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TruSeq Synthetic Long- Read DNA

ライブラリー調製キット

イルミナ株式会社マーケティング部

2

TruSeq Synthetic Long-Read DNAライブラリー調製キットは、現時点ではHiSeqのみサポートしています。

解析は、BaseSpaceで実施していただきます。

必要準備品が複数ございます。事前にご確認をお願いします。

TruSeq Synthetic Long-Read DNA ライブラリー調製キット使用にあたっての注意点

3

イルミナのDNAライブラリー調製キット

TruSeq DNAPCR-Free

TruSeqNano DNA

NexteraMate Pair

TruSeqSynthetic

Long-ReadNextera Nextera XT

概要PCRがもたら

すバイアスを削除

少ないDNA量で新たな標準

キット

長いインサートでゲルフ

リー

複数のアプリケーションに

対応

微量、迅速、MiSeq

超微量、微生物、

MiSeq

アッセイ時間 ~5時間 ~6時間 1.5日 3日 1.5時間 1.5時間

アプリケーション

全ゲノム 全ゲノムDe novo構造変化

ゲノムフィニッシング、

De novoフェージング

全ゲノム

アンプリコン

プラズミド

小さいゲノム

必要量 1ug+ 100ng+ 1ug+ 500ng 50ng 1ng

インデックス 96 96 48 (gel-free) 96 96

インサート 350 or 550bp 350 or 550bp 約8kbp 10kbp ～300bp ～300bp

NEW

4

Library Prep Barcoding Sequencing Analysis

TruSeq Synthetic Long-Read ワークフローSample to Answerのトータルソリューション

HiSeqのみサポート

5

TruSeq Synthetic Long-Read ワークフロー

DNA断片化＆ライゲーション• ゲノムDNA 500ngをCovarisで約10Kbに断片化• 両端に増幅用のアダプターをライゲーション• 精製、サイズ選択および定量

DNA断片の希釈および増幅• ウェルあたり数百分子程度になるように384ウェ

ルプレートに希釈• ロングレンジPCR反応でDNA断片を増幅

バーコード化およびライブラリー調製• Nexteraによるタグメンテーション• ウェルごとに固有のバーコードを付加• ライブラリーのプーリング、精製、サイズ選択

（ビーズ使用）• 電動ピペット推奨

シーケンス• ライブラリーをまとめてHiSeqで解析

6

TruSeq Synthetic Long-Read ワークフローショートリードからロングリードを合成

100bp x2 の区分け• バーコード情報を元に区分け• ウェル単位にリード配列を分割

100bp x2 のクオリティ前処理（ウェルごと）• PCRエラーの修正

コンティグ & アセンブル（ウェルごと）• ウェルごとにコンティグを作成• アセンブルを実行してロングリードを構築

ロングリード完成• 各ウェルから得られた~10Kbのロングリード

(FASTQ）

7

BaseSpaceで2つのアプリケーションを解析サポート

De novoロングリードヒトゲノム専用フェージング

8

製品名（Library Prep） カタログ番号

TruSeq SYNTH Long-Read DNA Library Prep Kit (4 Samples) FC-126-1001

TruSeq Synthetic Long-Read 製品情報

製品名（Barcoding） カタログ番号

TruSeq SYNTH Long-Read DNA Barcode Kit (1 Sample) FC-126-1002

TruSeq SYNTH Long-Read DNA Barcode Kit (4 Samples) FC-126-1003

製品名（Optional） カタログ番号

TruSeq SYNTH Long-Read DNA Accessory Kit FC-126-1004

9

バーコードキットの利用方法

30x 全ゲノムVCFデータ（フェーズ

なし）

ヒト gDNA500ng

Phased VCF

1x Analysis

高出力あるいはRapid 1レーン

1x Library Prep

1x Barcode Prep

フェージング

LR LibraryPrep Kit

Barcode Plate

gDNA 500ng

ロングリードFastq

4x Barcode Prep

4x Analysis

• 100bp x 2のラン設定• 高出力の場合、1レーン/バーコードプレート• Rapidの場合、2レーン/バーコードプレート

Barcode Plate

Barcode Plate

Barcode Plate

Barcode Plate

LR LibraryPrep Kit

1x Library Prep

ロングリードFastq

ロングリードFastq

ロングリードFastq

ロングリード

10

gDNA 500ng

ロングリードFastq

4x Barcode Prep

4x Analysis

• 100bp x 2のラン設定• 高出力の場合、1レーン/バーコードプレート• Rapidの場合、2レーン/バーコードプレート

Barcode Plate

Barcode Plate

Barcode Plate

Barcode Plate

LR LibraryPrep Kit

1x Library Prep

ロングリードFastq

ロングリードFastq

ロングリードFastq

ロングリード

バーコードキットの利用方法de novoロングリードの場合

バーコードプレートあたり、約600Mbのロングリードのセットを構築（目安）

1サンプルスタート

1ライブラリー調製

複数のバーコードプレートを使用（必要数は次スライド参照）

バーコードプレートごとにシーケンスを実施

バーコードプレートごとに解析を実施

11

• イネのゲノムサイズ = 400Mb• 5xのデータ量で1サンプルをde novo解析• 400Mb x5 = 2Gb 必要• 2Gb / 600Mb = 4バーコードプレート必要

gDNA 500ng

ロングリードFastq

4x Barcode Prep

4x Analysis

• 100bp x 2のラン設定• 高出力の場合、1レーン/バーコードプレート• Rapidの場合、2レーン/バーコードプレート

Barcode Plate

Barcode Plate

Barcode Plate

Barcode Plate

LR LibraryPrep Kit

1x Library Prep

ロングリードFastq

ロングリードFastq

ロングリードFastq

ロングリード

イネ（400Mb）をde novo解析するには

ライブラリー調製キットFC-126-1001（4サンプルキット）1キット購入し、1サンプル分を調製

バーコードキットFC-126-1002（4サンプルキット）1キット購入し、4プレートを使用

600Mb x 4 = 2.4 Gb

高出力の場合、4レーンRapidの場合、8レーン必要

12

ゲノムサイズ

N50(>1.5kb)

(bp)

ロングリード（1.5Kb以上）に

アセンブルできた塩基数

アカパンカビ 41 Mb 8,285 1,417Mb

線虫 102 Mb 9,125 1,182 Mb

トキソプラズマ 65.6 Mb 8,847 1,052Mb

イネ 420 Mb 7,095 1,088Mb

トウモロコシ 2.3 Gb 6,129 597Mb

ロングリード解析例：ゲノムサイズ、複雑性の異なる生物種で実施

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

%GC Reference %GC Long-Reads %Aligned toReference

%Misassembled

%

Neurospora crassa C. Elegans Toxoplasma gondii Oryza sativa Zea mays

13

ゲノムサイズN50 (>1.5kb)

(bp)

ロングリード(>1.5kb)

にアセンブルされた塩基数

パイナップル TBD 6640 824Mb

昆虫 TBD 7,002 814Mb

TruSeq Synthetic Long-Read 使用例

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

4500

1500

2100

2700

3300

3900

4500

5100

5700

6300

6900

7500

8100

8700

9300

9900

10500

11100

11700

12300

12900

13500

14100

14700

Num

ber o

f Lon

g Re

ads

Read Length (bp)

昆虫

0

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

1500

2100

2700

3300

3900

4500

5100

5700

6300

6900

7500

8100

8700

9300

9900

10500

11100

11700

12300

12900

13500

14100

14700

Num

ber o

f Lon

g Re

ads

Read Length (bp)

パイナップル

14

TruSeq Synthetic Long-Read Nexteraメイトペア

原理

• DNAを約10kbに断片化（ロングフラグメント）した後、さらにNextera でタグメンテーション

• もとのロングフラグメントすべてを、ショートリードで読み取り、アセンブルして合成ロングリードを構築

• DNAを約5~8kbに断片化（ロングフラグメント）した後、環状化

• 環状化した接点を抽出しシーケンス（ロングフラグメントの末端配列のみを解析）

目安となるゲノム 40Mbサイズ以上のゲノム 主に微生物でよく使われる

DNAスタート量 500ng ゲルフリー 1ugゲルあり 4ug

最終産物 約10kbをアセンブル5～8kb離れたDNA断片の

両端のみシーケンス

インデックス 利用不可 12プレックス

ライブラリー調製にかかる時間

3日 1.5日

ライブラリーコスト 高 安

対応システム HiSeq HiSeq, NextSeq, MiSeq, GA

シーケンス100bp x2（高出力v3の場合）

1バーコード1レーン（高出力の場合）150bp x2

30～60xカバレッジ推奨

解析 BaseSpace専用アプリメイトペアリード解析が可能なソフトウェア

BaseSpaceアプリ（Spades, Velvet）

Nextera Mate Pairとの違い

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Library Prep Barcoding Sequencing Analysis

TruSeq Synthetic Long-Read DNA ライブラリー調製キットSample to Answer – トータルソリューション