (3) 0,37 ± 0,06 (3)

dinamin-1(K44A) � � 0,03 ± 0,01 (3) 0,04 ± 0,01 (3) 0,16 ± 0,03 (3)

dinamin-2(K44A) 0,08 ± 0,01 (3) 0,05 ± 0,01 (3) 0,07 ± 0,01 (3) 0,04 ± 0,01 (3) 0,17 ± 0,01 (3)

ß-arrestin-1(V53D) � � 0,20 ± 0,01 (3) 0,18 ± 0,01 (3) 0,33 ± 0,01 (3)

ß-arrestin-1(1-349) 0,06 ± 0,01 (3) 0,04 ± 0,02 (3) 0,06 ± 0,01 (3) 0,04 ± 0,01 (3) 0,07 ± 0,01 (3)

ß-arrestin-1 0,25 ± 0,01 (3) 0,10 ± 0,01 (3) 0,25 ± 0,03 (5) 0,31 ± 0,01 (3) 0,44 ± 0,03 (3)

1. táblázat Endocitotikus sebességi állandók. A ke értékeket a 125I-Ang II internalizációja alapján

határoztuk meg az AT1-R cDNS-sel és üres pcDNA3 vektorral vagy a különböző vad típusú és mutáns

fehérjéket kódoló cDNS-ekkel tranziensen transzfektált sejtekben. A ke értékeket a 2, 3 és 5 perces

inkubációs időknél nyert adatok alapján számítottuk a Wiley és Cunningham által kidolgozott

algoritmusok felhasználásával [152]. A független kísérletekben kapott eredmények átlagát ± az átlag

32

szórását tüntettem fel, az értékek után zárójelben a kísérletek száma látható. A ke endocitotikus sebességi

állandó dimenziója perc-1.

ß-arresztin fehérjék szerepe az AT1-angiotenzinreceptor internalizációjában

A ß-arresztinek a 7TM-receptorok aktivációját követően a receptor intracelluláris

régióihoz kötődve a receptort a klatrin-burkos gödröcskékhez irányítják, ezzel

elősegítve a receptor endocitózisát [58]. A ß-arresztin adapter fehérje funkcióját az teszi

lehetővé, hogy a fehérje kötődni tud az aktivált és foszforilált receptorhoz, és tartalmaz

olyan elemeket amelyek a klatrin-burkos vezikula alkotóelemeihez történő

asszociációját teszik lehetővé. Az ß-arresztin N-terminális végén helyezkedik el a

receptorkötésért felelős régió (3. ábra), ezen régióban található konzervált valin

helyettesítése aszpartáttal a ß-arresztin fehérje receptor iránti affinitásának jelentős

csökkenését eredményezi [164]. Kísérleteinkben a ß-arresztin-1 fehérje Val53�Asp [ß-

arresztin-1(V53D)] pontmutánsát használtuk. A ß-arresztin klatrin és AP-2 kötésért

felelős régiója a molekula karboxi-terminális végén található [80-82], ez a régió van

eltávolítva a ß-arresztin1 fehérje ß-arresztin-1(1-349) mutánsában, ahol a 349-es

pozíciójú aminosavat kódoló bázishármas stopkodonra lett cserélve (lásd 3. ábra). Az ily

módon nyert funkcióvesztett fehérjéket nagy mennyiségben expresszálva az endogén

funkcióképes fehérje működését domináns-negatív módon gátolni lehet. Kontrollként a

vad típusú fehérjét használtuk.

CHO sejteket kotranszfektáltunk az AT1A-receptort és a különböző ß-arresztin-1

fehérjéket kódoló plazmidokkal. Az optimális kotranszfekciós körülmények

meghatározásához a különböző DNS mennyiségekkel transzfektált sejtekben megnéztük

az expresszált fehérje mennyiségét valamint a receptorkötést. Az expresszált ß-arresztin

fehérje mennyiségét Western blottal ellenőriztük, ß-arresztin ellenes antitest

segítségével, a receptor expresszióját ligandkötése alapján ellenőriztük. Ezek alapján a

koexpressziós kísérletekben mindkét plazmidból 0,5-0,5 �g DNS-t használtunk

pontonként, mert ekkor az expresszált fehérje mennyisége még nem csökkentette a

receptor expressziójának hatásfokát, és maximális gátló hatást tudott kifejteni. Ilyen

körülmények között vizsgáltuk a receptorendocitózis kinetikáját a korábban leírtaknak

megfelelően. A II/2. ábrán jól látható, hogy a csökkent receptorkötést mutató ß-

arresztin-1(V53D) fehérje jelentősen csökkentette a receptorinternalizáció sebességét.

33

Az endocitózis sebességét jellemző endocitotikus sebességi állandó értékei az 1.

táblázatban láthatóak. Ennél a részleges gátlásnál lényegesen nagyobb gátló hatást

mutatott az a ß-arresztin-1 mutáns, amely a klatrin asszociációjában károsodott (ß-

arresztin-1(1-349)). A kontrollként vizsgált vad típusú ß-arresztin-1 kismértékben

szintén gátolta a receptorinternalizációt (lásd 1. táblázat), aminek lehetséges

magyarázata, hogy a nagymértékű exogén fehérje expressziója miatt egyes endogén

fehérjék átírása visszaszorul. A vad típusú ß-arresztin-1 hatásához képest mind a

receptor, mind a klatrin kötésben gátolt mutáns ß-arresztin-1 expressziója a

receptorinternalizáció gátlását okozta, ami arra utal, hogy ebben a folyamatban a ß-

arresztinek részt vesznek.

Dinamin szerepe az AT1-angiotenzinreceptor internalizációjában

A dinamin GTP-ázok funkcióját a receptor internalizációjában szintén domináns-

negatív mutánsaik segítségével vizsgáltuk meg. Ismert, hogy a dinamin GTP-áz

aktivitása szükséges a klatrin-burkos vezikulák leválásához a plazmamembránról [105].

A dinamin N-terminális GTP-áz doménjében létrehozott K44A mutáció (3. ábra), amely

csökkenti a fehérje GTP kötését, jelentősen csökkenti a fehérje GTP-áz aktivitását

[117;118]. Ezt a csökkent GTP-áz aktivitású dinamint a sejtekben expresszálva gátolja a

klatrinnal burkolt gödröcskék lefűződését. A dinamin 3 izoformája közül elsőként a

neuronális dinamin-1 izoformát írták le, ezért a korábbi kísérletekben ennek az

izoformának a domináns-negatív mutánsát használták az endocitózis gátlására

[85;89;165;166]. Zhang és munkatársai is a dinamin-1(K44A) mutáns hatását vizsgálták

az AT1-R internalizációjára, és nem tapasztaltak gátlást [2]. Azonban az endogén AT1-

receptort expresszáló sejtek nagy többségében nem a neuronális izoforma, hanem az

ubikviter kettes izoforma expresszálódik. Ezek alapján annak, hogy a dinamin-1(K44A)

nem gátolta az endocitózist, egy lehetséges magyarázata, hogy az endogén dinamin-2

fehérje funkcióját nem lehet a másik izoforma domináns-negatív mutánsával gátolni.

Ezért mi a kísérleteinkben mindkét izoforma domináns-negatív mutánsának hatását

megvizsgáltuk. A koexpressziós kísérletek körülményei megegyeztek az előző

fejezetben leírtakkal. A II/3. ábra A paneljén látható, hogy a vad típusú dinaminok a ß-

arresztinhez hasonlóan a receptorinternalizáció kismértékű gátlását hozták létre. A

K44A mutáns dinamin-1 és 2 molekulák koexpressziója azonban az endocitózis

34

sebességének lényegesen nagyobb csökkenését eredményezte, ami arra utal, hogy a

dinamin GTP-áz aktivitása az AT1-R endocitózisának is elengedhetetlen feltétele. A két

dinamin izoforma ugyan eltérő mértékű gátló hatást fejtett ki, de mindkettő hatásosan

gátolta az AT1A-receptor endocitózisát CHO sejtekben. Az endogén dinamin-2 gátlása

ezen adatok alapján mindkét dinamin izoforma domináns-negatív mutánsával

lehetséges, az eltérő mértékű gátló hatás magyarázata az lehet, hogy a sejtek különböző

mértékben expresszálják a fehérjéket.

A transzfektált fehérjék expresszióját Western blottal ellenőriztük, dinamin-1 és

dinamin-2 monoklonális elsődleges antitestekkel. Az II/3. ábra B részén látható Western

blot az endogén és az expresszált fehérjék mennyiségét mutatja CHO és COS-7

sejtekben. A transzfektálásával bejuttatott dinamin fehérjék mennyisége az endogén

fehérje mennyiségének 2-4-szerese volt CHO és 3-5-szöröse COS-7 sejtekben. Az ábrán

az is jól megfigyelhető, hogy a CHO és COS-7 sejtekben az endogén fehérje a dinamin-

2. Az expresszált dinamin-1 és dinamin-2 mennyiségének összehasonlítását a dinamin

cDNS-eken található hemagglutinin epitóp tette lehetővé. Ez egyrészt az endogén

fehérjét nem ismeri fel, másrészt egyforma mértékben ismeri fel mindkét izoformát. Ez

alapján megállapítható volt, hogy a vad típusú és domináns-negatív dinamin-1-t

nagyobb mennyiségben expresszálták a sejtek, ami magyarázhatja a dinamin-1(K44A)

által kifejtett nagyobb gátló hatást.

A domináns-negatív dinaminok hatását az AT1-R internalizációjára konfokális

mikroszkóp segítségével is megvizsgáltuk. A tranziensen transzfektált sejtekhez 50 nM

Fluo-Ang II-t adtunk és 4°C-on inkubáltuk, majd az agonista kötődése alapján

azonosítottuk a receptort expresszáló sejteket. A 5. ábra egy CHO sejtpopulációról

készített transzmissziós és fluoreszcens kép egymásravetítésével készült. Az ábrán

látható, hogy a fluorenszcensen jelzett ligand egy sejt felszínén kötődött specifikusan,

ami azt mutatja, hogy ez a sejt expresszálta az AT1A-receptort. A sejteket ezután 37°C-on

inkubálva tovább a fluoreszcens ligand citoplazmatikus lokalizációja volt megfigyelhető.

Az endocitózis kinetikája megfelelt a radioaktívan jelzett ligand internalizációs

kinetikájának. A 6. ábra B panelja 20 perces 37°C-os inkubáció után készült. Hasonló

mértékű endocitózis volt látható az 57 vizsgált sejt 98%-ában. Ugyanilyen körülmények

között megvizsgáltuk a K44A mutáns dinamin-1 és 2 molekulák expressziójának hatását.

35

A 6/C ábra egy dinamin-1(K44A) és AT1A-R cDNS-sel kotranszfektált sejtet mutat 20

perces 37 °C-os inkubálás után. A vizsgált 48 sejt 70 %-ában a C panelhez hasonlóan nem

volt detektálható intracelluláris fluoreszcencia. Az ábra D részén a dinamin-2(K44A)

mutánst expresszáló sejt látható 20 perces inkubálás után, a kép a vizsgált 119 sejt 68%-

ban ezzel egyező volt. Ezek alapján elmondható, hogy mindkét domináns-negatív mutáns

jelentős mértékben gátolta a Fluo-Ang II endocitózisát, megerősítve azt a feltevést, hogy a

dinamin funkcióképessége feltétele az AT1-R endocitózisának CHO sejtekben. Mivel

mind a dinamin-1, mind a dinamin-2 K44A mutánsa hatásosan gátolta a receptor

endocitózisát CHO sejtekben, ezért felmerült az a lehetőség, hogy az irodalmi adatoktól

tapasztalható eltérés oka [2], hogy a jelenséget különböző sejttípusokban vizsgáltuk. Ezért

a továbbiakban megvizsgáltuk a dinamin és ß-arresztin fehérjék szerepét az AT1-R

endocitózisában COS-7 és HEK-293 sejtekben is.

5. ábra A Fluo-Ang II kötése az AT1-receptorhoz tranziensen transzfektált CHO sejtekben. A

fedőlemezen tenyésztett CHO sejteket a kísérletek előtt 48 órával transzfektáltuk AT1-R cDNS-sel. A

sejtekhez 50nM Fluo-Ang II-t adtunk Hepessel pufferolt F-12 médiumban, majd 4 °C-on inkubáltuk 15

percig. Az ábra a sejtekről készített transzmissziós és fluoreszcens kép egymásra vetítésével készült. A Fluo-

Ang II specifikus kötődése alapján azonosítani lehet az AT1-receptort expresszáló sejtet.

36

6. ábra Dinamin mutánsok hatása a Fluo-Ang II endocitózisára CHO sejtekben A fedőlemezen

tenyésztett CHO sejteket az AT1A-receptort és a dinamin-1 vagy 2 (K44A) mutánsait kódoló cDNS-sekkel

transzfektáltuk. A kísérletek előtt a sejtekhez 50nM Fluo-Ang II-t adtunk Hepessel pufferolt F-12

médiumban, majd 4 °C-on inkubáltuk 15 percig (A panel). A sejteket ezután 37°C-on inkubáltuk tovább. A B

panelen a Fluo-Ang II lokalizációja látható egy AT1A-receptort expresszáló sejtben 20 perces inkubálás után.

A C panelen AT1A-R és dinamin-1(K44A) cDNS-sel transzfektált sejtben látható a Fluo-Ang II lokalizációja

20 perc után. A D ábrán AT1A-R és dinamin-2(K44A) cDNS-sel kotranszfektált sejt látható azonos

körülmények között.

A receptorinternalizáció mechanizmusa különböző sejtekben

Domináns-negatív dinamin és ß-arresztin gátolja az AT1-receptor endoticózisát COS-7

sejtekben

A receptorendocitózis mechanizmusát COS-7 sejtekben is megvizsgáltuk a CHO

sejteken leírt körülmények között. Mint a II/6. ábrán látható az AT1-R endocitózisának

kinetikája COS-7 sejtekben valamivel lassúbb mint CHO sejtekben. A

Fluo-Ang II 37°C/20 min

Fluo-Ang II 4°C/15 min

Fluo-Ang II 37°C/20 min

Fluo-Ang II 37°C/20 min

Dyn1(K44A) Dyn2(K44A)

37

receptorendocitózis ke értéke COS-7 sejtekben 0,25 ± 0,02 perc-1 a CHO sejtekben mért

0,48 ± 0,02 perc-1 értékhez képest (1. táblázat), ami közel kétszeres sebességet jelent

CHO sejtekben a COS-7 sejtekhez képest. Ha COS-7 sejtekben vad típusú ß-arresztint

expresszálunk a receptor mellett, akkor a receptorendocitózis sebessége fokozódik, a ke

érték 0,31 ± 0,01 perc-1-re nő. Ez az eredményt arra utal, hogy ebben a sejtben az

endogén ß-arresztin mennyisége sebességmeghatározó lehet az AT1-R endocitózisában.

Ez igen jó összhangban van irodalmi adatokkal, ahol az egyes sejtvonalakban

expresszált endogén ß-arresztinek mennyiségét összehasonlítva azt találták, hogy a

CHO, HEK-293 és COS-7 sejtek közül a COS sejtekben található legkisebb

mennyiségben endogén ß-arresztin [71]. A ß-arresztin-1 domináns-negatív mutánsai

azonban gátolni tudták a receptor endocitózisát, ami azt mutatja, hogy ebben a

sejtípusban is a klatrin mediált ß-arresztin-függő útvonal dominál az AT1-R endocitózisa

során (I/6A ábra). Ezzel összhangban a hiperozmotikus szacharóz kezelés is

szignifikánsan csökkentette az endocitózis sebességét, ami az 1. táblázat ke értékeiből

jól látható.

Ebben a sejtben is megvizsgáltuk a K44A mutáns dinaminok hatását az AT1-R

internalizációra. Mindkét domináns-negatív fehérje expressziója nagymértékben

csökkentette a receptorendocitózis sebességét (II/6B). Mivel a domináns-negatív

dinaminok expressziója COS-7 sejtekben nagyobb mértékű volt mint CHO sejtekben

(II/3B), a mutánsok nagyobb gátló hatást fejtettek ki a receptor endocitózisára is.

Mindezen eredmények alapján elmondható, hogy az alacsony endogén ß-arresztin

expressziós szint ellenére az AT1-R a ß-arresztin- és dinamin-függő klatrin-mediált

útvonalon kerül felvételre COS-7 sejtekben is.

ß-arresztin és dinamin szerepe az AT1A-receptor endocitózisában HEK-293 sejtekben

Zhang és munkatársai az AT1-R internalizációjának dinamin- és ß-arresztin-

függetlenségét elsősorban HEK sejtekben írták le [2], ezért mi is megvizsgáltuk a

receptorendocitózis mechanizmusát ebben a sejtben is. A receptor internalizációs

kinetikája HEK sejtekben igen jó egyezést mutatott a CHO sejtben kapott értékekkel.

Hiperozmotikus szacharóz kezelés az endocitotikus sebességi állandót 90%-kal

csökkentette 0,48 ± 0,03 perc-1-ről 0,04 ± 0,01 perc-1 értékre (n = 3). A ß-arresztin-

1(V53D) mutáns expressziója csak részleges gátló hatást fejtett ki, míg a C-terminális

38

deléciós mutáns ß-arresztin-1(1-349) lényegesen nagyobb mértékben csökkentette a

receptorendocitózis sebességét (lásd II/7A). A vad típusú ß-arresztin-1 a

receptorinternalizáció sebességének minimális csökkenését okozta (lásd 1. táblázat).

A domináns-negatív dinaminok szintén jelentős mértékben csökkentették a receptor

endocitózisának sebessségét (lásd II/7B), ami azt mutatja, hogy az AT1-R endocitózisa

HEK sejtekben is dinamin-függő folyamat. A kísérleti eredmények alapján

elmondhatjuk, hogy a receptorendocitózis alapvető mechanizmusában nincs különbség a

három sejtvonal között, a receptor mindhárom sejtben döntően klatrin-burkos

vezikulákkal kerül felvételre, ezek lefűződéséhez szükség van dinamin GTP-ázok

működésére, és a folyamatban részt vesznek ß-arresztin fehérjék.

A receptorendocitózis kinetikája függ az agonista koncentrációjától

A korábbi kísérletekben az alkalmazott Ang II koncentrációja a fiziológiás tartományon

belül volt. A Zhang és mtsai által használt Ang II koncentráció viszont lényegesen

magasabb ennél [2]. Annak ellenőrzésére, hogy a ligand koncentrációja befolyásolja-e a

receptorendocitózis kinetikáját, elvégeztük az internalizációs kísérleteket magasabb Ang

II koncentrációk mellett is. A 125I-dal jelzett Ang II koncentrációját 0,03 nM-ról 0,2 nM-

ra emeltük és jelöletlen Ang II hozzáadásával tovább növeltük a ligand koncentrációt 30

nM végkoncentrációig. Amint a 2. táblázatból kitűnik az endocitózisra került ligand-

receptor komplex mennyisége nő az Ang II koncentráció emelésével, de ez a növekedés

nem arányos a ligand koncentrációjának emelkedésével. Ez arra utal, hogy a ligandot

kötő receptor számának emelkedésével az endocitotikus útvonal telítődik és csökken a

ligandot kötő receptorok közül endocitózisra kerülők hányada. Ez látható a II/5. ábrán,

ami a 0,2 és 30 nM Ang II által indukált receptorendocitózist mutatja CHO sejtekben. A

ligand koncentrációjának 0,03 nM-ról 0,2 nM-ra emelése az endocitotikus sebességi

állandó értékének 25%-os csökkenését eredményezte, az Ang II koncentráció 30 nM-ra

emelésének hatására a kezdeti ke érték 1/6-ra csökkent (lásd 1. táblázat). Ezek után

megnéztük, hogy a magas Ang II koncentrációknál tapasztalható lassú kinetikájú

receptorinternalizáció gátolható-e domináns-negatív dinaminnal. Ezért elvégeztük a

kísérleteket a dinamin-2(K44A) mutánst expresszáló sejteken is. 0,2 nM Ang II

koncentráció mellett a dinamin-2(K44A) jelentős gátlást hozott létre. 30 nM Ang II-vel

stimulált sejtekben azonban a receptor endocitózisának sebessége nem különbözött a

39

csak receptort és a domináns-negatív dinamin-2-t is expresszáló sejtek között. A

dinamin-2(K44A) a csökkent intenzitású endocitózist nem képes tovább gátolni (lásd

II/5. ábra). Hasonló adatokat kaptunk a dinamin-1(K44A) mutánsával is. Ezek az adatok

azt mutatják, hogy a receptor endocitózisa fiziológiás Ang II koncentrációk mellett

gátolható domináns-negatív dinaminokkal, de ez a gátló hatás magas Ang II

koncentrációk mellett nem detektálható.

Idő (perc) Ang II koncentráció

0,03 nM 0,2 nM 30 nM

0,5 0,009 ± 0,001 (3) 0,07 ± 0,03 (3) 1,02 ± 0,412 (3)

2 0,18 ± 0,02 (3) 1,59 ± 0,41 (3) 11,26 ± 2,96 (3)

3 0,33 ± 0,04 (3) 2,38 ± 0,47 (3) 23,83 ± 3,96 (3)

5 0,54 ± 0,06 (3) 4,21 ± 0,63 (3) 26,68 ± 5,31 (3)

10 0,95 ± 0,09 (3) 6,91 ± 1,18 (3) 38,48 ± 9,35 (3)

30 1,84 ± 0,09 (3) 11,03 ± 1,68 (3) 35,51 ± 10,62 (3)

2. táblázat Különböző Ang II koncentrációk mellett endocitózisra került Ang II [10-12 mol]. Az AT1-

receptort expresszáló CHO sejtekhez 125I-Ang II-t adtunk különböző koncentrációban 250 �l térfogatban,

majd 37 °C-on inkubáltuk a táblázatban feltüntetett időtartamokig. A különböző inkubálási idők alatt

endocitózisra került Ang II mennyiségét pontonként a 125I-Ang II specifikus aktivitása alapján számítottuk.

A független kísérletekben kapott eredmények átlagát ± SEM tüntettem fel, az értékek után zárójelben a

kísérletek száma látható.

Azonos körülmények között megvizsgáltuk a kis Ang II koncentrációknál közel teljes

gátlást létrehozó ß-arresztin-1(1-349) mutáns hatását is magasabb Ang II koncentrációk

mellett. Mint a 7. ábrán is látható a 30 nM Ang II koncentrációnál nem detektálható a

receptorendocitózis sebességének további csökkenése a ß-arresztin-1(1-349)-t

expresszáló sejtekben. A vad típusú ß-arresztin-1 expressziója azonban, bár 0,2 nM Ang

II-nál minimális mértékben csökkentette a receptorendocitózis sebességét, a 30 nM Ang

II által indukált lassú internalizáció sebességének növekedését okozta. Ezek az adatok

egybevágnak a dinamin mutánsok adataival, vagyis a domináns-negatív ß-arresztinek

által létrehozott gátló hatás a dinaminok hatásához hasonlóan csak subnanomoláris

koncentrációknál detektálható. Miután a keringő Ang II koncentrációja in vivo ebben a

40

tartományban van adataink arra utalnak, hogy fiziológiás körülmények között a ß-

arresztin- és dinamin-dependens mechanizmusnak fontos szerepe van. Eredményeink

alapján a receptorendocitózis sebességét magasabb agonista koncentrációknál az

általunk használt tranziens expressziós rendszerben a klatrin-mediált endocitotikus

útvonalban szerepet játszó valamelyik endogén fehérje mennyisége limitálja. Ha a ß-

arresztin mennyiségét növeljük a fehérje transzfektálásával a sejtben akkor ez lehetővé

teszi az endocitózis sebességének növekedését, ami arra utal, hogy nagy agonista

koncentrációknál az endogén ß-arresztin mennyisége limitálja, hogy mennyi receptor

kerül endocitózisra a klatrin-mediált úton. Azonban az endogén ß-arresztin mennyisége

nem lehet egyedül felelős az endocitózis sebességének csökkenéséért, hiszen e fehérje

expressziója nem állította helyre teljes mértékben a receptor internalizációját.

7. ábra Vad típusú és mutáns ß-

arresztin-1 hatása az AT1-receptor

endocitózisára különböző Ang II

koncentrációknál A sejteket a

kísérletek előtt 48 órával

kotranszfektáltuk az AT1-R cDNS-sel

és üres pcDNA3 vektorral (�), ß-

arresztin-1 (�) vagy ß-arresztin-1(1-

349) (�) cDNS-t tartalmazó

plazmidokkal. A sejteket 37 °C-on

inkubáltuk az ábrán jelzett időkig és

mértük a 125I-Ang II internalizációját.

Az intracelluláris és extracelluláris ligandot a kötés savérzékenysége alapján különítettük el. Az intracelluláris

specifikus kötést a teljes specifikus kötés %-ban tüntettem fel. A 0,02 nM 125I-Ang II-höz jelöletlen Ang II-t

adtunk a 30 nM végkoncentráció eléréséhez. A 0,02 nM Ang II koncentrációnál mért adatokat teli

szimbólumok jelölik, míg a 30 nM Ang II-vel mért adatokat üres szimbólumokkal jelöltem. Az ábrán három

független kísérlet eredményeinek átlaga ± SEM van feltüntetve.

Idő (perc)

0 5 10 15 20 25 30

Inte

rnal

izál

t (te

ljes k

ötés

%-b

an)

0

10

20

30

40

50

60

70

�-arrestin1

�-arrestin1 (1-349)

AT1A

41

MEGBESZÉLÉS

A karboxi-terminális régió a receptorfehérje expressziójában és a receptor

endocitózisában játszik szerepet

Az AT1A-angiotenzinreceptor karboxi-terminális intracelluláris régiójának eltávolítása a

receptorfehérje szerkezeti épségét nem befolyásolta, a receptor peptid antagonista iránti

affinitása nem változott a mutációk következtében. A régió eltávolítása nem szüntette

meg a receptor intracelluláris jelátvitelét sem, amit az agonista hatására létrejövő

inozitol-foszfát válasszal vizsgáltunk. Hatással volt azonban a receptorfehérje

sejtfelszíni expressziójára, a 319 mutánst expresszáló sejtekben a sejtfelszíni

receptorszám a vad típusú receptorszám 50 %-a körül volt. További 4 aminosav

eltávolítása a receptorexpresszió további körülbelül 30 %-os csökkenését okozta. A 315-

ös és 309-es pozíciók közötti aminosavak eltávolítása megszüntette a sejtfelszíni

receptorkötést a 308 mutáns receptort expresszáló sejtek felszínén. Ez arra utal, hogy

egyrészt a 315-ös pozíciótól disztálisan, másrészt a 315-ös és 308-as pozíciók közötti

aminosavak felelősek a sejtfelszíni receptorszám csökkenéséért. Továbbiakban sikerült

azonosítani egy konzervált KKFKK motívumot, aminek a jelenléte szükséges a

receptorfehérje sejtfelszíni expressziójához. Ezek az eredmények összhangban vannak

korábbi adatokkal, amelyek azt mutatták, hogy más G-fehérjéhez kapcsolt receptorok C-

terminális membrán-proximális aminosavai szükségesek a receptor megfelelő

kifejeződéséhez [73;154;167-170]. A humán AT1-receptorról leírták, hogy a karboxi-

terminális régió eltávolítása a 310-es pozíciótól csökkentette a receptor expresszióját

COS-7 sejtekben [155]. A patkány AT1A-receptor 315Stop mutánsának expressziója

szintén csökkent CHO sejtekben [138]. Ezek az adatok egybevágnak az általunk leírt

eredményekkel. A rodopszin karboxi-terminális régiójának deléciója gátolja a receptor

transzportját az endoplazmás retikulumból és kihelyeződését a membránba [153]. A H2

hisztamin receptor karboxi-terminális deléciója szintén megszüntette a receptorkötést a

sejtfelszínen, ugyanakkor a receptor mRNS detektálható volt a sejtekben [154]. Ezek az

adatok arra utalnak, hogy a receptorok karboxi-terminális struktúrái a receptorfehérje

stabilitásához vagy plazmamembránba juttatásához szükségesek. Korábbi irodalmi

adatok azt mutatták, hogy az AT1-R 310Stop mutánsának mRNS szintje normális volt

42

annak ellenére, hogy a receptor expressziója csökkent volt tranziensen transzfektált

COS-7 sejtekben [155]. Bár kísérleteinkben mi nem vizsgáltuk receptorexpresszió

csökkenésének tényleges okát, mindezek alapján levonhatjuk azt a következtetést, hogy

az AT1A-R karboxi-terminális régiója szükséges a receptorfehérje membránba

juttatásához, de nem feltétele a receptor-G-fehérje kapcsolatnak.

Fontos szerepet játszanak azonban a receptor endocitózisában a karboxi-terminális régió

disztálisabb aminosavai, a C-terminális deléciós mutánsok internalizációs kinetikája

nagymértékben csökkent a vad típusú receptoréhoz képest. Kollaborációs munka

keretein belül kimutattuk, hogy mellékvesekéreg glomerulosa sejtekben az endogén

AT1-R agonista hatására foszforilálódik �IV�. A molekula karboxi-terminális részén

korábban azonosítottak egy STL aminosav szekvenciát, amelynek eltávolítása gátolta a

receptor endocitózisát [136]. Későbbi kísérletek azt is igazolták, hogy az Ang II hatására

történő foszforiláció kb. 50 %-áért a Ser335 és/vagy Thr336 aminosavak foszforilációja

felelős. Miután e két aminosav jelenléte fontos az AT1-R internalizáció kialakulása

szempontjából is, ezért valószínűsíthető, hogy a receptor internalizációjának kinetikáját

a receptor foszforilációja szabályozza [147;148]. A G-fehérjéhez kapcsolt receptorok

endocitózisának mechanizmusáról a ß2-adrenerg receptor esetében áll rendelkezésre a

legtöbb információ. Ezek alapján ismert, hogy a receptort az agonista kötését és a

következményes jelátvitel aktivációját követően specifikus receptor kinázok

foszforilálják [30;171]. A foszforiláció növeli a ß-arresztin fehérjék affinitását a

receptorhoz és a jelenlegi elképzelések szerint ezáltal fokozza a G-fehérjéhez kapcsolt

receptorok endocitózisát. A ß-arresztinek kötődnek a klatrin-burok komponenseihez,

részben a klatrinhoz másrészt az AP-2 adapter fehérjéhez, ezáltal a receptort a burkos

gödröcskék területére irányítják [58;59;82] elősegítve a receptor endocitózisát a klatrin-

mediált úton keresztül.

Az AT1-receptor endocitózisának mechanizmusa

Az endocitózis klatrin-burkolt vezikulákon keresztül történik

Az AT1-R internalizációjának foszforiláció függése felvetette azt a lehetőséget, hogy az

AT1-R endocitózisában is szerepet játszanak a ß-arresztin fehérjék. Ezért megvizsgáltuk,

hogy az általunk vizsgált sejtekben az AT1A-R endocitózisa a klatrin-mediált úton

43

történik-e. Kimutattuk, hogy az AT1-R endocitózisa hiperozmotikus szacharóz

kezeléssel gátolható mindhárom általunk vizsgált sejtben. Ez a kezelés a

plazmamembrán klatrin borításának felbomlásához és üres klatrin hálózatok

kialakulásához vezet, ezáltal megakadályozza a klatrinnal burkolt vezikulák kialakulását

és endocitózisát [159]. További érv a klatrin szerepe mellett a receptor kolokalizációja

transzferrinnel endocitotikus vezikulákban CHO sejtekben. A transzferrin receptorról jól

ismert, hogy a klatrin-mediált úton kerül felvételre a sejtekben, az így bejutott burkos

vezikulák azonos úton bejutott vezikulákkal fuzionálnak endoszómákat képezve

[160;161], ezért a transzferrint elterjedten használják a klatrin-mediált endocitotikus út

jelzésére. Eredményeink összhangban vannak az irodalmi adatok nagy részével,

melyekben az Ang II különböző célszerveiben (érfal simaizom, mellékvese, vese stb.)

megtalálható endogén AT1-receptorok endocitózisát szintén klatrin-függőnek találták

�VI�. A AT1-R endocitózisát számos sejtféleségben leírták, és a morfológiai adatok

többsége azt mutatta, hogy a receptor burkos vezikulákkal kerül felvételre [124;126;VI].

Ezt erősítették meg a klatrin mediált endocitózis specifikus gátlószereivel elvégzett

kísérletek is [8;125;134;172]. Annak ellenére, hogy érfal simaizomsejtben a receptort

kimutatták kaveolákban is [53], a jelenlegi adatok arra utalnak, hogy a klatrin-mediált

endocitotikus út dominál a receptor endocitózisában az általunk vizsgált CHO, COS-7

és HEK-293 sejtekben.

A receptorendocitózisban részt vesznek a ß-arresztin és dinamin fehérjék

A ß-arresztinek szerepét a ß2-adrenerg receptor endocitózisában először 1996-ban írták

le [58;59]. A ß-arresztin-1 N-terminális részén található receptorkötő régióban

létrehozott V53D pontmutáció csökkenti a fehérje receptor iránti affinitását [59;164].

CHO sejtekben expresszálva ezt a mutáns ß-arresztint az AT1-receptorendocitózis

sebességének több mint 50 %-os csökkenését eredményezte. Az adapter fehérje C-

terminális végén található klatrin és AP-2 kötő domén [80-82] eltávolításával létrehozott

ß-arresztin-1(1-349) mutáns fehérje expressziója következtében a receptorinternalizáció

sebessége a kontrol 1/8-ára csökkent. Különböző mértékben, de mindkét ß-arresztin-1

mutáns domináns-negatív módon gátolta az AT1-R internalizációját fiziológiás Ang II

koncentráció mellett CHO sejtekben, ami arra utal, hogy a folyamatban szerepük van az

ß-arresztin fehérjéknek. A receptorendocitózis mechanizmusa nem volt sejtfüggő,

44

hiszen mind COS-7 mind HEK sejtekben hasonló mértékű gátlást okozott a mutáns ß-

arresztinek expressziója. Korábbi kísérletekben az AT1-R internalizációjának ß-arresztin

függését a ß-arresztin-1(V53D) mutáns segítségével vizsgálták a magas

hormonkoncentrációkkal stimulált sejtfelszíni receptorszám csökkentését követve HEK-

293 sejtekben [2]. Ezzel a módszerrel HEK sejtben nem volt kimutatható a ß-arresztin

mutáns gátló hatása, a vad típusú ß-arresztin expressziója azonban képes volt fokozni az

AT1-R internalizációját HEK és COS-7 sejtekben is. Ezt a ß-arresztinnel fokozott

receptorendocitózist a dinamin-1(K44A) mutáns expressziója teljes mértékben kivédte,

annak ellenére, hogy a kontroll ß-arresztinnel nem transzfektált sejtekben a mutáns

dinamin hatástalan volt. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy az AT1-R

internalizációja HEK és COS-7 sejtekben nem ß-arresztin- és dinamin-függő folyamat,

de ha a ß-arresztin nagyobb mennyiségben van jelen a receptor a ß-arresztin mediált

úton is felvételre kerülhet a sejtben. Az általunk vizsgált sejtekben a dinamin 1-es és 2-

es izoformájának GTP-áz deficiens mutánsa gátolta az AT1-R endocitózisát fiziológiás

Ang II koncentrációknál endogén ß-arresztin jelenlétében. A radioaktívan jelzett Ang II

endocitózisának sebességét a dinamin-1 és 2 (K44A) mutánsok expressziója CHO

sejtekben 86-94 %-kal, COS-7 sejtekben 84%-kal, HEK sejtekben pedig közel 70 %-kal

csökkentette. A dinamin szerepét a receptor endocitózisában konfokális mikroszkópos

vizsgálatokkal is alátámasztottuk.

Az AT1-receptor endocitózisát befolyásolja az agonista koncentrációja

Az irodalmi adatokkal tapasztalt eltérés lehetséges magyarázata az AT1-R

endocitózisának függése az agonista koncentrációjától. Különböző Ang II koncentrációk

mellett elvégzett internalizációs kísérleteink azt mutatták, hogy az agonista koncentráció

emelésével csökken az agonista kötött receptorok közül az endocitózisra kerülők

hányada. 30 nM Ang II koncentráció mellett a receptorendocitózis sebessége 1/8-ára

csökken a 0,03 nM-os Ang II koncentráció mellett mérhető sebességhez képest. A 30

nM Ang II koncentráció által indukált receptorendocitózis sebességét a domináns-

negatív ß-arresztin és dinamin mutánsok expressziója nem csökkentette tovább. Vad

típusú ß-arresztin expressziója azonban részben helyreállította a receptor endocitózisát.

Ezek az adatok arra utalnak, hogy a receptorendocitózis sebességét magasabb agonista

koncentrációknál, az általunk használt tranziens expressziós rendszerben, a klatrin

45

mediált endocitotikus útvonalban szerepet játszó valamelyik endogén fehérje

mennyisége limitálja. Ha transzfektálással növeljük a ß-arresztin fehérje mennyiségét a

sejtben akkor ez lehetővé teszi az endocitózis sebességének növekedését, ami azt

mutatja, hogy nagy agonista koncentrációknál, amikor az expresszált receptorok nagy

hányada agonistát köt, az endogén ß-arresztin mennyisége limitálja, hogy mennyi

receptor kerül felvételre a klatrin-mediált úton. Azonban az endogén ß-arresztin

mennyisége nem lehet egyedül felelős az endocitózis sebességének csökkenéséért,

hiszen a fehérje expressziója nem tudta teljes mértékben helyreállítani a receptor

internalizációjának sebességét.

Az AT1 és ß2-adrenerg receptorok endocitózisa között számos különbséget írtak le

[2;173;174]. Mindkét receptorról kimutatták, hogy agonista stimuláció hatására a ß-

arresztin diffúz citoplazmatikus lokalizációja megváltozik a sejtekben, a fehérje a

sejtmembránhoz lokalizál [173;175]. A ß2-adrenerg receptor esetében azonban az

endocitózisra kerülő receptorral már nem mutat kolokalizációt a ß-arresztin, míg az

endocitózisra került AT1-receptorral a ß-arresztin az endocitotikus vezikulákban is

kolokalizációt mutat [173;174]. Ezekben az AT1-receptort és ß-arresztint tartalmazó

endoszómákban megtalálható a klatrin is [174]. Mindezek az adatok arra utalnak, hogy

az AT1-R és a ß-arresztin kapcsolata stabilabb és hosszabb ideig fennmarad az

endoszómákban is, mint a ß2-adrenerg receptor és a ß-arresztin között kialakuló kötés

[173]. Ezt a nagy affinitású kötést nagy valószínűséggel a receptor karboxi-terminális

régiója mediálja, az AT1 és ß2-adrenerg receptorok C-terminális régióinak kicserélésével

nyert receptor kimérákban ugyanis a karboxi-terminális régió származása határozta meg

az ß-arresztin kötés és a receptorinternalizáció paramétereinek jellemzőit [173]. Ennek a

különbségnek az egyik következménye az, hogy ez a hosszú ideig fennmaradó AT1-

receptort és ß-arresztint tartalmazó klatrin burkolt vezikula lehet a felelős azért, hogy

magas Ang II koncentrációknál az endocitotikus út komponenseinek mennyisége a

sejtben limitálja a receptorendocitózis sebességét. Ezek alapján a ß-arresztin mellett az

endogén klatrin mennyisége lehet a másik sebességmeghatározó tényezője az AT1-R

internalizációnak nagy agonista koncentrációknál.

Mindezek alapján érthető, hogy Zhang és munkatársai HEK-293 sejtekben 100 nM Ang

II koncentrációval stimulálva a sejteket nem tapasztalták a receptorinternalizáció

46

gátlását ß-arresztin és dinamin mutánsokkal. Ugyanebben a munkában azonban HEK és

COS-7 sejtekben is kimutatták, hogy a vad típusú ß-arresztin expressziójával fokozható

az AT1-receptor endocitózisa és ez a ß-arresztin-dependens internalizáció a dinamin-

1(K44A) mutánsával gátolható [2]. Az AT1-R internalizációjának dinamin függését

megerősíti az a közelmúltban megjelent közlemény, mely azt mutatta, hogy magas

(1µM) Ang II koncentrációk mellett is gátolható volt a receptor endocitózisa olyan

dinamin mutánsok expressziójával, amelyből vagy a teljes GTP-kötő domént

távolították el, vagy a molekula foszfoinozitideket kötő pleksztrin-homológia

doménjében létrehozott mutációval a lipidkötést szüntették meg [176]. Mindkét

mutációt tartalmazó dinamin hatékonyan gátolta a receptor endocitózisát, míg a

dinamin-1(K44A) mutáns nem befolyásolta azt. Ezek az adatok arra utalnak, hogy a

receptor endocitózisa magas agonista koncentrációk mellett is dinamin-függő úton

történik, de a folyamat gátlásához hatékonyabb domináns-negatív mutánsokra van

szükség.

Az általunk megjelentetett közlemény elfogadását követően több közlemény is

megjelent ebben a témában. ß-arresztin-1 és ß-arresztin-2 génhiányos egerekből

származó fibroblaszt sejtvonalakon végzett vizsgálatok azt mutatták, hogy az AT1-R

endocitózisa a ß-arresztin-1-t nem expresszáló sejtekben kismértékben csökkent, a ß-

arresztin-2 hiánya nem okozott eltérést, míg a ß-arresztint nem tartalmazó, duplán

génhiányos sejtekben a receptor endocitózisa nagymértékben károsodott [177]. Ezek az

adatok alátámasztják a ß-arresztin fiziológiás szerepét az AT1-R endocitózisában.

Anborgh és munkatársai tovább vizsgálták az AT1 és ß2-adrenerg receptorok

endocitózisa közötti különbségeket és az ebből adódó eltérő szabályozását [174]. Az

agonista kötődését követően mindkét receptor foszforilálódik a karboxi-terminális régió

szerin és treonin aminosavain [30;147;148;171], ezt követi a ß-arresztin fehérjék

kötődése a receptorokhoz, ami jól követhető a ß-arresztin citoplazmából

plazmamembránba történő lokalizációjának segítségével [173]. Ez egyrészt a G-fehérje

kapcsolat megszüntetésén keresztül a receptorok deszenzitizációjához vezet, másrészt a

receptort a klatrinnal burkolt vezikulákhoz irányítja. A klatrin-burkos vezikulák

lefűződésével a receptorok endocitózisra kerülnek. A ß2-adrenerg receptorról a ß-

arresztin leválik és a membránban marad, míg az AT1-receptort tartalmazó vezikulákban

megtalálható mind a ß-arresztin mind a klatrin [174]. A ß-arresztin kötés erőssége

47

befolyásolja a receptor defoszforilációját és az aktiválható receptor visszajutását a

plazmamembránba, vagyis a receptor reszenzitizációját. Korábban leírták, hogy az AT1-

receptor reszenzitizációja lényegesen lassabban következik be, mint a ß2 receptoré,

valamint, hogy ez a tulajdonság a receptorok karboxi-terminális régióinak kicserélésével

átruházható [178].

Később azt is kimutatták, hogy a receptorok defoszforilációjának bekövetkezéséért is a

receptor C-terminális régiói felelősek, az AT1-R karboxi-terminális régióját tartalmazó

ß2-adrenerg receptor lényegesen lassabban defoszforilálódik mind a vad típusú ß2

receptor. Az AT1-receptornál nem volt detektálható foszforiláció csökkenés az agonista

kimosását követő 20 perc elteltével. Ezzel párhuzamosan a receptor reciklizációja a

plazmamembránba is jelentős eltérést mutat a két receptor között. Míg a ß2-adrenerg

receptor gyorsan visszajut a sejtfelszínre addig az AT1-R esetében alig detektálható a

receptor reciklizációja 1 óra elteltével. A receptor kimérák esetében az AT1-R C-

terminális régiójának helyettesítése a ß2-adrenerg receptoréval segítette az AT1-R

visszajutását a sejtfelszínre, míg az AT1-R karboxi-terminális régióját tartalmazó ß2

receptor reciklizációja jelentős mértékben csökkent [174]. Mindezen adatok alapján úgy

tűnik, hogy a ß2-adrenerg receptorról az endocitózist követően a ß-arresztin gyorsan

leválik, ezzel lehetővé teszi a receptor defoszforilációját és gyors reciklizációját a

plazmamembránba, ahol újra aktiválható. Az AT1-R azonban az endocitózist követően

is hosszú ideig asszociálva marad a ß-arresztinnel az endoszómákban, ennek

következtében a receptor defoszforilációja és reciklizációja lassabban következik be, a

receptor lényegesen lassabban reszenzitizálódik [174].

Eredményeinket összefoglalva elmondhatjuk, hogy az AT1-R karboxi-terminális régiója

nem játszik szerepet a jelátviteli folyamat aktiválásában, azonban a receptorendocitózis

kinetikáját jelentős mértékben befolyásolja. Kimutattuk, hogy az AT1A-R

endocitózisának fő útja a klatrin-mediált endocitózis mindhárom általunk vizsgált

sejtben. Ebben a folyamatban adapter funkciót töltenek be a ß-arresztin fehérjék,

valamint az endocitózishoz szükséges a dinamin fehérjék működése. Magasabb agonista

koncentrációknál azonban a receptorendocitózis sebességét limitálhatja az endogén ß-

arresztin és egyéb, a klatrin mediált endocitózisban szerepet játszó fehérjék mennyisége,

így a receptorendocitózisnak egy alternatív útja kerülhet előtérbe.

48

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Mindenekelőtt témavezetőmnek Dr. Hunyady Lászlónak tartozom köszönettel, aki

laboratóriumába vett, megteremtette munkám feltételeit és mindvégig irányította,

támogatta munkámat.

Köszönöm Dr. Spät Andrásnak, hogy intézetvezetőként és egyben programvezetőként

lehetővé tette tudományos tevékenységemet az Intézetben, és figyelemmel kísérte

munkámat.

Hálás vagyok közvetlen munkatársaimnak Mihalik Balázsnak, Szaszák Mártának

segítségükért, a szakmai eszmecserékért és laborunk baráti hangulatáért. Köszönöm

asszisztensnőink Antal Andrea, Bakacsiné Rácz Judit, Sneider Istvánné és Süpeki

Katinka odaadó asszisztensi munkáját. Köszönöm diákköröseimnek Szidonya

Lászlónak és Balla Borbálának, hogy csatlakoztak hozzánk és gyakran ösztönző

kérdéseikkel is hozzájárultak a munka előrehaladásához. Köszönettel tartozom a labor

többi tagjának Balogh Katalinnak, Turu Gábornak és Várnai Péternek és az Élettani

Intézet valamennyi munkatársának minden segítségért.

Köszönöm Dr. Kevin Catt-nek és Dr. Adrian J.L. Clark-nak a kísérletes munka anyagi

feltételeinek megteremtéséhez nyújtott segítségüket, valamint a kísérletek értékeléséhez

és a publikációkhoz nyújtott támogatásukat. Külön köszönöm Dr. Kevin Catt-nek, hogy

lehetővé tette, hogy laborjában dolgozhassam és mindvégig támogatta munkámat. Itt

volt lehetőségem a konfokális mikroszkópos kísérleteket elkezdeni, amit itthon Dr. Paku

Sándor segítségével az I. sz. Pathológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben folytattam.

Ezúton is köszönöm a segítségét.

Köszönöm a cikkekben szereplő azon társszerők segítségét is akiket itt név szerint nem

említek, mert a kísérletes munka olyan részleteiben vettek részt ami a disszertációban

nem szerepel.

Végezetül férjemnek és családom többi tagjának szeretném megköszönni szeretetüket és

azt, hogy mindvégig bíztattak és mellettem álltak.

49

IRODALOMJEGYZÉK

1. Hunyady L: Molecular mechanisms of angiotensin II receptor internalization. J.Am.Soc.Nephrol. 1999, Suppl.11:S47-S56.

2. Zhang J, Ferguson SG, Barak LS, Menard L, Caron MG: Dynamin and �-arrestin reveal distinct mechanisms for G protein- coupled receptor internalization. J.Biol.Chem. 1996, 271:18302-18305.

3. Griendling KK, Lassčgue B, Alexander RW: Angiotensin receptors and their therapeutic implications. Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 1996, 36:281-306.

4. De Gasparo M, Catt KJ, Inagami T, Wright JW, Unger T: International union of pharmacology. XXIII. The angiotensin II receptors [In Process Citation]. Pharmacol.Rev. 2000, 52:415-472.

5. Murphy TJ, Alexander RW, Griendling KK, Runge MS, Bernstein KE: Isolation of a cDNA encoding the vascular type-1 angiotensin II receptor. Nature 1991, 351:233-236.

6. Sasaki K, Yamano Y, Bardhan S, Iwai N, Murray JJ, Hasegawa M, Matsuda Y, Inagami T: Cloning and expression of a complementary DNA encoding a bovine adrenal angiotensin II type-1 receptor. Nature 1991, 351:230-233.

7. Mukoyama M, Nakajima M, Horiuchi M, Sasamura H, Pratt RE, Dzau VJ: Expression cloning of type 2 angiotensin II receptor reveals a unique class of seven-transmembrane receptors. J.Biol.Chem. 1993, 268:24539-24542.

8. Thomas WG: Regulation of angiotensin II type 1 (AT1) receptor function. Regul.Pept. 1999, 79:9-23.

9. Pucell AG, Hodges JC, Sen I, Bumpus FM, Husain A: Biochemical properties of the ovarian granulosa cell type 2-angiotensin II receptor. Endocrinology 1991, 128:1947-1959.

10. Hein L, Meinel L, Pratt RE, Dzau VJ, Kobilka BK: Intracellular trafficking of angiotensin II and its AT1 and AT2 receptors: Evidence for selective sorting of receptor and ligand. Mol.Endocrinol. 1997, 11:1266-1277.

11. Sandberg K, Ji H, Clark AJL, Shapira H, Catt KJ: Cloning and expression of a novel angiotensin II receptor subtype. J.Biol.Chem. 1992, 267:9455-9458.

12. Kakar SS, Sellers JC, Devor DC, Musgrove LC, Neill JD: Angiotensin II type-1 receptor subtype cDNAs: differential tissue expression and hormonal regulation. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1992, 183:1090-1096.

13. Marrero MB, Schieffer B, Paxton WG, Heerdt L, Berk BC, Delafontaine P, Bernstein KE: Direct stimulation of Jak/STAT pathway by the angiotensin II AT1 receptor. Nature 1995, 375:247-250.

14. Aoki H, Izumo S, Sadoshima J: Angiotensin II activates RhoA in cardiac myocytes: a critical role of RhoA in angiotensin II-induced premyofibril formation. Circ.Res. 1998, 82:666-676.

15. Berk BC: Angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle: pathways activated by specific tyrosine kinases . J.Am.Soc.Nephrol. 1999, 10 Suppl 11:S62-S68.

16. Eguchi S, Inagami T: Signal transduction of angiotensin II type 1 receptor through receptor tyrosine kinase. Regul.Pept. 2000, 91:13-20.

17. Schmitz U, Thommes K, Beier I, Wagner W, Sachinidis A, Dusing R, Vetter H: Angiotensin II-induced stimulation of p21-activated kinase and c-Jun NH2-terminal kinase is mediated by Rac1 and Nck. J.Biol.Chem. 2001.

18. Bouscarel B, Wilson PB, Blackmore PF, Lynch CJ, Exton JH: Agonist-induced down-regulation of the angiotensin II receptor in primary cultures of rat hepatocytes. J.Biol.Chem. 1988, 263:14920-14924.

19. Boulay G, Chrétien L, Richard DE, Guillemette G: Short-term desensitization of the angiotensin II receptor of bovine adrenal glomerulosa cells corresponds to a shift from a high to a low affinity state. Endocrinology 1994, 135:2130-2136.

50

20. Thekkumkara TJ, Du J, Dostal DE, Motel TJ, Thomas WG, Baker KM: Stable expression of a functional rat angiotensin II (AT1A) receptor in CHO-K1 cells: Rapid desensitization by angiotensin II. Mol.Cell.Biochem. 1995, 146:79-89.

21. Oppermann M, Freedman NJ, Alexander RW, Lefkowitz RJ: Phosphorylation of the type 1A angiotensin II receptor by G protein-coupled receptor kinases and protein kinase C. J.Biol.Chem. 1996, 271:13266-13272.

22. Tang H, Guo DF, Porter JP, Wanaka Y, Inagami T: Role of cytoplasmic tail of the type 1A angiotensin II receptor in agonist- and phorbol ester-induced desensitization. Circ.Res. 1998, 82:523-531.

23. Palczewski K, Kumasaka T, Hori T, Behnke CA, Motoshima H, Fox BA, Le T, I, Teller DC, Okada T, Stenkamp RE, Yamamoto M, Miyano M: Crystal structure of rhodopsin: A G protein-coupled receptor. Science 2000, 289:739-745.

24. Bockaert J, Pin JP: Molecular tinkering of G protein-coupled receptors: an evolutionary success. EMBO J. 1999, 18:1723-1729.

25. Bockaert J: Coupling of receptors to G proteins, pharmacological implications. Therapie 1991, 46:413-420.

26. Wess J: G-protein-coupled receptors: Molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 1997, 11: 346-354.

27. Gether U, Kobilka BK: G protein-coupled receptors. II. Mechanism of agonist activation. J.Biol.Chem. 1998, 273:17979-17982.

28. O'Dowd BF, Hnatowich M, Regan JW, Leader WM, Caron MG, Lefkowitz RJ: Site-directed mutagenesis of the cytoplasmic domains of the human beta 2-adrenergic receptor. Localization of regions involved in G protein-receptor coupling. J.Biol.Chem. 1988, 263:15985-15992.

29. Wess J: Molecular basis of receptor/G-protein-coupling selectivity. Pharmacol.Ther. 1998, 80:231-264.

30. Krupnick JG, Benovic JL: The role of receptor kinases and arrestins in G protein-coupled receptor regulation. Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol. 1998, 38:289-319.

31. Böhm SK, Grady EF, Bunnett NW: Regulatory mechanisms that modulate signalling by G-protein-coupled receptors. Biochem.J. 1997, 322:1-18.

32. Ferguson SS: Evolving concepts in G protein-coupled receptor endocytosis: the role in receptor desensitization and signaling. Pharmacol.Rev. 2001, 53:1-24.

33. Trowbridge IS, Collawn JF, Hopkins CR: Signal-dependent membrane protein trafficking in the endocytic pathway. Annu.Rev.Cell Biol. 1993, 9:129-161.

34. Mukherjee S, Ghosh RN, Maxfield FR: Endocytosis. Physiol.Rev. 1997, 77:759-803.

35. Chuang DM, Costa E: Evidence for internalization of the recognition site of beta-adrenergic receptors during receptor subsensitivity induced by (-)-isoproterenol. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1979, 76:3024-3028.

36. Harden TK, Cotton CU, Waldo GL, Lutton JK, Perkins JP: Catecholamine-induced alteration in sedimentation behavior of membrane bound beta-adrenergic receptors. Science 1980, 210:441-443.

37. Von Zastrow M, Kobilka BK: Ligand-regulated internalization and recycling of human beta 2-adrenergic receptors between the plasma membrane and endosomes containing transferrin receptors. J.Biol.Chem. 1992, 267:3530-3538.

38. Barak LS, Ferguson SS, Zhang J, Martenson C, Meyer T, Caron MG: Internal trafficking and surface mobility of a functionally intact beta2-adrenergic receptor-green fluorescent protein conjugate. Mol.Pharmacol. 1997, 51:177-184.

39. Tarasova NI, Stauber RH, Choi JK, Hudson EA, Czerwinski G, Miller JL, Pavlakis GN, Michejda CJ, Wank SA: Visualization of G protein-coupled receptor trafficking with the aid of the green

51

fluorescent protein - Endocytosis and recycling of cholecystokinin receptor type A. J.Biol.Chem. 1997, 272:14817-14824.

40. Kallal L, Gagnon AW, Penn RB, Benovic JL: Visualization of agonist-induced sequestration and down-regulation of a green fluorescent protein-tagged beta2-adrenergic receptor. J.Biol.Chem. 1998, 273:322-328.

41. Barlic J, Khandaker MH, Mahon E, Andrews J, DeVries ME, Mitchell GB, Rahimpour R, Tan CM, Ferguson SS, Kelvin DJ: beta-arrestins regulate interleukin-8-induced CXCR1 internalization. J.Biol.Chem. 1999, 274:16287-16294.

42. Doherty AJ, Coutinho V, Collingridge GL, Henley JM: Rapid internalization and surface expression of a functional, fluorescently tagged G-protein-coupled glutamate receptor. Biochem.J. 1999, 341 ( Pt 2):415-422.

43. Montesano R, Orci L, Robert A, Roth J: Non-coated membrane invaginations are involved in binding and internalization of cholera and tetanus toxins. Nature 1982, 296:651-653.

44. Anderson RGW: Caveolae: Where incoming and outgoing messengers meet. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1993, 90:10909-10913.

45. Pearse BMF, Robinson MS: Clathrin, adaptors, and sorting. Annu.Rev.Cell Biol. 1990, 6:151-171.

46. Tsao P, Zastrow M: Downregulation of G protein-coupled receptors. Curr.Opin.Neurobiol. 2000, 10:365-369.

47. Chun MY, Liyanage UK, Lisanti MP, Lodish HF: Signal-transduction of a G-protein-coupled receptor in caveolae - Colocalization of endothelin and its receptor with caveolin. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1994, 91:11728-11732.

48. Bunemann M, Lee KB, Pals-Rylaarsdam R, Roseberry AG, Hosey MM: Desensitization of G-protein-coupled receptors in the cardiovascular system. Annu.Rev.Physiol 1999, 61:169-192.

49. Raposo G, Andre C, Benedetti EL, Dunia I, Guillet JG, Hoebke J, Marullo S, Strosberg AD: Redistribution of muscarinic acetylcholine-receptors on human-fibroblasts induced by regulatory ligands. Biol.Cell 1987, 60:117-124.

50. Raposo G, Dunia I, Delavierklutchko C, Kaveri S, Strosberg AD, Benedetti EL: Internalization of beta-adrenergic-receptor in A431 cells involves non-coated vesicles. Eur.J.Cell Biol. 1989, 50:340-352.

51. Feron O, Smith TW, Michel T, Kelly RA: Dynamic targeting of the agonist-stimulated m2 muscarinic acetylcholine receptor to caveolae in cardiac myocytes. J.Biol.Chem. 1997, 272:17744-17748.

52. Haasemann M, Cartaud J, Muller-Esterl W, Dunia I: Agonist-induced redistribution of bradykinin B2 receptor in caveolae. J.Cell Sci. 1998, 111 ( Pt 7):917-928.

53. Ishizaka N, Griendling KK, Lassegue B, Alexander RW: Angiotensin II type 1 receptor: relationship with caveolae and caveolin after initial agonist stimulation. Hypertension 1998, 32:459-466.

54. Lasley RD, Narayan P, Uittenbogaard A, Smart EJ: Activated cardiac adenosine A(1) receptors translocate out of caveolae. J.Biol.Chem. 2000, 275:4417-4421.

55. Okamoto Y, Ninomiya H, Miwa S, Masaki T: Cholesterol oxidation switches the internalization pathway of endothelin receptor type A from caveolae to clathrin-coated pits in Chinese hamster ovary cells . J.Biol.Chem. 2000, 275:6439-6446.

56. Kirchhausen T: Clathrin. Annu.Rev.Biochem. 2000, 69:699-727.

57. Marsh M, McMahon HT: The structural era of endocytosis. Science 1999, 285:215-220.

58. Goodman OB, Jr., Krupnick JG, Santini F, Gurevich VV, Penn RB, Gagnon AW, Keen JH, Benovic JL: �-arrestin acts as a clathrin adaptor in endocytosis of the �2- adrenergic receptor. Nature 1996, 383:447-450.

52

59. Ferguson SSG, Downey WE, III, Colapietro AM, Barak LS, Ménard L, Caron MG: Role of �-arrestin in mediating agonist-promoted G protein- coupled receptor internalization. Science 1996, 271:363-366.

60. Ferguson G, Watterson KR, Palmer TM: Subtype-specific kinetics of inhibitory adenosine receptor internalization are determined by sensitivity to phosphorylation by G protein-coupled receptor kinases . Mol.Pharmacol. 2000, 57:546-552.

61. Cao TT, Mays RW, Von Zastrow M: Regulated endocytosis of G-protein-coupled receptors by a biochemically and functionally distinct subpopulation of clathrin-coated pits. J.Biol.Chem. 1998, 273:24592-24602.

62. Murray SR, Evans CJ, Von Zastrow M: Phosphorylation is not required for dynamin-dependent endocytosis of a truncated mutant opioid receptor. J.Biol.Chem. 1998, 273:24987-24991.

63. Pizard A, Blaukat A, Muller-Esterl W, Alhenc-Gelas F, Rajerison RM: Bradykinin-induced internalization of the human B2 receptor requires phosphorylation of three serine and two threonine residues at its carboxyl tail. J.Biol.Chem. 1999, 274:12738-12747.

64. Maestes DC, Potter RM, Prossnitz ER: Differential phosphorylation paradigms dictate desensitization and internalization of the N-formyl peptide receptor. J.Biol.Chem. 1999, 274:29791-29795.

65. Ferguson SSG, Zhang J, Barak LS, Caron MG: Pleiotropic role for GRKs and �-arrestins in receptor regulation. News Physiol.Sci. 1997, 12:145-152.

66. Premont RT, Claing A, Vitale N, Freeman JL, Pitcher JA, Patton WA, Moss J, Vaughan M, Lefkowitz RJ: beta2-Adrenergic receptor regulation by GIT1, a G protein- coupled receptor kinase-associated ADP ribosylation factor GTPase- activating protein. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1998, 95:14082-14087.

67. Claing A, Perry SJ, Achiriloaie M, Walker JK, Albanesi JP, Lefkowitz RJ, Premont RT: Multiple endocytic pathways of G protein-coupled receptors delineated by GIT1 sensitivity [In Process Citation]. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2000, 97:1119-1124.

68. Tsuga H, Kameyama K, Haga T, Kurose H, Nagao T: Sequestration of muscarinic acetylcholine receptor m2 subtypes. Facilitation by G protein-coupled receptor kinase (GRK2) and attenuation by a dominant-negative mutant of GRK2. J.Biol.Chem. 1994, 269:32522-32527.

69. Ferguson SSG, Ménard L, Barak LS, Koch WJ, Colapietro AM, Caron MG: Role of phosphorylation in agonist-promoted �2-adrenergic receptor sequestration - Rescue of a sequestration-defective mutant receptor by �ARK1. J.Biol.Chem. 1995, 270:24782-24789.

70. Menard L, Ferguson SS, Barak LS, Bertrand L, Premont RT, Colapietro AM, Lefkowitz RJ, Caron MG: Members of the G protein-coupled receptor kinase family that phosphorylate the beta2-adrenergic receptor facilitate sequestration. Biochemistry 1996, 35:4155-4160.

71. Menard L, Ferguson SS, Zhang J, Lin FT, Lefkowitz RJ, Caron MG, Barak LS: Synergistic regulation of beta2-adrenergic receptor sequestration: intracellular complement of beta-adrenergic receptor kinase and beta- arrestin determine kinetics of internalization. Mol.Pharmacol. 1997, 51:800-808.

72. Lefkowitz RJ: G protein-coupled receptor kinases. Cell 1993, 74:409-412.

73. Moro O, Lameh J, Sadée W: Serine- and threonine-rich domain regulates internalization of muscarinic cholinergic receptors. J.Biol.Chem. 1993, 268:6862-6865.

74. Trapaidze N, Keith DE, Cvejic S, Evans CJ, Devi LA: Sequestration of the � opioid receptor - Role of the C terminus in agonist-mediated internalization. J.Biol.Chem. 1996, 271:29279-29285.

75. Lohse MJ, Andexinger S, Pitcher J, Trukawinski S, Codina J, Faure JP, Caron MG, Lefkowitz RJ: Receptor-specific desensitization with purified proteins. Kinase dependence and receptor specificity of beta-arrestin and arrestin in the beta 2-adrenergic receptor and rhodopsin systems. J.Biol.Chem. 1992, 267:8558-8564.

53

76. Gurevich VV, Dion SB, Onorato JJ, Ptasienski J, Kim CM, Sterne-Marr R, Hosey MM, Benovic JL: Arrestin interactions with G protein-coupled receptors. Direct binding studies of wild type and mutant arrestins with rhodopsin, beta 2-adrenergic, and m2 muscarinic cholinergic receptors. J.Biol.Chem. 1995, 270:720-731.

77. Pfister C, Chabre M, Plouet J, Tuyen VV, De Kozak Y, Faure JP, Kuhn H: Retinal S antigen identified as the 48K protein regulating light-dependent phosphodiesterase in rods. Science 1985, 228:891-893.

78. Krupnick JG, Gurevich VV, Benovic JL: Mechanism of quenching of phototransduction. Binding competition between arrestin and transducin for phosphorhodopsin. J.Biol.Chem. 1997, 272:18125-18131.

79. Benovic JL, Kuhn H, Weyand I, Codina J, Caron MG, Lefkowitz RJ: Functional desensitization of the isolated beta-adrenergic receptor by the beta-adrenergic receptor kinase: potential role of an analog of the retinal protein arrestin (48-kDa protein). Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1987, 84:8879-8882.

80. Krupnick JG, Goodman OB, Keen JH, Benovic JL: Arrestin/clathrin interaction. Localization of the clathrin binding domain of nonvisual arrestins to the carboxy terminus. J.Biol.Chem. 1997, 272:15011-15016.

81. Goodman OB, Krupnick JG, Gurevich VV, Benovic JL, Keen JH: Arrestin/clathrin interaction. Localization of the arrestin binding locus to the clathrin terminal domain. J.Biol.Chem. 1997, 272:15017-15022.

82. Laporte SA, Oakley RH, Zhang J, Holt JA, Ferguson SS, Caron MG, Barak LS: The beta2-adrenergic receptor/betaarrestin complex recruits the clathrin adaptor AP-2 during endocytosis. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 1999, 96:3712-3717.

83. Laporte SA, Oakley RH, Holt JA, Barak LS, Caron MG: The interaction of {beta}arrestin with the AP-2 adaptor, rather than clathrin, is required for the clustering of {beta}2-adrenergic receptor into clathrin-coated pits. J.Biol.Chem. 2000.

84. Vogler O, Nolte B, Voss M, Schmidt M, Jakobs KH, Van Koppen CJ: Regulation of muscarinic acetylcholine receptor sequestration and function by beta-arrestin. J.Biol.Chem. 1999, 274:12333-12338.

85. DeGraff JL, Gagnon AW, Benovic JL, Orsini MJ: Role of arrestins in endocytosis and signaling of alpha2-adrenergic receptor subtypes. J.Biol.Chem. 1999, 274:11253-11259.

86. Cheng ZJ, Zhao J, Sun Y, Hu W, Wu YL, Cen B, Wu GX, Pei G: beta-arrestin differentially regulates the chemokine receptor CXCR4-mediated signaling and receptor internalization, and this implicates multiple interaction sites between beta-arrestin and CXCR4. J.Biol.Chem. 2000, 275:2479-2485.

87. Bremnes T, Paasche JD, Mehlum A, Sandberg C, Bremnes B, Attramadal H: Regulation and intracellular trafficking pathways of the endothelin receptors. J.Biol.Chem. 2000, 275:17596-17604.

88. Vickery RG, Von Zastrow M: Distinct dynamin-dependent and -independent mechanisms target structurally homologous dopamine receptors to different endocytic membranes. J.Cell Biol. 1999, 144:31-43.

89. Vogler O, Bogatkewitsch GS, Wriske C, Krummenerl P, Jakobs KH, Van Koppen CJ: Receptor subtype-specific regulation of muscarinic acetylcholine receptor sequestration by dynamin. Distinct sequestration of m2 receptors. J.Biol.Chem. 1998, 273:12155-12160.

90. Sibley DR, Lefkowitz RJ: Molecular mechanisms of receptor desensitization using the beta-adrenergic receptor-coupled adenylate cyclase system as a model. Nature 1985, 317:124-129.

91. Ferguson SS, Zhang J, Barak LS, Caron MG: Molecular mechanisms of G protein-coupled receptor desensitization and resensitization. Life Sci. 1998, 62:1561-1565.

54

92. Lefkowitz RJ: G protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor siganaling and desensitization. J.Biol.Chem. 1998, 273:18677-18680.

93. Pitcher JA, Payne ES, Csortos C, DePaoli-Roach AA, Lefkowitz RJ: The G-protein-coupled receptor phosphatase: A protein phosphatase type 2A with a distinct subcellular distribution and substrate specificity. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1995, 92:8343-8347.

94. Sibley DR, Strasser RH, Benovic JL, Daniel K, Lefkowitz RJ: Phosphorylation/dephosphorylation of the beta-adrenergic receptor regulates its functional coupling to adenylate cyclase and subcellular distribution. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1986, 83:9408-9412.

95. Krueger KM, Daaka Y, Pitcher JA, Lefkowitz RJ: The role of sequestration in G protein-coupled receptor resensitization - Regulation of �2-adrenergic receptor dephosphorylation by vesicular acidification. J.Biol.Chem. 1997, 272:5-8.

96. Pippig S, Andexinger S, Lohse MJ: Sequestration and recycling of beta 2-adrenergic receptors permit receptor resensitization. Mol.Pharmacol. 1995, 47:666-676.

97. Garland AM, Grady EF, Lovett M, Vigna SR, Frucht MM, Krause JE, Bunnett NW: Mechanisms of desensitization and resensitization of G protein-coupled neurokinin1 and neurokinin2 receptors. Mol.Pharmacol. 1996, 49:438-446.

98. Barak LS, Tiberi M, Freedman NJ, Kwatra MM, Lefkowitz RJ, Caron MG: A highly conserved tyrosine residue in G protein-coupled receptors is required for agonist-mediated �2-adrenergic receptor sequestration. J.Biol.Chem. 1994, 269:2790-2795.

99. Lutz MP, Pinon DI, Gates LK, Shenolikar S, Miller LJ: Control of cholecystokinin receptor dephosphorylation in pancreatic acinar cells. J.Biol.Chem. 1993, 268:12136-12142.

100. Giannini E, Boulay F: Phosphorylation, dephosphorylation, and recycling of the C5a receptor in differentiated HL60 cells. J.Immunol. 1995, 154:4055-4064.

101. Wolf R, Koch T, Schulz S, Klutzny M, Schroder H, Raulf E, Buhling F, Hollt V: Replacement of threonine 394 by alanine facilitates internalization and resensitization of the rat mu opioid receptor. Mol.Pharmacol. 1999, 55:263-268.

102. van der Bliek AM, Meyerowitz EM: Dynamin-like protein encoded by the Drosophila shibire gene associated with vesicular traffic. Nature 1991, 351:411-414.

103. Chen MS, Obar RA, Schroeder CC, Austin TW, Poodry CA, Wadsworth SC, Vallee RB: Multiple forms of dynamin are encoded by shibire, a Drosophila gene involved in endocytosis. Nature 1991, 351:583-586.

104. Urrutia R, Henley JR, Cook T, McNiven MA: The dynamins: Redundant or distinct functions for an expanding family of related GTPases. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94:377-384.

105. Hinshaw JE: Dynamin and its role in membrane fission. Annu.Rev.Cell Dev.Biol. 2000, 16:483-519.

106. Hinshaw JE, Schmid SL: Dynamin self-assembles into rings suggesting a mechanism for coated vesicle budding. Nature 1995, 374:190-192.

107. Muhlberg AB, Warnock DE, Schmid SL: Domain structure and intramolecular regulation of dynamin GTPase. EMBO J. 1997, 16:6676-6683.

108. Carr JF, Hinshaw JE: Dynamin assembles into spirals under physiological salt conditions upon the addition of GDP and gamma-phosphate analogues. J.Biol.Chem. 1997, 272:28030-28035.

109. Takei K, Haucke V, Slepnev V, Farsad K, Salazar M, Chen H, De Camilli P: Generation of coated intermediates of clathrin-mediated endocytosis on protein-free liposomes. Cell 1998, 94:131-141.

110. Takei K, McPherson PS, Schmid SL, De Camilli P: Tubular membrane invaginations coated by dynamin rings are induced by GTP-gammaS in nerve terminals. Nature 1995, 374:186-190.

111. Hinshaw JE: Dynamin spirals. Curr.Opin.Struct.Biol. 1999, 9:260-267.

55

112. Warnock DE, Hinshaw JE, Schmid SL: Dynamin self-assembly stimulates its GTPase activity. J.Biol.Chem. 1996, 271:22310-22314.

113. Stowell MHB, Marks B, Wigge P, McMahon HT: Nucleotide-dependent conformational changes in dynamin: evidence for a mechanochemical molecular spring. Nat.Cell Biol. 1999, 1:27-32.

114. Sweitzer SM, Hinshaw JE: Dynamin undergoes a GTP-dependent conformational change causing vesiculation. Cell 1998, 93:1021-1029.

115. Sever S, Muhlberg AB, Schmid SL: Impairment of dynamin's GAP domain stimulates receptor-mediated endocytosis [see comments]. Nature 1999, 398:481-486.

116. Sever S, Damke H, Schmid SL: Dynamin:GTP controls the formation of constricted coated pits, the rate limiting step in clathrin-mediated endocytosis. J.Cell Biol. 2000, 150:1137-1148.

117. Herskovits JS, Burgess CC, Obar RA, Vallee RB: Effects of mutant dynamin on endocytosis. J.Cell Biol. 1993, 122:565-578.

118. Schmid SL, McNiven MA, De Camilli P: Dynamin and its partners: a progress report. Curr.Opin.Cell Biol. 1998, 10:504-512.

119. Yang W, Wang D, Richmond A: Role of clathrin-mediated endocytosis in CXCR2 sequestration, resensitization, and signal transduction. J.Biol.Chem. 1999, 274:11328-11333.

120. Trejo J, Altschuler Y, Fu HW, Mostov KE, Coughlin SR: Protease-activated receptor-1 down-regulation: a mutant HeLa cell line suggests novel requirements for PAR1 phosphorylation and recruitment to clathrin-coated pits. J.Biol.Chem. 2000, 275:31255-31265.

121. Richardson JB, Beaulnes A: The cellular site of action of angiotensin. Cell.Biol. 1971, 51:419-432.

122. Robertson AL, Jr., Khairallah PA: Angiotensin II: Rapid localization in nuclei of smooth and cardiac muscle. Science 1971, 172:1138-1139.

123. Bianchi C, Gutkowska J, Charbonneau C, Ballak M, Anand-Srivastava MB, De Léan A, Genest J, Cantin M: Internalization and lysosomal association of [125I] angiotensin II in norepinephrine-containing cells of the rat adrenal medulla. Endocrinology 1986, 119:1873-1875.

124. Anderson KM, Murahashi T, Dostal DE, Peach MJ: Morphological and biochemical analysis of angiotensin II internalization in cultured rat aortic smooth muscle cells. Am.J.Physiol.Cell Physiol. 1993, 264:C179-C188.

125. Hunyady L, Merelli F, Baukal AJ, Balla T, Catt KJ: Agonist-induced endocytosis and signal generation in adrenal glomerulosa cells. A potential mechanism for receptor-operated calcium entry. J.Biol.Chem. 1991, 266:2783-2788.

126. Bianchi C, Gutkowska J, De Léan A, Ballak M, Anand-Srivastava MB, Genest J, Cantin M: Fate of [125I]angiotensin II in adrenal zona glomerulosa cells. Endocrinology 1986, 118:2605-2607.

127. Crozat A, Penhoat A, Saez JM: Processing of angiotensin II (A-II) and (Sar1,Ala8)A-II by cultured bovine adrenocortical cells. Endocrinology 1986, 118:2312-2318.

128. Griendling KK, Delafontaine P, Rittenhouse SE, Gimbrone MA, Jr., Alexander RW: Correlation of receptor sequestration with sustained diacylglycerol accumulation in angiotensin II-stimulated cultured vascular smooth muscle cells. J.Biol.Chem. 1987, 262:14555-14562.

129. Ullian ME, Linas SL: Role of receptor cycling in the regulation of angiotensin II surface receptor number and angiotensin II uptake in rat vascular smooth muscle cells. J.Clin.Invest. 1989, 84:840-846.

130. Schelling JR, Hanson AS, Marzec R, Linas SL: Cytoskeleton-dependent endocytosis is required for apical type 1 angiotensin II receptor-mediated phospholipase C activation in cultured rat proximal tubule cells. J.Clin.Invest. 1992, 90:2472-2480.

131. Becker BN, Cheng HF, Burns KD, Harris RC: Polarized rabbit type 1 angiotensin II receptors manifest differential rates of endocytosis and recycling. Am.J.Physiol.Cell Physiol. 1995, 269:C1048-C1056.

56

132. Richard DE, Chrétien L, Caron M, Guillemette G: Stimulation of the angiotensin II type I receptor on bovine adrenal glomerulosa cells activates a temperature-sensitive internalization-recycling pathway. Mol.Cell.Endocrinol. 1997, 129:209-218.

133. Becker BN, Cheng H-F, Harris RC: Apical ANG II-stimulated PLA2 activity and Na+ flux: a potential role for Ca2+-independent PLA2. Am.J.Physiol. 1997, 273:F554-F562.

134. Lázari MDM, Porto CS, Freymüller E, Abreu LC, Picarelli ZP: Receptor-mediated endocytosis of angiotensin II in rat myometrial cells. Biochem.Pharmacol. 1997, 54:399-408.

135. Thomas WG, Thekkumkara TJ, Baker KM: Molecular mechanisms of angiotensin II (AT1A) receptor endocytosis. Clin.Exp.Pharmacol.Physiol. 1996, Suppl.3:S74-S80.

136. Hunyady L, Bor M, Balla T, Catt KJ: Identification of a cytoplasmic Ser-Thr-Leu motif that determines agonist-induced internalization of the AT1 angiotensin receptor. J.Biol.Chem. 1994, 269:31378-31382.

137. Hunyady L, Baukal AJ, Balla T, Catt KJ: Independence of type 1 angiotensin II receptor endocytosis from G protein coupling and signal transduction. J.Biol.Chem. 1994, 269:24798-24804.

138. Thomas WG, Thekkumkara TJ, Motel TJ, Baker KM: Stable expression of a truncated AT1A receptor in CHO- K1 cells. The carboxyl-terminal region directs agonist- induced internalization but not receptor signaling or desensitization. J.Biol.Chem. 1995, 270:207-213.

139. Thomas WG, Baker KM, Motel TJ, Thekkumkara TJ: Angiotensin II receptor endocytosis involves two distinct regions of the cytoplasmic tail. A role for residues on the hydrophobic face of a putative amphipathic helix. J.Biol.Chem. 1995, 270:22153-22159.

140. Conchon S, Monnot C, Teutsch B, Corvol P, Clauser E: Internalization of the rat AT1a and AT1b receptors: Pharmacological and functional requirements. FEBS Lett. 1994, 349:365-370.

141. Bihoreau C, Monnot C, Davies E, Teutsch B, Bernstein KE, Corvol P, Clauser E: Mutation of Asp74 of the rat angiotensin II receptor confers changes in antagonist affinities and abolishes G-protein coupling. Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993, 90:5133-5137.

142. Barker S, Kapas S, Fluck RJ, Clark AJL: Effects of the selective protein kinase C inhibitor Ro 31- 7549 on human angiotensin II receptor desensitisation and intracellular calcium release. FEBS Lett. 1995, 369:263-266.

143. Balmforth AJ, Shepherd FH, Warburton P, Ball SG: Evidence of an important and direct role for protein kinase C in agonist-induced phosphorylation leading to desensitization of the angiotensin AT1A receptor. Br.J.Pharmacol. 1997, 122:1469-1477.

144. Ishizaka N, Alexander RW, Laursen JB, Kai H, Fukui T, Oppermann M, Lefkowitz RJ, Lyons PR, Griendling KK: G protein-coupled receptor kinase 5 in cultured vascular smooth muscle cells and rat aorta. Regulation by angiotensin II and hypertension. J.Biol.Chem. 1997, 272:32482-32488.

145. Sasamura H, Hein L, Saruta T, Pratt RE: Evidence for internalization of both type 1 angiotensin receptor subtypes (AT1a, AT1b) by a protein kinase C independent mechanism. Hypertens.Res. 1997, 20:295-300.

146. Qian H, Pipolo L, Thomas WG: Identification of protein kinase C phosphorylation sites in the angiotensin II (AT1A) receptor. Biochem.J. 1999, 343 Pt 3:637-644.

147. Thomas WG, Motel TJ, Kule CE, Karoor V, Baker KM: Phosphorylation of the angiotensin II (AT1A) receptor carboxyl terminus: A role in receptor endocytosis. Mol.Endocrinol. 1998, 12:1513-1524.

148. Smith RD, Hunyady L, Olivares-Reyes JA, Mihalik B, Jayadev S, Catt KJ: Agonist-induced phosphorylation of the angiotensin AT1a receptor is localized to a serine/threonine-rich region of its cytoplasmic tail. Mol.Pharmacol. 1998, 54:935-941.

149. Kunkel TA, Roberts JD, Zakour RA: Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Methods Enzymol. 1987, 154:367-382.

57

150. Balla T, Enyedi P, Hunyady L, Spät A: Effects of lithium on angiotensin-stimulated phosphatidylinositol turnover and aldosterone production in adrenal glomerulosa cells: a possible causal relationship. FEBS Lett. 1984, 171:179-182.

151. Hunyady L, Bor M, Baukal AJ, Balla T, Catt KJ: A conserved NPLFY sequence contributes to agonist binding and signal transduction but is not an internalization signal for the type 1 angiotensin II receptor. J.Biol.Chem. 1995, 270:16602-16609.

152. Wiley HS, Cunningham DD: The endocytoc rate constant. A cellular parameter for quantitating receptor-mediated endocytosis. J.Biol.Chem. 1982, 257:4222-4229.

153. Heymann JAW, Subramaniam S: Expression, stability, and membrane integration of truncation mutants of bovine rhodopsin . Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94:4966-4971.

154. Josiah SM, Cyr CR, Chu V, Grumet M, Gardner JP, Kris RM: Regions of the human neurokinin A receptor involved in the generation of second messenger and in receptor desensitization. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1994, 199:626-632.

155. Shibata T, Suzuki C, Ohnishi J, Murakami K, Miyazaki H: Identification of Region in the Human Angiotensin II Receptor Type 1 Responsible for Gi and Gq Coupling by Mutagenesis Study. Biochem.Biophys.Res.Commun. 1996, 218:383-389.

156. Chaki S, Guo D-F, Yamano Y, Ohyama K, Tani M, Mizukoshi M, Shirai H, Inagami T: Role of carboxyl tail of the rat angiotensin II type 1A receptor in agonist-induced internalization of the receptor. Kidney Int. 1994, 46:1492-1495.

157. Lohse MJ, Benovic JL, Codina J, Caron MG, Lefkowitz RJ: beta-Arrestin: a protein that regulates beta-adrenergic receptor function. Science 1990, 248:1547-1550.

158. Pippig S, Andexinger S, Daniel K, Puzicha M, Caron MG, Lefkowitz RJ, Lohse MJ: Overexpression of beta-arrestin and beta-adrenergic receptor kinase augment desensitization of beta 2-adrenergic receptors. J.Biol.Chem. 1993, 268:3201-3208.

159. Heuser JE, Anderson RG: Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking clathrin-coated pit formation. J.Cell Biol. 1989, 108:389-400.

160. Woods JW, Goodhouse J, Farquhar MG: Transferrin receptors and cation-independent mannose-6-phosphate receptors deliver their ligands to two distinct subpopulations of multivesicular endosomes. Eur.J.Cell Biol. 1989, 50:132-143.

161. Anderson RG: The caveolae membrane system. Annu.Rev.Biochem. 1998, 67:199-225.

162. Tolbert LM, Lameh J: Human muscarinic cholinergic receptor Hm1 internalizes via clathrin-coated vesicles. J.Biol.Chem. 1996, 271:17335-17342.

163. Tsao PI, Von Zastrow M: Type-specific sorting of G protein-coupled receptors after endocytosis. J.Biol.Chem. 2000, 275:11130-11140.

164. Krupnick JG, Santini F, Gagnon AW, Keen JH, Benovic JL: Modulation of the arrestin-clathrin interaction in cells. Characterization of beta-arrestin dominant-negative mutants. J.Biol.Chem. 1997, 272:32507-32512.

165. Li JG, Luo LY, Krupnick JG, Benovic JL, Liu-Chen LY: U50,488H-induced internalization of the human kappa opioid receptor involves a �-arrestin- and dynamin-dependent mechanism. Kappa receptor activation is not required for mitogen-activated protein kinase activation. J.Biol.Chem. 1999, 274:12087-12094.

166. Orsini MJ, Parent JL, Mundell SJ, Benovic JL: Trafficking of the HIV coreceptor CXCR4. Role of arrestins and identification of residues in the c-terminal tail that mediate receptor internalization. J.Biol.Chem. 1999, 274:31076-31086.

167. Cheung AH, Sigal IS, Dixon RA, Strader CD: Agonist-promoted sequestration of the beta 2-adrenergic receptor requires regions involved in functional coupling with Gs. Mol.Pharmacol. 1989, 35:132-138.

58

168. Klos A, Mätje C, Rheinheimer C, Bautsch W, Köhl J, Martin U, Burg M: Amino acids 327-350 of the human C5a-receptor are not essential for [125I]C5a binding in COS cells and signal transduction in Xenopus oocytes. FEBS Lett. 1994, 344:79-82.

169. Schneider H, Feyen JHM, Seuwen K: A C-terminally truncated human parathyroid hormone receptor is functional and activates multiple G proteins. FEBS Lett. 1994, 351:281-285.

170. Smit MJ, Timmerman H, Blauw J, Beukers MW, Roovers E, Jacobs EH, Hoffmann M, Leurs R: The C terminal tail of the histamine H2 receptor contains positive and negative signals important for signal transduction and receptor down-regulation. J.Neurochem. 1996, 67:1791-1800.

171. Benovic JL, Strasser RH, Caron MG, Lefkowitz RJ: Beta-adrenergic receptor kinase: identification of a novel protein kinase that phosphorylates the agonist-occupied form of the receptor. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1986, 83:2797-2801.

172. Delafontaine P, Griendling KK, Gimbrone MA, Jr., Alexander RW: Potassium depletion selectively inhibits sustained diacylglycerol formation from phosphatidylinositol in angiotensin II-stimulated, cultured vascular smooth muscle cells. J.Biol.Chem. 1987, 262:14549-14554.

173. Zhang J, Barak LS, Anborgh PH, Laporte SA, Caron MG, Ferguson SS: Cellular trafficking of G protein-coupled receptor/beta-arrestin endocytic complexes. J.Biol.Chem. 1999, 274:10999-11006.

174. Anborgh PH, Seachrist JL, Dale LB, Ferguson SS: Receptor/beta-arrestin complex formation and the differential trafficking and resensitization of beta2-adrenergic and angiotensin II type 1A receptors. Mol.Endocrinol. 2000, 14: 2040-2053.

175. Barak LS, Ferguson SS, Zhang J, Caron MG: A beta-arrestin/green fluorescent protein biosensor for detecting G protein-coupled receptor activation. J.Biol.Chem. 1997, 272:27497-27500.

176. Werbonat Y, Kleutges N, Jakobs KH, Van Koppen CJ: Essential role of dynamin in internalization of M2 muscarinic acetylcholine and angiotensin AT1A receptors. J.Biol.Chem. 2000, 275:21969-21974.

177. Kohout TA, Lin FS, Perry SJ, Conner DA, Lefkowitz RJ: beta-Arrestin 1 and 2 differentially regulate heptahelical receptor signaling and trafficking. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 2001, 98:1601-1606.

178. Oakley RH, Laporte SA, Holt JA, Barak LS, Caron MG: Association of beta-arrestin with G protein-coupled receptors during clathrin-mediated endocytosis dictates the profile of receptor resensitization. J.Biol.Chem. 1999, 274:32248-32257.

179. Baldwin JM, Schertler GFX, Unger VM: An alpha-carbon template for the transmembrane helices in the rhodopsin family of G-protein-coupled receptors. J.Mol.Biol. 1997, 272:144-164.