BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCgust.edu.vn/media/25/uftai-ve-tai-day25963.pdf · bỘ giÁo dỤc vÀ ĐÀo tẠo viỆn hÀn lÂm khoa hỌc vÀ cÔng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC

VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

-----------------------------

NGUYỄN HOÀNG SA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,

PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

HÀ NỘI – 2017

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM

HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ

……..….***…………

NGUYỄN HOÀNG SA

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ HOẠT TÍNH

SINH HỌC CỦA CÁC LOÀI LÁ KIM: PINUS DALATENSIS,

PINUS KESIYA VÀ PODOCARPUS NERIIFOLIUS Ở VIỆT NAM

LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Chuyên ngành: Hoá hữu cơ

Mã số: 62 44 01 14

Người hướng dẫn khoa học 1: PGS.TS. Trịnh Thị Thủy

Người hướng dẫn khoa học 2: TS. Nguyễn Thanh Tâm

Hà Nội – 2017

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan:

Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học

của PGS.TS. Trịnh Thị Thủy và TS. Nguyễn Thanh Tâm. Các kết quả

thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố

trong bất kỳ công trình nào khác. Toàn bộ trích dẫn trong luận án đều

chỉ rõ nguồn gốc.

Tác giả luận án

Nguyễn Hoàng Sa

LỜI CẢM ƠN

Luận án này được hoàn thành tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công

nghệ Việt Nam. Trong quá trình nghiên cứu, tác giả đã nhận được nhiều sự giúp đỡ quý

báu của thầy cô, các nhà khoa học cũng như đồng nghiệp, bạn bè và gia đình.

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc đến PGS.TS. Trịnh Thị Thủy

và TS. Nguyễn Thanh Tâm là những người đã hướng dẫn tận tình, chu đáo và tạo mọi

điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận án.

Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Nghiên cứu hợp chất thiên nhiên,

Phòng Tổng hợp hữu cơ, Viện Hóa học đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi trong suốt quá trình làm

luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự quan tâm giúp đỡ của Học viện Khoa học và Công

nghệ, lãnh đạo Viện Hóa học, bộ phận đào tạo Phòng Quản lý tổng hợp đã tạo điều kiện

và giúp đỡ tôi hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn lãnh đạo Trường Đại học Khánh Hòa, trưởng Khoa

cùng cán bộ của Khoa Tự nhiên và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi

trong thời gian làm luận án.

Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới GS.TSKH. Trần Văn Sung đã có những định

hướng xây dựng nền móng ban đầu cho tôi trên con đường học tập và nghiên cứu khoa

học.

Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã cổ vũ, động viên tôi

hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn !

Hà Nội, ngày…..tháng…..năm 2017

Tác giả luận án

Nguyễn Hoàng Sa

i

MỤC LỤC

MỤC LỤC ............................................................................................................................. i

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ......................................................... iv

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG ....................................................................................... vii

DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................................. viii

PHỤ LỤC ............................................................................................................................ ix

MỞ ĐẦU .............................................................................................................................. 1

Chương 1. TỔNG QUAN .................................................................................................. 3

1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu .......................................................................... 3

1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis)........................................................................ 3

1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya) ............................................................................... 3

1.1.3. Thông tre lá dài dai (Podocarpus neriifolius) .................................................. 4

1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus ............................... 5

1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus ............................................. 5

1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus ................................................................ 6

1.2.3. Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus ............................................................. 14

1.2.4. Các hợp chất lignan từ chi Pinus ................................................................... 17

1.2.5. Các hợp chất khác từ chi Pinus ...................................................................... 19

1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của Thông ba lá ................................. 20

1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc chi

Pinus.. .............................................................................................................................. 20

1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau ................................................................ 21

1.4.2. Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư ............................................... 22

1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm ............................................................ 24

1.4.4. Hoạt tính chống oxi hóa ................................................................................. 26

1.4.5. Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác ............................................. 27

1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi

Podocarpus. .................................................................................................................... 28

1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus

neriifolius).... ................................................................................................................... 39

Chương 2. THỰC NGHIỆM ............................................................................................ 42

ii

2.1. Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học ........................................................... 42

2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu........................................................................... 42

2.3. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật ........ 42

2.4. Phương pháp xác định cấu trúc ............................................................................. 43

2.5. Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học .......................................................... 43

2.6. Hóa chất và thiết bị ............................................................................................... 46

2.7. Quy trình chiết và thu các chiết xuất từ các loài thực vật nghiên cứu .................. 47

2.8. Phân lập chất từ các chiết xuất .............................................................................. 48

2.8.1. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt ................. 48

2.8.2. Phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt ...................... 49

2.8.3. Phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt ....................... 49

2.8.4. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt .................. 50

2.8.5. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá ................... 51

2.8.6. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài ............ 52

2.9. Dữ kiện phổ của các chất tách được ..................................................................... 60

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................... 70

3.1. Các chất được phân lập từ Thông đà lạt (Pinus dalatensis) ................................. 70

3.1.1. Chất TT1: Caryolane-1β,9β-diol ................................................................... 70

3.1.2. Hỗn hợp TT2 ................................................................................................. 71

3.1.3. Chất TT3: 15-Methoxypinusolidic acid ........................................................ 73

3.1.4. Chất TT4: Lambertianic acid ........................................................................ 75

3.1.5. Chất TT5: 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-oic acid ................. 77

3.1.6. Chất TT6: Isopimaric acid ............................................................................. 78

3.1.7. Chất TT12: 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one ................................................ 79

3.1.8. Chất TF1: Pinocembrin .................................................................................. 81

3.1.9. Chất TF2: Chrysin ......................................................................................... 82

3.1.10. Chất TF3: Pinostrobin .................................................................................... 83

3.1.11. Chất TF4: (+) Catechin .................................................................................. 84

3.1.12. Chất TF5: Kaempferol ................................................................................... 85

iii

3.1.13. Chất TF7: Kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyrano-

side........ ....................................................................................................................... 86

3.1.14. Chất TP1: Dihydropinosylvin ........................................................................ 89

3.1.15. Chất TP2: Dihydropinosylvin 5-methyl ether ............................................... 89

3.1.16. Chất TP3: 3-Hydroxy-5-methoxystilbene ..................................................... 90

3.1.17. Hỗn hợp TP5 .................................................................................................. 90

3.1.18. Chất TP6: Vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside) ....................................... 92

3.1.19. Chất TL1: (+) Lariciresinol ........................................................................... 94

3.1.20. Chất TL3: Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside ............................................ 95

3.1.21. Chất TS1: β-Sitosterol .................................................................................... 97

3.1.22. Chất TS2: Daucosterol ................................................................................... 98

3.2. Các chất được phân lập từ Thông ba lá (Pinus kesiya) ......................................... 99

3.2.1. Chất TT11: 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid ...................................... 99

3.2.2. Chất TF6: 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside ........................ 101

3.2.3. Chất TP4: Resveratrol-3-O-β-D-glucoside. ................................................. 102

3.2.4. Chất TP7: 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl) -β-

D-glucopyranoside ..................................................................................................... 103

3.2.5. Chất TL2: Cedrusin ..................................................................................... 105

3.3. Các chất được phân lập từ Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius) ................ 105

3.3.1. Chất TT7: Totarol ........................................................................................ 105

3.3.2. Chất TT8: Totarol-19-carboxylic acid ......................................................... 106

3.3.3. Chất TT9: Inumakiol D ............................................................................... 107

3.3.4. Chất TT10: Macrophyllic acid..................................................................... 108

3.4. Hoạt tính sinh học của một số chất sạch ............................................................. 111

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................... 116

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ...................................................... 119

TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 120

iv

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT

Các phương pháp sắc ký

CC Column Chromatography Sắc ký cột thường

GFC Gel filtration chromatography Sắc ký lọc Gel

TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng

Các phương pháp phổ 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H

13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance

Spectroscopy

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân

carbon 13

COSY Correlation Spectroscopy

Phổ tương tác hai chiều 1H-1H

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisa-

tion Transfer Phổ DEPT

ESI-MS Electron Spray Ionization Mass Spec-

trometry

Phổ khối ion hóa phun mù

điện tử

HR-ESI-MS High Resolution - Electron Spray Ioniza-

tion - Mass Spectrometry

Phổ khối phân giải cao ion

hóa phun mù điện tử

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation

Phổ tương tác dị hạt nhân

qua nhiều liên kết

s: singlet d: doublet t: triplet q: quartet

m: multiplet brs: broad singlet brd: broad doublet

dd: doublet of doublets ddd: doublet of doublet of doublets

td: triplet of doublets dt: doublet of triplets

HSQC Heteronuclear Single Quantum

Coherence

Phổ tương tác dị hạt nhân

qua một liên kết

IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại

NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY

Các dòng tế bào

9-KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô họng ở

người

26-L5 Murine colon carcinoma Ung thư ruột kết ở chuột

A-431 Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người

A-549 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người

v

Bel-7402 Human hepatoma Ung thư gan ở người

DU-145 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở

người

HeLa HeLa cell line Tế bào ung thư Hela

Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Ung thư gan ở người

HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính ở

người

HT-1080 Human fibrosarcoma bào ung thư biểu mô liên kết

di căn ở người

KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô ở người

L-929 Mouse fibroblast Ung thư biểu mô liên kết sợi

ở chuột

LNCaP Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở

người

LU Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi ở người

MCF-7 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú ở người

NCI-H292 Human lung mucoepidermoid Ung thư biểu mô phổi ở

người

OCI-AML Acute Myeloid Leukemia cells Tế bào ung thư bạch cầu

myeloid cấp tính

P-388 Lymphocytic leukemia Ung thư máu lympho

(Ung thư bạch cầu)

PC-3 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt ở

người

SK-LU-1 Human Caucasian Lung adenocarcinoma Ung thư phổi ở người

SK-N-SH Human neuroblastoma cell line U nguyên bào thần kinh ở

người

SMMC-

7721 Human hepatocarcinoma

Ung thư biểu mô tế bào gan

ở người

T-47D Human ductal breast epithelial tumor Ung thư vú ở người

U-397 Human leukemic monocyte lymphoma Ung thư máu ở người

Các viết tắt khác

COX-2 Cyclooxygenase-2 Enzym cyclooxygenase-2

CTPT Công thức phân tử

EBV Epstein-Barr Virus Virus Epstein-Barr

ED50 Effective Dose Liều tác dụng tối đa trên 50%

đối tượng thử

vi

FIV Feline immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn

dịch ở động vật họ mèo

HSV Herpes simplex virus Virus Herpes simplex

HIV Human immunodeficiency virus Virus gây suy giảm miễn

dịch ở người

IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% đối

tượng thử

LD50 Lethal Dose 50 Liều gây chết 50% thú thử

MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu

MMTV Mouse mammary tumour virus Chủng virus gây ung thư vú

ở chuột

OD Optical Density Mật độ quang

ROS Reactive oxygen species Những phần tử hoạt động

chứa Oxygen

mp Melting point Điểm nóng chảy

n-BuOH n-Butanol Ac Acetoxyl

CDCl3 Chloroform deuteri (d) Bz Benzoyl

DCM Dichloromethane OMe Methoxy

DMSO Dimethylsulfoxide Ph Phenyl

EtOAc Ethyl acetate Et Ethyl

EtOH Ethanol Me Methyl

MeOH Methanol Glc Glucose

CD3OD Methanol deuteri (d4)

TMS Tetramethylsilane Xyl Xylose

C Carbon bậc 4 Rf Retardation factor

(retention factor)

dm Dung môi

vii

DANH MỤC CÁC BIỂU BẢNG

Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus ......... 8

Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus ....................... 9

Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus ... 14

Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus ................ 16

Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus ..................... 18

Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus .................. 19

Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus ............................ 33

Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài (Podocapus

neriifolius) .......................................................................................................................... 40

Bảng 3.1. Số liệu phổ của TT1 và caryolane-1β,9β-diol ................................................... 70

Bảng 3.2. Số liệu gán phổ 1HNMR và 13CNMR của TT2a và TT2b .................................. 72

Bảng 3.3. Số liệu phổ của TT3 và 15-methoxypinusolidic acid ......................................... 74

Bảng 3.4. Số liệu phổ của TT4 và lambertianic acid ......................................................... 76

Bảng 3.5. Số liệu phổ của chất TT5 và 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid

............................................................................................................................................ 78

Bảng 3.6. Số liệu phổ của TT12 so với 429 và 430............................................................ 81

Bảng 3.7. Số liệu phổ của TF7 và 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside

............................................................................................................................................ 87

Bảng 3.8. So sánh số liệu phổ của TP6 với chất 431 và vanillic acid 4-(-β-D-

glucopyranoside.................................................................................................................. 93

Bảng 3.9. So sánh số liệu phổ của TL3 với chất 218 và 432 ............................................. 97

Bảng 3.10. Số liệu phổ của TT11 và abiesadine R, abiesadine O ................................... 100

Bảng 3.11. So sánh số liệu phổ của TP7 với 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-

rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside ......................................................................... 104

Bảng 3.12. So sánh số liệu phổ 13C-NMR của TT7, TT8 và TT9 ..................................... 108

Bảng 3.13. Số liệu phổ của TT10 so với totarol-19-carboxylic acid (TT8) ..................... 111

Bảng 3.14. Kết quả thử in vitro trên các dòng tế bào SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2 của một

số chất sạch ...................................................................................................................... 112

viii

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3).. .... 3

Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá ............................... 4

Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài ............................... 4

Hình 2.1. Sơ đồ chung mô tả quá trình chiết và thu được các chiết xuất ......................... 47

Hình 2.2. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông

đà lạt ........................................................................................................................ 54

Hình 2.3. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông

đà lạt ........................................................................................................................ 55

Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông

đà lạt ........................................................................................................................ 56

Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông

đà lạt ........................................................................................................................ 57

Hình 2.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông

ba lá ......................................................................................................................... 58

Hình 2.7. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông

tre lá dài ................................................................................................................... 59

Hình 3.1. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT2a và TT2b ................................ 73

Hình 3.2. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT4 ................................................. 76

Hình 3.3. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT6 ............................... 79

Hình 3.4. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TP6 ................................................. 94

Hình 3.5. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TL1 ............................... 95

Hình 3.6. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT11 ............................................. 100

Hình 3.7. TT10 và các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT10. ............ 109

Hình 3.8. Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6,

TT10, TF1, TP2 và TL1 ........................................................................................ 113

Hình 3.9. Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau 24

giờ khi thử nghiệm với TT2, TT6, TT10, TF1, TP2 và TL1. ............................... 114

Hình 3.10. Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi

được xử lí. (A): TT2; (B): TT6 (C): TT10; (D): TF1; (E): TP2 ở các nồng độ khác

nhau ....................................................................................................................... 115

ix

PHỤ LỤC

Phụ lục 1 Các phổ của hợp chất TT1 PL1

Phụ lục 2 Các phổ của hỗn hợp TT2 PL5






Phụ lục 8 Các phổ của hợp chất TF1 PL41






Phụ lục 14 Các phổ của hợp chất TP1 PL60



Phụ lục 17 Các phổ của hỗn hợp TP5 PL69


Phụ lục 19 Các phổ của hợp chất TL1 PL80


Phụ lục 21 Các phổ của hợp chất TS1 PL94

Phụ lục 22 Các phổ của hợp chất TS2 PL97










Phụ lục 32 Các biểu đồ biểu thị kết quả thử hoạt tính chống tăng

sinh trên dòng tế bào OCI-AML của TF3 PL155

Phụ lục 33 Kết quả phân tích protein bằng Western plot của hỗn

hợp TT2 với các tế bào OCI-AML PL155

1

MỞ ĐẦU

Ngày nay, đi đôi với sự phát triển nhanh chóng về mọi mặt của xã hội loài người là

nhiều vấn đề nghiêm trọng mà cả thế giới đang phải đối mặt. Trong tám mục tiêu thiên niên

kỷ mà nhân loại cố gắng đạt được trong thế kỷ 21 (gọi tắt là MDGs từ tiếng Anh:

Millennium Development Goals), thì vấn đề có liên quan tới sức khỏe của con người là một

trong số mục tiêu được đặt lên hàng đầu. Rõ ràng, biến đổi khí hậu đang diễn ra trên phạm

vi toàn cầu cùng với sự ô nhiễm ô nhiễm môi trường ngày càng trầm trọng và vấn đề thực

phẩm bẩn đã và đang gây ra những ảnh hưởng vô cùng tiêu cực đến sức khỏe của con người

nói riêng và sự sống của toàn thể sinh vật trên trái đất nói chung. Cụ thể là, gần đây nhân

loại luôn phải đối mặt với những dịch bệnh nguy hiểm và có khả năng lan rộng thành đại

dịch ở quy mô toàn cầu. Có thể lấy một số ví dụ điển hình như HIV/AIDS, các loại ung

thư, các loại bệnh viêm nhiễm, các loại cúm virus, bệnh do virus Ebola, các biến chứng do

nhiễm virus Zika, tim mạch, đái tháo đường, vv... Việc tìm ra phương pháp hiệu quả để

điều trị các bệnh này là vấn đề vô cùng khó khăn, nó đặt ra nhiều thách thức lớn cho các

nhà khoa học. Trước thực trạng đó, một trong những con đường hữu hiệu để phát hiện ra

các chất có hoạt tính tiềm năng có thể phát triển thành thuốc mới chữa bệnh cho người, vật

nuôi và cây trồng là đi từ các hợp chất thiên nhiên. Và như thế, người ta có thể sử dụng các

hợp chất có nguồn gốc thiên nhiên một cách trực tiếp để làm thuốc, hoặc sử dụng chúng

làm chất dẫn đường để nghiên cứu tổng hợp các loại thuốc mới.

Việt Nam là nước có khí hậu và địa hình rất đa dạng, gồm có bốn miền khí hậu chủ

yếu: khí hậu phía Bắc, phía Nam, Trung và nam Trung bộ, khí hậu Biển Đông. Việt nam

với trên 3000 km bờ biển và 4/5 diện tích là đồi núi. Những đặc điểm về điều kiện tự nhiên

và khí hậu như trên đã tạo ra thảm thực vật có đa dạng sinh học cao. Theo những nghiên

cứu mới đây ở Việt Nam có hơn 11.000 loài thực vật bậc cao có mạch, 800 loài rêu, 600

loài nấm, hơn 2000 loài tảo, 537 loài vi tảo, 667 loài rong biển và 15 loài cỏ biển, trong đó

nhiều loài được dùng làm thuốc [1].

Trong thảm thực vật phong phú và đa dạng ấy, các loài cây lá kim là những cây rừng

quan trọng cả về sinh thái, kinh tế, thương mại và văn hóa. Ngoài nguồn cung cấp gỗ, tinh

dầu thông còn là nguyên liệu chính trong nhiều ngành công nghiệp (công nghiệp sơn, công

2

nghiệp chất béo, vv...), một số loài Thông còn được dùng là vị thuốc dân tộc. Thông còn là

môi trường của nhiều loài nấm nội kí sinh, Taxol® (paclitaxel) là thuốc chống ung thư được

cho là tốt nhất hiện nay được phát hiện từ loài thông đỏ ở châu Âu.

Cũng như các chi khác trong bộ Thông (Pinales), nhiều loài trong chi Pinus L.

(Pinaceae) và chi Podocarpus L'Hér. ex Pers. (Podocarpaceae) từ lâu đã gắn bó với đời

sống hằng ngày của người dân và cũng được sử dụng trong y học cổ truyền để trị nhiều loại

bệnh khác nhau. Trong khi đó, tính tới thời điểm này (2017) tuy đã có nhiều công trình

nghiên cứu nghiên cứu về mặt hóa học cũng như hoạt tính sinh học của trên một trăm loài

Pinus và khoảng tám mươi loài Podocarpus nhưng vẫn còn có nhiều loài trong hai chi này

hầu như chưa được nghiên cứu hoặc mới chỉ có những nghiên cứu bước đầu. Trong đó, loài

Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré) là một loài gần như đặc hữu của Việt Nam và chưa

được nghiên cứu về mặt hóa học; Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon) và loài

Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) trên thế giới mới chỉ có một vài nghiên

cứu nên việc nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ba loài này là rất

cần thiết, nhằm góp phần tạo cơ sở để hướng đến nghiên cứu khai thác và sử dụng sau này.

Chính vì lý do trên, mục tiêu của các nghiên cứu trong luận án này là:

1. Nghiên cứu thành phần hóa học của ba loài lá kim: Thông đà lạt (P. dalatensis),

Thông ba lá (P. kesiya) và Thông tre lá dài (P. neriifolius)

2. Thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất sạch tách ra từ các loài trên để

tìm kiếm các hoạt chất tiềm năng có thể ứng dụng vào cuộc sống.

3

Chương 1. TỔNG QUAN

1.1. Tổng quan về các loài nghiên cứu

1.1.1. Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré)

Thông đà lạt (Pinus dalatensis Ferré), tên đồng nghĩa: Pinus wallichiana A.B. Jacks.

[2] thuộc họ Thông (Pinaceae). Đây là một loài thông năm lá gần đặc hữu của Việt Nam,

cây phân bố chủ yếu ở Đà Lạt và một số vùng lân cận, ngoài ra một số ít được tìm thấy ở

Quảng Nam, Quảng Bình và biên giới Việt-Lào. Cây mọc trong rừng rậm, trên núi trung

bình, ở độ cao 1500-2000 m. Cây gỗ to, cao đến hơn 30 m và đường kính thân 0.6-0.8 m

[2]. Gỗ không bị mối mọt, được sử dụng trong xây dựng, làm đồ gỗ gia dụng và mỹ nghệ.

Đến nay, chưa có công bố nào ở Việt Nam cũng như trên thế giới về thanh phân hoa hoc

và hoat tinh sinh học của loài này.

Hình 1.1. Hình chụp cây Thông đà lạt (1), tiêu bản cành mang lá và quả (2), quả (3)

(Tiêu bản số VNMN.B000005006 bảo tàng thiên nhiên Việt Nam, VAST)

1.1.2. Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon)

Thông ba lá (Pinus kesiya Royle ex Gordon; tên đồng nghĩa: Pinus langbianensis A.

Chev., Pinus insularis var. khasyana (Griff.) Silba, Pinus yunnanensis Franch.) là một loài

lá kim thuộc họ Thông (Pinaceae). Trên thế giới, cây phân bố ở Ấn Độ, Myanmar, Thái

Lan, Lào, Việt Nam và Philippines. Ở Việt Nam, thông ba lá lần đầu được phát hiện ở cao

nguyên Langbiang, đó là loài có diện tích lớn nhất trong số các loài thông ở Việt Nam, phân

bố ở Hà Giang, Sơn La, Gia Lai, Kon Tum,... nhưng nhiều nhất (90% diện tích) là trên cao

4

nguyên Langbiang. Lá cây hình kim, thường đính ba lá kim trên một đầu cành ngắn, thường

có màu xanh ngọc, mỗi lá kim thường dài 20-25 cm. Đầu cành ngắn đính lá thường có độ

dài 1.5 cm, đính cách vòng xoắn ốc trên cành lớn [3]. Cây thường được trồng để lấy gỗ

phục vụ cho công nghiệp giấy, ngành xây dựng và mỹ nghệ. Đến nay, chỉ mới có vài công

bố về thành phần hóa học và hoạt tính của tinh dầu từ loài này. Gần đây (năm 2013 và

2014), có một vài công bố nghiên cứu bước đầu về thanh phân hoa hoc của loài này ở Trung

Quốc [4, 5].

Hình 1.2. Hình chụp quần thể cây (1) rễ (2) và lá (3) của thông ba lá


1.1.3. Thông tre lá dài dai (Podocarpus neriifolius D. Don)

Hình 1.3. Hình chụp mẫu gỗ (1), tiêu bản lá (2) của Thông tre lá dài


Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius D. Don) là một loài thực vật họ Thông tre

5

(Podocarpaceae). Ở Việt Nam, cây mọc rải rác trong rừng nguyên sinh các tỉnh Kon Tum,

Gia Lai, ĐakLak, Lâm Đồng, Khánh Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Đồng Nai, Kiên Giang,

Nghệ An, Hà Tĩnh, Yên Bái, Tuyên Quang... và mọc ở độ cao 2300 m ở Vườn quốc gia Bì

Đúp - Núi Bà thuộc tỉnh Lâm Đồng. Cây gỗ cao 20–25 m, đường kính có thể tới 50 cm,

thân thẳng, tròn. Vỏ xám nâu, mỏng, nhẵn. Cành lá mọc vòng, màu xanh non hoặc xanh

vàng. Lá mọc cách, hình mác dài, đầu nhọn dần, dài 7–15 cm, rộng 0.9–1.9 cm, đầu và đuôi

nhọn, đầu mặt trên xanh bóng, mặt dưới xanh vàng. Gân chính nổi ở giữa rõ cả 2 mặt, mép

lá cong xuống phía dưới. Cuống lá dài 0.3–0.5 cm, phía dưới có rãnh. Nón đực dạng bông

không cuống, thường 3 bông mọc chụm ở nách lá gần đầu cành, khi non hình trứng, khi già

hình trụ dài 2–5 cm. Nón cái mọc lẻ ở nách lá, chỉ có một lá noãn phát triển mang một noãn,

các lá noãn khác hợp thành đế. Nón hình trứng dài 1.2–1.6 cm, đường kính 0.8–12 cm, đế

mập to gần bằng nón, có cuống dài 0.5-1 cm. Có 2 lá bắc sớm rụng, dài 1,5 cm, rộng 1 cm.

Hạt hình trứng, dài 1,2–1.6 cm, rộng 1.1 cm, dưới có đế mập, đường kính gần bằng đường

kính hạt, quả màu tím [6].

1.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học một số loài thuộc chi Pinus

Về thành phần hóa học thì hầu hết các loài lá kim đều có chứa tinh dầu. Bên cạnh

đó, theo thống kê trên thế giới đến nay đã có trên 450 hợp chất được phân lập từ trên một

trăm loài thuộc chi Pinus, bao gồm các hợp chất carbohydrate, cyclitol, acid béo, terpenoid,

phổ biến nhất là diterpene có khung carbon rất đa dạng như: cembrane pimarane, labdane

và abietane; triterpene khung seratane và lanostane, lignan, steroid, các phenol, flavonoid

và flavonoid glycoside [7].

1.2.1. Nghiên cứu về thành phần tinh dầu từ chi Pinus

Hầu hết các loài trong chi Pinus đều có tinh dầu, có rất nhiều nghiên cứu trong vòng

40 năm trở lại đây chỉ ra rằng thành phần chính của có trong dầu thông của nhiều loài thuộc

chi Pinus có chứa chủ yếu là các hợp chất terpenoid như: sesquiterpenoid và monoterpe-

noid; trong đó thường hay gặp với hàm lượng cao là các chất α-pinene (1) và β-pinene (2),

camphene (3), α-myrcene (4), β-myrcene (5) α-terpineol (6), limonene (7) và α-terpinene

(8) [8, 9, 10, 11, 12]; các sesquiterpenoid thường thấy nhất là longifolene (9), caryo-

phyllene (10) và germacrene D (11) [10, 11]. Ngoài ra, theo một nghiên cứu gần đây vào

6

2014 về thành phần tinh dầu của loài P. nigra, người ta đã nhận thấy sự có mặt lượng lớn

các nhóm chất oxygen–diterpene và sesquiterpene [13]. Trong một công bố vào năm 2015

của Zhouqi Li và các cộng sự, ngoài α-pinene (1) còn tìm thấy thêm hàm lượng β-

caryophellen (12) tương đối cao trong tinh dầu ở sáu loài thuộc chi Pinus bản địa ở Trung

Quốc [14].

1.2.2. Các hợp chất terpenoid từ chi Pinus

Các triterpenoid được tìm thấy trong chi Pinus chủ yếu có khung seratane và

lanostane. Trong một công bố vào năm 1991, từ vỏ loài thông trắng Trung Quốc P.

armandii các nhà khoa học đã tách ra được các chất (13-22) có khung seratane [15]. Từ các

loài thông trắng miền Tây ở Bắc Mỹ là P. monticola, và loài thông Luchu P. luchuensis đã

tách được tám triterpenoid khung seratane (23-30) trong các công bố vào năm 1984, 1975

và 2001 [16, 17, 18]. Ngoài ra, các seratane triterpenoid kể trên cũng được tìm thấy từ các

loài P. massoniana, P. taiwanensis, P. monticola và P. strobus [12]. Các lanostane

triterpenoid được tìm thấy chủ yếu từ loài P. monticola và P. luchuensis. Cụ thể là, năm

1981, mười chất (31-40) đã được phân lập từ loài P. monticola [19]; năm 2000, có bốn

chất mới (41-44) được xác định từ loài P. luchuensis [20]; năm 2010, hợp chất mới

pinusyunnanol (45) được phân lập từ loài P. yunnanensis phân bố ở vùng Vân Nam, Trung

Quốc [21]. Ngoài ra trước đó, trong một công bố khác, các chất (24S)-3β-methoxy-5α-

lanost-9(11)-ene-24,25-diol (31), (32) và (5α,24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46),

(3α,5α,24S)-lanost-9(11)-ene-3,24,25-triol (47) đã được tách ra từ loài P. luchuensis [18].

Có thể nói diterpenoid là nhóm chất chính có trong chi Pinus. Cho đến nay, các

diterpenoid chủ yếu được tách ra từ các loài thuộc chi này có thể chia thành ba nhóm với

đặc trưng cấu trúc chứa các bộ khung pimarane, abietane và labdane. Các chất 48-58 thuộc

nhóm có khung pimarane thường hay gặp ở loài P. massoniana và P. armandii. Cụ thể là

sandaracopimaric acid (49), 2β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-oic acid (53), pimaric

acid (54), pimara-8(14),15-dien-18-al (55), 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56) và

ent-8,13-epoxylabd-14-en-19-oic acid (57) được tách ra từ loài P. massoniana [12, 22, 23];

từ loài P. armandii đã tách được isopimaric acid (48), isodextropimaric acid (51) cùng với

49 và 54 [12, 24]. Các chất isopimarol (50) và pimarol (52) có trong loài P. kesiya còn

7

manoyl oxide acid (58) đã được tìm thấy trong các loài P. sylvestris, P. nigra và P. pumila

[12].

Cho đến nay, trong các loài Pinus thì các chất thuộc nhóm abietane (59-118) được

tìm thấy với số lượng nhiều nhất so với các diterpenoid còn lại. Từ loài P. massoniana đã

tách được hai mươi ba chất abietane diterpenoid đó là levopimaric acid (60), palustric acid

(61), neoabietic acid (62), abietic acid (63), dehydroabietic acid (66), 7-oxodehydroabietic

acid (67), 7α- hydroxydehydroabietan-18-oic acid (68), 7β- hydroxydehydroabietan-18-

oic acid (69), abieta-6,8,11,13-tetraene-15,19-diol (70), 2β-hydroxydehydroabietic acid

(72), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 7β-hydroxydehydroabiet-15-enoic acid (76),

13β-ethoxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (90), podocarp-8(14)-ene-7,13-dion-18-oic

acid (92), 12α-hydroxydehyroabietic acid (98), abieta-7,13,15-trien-18-oic acid (99), 15-

hydroxy-12-oxoabietic acid (100), 12β-methoxyabietic acid (103), 13-hydroxypodocarpa-

8,11,13-trien-18-oic acid (113), 12-hydroxypodocarpa-8,11,13-trien-18-oic acid (114), 7β-

hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (115), 7α-hydroxy-13-oxopodocarp-8(14)-

en-15-oic acid (116) và 13-oxopodocarp-8(14)-en-18-oic acid (117) trong các công bố vào

năm 1993 và 2010 [12, 22, 23]. Trong các năm 2010 và 2011, từ loài P. yunnanensis các

nhà khoa học đã phân lập được dehydroabietane (64), 66, abieta-6,8,11,13-tetraene-15,18-

diol (71), 73, abiesadine N (75), 15-hydroxy-7-oxodehydroabietic acid (79), 15,18-

dihydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (80), 4,15-dihydroxy-18-norabieta-8,11,13-trien-7-

one (81), 18-hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), 4-hydroxy-19-norabieta-8,11,13-

trien-7-one (83), abieta-8,11,13-triene-7a ,15,18-triol (84), methyl 7α ,15-

dihydroxydehydroabietate (85), 7α,15-dihydroxypodocarp-8(14)-en-13-one (86), 12α,13β-

dihydroxy-7-oxoabiet-8(14)-en-18-oic acid (87), daturabietatriene (93), 18-norabieta-

8,11,13-triene-4,15-diol (94), abiesadine I (95), dehydroabietinol (96), 18-norabieta-

8,11,13-trien-4-ol (97), 12α -methoxyabietic acid (102), pinyunin A (104), pinyunin B

(105), 113 và 117 [25, 26]. Ngoài ra, các hợp chất abietane diterpenoid cũng đã được tìm

thấy từ các loài P. koraiensis, P. pumila, P. densiflora, P. strobus, P. taeda, P. kesiya, P.

armandii, P. sylvestris, P. luchuensis, P. sibirica và P. banksiana trong các công bố khoa

học từ năm 1970-2010 [12].

8

Bảng 1.1. Các khung cơ bản của các terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus

Khung Cấu trúc cơ bản Khung Cấu trúc cơ bản

seratane

pimarane

lanostane

abietane

labdane

Các hợp chất labdane diterpenoid (119-159) cũng thường có mặt trong thành phần

hóa học của nhiều loài Pinus. Năm 1985, từ loài Thông đen P. nigra, Duane và cộng sự đã

tách được: chất 120, labda-13(16),14-dien-8-ol (132), pinifolic acid (133), 4-

epiimbricataloic acid (134), dimethyl pinifolate (147), methyl 15-methyl-15-oxolabd-

8(17)-en-18-oate (148), 4-Epiimbricataloate (149) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)-

en-13-one (150) [27]. Năm 2002, các chất (E)-communic acid (119), (E)-15-norlabda-

8(17),12-diene-13,19-dioic acid (125), (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid

(126) và 19-hydroxy-15,16-dinorlabd-8(17)-en-13-one (150) đã được tách ra từ loài P.

luchuensis [28]. Trong các năm 1991 và 2005, từ loài P. armandii các nhà khoa học Trung

Quốc đã phân lập được tám labdane, đó là (+)-isocupressic acid (140), demethyl pinusolide

(145), 16-hydroxy-14-oxo-15-norlabd-8-en-19-oic acid (152), pinusolide (153), 16-

hydroxylabda-8(17),13-diene-15,19-dioic acid butenolide (154), lambertianic acid (155),

labda-8(17),13-dien-16,14-olid-18-oic acid (156) và 15-hydroxylabda-8(17),13-dien-

16,14-olid-18-oic acid (157) [24, 29]. Năm 2008, từ loài P. densiflora các nhà khoa học

9

Hàn Quốc đã tách ra được hai labdane là 4-epicommunic acid (120)và (E)-15-nor-14-

oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (127) [30]. Năm 2010, từ loài P. massoniana đã tách

được elliotinol (121), (E)-19-acetoxylabda-8(14),12,15-triene (122), 13-epimanool (128)

và 8,14-dioxo-8,14-secoabiet-13(15)-en-18-oic acid (138) [23]. Trong các năm 2006, 2008

và 2010, từ loài P. sylvestris các nhà khoa học đã tách được chất 133, 134, 15-acetoxylabd-

8(17)-en-18-oic acid (135), 15-ethyl 18-methyl pinifolate (136), 18-acetoxylabd-8(17)-en-

15-oic acid (137), 15-norpinifolic acid (139), (13E)-18-hydroxylabda-8(17),13-dien-15-yl

acetate (142), (13E)-18-acetoxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (143), (13E)-3β-

hydroxylabda-8(17),13-dien-15-oic acid (144) và monomethyl pinifolate (146) [12, 31, 32].

Ngoài ra, các hợp chất diterpenoid khung labdane cũng đã được tìm thấy ở các loài

P. pumila, P. sibirica, P. koraiensis, P. radiata, P. strobus và P. banksiana [12]. Hợp chất

(14S)-14,17-cyclolabda-8(17),12-dien-18-oic acid (160) là một là một chất tương đối khác

lạ với cấu trúc vòng C có bảy cạnh, đã được phân lập từ vỏ của loài P. strobus [33]. Chất

isocembrol (161) và 18-norcembra-2,7,11-trien-4-one (162) là các macrocyclic diterpene

có trong dầu-nhựa của loài P. koraiensis [12, 34].

Năm 2009, từ phần ethyl acetate của chiết xuất methanol lá loài P. densiflora đã tách

được một diterpenoid glucoside mới là 9α,13α-epoxy-8β,14β-dihydroxy-abietic acid-18-O-

β-D-glucopyranoside (163). Đặc biệt đây là lần đầu tiên hợp chất monoterpenoid glucoside

được tìm thấy trong chi này đó là bornyl 6-O-α-L-arabinofuranosyl (1→6)-β-D-

glucopyranoside (164) và bornyl 6-O-β-D-apiofuranosyl (1→6)-β-D-glucopyranoside

(165) [35].

Bảng 1.2. Cấu trúc các chất terpenoid đã được phân lập từ các loài Pinus

10

11

12

13

14

1.2.3. Các hợp chất flavonoid từ chi Pinus

Flavonoid cũng là một lớp chất tương đối phổ biến có trong các loài họ Thông nói

chung và trong chi Pinus nói riêng. Chiếm đa số trong các chất 166-212 đã được tìm thấy

từ các loài Pinus thì chủ yếu là dạng cấu trúc flavone, flavonol, flavanone, flavanonol và

một số ít chất khác có cấu trúc flavan-3-ol.

Bảng 1.3. Những khung cơ bản của các flavonoid đã được phân lập từ các loài Pinus

Khung Cấu trúc cơ bản Khung Cấu trúc cơ bản

flavone

flavanone

flavonol

flavanonol

flavan-3-ol

Vào năm 1987, từ loài Thông trắng P. morrisonicola Đài Loan, Y.S. Cheng và các

cộng sự đã phân lập được chrysin (166), tectochrysin (167), apigenin (168), pinocembrin

(169), pinostrobin (170), pinobanksin (171), pinobanksin 3-acetate (172), strobochrysin

(173), cryptochrysin (174), genkwanin (175), izalpinin (176), galangin (177), poriol (178),

3-acetoxy-5,7-dihydroxy-6-methylflavanone (179) và 3,5,7-Trihydroxy-6-methyl-fla-

vanone (180) [36].

Từ loài Thông trắng P. armandii Trung Quốc, đã phân lập được các flavonoid 166-

15

172, catechin (190) và naringenin 4′,7-dimethyl ether (203) trong các công bố vào năm

1988 và 1991 [12, 29, 37].

Năm 1996, các nhà khoa học Thụy Điển đã phân lập được chất 190, catechin 3-β-D-

glucopyranoside (191), 3′-O-methylcatechin (192), (2R,3R)-dihydroquercetin (193),

(2R,3R)-dihydroquercetin 3′-O-β-D-glucopyranoside (194), (2R,3R)-dihydroquercetin 7-

O-β-D-glucopyranoside (195), kaempferol 3-O-α-L-rhamnopyranoside (202), proanthocy-

anidin B1-B3 (208-210) và epicatechin-(4β→ 8)-epicatechin-(4β→ 8)-catechin từ loài

Thông Scotland P. sylvestris [38]. Trong số đó các chất 209-211 là biflavone và duy nhất

một triflavone là 212. Ngoài ra, cũng trong năm này các flavonoid là 6-methyltectochrysin

(196), 6-methylpinostrobin (198) và 6-methylchrysin (199) cũng đã được phân lập từ loài

P. strobus [39].

Từ loài Thông đuôi ngựa P. massoniana, đã phân lập được các chất 3′,5-dihydroxy-

4′-methoxyflavanone 7-O-𝛼-L-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (183), 3′,5-

dihydroxy-4′-methoxyflavanone 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-rhamnopyranoside

(184), 4′,5-dihydroxyflavanone 7-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside

(185), luteolin (186), luteolin 7-O- β-glucopyranoside (187), quercetin (188), taxifolin

(189) và pinocembrin (169) vào năm 2008 [40, 41]. Năm 2009 và 2010, từ phần ethyl ace-

tate của chiết xuất methanol lá loài P. densiflora đã phân lập được các flavonoid glycoside

đó là 4′,5,7,8-tetrahydroxy-3-methoxy-6-methylflavone 8-O-β-D-glucopyranoside (181),

kaempferol 3-O-β-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182), quercetin 3-O-β-D-glucopyra-

noside (197), 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol 3-O-β-

D-glucopyranoside (201) [35, 42]

Khi nghiên cứu về loài thông lá dẹt P. krempfii Việt Nam, H. Erdtman đã phân lập

được bốn flavonoid từ thân gỗ đó là: chrysin (166), strobopinin (204), cryptostrobin (205),

demethoxymatteucinol (206). Trong đó, các hợp chất C-methyl flavanoid như 205, 206 và

207 là các hợp chất có cấu trúc rất thú vị [43]. Vào năm 2013, nhóm các nhà khoa học Việt

Nam khi nghiên cứu về hóa học rễ loài P. krempfii đã phân lập và xác định cấu trúc được

sáu flavononoid đó là tectochrysin (167), pinostrobin (170), pinobanksin (171), galangin

16

(177), 205 và 206. Sàng lọc về hoạt tính sinh học bước đầu cho thấy các chất 171, 177, 206

có hoạt tính tương đối tốt với các dòng tế bào KB, Hep-G2, LU, MCF-7 [44].

Bảng 1.4. Cấu trúc các chất flavonoid đã được phân lập từ một số loài Pinus

17

1.2.4. Các hợp chất lignan từ chi Pinus

Các hợp chất lignan cũng thường được tách ra từ các loài Pinus. Trong đó có, hai

benzodioxane là massonianoside E (212) được phân lập từ loài P. massoniana [12] và

cupressoside A (213) được phân lập từ loài P. densiflora [42]. Mười một benzofuran

neolignan (214-224) đã được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana, P. koraiensis

và P. densiflora [12, 45]. Ba lignanolide chứa vòng γ-lactone được xem là các

dibenzylbutyrolactone (225-227) đã được phân lập từ các loài P. armandii, P. massoniana

18

và P. koraiensis [12]. Bảy tetrahydrofuran (228-234) đã được phân lập từ các loài P.

massoniana và P. strobus [12, 39]. Tám oligomeric lignan (235-237) và (239-243) đã được

phân lập từ các loài P. massoniana, P. yunnanensis, P. koraiensis và P. sylvestris [12]. Một

diepoxylignan là pinoresinol (238); ba arylnaphthalene (244-246) và một

dibenzocyclooctene là schizandrin (247) được phân lập từ các loài P. armandii, P.

massoniana, P. koraiensis và P. roxburghii [12].

Bảng 1.5. Cấu trúc các chất lignan đã được phân lập từ một số loài Pinus

19

1.2.5. Các hợp chất khác từ chi Pinus

Có hai mươi bảy dẫn xuất của phenol và anisole (249-285) được phân lập và xác

định cấu trúc từ các loài thuộc chi Pinus như P. massoniana, P. strobus, P. taeda, P.

armandii, P. sylvestris, P. densiflora, P. koraiensis và P. kesiya. Ngoài ra còn có một số

loại chất khác như coumarin (286), các acid béo (287-291), các steroid (292-293) và (-)

shikimic acid (294) [12, 5, 45].

Bảng 1.6. Cấu trúc một số chất khác đã được phân lập từ một số loài Pinus

20

1.3. Một số nghiên cứu về thành phần hóa học của loài Thông ba lá

Năm 2013, từ quả của loài Thông ba lá, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập

được bốn hợp chất lignan đó là cedrusin (214), matairesinol (225), pinoresinol (238) và

dihydrodehydrodiconiferyl alcohol (248), cùng với một flavonoid là 4′,5,7-

trihydroxyflavanonol-3′-O-β-D-glucopyranoside (207) và một phenol là 3,4-

dihydroxybenzoic acid (271) [4]. Tiếp sau đó. vào năm 2014, cũng từ quả của loài này đã

tách thêm được ba diterpenoid là 15-hydroxydehydroabietic acid (73), imbricatolic acid

(158), junicedric acid (159) cùng với hai sterol là 292 và 293 [5].

1.4. Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chất phân lập từ các loài thuộc

chi Pinus

21

Diterpenoid là nhóm chất chủ yếu có trong các loài thuộc chi Thông (Pinus), tiếp

đến là các hợp chất flavonoid, lignan và phenol cũng tương đối phổ biến. Trong chi này,

các thành phần dầu dễ bay hơi và các phần rất phân cực như dịch chiết cồn, dịch nước chứa

nhiều polyphenol và polysaccharide thể hiện nhiều hoạt tính mạnh mẽ nhất như chống oxi

hóa, kháng viêm, kháng nấm, kháng khuẩn, chống ung thư, kháng HIV, vv… nhiều chất

sạch đã được sàng lọc hoạt tính và một số đã cho thấy được chúng là những hoạt chất tiềm

năng. Những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính có thể mở ra cơ hội sử dụng các thành phần

có hoạt tính từ các loài thuộc chi này để làm thuốc trị bệnh trên người, động vật và cả thực

vật. Sau đây là một số thống kê đáng chú ý.

1.4.1. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau

Dịch chiết H2O từ lá của loài P. massoniana cho thấy khả năng làm tăng đáng kể

ngưỡng chịu đau và giảm số lượng chuột bị cơn đau quằng quại ở mô hình gây phù tai chuột

vào năm 1999 [12]. Khi cho chuột thử nghiệm uống hoặc tiêm qua màng bụng thì các nhà

khoa học thấy rằng tinh dầu của loài P. pumila có khả năng ức chế hệ thống thần kinh trung

ương và liều gây chết 50% đối tượng thử LD50 = 0,577 ± 0,056 mL/kg [12]. Chiết xuất H2O

từ lá của loài P. armandii cũng biểu hiện tỉ lệ ức chế 50.8% tại liều lượng thử 100m g/kg ở

mô hình gây phù nề cấp tính cho tai chuột bằng dầu [12].

Vào năm 2007, ở phép thử nghiệm in vivo trên mô hình gây quặn đau bằng acetic

acid, mô hình gây đau bằng formalin và mô hình gây đau bằng đĩa nóng tại liều lượng thử

tại liều lượng thử 100 mg/kg và 200 mg/kg; kết quả là chiết xuất ethanol từ phấn hoa loài

P. densiflora đã tạo ra ức chế đáng kể (thể hiện qua thông số tỉ lệ giảm các cơn đau) ở cả

ba mô hình trên khi so sánh với chất đối chiếu là aminopyrine. Thêm vào đó, khả năng

kháng viêm của chiết xuất ethanol này cũng được thể hiện qua những thử nghiệm ở chuột

trên các mô hình gây phù nề chân bằng carrageenan, bằng formalin và gây phù nề tai bằng

arachidonic acid so sánh với chất đối chiếu là indomethacin [46].

Năm 2012, khi nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm và giảm đau của các chất có

trong loài P. roxburghii, các nhà khoa học Ấn Độ đã thấy rằng chiết xuất ethanol phần lá

của loài này thể hiện hoạt tính ức chế đáng kể phù nề chân chuột trên mô hình gây phù bằng

carrageenan, tại liều lượng thử 100 mg/kg, 300 mg/kg và 500 mg/kg trọng lượng chuột

22

được thử nghiệm khi so sánh với tác nhân đối chiếu là indomethacin; hoạt tính kháng viêm

của chiết xuất ethanol còn được thể hiện ở khả năng ức chế các u hạt cấy dưới da chuột (mô

hình “cotton pellet granuloma”) khi so sánh với tác nhân đối chiếu là diclofenac sodium.

Về hoạt tính giảm đau, cao chiết này cũng thể hiện được hiệu quả đáng kể qua hai mô hình

thử nghiệm là mô hình gây đau bằng cách tiêm acetic acid (Acetic Acid Induced Writhing

Test) và mô hình giảm đau trung ương theo phương pháp nhúng đuôi chuột (Tail Immersion

Test) [47]. Cũng trong năm này, Ipek Suntar và cộng sự phát hiện khả năng chống viêm

của tinh dầu một số loài thuộc chi này như P. brutia Ten., P. halepensis Mill., P. nigra

Arn., P. pinea L. và P. sylvestris L. [48].

Các diterpenoid pinyunin A (104), pinyunin B (105) và hợp chất lignan mới là 2-

[2,3-dihydroxy-5-(3-hydroxypropyl)phenyl]-1-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)propane-

1,3-diol (237) thể hiện hoạt tính kháng viêm thông qua khả năng ức chế COX-2 với tỉ lệ ức

chế là 84.83, 83.71 và 88.25% tương ứng trong các phép thử nghiệm in vitro [25, 49]. Các

flavonol kaempferol 3-O-𝛽-D-(6-O-acetylgalactopyranoside) (182) và 6-methyl-

tectochrysin (196) có hoạt tính ức chế đáng kể NO với nồng độ ức chế 50% đối tượng thử

IC50 lần lượt là 26,8 và 27,1 μg/mL, và còn ức chế ở mức độ vừa phải prostaglandin E2

(PGE2) khi IC50 là 56,2 và 24,8 μg/mL tương ứng [12].

1.4.2. Hoạt tính ức chế các khối u và kháng ung thư

Hoạt tính này được thể hiện nhiều ở phần cao chiết và tinh dầu, một số chất sạch

được tách ra cũng thể hiện được khả năng kháng ung thư đáng quan tâm. Từ những năm

1987, các nhà khoa học Nhật Bản đã thấy rằng, chiết xuất nước nóng từ quả của loài P.

parviflora (PCE) có tác dụng ức chế các khối u gây bụng báng (u cổ trướng-ascites tumor

cells) trên chuột. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng các polysaccharide có tính acid trong chiết

xuất từ dịch chiết dung dịch NaOH có hoạt tính mạnh nhất [50]. Sau đó, vào năm 1992,

Nagasawa và các cộng sự cũng đã công bố rằng, khi các con chuột đang cho con bú được

tiêm tĩnh mạch hoặc uống PCE cùng với dehydrogenation polymer của ferulic acid (DHP-

FA) thì thấy có tác dụng ngăn chặn đáng kể sự phát triển của chủng virus gây ung thư vú

(mouse mammary tumour virus-MMTV) [51].

Năm 2006, các chiết xuất từ vỏ của loài P. maritima đã chứng tỏ khả năng ngăn ngừa

23

ung thư da trên chuột khi được thử nghiệm trên hai mô hình gây ung thư da bằng bức xạ

cực tím (UVR) và mô hình UVR kết hợp với 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA)

[52]; chiết xuất từ vỏ của loài này cũng được chứng minh có nhiều hoạt tính tốt như tiêu

diệt các tế bào ung thư, chống oxi hóa, bảo vệ tim mạch, trị tiểu đường,... và đã được đưa

ra thị trường với tên thương phẩm là Pycnogenol®. Trong một công bố vào năm 2007, các

nhà khoa học Trung Quốc đã chỉ ra rằng, các procyanidin có trong các chiết xuất từ vỏ của

loài P. koraiensis thể hiện tác dụng ức chế sự tăng sinh trưởng cũng như sự biểu hiện của

kháng nguyên liên quan đến sự tăng sinh tế bào (proliferating cell nuclear antigen-PCNA)

và cả yếu tố hoại tử u α (TNF-α) ở ung thư cổ tử cung trên chuột [53]. Năm 2009, các nhà

khoa học đã thấy rằng, các chiết xuất từ vỏ của loài P. pinea và P. sylvestris thể hiện hoạt

tính gây độc tế bào mạnh mẽ kháng lại các dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC-3, DU-

145, LNCaP) và ung thư tuyến vú (MCF-7) [54]. Vào năm 2010, một nghiên cứu khoa học

đã chỉ ra rằng, dịch chiết từ vỏ của loài P. massoniana không chỉ có tác dụng kích hoạt các

caspase để cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên (apoptosis) ở các tế bào ung thư

gan ở người (Hep-G2) trong thử nghiệm in vitro mà còn ức chế sự tăng trưởng của các khối

u được cấy ghép trên cơ thể chuột qua các phép thử in vivo [55]. Sau đó, vào năm 2012, khi

nghiên cứu về hoạt tính kháng ung thư của tinh dầu từ lá của loài P. densiflora, các nhà

khoa học Hàn Quốc đã thấy rằng tinh dầu này cũng có khả năng cảm ứng và kích hoạt quá

trình chết tự nhiên của các tế bào ung thư miệng ở người (YD-8) qua việc kích hoạt được

các caspase và các phần tử hoạt động chứa oxygen (reactive oxygen species-ROS) [56].

Tiếp theo, năm 2013, một công bố khoa học đã cho thấy rằng polysaccharide từ các chiết

xuất ethanol của quả khô loài P. koraiensis cho hoạt tính ức chế tế bào ung thư gan ở người

(Hep-G2), trong đó hai chiết xuất sử dụng dịch chiết là dung dịch ethanol 30% và 80% có

hoạt tính mạnh nhất [57]. Mới đây, năm 2016, W. Natthida và các cộng sự đã thấy rằng

chiết xuất ethanol-H2O (50:50) của cành nhỏ loài thông ba lá P. kesiya khi kết hợp với

melphalan theo một tỉ lệ thích hợp cho thấy khả năng gây độc tế bào tốt trên hai dòng tế

bào ung thư máu (U-937) và ung thư gan (Hep-G2), quan trọng hơn, sự kết hợp này cũng

làm giảm độc tính của melphalan xuống khoảng 4-9 lần [58].

24

Một số chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có những hoạt tính khá thú vị.

Cụ thể là, 15-ethyl-18-methyl pinifolate (136) có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào ung

thư ở người như Hela, u nguyên bào thần kinh (SK-N-SH) và ung thư gan (Bel-7402) tại

các phép thử in vitro [31]. Một nghiên cứu vào năm 2001 về hợp chất triterpenoid là (5α,

24S)-3-oxolanost-9(11)-ene-24,25-diol (46) có hoạt tính ức chế nhẹ khả năng xúc tác của

enzyme Topoisomerase II với giá trị IC50 là 186 μM [18]. Các chất isopimaric acid (48) và

dehydroabietic acid (66) có ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ các khối u da ở chuột trên mô hình

gây ung thư bằng DMBA và TPA (12-O-tetradecanoylphorbol-13- acetate) [59]. Các hợp

chất 3β-hydroxypimara-8(14),15-dien-18-ol (56), elliotinol (121) và (E)-19-acetoxylabda-

8(14),12,15-triene (122) cho thấy khả năng kháng mạnh mẽ lại các tế bào ung thư biểu mô

(A-431) và ung thư phổi (A549) với giá trị IC50 tương ứng là 1.60, 0.38, 4.74 μM (với dòng

tế bào A-431) và 16.44, 2.00, 19.62 μM (với dòng tế bào A-549); người ta giải thích rằng

122 thể hiện hoạt tính mạnh mẽ nhất có thể là do ảnh hưởng của khung labdane và nhóm

ester -OAc tại vị trí C-19 [23]. Chất 15-norpinifolic acid (139) thể hiện hoạt tính kháng ung

thư trên hai dòng tế bào ung thư ác tính ở người-Hela và dòng tế bào ung thư biểu mô liên

kết sợi ở chuột (L-929); hoạt tính của chất này có được có thể là do đặc thù cấu trúc khung

labdane kết hợp với vị trí C-15 kém phân cực của phân tử này [32]. Gần đây, vào năm 2014,

các nhà khoa học đã thấy rằng, α-terpineol (6)-một monoterpenoid có trong tinh dầu nhiều

loài Pinus, có thể kháng lại hai dòng tế bào ung thư Hela và ung thư vú (T-47D). Ngoài ra,

6 còn có khả năng ức chế dòng tế bào ung thư vú (MCF-7) theo cơ chế kích hoạt lại quá

trình chết tự nhiên (apoptosis) của dòng tế bào này bằng cách làm suy giảm số lượng gene

Bcl-2 (một loại gene ức chế chết tế bào theo chương trình) và tăng số lượng biểu hiện của

các gene Bax [60].

1.4.3. Hoạt tính kháng khuẩn và kháng nấm

Từ những năm 1994, khả năng kháng vi sinh vật của lá các loài Pinus đã được kiểm

chứng qua các thử nghiệm; người ta thấy rằng chúng có hiệu quả trong việc chống lại sự

phát triển theo quá trình amôn hóa của các vi sinh vật gây thối trong thực phẩm [12]. Trong

những năm về sau đã có thêm nhiều nghiên cứu về hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng

nấm từ các dịch chiết của ở loài Pinus. Năm 2006, các nhà khoa học đã thấy rằng dịch chiết

25

nước và alcohol từ lá, thân, vỏ và quả khô của loài P. roxburghii có khả năng ức chế sự

tăng trưởng của các vi sinh vật gây bệnh đó là Agrobacterium tumefaciens (gây bệnh khối

u cho thực vật), Escherichia coli (gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella arizonae

(gây bệnh đường ruột trên người), Salmonella Typhi (gây bệnh đường ruột trên người) và

Staphylococcus aureus (có khả năng gây cách bệnh ngoài da, gây viêm, mủ trên người)

[12]. Tinh dầu của các loài P. densiflora và P. thungergii thể hiện khả năng kháng khuẩn

đối với các dòng Klebsiella pneumoniae (gây ra các bội nhiễm ở đường hô hấp), Shigella

flexneri (bệnh lỵ trực khuẩn), Proteus vulgaris (có thể gây ra các viêm nhiễm) với nồng độ

kiềm khuẩn tối thiểu (MIC) đều nhỏ hơn 0.4 mg/mL [61]. Năm 2012, các nhà khoa học Mỹ

và Canada đã nghiên cứu ra rằng, một peptide giàu hàm lượng cysteine tên là PmAMP1

được phân lập từ loài P. monticola có khả năng kháng lại các chủng nấm gây bệnh trên loài

cải dầu (Brassica napus) [62]. Một công bố khoa học vào năm 2013 cho thấy dầu từ nhựa

loài thông Scotland P. slyvestris có khả năng kháng lại mười ba chủng vi khuẩn gây bệnh

trên cây trồng với liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 300 µg/mL; và kháng lại sáu

chủng nấm gây bệnh trên thực vật liều lượng tác dụng hiệu quả cao nhất là 200 µg/mL [63].

Trong một nghiên cứu khác, phần tinh dầu và dịch chiết chloroform của loài P. roxburghii

có khả năng ức chế các dòng vi khuẩn thử nghiệm Escherichia coli, Pseudomonas

aeruginosa (trực khuẩn mủ xanh), Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Streptococcus

pyogenes (khuẩn liên cầu) [64]. Năm 2014, các nhà khoa học Brazil đã tìm thấy khả năng

đầy hứa hẹn về việc sử dụng nhựa-dầu của loài P. elliottii làm thuốc chữa bệnh héo rũ trên

hoa màu do vi nấm Sclerotium rolfsii gây ra khi giá trị MIC lên loài này là 1.95 μg/mL.

Cũng trong nghiên cứu này, nhựa-dầu của loài P. tropicalis thể hiện hoạt tính tốt kháng lại

dòng nấm Colletotrichum gloeosporioides (gây bệnh thán thư trên cây trồng) và Fusarium

solani (gây bệnh vàng lá, thối rễ) với giá trị MIC tương ứng là 31.25 μg/mL và 62.5 μg/mL,

điều này cũng đã mở ra hy vọng cho việc sử dụng nhựa-dầu loài P. tropicalis làm thuốc

sinh học điều trị các bệnh trên cây trồng do một số loài vi nấm gây ra [65]. Gần đây, từ hai

loài P. brutia và P. pinea ở vùng Địa Trung Hải, người ta nhận thấy tinh dầu của chúng

không những có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm mà còn có khả năng diệt trừ sâu bọ rất

tốt. Phát hiện này mở đường cho khả năng sử dụng làm tác nhân bảo vệ thực vật sinh học

26

thân thiện với môi trường [9]. Bên cạnh đó, tinh dầu của một số loài P. halepensis Mill., P.

densiflora, P. thunbergii, P. rigida lại cho thấy khả năng kháng vi sinh vật rất tốt [66, 67].

Nhiều chất sạch được tách ra từ các loài Pinus cũng có hoạt tính kháng khuẩn và

kháng nấm hiệu quả. Các chất diterpenoid abieta-8,11,13-trien-7-ol (65), dehydroabietic

acid (66), 7-oxodehydroabietic acid (67), 15-hydroxydehydroabietic acid (73), 18-

hydroxyabieta-8,11,13-trien-7-one (82), dehydroabietinol (96), 18-norabieta-8,11,13-trien-

4-ol (97), (E)-communic acid (119) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-18-oic acid

(127) đều có khả năng ngăn ngừa mụn khi chúng có hoạt tính ức chế lại chủng vi khuẩn

Propionibacterium acnes gây ra mụn ở người [12, 30]. Các nhà khoa học tại đại học London

cho rằng isopimaric acid (48) tách từ loài P. nigra có tác dụng kháng lại các chủng đa kháng

thuốc (EMRSA) ở loài Staphylococcus aureus [68]. Ngoài ra, đã có những nghiên cứu chỉ

ra rằng, hoạt tính kháng khuẩn ở các diterpenoid khung pimarane có được là do nhóm –

COOH ở vị trí C-19 và hoạt tính này sẽ tăng thêm hơn nữa khi nhóm carboxyl được thay

thế bằng các nhóm chứa oxymethylene (–CH2OR) [69]. Một số hợp chất phenolic như

pinobanksin (171), 6-methyltectochrysin (196), (E)-pinosylvin monomethyl ether (249) và

pinosylvin (252) có thể kháng lại nấm Cladosporium herbarum (gây bệnh thối rễ ở cây

trồng). Ngoài ra, chất 249 và dihydropinosylvin monomethyl ether (257) còn có tác dụng

ức chế năm chủng loại nấm gây thối rễ khác và còn có khả năng hoạt hóa enzyme lactase

[12].

1.4.4. Hoạt tính chống oxi hóa

Có nhiều nghiên cứu bước đầu khẳng định các chiết xuất của nhiều loài Pinus thể

hiện hoạt tính chống oxi hóa tốt [12]. Sau đó, cũng có nhiều nghiên cứu về hoạt tính chống

oxi hóa của các loài từ chi này. Các polyphenolic từ chiết xuất của hạt loài P. koraiensis

thể hiện tính chống oxi hóa tốt qua các phép thử DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl),

HO. và O2. với giá trị nồng độ 50% tác dụng tối đa EC50 lần lượt là 0,023 ± 0,004 mg/mL,

0,391 ± 0.055 mg/mL và 4,37 ± 0.19 mg/mL tương ứng [70]. Năm 2011, Kim Mihyang và

các cộng sự, bằng phương pháp gốc tự do DPPH , đã thấy rằng dịch chiết nước nóng của

loài P. densiflora thể hiện hoạt tính chống oxi hóa mạnh mẽ với IC50 = 0,27 mg/mL tương

đương với vitamin C (IC50 = 0,26 mg/mL). Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, dịch chiết này

27

cũng có tác dụng ngăn chặn mạnh mẽ lên các LOPs (Lipid Oxidation Products – các sản

phẩm oxi hóa lipid bằng gốc tự do peroxide hay superoxide gây tổn thương tế bào) trong

gan và hồng cầu của chuột [71]. Chiết xuất alcohol của loài P. roxburghii cũng được chứng

minh có hoạt tính chống oxi hóa tốt qua các thử nghiệm theo phương pháp TEAC (xác định

hoạt tính chống oxi hóa khi so sánh với khả năng chống oxi hóa của Trolox) [72]. Năm

2016, nghiên cứu về chiết xuất methanol của nhựa loài P. nigra đã hứa hẹn rằng chúng sẽ

sử dụng như là một chất chống oxi hóa tự nhiên khi nó thể hiện hoạt tính chống oxi hóa

tương đối tốt trên các phép thử nghiệm DPPH, tạo phức chelate với Fe2+, TEAC, dọn

hydrogen peroxide (H2O2) và dọn gốc tự do peroxide (O2.–

) [73].

Các chất như 6-methylkaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (200) và kaempferol 3-

O-β-D-glucopyranoside (201) có khả năng “quét dọn” các gốc NO3– rất tốt với các giá trị

IC50 tương ứng là 3,86 ± 0,41 μM và 4,02 ± 0,18 μM trong khi giá trị IC50 của chất so sánh

L-penicillamine là 3,04 ± 0,74 μM [35].

1.4.5. Hoạt tính kháng virus và một số hoạt tính khác

Các chất isopimaric acid (48), sandaracopimaric acid (49) neoabietic acid (62),

dehydroabietic acid (66) và (E)-15-nor-14-oxolabda-8(17),12-dien-19-oic acid (126) có

ảnh hưởng ức chế mạnh mẽ chủng virus có thể gây ung thư máu, ung thư vòm-mũi họng

Epstein-Barr (EBV) [28, 59]. Các thử nghiệm dược lý cũng cho thấy rằng abietic acid (63)

có tác dụng chống co thắt [12]. Các phức lignin-carbohydrate (Lignin – carbohydrate

complexes: LCC) có trong quả khô và hạt của nhiều loài Pinus như P. parviflora, P.

densiflora, P. thunbergii, P. elliottii, P. taeda, P. caribaea, P. sylvestris và P. armadii được

cho là có khả năng ức chế sự phát triển của của dòng virus nguy hiểm trên người HSV

(Herpes Simplex Virus), đây là loại virus gây mụn mủ, lở loét ở da, niêm mạc phần trên

của cơ thể như mắt, mũi, miệng và bộ phận sinh dục [74].

Các hợp chất polysaccharide có tính acid từ loài P. parviflora được cho là có khả

năng kháng lại các virus cúm theo cách ức chế, “đầu độc” quá trình tổng hợp protein và

enzyme quan trọng trong quá trình tự nhân đôi của DNA (enzyme RNA-dependent RNA

polymerase) [75]. Năm 1998, Masatoshi Nakano và các cộng sự đã một nghiên cứu cho

thấy rằng chiết xuất kiềm từ vỏ hạt loài P. koraiensis có khả năng ức chế virus gây suy

28

giảm miễn dịch mắc phải ở người (HIV) và ở động vật họ mèo (FIV) qua các phép thử in

vivo [76]. Những năm sau đó, cũng có những công bố khoa học cho thấy khả năng kháng

HIV của dịch chiết từ quả khô các loài P.nigra, P. parvifloria và P. elliottii. Đặc biệt là vào

năm 2012, các nhà khoa học cũng nhận thấy rằng chiết xuất từ quả khô của loài P.

yunnanensis được xem như là nhóm ức chế men phiên mã ngược (reverse transcriptase

inhibitors= RTI) trong điều trị HIV bởi vì nó có khả năng ức chế mạnh các chủng virus

trong phòng thí nghiệm HIV-1IIIB, HIV-1RF, HIV-1A17, HIV-1AO18 và HIV-2ROD. Tất cả các

nghiên cứu về hoạt tính kháng HIV được nêu ở trên đã mở ra hy vọng lớn về việc sử dụng

các chiết xuất từ quả khô của các loài Pinus như là một tác nhân để điều trị HIV trong tương

lai [77].

Năm 2011, nghiên cứu chiết xuất alcohol của loài P. roxburghii cho thấy hoạt tính

chống rối loạn lipid trong máu (antidyslipidemic) khi làm giảm đáng kể triglyceride huyết

tương (TG), cholesterol tổng (TC) và glicerol (Gly) trên những chú chuột Hamster được

thử nghiệm. Trong một công bố vào năm 2012, chiết xuất dầu từ gỗ của loài này cũng cho

thấy hoạt tính bảo vệ gan qua các phép thử in vivo trên chuột bị gây tổn thương gan bằng

chloroform và ethanol. Hơn nữa, dịch chiết ethanol từ loài này được đánh giá là có tác dụng

trị hen, co thắt phế quản trên các phép thử in vitro và cả in vivo. Tới năm 2015, các nhà

khoa học Ấn Độ đã nhận thấy rằng, dịch chiết ethanol cũng như hợp chất flavonoid là

quercetin (188) được tách ra từ vỏ của loài P. Roxburghii có khả năng ức chế enzyme α-

amylase đã mở ra hi vọng sử dụng chúng trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đường [78,

79]. Ngoài ra, tinh dầu nhiều loài thông trong chi Pinus còn có tác dụng tiêu diệt ấu trùng

của loài muỗi vằn hổ Aedes albopictus – một loài sinh vật trung gian gây nhiều bệnh nguy

hiểm, đặc biệt là sốt xuất huyết [11]. Gần đây nhất, vào năm 2016, khi nghiên cứu tinh dầu

của loài thông ba lá P. kesiya ở Ấn Độ, các nhà khoa học đã nhận thấy rằng nó có hoạt tính

chống lại các loài ấu trùng muỗi gây các bệnh sốt rét, sốt xuất huyết và giun chỉ bạch huyết

[80].

1.5. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học một số loài thuộc chi

Podocarpus.

29

Chi Thông tre (Podocarpus) là một chi lớn của họ Kim giao (Podocarpaceae), có

khoảng 105 loài, phân bố chủ yếu ở bắc bán cầu [81]. Có nhiều loài trong chi này đã được

quan tâm nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Có thể liệt kê ra một số

công bố đáng chú ý sau đây.

Trong công bố vào năm 1976, từ nhiều loài Podocarpus khác nhau được thu thập từ

các đại lục Á, Âu, Phi ; New Zealand và Brazil; Robert B. Bates và các cộng sự đã phân

lập và chứng minh được cấu trúc các hợp chất norditerpene dilactone như inumakilactone

A (295), nagilactone C (296), podolactone A (297), nagilactone A (298) và sellowin B

(299) dựa trên một số biến đổi hóa học và các phương pháp phổ, đặc biệt là X-Ray đơn tinh

thể [82].

Năm 1977, quả và vỏ rễ của loài P. nagi, Yuji Hayashi và các cộng sự đã phân lập

và xác định được cấu trúc của một số norditerpene dilactone đó là 15-hydroxy-nagilactone

D (300), 3β-hydroxy-nagilactone A (301), 1β,2β-dihydroxy-nagilactone D (302), 15-

methoxycarbonyl-nagilactone D (303), 1-deoxy-2α-hydroxy-nagilactone A (304), 16-

hydroxy-podolide (305), 2,3-dihydro-16-hydroxy-podolide (306) và 2β,3β -epoxy-

podolide (307) [83, 84, 85]. Năm 1990, từ vỏ rễ loài này, đã tách được ba hợp chất

norditerpene dilactone đó là 2,3-dehydro-16-hydroxy-nagilactone F (308), nagilactone I

(309) và l6-hydroxy-nagilactone E (310) [86]. Trong năm 1991, khi nghiên cứu thành phần

hóa học của lá và vỏ rễ loài P. nagi, Isao Kubo và cộng sự đã phân lập được một số

norditerpene dilactone mới đó là 2α-hydroxy-nagilactone F (311), 3-deoxy-2α-

hydroxynagilactone E (312), 3-epinagilactone C (313) và nagilactone J (314). Thử nghiệm

ban đầu về hoạt tính đã cho thấy chất 311 có khả năng kháng lại chủng nấm Saccharomyces

cerecisiae-có thể gây ra một số bệnh về đường ruột trên người và động vật [87, 88, 89]. Sau

đó, vào năm 1993, ba norditerpene dilactone mới đã được phân lập từ vỏ rễ của loài này đó

là 1-deoxynagilactone A (315), 1-deoxy-2,3-dehydronagilactone A (316) và 2,3-

dehydronagilactone A (317) [90]. Năm 1995, đã có ba hợp chất diterpene dilactone

glycoside của nagilactone C-E (318-320) được phân lập từ dịch nước vỏ hạt loài P. nagi

[91]. Trong một công bố vào năm 1996, H. Haraguchi và các cộng sự đã chỉ ra rằng totarol

(321) được tách ra từ loài P. nagi có hoạt tính chống oxi hóa tốt, nó không những ức chế

30

quá trình peroxide hóa lipid mà còn thể hiện khả năng bảo vệ tế bào hồng cầu kháng lại sự

huyết tán (hemolysis). Hơn nữa 321 còn được chứng minh có khả năng bảo vệ các hệ thống

sinh học bằng cách chống lại quá trình ”stress oxi hóa” trong cơ thể [92]. Năm 1999, đã có

hai diterpene dilactone glycoside mới với phần đường là một trisaccharide đã được phân

lập từ loài này đó là 1-deoxy-nagilactone A-2α-O-β-D-glucopyranosyl-(1–3)-β-D-

glucopyranosyl-(1–6) -β-D-glucopyranoside (322) và 1-deoxy-nagilactone A-2α-O-β-D-

glucopyranosyl-(1–6)-β-D-glucopyranosyl-(1–3)-β-D-glucopyranoside (323) cùng với

năm chất diterpene dilactone glycoside đã biết gồm (318-320) và (324-325) [93]. Thú vị là

vào năm 2012, hai hợp chất cyclopeptide đó là nagitide A (326) và nagitide B (327) đã

được phân lập từ chiết xuất CH2Cl2 và EtOAc của vỏ rễ loài P. nagi bởi Yang Ye và các

cộng sự [94]. Gần đây nhất, năm 2017, từ chiết xuất EtOAc của lá loài P. nagi, Yegao Chen

cùng các cộng sự đã phân lập và xác định cấu trúc được bốn chất là nagiol A (328), sugiol

(329), 2,3-dihydroxyferruginol (330) và 298, trong đó 328 là một abietane mono-

norditerpenoid mới [95].

Năm 1979, từ vỏ thân loài P. milanjianus và P. sellowii các nhà khoa học Mỹ và

Brazil đã phân lập được nagilactone F (331) và nagilactone G (332). Thử nghiệm hoạt tính

gây độc tế bào cho thấy chất 332 có khả năng kháng lại tế bào ung thư biểu mô họng người

(9-KB) với ED50 = 10-2 µg/mL [96]. Một năm sau đó, từ loài P. milanjianus nhóm nghiên

cứu này cũng đã tách và xác định thêm được hai chất có hoạt tính kháng lại tế bào 9-KB là

milanjilactone A (333) và milanjilactone B (334) với giá trị ED50 tương ứng là 4 µg/mL và

10-1 µg/mL [97]. Tới năm 1984, podolactone C (335) cũng đã được phân lập và chứng minh

lại cấu trúc đúng hơn của nó với cấu trúc 2,3-β-epoxide cùng với đặc trưng lập thể tại vị trí

C-4, C-6 và C-15. Bước đầu sàng lọc hoạt tính cho thấy 335 có mức độ kháng trung bình

đối với tế bào ung thư bạch cầu P-388 [98]. Trong một công bố năm 2005, từ vỏ rễ loài đã

tách và xác định được chín hợp chất đó là β-sitosterol (292), daucosterol (293), 321, 331,

332, 335, nagilactone D (336), 19-hydroxytotarol (337) và stigmasterol (338) [99].

Năm 1999, Roy Stahlhut và các cộng sự khi sàng lọc về hoạt tính sinh học của loài

P. gracilior đã nhận thấy rằng có sự tồn tại một lượng nhỏ hoạt chất kháng ung thư rất tốt

là taxol (339) trong cuống lá và lá của loài này. Đây cũng là lần đầu tiên taxol được chứng

31

minh là có ở một loài thực vật không thuộc họ Thông đỏ (Taxaceae) [100]. Trong một công

bố vào năm 2012, từ lá của loài này, Alessandra Braca và các cộng sự đã phân lập được ba

terpenoid mới đó là 2α,16-dihydroxy-4β-carboxy-O-β-D-glucopyranosyl-19-nor-totarol

(340), nagilactone K (341) và 15-hydroxy phaseic acid (342) [101].

Năm 2003 từ loài Tùng La hán lá dài P. macrophyllus đã phân lập được hai hợp chất

có cấu trúc lập thể đối nhau tại vị trí chứa nguyên tử lưu huỳnh đó là SR-podolactone D

(343) và SS-podolactone D (344), trong đó 343 là một chất mới [102]. Năm 2004, từ lá loài

này, nhóm tác giả trên đã phân lập được mười chất, trong đó có 335, 343, 344, hallactone

B (345) cùng với sáu norditerpene dilactone mới có chứa lưu huỳnh là các

rakanmakilactone A–F (346-351), đặc biệt hợp chất rakanmakilactone E (350) có chứa

nguyên tử chlorine trong phân tử. Qua các thử nghiệm in vitro cho thấy các chất 335, 343,

344 và các rakanmakilactone A–F (346-351) đều có hoạt tính kháng lại tế bào ung thư bạch

cầu P-388 với các gí trị IC50 tương ứng là 0,16, 0,52, 0,23, 0,31, 0,18, 0,29, 0,25, 5,0, và

4,3 µg/mL [103]. Năm 2007, cũng từ loài này, Mei-Hsien Lee và các cộng sự đã phân lập

được một biflavonoid mới là 2,3-dihydro-4′,4′′′-di-O-methylamentoflavone (352), và năm

hợp chất đã được biết đến là quercetin (188), 2,3-dihydrosciadopitysin (353), (-)-catechin

(354), sciadopitysin (355), và isoginkgetin (356). Các hợp chất này được thử nghiệm khả

năng ức chế hoạt động của enzyme tyrosinase chống lại quá trình tổng hợp ra chất tạo ra

melanin trong biểu bì hắc tố con người (HEMn). Kết quả cho thấy 352 có thể ức chế

tyrosinase mạnh với IC50 = 0,098 mM [104]. Trong một công bố vào năm 2014, từ cành lá

và lá loài P. macrophyllus, các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được một chất mới

là podocarflavone A (357) cùng với mười lăm flavonoid đã biết đó là apigenin (168),

luteolin (186), luteolin 7-O-β-D-glucopyranoside (187), 188, quercetin 3-O-β-D-

glucopyranoside (197), 356, amentoflavone (358), hinokiflavone (359), apigenin-7-O-(-D-

glucopyranoside) (360), tricin (361), salvigenin (362), ladanein (363), norartocarpesin

(364), avicularin (365) và pedalitin-3′-O-glucoside (366). Các phép thử in vitro cho thấy

các flavonoid 188, 197, 356 và 358 có hoạt tính chống oxi hóa tốt. Ngoài ra, các chất 186-

188, 197 và 358 có tác dụng bảo vệ tim mạch theo cách làm suy giảm nồng H2O2 nội sinh-

nguyên nhân gây chết tự nhiên của tế bào cơ tim (H9c2) trong ống nghiệm [105]. Mới đây,

32

năm 2016, từ vỏ của loài này, Ye-Gao Chen và cộng sự đã phân lập được mười lăm chất

sạch đó là 73, ferulic acid (264), 15-methoxydehydroabietic acid (367), 7α-

hydroxydehydroabietic acid (368), methyl trans-ferulate (369), methyl 22-O-

feruloyloxydocosanoate (370), vanillic acid (371), 2,6-dihydroxy-3,4-dimethylbenzoic acid

methyl ester (372), các lignan (373-375), một flavonoid là sideroxylin (376) và ba steroid

292, 7-ketositosterol (377), 3β,5α-dihydroxy-6β-methoxyergosta-7,22-diene (378) [106].

Năm 2011, từ chiết xuất CH2Cl2-MeOH của vỏ rễ loài P. latifolius, John A. Beutler

và các cộng sự đã phân lập được sáu chất, trong đó có ba diterpenoid mới là cycloinumakiol

(379), inumakal (380), inumakoic acid (381) cùng với ba chất đã biết là 331, inumakilactone

B (382)và inumakilactone (383). Qua phép thử AP-1 cho thấy hợp chất 331 và 383 có hoạt

tính ức chế AP-1 (một protein hoạt hóa, được kích hoạt bởi 12-otetradecanoyl phorbol-13-

acetate (TPA)) với IC50 tương ứng là 1,5 và 4 µM, kết quả này cho thấy hai chất trên rất có

tiềm năng trong việc ngăn ngừa và điều trị các bệnh ung thư [107].

Năm 2012, từ lá của loài P. elongatus, Alessandra Braca và các cộng sự đã phân lập

được tám hợp chất glycoside mới bao gồm nagilactone C 7-O-α-L-arabinopyranosyl-

(1→4)-β-D-xylopyranoside (384), nagilactone C 7-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-

xylopyranoside (385), nagilactone C 7-O-β-D-xylopyranoside (386), nagilactone A 7-O-α-

L-arabinopyranosyl-(1→4)-β-D-xylopyranoside (387), 2β,15S,16,17,19-pentahydroxy-iso

pimar-8(14)-ene 17-O-β-D-glucopyranoside (388), 2β,15R,16,17,19-pentahydroxy-iso

pimar-8(14)-ene 17-O-β-D-glucopyranoside (389), một dẫn xuất ionol là 1-(2,6,6-

trimethyl-4-hydroxycyclohexenyl)-1-hydroxy-buta-1-en-3-one 4-O-β-D-glucopyranoside

(390) và một flavone C-glycoside đó là vitexin 2′′-O-β-D-(6′′′-acetyl)-glucopyranoside

(391) [108].

Năm 2013, từ loài P. fleuryi các nhà khoa học Trung Quốc đã phân lập được tổng

cộng mười bảy chất trong đó có tám abietane diterpenoid đó là 337, các fleuryinol A–C

(392-394), 19-hydroxyferruginol (395), lambertic acid (396), inumakiol D (397) và

totaradiol (398), các chất 392-394 là những chất mới. Bước đầu sàng lọc hoạt tính cho thấy

393 và 395 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình đối với dòng tế bào ung

thư biểu mô tế bào gan (SMMC-7721) và ung thư phổi (A-549); riêng chất mới 393 còn

33

thể hiện mức độ ức chế trung bình đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu (HL-60) và ung

thư vú (MCF-7) [109]. Trong năm nay, 2017, cũng từ loài này đã phân lập được một sterol

mới có cấu trúc hiếm gặp với dạng bốn vòng ngưng tụ kiểu [6/5/6/5] đó là 3β,5β,6-

trihydroxyl-B-norsitostane (399) cùng với mười hợp chất đã biết là 381, 396, sitostenone

(400), β-sitosterol linoleate (401), 4β-hydroxyl-4(20→5),10(18→9)- abeopimar-15(16)-

ene (402), secoisolariciresinol-9,9′-acetonide (403), 3,4-dimethoxy-benzyl alcohol (404),

p-hydroxybenzyl alcohol (405), chrysophanol (406) và (−)-epicatechin (407) [110].

Năm 2014, từ loài P. imbricatus, Xiao-Ning Wang và các cộng sự phân lập được

bảy chất trong đó có năm chất đã biết là abieta-8,11,13-triene-3β,6β,12-triol (408),

margoclin (409), agathic acid (410), 6β-hydroxyisocupressic acid (411) và sanjoinenine

(412) cùng với hai chất mới là podoimbricatin A (413) và podoimbricatin B (414). Chất

412 là một cyclic peptide, chất 413 là một diterpenoid có cấu trúc hiếm gặp với dạng bốn

vòng ngưng tụ kiểu [6/6/5/6] còn 414 là một abietane mới. Qua các phép thử in vitro cho

thấy 411, 413 và 414 có hoạt tính kháng lại các dòng tế bào ung thư phổi (A-549) và ung

thư biểu mô phổi (NCI-H292) [111].

Bảng 1.7. Cấu trúc các chất được phân lập từ một số loài Podocapus

34

35

36

37

38

39

1.6. Tình hình nghiên cứu về hóa học của loài thông tre lá dài (Podocarpus

neriifolius)

Trong khoảng thập niên 70 của thế kỉ 20, loài thông tre lá dài đã được nghiên cứu sơ

bộ về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học. Điển hình như, trong công bố vào năm

1971, nhóm các nhà khoa học người Australia đã phân lập được podolactone C (335) và

podolactone D (344) [112]. Tuy nhiên, công bố này đã đề xuất cấu trúc cho 335 là chưa

thật chính xác, sau đó, 335 đã được chứng minh lại cấu trúc đúng của nó bởi John M.

Cassady và các cộng sự dựa trên phương pháp X-Ray đơn tinh thể [98]. Năm 1974, các

chất dạng biflavone như isoginkgetin (356), amentoflavone (358), podocarpusflavone A

(415) và podocarpusflavone B (416) đã được phân lập từ lá của loài này [113]. Cũng trong

năm 1974, ở một công bố khác, từ bộ phận lá, nhóm tác giả trên đã phân lập được các chất

7,4′-dimethylaromadendrin (417) và 7,4′-dimethylaromadendrin 5-glucoside (418) [114].

Gần đây cũng đã có một vài công bố đáng chú ý, đó là vào năm 2001, nagilactone C

(296) được tách ra từ loài này có hoạt tính chống tăng sinh đối với các dòng tế bào ung thư

biểu mô liên kết di căn ở người (HT-1080) và ung thư ruột kết ở chuột (26-L5) với giá trị

ED50 tương ứng là 2.3 và 1.2 µg/mL [115]. Năm 2017, từ phần chiết xuất tan trong EtOAc

của lá loài P. neriifolius, Yegao Chen và các cộng sự đã phân lập được hai chất mới là

neriitide A (419), neriilignan (420) cùng với sáu chất đã biết gồm ba sesquiterpenoid

spatulenol (421), 10α-epoxyaromadendrane (422), blumenol C (423); hai diterpenoid

isopimaric acid (48), Δ8,9 isopimaric acid (424); một sterol là 5α,6β-dihydroxysitosterol

(425) [116].

40

Bảng 1.8. Cấu trúc một số chất đã được phân lập từ loài Thông tre lá dài

(Podocapus neriifolius)

❖ Nhận xét chung

- Các nghiên cứu gần đây về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc

chi Pinus và chi Podocarpus chủ yếu tập trung vào các loài phân bố phổ biến ở châu Á

và nhiều nhất là ở Trung Quốc. Ở Việt Nam có khoảng 09 loài Pinus và 03 loài Podo-

carpus; phân bố nhiều ở Tây nguyên, tuy nhiên những công bố mới chỉ tập trung về

thực vật học, còn về thành phần hóa học và hoạt tính mới chưa nhiều và chưa có hệ

thống

- Thành phần hóa học của các loài trong hai chi này tương đối đa dạng, và nổi trội là các

hợp chất diterpenoid với nhiều khung cấu trúc khác nhau.

- Từ cơ sở trên, luận án tập trung nghiên cứu 03 loài sau:

41

Thông đà lạt (Pinus dalatensis): trên thế giới, chưa được nghiên cứu về thành phần

hóa học và hoạt tính sinh học. Bộ phận được chọn để nghiên cứu là gỗ (chứa nhựa Thông)

và lá (tùng diệp) vì chúng đã được sử dụng như là một vị thuốc trong y học cổ truyền để

chữa nhiều bệnh khác nhau.

Thông ba lá (Pinus kesiya): chỉ có những nghiên cứu bước đầu về thành phần hóa

học tại Trung Quốc. Ở Việt Nam, loài này hầu như chưa được nghiên cứu về hóa học. Bộ

phận được chọn để nghiên cứu là rễ (tùng tiết) vì nó được sử dụng trong y học cổ truyền để

chữa lo âu, mất ngủ; giúp an thần, trừ thấp.

Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius): bộ phận lá đã được nghiên cứu nhiều ở

nước ngoài. Loài này có thành phần hóa học phong phú, có nhiều cấu trúc mới, là những

chất ít gặp trong thiên nhiên và có hoạt tính sinh học thú vị và cũng chưa được nghiên cứu

kỹ về mặt hóa học. Loài này phân bố ở Việt Nam tương đối ít nên để không làm ảnh hưởng

nhiều tới sự sinh trưởng và phát triển của quần thể, tác giả đã thu lấy mẫu gỗ (cành) để

nghiên cứu thành phần hóa học.

42

Chương 2. THỰC NGHIỆM

2.1. Thu hái mẫu cây và xác định tên khoa học

Thân gỗ và lá Thông đà lạt (Pinus dalatensis) cùng với thân gỗ loài Thông tre lá dài

(Podocarpus neriifolius) thu tại Lâm Đồng, vào tháng 1/2013. Rễ Thông ba lá Pinus kesiya

được thu tại DakLak vào tháng 8/2015. Tất cả các mẫu trên đều được TS. Nguyễn Tiến

Hiệp định danh và có tiêu bản tương ứng là VNMN.B000005006, VNMN.B0000050013

và VNMN.B000005007 được giữ tại Bảo tàng Thiên nhiên Việt Nam - Viện Hàn lâm Khoa

học và Công nghệ Việt Nam.

2.2. Phương pháp xử lý và chiết mẫu

Các mẫu thực vật sau khi thu hái được cắt nhỏ, phơi khô dưới nắng sau đó sấy ở

nhiệt độ 40-45 0C rồi đem nghiền nhỏ.

Tất cả các mẫu thực vật được chiết theo quy trình chung như sau: đem chiết các mẫu

đã được xay nhỏ ba lần với hỗn hợp dung môi MeOH-H2O ở nhiệt độ phòng. Lọc các dịch

chiết, cô đặc dưới áp suất giảm thu được chiết xuất MeOH-H2O. Chiết xuất này được hòa

vào nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane, EtOAc và n-butanol. Quay

cất dung môi dưới áp suất thấp thu được các chiết xuất tương ứng.

2.3. Phương pháp khảo sát, phân tách và tinh chế các hợp chất từ mẫu thực vật

Việc phân tích, phân tách các dịch chiết của cây được thực hiện bằng các phương

pháp sắc ký khác nhau như: sắc ký lớp mỏng (TLC), sắc ký cột thường (CC) và sắc ký lọc

Gel.

Sắc ký lớp mỏng (TLC) được dùng để khảo sát sơ bộ thành phần các chất trong chiết

xuất, trong các phân đoạn chạy cột và kiểm tra chất sạch. Sự triển khai sắc ký lớp mỏng được

thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1.05715) và RP-18 F254s

(Merck). Dung môi triển khai là hỗn hợp các dung môi thông dụng trong phòng thí nghiệm

như n-hexane, CH2Cl2, EtOAc, acetone, MeOH, EtOH và H2O.

Sắc ký cột thường pha thuận với chất hấp phụ là silica gel 60, cỡ hạt 0.040-0.063

mm (230-400 mesh) của hãng Merck, dung môi rửa giải chủ yếu dùng các hệ dung môi như

n-hexane:CH2Cl2, n-hexane:EtOAc, n-hexane:acetone, CH2Cl2:EtOAc, CH2Cl2:acetone,

43

CH2Cl2:MeOH, CH2Cl2:MeOH:H2O, vv… với các tỉ lệ thích hợp.

Sắc ký cột thường pha đảo với chất hấp phụ là RP-18, hệ dung môi dùng để rửa giải

là MeOH:H2O, acetone:H2O, acetonitrile:H2O, vv... với tỉ lệ thích hợp

Sắc ký lọc Gel (GFC) dùng Sephadex LH20 làm pha tĩnh với dung môi chạy cột là

MeOH hoặc CH2Cl2:MeOH với tỉ lệ CH2Cl2<10%.

2.4. Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc của các hợp chất được xác định bằng sự kết hợp và phân tích những số liệu

thu được từ các phương pháp phổ hiện đại như phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ khối (ESI-MS,

HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) và hai

chiều (HSQC, HMBC, 1H-1H-COSY, NOESY).

2.5. Phương pháp thử một số hoạt tính sinh học

▪ Thực hiện ở Viện Hóa học Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các tế bào ung thư KB ở người được cung cấp bởi ATCC

Các tế bào ung thư nghiên cứu được nuôi cấy trong các môi trường nuôi cấy phù hợp

có bổ sung thêm 10% huyết thanh bò (FBS) và các thành phần cần thiết khác ở điều kiện

tiêu chuẩn (5% CO2; 370C; độ ẩm 98%; vô trùng tuyệt đối). Tùy thuộc đặc tính của từng

dòng tế bào khác nhau, thời gian cấy chuyển cũng khác nhau.

Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ

(National Cancer Institute-NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc,

phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện

in vitro. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ

quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm

bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với

phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD

càng lớn (phương pháp Monks).

Cách thử độc tế bào như sau: Cho 200 μL dung dịch tế bào ở nồng độ 3,104 tế

bào/mL vào mỗi giếng (đĩa 96 giếng) trong môi trường RPMI 1640 cho các dòng tế bào

44

được thử nghiệm. Mẫu thử được xử lí với tế bào ở các nồng độ pha loãng khác nhau sao

cho đạt đến nồng độ cuối cùng là 128 μg/mL; 32 μg/mL; 8 μg/mL; 2 μg/mL; 0,5 μg/mL. Ủ

trong điều kiện 37 0C, 5% CO2 trong 3 ngày. Giếng điều khiển gồm 200μl dung dịch tế bào

nồng độ 3.104 tế bào/mL, ủ ở 370C, 5% CO2 trong 3 ngày, thêm 50 μL MTT (1 mg/mL pha

trong môi trường nuôi cấy không huyết thanh), ủ 370C 4 giờ. Loại bỏ môi trường, thêm 100

μL DMSO, lắc đều, đọc kết quả ở bước sóng 540 nm trên máy spectrophotometter Genios

TECAN. Kết quả được tính như sau:

% 100%mÉu®iÒu khiÓn

®iÒu khiÓn

OD ODGI

OD

GI%: Phần trăm kìm hãm sự phát triển (Growth Inhibition).

Giá trị IC50 được tính dựa trên kết quả GI% của tế bào bằng phần mềm máy tính

table curve.

▪ Thực hiện ở Viện Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ

Việt Nam

Các dòng tế bào ung thư do GS. TS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS.

Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italy cung cấp.

Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:

- Pha chất thử thành các dải nồng độ thích hợp. Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm

rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. Chất

thử đã pha ở các nồng độ vào các giếng của đĩa 96 giếng, thêm tế bào đã điều chỉnh nồng

độ phù hợp ở trên vào các giếng này sao cho nồng độ chất thử trong giếng là 100 μg/mL;

20 μg/mL; 4 μg/mL; 0,8 μg/mL. Ủ trong tủ ấm 48 giờ. Giếng không có chất thử nhưng có

TBUT (190L) sẽ được sử dụng làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, giếng đối chứng ngày 0

tế bào sẽ được cố định bằng Trichloracetic acid (TCA). Sau 48 giờ, tế bào được cố định bằng

TCA trong 1 giờ, được nhuộm bằng SRB trong 30 phút ở 37 0C, rửa 3 lần bằng acetic acid rồi

để khô ở nhiệt độ phòng. Cho 10 mM unbuffered Tris base để hòa tan lượng SRB, lắc nhẹ

trong 10 phút. Đọc kết quả OD ở bước sóng 515-540 nm trên máy ELISA Plate Reader

(Bio-Rad). Phần trăm ức chế sự phát triển của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định

45

thông qua công thức sau:

[ ] 100% 100%

chÊt thö ngµy 0

®èi chøng ©m ngµy 0

øc chÕ

OD OD

OD OD

Phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine ở các nồng độ 10

g/mL; 2 g/mL; 0,4 g/mL; 0,08 g/mL được sử dụng như là chất đối chứng dương;

- DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 (nồng độ ức chế 50%

sự phát triển) sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4.

Theo tiêu chuẩn của Viện ung thư quốc gia Hoa Kỳ (NCI), chiết xuất được coi có

hoạt tính tốt với IC50 20 μg/mL, trong khi chất tinh khiết được coi có hoạt tính tốt (hit

compound) khi IC50 5 μM

▪ Thực hiện ở Đại học y Perugia - Đại học tổng hợp Perugia, Cộng hòa Italy

Thử hoạt tính ức chế miễn dịch dựa vào hiệu ứng kìm hãm sự phát triển nhanh của

các tế bào lympho T hoạt hóa. Dòng tế bào bạch cầu ung thư bạch cầu cấp tính T cell

leukemia phân lập từ tủy sống người (OCI-AML). Số lượng các tế bào được đếm trên

hemocytometer; phân tích protein bằng kỹ thuật Western Blot.

Kỹ thuật tiến hành nhuộm màu tế bào còn sống sót (cell viability)

- Nguyên tắc: Phương pháp này dùng để xác định số tế bào sống khi có mặt tế bào

chết. Thí nghiệm này dựa trên cơ sở màng tế bào lympho sống không bị thay đổi khi bị

nhuộm màu bởi Trypan blue, Eosin hoặc Propidium trong khi tế bào chết sẽ có màu xanh.

- Các bước tiến hành thử như sau:

Dòng tế bào lympho được tách từ tủy sống người bệnh, được bảo quản đông lạnh và

giữ tế bào ở nhiệt độ thấp (₋70 0C).

Tế bào sau khi lấy ra được làm ấm bằng nước ở 370C, pha loãng bằng RPMI/10%

natriglutamine) nhuộm màu bằng 0,4% propidium (được bảo quản trong lọ tối màu,

lọc nếu để trong thời gian dài). Các bước tiến hành:

1. Dùng pipet (vô trùng) chuyển tế bào vào ống ly tâm. Ly tâm trong 5 phút (12.000

vòng/phút) ở nhiệt độ phòng, thu lấy phần lắng, loại bỏ phần dung dịch có huyền

phù lơ lửng. Lượng của dung dịch ly tâm phụ thuộc vào số lượng tương đối của tế

46

bào trong 1 mL PBS (Phosphate buffered saline) nếu đặc quá sẽ pha loãng bằng 0,4

% propidium sao cho nồng độ tế bào ước tính khoảng 5x105cells/mL.

2. Ly tâm loại bỏ nước mặt để thu cặn (giữ lại tế bào lắng lại thành viên) và cho vào

1mL PBS.

3. Tiến hành nuôi cấy trên đĩa petri, mỗi lọ chứa 1mL tế bào ở nồng độ chuẩn, bổ sung

thêm thuốc định thử tác dụng, theo các thang nồng độ khác nhau. Nuôi cấy trong tủ

ấm ở nhiệt độ 370C, thời gian 72 giờ.

4. Nhuộm màu với 0,4 % propidium với tỉ lệ 1:1

5. Lấy một giọt hỗn hợp propidium /hỗn hợp tế bào.

6. Thu hoạch: Đếm lại tỉ lệ tế bào sống/chết trên máy đếm. Phân tích chu trình tế bào

bằng flow cytometry, giá trị thu được được biểu thị dưới dạng biểu đồ.

7. Tính tỉ lệ tế bào sống theo công thức:

% tế bào sống sót = Tổng số tế bào sống sót có trong 1 mL

Tổng số tế bào có trong 1 mL

2.6. Hóa chất và thiết bị

Các dung môi như n-hexane, EtOAc, CH2Cl2, acetone, MeOH đều được cất lại qua

cột Vigreux trước khi sử dụng để chạy sắc ký cột và sắc ký bản mỏng.

Điểm nóng chảy được đo trên máy Buchi B-545 tại Viện Hóa học, Viện Khoa học

và Công nghệ Việt Nam.

TLC, TLC–RP, Silica gel, RP18, Diol, cột sắc ký các loại đều do hãng Merck (Đức)

cung cấp. Các chất khảo sát trên bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng

ngắn 254 nm và dài 365 nm sau đó được phát hiện bằng thuốc thử vanilin-H2SO4 (vanilin

1.2 g; MeOH 200 mL; CH3COOH 25 mL; H2SO4 11 mL) bằng cách hơ nóng trên bếp điện

đến khi hiện màu rõ nhất.

Độ quay cực [α]D được đo trên máy JASCO P2000 Polarimeter tại Viện Hóa Sinh

biển-Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy ATAGO POLAX-2L tại Viện Hóa

học-Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ hồng ngoại FT-IR được đo dưới dạng viên nén KBr bằng máy IMPACT-410,

47

Nicolet-Carl Zeiss Jena (Đức) tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Phổ khối ESI-MS được đo trên máy Agilent LC-MSD-Trap SL tai Viện Hóa học,

Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và máy AMD 402 (Đức).

Phổ khối phân giải cao HR-ESI-MS được đo trên máy LTQ Orbitrap XL™ Hybrid

Ion Trap-Orbitrap (USA), tai Khoa Hóa học, Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz Viện

Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.7. Quy trình chiết và thu các chiết xuất từ các loài thực vật nghiên cứu

Các mẫu gỗ và lá Thông đà lạt, rễ Thông ba lá, gỗ Thông tre lá dài đã được xay nhỏ

rồi chiết ba lần với hỗn hợp dung môi MeOH:H2O (9:1) ở nhiệt độ phòng. Lọc các dịch

chiết, cô đặc dưới áp suất giảm thu được chiết xuất MeOH-H2O. Chiết xuất này được hòa

vào nước và chiết phân bố lần lượt với các dung môi n-hexane, EtOAc và n-butanol. Quay

cất dung môi dưới áp suất giảm thu được các chiết xuất tương ứng. Sau đây là sơ đồ chung

mô tả quá trình chiết và thu các chiết xuất.

Hình 2.14. Sơ đồ chung mô tả quá trình chiết và thu được các chiết xuất

Theo cách làm như vậy:

- Từ 0,8 kg gỗ Thông đà lạt thu được 1,5 g chiết xuất n-hexane (PDWN), 31 g chiết

xuất EtOAc (PDWE) và 18,5 g chiết xuất n-butanol (PDWB).

48

- Từ 0,83 kg lá Thông đà lạt thu được 9,2 g chiết xuất n-hexane (PDLN), 16 g chiết

xuất EtOAc (PDLE) và 24 g chiết xuất n-butanol (PDLB).

- Từ 2 kg rễ Thông ba lá thu được 15 g chiết xuất n-hexane (PKRN), 19 g chiết xuất

EtOAc (PKRE) và 80 g chiết xuất n-butanol (PKRB).

- Từ 0,8 kg gỗ Thông tre lá dài thu được 0,5 g chiết xuất n-hexane (PNWN), 15 g

chiết xuất EtOAc (PNWE) và 13 g chiết xuất n-butanol (PNWB).

2.8. Phân lập chất từ các chiết xuất

2.8.1. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt

Từ 31 gam chiết xuất EtOAc, chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu là

n-hexane:EtOAc = 95:5 (grad. EtOAc 5→95%) thu được 27 phân đoạn.

Phân đoạn 8 (603 mg) được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu là n-

hexane:CH2Cl2:EtOAc = 85:15:0 (grad. CH2Cl2 15→100%; grad. EtOAc 0→95%) thu

được các chất sạch là PDWE8 (137 mg), PDWE9 (67 mg) và kết tinh lại thu được

PDWE10 (35 mg).

Phân đoạn 10 (3,72 g) được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu là n-

hexane:CH2Cl2:EtOAc = 80:20:0 (grad. CH2Cl2 20→100%; grad. EtOAc 0→50%) thu

được 10 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 10.1 đến 10.10). Tiếp tục chạy sắc ký cột silica

gel phân đoạn nhỏ 10.1 với hệ dung môi ban đầu là n-hexane:CH2Cl2: EtOAc = 30:70:0

(grad. CH2Cl2 70→100%; grad. EtOAc 0→50%) thu được chất sạch PDWE11 (600 mg).

Phân đoạn 14 (922 mg) được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi n-

hexane:CH2Cl2 :MeOH = 30:70:5 thu được chất sạch PDWE12 (190 mg).

Kết tinh lại phân đoạn 14 (1,52 g) bằng dung môi EtOAc thu được chất sạch

PDWE1 (700 mg).

Kết tinh lại phân đoạn 18 (828 mg) bằng dung môi EtOAc thu được chất sạch

PDWE2 (48 mg).

Rửa kết tủa phân đoạn 23 (1,15 g) bằng dung môi CH2Cl2 thu được chất sạch

PDWE6 (67 mg).

49

Chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 phân đoạn 21 (630 mg) dung môi rửa là MeOH

thu được chất sạch PDWE5 (110 mg).

Phân đoạn 25 (2,59 g) được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH

thu được 7 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 25.1 đến 25.7). Tiếp tục chạy sắc ký cột silica

gel phân đoạn nhỏ 25.2 với hệ dung môi ban đầu là CH2Cl2:MeOH = 98:2 (grad. MeOH

2→20%) thu được chất sạch PDWE3 (482 mg). (Hình 2.2)

2.8.2. Phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt

Từ 18 gam chiết xuất n-hexane, chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu

là CH2Cl2:MeOH:H2O = 100:10:0 (grad. 20:10:1) thu được 8 phân đoạn.

Phân đoạn 3 (870 mg) được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH


gel phân đoạn nhỏ 3.2 với hệ dung môi ban đầu là CH2Cl2:MeOH = 90:10 (grad. MeOH

10→50%) thu được chất sạch PDWB1 (10 mg). Phân đoạn nhỏ 3.3 cho chạy qua cột sắc

ký sephadex LH20 dung môi triển khai là MeOH thu được chất sạch PDWB2 (35 mg), so

sánh trên TCL thì nhận định sơ bộ PDWB2 là catechin.

Phân đoạn 4 (2.2 g) được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH thu

được 5 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 4.1 đến 4.5). Tiếp tục chạy sắc ký cột silica gel

phân đoạn nhỏ 4.1 với hệ dung môi ban đầu là CH2Cl2:MeOH:H2O = 100:10:0.8 (grad.

100:50:1) thu được 8 phân đoạn nhỏ hơn (4.1.1 đến 4.1.8). Chạy sắc ký cột pha đảo (RP-

18) 4.1.8 với hệ dung môi rửa giải là MeOH: :H2O = 2:3 thu được 13 mg PDWB6 sạch.

Phân đoạn 6 (609 mg) được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH


gel phân đoạn nhỏ 6.4 với hệ dung môi ban đầu là EtOAc:MeOH = 90:10 (grad. MeOH

10→50%) thu được chất thô PDWB4, tiếp tục chạy qua cột sephadex LH20 thu được 13 mg

PDWB4 sạch. (Hình 2.3)

2.8.3. Phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt

Từ 9.2 gam chiết xuất n-hexane, chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu

là là n-hexane:EtOAc = 95:5 (grad. EtOAc 3→90%) thu được 12 phân đoạn.

50


hexane:EtOAc = 98:2 (grad. EtOAc 2→5%) thu được chất sạch PDLN1 (126 mg)


hexane:EtOAc = 98:2 thu được chất sạch PDLN2 (100 mg), kiểm tra đối chứng trên TLC,

nhận định PDLN2 là -sitosterol (292).


hexane:CH2Cl2 = 80:20 (grad. CH2Cl2 20→50%) thu được 6 phân đoạn nhỏ hơn (được kí

hiệu 6.1 đến 6.6). Phân đoạn nhỏ 6.3 được chạy qua cột sắc ký sephadex LH20 dung môi

triển khai là MeOH thu được chất sạch PDLN8 (11 mg) kiểm tra đối chứng trên TLC thấy

PDLN8 trùng với PDWE11.


hexane:CH2Cl2 = 80:20 (grad. CH2Cl2 20→50%) thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn (được kí

hiệu 8.1 đến 8.3). Phân đoạn nhỏ 8.3 được chạy qua cột sắc ký sephadex LH20 dung môi

triển khai là MeOH thu được phân đoạn 8.3.1. Sau đó, đtiếp tục chạy sắc ký cột silica gel

phân đoạn 8.3.1 với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH = 100:1 (grad. MeOH 1→5%)

thu được chất sạch PDLN5 (15 mg).

Phân đoạn 9 (609 mg) được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-

hexane:CH2Cl2:MeOH theo tỉ lệ cố định tương ứng là 30:10:1 thu được 8 phân đoạn nhỏ

hơn (được kí hiệu 9.1 đến 9.8). Phân đoạn nhỏ 9.2 được tiếp tục chạy sắc ký cột thường

với chất hấp phụ silica gel cùng hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:MeOH = 100:1, thu được

chất PDLN3 (52 mg). Phân đoạn nhỏ 9.6 được chạy qua cột sắc ký sephadex LH20 dung

môi triển khai là MeOH thu được chất sạch PDLN4 (42 mg) kiểm tra đối chứng trên TLC

thấy PDLN4 trùng với daucosterol (293). (Hình 2.4)

2.8.4. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt


n-hexane:EtOAc:MeOH = 100:5:0 (grad. EtOAc 5→80%, MeOH 0→20%) thu được 12

phân đoạn.

51

Phân đoạn 6 (110 mg) được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải là n-

hexane:EtOAc:MeOH = 10:10:1 thu được chất sạch PDLE1 (10mg).

Chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 phân đoạn 7 (390 mg) với dung môi triển khai là

MeOH thu được 3 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 7.1 đến 7.3). Tiếp tục chạy sắc ký cột

silica gel 7.1 với hệ dung môi rửa giải là n-hexane:EtOAc:MeOH = 10:10:1 đã tách được

chất sạch PDLE2 (4 mg). Thử trên cùng TLC và so sánh nhiệt độ nóng chảy thấy rằng

PDLE2 trùng với PDWE10 (mp 127 0C).

Chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 phân đoạn 8 (218 mg) với dung môi rửa là MeOH

thu được 2 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 8.1 và 8.2). Tiếp tục chạy sắc ký cột silica gel

8.1 với hệ dung môi rửa giải là n-hexane:CH2Cl2:MeOH = 10:40:1 thu được các phân đoạn

nhỏ hơn (8.1.1 đến 8.1.7). Chạy sắc ký cột silica gel 8.1.3 với hệ dung môi rửa giải là n-

hexane:CH2Cl2:EtOAc = 20:10:10 đã tách được chất sạch PDLE3 (6 mg). Còn phân đoạn

8.1.5 được cho chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 với dung môi rửa là MeOH thu được 59

mg chất sạch PDLE4.

Phân đoạn 9 (820 mg), được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải ban

đầu là n-hexane:CH2Cl2:acetone = 20:50:1 (grad. 5:10:5) thu được 6 phân đoạn nhỏ (được

kí hiệu 9.1→9.6). Tiếp tục chạy sắc ký cột silica gel 9.6 bằng hệ dung môi rửa giải là

CH2Cl2:EtOAc = 200:5 (grad. 100:3) thu được 50 mg chất PDLE5. Tiến hành kiểm tra đối

chứng trên TLC thấy PDLE5 trùng với PDLN3.

Phân đoạn 10 (715 mg), được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải ban

đầu là n-hexane: CH2Cl2:acetone = 15:50:2 (grad. 0:80:3) thu được 5 phân đoạn nhỏ (được

kí hiệu 10.1→10.5). Tiếp tục chạy sắc ký cột silica gel 10.5 bằng hệ dung môi rửa giải là

CH2Cl2:EtOAc = 1:1 thu được 12 mg chất sạch PDLE6

Phân đoạn 12 (2.4 g), được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải ban

đầu là CH2Cl2:acetone = 200:1 (grad. 100:5) thu được 5 phân đoạn nhỏ (được kí hiệu

12.1→12.5). Tiếp tục chạy sắc ký cột sephadex LH20 phân đoạn 12.4 với dung môi rửa là

MeOH thu được 200 mg chất sạch PDLE7. (Hình 2.5)

2.8.5. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá

52


CH2Cl2:MeOH:H2O = 100:5:0 (grad. 25:10:1) thu được 8 phân đoạn.

Phân đoạn 2 (620 mg), sau khi được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa

giải là CH2Cl2:MeOH:H2O = 20:10:0 (grad. 10:10:2) đã thu được 6 phân đoạn nhỏ (được

kí hiệu 2.1→2.6). Sau đó chạy sắc ký cột pha đảo (RP-18) 2.5 với hệ dung môi rửa giải là

MeOH:H2O = 2:3 thu được 12 mg PKRE2.

Phân đoạn 3 (1000 mg), được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH


gel 3.2 với hệ dung môi rửa giải là CH2Cl2:EtOAc:MeOH = 10:10:1 rồi sau đó tinh chế qua

cột sephadex LH20 (dung môi MeOH ) thu được 15 mg PKRE4.

Phân đoạn 4 (1,5 g), được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH

thu được 7 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 4.1 đến 4.7). Tiếp tục chạy sắc ký lọc gel

sephadex LH20 4.3 với dung môi triển khai là MeOH thu được 120 mg PKRE5.


thu được 9 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 5.1 đến 5.9). Phân đoạn 5.1 được chạy sắc ký

cột pha đảo (RP-18) với hệ dung môi rửa giải là MeOH:H2O = 2:3 thu được 4 phân đoạn

nhỏ hơn (5.1ª đến 5.1d). 5.1c được được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là

MeOH thu được chất 8 mg PKRE8 và 5.1c2; sau đó chạy sắc ký 5.1c2 với chất hấp phụ

DIOL và hệ dung môi DCM:MeOH = 90:10 thu được 14 mg PKRE11. Phân đoạn 5.3

được chạy sắc ký cột pha đảo (RP-18) với hệ dung môi rửa giải là acetone:H2O = 1:1.3 thu

được 10 mg PKRE9.


thu được 4 phân đoạn nhỏ hơn (được kí hiệu 6.1 đến 64). Phân đoạn 6.1 được chạy sắc ký

cột pha đảo (RP-18) với hệ dung môi rửa giải là MeOH: :H2O = 2:3 thu được phân đoạn

nhỏ 6.1ª. Sau đó tiếp tục chạy sắc ký cột silica gel 6.1ª với hệ dung môi rửa giải là

CH2Cl2:MeOH = 50:1 thu được 15mg PKRE12. (Hình 2.6)

2.8.6. Phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài

53


n-hexane CH2Cl2:MeOH = 30:70:0 (grad. 0:65:35) thu được 18 phân đoạn.

Phân đoạn 3 (344 mg), chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu là n-

hexane:EtOAc = 100:1 (grad. EtOAc 1→15%) thu được chất PNWE2 (33 mg)

Phân đoạn 7 (419 mg), chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu là n-

hexane:CH2Cl2 = 90:10 (grad. CH2Cl2 10→90%) thu được chất PNWE3, kết tinh lại

PNWE3 trong dung môi CH2Cl2 thu được 8.4 mg chất sạch.

Phân đoạn 9 (217 mg), kết tinh lại phân đoạn 9 trong dung môi CH2Cl2 thu được 29

mg chất sạch PNWE1

Phân đoạn 11 (3.1 g), được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu n-

hexane:EtOAc:MeOH = 80:20:1 (grad. EtOAc 20→40%, MeOH 1→6%) thu được 10 phân

đoạn nhỏ (11.1 đến 11.10). Chạy tiếp sắc ký cột silica gel 11.3 với hệ dung môi n-

hexane:EtOAc = 80:20 thu được 11 mg chất sạch PNWE5. Kết tinh lại 11.8 trong dung

môi CH2Cl2 thu được 107 mg chất sạch PNWE1.

Phân đoạn 14 (325 mg), được chạy sắc ký cột silica gel với hệ dung môi ban đầu là

CH2Cl2:MeOH = 80:20:1 (grad. MeOH 1→20%) thu được 7 phân đoạn nhỏ (14.1 đến

14.7). 14.3 được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH thu được chất

PNWE4 (9 mg).

Phân đoạn 18 (410 mg), được chạy sắc ký lọc gel sephadex LH20 dung môi là MeOH

thu được chất PNWE9 (12 mg). (Hình 2.7)

54

Hình 2.2. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông đà lạt

PDWE (31g)

27 Phân đoạn

CC ; Sol n-Hexane : EtOAc; (EtOAc: 5→95%)

Kết

tinh

lại

TF3 TT6

TT4

TP2

TP3

TF1

TF2

TF5

TP1

TL1

55

Hình 2.3. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-butanol của gỗ Thông đà lạt

PDWB (18 g)

CC; silicagel ; dm DCM: MeOH: H2O

grad. (100:10:0 → 20:10:1)

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

3.2 3.3

CC; silicagel ;

dm DCM :

MeOH grad. (10:1→ 10:5)

PDWB1

(10 mg)

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

PDWB2

Catechin

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

3.1

CC; silicagel ; dm DCM : MeOH : H2O

grad. (100:10:0.8→ 100:50:1)

3.1.8

CC; RP18 ; dm :

MeOH:H2O = 1:1.5

PDWB6 ( 13 mg)

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

TP4 + TP5a TF4 TL3

TP6

56

Hình 2.4. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất n-hexane của lá Thông đà lạt

PDLN (9.2g)

CC; silicagel ; dm n-hexane: EtOAc

grad. (97 :3 → 10 : 90)

CC; silicagel ;

dm n-hexane :

DMC= 98:2

PDLN2

(β-sitosterol)

CC; silicagel ; dm

n-hexane:DMC

grad. (4:1→ 1:1)

6.1

CC; LH20 ; dm : MeOH

PDLN8

(11 mg)

CC; silicagel ; dm n-

hexane:DMC grad. (4:1→ 1:5)

8.3


8.3.1

PDLN5 (15 mg)

CC; silicagel ; dm

n-hexane:DCM:

MeOH: = 3 : 1 : 0.1

9.2 9.6

CC; silicagel ; dm

DCM: MeOH: = 100:1

PDLN3

(52 mg)

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

PDLN4

(daucosterol)

TS1

TP2

TT2 TS2

TT5

57

Hình 2.5. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của lá Thông đà lạt

CC; silicagel ; dm

n-hexane:EtOAc:

MeOH ; (1 : 1 : 0.1)

PDLE (16g)

CC; silicagel ; dm n-hexane: EtOAc: MeOH ;

grad. (100 : 5 : 0 → 0 : 80 : 20)

CC; silicagel ; dm

n-hexane:EtOAc:

MeOH: ; (1 : 1 :

0.1)

PDLE1

(10 mg)

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

7.1

PDLE2

(4 mg)


8.1

CC; silicagel ; dm

n-hexane:DCM:

MeOH: ; (1 : 4 : 0.1)

8.1.3 8.1.5

PDLE3

(6 mg)

PDLE4

(59 mg)

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

PDLE5

(50 mg)

CC; silicagel ; dm

n-hexane:DCM:

acetone: ; (2 : 5 :

0.1 → 0:5:1 + 0.5

MeOH)

9.6

CC; silicagel ; dm

n-hexane:DCM:

acetone: ; (1.5 : 5 :

0.2 → 0: 8: 3

10.5

PDLE6

(12 mg)

CC; silicagel ; dm

DCM: acetone: ;

(20 : 0.1 → 10: 5

12.4

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

PDLE7

(200 mg)

TT12

TT4

TT3 TT5

TT2 TT1 TF7

58

Hình 2.6. Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của rễ Thông ba lá

CC; DIOL ; dm

DCM : MeOH (9:1)

CC;

silicagel ;

dm DCM

: EtOAc:

MeOH; (1

: 1 : 0.1)

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

CC; silicagel ; dm

DCM : MeOH:

H2O ; grad. (2 : 1 :

0 → 1 : 1 : 0.2)

PKRE (19g)

PĐ 2 (620 mg)

CC; silicagel ; dm DCM : MeOH: H2O ;

grad. (100 : 5 : 0 → 25 : 10 : 1)

PĐ 4 (1500 mg)

2.5

CC; RP18; dm :

MeOH:H2O = 2 :3

PKRE2 (12 mg)

3.2

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

4.3

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

5.1 5.3

CC;

LH20 ;

dm :

MeOH

6.1

CC; LH20 ;

dm : MeOH

PKRE5 (120 mg)

CC;

RP18;

dm :

MeOH:

H2O =

2 :3

CC;

RP18;

dm :

Actone:

H2O =

1 :1.3

5.1c

5.1c2


PKRE11 (14 mg)

6.1a

PKRE12 (15 mg)

TT11 TF4

TL2

TP4

TL3

TP7

TF6

59

Hình 2.7 . Sơ đồ mô tả quá trình phân lập các chất từ chiết xuất ethyl acetate của gỗ Thông tre lá dài

PNWE1

(107mg)

TT7

TS1

TT10

TT9 TT8 TT10

TS2

60

2.9. Dữ kiện phổ của các chất tách được

❖ Chất TT1 (PDLE6): Caryolane-1β,9β-diol.

Chất dạng dầu màu vàng rất nhạt, 12 mg, [α]D= + 0,7 (CHCl3)

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz và 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (Bảng 3.1)

❖ TT2 (PDLN3 và PDLE5): là hỗn hợp hai chất đó là 16-Hydroxy-8(17),13-

labdadien-15,16-olid-19-oic acid (TT2a) và 15-Hydroxypinusolidic acid

(TT2b).

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (Bảng 3.2)

❖ Chất TT3 (PDLE3): 15-Methoxypinusolidic acid

Chất dạng dầu màu vàng nhạt, 6 mg, [α]D= + 51,8 (CHCl3)


❖ Chất TT4 (PDWE10 và PDLE2): Lambertianic acid (155)

Chất rắn không màu, 35 mg, [α]D + 80,0 (MeOH), mp 127 0C, ESI-MS: m/z

315,2 [M–H]+, 339.3 [M+Na]+, CTPT: C20H28O3


❖ Chất TT5 (PDLN5 và PDLE4): 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-

oic acid

Chất dạng dầu màu vàng nhạt, [α]D – 44,6 (MeOH)

▪ PDLN5 (15 mg)


▪ PDLE4 (59 mg)

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7,11 (1H, d, J = 1,0 Hz, H-14), 4,89 và 4,59

(1H, s và 1H, s, H-17 ), 4,77 (2H, d, J =1,5 Hz, H-15), 1,24 (3H, brs, H-18), 0,60

(3H, brs, H-18).

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 39,2 (C-1), 19,9 (C-2), 37,9 (C-3), 44,2 (C-

4), 56,3 (C-5), 26,0 (C-6), 38,6 (C-7), 147,4 (C-8), 55,7 (C-9), 40,5 (C-10), 21,9 (C-

11), 24,7 (C-12), 134,8 (C-13), 144,0 (C-14), 70,1 (C-15), 174,4 (C-16), 106,8 (C-

17), 29,0 (C-18), 183,8 (C-19), 12,8 (C-20).

61

❖ Chất TT6 (PDWE9): Isopimaric acid (48)

Chất rắn không màu, 67 mg, ESI-MS: m/z 303,2 [M+H]+, CTPT: C20H30O2

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 5,80 (1H, dd, J = 17,5 Hz, 11,0 Hz, H-15),

5,32 (1H, d, J = 4,0 Hz, H-7), 4,92 (1H, d, J = 17,0 Hz, H-16a), 4,86 (1H, d, J = 10,0

Hz, H-16b), 2,03 (1H, m, H-6e), 1,75 (1H, m, H-6a), 0,91 (3H, brs, H-20), 0,86 (3H,

brs, H-17), 0,27 (3H, brs, H-19).


4), 44,0 (C-5), 25,2 (C-6), 121,0 (C-7), 135,7 (C-8), 52,0 (C-9), 35,0 (C-10), 20,0 (C-

11), 36,1 (C-12), 36,8 (C-13), 46,1 (C-14), 150,3 (C-15), 109,3 (C-16), 21,5 (C-17),

185,4 (C-18), 17,1 (C-19), 15,3 (C-20).

❖ Chất TT12 (PDLE1): 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one

Chất rắn dạng bột, màu trắng, 10 mg, mp 247 0C. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz)

và 13C-NMR (CDCl3, 125 MHz) (Bảng 3.6)

❖ Chất TF1 (PDWE1) Pinocembrin

Tinh thể hình kim, không màu, 700 mg, mp 192-1930C. ESI-MS: m/z 257,0

[M+H]+, CTPT: C15H12O4

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 12,03 (1H, s, 5-OH), 7,39-7,47 (5H, m, H-

2′→H-6′), 7,07 (1H, brs, 7-OH), 6,02 (1H, s, H-8), 6,01 (1H, s, H-6), 5,44 (1H, dd,

JH2/H3a = 13,0 Hz, JH2/H3e = 3,5 Hz, H-2), 3,08 (1H, dd, JH3a/H3e =17,5 Hz, JH3a/H2 = 13,0

Hz, H-3a), 2,82 (1H, dd, JH3e/H2 = 3,0 Hz, JH3e/H3a =17,5 Hz, H-3e).

13C-NMR (CDCl3, 125 MHz): δC 79,2 (C-2), 43,4 (C-3), 195,7 (C-4), 164,3

(C-5), 95,5 (C-6), 169,6 (C-7), 95,8 (C-8), 165,2 (C-9), 103,1 (C-10), 138,4 (C-1′),

126,2 (C-2′ và C-6′), 128,9 (C-3′ và C-5′), 128,9 (C-4′).

❖ Chất TF2 (PDWE2) Chrysin

Dạng bột màu vàng, 48 mg, mp 284-286 0C, ESI-MS: m/z 255,0 [M+H]+,

CTPT: C15H10O4

1H-NMR (CDCl3 & CD3OD, 500 MHz): δH 12,75 (1H, s, 5-OH), 7,90 (2H, dd,

J = 7.9 Hz, 1 Hz, H-2′ và H-6′), 7,52-7,55 (3H, m, H-3′→H-5′), 6,66 (1H, s, H-3),

6,47 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-6), 6,30 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-8).

62

13C-NMR (CDCl3 & CD3OD, 125 MHz): δC 164,3 (C-2), 105,0 (C-3), 182,7

(C-4), 161,8 (C-5), 99,6 (C-6), 164,3 (C-7), 94,6 (C-8), 158,3 (C-9), 105,5 (C-10),

131,4 (C-1′), 126,5 (C-2′ và C-6′), 129,2 (C-3′ và C-5′), 132,0 (C-4′).

❖ Chất TF3 (PDWE8), Pinostrobin

Chất rắn không màu, 137 mg, mp 112-113 0C

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 12,01 (1H, s, 5-OH), 7,41-7,46 (5H, m, H-

2′→H-6′), 6,06 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6), 6,05 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 5,40 (1H,

dd, JH2/H3a = 13,0 Hz, JH2/H3e = 3,0 Hz, H-2), 3,79 (3H, s, 7-OCH3), 3,06 (1H, dd,

JH3a/H3e = 17,0 Hz, JH3a/H2 = 13,0 Hz, H-3a), 2,80 (1H, dd, JH3e/H3a =17,0 Hz, JH3e/H2

= 3,0 Hz, H-3e).


(C-5), 95,1 (C-6), 167,9 (C-7), 94,2 (C-8), 164,1 (C-9), 103,1 (C-10), 138,4 (C-1′),

126,1 (C-2′ và C-6′), 126,1 (C-3′ và C-5′), 128,8 (C-4′), 55,6 (7-OCH3).

❖ Chất TF4 (PKRE5 và PDWB2) (+) Catechin, [α]D + 15.5 (MeOH)

❖ PKRE5 (120 mg)

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 6,86 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′), 6,79 (1H, d,

J = 8,0 Hz, H-5′), 6,74 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 2,0 Hz, H-6′), 5,95 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-

6), 5,88 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), 4,59 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), 3,99 (1H, m, H-3),

2,87 (1H, dd, J = 16,0 Hz, 5,5 Hz, H-4a), 2,53 (1H, dd, J = 16,0 Hz, 7,5 Hz, H-4b).

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δC 82,9 (C-2), 68,8 (C-3), 28,5 (C-4), 157,6

(C-5), 96,3 (C-6), 157,8 (C-7), 95,5 (C-8), 156,9 (C-9), 100,9 (C-10), 132,2 (C-1′),

115,3 (C-2′), 146,2 (C-3′/C-4′), 116,1 (C-5′), 120,1 (C-6′).

❖ PDWB2: 1HNMR (CD3OD) (25 mg)

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 6,86 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,78 (1H, d,

J = 8,0 Hz, H-5′), 6,74 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 1,5 Hz, H-6′), 5,95 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-

6), 5,88 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-8), 4,59 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-2), 3,99 (1H, m, H-3),

2,87 (1H, dd, J = 16,0 Hz, 5,0 Hz, H-4a), 2,53 (1H, dd, J = 16,0 Hz, 8,5 Hz, H-4b).

❖ Chất TF5 (PDWE6) Kaempferol

Dạng bột màu vàng, mp 276-278 0C. ESI-MS: m/z 287,1 [M+H]+

63

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7,88 (2H, d, J = 9,0 Hz , H-2′/H-6′), 6,96

(2H, d, J = 9,0 Hz , H-3′/H-5′), 6,48 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8), 6,24 (1H, d, J = 2,0 Hz,

H-6).


(C-5), 100,1 (C-6), 166,1 (C-7), 95,1 (C-8), 163,1 (C-9), 103,9 (C-10), 123,2 (C-1′),

129,4 (C-2′ và C-6′), 117,1 (C-3′ và C-5′), 162,7 (C-4′).

❖ Chất TF7 (PDLE7) Kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside

Bột màu vàng, 300 mg;

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): (Bảng 3.7)

❖ Chất TP1 (PDWE5) Dihydropinosylvin

Dạng dầu, không màu, 110 mg, ESI-MS: m/z 215,1 [M+H]+, CTPT: C14H14O2

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7,21-7,25 (2H, m, H-3′/H-5′), 7,15-7,16 (1H,

m, H-4′), 7,11-7,14 (2H, m, H-2′/H-6′), 6,22 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2/H-6), 6,18 (1H,

brs, H-4), 2,79-2,82 (2H-8, m), 2,71-2,74 (2H-7, m).


(C-2), 156,5 (C-3), 100,6 (C-4), 156,5 (C-5), 108,2 (C-6), 141,6 (C-1′), 128,4 (C-2′

và C-6′), 128,3 (C-3′ và C-5′), 125,9 (C-4′).

❖ Chất TP2 (PDWE11 và PDLN8) Dihydropinosylvin 5-methyl ether,

Dạng dầu không màu; mp 51 0C

▪ PDWE11 (600 mg)


m, H-4′, H-2′/H-6′), 6,30 (1H, brs, H-4), 6,24 (2H, t, J = 2,5 Hz, H-2/H-6), 3,69 (3H,

brs, O-CH3) 2,83-2,87 (2H-8, m), 2,77-2,80 (2H-7, m).


(C-2), 156,2 (C-3), 99,2 (C-4), 160,6 (C-5), 106,7 (C-6), 141,6 (C-1′), 128,4 (C-2′ và

C-6′), 128,3 (C-3′ và C-5′), 125,9 (C-4′), 55,2 (5-OCH3).

▪ PDLN8 (11 mg)

64


m, H-4′, H-2′/H-6′), 6,32 (1H, brs, H-4), 6,25 (2H, m, H-2/H-6), 3,74 (3H, brs, O-

CH3) 2,88-2,91 (2H-8, m), 2,81-2,85 (2H-7, m).


(C-2), 156,6 (C-3), 99,1 (C-4), 160,9 (C-5), 106,8 (C-6), 141,7 (C-1′), 128,4 (C-2′ và

C-6′), 128,3 (C-3′ và C-5′), 126,0 (C-4′), 55,3 (5-OCH3).

❖ Chất TP3 (PDWE12) 3-Hydroxy-5-methoxystilbene

Dạng rắn, màu vàng nhạt, mp 120 0C

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 7,52 (2H, d, 7,0 Hz, H-2′/H-6′), 7,39 (2H, t,

7,5 Hz, H-3′/H-5′), 7,28-7,32 (1H, m, H-4′), 7,08 (1H, d, 16.0 Hz, H-7), 7,08 (1H, d,

16,5 Hz, H-8), 6,70 (1H, brs, H-6), 6,66 (1H, brs, H-2), 6,41 (1H, t, 2,0 Hz, H-4),

3,84 (3H, brs, O-CH3).


(C-2), 156,8 (C-3), 101,3 (C-4), 160,9 (C-5), 104,9 (C-6), 136,9 (C-1′), 126,6 (C-2′

và C-6′), 128,6 (C-3′ và C-5′), 129,4 (C-4′), 55,4 (5-OCH3).

❖ TP5 (PDWB1) là hỗn hợp Resveratrol-3-O-β-D-glucoside và 3,5,4′-

Trihydroxystilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside

▪ Resveratrol-3-O-β-D-glucoside

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7,38 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H-6′), 7,04

(1H, d, J = 16,5 Hz, H-8), 6,88 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7), 6,81 (1H, brs, H-2), 6,79

(2H, d, J = 8,5 Hz, H3′/H5′), 6,64 (1H, brs, H-6), 6,48 (1H, brs, H-4), 4,92 (1H, d, J

= 7,0 Hz, H-1′′), 3,95 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 2.0 Hz, H-6′′a), 3,74 (1H, dd, J = 12,0

Hz, 5,5 Hz, H-6′′b), 3,40-3,52 (4H, m, H-2′′-H-5′′).


(C-4), 159,6 (C-5), 108,4 (C-6), 126,7 (C-7), 130,0 (C-8), 130,3 (C-1′), 128,9 (C-2′

và C-6′), 116,5 (C-3′ và C-5′), 158,5 (C-4′), glucose 102,4 (C-1′′), 78,2 (C-5′′), 78,1

(C-3′′), 75,0 (C-2′′), 71,5 (-4′′), 62,6 (C-6′′).

▪ Resveratroloside (tên khác 3,5,4′-trihydroxystilbene 4′-O-β-D-glucopyranoside)

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7,47 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H-6′), δH 7,10

65

(1H, J = 8,5 Hz, H3′/H5′), 7,02 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-8), 6,90 (1H, d, J = 16,5 Hz,

H-7), 6,49 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2 và H-6), 6,20 (1H, brs, H-4), 4,90 (1H, d, J = 7,0

Hz, H-1′′), 3,92 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 2,0 Hz, H-6′′a), 3,74 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 5,5

Hz, H-6′′b), 3,41-3,52 (4H, m, H-2′′-H-5′′).

13C-NMR (CD3OD, 125 MHz): δC 141,0 (C-1), 106,0 (C-2 và C-6), 159,7 (C-

3 và C-5), 104,1 (C-4), 128,6 (C-7), 129,9 (C-8), 133,2 (C-1′), 128,9 (C-2′ và C-6′),

117,9 (C-3′ và 5′), 159,6 (C-4′), glucose 102,3 (C-1′′), 78,2 (C-3′′), 78,1 (C-5′′), 75,0

(C-2′′), 71,4 (C-4′′), 62,5 (C-6′′).

❖ Chất TP6 (PDWB4) Vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside)

Chất rắn dạng bột không màu, 13 mg, mp 137 0C

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz (Bảng 3.8).

❖ Chất TL1 (PDWE3) (+) Lariciresinol

Chất rắn dạng bột, màu trắng, 482 mg, [α]D + 15.5 (MeOH), mp 168 0C, ESI-

MS m/z 361,1 [M+H]+, CTPT: C20H24O6

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 6,85 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 6,84 (1H, d, J

= 8,0 Hz, H-5′), 6,83 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6), 6,78 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 1,5 Hz, H-

6′), 6,67 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,66 (1H, d, J =1,5 Hz, H-2), 4,78 (1H, d, J = 6,5

Hz, H-7′), 4,04 (1H, dd, J = 8,5 Hz, 6,5 Hz, H-9a), 3,88 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 3,5 Hz,

H-9′a), 3,85 (3H, brs, 3-OCH3), 3,84 (3H, brs, 3′-OCH3), 3,75 (1H, m, H-9′b), 3,72

(1H, d, J = 6,5 Hz, H-9b), 2,89 (1H, dd, J = 14,0 Hz, 5,2 Hz, H-7a), 2,71 (1H, m, H-

8), 2,52 (1H, dd, J = 13,5 Hz, 11,0 Hz, H-7b), 2,40 (1H, m, H-8′).


(C-4), 114,5 (C-5), 121,2 (C-6), 33,3 (C-7), 42,4 (C-8), 72,9 (C-9), 134,8 (C-1′),

108,4 (C-2′), 146,7 (C-3′), 145,1 (C-4′), 114,3 (C-5′), 118,8 (C-6′), 82,9 (C-7′), 52,6

(C-8′), 60,8 (C-9′), 56,0 (3-OCH3), 55,9 (3′-OCH3).

❖ Chất TL3 (PDWB6 và PKRE12) Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside

▪ PDWB6: Chất rắn dạng bột, màu trắng, 13 mg.

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng 3.9).

▪ PKRE12: Chất rắn dạng bột, màu trắng, 15 mg

66

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7,16 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 7,08 (1H, s,

H-2), 6,97 (1H, dd, J = 8,0, H-6), 6,61 (1H, s, H-6′), 6,60 (1H, s, H-2′), 5,57 (1H, d,

J = 5,5 Hz, H-7), 3,83 (3H, s, 3-OCH3), 3,57 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-9′), 2,58 (2H, t, J

= 7,5 Hz, H-7′), 1,81 (2H, quintet, J = 6,5 Hz, H-8′).


(C-4), 118,1 (C-5), 119,4 (C-6), 88,2 (C-7), 55,9 (C-8), 62,5 (C-9), 136,9 (C-1′),

117,1 (C-2′), 141,9 (C-3′), 146,4 (C-4′), 129,5 (C-5′), 116,7 (C-6′), 32,7 (C-7′), 35,7

(C-8′), 62,3 (C-9′), 56,7 (3-OCH3); glucose 102,8 (C-1g), 74,9 (C-2g), 77,8 (C-3g),

71,3(C-4g), 78,1(C-5g), 65,2 (C-6g).

❖ Chất TS1 (PNWE3 và PDLN2) β-Sitosterol (292)

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 5,35 (1H, d, J = 5,2 Hz, H-6), 3,52 (1H, m,

H-3), 2,27 (2H, m), 1,01 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, d, J = 6,6 Hz, H-21), 0,84 (3H, t, J

= 7,5 Hz, H-29), 0,82 (3H, d, J = 6,9 Hz, H-27), 0,78 (3H, d, J = 6,9 Hz, H-26), 0,68

(3H,s, H-18).


4), 140,8 (C-5), 121,7 (C-6), 31,7 (C-7), 31,9 (C-8), 50,2 (C-9), 36,5 (C-10), 21,1 (C-

11), 39,8 (C-12), 42,3 (C-13), 56,8 (C-14), 24,3 (C-15), 28,3 (C-16), 56,1 (C-17),

11,9 (C-18), 19,8 (C-19), 36,16 (C-20), 18,8 (C-21), 34,0 (C-22), 26,1 (C-23), 45,9 (

C-24), 29,2 (C-25), 19,1 (C-26), 19,4 (C-27), 23,1 (C-28), 12,0 (C-29).

❖ Chất TS2 (PDLN4 và PNWE9) Daucosterol (293)

▪ PNWE9

1H-NMR (DMSO, 500 MHz): δH 5,33 (1H, brs , H-6), 4,24 (1H, d, J = 8,0 Hz

, H-1′), 3,67 (1H, d, J = 10,5 Hz, H-6′a), 3,47 (1H, m, H-6′b), 3,11 (1H, m, H-3,

overlap với DMSO), 0,99 (3H, brs, H-19), 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,86 (3H,

brs, H-27), 0,84 (3H, brs, H-27), 0,67 (3H, brs, H-18), các -OH khác của glucose

4.57-4.60 (3H, m, 2′-OH, 3′-OH, 4′-OH), 4,20 (6′-OH, brs).

13C-NMR (DMSO, 125 MHz): δC 36,6 (C-1), 33,2 (C-2), 76,7 (C-3), 38,2 (C-

4), 140,3 (C-5), 120,7 (C-6), 31,1 (C-7), 31,2 (C-8), 49,5 (C-9), 36,0 (C-10), 22,5 (C-

11), 41,6 (C-12), 41,6 (C-13), 56,0 (C-14), 23,5 (C-15), 29,0 (C-16), 55,3 (C-17),

11,5 (C-18), 19,2 (C-19), 35,2 (C-20), 18,3 (C-21), 27,4 (C-22), 45,1 (C-23), 31,2 (C-

24), 28,7 (C-25), 19,3 (C-26), 18,8 (C-27), 23,6 (C-28), 11,4 (C-29), glucose 100,7

(C-1′), 70,1 (C-2′), 76,9 (C-3′), 73,4 (C-4′), 76,4 (C-5′), 61,1 (C-6′).

67

▪ PDLN4

1H-NMR (DMSO, 500 MHz): δH 5,32 (1H, brs , H-6), 4,21 (1H, d, J = 7,5 Hz

, H-1′), 3,64 (1H, dd, J = 11,0 Hz, 4,5 Hz, H-6′a), 3,45 (1H, m, H-6′b), 3,11 (1H, m,

H-3), 0,96 (3H, brs, H-19), 0,90 (3H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 0,82 (3H, brs, H-27), 0,80

(3H, brs, H-27), 0,65 (3H, brs, H-18), các -OH khác của glucose 4,87 (3′-OH, brs),

4,85 (2′-OH, brs), 4,84 (4′-OH, brs), 4,40 (6′-OH, t, J = 5,5 Hz).

❖ Chất TT11 (PKRE2) 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid

Chất rắn màu vàng rất nhạt, 12 mg, mp 119 0C. 1H-NMR (CD3OD, 500 MHz)

và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng 3.10).

❖ Chất TF6 (PKRE8) 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside

Dạng bột màu vàng, 8 mg, [α]D = – 144 (MeOH), ESI-MS: m/z 467,2 [M+H]+,

CTPT: C22H26O11

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 6,98 (1H, d, J = 1,5 Hz, H-2′), 6,86 (1H, dd,

J = 8,0 Hz, 1,5 Hz, H-6′), 6,82 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,30 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-

8), 6,05 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-6), 4,84 (H-1′′, overlap với H2O), 4,64 (1H, d, J = 8,0

Hz, H-2), 4,05-4,01 (1H, m, H-3), 3,93 (1H, d, J = 11,5 Hz, H-6′′a), 3,85 (3H, s, 3′-

OCH3), 3,75 (1H, dd, J = 11,5 Hz, 4,5 Hz, H-6′′b), 3,48-3,43 (m, H-2′′- H-5′′), 3,09

(1H, dd, J = 16,5 Hz, 5,5 Hz, H-4a), 2,60 (1H, dd, J = 16,0 Hz, 8,5 Hz, H-4b).


(C-5), 98,1 (C-6), 156,7 (C-7), 97,0 (C-8), 158,1 (C-9), 103,5 (C-10), 131,9 (C-1′),

111,9 (C-2′), 148,9 (C-3′), 147,5 (C-4′), 116,0 (C-5′), 121,3 (C-6′), glucose 102,5 (C-

1′′), 74,9 (C-2′′), 78,1 (C-3′′), 71,3 (C-4′′), 78,2 (C-5′′), 62,6 (C-6′′), 56,4 (3′-OCH3).

❖ Chất TP4 (PKRE9) Resveratrol-3-O-β-D-glucoside

▪ PKRE9

Tinh thể hình kim màu vàng rất nhạt, 10 mg, mp 136 0C, ESI-MS m/z 391,1

[M+H]+ , CTPT: C20H22O8, Tên khác: (E) Piceid

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7,38 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H-6′), 7,03

(1H, d, J = 16,5 Hz, H-8), 6,87 (1H, d, J = 16,5 Hz, H-7), 6,81 (1H, brs, H-2), 6,79

(2H, d, J = 8,5 Hz, H3′/H5′), 6,64 (1H, brs, H-6), 6,48 (1H, brs, H-4), 4,92 (1H, d, J

68

= 7,0 Hz, H-1′′), 3,95 (1H, dd, J = 12,0 Hz, 2,0 Hz, H-6′′a), 3,74 (1H, dd, J = 12,0

Hz, 5,5 Hz, H-6′′b), 3,40-3,52 (4H, m, H-2′′-H-5′′).


(C-4), 159,5 (C-5), 108,4 (C-6), 126,7 (C-7), 130,0 (C-8), 130,3 (C-1′), 129,0 (C-2′

và C-6′), 116,5 (C-3′ và C-5′), 158,4 (C-4′), glucose 102,4 (C-1′′), 75,0 (C-2′′), 78,1

(C-3′′), 71,5 (-4′′), 78,2 (C-5′′), 62,6 (C-6′′).

❖ Chất TP7 (PKRE11) 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-

rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside

Chất rắn, màu trắng, 14 mg, [α]D – 90.0 (MeOH). 1H-NMR (CD3OD, 500

MHz) và 13C-NMR (CD3OD, 125 MHz) (Bảng 3.11).

❖ Chất TL2 (PKRE4) (+) Cedrusin

Chất rắn dạng bột, màu trắng, 15 mg, [α]D = + 4.8 (MeOH)

1H-NMR (CD3OD, 500 MHz): δH 7,00 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-2), 6,86 (1H, dd,

J = 8,0 Hz, 1,5 Hz, H-6), 6,79 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5), 6,62 (1H, s, H-6′), 6,59 (1H,

s, H-2′), 5,51 (1H, d, J = 6,0 Hz, H-7), 3,80 (3H, s, 3-OCH3), 3,58 (2H, t, J = 6,5 Hz,

H-9′), 3,47 (1H, q, J = 6,0 Hz, H-8), 2,58 (2H, t, J = 7,5 Hz, H-7′), 1,81 (2H, quintet,

J = 7,0 Hz, H-8′).


(C-4), 116,1 (C-5), 119,7 (C-6), 88,7 (C-7), 55,7 (C-8), 65,1 (C-9), 136,7 (C-1′),

117,0 (C-2′), 141,8 (C-3′), 146,6 (C-4′), 129,8 (C-5′), 116,7 (C-6′), 32,7 (C-7′), 35,8

(C-8′), 62,3 (C-9′), 56,4 (3-OCH3).

❖ Chất TT7 (PNWE2): Totarol (321)

Chất rắn dạng bột màu trắng, 33 mg, mp 128 0C

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 6,98 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-11), 6,49 (1H, d,

J = 8,5 Hz, H-12), 4,51 (1H, s, 13-OH), 3,27-3,30 (1H, m, H-15), 2,93 (1H, dd, J =

17,0, Hz, 6,5, H-7e), 2,71-2,78 (1H, m, H-7a), 1,35 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-16), 1,33

(3H, d, J = 7,0 Hz, H-17), 1,17 (3H, s, H-20), 0,94 (3H, s, H-18), 0,91 (3H, s, H-19).


4), 49,6 (C-5), 19,3 (C-6), 28,8 (C-7), 134,0 (C-8), 143,2 (C-9), 37,7 (C-10), 123,0

69

(C-11), 114,3 (C-12), 152,0 (C-13), 131,0 (C-14), 27,1 (C-15), 20,3 (C-16), 20,3 (C-

17), 33,2 (C-18), 21,6 (C-19), 25,2 (C-20).

❖ Chất TT8 (PNWE5) Totarol-19-carboxylic acid

Chất rắn dạng bột màu trắng, 9 mg, ESI-MS (positive) m/z 353.1 [M–2H+K]+,

ESI-MS (negative) m/z 315.1 [M–H]–

1H-NMR (CDCl3, 500 MHz): δH 6,99 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-11), 6,52 (1H, d,

J = 8,5 Hz, H-12), 3,25-3,31 (1H, m, H-15), 2,95 (1H, dd, J = 16,5 Hz, 4,5 Hz, H-7a)

2,62-2,69 (1H, m, H-7e), 1,34 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-16), 1,34 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-

17), 1,33 (3H, s, H-18), 1,12 (3H, s, H-20).


4), 52,1 (C-5), 21,1 (C-6), 30,0 (C-7), 134,3 (C-8), 141,0 (C-9), 38,5 (C-10), 124,1

(C-11), 114,6 (C-12), 152,1 (C-13), 130,9 (C-14), 27,3 (C-15), 20,3 (C-16), 20,4 (C-

17), 28,6 (C-18), 183,9 (C-19), 23,2 (C-20).

❖ Chất TT9 (PNWE4): Inumakiol D

Chất rắn màu vàng nhạt, 9 mg, mp 136 0C

1H-NMR (CDCl3 & MeOH, 500 MHz): δH 6,99 (1H, d, J = 8.5 Hz, H-11), 6,68

(1H, d, J = 8,5 Hz, H-12), 4,99 (1H, brs, H-7), 3,50-3,53 (1H, m, H-15), 1,97 (1H,

brd, J = 12,5 Hz, H-5) 1,42 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-16), 1,37 (3H, d, J = 7,0 Hz, H-17),

1,31 (3H, s, H-20), 1,07 (3H, s, H-19).

13C-NMR (CDCl3 & MeOH, 125 MHz): δC 40,1 (C-1), 20,4 (C-2), 37,7 (C-3),

43,5 (C-4), 45,4 (C-5), 31,2 (C-6), 65,5 (C-7), 134,2 (C-8), 140,4 (C-9), 38,9 (C-10),

124,2 (C-11), 117,1 (C-12), 154,4 (C-13), 133,4 (C-14), 28,1 (C-15), 20,6 (C-16),

20,7 (C-17), 28,6 (C-18), 181,1 (C-19), 22,5 (C-20).

❖ Chất TT10 (PNWE1): Macrophyllic acid

Chất rắn dạng bột màu vàng nhạt, 136 mg, IR (KBr) υmax cm-1: 3547 (OH),

3095 (=C–H thơm), 2954, 2875 (C–H no), 1700 (C=O/ acid), 1374-1458 (C=C vòng

thơm), 1249 (C–O/acid). HR-ESI-MS (MeOH) m/z 653,3813 [M+Na]+ (calc.

653,3818), bis-totarol-19-carboxylic acid. 1H-NMR (CDCl3, 500 MHz) và 13C-NMR

(CD3Cl3, 125 MHz) (Bảng 3.12).

70

Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1. Các chất được phân lập từ Thông đà lạt (Pinus dalatensis)

3.1.1. Chất TT1: Caryolane-1β,9β-diol

Tên khác (1R,2S,5R,8S,9S)-4,4,8-trimethyl tricyclo[6.3.1.02,5]dodecane-1,9-

diol, chất dạng dầu màu vàng rất nhạt. [α]D = + 0,7 (CHCl3), CTPT: C15H26O2

Phổ 13C-NMR và HSQC chỉ ra đây là một hợp chất có chứa 15 carbon với ba

carbon bậc 4, ba nhóm CH, sáu nhóm CH2 và ba nhóm CH3, trong đó có tín hiệu

carbon bậc 4 liên kết với oxygen ở δC 70,7 (C-1) và oxymethine ở δC 72,3 (C-9) cùng

với độ chuyển dịch của các nhóm methyl ở δC 20,8 (C-13), 26,6 (C-15) và 30,6 (C-

14).

Bảng 3.1. Số liệu phổ của TT1 và caryolane-1β,9β-diol, [CDCl3, δ (ppm), J (Hz)]

C TT1 Caryolane-1β,9β-diol

HSQC δC δH* δC

# δH##

1 C 70,7 - 70,7 -

2 CH 38,2 2,19-2,23, m 38,0 2,22, ddd, (12,0, 10,0,

8,5)

3 CH2 34,1 1,49-1,55, m 34,0 1,49, dd, (10,0, 9,0)

1,54, t, (10,0)

4 C 35,1 - 35,0 -

5 CH 44,0 1,89, m 43,8 1,89, ddd, (12,0, 9,0,

6,0)

6 CH2 20,5 1,37-1,40, m 1,52-1,55, m

20,3 1,39, m 1,54, m

7 CH2 35,5 1,15-1,19, m 1,40-1,43, m

35,3 1,15, m 1,42, m

8 C 39,4 - 39,3 -

9 CH 72,3 3,44, t, (3,5) 72,1 3,44, t, (3,0)

10 CH2 28,2 1,74-1,80, m 2,00-2,04, m

28,1 1,77, ddt, (15,0, 5,0, 3,0) 2,04, dddd, (15,0, 12,5,

5,5, 3,0)

11 CH2 33,5 1,46-1,55, m 1,63-1,67, m

33,3 1,51, m

1,44, td, (12,5, 5,0)

12 CH2 42,5 1,40-1,43 m 1,46-1,52, m

42,4 1,42, d 1,47, d

13 CH3 20,8 1,00, brs 20,8 1,00, brs

14 CH3 30,6 1,02, brs 30,5 1,02, brs

15 CH3 26,6 1,19, brs 26,7 0,93, brs * Số liệu được gán dựa trên dữ kiện phổ HSQC

71

δC # (125 MHz), δH

## (500 MHz) của caryolane-1β,9β-diol được ghi trong CDCl3

Phổ 1H-NMR với tín hiệu oxymethine tại δH 3,44 (1H, t, J = 3,5 Hz, H-9) cùng

với ba tín hiệu của các nhóm methyl ở δH 1,19 (3H, brs, H-15), 1,02 (3H, brs, H-14)

và 1,00 (3H, brs, H-13). Kết hợp các dữ liệu trên các phổ NMR giúp suy đoán đây là

một sesquiterpenoid khung caryolane có chứa hai nhóm -OH trong phân tử. So sánh

với số liệu trong tài liệu tham khảo [117] (Bảng 3.1) giúp xác định TT1 là caryolane-

1β,9β-diol, hợp chất này đã được phân lập tử vỏ quả của loài thực vật họ Đậu là

Sindora sumatrana bởi Tohru Kikuchi và các cộng sự vào năm 1994. Đây là lần đầu

tiên một hợp chất có khung caryolane được phân lập từ chi Pinus. Chất này cũng đã

được tách ra từ loài riềng nếp Alpinia galangal và thể hiện hoạt tính chống tăng sinh

trên các dòng tế bào ung thư HeLa, A-549, Hep-G2 và SMMC-7721 [118].

3.1.2. Hỗn hợp TT2

Hỗn hợp 16-Hydroxy-8(17),13-labdadien-15,16-olid-19-oic acid (TT2a) và

15-Hydroxypinusolidic acid (TT2b). Có chung CTPT: C20H28O5

Trên phổ 13C-NMR có nhiều cặp tín hiệu rất gần nhau theo tỷ lệ 2:3 cùng với

những tín hiệu có cường độ tăng lên (tín hiệu chung) chứng tỏ TT2 là hỗn hợp hai

đồng phân. Qua số lượng các tín hiệu đã thống kê được, dự đoán đây là hỗn hợp của

hai diterpenoid. Phổ HSQC chỉ ra hỗn hợp trên tổng cộng có 04 nhóm carbonyl ở δC

(171,5, 183,0) và (171,9, 183,0) cùng với 08 carbon olefin ở δC (171,5, 117,1, 147,3,

106,8) và (143,3, 138,6, 147,4, 106,8). Thêm vào đó, hỗn hợp trên còn có tổng cộng

02 oxymethine ở δC 99,3 và 97,3, 04 tín hiệu methine với δC (56,2, 55,6) và (56,2,

55,7) cùng 14 tín hiệu methylene no. Ngoài ra, còn có các tín hiệu methyl δC (29,0,

12,9) với δH tương ứng là (1,24, 0,60) và δC (29,0, 12,9) với δH tương ứng là (1,24,

0,61). Trên phổ 1H-NMR cũng có các cặp tín hiệu tương ứng như các tín hiệu broad

singlet ứng với các hydrogen của alkene ở δH (5,97, 5,48, 4,89, 4,50) và (5,97, 5,94.

72

4,88, 4,48). Các số liệu được gán tương ứng dựa trên dữ kiện của phổ HSQC được

trình bày trong Bảng 3.2.

Bảng 3.2. Số liệu gán phổ 1HNMR và 13CNMR của TT2a và TT2b,

[CDCl3, δ (ppm), J (Hz)]

C

Hỗn hợp TT2

Chất TT2a Chất TT2b

HSQC δC δH* HMBC HSQC δC δH

* HMBC

1 CH2 39,2

(39,218) a: 1.08-1.11 e: 1.82-1.85

CH2 39,2

(39,176) a: 1,08-1,11 e: 1,82-1,85

2 CH2 21,1 a: 1.57-1.59 e: 1.77-1.79

CH2 19,9 a: 1,53-1,57 e: 1,85-1,88

3 CH2 37,9

(37,920)

a: 1.02-1.05 e: 2.14 –

2.17 H-18 CH2

38,0 (37,952)

a: 1,02-1,05 e: 2,14 – 2,17

H-18

4 C 44,2 - C 44,2 -

5 CH 56,2

(56,202) 1.32-1.34 CH

56,2 (56,225)

1,32-1,34

6 CH2 26,0 a: 1,90-1,93 e: 1,98-1,99

CH2 26,0 a: 1,90-1,93 e: 1,98-1,99

7 CH2 38,6 a: 1,85-1,88 e: 2,41-2,43

CH2 38,6 a: 1,85-1,88 e: 2,41-2,43

8 C 147,3 -

H-7e, H-7a,

H-9, H-11

C 147,4 -

H-7e, H-7a, H-9, H-11

9 CH 55,6 1,62-1,64 H-7e, H-20

CH 55,7 1,62-1,64 H-7e, H-20

10 C 40,6 - H-20,

H-9, H-11

C 40,5 - H-20, H-9, H-11

11 CH2 21,8 1,53-1,57 1,73-1,76

H-14 CH2 21,8 1,53-1,57 1,73-1,76

H-12, H-9

12 CH2 26,8 2,24-2,26 2,55-2,57

CH2 24,3 2,08-2,12 2,46-2,48

H9

13 C 171,5 - H-14, H-16

C 138,6 - H-14, H-15, H-12

14 =CH 117,1 5,84 H-16 =CH 143,3 6,82 H-11

15 C 171,5 - H-14, H-16

CH 97,3 6,10 H-15

16 CH 99,2 5,97 H-14 C 171,9 - H-14, H-15

17 =CH2 106,8

(106,751) 4,89 4,50

H-7a, H-7e, H-9

=CH2 106,8

(106,795) 4,89 4,56

H-7a, H-7e, H-9

18 CH3 29,0 1,24 CH3 29,0 1,24

19 C 183,0 - H-18,

(H-5, H-3a)

C 183,0 - H-18, (H-5, H-3a)

20 CH3 12,9 0,60 H-5, H-

9, H-1a

CH3 12,9 0,61 H-5, H-9, H-1a

* Số liệu được gán dựa trên dữ kiện phổ HSQC; a: axial ; e: equatorial;

73

Kết hợp các dữ kiện phổ thu được với so sánh với các tài liệu tham khảo giúp

cho biết rằng hai chất trong hỗn hợp TT2 là các labdane diterpenoid với một chất có

kí hiệu TT2a được xác định là là 16-hydroxy-8(17),13-labdadien-15,16-olid-19-oic

acid [119]; chất còn lại TT2b được cho là phù hợp với 15-hydroxypinusolidic acid

[24]. Ngoài ra, qua phổ dữ kiện của HMBC còn xác định được về mặt lập thể một số

vị trí ở cả hai chất trên. Cụ thể là: thông qua 3JCH cho thấy tương tác mạnh H-5 và C-

20 chứng tỏ H-5 và C-20 ở vị trí anti (đều nằm trên liên kết axial) với nhau qua liên

kết C5–C10. Tương tác mạnh H-9 và C-20 chứng minh H-9 và C-20 ở vị trí anti (đều

nằm trên liên kết axial) với nhau qua liên kết C9–C10. Các tương tác H-5 với C-19

cùng với H-3a và C-19 cho thấy rằng H-5 và C-19 ở vị trí anti (đều nằm trên liên kết

axial) với nhau qua liên kết C5-C4 và H-3a và C-19 ở vị trí anti (đều nằm trên liên kết

axial) với nhau qua liên kết C3–C4. Các tương tác này được minh họa trên Hình 3.1.

Hình 3.1. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT2a và TT2b

3.1.3. Chất TT3: 15-Methoxypinusolidic acid

Chất dạng dầu, màu vàng nhạt, CTPT: C21H30O5

Phổ 1H-NMR, 13C-NMR và HSQC của TT3 cho thấy đây là một hợp chất có

21 carbon (2.C=O + 4.C; 1.CHalkene + 3.CH; 1.CH2.alkene + 7.CH2 và 2.CH3 +

1.OCH3) với một số tín hiệu đặc trưng của hợp chất diterpenoid khung labdane như

hai hydrogen olefin cuối mạch tại δH 4,89 (1H, s,) và 4,57 (1H, d, J = 6 Hz); hai nhóm

methyl tại δH 1,24 (3H, brs) và 0,60 (3H, brs).

74

Ngoài ra, kết hợp các tín hiệu δH 6,77 (1H, s), 5,73 (1H, d, J = 2,0 Hz), 3,57

(3H, brs) với các tín hiệu trên phổ HSQC và 1C-NMR δC 171,4 (C=O, C-16), 141,5

(C-14), 139,2 (C-13), 102,5 (C-15) giúp nhận định phân tử có chứa một vòng α,β-

không no-γ-lactone và một nhóm methoxy.

Bảng 3.3 . Số liệu phổ của TT3 và 15-methoxypinusolidic acid,


Vị trí TT3 15-Methoxypinusolidic acid

HSQC δC δH* δC

#

1 CH2 39,2 a: 1,08-1,11, m e: 1,82-1,84, m

39,2

2 CH2 19,9 a: 1,51-1,54, m e: 1,82-1,88, m

19,8

3 CH2 38,0 a: 1,02-1,06, m e: 2,14-2,17, m

37,9

4 C 44,1 - 44,2

5 CH 56,2 3,15-3,39, m 56,2

6 CH2 26,0 a: 1,81-1,86, m e: 1,98-2,00, m

26,0

7 CH2 38,6 a:1,85-1,88, m e: 2,41-2,43, m

38,6

8 C 147,2 - 147,2

9 CH 55,7 1,64, brs 55,7

10 C 40,5 - 40,5

11 CH2 21,8 1,58-1,61, m 1,70-1,74, m

21,7

12 CH2 24,6 2,11-2,15, m 2,43-2,48, m

24,5

13 C 139,2 - 139,2

14 =CH 141,5 6,77, s 141,5

15 CH 102,5 5,73, d, (2,0) 102,4

16 C 171,4 - 171,3

17 =CH2 106,8 4,89, brs

4,57, d, (6,0) 106,8

18 CH3 29,0 1,24, brs 29,0

19 C 182,5 - 182,9

20 CH3 12,8 0,60, brs 12,8

15-OCH3 CH3 57,0 3,57, brs 56,9 * Số liệu được gán dựa trên dữ kiện phổ HSQC

75

δC # (125 MHz) của 15-methoxypinusolic acid được ghi trong CDCl3 [120]

Qua phân tích trên cùng với việc so sánh với số liệu phổ của 15-

methoxypinusolidic acid đã được phân lập từ lá của loài Calocedrus microlepic var.

formosana [120] (Bảng 3.3) thấy hoàn toàn trùng khớp nên hợp chất TT3 chính là

15-methoxypinusolidic; một chất đã được sàng lọc hoạt tính và cho thấy có hoạt tính

kháng viêm tốt [121]. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được tách ra từ chi Pinus.

3.1.4. Chất TT4: Lambertianic acid

Chất rắn không màu, [α]D + 80,0 (MeOH), mp 127 0C, ESI-MS: m/z 315,2 [M–

H]+, 339,3 [M+Na]+, CTPT: C20H28O3

Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra TT4 có 20 carbon bao gồm hai nhóm methyl

(δC 29,0 và 12,8), tám nhóm methylene (trong đó có một nhóm methylene ứng với

alkene cuối mạch), năm nhóm methine và năm carbon bậc 4 (trong đó có một nhóm

C=O/acid ). Kết hợp phổ 13C-NMR với số liệu thu được từ phổ ESI-MS giúp dự đoán

TT4 là một diterpenoid khung labdane có CTPT là C20H28O3. Phổ HSQC và 1H-NMR

đã cho thấy rằng hợp chất này có chứa một vòng furan bị thế tại vị trí β; điều này

được minh chứng bởi những tín hiệu đặc trưng như: tín hiệu của hai H-α trong vòng

furan ở δH 7,34 (1H, m), 7,19 (1H, s) cùng với một tín hiệu H-β với hằng số tương tác

nhỏ đặc trưng cho vòng bé ở 6,25 (1H, d, J = 0,5 Hz). Ngoài ra, TT4 còn có tín hiệu

đặc trưng của một Δ8,17-labdane khi trên phổ cho thấy hai singlet tương ứng hydrogen

của alkene cuối mạch tại vị trí C-17 có độ chuyển dịch là δH 4,88 (1H, s, H-17a), 4,57

(1H, s, H-17b). Từ những phân tích trên có thể thấy TT4 chính là lambertianic acid

đã được công bố ở các tài liệu [122, 123]; dựa trên phổ HSQC các số liệu phổ đã

được được gán cụ thể cho từng vị trí của TT4 và được biểu thị trong Bảng 3.4

76

Bảng 3.4. Số liệu phổ của TT4 và lambertianic acid, [CDCl3, δ (ppm), J (Hz)]

Vị trí

TT4 lambertianic acid

HSQC δC δH*

HMBC (H→C)

δC#

1 CH2 39,0 e: 1,81-1,85, m a: 0,98-1,05, m

- C-2, C-3, C-20

39,1

2 CH2 19,9 e: 1.81-1.85, m a: 1,48-1,51, m

- C-1, C-3

19,9

3 CH2 37,8 e: 2,14, m

a: 0,98-1,05, m C-4, C-5

C-1, C-2, C-4, C-19 38,0

4 C 44,2 - - 44,1

5 CH 56,3 1,31, m C-6, C-20, C-19 56,2

6 CH2 26,0 e: 1,93-1,98, m a: 1,81-1,85, m

C-7, C-8, C-10 C-8

26,1

7 CH2 38,7 e: 2,41-2,43, m a: 1,81-1,85, m

C-5, C-6, C-8 C-5, C-8

38,7

8 C 147,9 - - 147,8

9 CH 55,2 1,62, m C-20, C-8, C-10, C-

11, C-17 55,3

10 C 40,4 - - 40,4

11 CH2 23,6 2,42-2,58, m 2,23-2,27, m

C-9, C-12, C-13, C-16

23,6

12 CH2 24,3 1,71-1,75, m 1,58-1,60, m

C-8, C-9, C-11 24,3

13 C 125,4 - - 125,5

14 =CH 110,9 6,25, d, (0,5) C-13, C-15, C-16 111,0

15 =CH 142,7 7,34, m C-13, C-14, C-16 142,7

16 =CH 138,7 7,19, brs C-13, C-14, C-15 138,7

17 =CH2 106,5 4,88, s 4,57, s

C-7, C-8, C-9 106,5

18 CH3 29,0 1,23, s C-2, C-3, C-4, C-5, 29,0

19 C 184,4 - 182,6

20 CH3 12,8 0,60, s C-1, C-5, C-10 12,8 * Số liệu được gán dựa trên dữ kiện phổ HSQC; a: axial ; e: equatorial

δC # (125 MHz) của lambertianic acid được ghi trong CDCl3

Hình 3.2. Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT4

Phổ HMBC góp phần kiểm chứng cấu hình lập thể của TT4 tại các vị trí C-4,

C-5, C-10 và C-9 khi thể hiện: tương tác đáng kể của của H-5 với C-19 chứng tỏ

chúng đều nằm trên liên kết axial và anti với nhau qua liên kết C5–C4; tương tác đáng

kể của của H-5 với C-20 chứng tỏ chúng đều nằm trên liên kết axial và anti với nhau

77

qua liên kết C5–C10. tương tác đáng kể của của H-9 với C-20 chứng tỏ chúng đều nằm

trên liên kết axial và anti với nhau qua liên kết C9–C10. Một số tương tác HMBC quan

trọng của TT4 được mô tả ở Hình 3.2. Năm 2004, lambertianic acid cũng đã được

nhóm nghiên cứu của Jerzy W. Jaroszewski thử nghiệm in vitro và cho thấy chất này

có hoạt tính chống sốt rét với IC50 = 41,2± 4,0 µM [123]. Năm 2016, Hyo-Jeong Lee

và các cộng sự đã công bố rằng lambertianic acid có triển vọng trong điều trị ung thư

tuyến tiền liệt khi nó thể hiện khả năng chống tăng sinh trên các dòng tế bào LNCaP,

DU-145 và PC-3 theo cách kích hoạt các caspase 3, caspase 9, c-PARP và Bax; ức

chế Bcl-2 và gia tăng số lượng các protein ức chế khối u là p53, p21 và p27 để cảm

ứng đưa các tế bào này chết tự nhiên [124].

3.1.5. Chất TT5: 8(17), 13-ent-Labdadien-15→16-lactone-19-oic acid

Chất dạng dầu màu vàng nhạt, [α]D – 44.6 (MeOH), CTPT: C20H28O4

Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy TT5 là một labdane diterpenoid khi có 20

carbon bao gồm hai nhóm methyl (δC 29,0 và 12,8), 09 nhóm methylene (trong đó có

một nhóm methylene ứng với alkene cuối mạch với δC 106,8), 03 nhóm methine (δC

55,7, 56,3, 143,9) và 06 carbon bậc 4 (trong đó có hai nhóm C=O tại δC 174,4 và

183.2). Sự kết hợp các phổ NMR chỉ ra hợp chất có chứa một vòng α,β-không no-γ-

lactone qua các tín hiệu δH 7,26 (1H, s, H-14), 4,67 (2H, d, J = 1,5 Hz, H-15) và δC

134,9 (C-13), 143,9 (C-14), 70,1 (C-15), 174,4 (C-16). Ngoài ra, TT5 được cho có

cấu hình của một ent-labdane khi độ quay cực riêng của nó có giá trị âm ([α]D – 44,6).

Khi so sánh phổ của TT5 với 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid

[125] thì thấy hoàn toàn trùng khớp (Bảng 3.5). Vì vậy, hợp chất TT5 chính là

8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid, một chất được phân lập lần đầu

tiên từ loài thủy sinh Potamogeton pectinatus và chất này có khả năng tiêu diệt loài

78

vi tảo gây hại Raphidocelis subcapitata [125]. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được

tách ra từ chi Pinus.

Bảng 3.5. Số liệu phổ của chất TT5 và

8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid, [CDCl3, δ (ppm), J (Hz)]

Vị trí TT5 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid

DEPT δC δC#

1 CH2 39,2 39,2 (CH2)

2 CH2 19,9 19,9 (CH2)

3 CH2 37,9 37,9 (CH2)

4 C 44,2 44,3 (C)

5 CH 56,3 56,3 (CH)

6 CH2 26,0 26,0 (CH2)

7 CH2 38,6 38,6 (CH2)

8 C 147,4 147,4 (C)

9 CH 55,7 55,7 (CH)

10 C 40,5 40,5 (C)

11 CH2 21,9 21,9 (CH2)

12 CH2 24,7 24,7 (CH2)

13 C 134,9 134,9 (C)

14 =CH 143,9 143,8 (CH)

15 CH2 70,1 70,1 (CH2)

16 C=O 174,4 174,3 (C)

17 =CH2 106,8 106,8 (CH2)

18 CH3 29,0 29,0 (CH3)

19 C=O 183,2 183,2 (C)

20 CH3 12,8 12,8 (CH3)

δC# (125 MHz) của 13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid được ghi trong

CDCl3

3.1.6. Chất TT6: Isopimaric acid

Chất rắn không màu, CTPT C20H30O2

Phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra phân tử có 20 carbon trong đó bao gồm: 3.CH3

+ 8.CH2 + 4CH + 5C. Sự có mặt của một nhóm C=O của carboxylic acid được chứng

minh tại δC 185.4, 04 carbon thuộc vùng không no tại δC 109,3-150,3 còn lại là các

nguyên tử carbon thuộc vùng no (δC 15,3-52,0). Kết hợp các số liệu trên cộng với kết

quả biểu thị trên của phổ ESI-MS: m/z 303,2 [M+H]+ giúp biết được TT6 là một

79

diterpenoid có CTPT là C20H30O2. Từ đó cũng tính được TT6 có 03 vòng + 02 liên

kết π + 01 nhóm COOH. Thêm vào đó, trên phổ 1H-NMR và HSQC chỉ ra rằng có

chứa một nhóm vinyl liên kết với một carbon bậc 4 qua các số liệu về độ chuyển dịch

và tương tác của ba hydrogen δH 5,80 (1H, dd, J = 17,5 Hz, 11,0 Hz), 4,92 (1H, d, J

= 17,0 Hz), 4,86 (1H, d, J = 10,0 Hz) tương ứng với hai carbon có δC lần lượt là 150,3

và 109,3. Như vậy, có thể dự đoán rằng TT6 là một pimarane diterpenoid có cấu tạo

giống với isopimaric acid với số liệu phổ được công bố ở tài liệu [126]. Qua đó cùng

với phổ HSQC có thể gán các số liệu về độ chuyển dịch hóa học của carbon với

hydrogen tương ứng trong phân tử TT6. Phổ 1H1H-COSY cho thấy hydrogen olefin

δH 5,32 (d, J = 4.0 Hz) chỉ có tương tác với một hydrogen tại vị trí có δH 2,03 (m)/δC

25,2 (C-6) giúp khẳng định vị trí liên kết đôi là ở C7=C8. Trên Hình 3.3 biểu thị một

số tương tác đáng chú ý trên HMBC cho thấy tương tác đáng kể của của H-5 với C-

19 chứng tỏ chúng đều nằm trên liên kết axial và anti với nhau qua liên kết C5–C4;

tương tác đáng kể của của H-5 với C-20 chứng tỏ chúng đều nằm trên liên kết axial

và anti với nhau qua liên kết C5–C10. Phổ NOESY cho thấy tương tác cả H-19 với H-

20 chứng tỏ chúng ở gần nhau về mặt không gian (hai nhóm methyl chứa chúng đều

nằm trên liên kết axial).

Hình 3.3. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT6

Qua tất cả sự so sánh cũng như những phân tích ở trên có thể khẳng định rằng

TT6 chính là isopimaric acid; đây là một chất có khả năng kháng khuẩn tốt và phổ

kháng khuẩn tương đối rộng, ức chế sự phát triển của khuẩn E. coli và một số chủng

Gram (+) như S.aureus, S.aureus kháng methicillin, S. epidermidis và E. faecalis

[127].

3.1.7. Chất TT12: 3β-Hydroxy-14-serraten-21-one

80

Chất rắn dạng bột, màu trắng, mp 247 0C, CTPT C30H48O2

Kết hợp các phổ NMR cho thấy TT12 có 30 carbon (7.CH3 + 10.CH2 + 6.CH

+ 7.C). Vùng trường thấp xuất hiện một tín hiệu của C=O/ketone ở δC 217; hai tín

hiệu carbon không no tại δC 122,0 (=CH, δH 5,38) và 138,3 (C). Còn lại ở vùng no là

tín hiệu của hai mươi bảy carbon, trong đó có một CH có độ chuyển dịch lớn δC 78,8

chứng tỏ nhóm methine này liên kết với một nhóm thế có độ âm điện lớn (nhóm -

OH). Qua các phân tích trên có thể biết rằng TT12 là một triterpenoid có CTPT

C30H48O2, phân tử có một nhóm C=O, một liên kết đôi C=C và năm vòng. Các tín

hiệu phổ đặc trưng của TT12 giống với những mô tả ở tài liệu tham khảo [128] về

hợp chất 3β-methoxy-14-serraten-21-one.

Bảng 3.6 biểu thị sự gán số liệu phổ cho từng vị trí carbon của TT12, quá trình

được thực hiện dựa vào phổ HSQC cũng như đối chiếu với hợp chất 3α-methoxy-14-

serraten-21-one (429) và 3β-methoxy-14-serraten-21β-ol (430) ở trong tài liệu [129].

Trong đó, nhóm -OH tại vị trí C-3 của TT12 được gán cho nằm ở vị trí β (thuộc liên

kết equatorial) bởi vì tín hiệu H-3 tại δH 3,19 là một doublet kép với các hằng số

tương tác lớn và nhỏ lần lượt là 11.5 Hz và 4.5 Hz chứng tỏ hydrogen này phải nằm

81

trên liên kết axial. Như vậy, có thể khẳng định hợp chất TT12 tách được chính là 3β-

hydroxy-14-serraten-21-one.

Bảng 3.6 . Số liệu phổ của TT12 so với 429 và 430,[CDCl3, δ (ppm), J (Hz)]

C TT12 429 430

HSQC δC δH* δC

# δC#

1 CH2 38,6 e: 1,73-1,75, m a: 0,94-0,96, m

33,5 38,6

2 CH2 27,5 e:1,60-1,66, m a 1,53-1,59, m

20,2 22,4

3 CH 78,8 a: 3,19, dd, (11,5, 4,5)

85,8 88,6

4 C 38,2 - 38,0 39,0

5 CH 51,2 a: 1,53-1,64, m 51,1 56,4

6 CH2 18,9 e: 1,46-1,53, m a: 1,42-1,45, m

18,7 18,9

7 CH2 45,1 e: 1,40-1,42, m a: 1,19-1,20, m

44,7 45,3

8 C 37,1 - 37,3 37,2

9 CH 62,7 0,80, s 62,2 63,0

10 C 39,0 - 38,4 38,3

11 CH2 25,5 e: 1,68-1,73, m a: 1,11-1,14, m

25,4 25,3

12 CH2 27,2 e: 1,99-2,01, m

a: 1,11-1,17 27,1 27,3

13 CH 56,5 1,81, m 56,6 56,9

14 C 138,3 - 138,5 138,6

15 =CH 122,0 5,38, s 121,8 122,1

16 CH2 24,5 2,03-2,05, m 24,4 24,1

17 CH 55,7 0,77, s 51,2 43,4

18 C 36,2 - 36,2 36,0

19 CH2 34,8 e: 2,75, td (14,5, 5,0)

a: 2,26-2,27, m 34,8 31,3

20 CH2 38,4 e: 2,14-2,18, m a: 1,48-1,53, m

38,1 25,5

21 C 217,0 - 217,1 76,3 (CH)

22 C 47,7 - 47,7 37,5

23 CH3 28,1 0,97 (3H, brs) 28,5 28,2

24 CH3 15,4 0,77 (3H, brs) 22,5 16,2

25 CH3 15,7 0,80 (3H, brs) 15,7 15,8

26 CH3 19,8 0,83 (3H, brs) 19,9 19,8

27 CH2 55,9 e: 2,23-2,25, m a: 1,73-1,75, m

55,9 56,4

28 CH3 12,9 0,92 (3H, brs) 12,9 13,3

29 CH3 24,5 1,04 (3H, brs) 24,4 21,8

30 CH3 21,6 1,09 (3H, brs) 21,6 27,8

3-OCH3 - - - 57,1 57,5 * Các số liệu được gán dựa trên phổ HSQC; e: equatorial ; a: axial

δC # (125 MHz) của 429 và 430 được ghi trong CDCl3

3.1.8. Chất TF1: Pinocembrin

82

Chất TF1 được phân lập dưới dạng tinh thể hình kim, không màu, mp 192-

193 0C. Phổ khối ESI-MS cho m/z 257,0 [M+H]+, kết hợp với các số liệu của phổ

NMR giúp nhận định CTPT của TF1 là C15H12O4

Từ các dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của TF1 cho thấy phân tử chất này có

bộ khung 15 carbon đặc trưng của khung flavanone, bao gồm: 08 nhóm methine,

trong đó có một oxymethine ở δC 79,2 (C-2) và bảy nhóm CH nhân thơm tại δC 95,5-

138,4. Sáu tín hiệu carbon bậc 4 trong đó có một nhóm carbonyl cho tín hiệu ở 195,7

(C-4), năm tín hiệu carbon bậc 4 còn lại thuộc nhân thơm benzene với δC 103,1-169,5.

Trên phổ 1H-NMR, ở vùng thơm thấy xuất hiện tín hiệu của bảy hydrogen của

hai vòng A và B. Cụ thể, multiplet ở δH 7,39-7,47 với độ rộng của tích phân tương

ứng với năm carbon (C-2′ → C-6′) của vòng B; hai tín hiệu broad singlet lần lượt tại

δH 6,01 và 6,02 chứng tỏ hai hydrogen của vòng A ở vị trí meta với nhau. Như vậy,

hai nhóm thế (-OH) ở vòng A cũng sẽ ở vị trí meta với nhau. Cặp tín hiệu singlet ở

δH 12,03 và 7,07 chứng tỏ hai nhóm -OH ở vị trí C-5 và C-7 tương ứng; sự bất thường

ở vị trí C-5 khi có hydrogen của nhóm -OH bị chuyển dịch mạnh về phía trường thấp

được giải thích là do nó tạo liên kết hydrogen nội phân tử với nhóm carbonyl (C-4).

Ngoài ra, ở vùng trường thấp còn xuất hiện tín hiệu của một hydrogen của nhóm

oxymethine tại δH 5,44 với một doublet kép (dd, J = 13.0 Hz và 3.5 Hz) rất đặc trưng

cho cấu trúc khung flavanone của hợp chất TF1.

So sánh các số liệu phổ của TF1 với các số liệu trong công bố vào năm 2012

của Liang Jing Yu và các cộng sự [130], cho phép khẳng định TF1 là pinocembrin.

Đây là một flavonoid tương đối phổ biến trong tự nhiên, không những nó có nhiều

hoạt tính như kháng nấm, kháng khuẩn, kháng các khối u, bảo vệ tim mạch, chống

oxi hóa tốt mà đây còn là một chất tiềm năng trong nghiên cứu các loại thuốc điều trị

thiếu máu não, bệnh thoái hóa thần kinh, bệnh tim mạch và xơ vữa động mạch [131].

3.1.9. Chất TF2: Chrysin

83

Hợp chất TF2 thu được dưới dạng bột màu vàng, mp 284-286 0C. Phổ khối

ESI-MS cho peak m/z 255,0 [M+H]+ giúp dự đoán TF2 có CTPT là C15H10O4. Từ các

dữ liệu phổ 13C-NMR và DEPT của TF2 có nhiều điểm tương tự như của TF1. Cụ

thể là, trên phổ cho thấy 08 nhóm methine trong đó có 07 nhóm CH nhân thơm ở độ

chuyển dịch δC 94,6-129,2 và một nhóm CH olefin tại δC 132,0; 07 carbon bậc 4 trong

đó có một tín hiệu nhóm carbonyl (C-4) ở δC 181,9 và một carbon bậc 4 của oxygen-

alkenyl ở δC 158,3. Trên phổ 1H-NMR cũng phù hợp với dữ kiện phổ 13C-NMR, ở

vùng thơm cũng thấy xuất hiện tín hiệu tương ứng với 07 hydrogen của hai vòng A

và B. Cụ thể, multiplet ở δH 7,52-7,55 với độ rộng tích phân tương ứng với ba

hydrogen (H-3′, H-4′, H-5′) còn doublet kép ở δH 7,90 (dd, J = 7,9 Hz, 1,0 Hz) tương

ứng với hai hydrogen H-2′ và H-6′ ở vòng B; điều này cũng chứng tỏ rằng vòng B

không có nhóm thế. Hai tín hiệu doublet với hằng số tương tác J = 2,0 Hz lần lượt

tại δH 6,30 và 6,47 chứng tỏ hai hydrogen của vòng A ở vị trí meta với nhau. Tất cả

điều này giúp nhận định TF2 là một flavonnoid khung flavone; trong đó sự có mặt

của hai nhóm -OH ở vị trí C-5 và C-7 của vòng A được nhận biết không những dựa

trên tín hiệu của hai hydrogen meta của vòng A mà còn được chứng minh khi phổ

1H-NMR xuất hiện tín hiệu singlet ở δH 12,75 của -OH tại C-5 rất đặc trưng cho nhóm

hydroxyl có liên kết cầu hydro nội phân tử với C=O ở hợp chất flavonoid.

So sánh các số liệu phổ thu được với số liệu ở những tài liệu đối chiếu [132,

133] và với số liệu phổ của TF1, có thể kết luận rằng hợp chất TF2 là chrysin, đây

cũng là một flavonoid đã được tìm thấy ở nhiều loài thực vật. Chrysin đã được chứng

tỏ là chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng viêm, hạ huyết áp, chóng dị ứng, chống

tan máu và chống oxi hóa tốt [134], tuy nhiên do khả năng hấp thu và độ tan trong

nước kém nên việc sử dụng chất này trong dược phẩm là còn hạn chế [135].

3.1.10. Chất TF3: Pinostrobin

84

Hợp chất TF3 thu được dưới dạng chất rắn không màu, mp 112-113 0C. Dữ

liệu các phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT của TF3 tương tự phổ của TF1 giúp dự

đoán đây cũng là một flavanone. Sự giống nhau này cụ thể như sau: 07 hydrogen

thơm δH 6,05-7,41 với cặp doublet ở δH 6,05 và 6,06 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 2,0 Hz)

cho thấy hai hydrogen này ở vị trí meta với nhau (H-6/H-8); cụm ba tín hiệu doublet

của doublet ở δH 3,06 (dd, J = 17,0 Hz, 13,0 Hz, H-3a), δH 2,80 (dd, J = 17,0 Hz và

3,0 Hz, H-3e) và δH 5,40 (dd, J = 13,0 Hz, 3,0 Hz, H-2) là các tín hiệu của hydrogen

được xem là vân tay nhận dạng của các hợp chất thuộc khung flavanone. Điều này

càng được củng cố khi ở phổ 13C-NMR cũng thấy được tín hiệu của 08 nhóm methine,

trong đó có một oxymethine ở δC 79,2 (C-2) và 07 nhóm CH nhân thơm δC 94,2-

128,8. TF3 cũng có một nhóm hydroxyl tại vị trí C-5 khi ở phía trường thấp trên phổ

1H-NMR xuất hiện tín hiệu singlet ở δH 12,01 đặc trưng cho nhóm OH có liên kết cầu

hydro nội phân tử (nếu nhóm -OH gắn ở C-7 thì tín hiệu này sẽ là singlet rộng tù và

ở phía trường cao hơn). Điểm khác nhau duy nhất ở các phổ của TF3 với TF1 là

trong phổ 1H-NMR ở TF3 không thấy có tín hiệu tương ứng của 7-OH, thay vào đó

xuất hiện một singlet ứng với ba hydrogen của nhóm -OCH3 ở δH 3,79 và δC 55,6;

điều này chứng tỏ TF3 có một nhóm thế methoxy ở vị trí C-7. Từ những phân tích

trên cùng việc đối chiếu với số liệu phổ ở tài liệu tham khảo [136] giúp kết luận rằng

hợp chất TF3 là pinostrobin. Đây là một flavonoid có hoạt tính lý thú như chống oxi

hóa, kháng một số loại ung thư và có thể chữa vết thương do rắn cắn, chữa viêm loét

cũng như một số bệnh dạ dày, đường ruột, vv... và cũng đã được Kevin J. Hodgetts

tổng hợp thành công bằng con đường hóa học vào năm 2001 [136, 137, 138].

3.1.11. Chất TF4: (+) Catechin

Phô 13C-NMR cua chất TF4 co tin hiêu cua 15 nguyên tư carbon vơi nhưng

đăc trưng cua khung flavan-3-ol gôm: 07 tin hiêu cua carbon bâc 4 ở C 157,8-

132,2, cùng với 07 tin hiêu cua nhóm methine trong đo 05 tin hiêu cua năm methine

85

nhân thơm ở C 120,0-95,5 va 02 tin hiêu cua hai nhom oxymethine (C-2, C-3) ơ C

82,6 và 68,8, một tin hiêu cua nhom methylene (C-4) ơ C 28,5. Khung flavan-3-ol

cua hợp chất TF4 con đươc thây ro qua cac tin hiêu trên phô 1H-NMR gôm: môt

doublet ơ H 4,59 (J = 7,5 Hz, H-2), hai doublet kép ơ H 2,87 (J = 16,0, 5,5 Hz, H-

4a) va H 2,53 (J = 16,0, 7,5 Hz, H-4b), môt multiplet ơ H 3,99 (H-3) va 05 hydrogen

thơm. Các hydrogen thơm được thấy rõ qua cặp doublet ơ H 5,95 (1H) va 5,88 (1H)

có hằng số tương tác J = 2,5 Hz cho thấy hai hydrogen này ở vị trí meta (H-6 va H-

8) với nhau, do đó vòng A có hai nhóm thế ở C-5 và C-7; cac tín hiệu doublet ơ H

6,79 (J = 8,0 Hz; H-5′), 6,86 (J = 2,0 Hz, H-2′) va doublet kép ơ H 6,74 (J = 8,0, 2,0

Hz, H-6′) cho thấy vòng B có hai nhóm thế ở C-3′ và C-4′. Qua phân tich cac dư kiên

phô va so sanh vơi số liêu đa công bô [139], cấu trúc của chất TF4 đươc xac đinh la

catechin. Đây là một chất phổ biến trong tự nhiên, có nhiều trong trà xanh và có nhiều

công dụng có lợi cho sức khỏe như ngăn ngừa các bệnh như ung thư, tim mạch; đặc

biệt là catechin đã được chứng minh có khả năng làm hạ huyết áp hiệu quả [140].

3.1.12. Chất TF5: Kaempferol

Chất TF5 là dạng bột màu vàng, mp 276-278 0C. Phổ ESI-MS cho peak ion

giả phân tử tại m/z 287,1 [M+H]+. Phổ 13C-NMR và DEPT của TF5 cho tín hiệu của

15 carbon trong đó có 09 carbon bậc 4, và 06 nhóm CH. Tất cả các tín hiệu này đều

nằm ở vùng trường thấp (C 95,1-183,7) thuộc dãy của nhóm carbonyl (C 183,7),

vòng thơm và các alkenyl giúp nhận định TF5 là một flavonoid có CTPT là C15H10O6.

Điều này được làm sáng tỏ thêm khi trên phổ 1H-NMR cho thấy sự tương tác yếu của

86

hai hydrogen ở vị trí meta với nhau tại H 6,48 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8) và 6,24 (1H,

d, J = 2,0 Hz, H-6). Thêm vào đó, bốn hydrogen CH còn lại cho hai cặp tín hiệu trong

vùng thơm ở vị trí ortho của nhau với độ chuyển dịch H 7,88 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-

2′/H-6′), 6,96 (2H, d, J = 9,0 Hz, H-3′/H-5′) chứng tỏ rằng mỗi tín hiệu ứng với hai

hydrogen nằm đối xứng với nhau, hay nói cách khác vòng B phải có một nhóm thế ở

vị trí C-4′. Ngoài ra, khi so sánh TF5 với TF2 (chrysin) thì tín hiệu nhóm CH ở C-3

(ứng với C 105,0 và H 0,66, s) không còn mà thay vào đó là một tín hiệu carbon bậc

4 ở C 130,7; điều này chứng tỏ TF5 có một nhóm thế -OH ở C-3. So sánh các số liệu

phổ NMR của TF5 với các số liệu phổ của kaempferol ở các tài liệu tham khảo [141,

142] cho thấy chúng giống nhau, do đó có thể kết luận rằng hợp chất TF5 tách được

chính là kaempferol. Đây là một flavonol phổ biến trong thiên nhiên và đã được chứng

minh có nhiều tác dụng dược lý như có khả năng dập tắt các gốc tự do như HO. và

ROO., tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch, chống viêm,

chống dị ứng, ức chế sự hình thành và phát triển các khối u trên chuột, ức chế enzyme

cyclooxygenase và quá trình peroxide hóa lipid [143, 144, 145, 146, 147].

3.1.13. Chất TF7: Kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside

Chất TF7 thu được dưới dạng bột màu vàng. Qua số liệu trên các phổ NMR

cho thấy hợp chất có chứa nhiều vòng thơm và có gắn thêm một phân tử đường. Phổ

13C-NMR và HSQC chỉ ra hợp chất có 39 carbon trong đó có một nhóm methylene

(của phần đường với C 64,2, C-6g), 23 nhóm methine và 15 carbon bậc 4. Trên phổ,

87

các nhóm methine của phần đường hexose đứng tách biệt và dễ dàng nhận thấy với

C 104,0 (C-1g), 78,7 (C-3g), 75,6 (C-5g), 74,1 (C-2g) và 70,1 (C-4g). Ngoài ra, tín

hiệu của 03 nhóm được cho là của C=O liên hợp với liên kết đôi cũng được nhận biết

tại các vị trí C 179,1, 169,0 và 168,8. Trên phổ 1HNMR xuất hiện hai singlet tù tại

H 6.26 và 6.13 tương ứng với hai hydrogen tại vị trí meta của nhau giúp dự đoán đây

là H-6 và H-8 ở vòng A của một khung flavonoid. Ngoài ra, 06 tín hiệu doublet với

tổng độ rộng tích phân bằng 12 và hằng số tương tác từ 8,5-9,5 Hz giúp xác định

trong phân TF7 có ba vòng thơm benzene bị thế ở các vị trí 1,4; và một trong ba vòng

thơm này là vòng B của một khung flavonoid. Sau cùng là sự xuất hiện của 02 cặp

hydrogen của trans-alkene tại các vị trí H 7,69, 7,41, 6,42 và 6,09 với các hằng số

tương tác đặc trưng đều xấp xỉ 16,0 Hz. Phần đường hexose cũng được xác định có

cấu hình β khi anomeric hydrogen tương ứng là một doublet tại H 5,39 với hằng số

tương tác là 8,0 Hz (hydrogen trên liên kết axial). Qua phân tích trên cùng với đối

chiếu với số liệu phổ của kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside trong tài liệu [148] và dựa vào phổ HSQC tiến hành gán cho từng vị

trí carbon tương ứng (Bảng 3.7), thấy có sự phù hợp. Do vậy có thể khẳng định rằng

TF7 chính là kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-glucopyranoside với

công thức phân tử C39H32O15.

Bảng 3.7. Số liệu phổ của TF7 và 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside, [CD3OD, δ (ppm), J (Hz)]

Vị trí TF7

3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-

coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside

HSQC δC δH * δC

#

2 Cq 159.1 - 159.3

3 Cq 135.2 - 135.1

4 Cq 179.1 - 179.3

5 Cq 162.7 - 163.0

6 CH 100.0 6.13, brs 100.0

7 Cq 165.7 - 166.0

8 CH 94.9 6.26, brs 94.8

9 Cq 158.1 - 158.4

88

10 Cq 105.5 - 105.6

1′ Cq 122.5 - 122.7

2′ CH 132.2 7.98, d, (8.5) 132.2

3′ CH 116.0 6.82, d, (9.0) 116.1

4′ Cq 161.4 - 161.6

5′ CH 116.0 6.82, d, (9.0) 116.1

6′ CH 132.2 7.98, d, (8.5) 132.2

1g CH 104.0 5.39, d, (8.0) 103.7

2g CH 74.1 3.76, t, (9.5) 74.1

3g CH 78.7 5.22, t, (9.5) 78.7

4g CH 70.1 3.63, m 70.2

5g CH 75.6 3.72, dd, (7.0, 2.0) 75.7

6g CH2 64.2 4.38, d, (11.0)

4.27, dd, (12.0, 7.0) 64.1

1′′ Cq 127.2 - 127.3

2′′ CH 131.1 7.45, d, (8.5) 131.2

3′′ CH 116.8 6.80, 1H, d, (8.5) 116.8

4′′ Cq 161.1 - 161.2

5′′ CH 116.8 6.80, d, (8.5) 116.8

6′′ CH 131.1 7.45, d, (8.5) 131.2

7′′ =CH 146.8 7.69, d, (16.0) (trans) 146.7

8′′ =CH 115.3 6.42, d, (16.0) (trans) 115.4

9′′ Cq 169.0 - 169.0

1′′′ Cq 127.0 - 127.1

2′′′ CH 131.1 7.27, d, (8.5) 131.2

3′′′ CH 116.7 6.82, d, (9.0) 116.8

4′′′ Cq 161.1 - 161.2

5′′′ CH 116.7 6.82, d, (9.0) 116.8

6′′′ CH 131.1 7.27, d, (8.5) 131.2

7′′′ =CH 146.6 7.41, d, (15.5) (trans) 146.6

8′′′ =CH 114.6 6.09, d, (16.0) (trans) 114.7

9′′′ Cq 169.0 - 168.7

* Các số liệu được gán dựa trên dữ kiện phổ HSQC

89

3.1.14. Chất TP1: Dihydropinosylvin

Chất TP1 thu được dưới dạng dầu không màu, phổ khối ESI-MS có peak ion

giả phân tử tại m/z 215,1 [M+H]+ phù hợp với CTPT: C14H14O2. Trên phổ 1H-NMR

vùng trường thấp cho thấy sự hiện diện của hai vòng thơm với tổng số hydrogen thơm

là 8; trong đó, một vòng thơm có dạng một nhóm thế khi có các tín hiệu ứng với năm

hydrogen thơm ở gần nhau tại các vị trí δH 7,21-7,25 (2H, m, H-3′/H-5′), 7,15-7,16

(1H, m, H-4′) và 7,11-7,14 (2H, m, H-2′/H-6′); vòng thơm còn lại là một benzene bị

thế ở các vị trí đối xứng 1,3,5 phù hợp với giá trị độ chuyển dịch của các hydrogen ở

vị trí meta của nhau với δH 6,22 (2H, d, J = 2,0 Hz, H-2/H-6) và 6,18 (1H, brs, H-4).

Sự hiện diện của nhóm -CH2–CH2- được minh chứng khi ở vùng no xuất hiện các tín

hiệu δH 2,80 (2H, m, H-8) và 2,73 (2H, m, H-7); những điều này giúp nhận biết TP1

có cấu trúc khung carbon dạng bibenzyl. Nhận định này càng được kiểm chứng khi

trên phổ 13C-NMR và DEPT chỉ ra hợp chất này có chứa 12 carbon thơm (8.CH và

4.C) cùng với 02 nhóm methylene tại δC 37,6 (C-7) và 37,3 (C-8) tương ứng. So sánh

những số liệu phổ thu được với các số liệu của chất dihydropinosylvin trong công bố

[149] thấy chúng giống nhau nên kết luận rằng TP1 chính là dihydropinosylvin.

3.1.15. Chất TP2: Dihydropinosylvin 5-methyl ether

Tên khác 3-O-methyldihydropinosylvin, dạng dầu không màu; mp 51 0C,

CTPT: C15H16O2

TP2 có các tín hiệu trên phổ NMR của gần giống với TP1. Kết hợp các tín

hiệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT cho thấy chất TP2 có 15 carbon; bao gồm

mười hai carbon thơm tương ứng với hai vòng benzene biệt lập (8.CH và 4.C); hai

methylene carbon tại δC 37,8 và 37,4 và một nhóm methoxy (δC 55,2 và δH 3,69, brs).

90

Một trong hai vòng thơm có dạng bị thế tại vị trí 1,3,5 được thể hiện rõ qua tín hiệu

của các hydrogen ở vị trí meta của nhau với hằng số tương tác yếu tại δH 6,30 (1H,

brs, H-4) và 6,24 (2H, t, J = 2,5 Hz, H-2/H-6). Vòng benzene còn lại thể hiện đầy đủ

các tín hiệu ứng với năm hydrogen δH 7,25-7,26 (2H, m, H-3′/H-5′) và 7,14-7,18 (3H,

m, H-4′, H-2′/H-6′). Qua đó có thể nói rằng TP2 là một dẫn xuất mono-methyl ether

của dihydropinosylvin. Sự phù hợp của các tín hiệu phổ tương ứng với từng vị trí của

TP2 với dihydropinosylvin 5-methyl ether ở các tài liệu [149, 150] và với

dihydropinosylvin giúp khẳng định rằng TP2 chính là dihydropinosylvin 5-methyl

ether, một hoạt chất có tính kháng nấm khá tốt [150].

3.1.16. Chất TP3: 3-Hydroxy-5-methoxystilbene

Tên khác 5-O-methylpinosylvin, dạng rắn, màu vàng nhạt, mp 120 0C, CTPT:

C15H14O2

Phổ 13C-NMR của TP3 cho thấy 15 carbon với 4.C, 10.CH và 1.CH3. Các tín

hiệu của mười hai carbon vòng thơm cùng với nhóm -OCH3 (δC 55,4) giống với các

tín hiệu tương ứng ở TP2; nhưng so với TP2 thì đã không còn thấy tín hiệu của nhóm

-CH2–CH2- nữa mà thay vào đó là tín hiệu của nhóm -CH=CH- với δC 127,7 và 128,2.

Cấu hình E của hai hydrogen alkenyl trên cũng được làm sáng tỏ khi tín hiệu trên phổ

1H-NMR thể hiện hai doublet tại δH 7,08 và 7,03 với hằng số tương tác lớn xấp xỉ

16,0 Hz. Những điều trên giúp nhận biết TP3 là dẫn xuất monohydroxy

monomethoxy của (E)–Stilbene. Hơn nữa, các số liệu trên các phổ NMR của TP3 là

phù hợp so với các số liệu tương ứng của 3-hydroxy-5-methoxystilbene trong tài liệu

[151], chứng tỏ TP3 chính là 3-hydroxy-5-methoxystilbene (hay tên khác là 5-O-

methylpinosylvin). Gần đây, năm 2015, đã có nghiên cứu khoa học chỉ ra rằng

pinosylvin (252) cùng với dẫn xuất 5-O-methylpinosylvin (249) có hoạt tính làm

giảm biểu hiện gene gây viêm và phản ứng gây viêm trong cơ thể [152].

3.1.17. Hỗn hợp TP5

91

TP5 thu được dưới dạng bột màu vàng rất nhạt là hỗn hợp của Resveratrol-3-O-

β-glucoside (TP4) và Resveratroloside (TP5a)

▪ Resveratroloside, (tên khác 3,5,4′-trihydroxystilbene 4′-O-β-D-glucopyrano-

side)

Trên các phổ NMR của TP5 thấy xuất hiện các tín hiệu tương ứng của chất

resveratrol-3-O-β-glucoside (TP4). Kiểm tra trên TLC thấy TP4 và TP5 hoàn toàn

trùng nhau trên các hệ dung môi triển khai: DCM:MeOH:H2O = 50:10:1 (Rf = 0,42)

hay toluene:acetone:HCOOH = 3:6:1 (Rf = 0,41); chúng đều hiện màu tím sau khi

phun thuốc thử rồi hơ nóng. Ngoài ra trên các phổ 13C-NMR của TP5 còn xuất hiện

thêm tín hiệu của 20 carbon nằm gần sát những vị trí tương ứng ứng của TP4 điều

này giúp dự đoán rằng TP5 là hỗn hợp của hai đồng phân vị trí nhóm thế, trong đó

có một chất là resveratrol-3-O-β-glucoside (TP4). Trên phổ 1H-NMR và HSQC, chất

còn lại (được kí hiệu TP5a) cũng cho thấy các tín hiệu của 07 hydrogen thơm của hai

vòng benzene, 02 hydrogen olefin và 06 tín hiệu của một đường hexose. Trong hai

vòng benzen thì một vòng (vòng A) cũng bị thế ba nhóm theo kiểu 1,3,5-trisubstituted

benzene khi ba hydrogen ở vị trí meta của nhau tương ứng với các tín hiệu δH 6,49

(2H, d, J = 2,0 Hz, H-2 và H-6) và 6,20 (1H, brs, H-4); vòng benzene còn lại (vòng

B) vị thế theo kiểu 1,4-trisubstituted benzene khi xuất hiện hai cặp tín hiệu của 02

cặp hydrogen ortho tương ứng tại δH 7,47 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H-6′), δH 7,10 (1H,

J = 8,5 Hz, H3′/H5′). Tín hiệu của hai trans-hydrogen olefin được thể hiện rất rõ tại

các δH 7,02 và 6,90 với hằng số tương tác lớn (16,5 Hz). Phần đường cũng được xác

định là tương ứng với glucopyranose và có cấu hình khi anomeric hydrogen H-1′′

được cho là nằm trên liên kết axial với một doublet có độ chuyển dịch δH 4,90 và

hằng số tương tác J = 7,0 Hz. Vì TP5a là một đồng phân vị trí nhóm thế resveratrol-

3-O-β-glucoside nên phần đường sẽ phải thế vào vị trí 4′ ở vòng B. Thật vậy, khi so

sánh với số liệu các phổ NMR hợp chất 3,5,4′-trihydroxystilbene 4′-O-β-D-

92

glucopyranoside (có tên thông thường là resveratroloside) được công bố ở tài liệu

[153] thì thấy rất trùng khớp. Như vậy, kết luận rằng hợp chất TP5a chính là

resveratroloside.

3.1.18. Chất TP6: Vanillic acid 4-(- β-D-glucopyranoside)

Chất rắn dạng bột không màu, mp 137 0C, CTPT : C14H18O9

Phổ 13C-NMR và HSQC cho thấy phân tử có tổng cộng 14 carbon trong đó

vùng thơm ở phía trường thấp nằm tách biệt với vùng no. Ở vùng thơm thấy có 06 tín

hiệu carbon của một vòng benzene (δC 114,6-150,8) trong khi đó vùng no cho thấy

TP6 có chứa đường hexose (δC 62,4-102,2) và một nhóm methoxy (δC 56,6; δH 3,92,

s). Ngoài ra, còn có sự hiện diện của một nhóm carbonyl (δC 173,0). Các số liệu trên

phổ 1H-NMR cho thấy vòng benzene của TP6 có dạng hệ ABX khi ba hydrogen còn

lại trong vòng cho những tín hiệu δH 7,65 (1H, s, H-2), 7,62 (1H, d, 8,5 Hz, H-6) và

7,19 (1H, d , 8,5 Hz, H-5). Sự xuất hiện của một nhóm methylene tại δC 62,4 giúp

biết rằng phần đường hexose trong TP6 tồn tại dưới dạng vòng sáu cạnh pyranose.

Cấu hình β của đường này cũng được khẳng định khi anomeric hydrogen (H-1′) biểu

hiện doublet tại δH 5,01 với hằng số tương tác là 7,0 Hz. Phổ HMBC cho thấy sự

tương tác mạnh của H-2 qua ba liên kết (3JCH) với những nguyên tử carbon C=O, C-

4 và C6. Ngoài ra còn thấy tương tác H-1′ với vòng thơm tại vị trí ứng với carbon bậc

4 có δC 150,8 (được gán cho C-4) chứng tỏ rằng phần đường liên kết với vòng thơm

tại vị trí C-4; thêm vào đó các hydrogen của nhóm methoxy có sự tương tác với carbon

bậc 4 có δC 150,0 (được gán cho C-3) của vòng thơm chứng tỏ nhóm methoxy này

liên kết với vòng thơm tại vị trí C-3. Phổ HBMC còn cung cấp thêm một thông tin

quan trọng để xác định phần đường chính là β-D-glucopyranose khi trong đó cho thấy

sự tương tác mạnh của H-2′ với C1′ và C3′ chứng tỏ H-2′ với 1′-OR và 3′-OH nằm ở

vị trí cis với nhau; tương tác mạnh của H-3′ với C2′ và C4′ chứng tỏ H-3′ với 2′-OH

93

và 4′-OH nằm ở vị trí cis với nhau; tương tác mạnh của H-4′ với C3′ và C5′ chứng tỏ

H-4′ với 3′-OH và 5′-CH2OH nằm ở vị trí cis với nhau [154].

Bảng 3.8. So sánh số liệu phổ của TP6 với chất 431 và vanillic acid 4-(-β-D-

glucopyranoside), [CD3OD, δ (ppm), J (Hz)]

Vị trí

TP6 Pseudolaroside B vanillic acid

4-(-β-D-glucopyranoside)

HSQC δC δH*

HMBC (H→C)

δC# δH

## δC#

1 C 130,0 - 127,0 - 126,1

2 CH 114,6 7,65, s C=O C-6 C-4

114,9 7,60, s 114,4

3 C 150,0 - 150,8 - 150,4

4 C 150,8 - 152,6 - 152,0

5 CH 116,4 7,19, d,

(8,5) C-1 C-3

116,8 7,20, d,

(8,5) 116,4

6 CH 124,3 7,62, d,

(8,5)

C-4 C-2 C=O

125,2 7,63, d,

(8,5) 124,7

1′ CH 102,2 5,01, d,

(7,0) C-4 100,5

5,35, d, (8,0)

102,0

2′ CH 74,8 3,55, m C-3′ C-1′

72,5 3,65-3,69,

m 74,8

3′ CH 77,8 3,51, t, (9,0)

C-2′ C-4′

73,4 4,15, t, (3,0) 77,9

4′ CH 71,3 3,44, t, (8,5)

C-3′ C-5′ C-6′

69,1 3,60, dd, (9,5, 3,0)

71,3

5′ CH 78,2 3,45, m C-4′ 76,4 3,85-3,87,

m 78,3

6′ CH2 62,4 3,89, m 3,62, m

C-4′ 63,3

3,65-3,69, m

3,85-3,87, m

62,4

C=O C 173,0 - 170,6 - 169,6

3-OCH3

CH3 56,6 3,92, s C-3 57,2 3,89, s 57,7

* Các số liệu được gán dựa trên dữ kiện phổ HSQC

δC # (125 MHz), δH

## (500 MHz), được ghi trong CD3OD

Từ những phân tích trên có thể đề xuất là TP6 phù hợp với cấu tạo của vanillic

acid 4-(-β-D-glucopyranoside). TP6 được đem so sánh với hợp chất tương tự là

pseudolaroside B (431) ở tài liệu [155], qua đó thấy các số liệu phổ của chúng chỉ có

khác biệt đáng chú ý ở tín hiệu tại vị trí C-3′ (Bảng 3.8), sự khác nhau này được giải

thích là trong khi H-3′ (δH 4,15, t, 3,0 Hz) ở pseudolaroside B nằm trên liên kết

equatorial thì ở TP6 thì H-3′(δH 3,51, t, 9,0 Hz) nằm trên liên kết axial. Chính vì thế

khẳng định rằng TP6 chính là vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside). Chất này lần

94

đầu tiên được tách ra từ loài Boreava orientalis vào năm 1995 [156], tuy nhiên đây

là lần đầu tiên nó được tìm thấy ở một loài thuộc họ Thông nói chung và chi Pinus

nói riêng.

Hình 3.4 . Các tương tác chính trên phổ HMBC của TP6

3.1.19. Chất TL1: (+) Lariciresinol

Chất rắn dạng bột, màu trắng, [α]D + 15.5 (MeOH), mp 168 0C, CTPT:

C20H24O6. Phổ 13C-NMR, DEPT và HSQC chỉ ra TL1 có 20 carbon bao gồm: 06

carbon bậc 4 (đều nằm ở vùng thơm, δC 132,3, 134,8, 144,0, 145,1, 146,6 và 146,7),

09 nhóm methine (δC 42,4, 52,6, 82,9, 108,4, 111,3, 114,3, 114,7, 118,8 và 121,2),

03 nhóm methylene (δC 33,3, 60,8 và 72,9) và 02 nhóm methoxy (δC 56,0 và 55,9).

Các tín hiệu trên cũng đã chỉ ra rằng TL1 có chứa 02 vòng thơm benzene (12.C thơm,

δC 108,4 – 146,7) từ đó giúp dự đoán rằng đây là một hợp chất lignan (hai đơn vị C6

– C3 + 2. -OCH3). Trên phổ 1H-NMR thể hiện rõ mỗi vòng benzene đều có dạng hệ

ABX với ba hydrogen thơm ở các vị trí số 2,5,6: δH 6,85 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-2′),

6,84 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5′), 6,78 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 1,5 Hz, H-6′), và 6,66 (1H,

d, J =1,5 Hz, H-2), 6,67 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5), 6,83 (1H, d, J = 7,5 Hz, H-6). Phổ

HMBC cho thấy các tương tác dị hạt nhân giữa hydrogen với những carbon ở gần

nhưng không liên kết trực tiếp với nhau đã cho thấy rằng: hai hydrogen H-7 (δH 2,52

và 2.89) tương tác với những carbon có δC 42,4 (C-8), 72,9 (C-9), 111,3 (C-2), 121,2

(C-6), 132,1 (C-1) và 52,5 (C-8′) chứng tỏ rằng C-7 liên kết trực tiếp với một vòng

95

benzene; một hydrogen H-7′ (δH 4,78, d, J = 6,5 Hz) cho thấy tương tác với những

carbon có δC 52,5 (C-8′), 60,8 (C-9′), 108,4 (C-2′), 118,8 (C-6′), 134,8 (C-1′) và 42,4

(C-8), 72,9 (C-9) đã chứng minh rằng C-7′ liên kết trực tiếp với vòng benzene còn

lại. Ngoài ra trên phổ HBMC còn cho thấy H-2 tương tác với carbon δC 146,6 (C-3),

144,0 (C-4), 121,2 (C-6), 33,3 (C-7), hydrogen của nhóm methoxy (δH 3,85, brs)

tương tác mạnh với C-3 chứng tỏ rằng nhóm methoxy liên kết với vòng benzene tại

vị trí C-3; trong khi đó, H-2′ tương tác với carbon δC 146,7 (C-3′), 145,1 (C-4′), 118,8

(C-6′), 82,9 (C-7′), hydrogen của nhóm methoxy (δH 3,85, brs) tương tác mạnh với

C-3′ chứng tỏ rằng nhóm methoxy còn lại liên kết với vòng benzene thứ hai tại vị trí

C-3′. Các tín hiệu phổ cũng cho thấy vị trí C-4 và C-4′ ở mỗi vòng thơm có độ chuyển

dịch lớn hơn nhiều so với độ chuyển dịch của một carbon thơm thông thường nên tại

mỗi vị trí đó phải có liên kết với một nhóm -OH. Tất cả các phân tích trên cho thấy

TL1 có cấu tạo giống với lariciresinol (228). Phổ NOESY cũng đã giúp kiểm chứng

lại cấu hình của TL1 vị trí C-7′, C-8′ và C-8 khi tương tác của H-8′ và H-8 trên phổ

giúp khẳng định chúng ở vị trí cis với nhau và chúng cùng trans với H-7′ khi đều

không thấy có sự tương tác với H-7′ trên phổ đồ. So sánh dữ liệu phổ của TL1 với số

liệu của (+) lariciresinol trong công bố [157] giúp khẳng định rằng TL1 chính là (+)

lariciresinol.

Hình 3.5. Các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TL1

3.1.20. Chất TL3: Cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside

Chất rắn dạng bột, màu trắng, CTPT: C25H32O11

Kết hợp các phổ NMR cho thấy TL3 có 25 carbon (1.CH3 + 5.CH2 + 12.CH +

7.C). Phổ của TL3 khá tương đồng với phổ TL2 và có chứa thêm một đường. Cụ thể

là: phổ 13C-NMR cũng cho thấy tín hiệu của 12 carbon thơm (hai vòng benzene), còn

96

lại là 13 tín hiệu của carbon no [trong đó có tín hiệu của một đường hexose, δC 102,8

(CH), 74,9 (CH), 77,8 (CH), 71,3 (CH), 78,1(CH) và 65,2(CH2)].

Trong hai vòng benzene thì một vòng có dạng hệ ABX thể hiện qua sự tồn tại

của ba hydrogen tại δH 7,16 (1H, d, J = 8,5 Hz), 7,09 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,98 (1H,

dd, J = 8,5 Hz, 1,5 Hz) lần lượt tương ứng với các giá trị δC 118,0, 111,1 và 119,3.

Vòng benzene còn lại có dạng 1,3,4,5-tetrasubstituted benzene vì chỉ thấy tín hiệu

singlet của hai hydeogen ở meta tại δH 6,61 và 6,60. Từ phổ 1H-NMR cũng đã nhận

ra được sự có mặt của nhóm –CH2CH2CH2-OH khi xuất hiện các tín hiệu δH 2,58

(2H, t, J = 7,5 Hz), 1,81 (2H, quintet, J = 6,5 Hz) 3,57 (2H, t, J = 6,5 Hz), có δC tương

ứng là 32,7, 35,7 và 62,3. Ngoài ra còn thấy sự xuất hiện của một nhóm methoxy (δH

3,85/ δC 56,7); các tín hiệu của phần đường là phù hợp với D-glucopyranose.

Từ những phân tích trên cùng với tín hiệu đặc trưng của H-7 tại δH 5,57 (1H,

d, J = 5,5 Hz/δC 88,1) giúp nhận định rằng TL3 là một chất có bộ khung

dihydrobenzo[b]furan neolignan liên kết với một hexose. Thật vậy, các số liệu phổ

13C-NMR của TL3 giống với những mô tả ở tài liệu [158] về hợp chất cedrusin-4-O-

β-D-glucopyranoside (CTPT: C25H32O11) (218). Tiến hành gán phổ cho từng vị trí

carbon tương ứng của TL3 (Bảng 3.9) dựa trên phổ HMBC và trên sự so sánh với

các tín hiệu tương ứng ở cedrusin-4-O-β-D-(6′′-benzoyl)-glucopyranoside (432)

[159], Qua đó kết luận rằng hợp chất TL3 chính là cedrusin-4-O-β-D-

glucopyranoside.

97

Bảng 3.9. So sánh số liệu phổ của TL3 với chất 218 và 432,

[CD3OD, δ (ppm), J (Hz)]

Vị trí TL2 218 [158] 432 [159]

HSQC δC δH δC δC δH 1 C 138,7 - 137,9 138,7 -

2 CH 111,1 7,09, d, (1,5) 111,5 111,0 7,01, d, (1,8)

3 C 150,8 - 146,8 150,4 -

4 C 147,4 - 150,1 147,0 -

5 CH 118,0 7,16, d, (8,5) 116,9 117,4 7,03, d, (8,4)

6 CH 119,3 6,98, dd, (8,5,

1,5) 119,0 118,6

7,01, dd, (8,4, 1,8)

7 CH 88,1 5,57 d, (5,5) 87,6 88,1 5,52, d, (5,4)

8 CH 55,9 3,44, m 56,5 56,1 3,34, m

9 CH2 62,5 3,70, brd (11,5)

3,88, m 64,6 65,4

3,70, dd, (10,8, 7,8)

3,82, dd, (10,8, 5,4)

1′ C 136,9 - 129,1 136,8 -

2′ CH 117,1 6,60, s 117,3 117,0 6,63, s

3′ C 142,0 - 141,2 141,9 -

4′ C 146,4 - 145,9 146,4 -

5′ C 129,4 - 136,5 129,3 -

6′ CH 116,6 6,61, s 116,9 116,7 6,59, s

7′ CH2 32,7 2,58, t, (7,5) 35,2 32,7 2,58, t, (7,8)

8′ CH2 35,7 1,81, quintet,

(6,5) 32,2 35,8 1,80, m

9′ CH2 62,3 3,57, t, (6,5) 62,1 62,3 3,56, m

3-OCH3

CH3 56,7 3,85, s 56,5 56,6 3,80, s

Glc

1g CH 102,8 Overlap với dung

môi ở vùng khoảng 4.86

* 102,2 4,89, d, (7,2)

2g CH 74,9 3,53, m * 74,7 3,55, m

3g CH 77,8 3,51, m * 77,7 3,52, m

4g CH 71,3 3,42, m * 72,1 3,41, t, (9,0)

5g CH 78,1 3,41, m * 75,4 3,77, m

6g CH2 65,2 3,83, m 3,74, m

* 65,4

4,36, dd, (12,0, 8,4)

4,70, dd, (12,0, 2,4)

6′′-benzoyl

- - - ** **

* Số liệu không được công bố trong tài liệu, ** số liệu không được trình bày trong bảng

3.1.21. Chất TS1: β-Sitosterol

Tinh thể hình kim, không màu, mp 1400C. Tiến hành phân tích trên TLC để so

sánh TS1 với các chất thường gặp trong tự nhiên thì thấy rằng TS1 và β-sitosterol

hoàn toàn trùng nhau khi có cùng Rf = 0.25 trong hệ dung môi triển khai n-

hexane:EtOAc = 90:10.

98

Phổ 13C-NMR cho biết phân tử có 29 carbon, đa số trong đó thuộc vùng chuyển

dịch hóa học nằm trong khoảng 11-57 ppm, đây là vùng phổ 13C-NMR đặc trưng của

hợp chất steroid. Ngoài ra, cũng dễ dàng nhận thấy hai tín hiệu nằm trong vùng liên

kết C=C với δC 140,8 và 121,7, một tín hiệu ở δC 71,8 ứng với carbon liên kết với

oxygen (C-3). Trên DEPT cho biết phân tử TS1 gồm có 06 nhóm methyl (δC 11,9,

19,4, 19,1, 19,8, 18,8, và 12,0); 11 nhóm methylene (δC 37,3, 31,7, 42,3, 31,7, 21,1,

39,8, 24,3, 28,3, 34,0, 26,1, 23,1); 09 nhóm methine (δC 71,9, 121,7, 31,9, 50,2, 56,8,

56,1, 36,2, 45,9, 29,2) và 03 carbon bậc 4 (δC 140,8, 36,5, 42,3). Phổ 1H-NMR có

nhiều tín hiệu bị che chắn lẫn nhau trong khoảng từ 1,03-2,33; những tín hiệu dễ nhận

thấy là tín hiệu của sáu nhóm methyl δH 1,01 (3H, s, H-19), 0,90 (3H, d, J = 6,6 Hz,

H-21), 0,84 (3H, t, J = 7,5 Hz, H-29), 0,82 (3H, d, J = 6,9 Hz, H-27), 0,78 (3H, d, J

= 6,9 Hz, H-26), 0,68 (3H, s, H-18) và một tín hiệu của hydrogen olefin tại δH 5,35

(1H, d, J = 5,2 Hz, H-6) cùng với oxymethine tại δH 3,52 (1H, m, H-3).Các thông tin

này thường đặc trưng cho hợp chất có khung steroid. Mặt khác, multiplet ở δC 3,53

đặc trưng cho các steroid có một nhóm hydroxy liên kết tại C-3. Qua sự phân tích ở

trên cùng với việc so sánh số liệu phổ với tài liệu đã công bố [160] dẫn đến kết luận

rằng TS1 chính là β-sitosterol với công thức phân tử C29H50O.

3.1.22. Chất TS2: Daucosterol

Dạng bột màu trắng, mp 290 0C, Tiến hành phân tích trên TLC để so sánh TS2

với các chất thường gặp thì thấy rằng TS2 và daucosterol hoàn toàn trùng nhau khi

có cùng Rf = 0,30 trong hệ dung môi triển khai DCM:MeOH = 95:5. Trên các phổ

NMR của TS2 cho thấy ngoài những tín hiệu đặc trưng của một phytosterol giống

với TS1 (sáu nhóm methyl δC 11,4, 18,8, 19,3 18,3, 19,2 và 11,5; một hydrogen olefin

δH 5,33, brs) còn xuất hiện thêm các tín hiệu của một đường hexose (δC 61,1-100,7).

99

Các số liệu trên cũng cho phép dự đoán hợp phần đường này cũng được cho

là β-D-glucopyranose với anomeric hydrogen tại δH 4,24 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-1′).

Qua so sánh các số liệu phổ của TS2 với số liệu của daucosterol trong tài liệu tham

khảo [161] giúp khẳng định rằng TS2 chính là daucosterol với công thức phân tử

C35H60O6.

3.2. Các chất được phân lập từ Thông ba lá (Pinus kesiya)

3.2.1. Chất TT11: 7-Oxo-15-hydroxydehydroabietic acid

Chất rắn màu vàng rất nhạt, mp 119 0C , CTPT C20H26O4

Phổ 1H-NMR tính được TT11 có ít nhất 24 hydrogen trong đó chỉ có ba

hydrogen thơm, còn lại thuộc vùng no. Từ phổ 13C-NMR và HSQC thấy có 19 tín

hiệu bao gồm 8.C + 4.CH + 4.CH2 + 3.CH3. Tuy nhiên có một tín hiệu của nhóm

methyl tại δC 31,7 cao hơn hẳn so với tín hiệu của hai nhóm methyl còn lại (ở δC 23,9

và 17,9) cộng thêm trên phổ HSQC thấy tín hiệu này tương ứng với sáu hydrogen δH

1,54 (6H, brs) giúp khẳng định đây là một tín hiệu kép ứng với hai nhóm methyl

tương đương và dự đoán rằng chất này là một abietane diterpenoid có chứa 04 nhóm

methyl. Thêm vào đó, trên phổ 13C-NMR và HSQC còn có sự hiện diện của 06 carbon

100

thơm (δC 124,0-156,4) trong đó là 3.C + 3.CH; vòng benzene này bị thế ba vị trí có

các tín hiệu đặc trưng của một hệ ABX với δH 8,07 (1H, d, J = 2,0 Hz), 7,73 (1H, dd,

J = 8,5 Hz, 2,5 Hz) và 7,44 (1H, brd, J = 8,5 Hz). Ngoài ra, còn thấy tín hiện của hai

nhóm C=O trong đó có một C=O ketone liên hợp tại δC 201,2 và một C=O của acid

(hoặc ester) với cường độ rất bé tại δC 186,0; cộng thêm một tín hiệu của một carbon

bậc 4 liên kết với nhóm hydroxy tại δC 72,6. Các tín hiệu phổ 1H-NMR của TT11

giống với từng tín hiệu tương ứng của 7-oxo-15-hydroxy-dehydroabietic acid (CTPT:

C20H26O4) ở tài liệu [162] giúp dự đoán chất này chính là 7-oxo-15-hydroxy-

dehydroabietic acid. Tuy chất này đã được tách ra từ nhiều loài thực vật trong tự nhiên

nhưng chưa thấy bất kỳ công bố nào về dữ liệu phổ 13C-NMR của nó trong dung môi

CD3OD. Sau khi so sánh với những hợp chất tương tự được đo phổ NMR trong cùng

dung môi CD3OD, chúng tôi tiến hành gán các giá trị vào từng carbon tương ứng

(Bảng 3.10) và thấy rằng rất hợp lý.

Hình 3.6 . Các tương tác chính trên phổ HMBC của TT11

Phổ HMBC góp thêm phần khẳng định cấu trúc đề xuất ở trên khi biểu thị: các

tương tác của H-5 với C-7, C-19, C-20 chứng tỏ chúng đều thuộc liên kết axial và

nằm xen kẽ theo kiểu trans–anti; tương tác của H-11 với C-13, C-8, C-10; tương tác

của của H-12 với C-14, C-9, C-15, tương tác của H-14 với C-12, C-9; tương tác của

của H-16, H-17 với C-13 giúp khẳng định rằng nhóm thế liên kết với vòng thơm tại

vị trí C-13. Tương tác của H-14 với C-7 giúp khẳng định chắc chắn nhóm ketone nằm

ở vị trí C-7. Một số tương tác chính trên phổ HMBC được minh họa ở Hình 3.6.

Bảng 3.10. Số liệu phổ của TT11 và abiesadine R, abiesadine O,

[CD3OD, δ (ppm), J (Hz)]

Vị trí

TT11 abiesadine R (CD3OD) [163]

abiesadine O (CD3OD) [163]

HSQC δC δH#

HMBC (H→C)

δC δC

101

* Tín hiệu có cường độ thấp; # Các số liệu được gán dựa trên dữ kiện phổ HSQC

3.2.2. Chất TF6: 3′-O-Methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside

Chất TF6 là dạng bột màu vàng, ESI-MS cho peak ion giả phân tử m/z 467,2

[M+H]+. Kết hợp dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR, HSQC và ESI-MS giúp xác định

được công thức phân tử của TF6 là C22H26O11.

1 CH2 38,7 2,41, d, (12,0)

1,62, m 38,6 38,5

2 CH2 19,9 1,87, m 1,75, m

19,1 19,2

3 CH2 38,5 1,66, m 36,4 37,2

4 C 46,0 - 37,8 47,7

5 CH 45,8* 2,79, dd, (14,0, 2,0)

C-19 C-20 C-10 C-6 C-7

44,9 40,4

6 CH2 39,2 2,73, dd, (16,5,

14,0) 2,52, dd, (17,0, 1,5)

37,0 31,8

7 C=O 202,1 - - 201,2 68,1

8 C 131,7 - - 131,4 136,6

9 C 156,4 - - 155,7 148,9

10 C 38,8 - - 38,9 38,1

11 CH 124,9 7,44, brd, (8,5) C-13 C-8 C-10

125,0 124,7

12 CH 132,0 7,73, dd, (8,5, 2,5) C-14 C-9 C-15

132,2 126,3

13 C 148,9 - - 149,1 143,5

14 CH 124,0 8,07, d, (2,0) C-7 C-9 C-12

124,1 128,5

15 C 72,6 - - 72,6 77,8

16 CH3 31,7 1,54, brs C-13 31,7 28,0

17 CH3 31,7 1,54, brs C-13 31,7 28,1

18 C=O 186,0* - - 79,9 181,9

19 CH3 17,9 1,31, brs 17,5 16,9

20 CH3 23,9 1,28, brs 24,1 24,5

1′ - - - 174,2 -

2′ - - - 30,1 -

3′ - - - 30, 2 -

4′ - - - 176,1 -

102

Các số liệu phổ MS, NMR trên cho thấy chất TF6 có cùng cấu trúc khung với

chất TF4, nhưng có gắn thêm một đường glucose và một nhóm methoxy. Sự có mặt

của đường trong phân tử thấy rõ qua cụm tín hiệu của bốn nhóm oxymethin ở H 3,48-

3,43 (4H, m), C (78,2-71,3), một nhóm oxymethylene ở H 3,93 (1H, d, J = 11,5 Hz,

H-6′′a), 3,75 (1H, dd, J = 11,5, 4,5 Hz, H-6′′b); C 62,6 và một anomeric hydrogen H

4,84 (overlap với peak nước)/C 102,5. Ngoài ra, còn có tín hiệu của một nhóm -

OCH3 tại H 3,85 (3H, s), C 56,4. So sánh các dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR với

dữ liệu phổ của 3′-O-methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside [164] ghi trong cùng

dung môi cho thấy chúng hoàn toàn giống nhau. Vậy có thể kết luận rằng chất TF6

chính là 3′-O-methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside. Chất này được phân lập đầu

tiên từ vỏ rễ của loài thiết sam Picea abies vào năm 1995 nhưng đây là lần đầu tiên

hợp chất này được tìm thấy trong chi Pinus.

3.2.3. Chất TP4: Resveratrol-3-O-β-D-glucoside.

Tên khác: (E) piceid, tinh thể hình kim màu vàng rất nhạt, mp 136 0C

Phổ khối ESI-MS của chất TP4 cho peak ion giả phân tử tại m/z 391,1 [M+H]+,

kết hợp các dữ liệu phổ NMR và phổ khối xác định công thức phân tử của TP4 là

C20H22O8. Phổ 1H-NMR của nó cho các tín hiệu của 07 hydrogen thơm, 02 hydrogen

olefin và các tín hiệu của một đường hexose. Các tín hiệu hydrogen thơm thuộc hai

vòng benzene, trong đó ba hydrogen nằm ở vị trí meta với nhau của vòng thơm bị thế

ở C-1, C-3, C-5 xuất hiện ở δH 6,81 (1H, brs, H-2), 6,64 (1H, brs, H-6), 6,48 (1H, s,

H-4) và bốn hydrogen thuộc một vòng thơm còn lại bị thế ở C-1′ và C-4′ cộng hưởng

ở δH 7,38 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2′/H-6′), 6,79 (2H, d, J = 8,5 Hz, H3′/H5′). Cặp

doublet của hai hydrogen ở δH 7,03 và 6,87 (mỗi tín hiệu 1H, H-8 và H-7) có hằng số

tương tác lớn (J = 16,5 Hz), cho thấy chúng ở dạng trans với nhau và cũng giúp nhận

định đây là một dẫn xuất của trans-stilbene có gắn đường. Các tín hiệu của đơn vị

103

đường gồm năm nhóm oxymethine (δH 4,91-3,32 và C 102,4-71,5) cùng với tín hiệu

của một nhóm oxymethylene (δH 3,95, 3,74; C 62,6). Anomeric hydrogen ở δH 4,92

với J = 7,0 Hz xác định được đường glucose có cấu hình β. Phổ 13C-NMR và HSQC

của chất TP4 cho thấy sự xuất hiện của 20 carbon, trong đó có 14 carbon của aglycone

(3.C + 11.CH) và 06 carbon của đường (5.CH + 1.CH2). Các phân tích phổ trên cho

thấy chất TP4 là resveratrol có gắn thêm một nhánh đường β-glucopyranose. Qua so

sánh với các tài liệu tham khảo [165, 166] cấu trúc của chất TP4 được xác định là

resveratrol-3-O-β-D-glucoside. Chất này cùng với aglycone của nó (resveratrol) được

tìm thấy nhiều trong nước ép quả nho và chúng là những chất có tác dụng chống oxy

hóa, thu dọn gốc tự do rất tốt; ngoài ra chúng còn tỏ ra có hiệu quả trong điều trị các

bệnh suy giảm chức năng thần kinh như (Parkinson, Alzheimer, Huntington, vv...)

[167]. Chất này đã được tìm thấy từ các loài Polygonum cuspidatum và Eucalyptus

sp. [165] nhưng đây là lần đầu tiên hợp chất này được tìm thấy trong chi Pinus.

3.2.4. Chất TP7: 3,4-Dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl) -

β-D-glucopyranoside

Trên phổ 1H-NMR của chất TP7 ở vùng nhân thơm xuất hiện các tín hiệu đặc

trưng cho một vòng benzene hệ ABX cộng hưởng ở δH 6,88 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-

5), 6,78 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2), 6,67 (1H, dd, J = 9,0, 2,5 Hz, H-6). Ngoài ra còn có

tín hiệu của ba nhóm methoxy với các tín hiệu singlet tại δH 3,83, 3,78, 3,43 và tín

hiệu của một đường glucose cùng với một đường rhamnose đặc trưng bằng một nhóm

oxymethylene [δH 3,92 (1H, dd, J = 12,0, 1,5 Hz, H-6′a), 3,70 (1H, dd, J = 12,0, 6,0

Hz, H-6′b)], các nhóm oxymethine (δH 5,34-3,33) và một nhóm methyl ở δH 1,33 (3H,

dd, J = 6,0 Hz, H-6′′). Phổ 13C-NMR của hợp chất TP7 cho các tín hiệu của vòng

benzene với tín hiệu của ba carbon methine ở C 114,2 (C-6), 108,5 (C-5), 103,6 (C-

104

2), ba carbon bậc 4 mang oxygen ở vùng trường thấp hơn tại C 153,8 (C-3), 151,3

(C-4), 145,9 (C-1). Các tín hiệu carbon ở C-3′′ dịch chuyển về phía trường thấp (Δ

= +9,5 ppm), trong khi ở C-2′′ và C-4′′ lại dịch chuyển về phía trường cao hơn (Δ =

–3.9 và –0.9 ppm) so với các tín hiệu carbon tương ứng trong phân tử α-L-rhamno-

pyranose [168], điều này chứng tỏ nhóm -OCH3 gắn vào vị trí C-3′′ (tức gắn vào vị

trí C-3 của đường rhamose). Từ các dữ liệu phổ phân tích ở trên cho thấy chất TP7

là dẫn xuất của 3,4-dimethoxyphenol có gắn thêm một đường glucose và một đường

rhamnose. Cấu hình của hai đường này được xác định là β-D-glucopyranose và α-L-

rhamnopyranosyl qua tín hiệu của hai anomeric hydrogen xuất hiện ở δH 4.91 (1H, d,

J = 7,5 Hz, H-1′) và 5,34 (1H, brs, H-1′′). So sánh dữ liệu phổ 1H-NMR, 13C-NMR

của TP7 với tài liệu tham khảo [164] (Bảng 3.11), cho phép xác định chất TP7 là

3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyrano-

side.

Bảng 3.11. So sánh số liệu phổ của TP7 với 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-

methyl-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside, [CD3OD, δ (ppm), J (Hz)]

Vị trí TP7

3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-rhamnopyranosyl)-β-D-

glucopyranoside

HSQC δC δH δC δH 1 C 145,9 - 145,9 -

2 CH 103,6 6,78, d, (2,5) 103,6 6,75, d, (2,8)

3 C 153,8 - 153,8 -

4 C 151,3 - 151,2 -

5 CH 108,5 6,88, d, (9,0) 108,5 6,85, d, (8,9)

6 CH 114,2 6,68, dd, (9,0,

2,5) 114,2 6,64, dd, (8,9, 2,8)

1′ CH 101,6 4,91, d, (7,5) 101,6 4,88, d, (7,6)

2′ CH 79,0 3,65, m 78,9 3,63, dd, (8,4, 7,6)

3′ CH 79,2 3,60, m 79,2 3,57, dd, (9,3, 8,4)

4′ CH 71,7 3,35, m 71,7 3,32, m

5′ CH 78,1 3,41, m 78,1 3,41, m

6′ CH2 62,6

3,92, dd, (12,0, 1,5)

3,70, dd, (12,0, 6,0)

62,6

3,90, dd, (12,0, 2,3)

3,67, dd, (12,0, 5,5)

1′′ CH 102.3 5,34, brs 102,2 5,31, d, (1,8)

2′′ CH 68.0 4,18, m 68,0 4,15, dd, (3,2, 1,8)

3′′ CH 82,0 3,33, m 82,0 3,30, dd, (9,6, 3,2)

4′′ CH 72,7 3,41, m 72,7 3,47, t, (9,6)

5′′ CH 69,9 4,15, m 69,9 4,12, dq, (9,6, 6,2)

6′′ CH3 18,2 1,33, d, (6,0) 18,2 1,30, d, (6,2)

3-OCH3 CH3 56,5 3,83, brs 56,5 3,81, brs

4-OCH3 CH3 57,2 3,78, brs 57,2 3,77, brs

3′′-OCH3 CH3 57,2 3,43, brs 57,2 3,40, brs

105

Chất này đã được tách ra từ loài loài lá kim Picea abies nhưng đây là lần đầu

tiên nó được tìm thấy ở chi Pinus.

3.2.5. Chất TL2: (+) Cedrusin

Chất rắn dạng bột, màu trắng, [α]D = + 4,8 (MeOH), CTPT: C19H22O6

Kết hợp các phổ NMR cho thấy TL2 có 19 carbon (1.CH3 + 4.CH2 + 7.CH +

7.C). Trong đó có 12 carbon thơm (hai vòng benzene) và bảy tín hiệu của carbon no.

Trong hai vòng benzene thì một vòng có dạng hệ ABX thể hiện qua sự tồn tại của ba

hydrogen tại δH 7,00 (1H, d, J = 1,5 Hz), 6,86 (1H, dd, J = 8,0 Hz, 1,5 Hz), 6,79 (1H,

d, J = 8,5 Hz) lần lượt tương ứng với các giá trị δC 110,6, 119,7, 116,1. Vòng benzene

còn lại có dạng 1,3,4,5-tetrasubstituted benzene vì chỉ thấy tín hiệu singlet của hai

hydrogen ở meta tại δH 6,79 và 6,62. Từ phổ 1H-NMR đã nhận ra được sự có mặt của

nhóm –CH2CH2CH2–OH khi xuất hiện các tín hiệu δH 2,58 (2H, t, J = 7.5 Hz), 1,81

(2H, quintet, J = 7.0 Hz) 3,58 (2H, t, J = 6,5 Hz), có δC tương ứng là 32,7, 35,8 và

62, 3. Ngoài ra còn thấy sự xuất hiện của một nhóm methoxy (δH 3,85/ δC 56,7). Từ

những phân tích trên cùng với tín hiệu đặc trưng của H-7 tại δH 5,51 (1H, d, J = 6,0

Hz/ δC 88,7) giúp nhận định rằng TL2 là một dihydrobenzo[b]furan neolignan. Các

số liệu phổ 1HNMR và 13C-NMR của TL2 giống với những mô tả ở các tài liệu [158,

169] về hợp chất cedrusin (CTPT: C19H22O6), ở TL2 thì giá trị hằng số tương tác J7,8

= 6,0 chứng tỏ rằng H-7 và H-8 phải nằm ở vị trí trans với nhau; vì vậy kết luận rằng

TL2 chính là (+) cedrusin.

Ngoài ra, từ loài này còn tách được chất cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside

(TL3) và catechin (TF4)

3.3. Các chất được phân lập từ Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius)

3.3.1. Chất TT7: Totarol

Chất rắn dạng bột màu trắng, mp 128 0C, CTPT C20H30O

106

Phổ 13C-NMR và DEPT cho thấy chất TT7 có 20 nguyên tử carbon, bao gồm:

05 nhóm methyl, 05 nhóm methylene, 04 nhóm methine, và 06 carbon bậc 4. Vùng

thơm và vùng no được hiển thị rõ với các tín hiệu của 06 carbon thơm (δC 114,3-

152,0) và 14 carbon no phía trường cao (δC 19,5-49,6).

Phổ 1H-NMR cũng phù hợp với 13C-NMR và DEPT qua các tín hiệu của năm

nhóm methyl, trong đó có ba singlet tương ứng với ba methyl ở δH 0,91, 0,94, 1,17;

hai doublet ở δH 1,33, 1,35 ppm (mỗi tín hiệu 3H, d, J = 7,0 Hz) tương ứng với hai

nhóm methyl của isopropyl. Thêm vào đó còn có hai hydrogen thơm ở δH 6,98 và

6,50 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 8,5 Hz). Hai hydrogen thơm này có cùng hằng số tương

tác (J = 8,5 Hz), cho thấy chúng ở vị trí ortho với nhau. Kết hợp số liệu phổ trên gợi

ý cho thấy chất này là một totarane diterpenoid có chứa một vòng thơm. Điều này

được khẳng định thêm qua tín hiệu của bốn carbon thơm bậc 4 ở δC 134,0, 143,2,

152,0, 131,0; hai nhóm methine thơm =C–H ở δC 123,0, 114,3. Sự có mặt của nhóm

thế isopropyl được khẳng định qua tín hiệu ở δH 2,75 (m, H-15)/ δC 27,1 (C-15), δH

1,33 (H-16)/ δC 20,3, C-16 và δH 1,35 (H-17)/ δC 20,3 (C-17). Ngoài ra phổ 1H-NMR

còn có tín hiệu singlet tù ở δ = 4,51 ppm (brs) đặc trưng của nhóm OH. Kết hợp dữ

liệu phổ 1H-NMR, 13C NMR và DEPT đã xác định được công thức phân tử của chất

TT7 là C20H30O. Sau khi so sánh số liệu phổ NMR của TT7 và của totarol (321) [170]

với nhau thì thấy rất phù hợp nên có thể khẳng định TT7 chính là totarol. Chất này

được tìm thấy lần đầu tiên ở loài Podocarpus hallii thuộc chi Thông tre [171]. Do có

khả năng kháng tốt các chủng khuẩn Gram (+) như P. acnes, S. mutans, B. subtilis,

M. tuberculosis, B. ammoniagenes và S. aureus [172] nên đã được bán tổng hợp từ

methyl ester của zamoranic acid vào năm 2003 [173] và tổng hợp chemoenzymatic

vào năm 2007 [174]. Số liệu gán phổ 13C-NMR của TT7 và một số hợp chất tách

được có cùng bộ khung cấu trúc được trình bày ở Bảng 3.12.

3.3.2. Chất TT8: Totarol-19-carboxylic acid

107

Tên khác: 4β-carboxy-19-nortotarol, chất rắn dạng bột màu trắng, ESI-MS

(positive) m/z 353,10 [M–2H+K] +, ESI-MS (negative) m/z 315,12 [M–H]–, CTPT

C20H28O3. Phổ 13C-NMR cho thấy chất TT8 khá giống với TT7 khi có 20 nguyên tử

carbon, vùng trường thấp xuất hiện tín hiệu của một nhóm C=O (δC 183,9) và 06

carbon thơm (δC 114,6-152,1); vùng trường cao là 13 carbon no phía trường cao (δC

20,1-52,1). So với TT7 trên phổ 1H-NMR của TT8 chỉ còn tín hiệu của bốn nhóm

methyl. Ngoài ra các tín hiệu của hydrogen no, nhóm -OH cũng như của hai hydrogen

thơm ở vị trí ortho của nhau (δH 6,99 và 6,52 , mỗi tín hiệu 1H, d, J = 8,5 Hz) là hoàn

toàn tương tự. Từ đó có thể nhận xét rằng TT8 chỉ khác TT7 ở chổ trong phân tử có

một nhóm -COOH thay cho một trong ba nhóm methyl riêng lẽ ở vị trí C-18, C-19

hoặc C-20. Khi so sánh dữ liệu phổ của TT8 với 4β-carboxy-19-nortotarol ở tài liệu

tham khảo [170] thấy chúng giống nhau. Vì thể khẳng định rằng TT8 chính là chất

này, và còn thường hay được gọi bằng tên khác là totarol-19-carboxylic acid. Chất

này đã được tách ra từ loài Podocarpus lambertius vào năm 1975 [175], và là một

hoạt chất có thể kháng lại nhiều chủng vi khuẩn như S. Sobrinus, A. viscosus, P.

gingivalis, F. nucleatum, A. Actinomycetemcomitans và S. aureus ở mức độ trung

bình (MIC: 25 - 50 µM) [176].

3.3.3. Chất TT9: Inumakiol D

Chất rắn màu vàng nhạt, mp 136 0C, CTPT C20H28O4. Phổ 1H-NMR, 13C-NMR

và DEPT chỉ ra hợp chất có 20 carbon (4.CH3 + 4.CH2 + 5CH + 8.C). Trong đó bao

gồm các tín hiệu của: một nhóm isopropyl [δC 28,1, 20,6, 20,7 lần lượt tương ứng với

δH 3,53-3,50 (1H, m), 1,42 (3H, d, J = 7,0 Hz), 1,37 (3H, d, J = 7,0 Hz)]; một vòng

108

thơm (δC 154,4, 140,4, 134,2, 133,4, 124,2, 117,1); hai nhóm methyl (δC 28,6, 22,5)

liên kết với carbon 4; một nhóm -COOH ở δC 181,1. Vòng thơm chỉ có tín hiệu hai

hydrogen ở δH 6,99 và 6,68 (mỗi tín hiệu 1H, d, J = 8,5 Hz) đã chỉ ra rằng chúng ở vị

trí ortho với nhau. Hydrogen tại vị trí C-5 được cho là nằm trên liên kết axial khi ở

phổ 1H-NMR nó được biểu thị dưới dạng một doublet tù có hằng số tương tác lớn (J

= 12,5 Hz) tại vị trí δH 1,97. Nhóm methine có độ chuyển dịch tương đối cao tại δC

65,5 đã gợi ý rằng nhóm này có liên kết trực tiếp với nguyên tử có độ âm điện lớn (-

OH). Qua phân tích những số liệu phổ ở trên có thể dự đoán rằng chất TT9 là một

diterpenoid khung totarane có CTPT là C20H28O4. Các số liệu phổ được gán cho từng

vị trí carbon được dựa trên phổ HSQC và việc so sánh với các chất có cấu trúc tương

tự (Bảng 3.12).

Bảng 3.12 . So sánh số liệu phổ 13C-NMR của TT7, TT8 và TT9

Vị trí TT7 TT8 TT9

DEPT δC (ppm) δC (ppm) δC (ppm) 1 CH2 41,6 40,1 40,1

2 CH2 19,5 20,1 20,4

3 CH2 39,6 37,2 37,7

4 C 33,3 43,8 43,5

5 CH 49,6 52,1 45,4

6 CH2 19,3 21,1 31,2

7 CH2 28,8 30,0 65,5 (CH)

8 C 134,0 134,3 134,2

9 C 143,2 141,0 140,4

10 C 37,7 38,5 38,9

11 CH 123,0 124,1 124,2

12 CH 114,3 114,6 117,1

13 C 152,0 152,1 154,4

14 C 131,0 130,9 133,4

15 CH 27,1 27,3 28,1

16 CH3 20,3 20,3 20,6

17 CH3 20,3 20,4 20,7

18 CH3 33,2 28,6 28,6

19 CH3 21,6 183,9 (C=O) 181,1 (C=O)

20 CH3 25,2 23,2 22,5

Ngoài ra, trong phổ HMBC cho thấy một số tương tác quan trọng như: tương

tác của các hydrogen H-12 (δH 6,68), H-16 (δH 1,37), H-17 (δH 1,42) với C-14 (δC

133,4); tương tác của H-15 (δH 3,50-3,53) với C-8 (δC 134,2) và C-13 (δC 154,4);

tương tác của H-11 (δH 6,99), H-12 (δH 6,68), H-15 (δH 3,53-3,50) với C-13 (δC 154,4)

giúp biết chắc chắn nhóm isopropyl liên kết với vòng thơm tại vị trí C-14. Thêm vào

đó, trên phổ NOESY có xuất hiện tương giữa H-5 và H-18 (H 1,34, brs) giúp chứng

minh rằng H-5 và C-18 nằm ở vị trí cis với nhau qua liên kết C4–C5. Tất cả những

109

thông tin trên giúp kết luận rằng TT9 chính là Inumakiol D, chất này đã được phân

lập từ loài Tùng la hán lá dài Podocarpus macrophyllus thuộc chi thông tre vào năm

2008 [176].

3.3.4. Chất TT10: Macrophyllic acid

Chất rắn dạng bột màu vàng nhạt, IR (KBr) νmax cm-1: 3547 (OH), 3095 (=C–

H thơm), 2954, 2875 (C–H no), 1700 (C=O/ acid), 1374-1458 (C=C vòng thơm),

1249 (C–O/ acid). HR-ESI-MS (MeOH) m/z 653,3813 [M+Na]+ (calc. 653,3818)

Hình 3.7. TT10 và các tương tác chính trên phổ HMBC và NOESY của TT10.

Từ phổ FT-IR nhận ra rằng trong phân tử chất này có nhóm chức acid và vòng

thơm. Phổ 13C-NMR và DEPT của TT10 cho thấy tín hiệu của 20 carbon (4.CH3 +

5.CH2 + 3CH + 8.C); phía trường thấp là tín hiệu ứng với C=O của carboxylic acid

(C 185,4) và vùng thơm có 06 carbon (C 120,2-150,0) còn lại là tín hiệu của 13

carbon no. HR-ESI-MS của TT10 cho peak ion giả phân tử m/z 653,3813 [M+Na]+,

từ đó tính được TT10 có công thức phân tử là C40H54O6 và có dạng là dimer đối xứng

của một diterpenoid. Phổ 1H-NMR cho thấy hoàn toàn phù hợp với 13C-NMR và

DEPT khi vòng thơm chỉ còn có một tín hiệu singlet của hydrogen thơm tại H 6,86.

Tín hiệu của nhóm -OH gắn với vòng thơm cũng xuất hiện dưới dạng singlet tại H

5,01. Ngoài ra, tín hiệu của các nhóm methyl cũng biểu thị rõ đó là: hai methyl tại H

1,34 (3H, brs) và 1,00 (3H, brs); quan trọng hơn, trên phổ còn thấy tín hiệu của hai

methyl thuộc nhóm isopropyl qua hai doublet với hằng số tương tác J = 7,0 Hz tại H

1,35 và 1,31. Những điều này giúp nhận ra TT10 là một bis–diterpenoid có chứa bộ

110

khung totarane hoặc abietane, trong đó ½ phân tử này sẽ có một nhóm -COOH và

vòng thơm có chứa một nhóm -OH.

Vùng thơm trên phổ 1H-NMR chỉ thấy tín hiệu duy nhất một hydrogen thơm

ứng với một singlet tại H 6,86 (H-11), và còn cho thấy một thông tin quan trọng về

mặt cấu trúc lập thể khi tín hiệu của hydrogen methine H-5 (H 1.48) là một doublet

tù có giá trị hằng số tương tác lớn (12,0 Hz) đã giúp nhận ra hydrogen này nằm trên

liên kết axial. Các số liệu phổ 1H-NMR của TT10 được gán cho từng vị trí carbon

tương ứng dựa vào phổ HSQC (Bảng 3.13) qua đó thấy nó khá tương đồng với số

liệu phổ của totarol-19-carboxylic acid (TT8) giúp dự đoán đây là dimer của totarol-

19-carboxylic acid. Điểm khác biệt đáng kể duy nhất là trên phổ 13C-NMR tại vị trí

C-12, trong khi ở đó TT8 là một C–H thơm có C 114.6 thì TT10 lại là một carbon

bậc 4 có C 120,2. Điều này chứng tỏ trong phân tử TT10 thì hai hợp phần totarol-

19-carboxylic acid liên kết với nhau tại vị trí C-12. Phổ HMBC càng giúp khẳng định

điều này khi cho thấy tương tác mạnh của H-11 (H 6,86) với C-12′ (hay H-11′ với

C-12). Ngoài ra, H-11 còn có tương tác mạnh với carbon có độ chuyển dịch C 38,7

(C-10), 135,0 (C-8) và 150,0 (C-13). Thêm vào đó, trên phổ HBMC còn cho thấy

tương tác của H-7 (H 3,01 và 2,70) với carbon có C 21,3 (C-6), 52,4 (C-5) và 135,0

(C-8) giúp khẳng định sự gán giá trị độ chuyển dịch cho C-8 là chính xác. Sau đó

cũng khẳng định rằng hợp phần diterpenoid trong TT10 có bộ khung totarane với

nhóm -OH liên kết với vòng thơm tại C-13 khi hydrogen của C13–OH cho thấy sự

tương tác mạnh với C-13, C-12, C-14.

Hơn nữa, phổ HMBC còn làm sáng tỏ thông tin về lập thể tại vị trí C-4, C-5

và C-10 khi chỉ ra rằng C-19, H-5 và C-20 đều thuộc liên kết axial và nằm xen kẽ

theo kiểu trans–anti qua các biểu thị ở những tương tác mạnh của H-5→C-19 và H-

5→C-20. Thêm vào đó, tương tác qua hiệu ứng NOE giữa H-5 và H-18 (H 1,34, brs)

trên phổ NOESY giúp chứng minh rằng H-5 và C-18 nằm ở vị trí cis với nhau qua

liên kết C4–C5. Những tương tác quan trọng trên phổ HMBC và NOESY được biểu

thị qua Hình 3.7. Tất cả những phân tích này giúp đề xuất rằng TT10 có cấu trúc là

bis-totarol-19-carboxylic acid với tên gọi là macrophyllic acid.

Ngoài các terpenoid kể trên, từ loài này cũng đã tách ra được hai sterol đó là

β-sitosterol (TS1) và daucosterol (TS2).

111

Bảng 3.13. Số liệu phổ của TT10 so với totarol-19-carboxylic acid (TT8),


Vị trí

TT10 (CDCl3)

Totarol-19-carboxylic acid (TT8)

(CDCl3)

DEPT δC δH HMBC (H→C)

NOESY (H→H)

δC (ppm)

1, 1′ CH2 40,3

e: 2,09, brd, (13,0)

a: 1,30 (overlap với H-16, H-17)

C-2, C-10 40,1

2, 2′ CH2 19,9 e: 1,91-1,94, m

a: 1,56, brd, (13,0)

C-1, C-3 20,1

3, 3′ CH2 36,9

e: 2,19, brd, (13,5)

a: 1,07, td, (13,5, 4,0)

C-2, C-4, C-19

37,2

4, 4′ C 43,6 - - 43,8

5, 5′ CH 52,4 1,48, brd, (12,0)

C-19, C-20, C-18, C-6, C-7, C-10,

C-4

H-18 52,1

6, 6′ CH2 21,1 e: 2,26, dd, (13,5, 6,0) a: 2,01, m

C-5, C-7, C-10, C8, C-4

21,1

7, 7′ CH2 30,2 e: 3,01, dd, (17,0, 4,5) a: 2,70, m

C-5, C-6, C-8

H-7 30,0

8, 8′ C 135,0* - 134,3

9, 9′ C 140,7 - 141,0

10, 10′ C 38,7 - 38,5

11, 11′ CH 124,9 6,86, s C-8, C-13, C-10, C-12′

124,1

12, 12′ C 120,2 - - 114,6 (CH)

13, 13′ C 150,0* - - 152,1

14, 14′ C 131,9 - - 130,9

15, 15′ CH 27,8 3,30, brs - 27,3

16, 16′ CH3 20,0 1,35, d, (7,0) C-14 20,3

17, 17′ CH3 20,2 1,31, d, (7,0) C-14 20,4

18, 18′ CH3 28,2 1,34, brs C-5, C-3, C-

4, C-19 28,6

19, 19′ C=O 185,4 - - 183,9

20, 20′ CH3 22,3 1,00, brs C-10, C-1,

C-5 23,2

13-OH - 5,01, s C-14, C-13,

C-12

* Tín hiệu có cường độ thấp; e: equatorial ; a: axial

3.4. Hoạt tính sinh học của một số chất sạch

▪ Kết quả thử in vitro trên dòng tế bào ung thư thư biểu mô KB: các chất totarol

(TT7) và macrophyllic acid (TT10) cho thấy hoạt tính gây độc tế bào tương đối

tốt trên dòng tế bào KB với giá trị IC50 tương ứng là 20,0 µg/mL và 4,8 µg/mL.

112

▪ Thử nghiệm in vitro trên các dòng tế bào ung thư phổi SK-LU-1, ung thư thư vú

MCF-7 và ung thư gan Hep-G2 tại các nồng độ thử nghiệm 40 µg/mL, 20 µg/mL

và 10 µg/mL với ellipticine là chất đối chứng dương (Bảng 3.14). Kết quả trên

cho thấy các chất stilbenoid là dihydropinosylvin 5-methyl ether (TP2) và 5-O-

methylpinosylvin (TP3) thể hiện mức hoạt tính ức chế tương đối khá với giá trị

IC50 là 20,8 – 38,1 g/mL trên các dòng tế bào ung thư SK-LU-1, MCF-7 và Hep-

G2. Chất macrophyllic acid (TT10) cho thấy mức hoạt tính ức chế trung bình đối

với các dòng tế bào nghiên cứu khi có IC50 47,4 – 58,3 g/mL. Các chất còn lại

không thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào được nghiên cứu.

Bảng 3.14. Kết quả thử in vitro trên các dòng tế bào SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2

của một số chất sạch

Kí hiệu chất

Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào ung thư IC50 (µg/mL)

SK-LU-1 MCF-7 Hep-G2

TT2 (PDLE5) >100 >100 >100

TT4 (PDWE10) >100 >100 >100

TT6 (PDWE9) >100 >100 >100

TT10 (PNWE1) 50,8 56,3 47,4

TT11 (PKRE2) >100 >100 >100

TF1 (PDWE1) >100 >100 >100

TF7 (PDLE7) >100 >100 >100

TF3 (PDWE8) >100 >100 >100

TP2 (PDWE11) 32,2 29,2 38,1

TP3 (PDWE12) 28,0 20,8 36,8

TL3 (PKRE12) >100 >100 >100

Ellipticine 0.31 0.33 0.34

▪ Thử nghiệm in vitro về hoạt tính chống tăng sinh trên dòng tế bào bạch cầu tủy

xương cấp tính (OCI-AML) đối với hỗn hợp của 16-hydroxy-8(17),13-labdadien-

15,16-olid-19-oic acid và 15-hydroxypinusolidic acid (TT2), và các chất

isopimaric acid (TT6), macrophyllic acid (TT10), pinocembrin (TF1),

dihydropinosylvin 5-methyl ether (TP2) và (+) lariciresinol (TL1) thấy rằng TT2

(tại nồng độ 25 µg/mL, P < 0,001), TT6 (tại nồng độ 40 µg/mL, P < 0,05), TT10

(tại nồng độ 20 µg/mL, P < 0,01), TF1 (tại nồng độ 40 µg/mL, P < 0,001) và TP2

(tại các nồng độ 50 µg/mL và 30 µg/mL, P < 0,01) có khả năng làm suy giảm số

113

lượng các tế bào được thử nghiệm (Hình 3.8) và làm gia tăng lượng các tế bào

chết bằng cách cảm ứng và kích hoạt quá trình chết tự nhiên của chúng (apoptosis)

sau 24 giờ (Hình 3.9) ở mức có ý nghĩa thống kê. Trong khi đó chất TL1 được

xem như không thể hiện hoạt tính này khi nồng độ gây chết tế bào thử nghiệm là

200 µg/mL (P < 0,001).

Hình 3.8 . Số lượng của các tế bào OCI-AML sau 24 giờ khi thử nghiệm với TT2 (a),

TT6 (b), TT10 (c), TF1 (d), TP2 (e) và TL1 (f) được biểu thị ở các thanh đen (các

thanh trắng là DMSO làm đối chứng); các nồng độ thử nghiệm được thể hiện trên trục

x (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001)

Qua phân tích ảnh hưởng của các chất có hoạt tính tới chu trình phát triển của

các tế bào OCI-AML bằng kỹ thuật flow cytometry đã thấy được số lượng các tế bào

bị suy giảm đáng kể trong pha S đối với TT6 (tại nồng độ 40 µg/mL), TF1 (tại nồng

độ 40 µg/mL và 20 µg/mL). Kết quả này chứng tỏ rằng hai chất trên có khả năng tác

động tới sự nhân lên của các tế bào tế bào OCI-AML bằng cách ức chế quá trình tổng

hợp DNA của chúng. Đối với TP2 thì chất này làm giảm số lượng các tế bào OCI-

AML bằng cách ức chế quá trình phân bào (pha G2/M) trong chu trình tế bào.

114

Hình 3.9 . Số lượng của các tế bào OCI-AML chết theo chương trình (apoptosis) sau

24 giờ khi thử nghiệm với TT2 (a), TT6 (b), TT10 (c), TF1 (d), TP2 (e) và TL1 (f)

được biểu thị ở các thanh đen (các thanh trắng là DMSO làm đối chứng); các nồng độ

thử nghiệm được thể hiện trên trục x (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001).

Trong khi đó, TT2 (tại các nồng độ 25 µg/mL, 12,5 µg/mL và 6,25 µg/mL) và

TT10 (tại nồng độ 20 µg/mL) có khả năng can thiệp sự nhân lên của tế bào OCI-

AML bằng cách ức chế quá trình tổng hợp DNA (trong pha S) và ức chế quá trình

phân bào (pha G2/M) của chu trình tế bào (Hình 3.10). Riêng đối với pinostrobin

(TF3) tại nồng độ thử nghiệm 60 µg/mL, mặc dù khi phân tích chu trình tế bào có

quan sát thấy có sự suy giảm số lượng các tế bào ở pha G2/M (p < 0.05) nhưng yếu

tố này là không đủ để làm các tế bào OCI-AML bị suy giảm sau 24 giờ thử nghiệm

(Phụ lục 32).

115

Hình 3.10. Số lượng các tế bào OCI-AML trong các pha trong chu trình của tế bào khi

được xử lí. (A): TT2; (B): TT6 (C): TT10; (D): TF1; (E): TP2 ở các nồng độ khác nhau;

các nồng độ thử nghiệm được thể hiện trên trục x (*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001)

Hỗn hợp TT2 có hoạt tính ức chế sự phát triển của các tế bào OCI-AML ở

mức khá tốt nên đã được tìm hiểu sâu hơn về cơ chế tác dụng. Qua phân tích protein

bằng kỹ thuật Western blot đã thấy được rằng TT2 có thể kích hoạt các caspase 3 (tại

nồng độ 25 µg/mL) và gia tăng số lượng các protein ức chế khối u là p53 (tại các

nồng độ 25 và 12.5 µg/mL) và p21 (tại các nồng độ 25, 12.5 và 6.25 µg/mL) để cảm

ứng và đưa các tế bào ung thư này đi vào quá trình chết tự nhiên (Phụ lục 33).

116

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

❖ Kết luận

Hai loài Pinus là Pinus dalatensis, Pinus kesiya và một loài Podocarpus là

Podocarpus neriifolius ở Việt Nam lần đầu được nghiên cứu về thành phần hóa học

và hoạt tính sinh học:

1. Thành phần hóa học của lá và gỗ loài Thông đà lạt (Pinus dalatensis).

Bằng các phương pháp sắc ký cột đã phân lập được 24 hợp chất từ lá và gỗ;

Kết hợp các phương pháp phổ đã xác định được cấu trúc của các chất phân lập được

là:

- 01 sesquiterpenoid: caryolane-1β,9β-diol (TT1);

- 06 diterpenoid: 16-hydroxy-8(17),13-labdadien-15,16-olid-19-oic acid (TT2a),

15-hydroxypinusolidic acid (TT2b), 15-methoxypinusolic (TT3), lambertianic

acid (TT4), 8(17),13-ent-labdadien-15→16-lactone-19-oic acid (TT5),

isopimaric acid (TT6); 01 triterpenoid: 3β-hydroxy-14-serraten-21-one (TT12);

- 06 flavonoid: pinocembrin (TF1), chrysin (TF2), pinostrobin (TF3), catechin

(TF4), kaempferol (TF5), kaempferol 3-O-(3′′,6′′-di-O-E-p-coumaroyl)-β-D-

glucopyranoside (TF7);

- 05 hợp chất stilbenoid: dihydropinosylvin(TP1), dihydropinosylvin 5-methyl

ether (TP2), 5-O-methylpinosylvin (TP3), resveratrol-3-O-β-D-glucoside (TP4),

resveratroloside (TP5a);

- 01 hợp chất phenol đơn giản: vanillic acid 4-(-β-D-glucopyranoside) (TP6)

- 02 lignan: (+) lariciresinol (TL1), cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside (TL3);

- 02 sterol: β-sitosterol (TS1), daucosterol (TS2).

So sánh về thành phần hóa học của bộ phận gỗ và lá thì thấy rằng, trong khi

thành phần chính của lá là các terpenoid thì gỗ lại chứa nhiều flavonoid và stilbenoid.

Trong các chất đã tách được thì chất TT1, TT3, TT5 và TP6 lần đầu tiên được tìm

thấy trong chi Pinus. Riêng chất TP6 lần đầu tiên được tìm thấy trong họ Thông

(Pinaceae).

2. Thành phần hóa học của rễ loài Thông ba lá (Pinus kesiya).

Từ rễ của loài này đã phân lập và xác định được 07 hợp chất. Bao gồm:

117

- 01 abietane diterpenoid: 7-oxo-15-hydroxy-dehydroabieticacid (TT11);

- 02 flavonoid: catechin (TF4), 3′-O-methylcatechin 7-O-β-D-glucopyranoside

(TF6);

- 01 hợp chất stilbenoid: resveratrol-3-O-β-D-glucoside (TP4);

- 01 hợp chất phenol đơn giản: 3,4-dimethoxyphenyl 2-O-(3-O-methyl-α-L-

rhamnopyranosyl)-β-D-glucopyranoside (TP7);

- 02 lignan: cedrusin (TL2), cedrusin-4-O-β-D-glucopyranoside (TL3).

Chất TF6, TP4 và TP7 lần đầu tiên được tìm thấy trong chi Pinus.

3. Thành phần hóa học của gỗ loài Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius)

Từ gỗ của loài này đã đã phân lập và xác định được 06 hợp chất. Trong đó có:

- 03 totarane diterpenoid: totarol (TT7), totarol-19-carboxylic acid (TT8),

inumakiol D (TT9);

- 01 bis–diterpenoid: macrophyllic acid (TT10);

- 02 sterol: β-sitosterol (TS1), daucosterol (TS2).

Trong các chất đã tách được thì chất TT8, TT9 và TT10 lần đầu tiên được tìm

thấy từ loài này.

4. Đánh giá bước đầu về hoạt tính sinh học các chất sạch tách ra được

Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào cho thấy chất TT7 và TT10 có hoạt tính

ức chế khá tốt đối với dòng tế bào KB.

Các chất stilbenoid TP2 và TP3 thể hiện mức hoạt tính ức chế tương đối khá

trên các dòng tế bào ung thư SK-LU-1, MCF-7 và Hep-G2. Trong khi đó, TT10 cũng

cho thấy mức hoạt tính ức chế trung bình đối với các dòng tế bào này.

Các chất TT6 và TF1 có khả năng ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA (pha

S); TP2 có khả năng ức chế sự phân bào (pha G2/M) của chu trình tế bào ở các tế bào

bạch cầu tủy xương cấp tính nên làm suy giảm đáng kể số lượng các tế bào thử

nghiệm. Trong khi đó, hỗn hợp TT2 và chất TT10 có thể làm giảm số lượng các tế

bào bạch cầu tủy xương cấp tính theo cách ức chế quá trình sinh tổng hợp DNA và

quá trình phân bào (pha G2/M) của chu trình tế bào.

❖ Kết luận chung: Các kết quả của luận án đã thực hiện được mục tiêu đề ra là

nghiên cứu thành phần hóa học của các loài Pinus dalatensis, Pinus kesiya,

118

Podocarpus neriifolius và thử nghiệm một số hoạt tính sinh học của các chất sạch có

hàm lượng lớn. Trong tổng số 34 hợp chất tách ra được có: 07 chất lần đầu tiên được

tìm thấy từ chi Pinus, 06 chất và 01 hỗn hợp có hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng

tế bào ung thư thử nghiệm. Các chất tách ra được đều thuộc những lớp chất đã được

công bố trong chi Pinus và Podocarpus.

❖ Kiến nghị

1. Tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa học của các bộ phận chưa được nghiên

cứu từ ba loài Pinus dalatensis, Pinus kesiya và Podocarpus neriifolius.

2. Nghiên cứu sâu hơn về hoạt tính và cơ chế tác dụng của các chất có hoạt tính

để làm rõ bản chất cũng như làm cơ sở định hướng cho những nghiên cứu tiếp

theo.

119

DANH SÁCH CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ

1. Nguyen Hoang Sa, Nguyen Thanh Tam, Nguyen Thi Hoang Anh, Dao Duc

Thien, Tran Duc Quan, Dinh Thi Phong, Le Quoc Thang, Tran Van Sung, Trinh

Thi Thuy, Diterpenoids from the wood of Podocarpus neriifolius, Vietnam

Journal of Chemistry, International Edition, 2016, 54(4), 488-490.

2. Nguyễn Hoàng Sa, Nguyễn Thanh Tâm, Đào Đức Thiện, Trần Đức Quân, Trần

Văn Sung, Trịnh Thị Thủy, Các hợp chất phenol từ rễ Thông ba lá (Pinus kesiya),

Tạp chí Hóa học, 2016, 54(6A), 40-43.

3. Nguyen Hoang Sa, Nguyen Thanh Tam, Nguyen Thi Hoang Anh, Dao Duc

Thien, Tran Duc Quan,Tran Van Sung, Trinh Thi Thuy, Abietane diterpenoids

and neolignans from the roots of Pinus kesiya, Vietnam Journal of Chemistry,

International Edition, 2017, 55(2), 240-243.

4. Nguyen Hoang Sa, Nguyen Thanh Tam, Nguyen Thi Hoang Anh, Tran Duc

Quan, Dao Duc Thien, Dinh Thi Phong, Tran Van Sung, Trinh Thi Thuy,

Chemical constituents from the leaves of Pinus dalatensis Ferré, Natural Product

Research (SCIE), đã online từ 10/07/2017 (http://dx.doi.org/10.1080/14786419.2017.1350672)


Quan, Dao Duc Thien, Tran Van Sung, Trinh Thi Thuy, Chemical constituents of

Pinus dalatensis Ferré wood and their effect on proliferation of acute myeloid

leukemia cells, Letters in Organic Chemistry (SCIE), 2017, đang chờ chấp nhận đăng

(đã có ý kiến phản biện lần 2).


Quan, Dao Duc Thien, Tran Van Sung, Trinh Thi Thuy,Terpenoids from Pinus

dalatensis leaves. Vietnam Journal of Chemistry, International Edition, 2017, đã

nhận đăng

120

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Đỗ Huy Bích và cộng sự, Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập 1,

NXB Khoa học và Kỹ thuật, 2006, Hà Nội.

2. P. Thomas & P.K. Loc, Pinus dalatensis. The IUCN Red List of Threatened

Species 2013, 2013, e.T32803A2823679.

3. N.T. Hiep, P.K. Loc, N.D.T. Luu, T.L. Phillip, Vietnam Conifers: Conservation

Status Review 2004, 2004, 42–43. ISBN 1-872291-64-3.

4. S. Guirong et al, Preliminary Study of the Chemical Constituents of Pinus

Kesiya R. Pinecone, Journal of Dali Teachers College, 2013, 12(9), 4-6.

5. S. Guirong et al, Chemical Constituents from Pinecone of Pinus kesiya R.,

Journal of Dali Teachers College, 2014, 13(4), 1-2+11.

6. Phan Văn Thắng, Đặng Xuân Trường, Nguyễn Đức Tố Lưu, Hà Công Liêm ,

Chi dân vê cac loai thông ở vùng núi Mai Châu - Mộc Châu tinh Hoa Binh, Sơn

La, NXB Nông nghiêp ,2013.

7. Dictionary of Natural Products, version 20:2, Chapman&Hall/CRC, 2012.

8. S. Karel and Z. Eugenee, Composition of turpentine from Pinus edulis wood

oleoresin, Phytochemistry, 1975, 14(9), 2025-2028.

9. U. Zeynep, K. Salih, B. Fuat, A. Burhan, E. Selim, C. Menderes and K. M.

Göksin, Chemical composition, antimicrobial, insecticidal, phytotoxic and

antioxidant activities of Mediterranean Pinus brutia and Pinus pinea resin

essential oils, Chinese Journal of Natural Medicines, 2014, 12(12), 901-910.

10. T. İbrahim and R. Markku , A Comparative Study on Turpentine Oils of

Oleoresins of Pinus sylvestris L. from Three Districts of Denizli, Records of

Natural Products, 2010, 4(4), 224-229.

11. K. Katerina, G. Athanassios, P. Danae, P. Dimitrios, M. Antonios and T. Olga,

Greek Pinus essential oils: larvicidal activity and repellency against Aedes

albopictus (Diptera: Culicidae), Parasitology Research, 2015, 114(2), 583-592.

12. L. Bo, S.Y. Heng, H.Y. Ren, Z.W. Dong, Chemical Constituents and Biological

Activities of Pinus Species, Chemistry & Biodiversity, 2013, 10(12), 2133-2160

13. A. Ismail, H. Mohsen, J. Bassem and H. Lamia, Essential oils of Pinus nigra J.

F. Arnold subsp. laricio Maire: chemical composition and study of their

herbicidal potential, Arabian Journal of Chemistry, 2017, 10(sup.2), s3877-

s3882.

14. X. Qing, L. Zhihong and L. Zhouqi, Chemical Composition and Antioxidant

Activity of Essential Oil of Six Pinus Taxa Native to China, Molecules, 2015,

20(5), 9380-9392.

121

15. F.J. Min, T.W. Yu, C.Y. Shia, Serratene triterpenes from Pinus armandii bark,

Phytochemistry, 1991, 30(4), 1333-1336.

16. C.H. Anthony, N.A. Bhimsen, R.W. John, New serratane triterpenes from

western white pine bark, Tetrahedron, 1984, 40(21), 4217-4226.

17. C.Y. Shia, C.E.H. Tsun, F.G.J. Min, The Neutral Part of the Bark of Pinus lu-

chuensis Mayer, Journal of the Chinese Chemical Society, 1975, 22(4), 341-

347.

18. W. Shun-ichi, L. Akira, T. Reiko, Triterpene Constituents from the Stem Bark

of Pinus luchuensis and their DNA Topoisomerase II Inhibitory Effect, Planta

Medica, 2001, 67(7), 659-664.

19. K.P. James, E. Günter, W.R. Brian, R.W. John, C.H. Anthony, N.A. Bhimsen,

New Triterpenes from the Bark of Western White Pine (Pinus monticola

DOUGL.), Helvetica Chimica Acta, 1981, 64(4), 1183-1207.

20. W. Shun-ich, T. Reiko, Four New Trisnorlanostene-Type Triterpenoids from

the Stem Bark of Pinus luchuensis, Journal of Natural Products, 2000, 63(8),

1055-1057.

21. W. Bin, J. Jing, H.X. Feng, Y. Tao, Y.J. Min, Three New Terpenoids from Pinus

yunnanensis, Helvetica Chimica Acta, 2010, 93(3), 490-496.

22. C.H.T. Andrew, M. Toshio, L.P. Mark, S.A. Mary, Further acidic constituents

and neutral components of Pinus massoniana Resin, Tetrahedron, 1993, 49(36),

7903- 7915.

23. Y.N. Yun, L. Li, T.W. Wei, D.J. Ao, T.L. Juan, Diterpenoids from Pinus

massoniana resin and their cytotoxicity against A431 and A549 cells,

Phytochemistry, 2010, 71(13), 1528-1533.

24. Z.Y. Xing; Z. Lu, G. Lin, L.X. Dong, Z. Jun, Note: A new diterpenoid and active

stilbenes from Pinus armandii heartwood, Journal of Asian Natural Products

Research, 2005, 7(3), 259-264.

25. F. Tao, C.X. Hai, T.Q. Gang, L.X, Dong, Abietane Diterpenoids and a Lignan

from Pinus yunnanensis, Zeitschrift für Naturforschung B, 2010, 65(6), 765-

769.

26. L. Ting, L. Yan, L.D. Mei, L.G. Ming, L.J. Kai. W. Fei, A novel phenolic

compound from Pinus yunnanensis, Journal of Asian Natural Products

Research, 2011, 13(5), 425-429.

27. Z.F. Duane, M.V. Thomas, W. Jocclyn, Major resin acids of Pinus nigra

needles, Phytochemistry, 1985, 24(6), 1273-1277.

28. M. Toshifumi, W. Shun-ichi, T. Harukuni, T. Genzoh, M. Osamu, T. Reiko,

Potential Antitumor-Promoting Diterpenes from the Cones of Pinus luchuensis,

Chemistry of Natural Compounds, 2002, 65(12), 1921-1923.

122

29. F.J. Min, LChi-I, C.W. Lieh, C.Y. Shia, Diterpenoid acids from the leaves of

armand pine, Phytochemistry, 1991, 30(8), 2793-2795.

30. S.Md. Zakir, J.Y. Min, M.S. Sik, Labdane-Type Diterpenes Active against Acne

from Pine Cones (Pinus densiflora), Planta Medica, 2008, 74(4), 449-452.

31. W. Qiang, R. Zhang, T. Jie, T. Yoshihisa, D.H. Quan, Two new antitumor

diterpenes from Pinus sylvestris, Chinese Chemical Letters, 2008, 19(2), 187-

189.

32. T. Jie, R. Zhang, Z.Y. Wen, D.H. Quan, T. Yoshihisa, A new labdanic

norditerpene from Pinus sylvestris, Natural Product Research, 2010, 24(17),

1587-1591.

33. D.F. Zinkel, B.B. Evans, Terpenoids of Pinus strobus cortex tissue,

Phytochemistry, 1972, 11(11), 3387- 3389.

34. V. A. Raldugin, V. A. Pentegova, New diterpenoid components of the oleoresin

of Pinus koraiensis, Chemistry of Natural Compounds, 1976, 12(2), 157-161.

35. J.M. Jung, J.H. Ah, K.S. Sik, H.G. Sook, C.J. Sue, A new abietic acid-type

diterpene glucoside from the needles of Pinus densiflora, Archives of

Pharmacal Research, 2009, 32(12), 1699-1704.

36. F.J. Min, C.C. Feng, C.Y. Shia, Flavonoids from Pinus morrisonicola,

Phytochemistry,1987, 26(9), 2559-2561.

37. F.J. Min, S.W. Chiung, C.Y. Shia, Flavonoids and stilbenes from armand pine,

Phytochemistry, 1988, 27(5), 1395-1397.

38. P. Hefeng, L.N. Lennart, Phenolics from inner bark of Pinus sylvestris,

Phytochemistry, 1996, 42(4), 1185-1189.

39. C.M. Mário, C.C. Daniela, C.G. Acácio, Chemical Constituents from Pinus

strobus var. Chiapensis, Journal of the Brazilian Chemical Society, 1996,

7(3):187-191.

40. W. Wei, W.X. Hua, Y.J. Feng, Z.X. Jie, Study on the active compounents of

anti-platelet aggregation from pine needles of Pinus massoniana Lamb, Chinese

Journal of Hospital Pharmacy, 2008-3, 190-194.

41. W. Wei, W.X. Hua, Y.J. Feng, Z.X. Jie, Study on the flavanoid chemical

constituents from pine needles of Pinus massoniana, Chinese Journal of

Hospital Pharmacy, 2008-7, 549-552.

42. K.J. Hee, K.J. Hun, C.S. Eun, P.K. Hee, L.M. Won, Inhibitory effects of

phenolic compounds from needles of Pinus densiflora on nitric oxide and PGE2

production, Archives of Pharmacal Research, 2010, 33(12), 2011-2016.

43. E. Holger, K. Bjarne and N. Torbjorn, Wood constituents of Ducamponius

Krempfii (Lecomte) chevalier (Pinus Krempfii Lecomte), Phytochemistry,

1966, 5, 927-931.

123

44. L.T.H. Nhung, T.T.Thuy, N.T. Tam, D.T. Phong, N.T.Hiep, T.V. Sung,

Flavonoids and their biological activities from the rootbark of Pinus krempfii

Lecomte., Vietnam Journal of Chemistry, 2013, 51(5A), 22-26.

45. F. Weisheng, Z. Xiaozuo, W. Yanzhi, B. Yuefeng, W. Xinliang, Isolation and

structure identification of the chemical constituents from pine needles of Pinus

massoniana Lamb, Natural Product Research and Development, 2004, 16(6),

500-502.

46. C.E. Mi, Antinociceptive and antiinflammatory activities of pine (Pinus

densiflora) pollen extract, Phytotherapy Research, 2007, 21(5), 471-475.

47. K. Dhirender, K. Ajay, K. Pawan, A. C. Rana, Analgesic and Anti-

Inflammatory Activity of Pinus roxburghii Sarg., Advances in Pharmacological

Sciences, 2012, 2012, 1-6.

48. S. Ipek, T. Ibrahim, U. Osman, K. Hikmet and K. A. Esra, Appraisal on the

wound healing and anti-inflammatory activities of the essential oils obtained

from the cones and needles of Pinus species by in vivo and in vitro experimental

models, Journal of Ethnopharmacology, 2012, 139(2), 533-540.

49. X. Yang, Y. C. Zhang, H. Zhang, A. J. Dong, H. T. Zhao, D. C. Xu, Y. Ma, J.

Wang, Diterpenoid acids from Pinus koraiensis, Chemistry of Natural

Compounds, 2010, 46(2), 227-229.

50. H. Sakagami, M. Ikeda, S. Unten, K. Takeda, J. Murayama, A. Hamada, K.

Kimura, N. Komatsu, K. Konno, Antitumor activity of polysaccharide fractions

from pine cone extract of Pinus parviflora Sieb. et Zucc., Anticancer Research,

1987, 7(6), 1153-1159.

51. H. Nagasawa, Y. Iwai, M. Iwai, A. Suzuki, S. Imai, Suppression by a pine cone

extract of Pinus parviflora Sieb et Zucc of mammary tumour virus in milk of

mice, Anticancer Research, 1992, 12(3), 845-847.

52. K. Maria, Y. Dido, R. Michail, A. Lima, Cancer chemopreventive effects of

Pinus Maritima bark extract on ultraviolet radiation and ultraviolet radiation-

7,12,dimethylbenz(a)anthracene induced skin carcinogenesis of hairless mice,

Cancer Letters, 2006, 237(2), 234-241.

53. L. Kun, L. Qingwang, L. Jian, G. Dawei, Z. Tao, H.Z. Sheng, Z. Fulu, Effect of

procyanidins from Pinus koraiensis bark on growth inhibition and expression

of PCNA and TNF-α in mice with U14 cervical cancer, Therapy, 2007, 4(5),

685-690.

54. O.Y. Celiktas, M. Ganzera, I. Akgun, C. Sevimli, K.S. Korkmaz, E. Bedir,

Determination of polyphenolic constituents and biological activities of bark

extracts from different Pinus species, Journal of the Science of Food and

Agriculture, 2009, 89(8), 1339-1345.

124

55. M. Hongling, L. Bing, F. Dongru, X. Heng, L. Ruoda, Y. Yixing, W. Hongbin,

W. Jinfa, Pinus massoniana bark extract selectively induces apoptosis in human

hepatoma cells, possibly through caspase-dependent pathways, International

Journal of Molecular Medicine, 2010, 25(5), 751-759.

56. J.J. Rang, P. J. Sung, P.Y. Kyoung, C.Y. Zoo, L.G. Hee, P.G. Young, J.B. Churl,

Pinus densiflora leaf essential oil induces apoptosis via ROS generation and

activation of caspases in YD-8 human oral cancer cells, International Journal

of Oncology, 2012, 40(4), 1238-1245.

57. Z. Pan, Y. Xin, H.W. Wei, Z.H. Tian, W. Jing, X.R. Bo, H.X. Long, S.S. Yan,

Q. Di, Characterization and bioactivity of polysaccharides obtained from pine

cones of Pinus koraiensis by graded ethanol precipitation, Molecules, 2013,

18(8), 9933-9948.

58. W. Natthida, M. Sasipawan Machana, B. Sahapat, Synergistic effects of

melphalan and Pinus kesiya Royle ex Gordon (Simaosong) extracts on

apoptosis induction in human cancer cells, Chinese Medicine, 2016, 11:29.

59. T. Reiko, T. Harukuni, E. Yoichiro, Cancer chemopreventive activity of “rosin”

constituents of Pinus spez. and their derivatives in two-stage mouse skin

carcinogenesis test, Phytomedicine, 2008, 15(11), 985-992.

60. R. Noor, I. Astuti, Mustofa, Cytotoxicity of α-terpineol in HeLa cell line and its

effects to apoptosis and cell cycle, Journal of the Medical Sciences, 2014, 46(1),

1-9.

61. P.J. Sung, L.G. Hee, Volatile compounds and antimicrobial and antioxidant

activities of the essential oils of the needles of Pinus densiflora and Pinus

thunbergii, Journal of the Science of Food and Agriculture, 2011, 91(4), 703-

709.

62. S.S. Verma, W.R. Yajima, M.H. Rahman, S. Shah, J.J. Liu, A.K.M.

Ekramoddoullah, N.N.V. Kav, A cysteine-rich antimicrobial peptide from

Pinus monticola (PmAMP1) confers resistance to multiple fungal pathogens in

canola (Brassica napus), Plant Molecular Biology, 2012, 79(1), 61-74.

63. B. Esin, B. Hüseyin, Chemical composition, antibacterial and antifungal

activities of turpentine oil of Pinus sylvestris L. against plant bacterial and

fungal pathogens, Food-Agriculture and Environment, 2013, 11(3&4), 2261-

2264.

64. M. Shuaib, M. Ali, J. Ahamad, K.J. Naquvi, M.I. Ahmad, Pharmacognosy of

Pinus roxburghii: A Review, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry,

2013, 2(1), 262-268.

65. A. Gessica, A. Fariza, S. Patrick, A.R. Sérgio, V.C.S. Rodrigo, C.R. Wilson,

P.H. Regina, M.G.H. Carlos, Antifungal Activity of Oleoresin and Fractions of

125

Pinus elliottii Engelm and Pinus tropicalis against Phytopathogens, American

Journal of Plant Sciences, 2014, 5(26), 3898-3903.

66. F. Nadia, A. Hocine, M. Salima, C. Faïza, M. Djamila, M.E. Aminea, D.

Nassim, M. Alain, T. Boufeldja, C. Jean, Chemical composition and

antibacterial activity of Pinus halepensis Miller growing in West Northern of

Algeria, Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2013, 4(2), 97-103.

67. K. Hyeusoo, L. Byongsoon, Y.W. Kyeong, Comparison of chemical composi-

tion and antimicrobial activity of essential oils from three Pinus species, Indus-

trial Crops and Products, 2013, 44, 323-329.

68. S. Eileen, W. Elizabeth, Z. Mire, G. Simon, Isopimaric acid from Pinus nigra

shows activity against multidrug-resistant and EMRSA strains of

Staphylococcus aureus, Phytotherapy Research, 2005, 19(6), 538-542.

69. W.M. Girma, W. Gerald, S.P. Maya, M.M. William, T.N. Barbara, Antibacterial

diterpenes from Calceolaria pinifolia., Journal of Natural Products, 2003,

66(2), 242-246.

70. S.X. Yu, W.Z. Yu, L.J. Ren, In vitro and in vivo antioxidant activity of Pinus

koraiensis seed extract containing phenolic compounds, Food Chemistry, 2009,

117(4), 681-686.

71. P.Y. Soo, J.M. Hee, H.H. Jung, P.M. Ra, L.S. Hyeon, K.S. Gu, K. Mihyang,

Antioxidant activity and analysis of proanthocyanidins from pine (Pinus

densiflora) needles, Nutrition Research and Practice, 2011, 5(4), 281-287.

72. A. Puri, Anuj K. Srivastava, B. Singhal, S. K. Mishra, S. Srivastava, V. Lakshmi,

Antidyslipidemic and antioxidant activity of Pinus roxburghii needles,

Medicinal Chemistry Research, 2011, 20(9), 1589-1593.

73. K. Ismail, Spectrometric Studies on Antioxidant Activity of Pinus Nigra Resin

in Vitro and Its Total Phenolic and Flavonoid Content, Current Pharmaceutical

Analysis, 2016, 12(2), 146-151.

74. C. Debprasad, K.T.H. Mahmud, Ethnomedicines and ethnomedicinal

phytophores against herpesviruses, Biotechnology Annual Review, 2008, 14,

297-348.

75. M. Abad, J. Maria, Antiviral activities of polysaccharides from natural sources,

Studies in Natural Products Chemistry, 2005, 30, 393-418.

76. N. Masatoshi, I. Yoshiko, M. Toshiaki, N. Hideki, Anti-HIV activity of alkaline

extract from pine seed shells (Pinus koraiensis), Asia Pacific Journal of Clinical

Nutrition, 1998, 7(1), 84-87.

77. Z. Xuan, Y.L. Meng Yang, L.G. Ming, L.Y. Juan, Z.C. Bo, L.Y. Jun, L.H. Zhi,

Z.Y. Tang, Potent anti-HIV activities and mechanisms of action of a pine cone

extract from Pinus yunnanensis, Molecules, 2012, 17(6), 6916-6929.

126

78. P. Kaushik, G. Singh, S.L. Khokra, D. Kaushik, Bioassay Guided Fractionation

and α-Amylase Inhibitory Activity of Flavanoid Isolated from Pinus roxburghii

Sarg. Natural Products Chemistry & Research, 2015, 3:179.

79. P. Kaushik, D. Kaushik, S. L. Khokra, Ethnobotany and phytopharmacology of

Pinus roxburghii Sargent: a plant review, Journal of Integrative Medicine,

2013, 11(6), 371-376.

80. G. Marimuthu, R. Mohan and B. Giovanni, Chemical composition, toxicity and

non-target effects of Pinus kesiya essential oil: An eco-friendly and novel

larvicide against malaria, dengue and lymphatic filariasis mosquito vectors,

Ecotoxicology and Environmental Safety, 2016, 129, 85-90.

81. F. Aljos, A Handbook of the World's Conifers, Brill Academic Pub, 2010, pp.

795–796, Netherlands.

82. A. K. Satish, B.B. Robert, C.C.C. Paul, S.L.E. Wolfango, B.S. Keith, N.M.

Galbraith, Structures of norditerpene lactones from Podocarpus species,

Journal of Organic Chemistry, 1976, 41(14), 2458-2461.

83. H. Yuji, M. Takeshi, Y. Yo-ichi, S. Takeo, New congeners of cytotoxic nor-

diterpenoid dilactones in Podocarpus nagi: three highly polar components with

α-pyrone ring, Tetrahedron Letters, 1977, 18(34), 2953-2956.


diterpenoid dilactones in Podocarpus nagi: two C19 lactones from seed extract,

Tetrahedron Letters, 1977, 18(41), 3637-3640.


diterpenoid dilactones in Podocarpus Nagi: three new components of 7,8-

epoxy-enolide type, Tetrahedron Letters, 1977, 18(48), 4215-4218.

86. Y.B. Ping, K. Isao, Chairul, M. Takeshi, H. Yuji, Congeners of norditerpene

dilactones from Podocarpus nagi, Phytochemistry, 1990, 29(12), 3953-3955.

87. K. Isao, H. Masaki, Y.B. Ping, An antifungal norditerpene dilactone from

Podocarpus nagi, Phytochemistry, 1991, 30(5), 1467-1469.

88. K. Isao, Y.B. Ping, Two nor-diterpene dilactones from Podocarpus nagi,

Phytochemistry, 1991, 30(6), 1967-1969.

89. K. Isao, Y.B. Ping, A bisnorditerpene dilactone from Podocarpus nagi,

Phytochemistry, 1991, 30(10), 3476-3477.

90. K. Isao, Y.B. Ping, Norditerpene dilactones from Podocarpus nagi,

Phytochemistry, 1993, 34(4), 1107-1110.

91. X.L. Jang, X.Y. Min Xu, F.S. Ding, Three diterpene dilactone glycosides from

Podocarpus nagi, Phytochemistry, 1995, 39(5), 1143-1145.

127

92. H. Hiroyuki, H. Ishikawa, Y.B. Ping, K. Isao, Inhibition of lipid peroxidation

by diterpenoid from Podocarpus nagi, Cellular and Molecular Life Sciences,

1996, 52(6), 573-576.

93. X.Y. Ming, X.L. Jiang, Two new diterpene dilactone glycosides with a

trisaccharide moiety from Podocarpus nagi, Studies in Plant Science, 1999, 6,

399-402.

94. Z. Yi, T. Chunping, S.S.V. Tanemossu, K. Changqiang, Y. Yang, Two new

Cyclopeptides from Podocarpus nagi, Cellular and Molecular Life Sciences,

2012, 30(6), 1361-1364.

95. Z. Hongmei, L. Haoliang, H. Guoli, C. Yegao, A new abietane mono-

norditerpenoid from Podocarpus nagi, Natural Product Research, 2017, 31(7)

(7), 844-848.

96. H.A. Johnny, C.C. Jer, Mc.L. Jerry, C.M. John, W.J. Daniel, W. Ernest, F.F.

Sebastiko, C.J.D. Paiva, The cytotoxic norditerpene dilactones of Podocarpus

milanjianus and Podocarpus sellowii, Phytochemistry, 1979, 18(10), 1691-

1694.

97. H.A. Johnny, C.C. Jer, Mc.L. Jerry, C.J.D. Paiva, Milanjilactones A and B, two

novel cytotoxic norditerpene dilactones from Podocarpus milanjianus Rendle,

Cellular and Molecular Life Sciences, 1980, 36(1), 28-29.

98. C.M. John, L.K. Teresa, Mc.C.G. Thomas, H.A. Johnny, B.R. Stephen, C.C.

Jer, Revised structure of podolactone C, the antileukemic component of

Podocarpus milanjianus Rendle, Journal of Organic Chemistry, 1984, 49(5),

942-945.

99. K. Enid, L. Ping, Chemical Constituents of Podocarpus milajianus Rendle,

Journal of China Pharrnaceutical University, 2005, 36(2), 118-121.

100. S. Roy, P. Gary, P. Raymond, M. Wenwen, H. Peter, The occurrence of the

anti-cancer diterpene taxol in Podocarpus gracilior Pilger (Podocarpaceae),

Biochemical Systematics and Ecology, 1999, 27(6), 613-622.

101. F. Laura, T. Abeer, S. Tiziana, T.D. Nunziatina, B. Alessandra, Terpenoids from

the leaves of Podocarpus gracilior, Phytochemistry Letters, 2012, 5(2), 297-

300.

102. P.H. Sun, T. Yoshinao, F. Haruhiko, A. Yutaka, T. Koichi, SR-Podolactone D,

a new Sulfoxide-containing norditerpene dilactone from Podocarpus

macrophyllus var. maki, Journal of Natural Products, 2003, 66(2), 282-284.

103. P.H. Sun, Y. Naoki, F. Haruhiko, A. Yutaka, T. Koichi, Rakanmakilactones A–

F, new cytotoxic sulfur-containing norditerpene dilactones from leaves of

Podocarpus macrophyllus var. maki, Tetrahedron, 2004, 60(1), 171-177.

128

104. C.K. Ta, H.H. Lin, C.S. Hui, H.P. Ke, H.H. Shan, L.C. Kuo, L.M. Hsien, New

Constituent from Podocarpus macrophyllus var. macrophyllus Shows Anti-

tyrosinase Effect and Regulates Tyrosinase-Related Proteins and mRNA in

Human Epidermal Melanocytes, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2007,

55(5), 757-761.

105. Q. Yun, S.W. Wei, F.J. Feng, Z.J. Dong, Flavonoids from Podocarpus

macrophyllus and their cardioprotective activities, Journal of Asian Natural

Products Research, 2014, 16(2), 222-229.

106. L.H. Liang, S.H. Chuan, Z. Yan, C.Y. Gao, Chemical Constituents of the Barks

of Podocarpus macrophyllus, Chemistry of Natural Compounds, 2016, 52(3),

539-541.

107. D.P. Krishna, R. Ranjala, C.H. Nancy, W.A. Jennifer, H.J. Curtis, McM.B.

James, B.A. John, Inhibitors of the Oncogenic Transcription Factor AP-1 from

Podocarpus latifolius, Journal of Natural Products, 2011, 74(3), 374-377.

108. F. Laura, T. Abeer, T.D. Nunziatina, B. Alessandra, Diterpenes, ionol-derived,

and flavone glycosides from Podocarpus elongatus, Phytochemistry, 2012, 76,

172-177.

109. Z.L. Chun, W.X. De, H. Juan, L. Yan, Z.R. Ping, Z.Q. Shi, Three new abietane

diterpenoids from Podocarpus fleuryi, Phytochemistry Letters, 2013, 6(3), 364-

367.

110. L. Juan, Y. Caiqiong, Z. Junjie, W. Jichun, C. Yegao, A new 5(6→7) abeo-

sterol from the twigs of Podocarpus fleuryi, Natural Product Research, 2017,

31(2), 175-180.

111. H. Yang, D.X. Xia, L.H. Zhen, S. Tao, R.D. Mei, L.H. Xiang, W.X. Ning,

Podoimbricatin A, a cytotoxic diterpenoid with an unprecedented 6/6/5/6-fused

tetracyclic ring system from the twigs and leaves of Podocarpus imbricatus,

Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2014, 24(15), 3326-3328.

112. M. N. Galbraith, D. H. S. Horn, S.M. Jenneth, Podolactones C and D, terpene

sulphoxides from Podocarpus neriifolius, Journal of the Chemical Society D:

Chemical Communications, 1971, 1362b-1363.

113. H. Syed, R. Mehdi, R. Wasiur, O. Masayoshi, K. Nobusuke, Biflavones from

Podocarpus neriifolius, Phytochemistry, 1974, 13(9), 1990.

114. H. Syed, R. Mehdi, R. Wasiur, 7,4′-Dimethylaromadendrin and its 5-glucoside

from Podocarpus neriifolius, Phytochemistry, 1974, 13(12), 2879.

115. K. Shrestha, A.H. Banskota, S. Kodata, S.P. Shrivastava, G. Strobel, M.B.

Gewali, An antiproliferative norditerpene dilactone, Nagilactone C, from

Podocarpus neriifolius, Phytomedicine, 2001, 8(6), 489-491.

129

116. W.J. Jing Wu, L.H. Liang, H. Guoli, C. Yegao, A new cyclopeptide and a new

lignan from Podocarpus neriifolius, Natural Product Research, 2017, 31(1),

239-244.

117. Y. Henry, T. Yasuhiro, K. Tohru, S. Sutardjo, Constituents of Sindora

sumatrana MIQ.I. Isolation and NMR Spectral Analysis of Sesquiterpenes from

the Dried Pods, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1994, 42(1), 138-146.

118. Z.Q. Hui, L.C. Li, Z.X. Wu, J.J. Guo, Isolation and identification of ingredients

inducing cancer cell death from the seeds of Alpinia galanga, a Chinese spice,

Food & Function, 2015, 6(2), 431-443.

119. F.J. Min, H.K. Chio, C.Y. Shia, Terpenoids from leaves of Calocedrus

formosana, Phytochemistry, 1989, 28(4), 1173-1175.

120. C.S. Chang, L.H. Kang, K.Y. Hsiung, Two New Compounds from the Leaves

of Calocedrus microlepic var. formosana, Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 2004, 52(6), 762-763.

121. W.E. Sook et al, Suppression of adipocyte differentiation by 15-

methoxypinusolidic acid through inhibition of PPARγ activity, Archives of

Pharmacal Research, 2010, 33(7), 1035-1041.

122. K. Kiyotaka, F. Fumiko, K. Junko Kimura, O. Toru, The Constituents of

Osmunda spp., The Japanese Society of Pharmacognosy, 1978, 32(2), 126-128.

123. J.W. Jerzy et al, Labdanes and Isopimaranes from Platycladus orientalis and

Their Effects on Erythrocyte Membrane and on Plasmodium falciparum

Growth in the Erythrocyte Host Cells, Journal of Natural Products, 2004, 67(4),

631-637.

124. L.M. Sun, L.S. Ok, K.S. Hoon, L.E. Ok, L.H. Jeong, Anti-Cancer Effect of

Lambertianic Acid by Inhibiting the AR in LNCaP Cells, International Journal

of Molecular Sciences, 2016, 17(7), 1066.

125. W.L. Jean et al, ent-Labdane diterpenes from the aquatic plant Potamogeton

pectinatus, Phytochemistry, 2003, 64(7), 1309-1317.

126. C.H. Ting et al, Isolation of antibacterial diterpenoids from Cryptomeria

japonica bark, Natural Product Research, 2008, 22(12), 1085-1093.

127. C.S. Sung, C.S. Tzen, Bioactivity and characterization of exudates from

Cryptomeria japonica bark, Wood Science and Technology, 2014, 48(4), 831-

840.

128. I. H. Rogersand, L. R. Rozo, Neutral terpenes from the bark of Sitka spruce

[Picea sitchensis (Bong.) Carr.], Canadian Journal of Chemistry, 1970, 48(6),

1021-1025.

130

129. T. Reiko, M. Chonhi, U. Yoshihide, M. Shunyo, 3-oxo-serratene triterpenoids

from the stem bark of Picea jezoensis Carr. Hondoensis, Phytochemistry, 1994,

35(6), 1517-1722.

130. W. Yi, Q. Wei, G. Di, L.J. Yu, L.Y. Li, Phenols and flavonoids from the aerial

part of Euphorbia hirta, Chinese Journal of Natural Medicines, 2012, 10(1),

40-42.

131. L. Xi, W.W. Zhu, L. Qiang, W. Jian, The Natural Flavonoid Pinocembrin:

Molecular Targets and Potential Therapeutic Applications, Molecular

Neurobiology, 2015, 53(3), 1794-801.

132. R.M. Ali, P.J. Houghton, R. Amala, J.R.S. Hoult, Antimicrobial and

antiinflammatory activities of extracts and constituents of Oroxylum indicum

(L.) Vent, Phytomedicine, 1998, 5(5), 375-381.

133. W. Iwona; Z. Agnieszka, 13C CP/MAS NMR studies of flavonoids, Magnetic

Resonance in Chemistry, 2001, 39(7), 369-419.

134. F. Sedigheh, J. Morteza, F. Ali, A systematic study on solubility and solvation

of bioactive compound chrysin in some water+cosolvent mixtures, Journal of

Molecular Liquids, 2016, 220, 478-483.

135. K. Hyunmyung, K.H. Won, J. Seunho, Aqueous Solubility Enhancement of

Some Flavones by Complexation with Cyclodextrins, Bulletin of the Korean

Chemical Society 2008, 29(3), 590-594.

136. A.S. Ibrahim et al, The methanolic extract of Boesenbergia rotunda (L.) Mansf.

and its major compound pinostrobin induces anti-ulcerogenic property in vivo:

Possible involvement of indirect antioxidant action, Journal of

Ethnopharmacology 2011, 137(2), 963-970.

137. Isabel Gómez-Betancur et al, Inhibitory effect of pinostrobin from Renealmia

alpinia, on the enzymatic and biological activities of a PLA2, International

Journal of Biological Macromolecules, 2016, 89, 35-42.

138. H.J. Kevin, Approaches to 2-substituted chroman-4-ones: synthesis of (−)-

pinostrobin, Tetrahedron Letters, 2001, 42(22), 3763-3766.

139. N.G. Ichiro, K. Osamu, N. Itsuo. Tannins and related compounds. XV. A new

class of dimeric flavan-3-ol gallates, theasinensins A and B, and

proanthocyanidin gallates from green tea leaf. Chemical and Pharmaceutical

Bulletin, 1983, 31(11), 3906 – 3914.

140. K. Saman, Green tea catechins and blood pressure: a systematic review and

meta-analysis of randomised controlled trials, European Journal of Nutrition,

2014, 53(6), 1299-1311.

141. M.A.M. Nawwar, A.M.A. Souleman, J. Buddrus, M. Linscheid, Flavonoids of

the flowers of Tamarix nilotica, Phytochemistry, 1984, 23(10), 2347-2349.

131

142. F. Torgils, L. Åsmund, K.T. Bernard, A.M. Øyvind, Flavonoids from blue

flowers of Nymphaèa caerulea, Phytochemistry, 1999, 51(8), 1133-1137.

143. W. S. Chang et al, Inhibitory effects of flavonoids on xanthine oxidase,

Anticancer Research, 1993, 13(6A), 2165-2170.

144. L.Y. Hee, K.I. Hwan, S.J. Ju, In vitro activity of kaempferol isolated from the

Impatiens balsamina alone and in combination with erythromycin or

clindamycin against Propionibacterium acnes, Journal of Microbiology, 2007,

45(5), 473-477.

145. R.H. Sik, C. J. Youl et al, Kaempferol and kaempferol rhamnosides with

depigmenting and anti-inflammatory properties, Molecules, 2011, 16(4), 3338-

3344.

146. S. Durlubh, Pharmacological properties of flavonoids including flavonolignans-

Integration of petrocrops with drug development from plants, Journal of

scientific and industrial research, 2006, 65(6), 477-484.

147. S.B. Duff et al, Identification of kaempferol as a monoamine oxidase inhibitor

and potential Neuroprotectant in extracts of Ginkgo biloba leaves, Journal of

Pharmacy and Pharmacology, 2000, 52(4), 451-459.

148. L. Hongmei, O. Jimmy, S. Otto, R. Topul, Acylated Flavonol Glycosides from

Leaves of Stenochlaena palustris, Journal of Natural Products, 1999, 62(1), 70-

75.

149. A. Yoshinori, K. Keiko Kondo, T.K. Née, T. Motoo, H. Toshihiro, O. Shunichi,

Prenyl bibenzyls from the liverwort Radula kojana, Phytochemistry, 1991,

30(1), 219-234.

150. H. Fujinori, Y. Toshihiro, N. Tadakazu, Phytoalexins from Pinus strobus bark

infected with pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus,

Phytochemistry, 2001, 57(2), 223-228.

151. N.K. Sin, B.D. Geoffrey, Stilbenes, monoterpenes, diarylheptanoids, labdanes

and chalcones from Alpinia katsumadai, Phytochemistry, 1998, 47(6), 1117-

1123.

152. M. Eeva Moilanen et al, Pinosylvin and Monomethylpinosylvin, Constituents

of an Extract from the Knot of Pinus sylvestris, Reduce Inflammatory Gene

Expression and Inflammatory Responses in Vivo, Journal of Agricultural and

Food Chemistry, 2015, 63(13), 3445-3453.

153. V.C. Bret, C. Yong, Z. Nanqun, H.C. Tang, Z. Zhengyi, R.T. Robert, Isolation

and Identification of Stilbenes in Two Varieties of Polygonum cuspidatum,

Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2000, 48(2), 253-256.

132

154. B. Eberhard, Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry: A Practical

Guide, 3rd Revised Edition, p.46, Wiley, 2002, ISBN: 978-0-470-85007-7,

England.

155. L. Peng, G. Hongzhu, T. Yin, W. Qiao, G. Dean, Benzoic acid allopyranosides

from the bark of Pseudolarix kaempferi, Phytochemistry, 2006, 67(13), 1395-

1398.

156. S. Akiyo, C. Maksut, M. Takashi, Hydroxybenzoic acids from Boreava

orientalis, Phytochemistry, 1995, 40(1), 257-261.

157. D.H Fu et al, Aquilarin A, a new benzenoid derivative from the fresh stem of

Aquilaria sinensis, Molecules, 2010, 15(6), 4011-4016.

158. P. K. Agrawal, R. P. Rastogi, B.G. Osterdahl, 13C NMR spectral analysis of

dihydrobenzofuran lignans, Magnetic Resonance in Chemistry, 1983, 21(2),

119-121.

159. Y.X. Wen, Z.W. Dong et al, New Monoterpenes, Diterpenes, and Lignans from

Abies recurvata, Planta Medica, 2012, 78(14), 1574-1578.

160. L. Sanghyun et al, Isolation and identification of phytochemical constituents

from Taraxacum coreanum, Journal of the Korean Society for Applied

Biological Chemistry, 2011, 54(1), 73-78.

161. M. Weihong et al, Isolation and characterization of an α-glucosidase inhibitor

from Musa spp. (Baxijiao) flowers, Molecules, 2014, 19(7), 10563-10573.

162. M. Takashi et al, The Conversion of (+)-Dehydroabietic Acid into Steroidal

Hormones, Bulletin of the Chemical Society of Japan, 1988, 61(3), 723-727.

163. Z.W. Dong et al, Isolation, structure, and bioactivities of abiesadines A–Y, 25

new diterpenes from Abies georgei Orr, Bioorganic & Medicinal Chemistry,

2010, 18(2), 744-754.

164. P. Hefeng, L.N. Lennart, Phenolic extractives from root bark of Picea abies,

Phytochemistry, 1995, 39(6), 1423-1428.

165. T.W. Pierre, D. Alain, V. Joseph, D. Gerard and M.J. Michel, Trans-resveratrol-

3-O-β-glucoside (Piceid) in cell suspension cultures of Vitis vinifera,

Phytochemistry, 1996, 42(6), 1591-1593.

166. M. Fulvio, R. Fabiano, K. Siegfried, Isolation, Characterization, and Evolution

in Red Wine Vinification of Resveratrol Monomers, Journal of Agricultural

and Food Chemistry, 1995, 43(7), 1820-1823.

167. R.K. Gopal, M.J. Michel, Bioactive Molecules and Medicinal Plants, Springer,

2008, ISBN 978-3-540-74600-3 (Print), 978-3-540-74603-4 (Online),

Germany.

133

168. J.P. Erik Jansson, K. Lennart, W. Goran, Computer-assisted structural analysis

of polysaccharides with extended version of casper using 1H- and 13C-NMR.

data, Carbohydrate Research, 1989, 188, 169-191.

169. P.K. Agrawal, S.K. Agarwal, R.P. Rastogi, A new neolignan and other phenolic

constituents from Cedrus deodara, Phytochemistry, 1980, 19(6), 1260-1261.

170. Y.B. Ping, K. Isao, Complete 1H and 13C NMR assignments of totarol and its

derivatives, Phytochemistry, 1991, 30(6), 1951-1955.

171. R.C. Cambie, W.R.J. Simpson, L.D. Colebrook, Chemistry of the

podocarpaceae—VII: Podototarin and the constituents of the heartwood of

Podocarpus hallii kirk, Tetrahedron, 1963, 19(1), 209-217.

172. K. Isao, M. Hisae, K. Aya, Naturally Occurring Antiacne Agents, Journal of

Natural Products, 1994, 57(1), 9-17.

173. I.S. Marcos, M.A. Cubillo, R.F. Moro, D. Diez, P. Basabe, F. Sanz, J.G. Urones,

Synthesis of (+)-totarol, Tetrahedron Letters, 2003, 44(49), 8831-8835.

174. M. Takahiro, K. Hideo, A. Hiroyuki, Chemoenzymatic synthesis of (+)-totarol,

(+)-podototarin, (+)-sempervirol, and (+)-jolkinolides E and D, Tetrahedron:

Asymmetry, 2007, 18(24), 2915-2922.

175. C.J. de Paiva, F.S. Ferreira, C.C. Jer Chang; W. Ernest, Terpenes of Podocarpus

lambertius, Phytochemistry, 1975, 14(1), 243-248.

176. T. Koichi et al, Antibacterial novel phenolic diterpenes from Podocarpus

macrophyllus D. Don, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 2008, 56(12),

1691-1697.

Documents

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌCgust.edu.vn/media/25/uftai-ve-tai-day25963.pdf · bỘ giÁo dỤc vÀ ĐÀo tẠo viỆn hÀn lÂm khoa hỌc vÀ cÔng