1

Neurofiziológiai kurzus – tervezett program I. Félév – celluláris neurofiziológia

A neuronok elektrofiziológiája: membrán potenciál, ioncsatornák és ion transzporterek; elektrotónusos és akciós potenciálok ionális mechanizmusai, a membrán passzív elektromos tulajdonságai és ennek következményei – az ionáramok mérése és jellemzése

Szinaptikus transzmisszió: a szinapszis felépítése és típusai, pre- és posztszinaptikus cellulárisfolyamatok a kémiai szinapszisban, neurotranszmitterek és transzmitter receptorok, intracelluláris szignalizáció, posztszinaptikus potenciálok, a szinaptikus plaszticitás alapjai, wiring versus volume transmission

A szenzoros transzdukció celluláris alapjai: a szenzoros inger – neurális aktivitás összefüggés általános törvényszerűségei, a szenzoros (generátor) potenciál keletkezése különböző szenzoros modalitásokban, a szenzoros információ kódolása a neuronokban

A neuronok kalcium háztartása és annak élettani és kórélettani vonatkozásai – az ic. Ca2+ tranziensek mérése

Intracelluláris transzport folyamatok a neuronokban: az axonális transzport mechanizmusai és jelentősége, a neuronális (membrán) fehérjék életciklusa – az axonális és az intraneuronálistranszport folyamatok vizsgálata

Neurogenezis, differenciálódás (cell faith), fejlődés és regeneráció, neuronális őssejtek, de novoneurogenezis, neurotrophikus faktorok és egyéb trofikus szignálmolekulák, „axonalguidance”

A neuronok intermedier anyagcseréjének és energiaháztartásának jellegzetességei. A neuronális energiaháztartás zavarai, a mitochondriumok szerepe a neuronális funkciókban és a neuronok károsodásában, neurodegeneráció és apaptózis

Ajánlott irodalom:

Principles of Neural Science (Eric R. Kandel, James Schwartz, and Thomas Jessell)

Neuroscience, 2nd ed. (Dale Purves, George J Augustine, David Fitzpatrick, Lawrence C Katz, Anthony-Samuel LaMantia, James O McNamara, and S Mark William) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=neurosci

http://nobelprize.org/ - Official web site of the Nobel Prize

Élettan tankönyvek (Fonyó A. Ligeti E.: Orvosi Élettan)

A molekuláris élettan alapjai (Dr. Erdélyi Lajos)

Basic Neurochemistry, 6th ed. (George J Siegel, MD, Bernard W Agranoff, Wayne Albers, Stephen K Fisher and Michael D Uhler)http://www.ncbi.nlm.nih.gov/bookshelf/br.fcgi?book=bnchm

A plazmamembrán klasszikus „fluid mosaic” modellje(Singer és Nicholson, 1972 )

Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997

A plazmamembrán felépítése I. – lipidek - lipoidok

Amphiphyl lipid molekolák által képzett lipid kettősréteg:

foszfolipidek: foszfatidilkolin, foszfatidilszerin, foszfatidiletanolamin, stb.sphingomyelinglikolipidek: gangliozidokkoleszterin

Spontán membrán képződés (mesterséges membránok)+ micellák, liposzómák

A lipidmembrán permeabilitása: hirofób anyagok >> hidrofil anyagok

Plaszticitás: deformáció, lefűződés, összeolvadás

„Lipid Raft“-ok: koleszterinben és glikolipidekben gazdag membrán szigetek(raftok): „Detergent Resistant Lipid Microdomain“

2

Diffúziós konstans függ:

hőmérséklettől

A diffundáló anyag és a diffúziós barrier fiziko-kémiai tulajdonságaitól:Zsír- és vízoldékonyságPalzmamembrán esetében magas permeabilitás:gázok, etilalkohol, urea, lipidek

nagyméretű vízoldékony molekulák és ionok:nagyon csekély permeabilitás

Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997

Lipid kettősréteg Suggested definition of lipid rafts(Pike LJ. 2006. J. Lipid Research

"Membrane rafts are small (10-200 nm), heterogeneous, highly dynamic, sterol-and sphingolipid-enriched domains thatcompartmentalize cellular processes. Small rafts can sometimes be stabilized toform larger platforms through protein-protein and protein-lipid interactions."

A lipid raftok

Jelentőségük: platform egyes fehérjék felszíni sűrűségének növelésére, fehérjekomplexek kialakulására és stabilizálására (jelátvitel, endo-/exocitózis, stb.)

A plazmamembrán alkotói II. - fehérjék (a tömeg 25-70%-a)

Az hidrofób amninósav oldalláncok és a zsírsav láncok közötti apoláros kölcsön-hatások rögzítik az egyes fehérjéket

-transzmembrán domének – hidrofób aminósav oldalláncok dominálnak(Val, Leu, Ile stb.)

A fehérjék (és a lipoidok) transzport vezikulák segítségével recirkulálnak

Intraceluláris transzport folyamatok biztosítják a fehérjék célzott mozgását„Trafficking”, axonális (dendritikus) transzport

Laterális diffúzió: a membrán alkotó molekulák mozgása a membrán síkjában„Single Particle Imaging/Tracking”de: a laterális diffúziót különböző kölcsönhatások akadályozhatják:más membrán fehérjék, citoszkeleton, membránszkeleton

(„Confinement”)

3

Anyagáramlás a IC és az EC folyadéktér között – transzmembrán transzport folyamatok

Szabad diffúzióIoncsatornán és pórusokon keresztül történő transzportFacilitált diffúzió (karrier/transzporter mediált passzív transzport)Karrier mediált aktív transzport (pumpák)

Exo- és endocytózis (vezikuláris transzport)

Transzport molekulák

Ioncsatornák és pórusok (porinok, perforin, komplement MAC)„Karrier” molekulák, pumpákHajtóerő lehet passzív: koncentráció grádiens

Ionok: elektrokémiai grádiens (Nernst potenciál)aktív trp.: metabolikus energia (ATP hidrolízis)

Általános tulajdonságok:

Specifikus: szelektív permeabilitás, szubsztrátspecifikus kötésSzaturáció: A transzport sebessége függ az aktív karrierek/csatornák

mennyiségétől (Tmax): maximális transzport ráta

Hőmérséklet függőségAktiválható/szabályozható: „Gating“ (csatorna alegységek konformáció váltása)

Kovalens/nem-kovalens modifikációkgén expresszió változás, transzlokáció

Szelektív gátolhatóság szelektív farmakonokkal gátolható (aktiválható)(pl. kompetitív kötés, csatorna gátlás)

Csatornák:

Vezetőképesség: 106-108 ion/s (Siemens (S): pS = 10-12 S)

Ionszelektivitás: szelektív és nem szelektív ioncsatornák (pl. NMDA receptor)

Rektifikáció: a csatorna vezetőképessége függhet az áram irányától is

A csatornák aktivitása (nyitás/zárás) általában szabályozott: kapuzás (Gating)

feszültségfüggő csat. (transzmembrán potenciál)ligandfüggő csat. (transzmitter, mediátor)feszülés érzékeny csat. (mechano- és ozmoreceptorok)hőmérséklet érzékeny csat. (termoreceptorok)intracelluláris szignálra érzékeny csat. (g-fehérje, foszforiláció, stb.)

Szivárgó (leaky) csatornák–tartósan nyitott csatornák – membrán potenciál beállítása „background current”

4

Az ioncsatorna működés funkcionális modellje –kölcsönhatás a transzportált ion és a csatorna között

Sch

mid

t/T

hew

s: P

hys

iolo

gie

des

Men

sch

en27

. A

ufl

age

1997

Ion potenciális energiája

IC EC

MacKinnon, Nobel ea. 2003

A pórus domain konzervetív konszenzus szekvenciája

Em

ImKifelé (outward) rektifikálás

Befelé (inward) rektifikáció

Ohmikus áram (nincs rektifikáció)

Az ionáramok feszültségfüggése – a rektifikáció jelensége

Voltage-current relationship of Kir2 channels

Az ioncsatorna „kapuzás” molekuláris háttere

MacKinnon, Nobel ea. 2003

5

Comparison of reported structures from electron microscopy of TRP channels and other membrane proteins. Negativestain structures, resolution: Prestin, 20 Å (Mio et al., 2008a); CFTR, 20 Å (Mio et al., 2008b); TRPM2, 37 Å (Maruyama etal., 2007); TRPC3, (Mio et al., 2005). Cryo–electron microscopy structures: Na channel, 19 Å (Sato et al., 2004); InsP3

receptor, 20 Å (Sato et al., 2004); TRPC3, 15.3 Å (Mio et al., 2007); TRPV1, 19 Å (Moiseenkova-Bell et al., 2008). Fouriershell correlation >0.5 is used as the resolution criterion for electron microscopy structures. X-ray structure: Kv2.1-1.2,

2.4 Å (Long et al., 2007). J Gen Physiol. 2009 March; 133(3): 239–244. doi: 10.1085/jgp.200810123.

Hot on the trail of TRP channel structure.Moiseenkova-Bell VY, Wensel TG.J Gen Physiol. 2009 Mar;133(3):239-44.

Példa I.: ligandfüggő ioncsatorna- nikotinerg acetylcholin (Ach) receptorionotróp receptor: a receptor fehérjeegyben ioncsatorna is(motoros véglemez, vegetatív ganglion)

Példa II.: feszültségfüggő ioncsatorna TTX (tetrodotoxin) érzékeny Na+-csatorna

(axolemma, izomrostok)

6

Példa III: g-fehérje (receptor) kapcsolt ioncsatorna: muszkarinerg Ach receptor(szív, zsigeri simaizomsejtek, szekretoros hámsejtek)

Metabotróp receptor: a ligand kötés másodlagos hírvivőket aktivál

Schmidt/Thews: Physiologie des Menschen 27. Auflage 1997

Példa IV.: Hőmérséklet függő ioncsatornák

A hőmérséklet hatására aktiválódó ioncsatornák

Fájdalmas meleg (>43 °C) receptor(„capsaicin” is aktiválja – paprika hatóanyaga)

hideg (

7

A feszültségfüggő Ca2+ csatornák családfája (új nómenklatúra)

Molekuláris biológiai módszerek:Heterológ expresszió sejtkultúrákban (Xenopus oocyta, inmortalizált sejtvonalak)Knock-out egér modellek, antiszenz RNS, RNS-interferencia: a vizsgált csatornákexpressziójának célzott gátlása

http://www.iuphar-db.org/index.jsp

Karrier-mediált transzport :

Enzim analógia: S(IC)⇔S+karrier⇔S(EC)Transzport sebessége:

8

A vezikuláris monoamin transzporter(VMAT) szekunder (H+ kapcsolt) aktív transzport

SERT: szeroteonin transzporter(reuptake): Na+; Cl- kapcsolt transzport

Cytoplasm

Extracellular fluid

Transzmembrán potenciál (Em)

Nyugalmi potenciál (E0): (Bernstein 1900 évek – sértési pot.; Young: óriás axon)Elektromos szempontból nyugalomban lévő sejt membránján mért potenciál különbség(a membránpotenciált befolyásoló külső és belső ingerek hiánya) Mértéke sejttípustól függ: -90 - -50 mV Az ionkoncentrációk és az iontranszport determinálják

Mérése: mikroelektróda + erősítő + voltméter– direkt elektromos kontaktus szükséges

Élettani szerepe:•Ingerület képzés és ingerület továbbítás•Transzportfolyamatok hajtóereje•A sejttérfogat szabályozásának faktora

A sejtek többsége stabil, negatív membrán potenciállalrendelkezika stabilitást folyamatos ATP felhasználás biztosítja (akár az ATP 70%-át is felemészti)

Bizonyos sejtek nem rendelkeznek stabil E0-lal: pacemaker (ritmusgenerátor) sejtek

Az extracelluláris és az intracelluláris folyadéktér aszimmetrikus ioneloszlása

ECF (mmol/L)(intersticiális folyadék)

ICF (mmol/L)(sejtplazma)

Plazmamembrán

0.00004 (pH=7.4)

Ionok diffúziós egyensúlya - töltésszétválasztás - a Nernst potenciál

A kémiai (koncentráció grádiens) és az elektromos (elektrosztatikus erőtér) hajtóerők egyensúlya következtében a nettó ionáramlás megszűnik – diffúziós egyensúlyNernst potenciál – megadja a vizsgált ion diffúziós egyensúlyi állapotában mért feszültséget (Nernst v. reversal potential)

- +

Negatív PozitívSzelektív K+ permeábilis membrán

Kiindulási állapot diffúziós egyensúly

9

A Nernst egyenlet: megadja az adott ion egyensúlyi potenciálját azadott ECF és ICF koncentráció értékek mellett:

Az egyes ionokra számított egyensúlyi potenciál értékek (ld. korábbi adatok):

Z = ionok töltéseR = gáz konstansF = Faraday konstansT = hőmérséklet

T=37 ºC

Problémák:

•A különböző ionoknak eltérő egyensúlyi potenciáljuk van•Ezek az értékek eltérnek a tapasztalati E0 értékétől is

Egyensúlyon alapuló tartós membránpotenciál feltétele, hogy a figyelembe vettionok (K+, Na+, Cl) nettó diffúziója (ionáram) nulla legyen.

Ohm törvénye: R = U / I → I = U / R és I = U x g (g=vezetőképesség)

Mekkora az egyes ionokra ható elektrokémiai hajtóerő (Ei) =??- Az aktuális membránpotenciál (Em) és az ion egyensúlyi potenciáljának(ENernst) a különbsége:

→Ei = ENernst – Em

Pl. A kálium áram (IK+) nagysága: IK+=EiK+ x gK+ =(EK+- Em) x gK+

ΣInet = 0 = IK++ INa++ ICl- = gK+ x EiK+ + gNa+ x EiNa+ + gCl- x EiCl-

Goldmann-Hodgkin-Katz (GHK) egyenlet:

Megadja az egyensúlyi membránpotenciál értéket az adott ionkoncentráció ésion permeabilitás (konduktancia) értékek esetén:

A sejtmembrán nyugalmi permeabilitás (konduktancia) értékeinek aránya: PK : PNa : PCl = 1 : 0,04 : 0,45

Magas K+ permeabilitás - a nyugalmi potenciál közel van a K+ egyensúlyi potenciáljához.

A fenti paraméterekben bekövetkező változások az Em (E0) változását okozzák!

Em negatív irányba tér el: hiperpolarizációEm pozitív irányba tér el: depolarizáció

Az ionkoncentrációk megváltozása:[K+] az ECF-ban megnő (hyperkalémia): depolarizáció – (transzmitter release kísérletek)[K+] az ECF-ben lecsökken (hypokalémia): hiperpolarizáció – (arrhythmiák, idegi zavarok

A konduktancia változik meg (pl. ioncsatornák aktiválódása/zárása):fázikus (gyors) változások: akciós potenciál – feszültség függő csatornák öngerjesztő akt.tónusos (lassú) változások: posztszinaptikus potenciál, szenzoros (generátor) potenciál

Újabb probléma: az ionok folyamatos egyirányú áramlása (A. ábra) hamar meg-szüntetné a koncentráció grádienst → végül az Em 0 mV körül stabilizálódna!

Az élő sejtekben egy elektrogén transzport a passzívan diffundáló Na+ és K+ ionokatvisszajuttatja az ECF-be illetve ICF-ba , és stabilizálja a membrán potenciált (B. ábra)

Na+ -K+ ATPáz

A sztöhiometrikus arány: 3 Na+ kifelé 2 K+ befelé (nettó 1+ kifelé/ciklus)Az ATPáz elektrogén hatása eltolja a GHK egyenletből számított egyensúlyi potenciálértékét még kb. 5 mV-tal a negatív irányba - hiperpolarizáló pumpa potenciálKövetkezmények:A Na-K ATPáz gátlása (pl.: ouabain, hypoxia) depolarizálja a membránt. Az Em csökkenése Cl- (és Na+) beáramlást okoz, ami sejtduzzadáshoz vezet (pl.: az agyban ödéma alakul ki) → Na+ -K+ ATPáz részt vesz a sejttérfogat szabályozásában!

Na+

K+

IC EC

Em=-65mV Na+

K+

IC EC

Em=-70mV

Na+

K+

A) B)passzív diffúzió passzív diffúzió

aktív transzport

10

A membrán kapacitás jelentősége

A plazmamembrán kondenzátorként is viselkedik (a lipid kettősréteg a szigetelő réteg, a szomszédos folyadék réteg a vezető).

Nyugalmi állapotban a membrán kapacitása határozza meg az Em feszültségű elektromos erőteret fenntartó ionok mennyiségét

C=Q/U → Q=Cm x Um (Um=Em)

Cm nagyságát a membrán felszíne, vastagsága és a dielektromos állandóhatározzák meg

Példa:

Gömb alakú, 50 µm átmérőjű sejtnél Em=- 60 mV, a membrán kapacitásaCm= 1 µF/cm2

A számítás szerint 30 x 106 töltés (ion) tartja fenn a membránpotenciált.Azonban ez csak 1/200 000 része a teljes intracelluláris ionmennyiségnek!

A membránpotenciál passzív változásai:elektrotónus

A sejt (membrán) ingerlése intracelluláris elektródával

A potenciál változás lefutása:membrán kapacitás gyors „kisülése”(kezdeti gyors depolarizáció)kationok kompenzáló kiáramlása fokozódik(késői lassú depolarizáció és steady state)

Befelé irányuló áram (+ töltések) – depolarizációKifelé irányuló áram (+ töltések) – hyperpolarizáció

Az elektromos ingerléssel kiváltott passzív potenciál változást elektrotónusospotenciál változásnak vagy elektrotónusnak nevezzük.∆Em (Emax) arányos a stimuláló áram intenzításával és a membrán ellenállásával.

E0

Stimuláló áram

electrotónusospotenciál

sejt

Kapacitív komponensOhmikus komp.

A membrán kapacitás hatása a passzív membránpotenciál változás időfüggésére

ττττ = time constant (63% ∆Vm)

A passzív membrán tulajdonságok szerepe az ingerület szummációban- temporális szummáció (repetitív ingerlés depolarizáció hatása összeadódik)

11

Az elektrotónusos potenciál terjedése elongált struktúrákban (rostokban)

Az EP amplitúdója a távolsággalexponenciálisan csökken - dekrementum

Ok: a depolarizáló áram a stimulushelyétől folyamatosan csökken(inhomogén árameloszlás)

lokális áramkörök modell (kábel-teória)Rm – membránellenállásRa – axon (hossz) ellenállás

Hossz „konstans” (37% Emax):

- Rm: egyenesen arányos- Ra: fordítottan arányos

37%Emax Ra= axon (hossz) ellenállás – az axon vastagsága befolyásolja

Rm= transzmembrán ellenállás – ioncsatornák konduktivitása bef.

Az áramsűrűség térbeli alakulása az ingerlés környezetében

(közel) egyidejű de eltérő lokalizációjú ingerlés hatásai összeadódnak:Térbeli (spatialis) szummáció

A membránpotenciál változás „passzív” terjedése elektromosan kapcsolt sejtekközött (gap junctions)

12

Extracelluláris ingerlés:

Katód–membrán depolarizáció

(katelektrotónus) Anód– membrán hiperpolarizációja

(anelektrotónus)

Felhasználás a gyógyászatban:Kamrai tachycardia (életveszély!!) – elektrokardioverzió és defibrillációPacemaker therápia (szív, rekeszizom, KIR)Elektrokonvulzív therápia (Psychotikus állapot)Endocochlearis implantáció („mesterséges” belső fül)TENS: Transdermal Electric Nerve Stimulation (fájdalomkezelés)

Nem külső ingerléssel kiváltott elektrotónusos potenciálok:Posztszinaptikus potenciál (ligandfüggő ioncsatornák, transzmitter receptor szignalizációReceptor- (generator) potenciál: érzőneuron és érzékhámsejtekAz akciós potenciál terjedésePacemaker potenciálok (a pacemaker sejtek spontán depolarizációja)

ECF

ICF

membrán

katód anód