BIOTECHNOLOGYBIOTECHNOLOGYVOL. 1, N3, 2008

BIMONTHLY

Адреса редакції:Редакція журналу «Біотехнологія», вул. Леонтовича, 9, 01601, Київ, УкраїнаТелефон: (38�044) 234�42�57; E�mail: biotech@biochem.kiev.ua

Свідоцтво про державну реєстрацію друкованого засобу масової інформаціїсерія КВ №10391 від 14.09.05

Науковий редактор Є.Л. Левицький Комп’ютерний набір Л.П. БабенкоЛітературний редактор Г.М. Шевченко Комп’ютерна верстка О.В. МележикФотороботи В.П. Артюх

Підп. до друку 14.10.08. Формат 210×297. Папір офс. 65 г/м2. Гарн. SchoolBookC.Друк — офсетний. Обл.�вид. арк. 14,0. Наклад 330 прим. Замовлення 1/6.

Оригінал�макет підготовлено в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України;друк — _________________________________.

Редакційна рада

Комісаренко Сергій Васильович(голова)Блюм Ярослав БорисовичЄгоров Олексій Михайлович (Росія)Єльська Ганна ВалентинівнаКордюм Віталій Арнольдович Кухар Валерій ПавловичМірошников Анатолій Іванович (Росія)Пастернак Чарльз (Великобританія)Підгорський Валентин СтепановичСеверин Євген Сергійович (Росія)Сибірний Андрій АндрійовичСидоров Володимирович Анатолійович(США)Скрябін Костянтин Георгійович (Росія)Созінов Олексій ОлексійовичШиробоков Володимир Павлович

Редакційна колегія

Комісаренко Сергій Васильович (головний редактор)Стойка Ростислав Степанович (заст. головного редактора)Колибо Денис Володимирович (заст. головного редактора)Ковтун Ірина Володимирівна (відповідальний секретар)Волков Георгій ЛеонідовичГончар Михайло ВасильовичДзядевич Сергій ВікторовичДробот Людмила БорисівнаКарпов Олександр ВікторовичКунах Віктор АнатолійовичЛевицький Євген ЛеонідовичЛукаш Любов ЛеонідівнаМельничук Максим ДмитровичМінченко Олександр ГригоровичСтародуб Микола ФедоровичТовкач Федір ІвановичФілоненко Валерій Вікторович

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИІНСТИТУТ БІОХІМІЇ ім. О. В. ПАЛЛАДІНА

БІОТЕХНОЛОГІЯБІОТЕХНОЛОГІЯНауковий журнал

Виходить один раз на два місяці

БИОТЕХНОЛОГИЯ / BIOTECHNOLOGYБИОТЕХНОЛОГИЯ / BIOTECHNOLOGYТом 1, №3, 2008

ЗМІСТ

ОГЛЯДИОГЛЯДИБуркат В. П.

Ковтун С. І.Сучасна біотехнологія у тваринництві . . . . . . . . . . . . . . .7

Мацелюх О. В.

Варбанець Л. Д.Колагенолітичні ферменти мікроорганізмів . . . . . . . . .13

Барабой В. А.Катехіни чайної рослини: структура, активність,застосування . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІКіт Ю. Я.

Старикович М. О.

Білий Р. О.

Скорохід Н. Р.

Янів Л. Б.

Стойка Р. С.

Імуноглобуліни молозива як молекулярні маркеридоклінічної діагностики автоімунних порушень у породіль . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37

Пирог Т. П.

Корж Ю. В.

Удосконалення біотехнології мікробногоекзополісахариду етаполану на етанолі . . . . . . . . . . . . .47

Пороннік О. О.

Шаблій В. А.

Кунах В. А.

Одержання культури тканин синяка подорожникового(Echium plantagineum L.) — продуцента шиконіновихпігментів . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56

© Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, 2008

4

НОВІ МЕТОДИНОВІ МЕТОДИГорюшкіна Т. Б.

Шкотова Л. В.

Гайда Г. З. Клепач Г. М. Гончар М. В. Солдаткін О. П. Дзядевич С. В.

Новий амперометричний біосенсор на основігліцеролоксидази для визначення вмісту гліцеролу . . .64

СТОРІНКИ ІСТОРІЇСТОРІНКИ ІСТОРІЇВидатні біотехнологи

Левицький Є. Л.Ефраїм Кацир (Качальський) — видатний досліднику галузі біохімії та біотехнології . . . . . . . . . . . . . . . . . .72

НОВИНИНОВИНИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74

НОВІ ПУБЛІКАЦІЇ З БІОТЕХНОЛОГІЇ НОВІ ПУБЛІКАЦІЇ З БІОТЕХНОЛОГІЇ ТА СУМІЖНИХ ДИСЦИПЛІН ТА СУМІЖНИХ ДИСЦИПЛІН

Молекулярна медицина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

5

СОДЕРЖАНИЕ

ОБЗОРЫОБЗОРЫБуркат В. П.

Ковтун С. И.Современная биотехнология в животноводстве . . . . . . . .7

Мацелюх О. В.

Варбанец Л. Д.Коллагенолитические ферменты микроорганизмов . . .13

Барабой В. А.Катехины чайного растения: структура, активность,применение . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИКит Ю. Я.

Старикович М. О.

Билый Р. О.

Скорохид Н. Р.

Янив Л. Б.

Стойка Р. С.

Иммуноглобулины молозива как молекулярные маркеры доклинической диагностики аутоимунныхнарушений у рожениц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37

Пирог Т. П.

Корж Ю. В.

Усовершенствование биотехнологии микробногоэкзополисахарида этаполана на этаноле . . . . . . . . . . . . .47

Поронник О. А.

Шаблий В. А.

Кунах В. А.

Получение культуры синяка подорожникового (Echium plantagineum L.) — продуцента шикониновых пигментов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .56

НОВЫЕ МЕТОДЫНОВЫЕ МЕТОДЫГорюшкина Т. Б.

Шкотова Л. В.

Гайда Г. З.

Клепач Г. М.

Гончар М. В. Солдаткин А. П. Дзядевич С. В.

Новый амперометрический биосенсор на основеглицеролоксидазы для определения содержанияглицерола . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64

СТРАНИЦЫСТРАНИЦЫ ИСТОРИИИСТОРИИ

Левицкий Е. Л.Эфраим Кацир (Качальский) — выдающийсяисследователь в области биохимии и биотехнологии . . .72

НОВОСТИНОВОСТИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74

НОВЫЕ ПУБЛИКАЦИ ПО БИОТЕХНОЛОГИИ НОВЫЕ ПУБЛИКАЦИ ПО БИОТЕХНОЛОГИИ И СМЕЖНЫМ ДИСЦИПЛИНАМ И СМЕЖНЫМ ДИСЦИПЛИНАМ

Молекулярная медицина . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

6

CONTENTS

REVIEWSREVIEWSBurkat V. P.

Kovtun S. I.Modern biotechnology in animal husbandry . . . . . . . . . . . .7

Matselyukh О. V.

Varbanets L. D.Microbial collagenolytic enzymes . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13

Baraboy V. A. Catechins of tea: structure, activity, application . . . . . . .25

EXPERIMENTAL ARTICLES EXPERIMENTAL ARTICLES Kit Yu. Ya.

Starykovych M. O.

Bilyy R. O.

Skorohyd N. R.

Yanyv L. B.

Stoika R. S.

Immunoglobulins of colostrum as novel molecular markers of preclinical diagnostics of autoimmune disorders in parturient women . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .37

Pirog T. P.

Korzh Ju. V.

Improvement of biotechnology of microbial exopolysaccharide ethapolan on ethanol . . . . . . . . . . . . . .47

Poronniк О. О.

Shablij V. А.

Кunakh V. А.

Generation of Echium plantagineum L. tissue culture which is producent of shikonin pigments . . . . . . . . . . . . .56

NEW METHODS NEW METHODS Goryushkina T. B.

Shkotova L. V.

Gayda G. Z.

Klepach H. M.

Gonchar M. V.

Soldatkin O. P.

Dzyadevych S. V.

Novel amperometric biosensor based on glycerol oxidasefor glycerol determination . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64

PAGES OF HISTORY PAGES OF HISTORY

Levitsky E. L.Ephraim Katzir (Katchalskiy) is a prominent scientist in field of research of biochemistry and biotechnology . . .72

NEWSNEWS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .74

NEW PUBLICATIONS ON BIOTECHNOLOGY NEW PUBLICATIONS ON BIOTECHNOLOGY AND ADJOINING BRANCHES OF SCIENCEAND ADJOINING BRANCHES OF SCIENCE

Molecular medicine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .78

ОГЛЯДИ

В. П. БУРКАТ, С. І. КОВТУН

Інститут розведення і генетики тварин УААНE/mail: kovtun_si@gala.net

УДК 636:591.391

СУЧАСНА БІОТЕХНОЛОГІЯ СУЧАСНА БІОТЕХНОЛОГІЯ У ТВАРИННИЦТВІУ ТВАРИННИЦТВІ

Розглянуто значення і основні напрями використання біотехнології у тваринництві, висвітлено досягненняі проблеми репродуктивної біотехнології, подано огляд біотехнологічних досліджень, які виконуються в Інсти�туті розведення і генетики тварин УААН. Викладено результати застосування комплексного морфогенетичногоаналізу під час вивчення закономірностей реалізації генетичної інформації в ембріогенезі отриманих in vitroембріонів. Обґрунтовано доцільність застосування цитогенетичного контролю для оцінки біологічної пов�ноцінності розвитку in vitro ембріонів ссавців.

Ключові слова: біотехнологія у тваринництві, клітинна і генна інженерія, ембріони,трансгенез, клонування, цитогенетичний аналіз.

7

ріонів поза організмом на доімплантаційнихстадіях. Досягнення високої результатив�ності саме цих біотехнологічних методів —один із пріоритетних напрямів досліджень.

Українські біотехнологи досягли конку�рентоспроможної результативності цьогонапряму. Розроблений нами комплекснийморфогенетичний аналіз закономірностейреалізації генетичної інформації у процесіембріогенезу, дослідження процесу in vitroдозрівання ооцитів корів та свиней, встанов�лення механізмів їх запліднення поза ор�ганізмом створює наукову основу для роз�ширення сучасних методів біотехнологіїу тваринництві. Елементи технології отри�мання in vitro ембріонів сільськогосподарсь�ких тварин з використанням епідидималь�них сперматозоїдів самців поглиблюютьзнання закономірностей ембріональногорозвитку тварин, сприяють вдосконаленнюметодів підвищення ефективності викорис�тання генетичного матеріалу тварин длязбереження генофонду [2–4].

Встановлено, що для одержання ембріо�нів великої рогатої худоби in vitro суміснуінкубацію гамет потрібно проводити протягом18 год [5], а зменшення тривалості спільногоперебування яйцеклітин та сперматозоїдівпризводить до різкого зменшення частотизапліднення. Також показано, що ефективним

Біотехнологія із застосуванням методівклітинної та генної інженерії відіграє дедаліважливішу роль у підвищенні відтворю�вальних функцій тварин. Слід зазначити,що результати біотехнологічних дослідженьвикористовуються для поліпшення здоров’ятварин, лікування людей, удосконаленняякості продуктів тваринництва, охоронидовкілля та збереження генофонду. Нинірозроблено нові біотехнологічні вакцини,які захищають тварин від широкого спектрузахворювань. Молекулярні методи ідентифі�кації патогенів (геномна дактилоскопія), гене�тичний аналіз захворювань тварин дозволя�ють організувати моніторинг та вдосконалитирозуміння причин їх виникнення. Методи ге�нетичного каріотипування дають змогу вияв�ляти генетично стійких до різних хвороб тва�рин (наприклад, стрес�синдром свиней,BLAD, недостатній фактор згортання кровіXIII, спадкова форма анемії і затримка ростувеликої рогатої худоби) та спрямовано вико�ристовувати їх у селекційному процесі [1].

Біотехнологічні методи допомагаютьполіпшити продуктивність худоби за допо�могою різних варіантів селекційного розве�дення. Від особин із бажаними характерис�тиками замість традиційного схрещуваннявідбирають сперму і яйцеклітини з наступ�ним заплідненням in vitro і одержанням емб�

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

8

У дослідах із запліднення ооцитів ссавцівв умовах in vitro слід виконувати контрольза партеногенетичним розвитком ооцитів,який здійснюється під впливом факторівманіпуляцій із ооцитами або факторів сере�довища. Частота впливу різних хімічних тафізичних чинників в умовах in vitro вища,ніж у природних умовах, що спричинює де�стабілізацію мейотичного блоку ооцитів.Унаслідок такого активування ооцитів утво�рюються зиготи з одним пронуклеусом і роз�виваються гаплоїдні ембріони. Під часздійснення нами зазначеного контролю яй�цеклітини, що дозріли поза організмом,культивували у середовищі запліднення безсперматозоїдів упродовж 18 год. Потім яй�цеклітини переносили у середовище культи�вування ембріонів та оцінювали на предметнаявності ембріонів або пронуклеусів на ос�нові цитогенетичного аналізу.

Встановлено, що підібрані умови культи�вування та проведені маніпуляції зі статеви�ми клітинами зумовлюють низьку акти�

є сумісне культивування гамет великої рога�тої худоби поза організмом у середовищізапліднення не менше 45 [6] і навіть 65 год [5]для уникнення маніпуляцій з ембріонами укритичні періоди розвитку. Важливим фак�тором для успішного одержання ембріонівсвиней поза організмом є визначення опти�мального часового параметру сумісної інку�бації гамет поза організмом. На даномуетапі досліджень ми вивчали ефективністьотримання ембріонів свиней поза організ�мом за різних часових параметрів сумісноїінкубації (4 та 18 год) дозрілих in vitro яй�цеклітин свинок із заморожено�розмороже�ними епідидимальними сперматозоїдамикнура. Співкультивування гамет свиней по�за організмом протягом 18 год було викорис�тано у зв’язку зі встановленням оптимально�го часу для ефективного отримання in vitroзародків великої рогатої худоби, а 4�годиннеспівкультивування зумовлено досліджен�ням виживаності розморожених епідиди�мальних сперматозоїдів кнурів, яка стано�вила 3 год. Також показано, що 4�годиннеперебування сперматозоїдів із дозрілими по�за організмом яйцеклітинами свиней забез�печує високий рівень запліднення з низь�ким рівнем поліспермії [7]. Умови in vitroкультивування ооцит�кумулюсних комп�лексів свиней було забезпечено таким чи�ном, що відмінностей у рівні дозрівання яй�цеклітин поза організмом не спостерігалось,і кількість гамет, що досягли стадії телофа�зи І (пізньої) — метафази ІІ мейозу (рис. 1),була на однаково високому рівні (70%). Ре�зультати досліджень свідчать, що 4� та 18�го�динне співкультивування поза організмомсперматозоїдів кнурів (0,25 млн/мл) та яйце�клітин свиней забезпечує отримання одна�ково високого рівня (майже 60%) заплідненихяйцеклітин. Вибрана нами концентраціясперматозоїдів та досліджувані часові пара�метри співкультивування гамет не вплива�ли на рівень поліспермнозапліднених яй�цеклітин, який не перевищував 12,4% відзагальної кількості досліджуваних жіночихгамет свиней. Розвиток зародків (рис. 2) та�кож не відрізнявся суттєво після 4� або 18�го�динного співкультивування гамет поза орга�нізмом, але досягнення більшої абсолютноїкількості зародків після 18�годинного спів�культивування гамет, виключення маніпу�ляцій із зиготами у критичні періодирозвитку, порівняно із 4�годинним перебу�ванням, дозволяє констатувати, що опти�мальним часом культивування in vitro спер�матозоїдів з яйцеклітинами для одержаннязародків свиней є 18 годин.

Рис. 1. Сухоповітряний препарат дозрілого in vitroооциту свиней на стадії телофази І (пізньої). ×400

Рис. 2. 6–10Kклітинний зародок свиней, одержаний in vitro. ×100

Огляди

9

тварин, генетично стійких до інфекційнихзахворювань, тварин — продуцентів біоло�гічно активних білків для медицини. Дедаліширшого значення набуває одержаннятрансгенних тварин як донорів внутрішніхорганів для пересаджування людині (ксе�нотрансплантація) [10, 11]. Основнимитруднощами на шляху ксенотрансплантаціїє реакція імунного відторгнення трансплан�тата організмом і можливість передаванняінфекції. Незважаючи на численність тарізноманітність проведених досліджень, ба�гато факторів, які зумовлюють ефектив�ність експресії чужорідних генів у клітинахорганізму, залишаються недостатньо вивче�ними [12]. Попередні дослідження з отри�мання трансгенних свиней, у геном яких буловключено генні конструкції соматотропіну,показують, що в окремих тварин експресіяінтегрованого в геном гена сприяє підви�щенню інтенсивності росту тварин [13, 14].У разі одержання трансгенних тваринмікроін’єкцію чужорідної ДНК потрібноздійснювати на раніших стадіях розвитку,переважно у пронуклеуси зигот. Проте кла�сична і найпоширеніша методика мікро�ін’єкції у чоловічий пронуклеус є малоефек�тивною, оскільки народжуються здебільшогонетрансгенні тварини. Інтеграція чужорід�ної ДНК відбувається випадково, кількістьвставок у геном не можна контролювати [15].

Встановлення того, що живих тваринможна одержувати методом пересадженняядер клітин після культивування, включаю�чи соматичні клітини як донори ядер [16], до�дало новий розділ у перелік методів трансге�незу. Культивовані in vitro клітини можутьбути генетично модифіковані та відібрані підчас культивування перед використанням їхдля пересадження ядер. При цьому відсутніймозаїцизм, через те що нащадків одержуютьвід одного ядра бажаного генотипу. Всі кліти�ни матимуть трансген, і залежно від сайтаінтеграції або від використаного тканиноспе�цифічного промотору експресія відбувати�меться у потрібних тканинах [17].

Перше повідомлення про одержаннятрансгенної свині було ще в 1985 р. післямікроін’єкції гена гормону росту людинив пронуклеуси зигот [18]. Мікроін’єкціядекількох сотень копій чужорідної ДНК —це найпоширеніший метод отримання транс�генних свиней [19]. У свиней для виконаннямікроін’єкції потрібно візуалізувати про�нуклеуси, а для цього необхідним є центри�фугування клітин. Центрифугування тамікроін’єкція негативно впливають на рівеньформування бластоцист. У таких зигот рівень

вацію яйцеклітин корів до спонтанного пар�теногенезу — 0,25% (6/24) [8]. Така кіль�кість партеногенонів корів є суттєво нижчоюпорівняно із дослідженнями Д. Лечняк —9,5% (132/1394) [9]. Використання умов до�зрівання ооцитів корів поза організмом, до�давання оптимальної кількості клітин гра�нульози фолікулів є одним із елементівполіпшення умов культивування поза орга�нізмом порівняно із додаванням екзогеннихгормонів (ФСГ, естрадіол 17β).

У результаті виконаних експериментіввстановлено, що дозрілі поза організмом яй�цеклітини свинок активувались до партено�генезу після культивування в середовищізапліднення на досить високому рівні —9,2% (9/98). Окрім того, в окремих дослідахспостерігалась наявність 2�клітинних за�родків навіть після 46�годинного дозріванняооцитів in vitro (у середньому 2 партеногене�тичні зародки на 100 гамет).

Отже, у процесі вивчення генетичних ме�ханізмів запліднення in vitro яйцеклітинсвиней нами комплексно досліджено підхо�ди до визначення основних етапів техноло�гії. Так, встановлення оптимальної концент�рації епідидимальних сперматозоїдів кнурів(250 тис./мл) у середовищі запліднення тачасу сумісної інкубації гамет (до 18 год) за�безпечує ефективне отримання ембріонів invitro. На основі одержання й аналізу цитоге�нетичних препаратів зигот свиней та ембріо�нів на різних стадіях розвитку можна аналі�зувати стан хроматину ядер та прогнозуватиподальший ембріогенез.

Методи геноміки також застосовуютьнині для удосконалення традиційних селек�ційних підходів у тваринництві. Так, у 2003 р.було офіційно зареєстровано перший пере�вірений за допомогою методу поліморфізмуодного нуклеотиду (SNP — single nucleotidepolymorphisms) геном великої рогатої худо�би м’ясного напряму. SNP�методом послуго�вуються для ідентифікації генних клас�терів, що відповідають за конкретну ознаку.Далі за допомогою традиційної селекції виво�дять породи, що відзначаються підвищенимпроявом бажаної ознаки (наприклад, вищоюмускулистістю). Наразі у світі активно ве�дуться дослідження із секвенування геноматварин. У жовтні 2004 р. успішно здійсненосеквенування генома великої рогатої худоби,а в грудні 2004 р. — генома курки [1].

Спрямоване одержання трансгенних тваринзі зміненим обміном речовин зараз прово�дять у напрямі підвищення якості й ефек�тивності виробництва продукції, поліпшен�ня показників росту, створення популяцій

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

10

пластинки. Він ускладнюється тим, що в ме�йозі відбувається скорочення хромосом у ре�зультаті вторинної спіралізації хромосомно�го матеріалу. У порівнянні з мітотичнимивони виглядають коротшими. Для поліп�шення якості препаратів мейотичних хро�мосом застосовують триступеневий методК. Мікамо і Ю. Камігучі [23].

Генетичний контроль гаметогенезу,мейозу, ембріогенезу ссавців здійснюютьшляхом виявлення мутацій, які суттєвовпливають на перебіг відповідних процесіву клітинах і навіть блокують їх. Вивченняза допомогою цитогенетичного аналізу про�цесу мейозу у ссавців є основою успішнихрозробок сучасних біотехнологічних ме�тодів у тваринництві [22]. Виконуючи сегре�гаційну функцію, тобто забезпечуючи регу�лярний, упорядкований розподіл різнихваріантів генів у процесі мітозу і мейозу,хромосоми перебувають під контролем склад�них генетичних систем, для пізнання яких

дроблення і формування бластоцист на 4�йдень культивування in vivo в яйцепроводахстановив 60 і 38% порівняно з 74 і 56% не�оброблених зигот, відповідно [20]. У нашихдослідженнях відзначено відсутність нега�тивного впливу центрифугування на дозрі�вання ооцитів свиней поза організмом(76,2%), а мікроін’єкція в зародковий міху�рець таких гамет знижувала здатність їх додозрівання (32%) [4].

Можливостям маніпулювання статеви�ми клітинами тварин передувало здійсненеу 1947 р. вітчизняним ученим І. В. Смирно�вим відкриття світового значення стосовноздатності сперматозоїдів кролів, бараніві бугаїв зберігати життєздатність після пе�ребування їх в умовах наднизьких темпера�тур. Завдячуючи цьому відкриттю черезможливість практично необмеженого у ча�совому вимірі збереження сперматозоїдів таембріонів у рідкому азоті (–196 0С) реалізу�ються програми великомасштабної транс�континентальної селекції. Оскільки данеповідомлення не має на меті розкриття сутіостанньої, зауважимо лише, що за названоютехнологією функціонує Банк генетичнихресурсів тварин при Інституті розведенняі генетики тварин УААН, який урядовимрішенням визнано національним науковимнадбанням України. Тут накопичено 132 тис.спермодоз 25 порід великої рогатої худоби(таблиця). Окрім того, одержано і закладенона зберігання близько 3 800 доз епідиди�мальних сперматозоїдів кнурів, а такожсперма коней, коропів та ембріони великоїрогатої худоби. Також для ДНК�тестуваннязаморожено зразки крові (порід): великоїрогатої худоби — 22, коней — 8, свиней — 3.

У вирішенні загальнобіологічних проб�лем, таких як тип і механізм виникненнямутацій, закономірності еволюції каріоти�пу, мінливості каріотипу в природних попу�ляціях і вивчення їхньої ролі в забезпеченніадаптації на популяційному рівні, важливезначення має цитогенетичний підхід. Комп�лексне використання цитогенетичних дослі�джень під час обґрунтування і розробленнясучасних біотехнологічних методів у тва�ринництві разом із морфологічною оцінкоюгамет та ембріонів дозволяє віднайти ефек�тивні підходи до вирішення поставленихзавдань [21, 22].

Проведення цитогенетичного аналізумейотичних хромосом ооцитів та яйцеклі�тин має певні особливості. На відміну відцитогенетичного аналізу хромосом соматич�них клітин, аналіз ооцитів залежить вик�лючно від одержання однієї метафазної

Порода великої рогатої худоби Кількістьплідників

Англерська 7Білоголова українська 9Бура карпатська 5Волинська м’ясна 13Гасконська 2Голштинська (червоно�ряба масть) 18Голштинська (чорно�ряба масть) 18Джерсі 2Знам’янський тип 3Кіан 8Лебединська 5Лімузин 3Мен�анжу 1Монбельярд 1Південна м’ясна, що створюється 2Пінцгау 3Світла аквітанська 4Сіра українська 5Симентальська (вітчизняної селекції) 23Червона датська 1Червона степова 3Українська м’ясна 19Українська червона молочна 2Українська червоно�ряба молочна 18Українська чорно�ряба молочна 8Шароле 2Синтетичні популяції 15

Наявність генетичного матеріалу у Національному банку генетичних ресурсів тварин

Огляди

11

одержання та маніпулювання ембріонамисільськогосподарських тварин in vitro на ос�нові детального розуміння процесів гамето�,ембріогенезу, комплексної практичної реа�лізації можливостей цього методу в тварин�ництві, збереженні генофонду і для розроб�лення нових біотехнологічних методів(трансгенез, клонування) забезпечить сучас�ній вітчизняній біотехнологічній науці по�дальший прогрес.

1. Коммерческая биотехнология. —http:/www.cbio.ru/modules/news.

2. Буркат В. П., Дзіцюк В. В., Ковтун С. І.Прикладні аспекти генетики та біотехнологіїв тваринництві //Вiсн. Укр. т�ва генетиків іселекціонерів. — 2005. — Т. 3, №1–2. —С. 131–144.

3. Ковтун С. І., Куновський Ю. В., Галаган Н. П.Вплив наноматеріалів на заплідненість яй�цеклітин свиней //Тваринництво України. —2007. — №2. — С. 72–74.

4. Буркат В. П. Розведення тварин і збережен�ня їхнього генофонду //Вiсн. аграрної нау�ки. — 2006. — № 3–4. — С. 100–105.

5. Рекомендації по одержанню ембріонів вели�кої рогатої худоби in vitro / В. Є. Кузнєцов,М. Я. Єфіменко, І. Б. Кузнєцова, Б. Є. Подо�ба. — К.: Міжнар. фін. агенція, 1998. —33 с.

6. Miller G. F., Gliedt D. W., Rakes J. M., Ro/rie R. W. Addition of penicillamine, hypotau�rine and pinephrine (PHE) or bovine — 20oviductal epithelial cells (BOEC) alone or incombination to bovine in vitro fertilizationmedium increases the subsequent embryocleavage rate // Theriogenology. — 1994. —V. 41. — P. 689–696.

7. Coy P., Martinez E., Ruiz S. et. аl. In vitro fer�tilization of pig oocytes after differrnt coin�cubation intervals // Ibid. — 1993. — V. 39. —P. 1208–1208.

8. Ковтун С. И., Куновский Ю. В. Контрольспонтанного партеногенетического развитияяйцеклеток коров и свиней в условиях invitro // Актуальные проблемы биологиив животноводстве: Матер. IV междунар.конф. — Боровск, 2006. — С. 244–245.

9. Lechniak D., Cieslak D., Switohski M. Cyto�genetic analysis of bovine parthenogenoneafter spontaneous activation in vitro //Theriogenology. — 1998. — N49. — Р. 779–785.

10. Зиновьева Н. А., Эрнст Л. К., Брем Г.Трансгенные животные и возможности ихиспользования: молекулярно�генетичес�кие аспекты трансгенеза в животновод�стве. — М.: ВИЖ, 2001. — 128 с.

застосовують метод створення генетичнихі цитогенетичних моделей. Ґрунтуються такімоделі на виявленні хромосомних порушень імінливості генів, що контролюють процеси,які проходять у цитоплазмі клітин під часмітотичного та мейотичного поділу [24].

Встановлено, що хромосомні порушен�ня, часто не впливаючи негативно на процесзапліднення, дають початок розвиткові ано�мальних ембріонів. Такі ембріони є основ�ною причиною ранньої ембріональної смерт�ності та зниження рівня запліднення [25].Показано, що однією із причин низькогорівня заплідненості жіночих гамет ссавцівє функціональна неповноцінність ооцитів,їхня знижена здатність до подальшого роз�витку, хромосомні порушення в них, що мо�жуть бути зумовлені аномаліями каріотипусоматичних клітин.

Відзначено, що хромосомні аномалії со�матичних клітин ссавців можуть у ходімейозу негативно впливати на морфофунк�ціональний стан ооцитів. У результаті мо�жуть спостерігатися хромосомні аномаліїооцитів і у вигляді тонких морфологічнихпорушень на рівні органел, які пов’язаніз хромосомними аномаліями ооцитів [26].Такі явища підтверджують існування при�родного біологічного відбору проти гамет зіструктурними аномаліями ядра і цитоплаз�ми під час запліднення яйцеклітин ссавцівпоза організмом. Цитогенетичний аналізооцитів ссавців дозволяє оцінити ступіньїхньої зрілості і компетентності до заплід�нення, виявляти типи цитогенетичних ано�малій, які після запліднення призводять доутворення аномальних зародків.

Виконані нами дослідження показують,що з використанням цитогенетичного мето�ду аналізу хроматину яйцеклітини корів тасвиней після дозрівання in vitro, заплідненняможна ефективно аналізувати під світловиммікроскопом зі збільшенням 100–1 000 раз.При цьому чітко видно стадії мейозу ооци�тів, стан хроматину в мейозі, а також станядер ембріонів. Дослідження проводилиу комплексі з одержанням ембріонів свинейin vitro і тому для об’єктивної оцінки рівнядозрівання поза організмом жіночих гаметсвиней показано, що ефективність цитоге�нетичного контролю становить 87,9%. Тоб�то із 463 ооцитів, відібраних на дозріванняі подальший ембріональний розвиток, у 407було виконано цитогенетичний аналіз.

Отже, сучасні методи біотехнології де�далі ширше застосовуються у тваринництві.Опанування технологічними підходами

ЛІТЕРАТУРА

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

12

СОВРЕМЕННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯВ ЖИВОТНОВОДСТВЕ

В. П. БуркатС. И. Ковтун

Институт разведения и генетики животных УААН

E/mail: kovtun_si@gala.net

Рассмотрены значение и основные направ�ления использования биотехнологии в животно�водстве, освещены достижения репродуктивнойбиотехнологии, представлен обзор ряда биотех�нологических исследований, выполняемых вИнституте разведения и генетики животныхУААН. Изложены результаты применениякомплексного морфогенетического анализа приизучении закономерностей реализации генети�ческой информации в эмбриогенезе полученныхin vitro эмбрионов. Обоснована целесообраз�ность применения цитогенетического контролядля оценки биологической полноценности раз�вития in vitro эмбрионов млекопитающих.

Ключевые слова: биотехнология в животноводстве,клеточная и генная инженерия, эмбрионы, трансге�нез, клонирование, цитогенетический анализ.

MODERN BIOTECHNOLOGY IN ANIMAL HUSBANDRY

V. P. BurkatS. I. Kovtun

Institute of Animal Breeding and Genetics UAAS

E/mail: kovtun_si@gala.net

Importance and main directions of biotech�nology application in livestock and progress andproblems of reproductive biotechnology havebeen considered. Тhe review of biotechnologicalresearches carried in the Institute of AnimalBreeding and Genetics is given. Results of com�plex morphologic and genetic analysis utiliza�tion during research of genetic information rea�lization pattern during embryogenesis ofembryos obtained in vitro are shown. Expediencyof cell genetics controls for evaluation of biolog�ical completeness of mammalian embryos devel�opment in vitro is validated.

Key words: biotechnology for farm animals, cell andgene engineering, embryos, transgenic, cloning, cyto�genetic analysis.

11. Wall R. J., Siedel G. E. Transgenic farm ani�mals critical analysis //Theriogenology. —1992. — V. 38. — P. 337–357.

12. Газарян К. Трансгенные животные: перс�пективы использования в животноводстве//Сельскохозяйственная биология. —1988. — №2. — С. 31–39.

13. Рябова Л. В., Васецкий С. Г. Роль элементовцитоскелета в созревании ооцитов живот�ных // Успехи современной биологии. — Т.109, Вып 2. — М.: Наука, 1990. — С. 5–10.

14. Brussow K./P., Kauffold I. Method of embryotransfer in swine //Mh. Vet. Med. — 1989. —V. 44. — P. 312–317.

15. Богатырев А. Н., Эрнст Л. К. Генная инже�нерия сельскохозяйственных животных —мощный рычаг селекции ХХI века //Генно�инженерные сельскохозяйственные жи�вотные: Сб. науч. тр. — 1995. — №1. — С. 3–13.

16. Wilmut I., Schnieke A. E., McWhir J. Viable off�spring derived from fetal and adult mammaliancells //Nature. — 1997. — V. 385. — P. 810–813.

17. Z. Machaty, K. R. Bondioli, J. J. Ramsoon/dar, W. L. Fodor. The Use of Nuclear Transferto Produce Transgenic Pigs // Cloning andstem cells. — 2002. — V. 4. — P. 21–27.

18. Pursel V. G., Rexroad Jr., C. E. Status ofresearch with transgenic farm animals //J.Anim. Sci. — 1993. — V. 71. — P. 10–19.

19. Brussow K./P., Geissler F., Kauffold M. Theinfluence of microinjection on early embry�onic development of porcine zygotes // Arch.Tierz. — 1990. — V. 33. — P 353–356.

20. Вrussow K./P., Schwiderski H. Results oftransfer of porcine split embryos // Ibid. —1990. — V. 33. — P. 443–447.

21. Ковтун С. І. Стан і перспективи одержан�ня зародків свиней in vitro // Вісн. аграр.науки. — 2004. — №5. — С. 52–54.

22. Кузнєцов В. Є. Біотехнологія у тварин�ництві //Генетика і селекція в Україні намежі тисячоліть: У 4 т. — К.: Логос, 2001. —Т. 4/ Гол. ред. В. В. Моргун. — С. 31–57.

23. Mikamo K., Kamiguchi Y. A new assessmentsustem for Chinese humstеr // Radiation�includes chromosome damage in man. — NewYork: Alan R. Liss, 1983. — P. 411–432.

24. Plachot M. Chromosomal abnormalities inoocytes //Mol. and Cell. Endocrinol. —2001. — V. 183. — P. 59–63.

25. Стефанович А. В., Червякова Е. В., Шеме/тун Е. В. и др. Цитогенетическое исследо�вание соматических клеток и морфофунк�циональные характеристики ооцитову женщин с нарушением репродуктивнойфункции // Цитология и генетика. —2004. — №1. — С. 3–8.

26. Wall R. J. Biotechnology for the production ofmodified and innovative animal products: trans�genic livestock bioreactors //Livestock Produc�tion Science. — 1999. — V. 59. — P. 243–255.

Огляди

13

Колагенази в організмі людини і тваринберуть участь у морфогенезі сполучної тка�нини, а також в усуненні деяких патологіч�них процесів при артритах, метастазах то�що, при цьому розщеплюють нативнийколаген у певних локусах на два фрагменти,не спричинюючи руйнування цілої молеку�ли. Колагенолітичні ферменти мікроор�ганізмів є унікальними за своєю здатністюв різних умовах ( рН, температури, іонноїсили) вибірково гідролізувати потрійну спі�раль молекули нативного нерозчинного при�родного білка — колагену.

Структура і властивості колагенів

Колагени є компонентами матриксу спо�лучної тканини (шкіра, сухожилля, кістки,зуби, тощо) вищих тварин і належать дофібрилярних білків групи склеропротеїнів.Розрізняють близько 20 типів колагеновихмолекул, які відрізняються молекулярноюбудовою і належністю до різних органів.Майже 30% білкової маси тіла людини і 6%загальної маси тіла припадає саме на кола�ген. Його кількість у біосфері оцінюютьв 1 млрд. т [1].

Основна одиниця будови колагену —тропоколаген (рисунок), який складаєтьсяз трьох поліпептидних α�спіралей завдовжкиблизько 300 нм (молекулярна маса 95 кДа).В амінокислотному складі тропоколагено�вих молекул переважають залишки гліцину(33%), проліну і гідроксипроліну (18%),а також лізину. Три ланцюги, згортаючись

Протеолітичні ферменти відіграють важ�ливу роль в обміні речовин усіх живих ор�ганізмів, починаючи від бактерій та мікро�міцетів і закінчуючи вищими тваринамиі людиною. Широке застосування протеазу наукових дослідженнях, медицині, косме�тології, у легкій та харчовій промисловостіспонукає до пошуку зручних та економічнихджерел для одержання ферментів у промис�ловому масштабі. У цьому сенсі мікроорга�нізми є винятково перспективним об’єктомдосліджень, оскільки багато широко розпов�сюджених мікроорганізмів виділяють вели�ку кількість протеолітичних ферментіву навколишнє середовище, що значно по�легшує завдання їх виділення та очищення.

Окрім своєї основної функції — розщеп�лення білків їжі до складових амінокислот,протеолітичні ферменти виконують низкуне менш важливих функцій. Наприклад,протеоліз лежить в основі таких процесів,як зсідання крові та лізис тромбів, утворенняряду білкових гормонів (інсулін), а такожфізіологічно важливих пептидів. Екстраце�люлярні протеолітичні ферменти мікроор�ганізмів розщеплюють білки, які містятьсяв навколишньому середовищі, і перетворю�ють їх на форму, що здатна легко проникатиусередину мікробної клітини. Оскількимікробну клітину, залежно від умов існу�вання, оточують різні білкові субстрати, той синтезуються різні за специфічністю про�теази — широкої специфічності (гідролізу�ють декілька субстратів) або високоспеци�фічні (діють виключно на певний субстрат).

МАЦЕЛЮХ О. В., ВАРБАНЕЦЬ Л. Д.

Інститут мікробіології і вірусології НАН України, КиївE/mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua

УДК 577.152.34:577.151.5

КОЛАГЕНОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ КОЛАГЕНОЛІТИЧНІ ФЕРМЕНТИ МІКРООРГАНІЗМіВМІКРООРГАНІЗМіВ

Мікробні колагенолітичні ферменти гідролізують білки родини колагенів. У роботі наведено дані щодо здат�ності деградувати колаген ферментами, виділеними з різних груп мікроорганізмів — бактерій, грибів, акти�номіцетів та дріжджів. Розглянуто фізико�хімічні властивості, методи виділення і очищення ферментних пре�паратів колагеназ. Проаналізовано існуючі й можливі шляхи використання цих ферментів у промисловостіі медицині.

Ключові слова: колагенолітичні ферменти мікроорганізмів, фізико�хімічні властивості,методи виділення і очищення, практичне застосування.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

14

в субстратзв’язувальній ділянці молекули ферменту. Проте вони відрізняються заструктурою, специфічністю дії на колаге�нові волокна і використовуються для різнихнаукових та прикладних цілей. Виділенняколагеназ із тваринних тканин є надто тру�домістким і неекономічним через малийвміст порівняно з іншими білками. Такожслід зазначити, що лише мікробні колагена�зи та колагенази амфібій можуть гідролізува�ти колагени до повного їх руйнування. Деякіз них було отримано як електрофоретично го�могенні препарати й охарактеризовано за мо�лекулярною масою, ізоелектричною точкою,чутливістю до інгібіторів, специфічністю діїта класифіковано за складом активнихцентрів. Однак загалом питання щодо синтезуколагенолітичних ферментів мікроорганіз�мами, їхніх властивостей, можливостей ви�користання досліджено недостатньо.

Уперше колагеназу мікробного поход�ження було виділено в 1957 р. з анаеробноїпатогенної бактерії Clostridium histolyticum,яка є збудником клостридіального міонекро�зу (газової гангрени) — захворювання з ви�соким рівнем смертності [3, 4]. Цей ферментбув здатен гідролізувати нативний колагенза фізіологічних значень рН і температури.Клостридіальній колагеназі дали назву «β�токсин». У комплексі з іншими метаболіта�ми бактерії фермент бере участь у поширен�ні тканинної деструкції. Останнім часомз’явилися дані про те, що колагенази родуСlostridium не є домінантою у вірулентнійінфекції [5]. Так, на хромосомальних colAмутантах C. perfringens було встановлено,що колагеназа (каппа�токсин) не відіграєвирішальної ролі у вірулентному процесі [6,7]. Здатність гідролізувати колаген маютьферменти й інших патогенних мікроор�ганізмів. Стрептококи групи В є головнимипатогенами в неонатальному сепсисі, пнев�монії та менінгітах [8, 9]. У дослідах in vitroпоказано властивість стрептококів групи Вокупувати багату на колаген амнеостатичну

навколо спільної осі, утворюють потрійнуспіраль. Для первинної структури характер�ним є чергування полярних (5%) і неполяр�них (95%) ділянок. Будова неполярнихділянок однорідна — це чергування послі�довності �Gly�Pro�X�, де X — будь�яка аміно�кислота, але найчастіше пролін і оксип�ролін, які надають молекулі форми ламаноїспіралі [2]. Полярні ділянки локалізовані наN�кінцях кожного ланцюга, мають глобу�лярну структуру і чутливі до атаки протеазширокої специфічності дії. Їхню будову вив�чено недостатньо, хоча й встановлено, щокожною третьою амінокислотою в нихє гліцин. Структура колагену стабілізованачисленними міжмолекулярними, водневи�ми, а також ковалентними зв’язками (міжлізином і оксилізином, проліном і окси�проліном). Усе це робить молекулу колагенудостатньо міцною та стійкою до розтягнен�ня. Так, наприклад, волокно колагену зав�товшки 1 мм витримує навантаження до 100 Н.У тканинах волокна орієнтовані строго па�ралельно лініям напруги, що виникає в нихв результаті виконання притаманних їмфункцій (рисунок). Як й інші фібрилярнібілки, колаген майже нерозчинний у нейт�ральних розчинах солей, слабких кислотах ілугах. Лише невелика частина колагеновоїмолекули екстрагується при температурі0 0С розчином хлориду натрію і кислими(нітратними, ацетатними) буферами. Про�цес не супроводжується денатурацією кола�гену, розчинені молекули якого за певнихумов знову утворюють фібрили. Колаген,який екстрагується цитратним буферомз рН 4,0, називається проколагеном, а той, щоекстрагується нейтральними розчинами со�лей, — тропоколагеном. Більшість протеазможуть гідролізувати лише одиночні спіраліабо денатуровані колагенові пептиди, і лише«істинні» колагенази (ферменти бактеріаль�ного походження, які атакують велику кіль�кість сайтів уздовж спіралі, чим відрізняють�ся від матриксних металопротеаз ссавців) тапротеази з колагенолітичною дією здатнірозщеплювати молекулу нативного колагену.

Біологічні функції і джерела виділення колагеназ

Колагенази різних типів було виділено ізтканин хребетних, крабів, личинок мух,екскретів комах, а також із культуральноїрідини або клітин мікроорганізмів — бак�терій, грибів, актиноміцетів. Колагенази,що їх одержано з різних джерел, мають де�які спільні структурні особливості, зокрема

Структура колагенового волокна (за Campbell, 1995)

Огляди

15

ізолювали й охарактеризували багато ґрунто�вих мікроорганізмів з колагенолітичною ак�тивністю. Вони належали до різних таксо�номічних груп, але більшість із них булапредставлена стрептоміцетами та мікроміце�тами [25, 26]. Так, ґрунтовий Streptomyceswartii був здатен гідролізувати колаген сухо�жиль, плаценти та деякі інші види колагену[27], а колагеназу із Streptomyces sp. А8 зафізико�хімічними властивостями і субстрат�ною специфічністю можна віднести до «істин�них» колагеназ [28]. Також здатність синтезуколагенази було виявлено у ґрунтової бак�терії Cytophaga sp. L43/1 [29], непатогенногомікроорганізму Vibrio alginolyticus [30, 31] тау термофільних (Streptomyces sp.) і психро�фільних (Azospirillum sp., Arthrobotrys tortor)мікроорганізмів [32, 33, 34, 35].

ФізикоKхімічні властивості колагеназ

Колагенази, виділені з різних джерел,відрізняються за своїми фізико�хімічнимивластивостями (рН� і температурним опти�мумом дії, молекулярною масою, ізоелект�ричною точкою, кінетичними характерис�тиками тощо). За здатністю гідролізуватиколагенові волокна ферменти з колагенолі�тичними властивостями поділяють на«істинні» та «неспецифічні». «Істинна» ко�лагеназа є ферментом, що гідролізує тількиколаген і не діє на інші білки. «Неспецифіч�на» колагеназа гідролізує й інші білковісубстрати, окрім нативного колагену [36].

Серед колагеназ мікробного походженнядобре відомими і найбільш вивченими є ко�лагенази C. histolyticum (КФ 3.4.24.3), якіхарактеризуються високою специфічністюдії на колагенові волокна і належать до«істинних» колагеназ. Їх широко застосову�ють у біотехнології та для лабораторнихцілей (наприклад, препарати фірм Sigma�Aldrich, Serva). Проте для культивуванняцієї бактерії потрібні складні запобіжні за�ходи, живильні середовища і відповідні умо�ви культивування. У результаті багатоста�дійного процесу очищення позаклітинногоферментного комплексу клостридій одержу�ють групу з 6–7 колагеназ із молекулярноюмасою від 68 до 125 кДа [37, 38]. Усі колаге�нази є нейтральними металопротеазами,у зв’язку з чим у процесі вирощування про�дуцента для біосинтезу їх необхідні іоницинку та кальцію. Дані, отримані під часвивчення атомно�адсорбційних спектріві впливу інгібіторів, свідчать про наявність цинку в активному центрі молекули фер�менту, а для зв’язування з колагеновим

мембрану плаценти, колагенові фібрилипри цьому руйнуються, що призводить допередчасного розриву мембран. Streptococ/cus mutans є збудником коронального каріє�су і відповідає за поширення його на всю по�рожнину рота [10]. Також проводятьсядослідження, спрямовані на з’ясування роліколагенази Candida albicans у розвитковікарієсу зубів [11, 12]. Інша патогенна анае�робна бактерія Porphyromonas gingivalis та�кож спричинює захворюванння порожнинирота — періодонтити. Було встановлено, щоцей мікроорганізм синтезує багато екзопро�теаз і принаймні декілька з них — у формібільш високомолекулярних зимогенів [13,14, 15]. Серед протеаз P. gingivalis виявленояк тіолові, так і серинові протеази, які дег�радують імуноглобуліни, фібриноген, фібро�нектин, колаген, еластин тощо [16, 17]. Дляфітопатогенної бактерії Corynebacterium(Clavibacter) rathayii встановлено, що її ко�лагеназа бере участь у прикріпленні клітиндо волокон колагену [18, 19]. КолагеназаBacillus cereus є одним з основних вірулент�них факторів цієї бактерії — збудникашвидкоплинних ендофтальмітів. Очищенийфермент, виділений із цього патогену, вик�ликав некрози сітківки in vivo. Нещодавнідосліди показали інфільтрацію бактеріаль�них клітин у склисте тіло, що пов’язаноз руйнуванням протективної захисної кола�генової капсули [20, 21]. Staphylococcusaureus продукує різні екзопротеїни, які зу�мовлюють здатність цього мікроорганізмуколонізувати тканини і спричинювати за�хворювання організму�хазяїна. Майже всіштами секретують цитокіни і групу фер�ментів у складі гемолізинів (α, β, γ, δ), нук�леаз, протеаз, ліпаз, гіалуронідаз і колаге�наз. Основна функція цих білків полягаєу прикріпленні до тканини хазяїна і пере�творенні її на джерело живлення [22, 23].

До 90�х років XX ст. панувала думка, щов мікроорганізмів украй рідко трапляєтьсяздатність деградувати колаген і використо�вувати його як джерело їжі. Однак було до�ведено, що колагенолітичні ферменти здатнівиділяти в навколишнє середовище не лишепатогенні штами. З ґрунту та стічної водиможна виділити штами, які мають влас�тивість синтезувати колагеназу. Так, за да�ними чеських учених [24], із 437 бактеріаль�них культур, що їх було виділено зі стічноїводи і різних зразків ґрунту, колагенолітичнудію мали (у % від кількості штамів у зраз�ку): стічна вода — 6,6; ґрунт смерековихлісів — 15; польовий ґрунт — 30; присадиб�ний ґрунт — 29; садовий ґрунт — 37. Згодом

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

16

наявність фракцій, неактивних навіть щодожелатину [40, 41].

Окрім групи клостридіальних колагеназ,одержана в гомогенному стані, детально вив�чена і застосовується для промислових потребколагеназа (КФ 3.4.24.3), яку виділеноз культуральної рідини бактерії Achromobac/ter iophagus [42]. Було показано, що цей фер�мент складається з двох ідентичних субоди�ниць з молекулярною масою 35 кДа.Дисоціація димеру в різних умовах призводи�ла до втрати ферментативної активності [43].Цей фермент також можна віднести до групи«істинних» колагеназ. Субстратами ферментуможуть бути, окрім нативного й денатурова�ного колагену, синтетичні пептиди, що іміту�ють амінокислотну послідовність колагену.Встановлено, що колагеназа з A. iophagus таксамо, як і ферменти, виділені з C. histolyticum,містить в активному центрі цинк і для виявуактивності потребує іонів кальцію.

Протеолітичні ферменти з активною ко�лагенолітичною дією, як з металом в актив�ному центрі, так і серинового типу, отрима�но з культуральної рідини штамів, якіналежать до родів Streptomyces i Actino/myces. Металозалежними протеазами є ко�

субстратом і повної каталітичної активностіпотрібні іони кальцію, які також запобіга�ють інактивації. Так, на кожну молекулуферменту припадає, за даними [39], 1 мольцинку. Препарати з колагенолітичною дією,виділені з C. histolyticum, мають специфіч�ність до X�Gly зв’язку (X — нейтральна аміно�кислота) у послідовності �Pro�X�Gly�Pro�.Усе це свідчить про «істинність» клостри�діальних колагеназ. Високоочищені клост�ридіальні колагенази активні щодо натив�ного і денатурованого колагену, желатину,деяких синтетичних субстратів, які іміту�ють послідовності амінокислот у молекуліколагену: 2�фуранакрилоїл�Leu�Gly�Pro�Ala(FALGPA), Pz�Pro�Arg�Gly�Pro (Pz�пептид),[Pro�OxyPro�Gly]n, [Pro�Pro�Gly]n, але не ді�ють на інші глобулярні й фібрилярні білки(казеїн, гемоглобін, альбумін, фібрин, кера�тин, еластин). Водночас неочищені препара�ти, що містять домішку неспецифічних про�теаз, здатні розщеплювати ще й інші білки,у зв’язку з чим їх широко застосовують дляізоляції клітин у різних типах тваринних тканин. Утім, специфічність цих колагеназ може бути ще вужчою, оскільки у дослідахіз фракціонування препарату встановили

ФізикоKхімічні властивості деяких колагеназ мікробного походження

Джерело виділення колагенази

Моле�куляр�на ма�

са, кДа

Оптимум дії Ізоелект�рична

точка,рІІнгібітор Субстрат

рН t, 0C

Candida albicans [68] 46 6,5–7,0 37–55 6,2 ЕДТА БСА, колаген, FALGPA

Candida albicansATCC 1002 [11] 40 4,0 40–50 4,0 Пепстатин, се�

човина, цистеїн БСА, колаген, FALGPA

Achromobacter iopha/gus (EC 3.4.24.3) [31] 82 – – – ДПФФ,

гістидинКазеїн, пролактин, міозин,

фібронектин, аденілаткіназа

Hypoderma lineatum(3.4.21.49) [60] 25,2 7,0–7,5 25–37 4,1 ДПФФ Нативний колаген, окисне�

ний В�ланцюг інсуліну

Cytophaga sp. L43�1[29, 72] 120 – – 4,96 ЕДТА Колаген, желатин, казеїн

Streptococcus mutans[10]

5250 – – – ЕДТА,

о�фенантролін Желатин, колаген, FALGPA

Alicyclobacillussendaiensis NTAP�1[69]

37 3,9 – – Пепстатин Колаген, FALGPA

Clostridium his/tolyticum [37]

6811579

100110125

7,0–7,5 37

5,95,66,15,85,95,4

ЕДТА, цистеїн,о�фенантролін Желатин, колаген, FALGPA

Azospirillum sp. [34] 48,6 8,5 40 8,5 EДТА Нативний колаген

Примітка: «–» — даних немає; ДПФФ — діізопропілфторфосфат; ЕДТА — етилендіамінтетраацетат.

Огляди

17

3.4.21.66), з максимумом стабільності притемпературі 60–85 0С. За каталітичнимивластивостями цей фермент нагадує суб�тилізини. З іншого штаму Thermoactino/myces vulgaris sp. 21Е виділено термофільнусеринову колагеназу з молекулярною масою50 кДа. Температурний оптимум дії для цьо�го ферменту становив 60–65 0С, а в присут�ності іонів кальцію підвищувався до70–75 0С. У разі нагрівання до 85 0С, зновуж таки у присутності іонів кальцію, протя�гом 30 хв залишалося до 50% вихідної ак�тивності. Фермент виявляв досить вузькуспецифічність дії — гідролізував лише кола�ген І типу, желатин і Pz�пептид [53].

Деякі представники Streptomyces i Actino/myces є джерелами промислових протеолі�тичних препаратів, які мають і колагенолі�тичну активність (проназа, протелін,римопротелін, протофрадин) [54]. Проназа,виділена із S. griseus, є комплексом протеазта пептидаз, які належать до класів серино�вих і металопротеаз [55]. Проназа, на відмі�ну від клостридіальних колагеназ, гідролі�зує внутрішньомолекулярні зв’язки, якіз’єднують молeкулу колагену латеральноі на кінцях, при цьому не порушуютьсяполіпептидні ланцюги потрійної спіралі.Протелін також одержують із S. griseus. Вінгідролізує внутрішньо� і міжмолекулярніпоперечні зв’язки колагену. Подібним чи�ном діє комплексний ферментний препаратримопротелін, виділений із S. rimosus.Комплексний препарат протофрадин, якиймістить трипсиноподібні серинові протеазиз колагенолітичною дією, виділено із S. fra/diae. Встановлено [56], що він може спричи�няти глибокий гідроліз колагену лише за до�вготривалого протеолізу і в разі великоїконцентрації ферменту.

У деяких мікроорганізмів виявлено здат�ність до синтезу позаклітинних колагенолі�тичних протеаз серинового типу, які відріз�няються від «істинних» колагеназ передусімбудовою активного центру, в якому містить�ся серин. Такі самі колагенази виділеноз комах Hypoderma lineatum, краба Uca pu/gilator, деяких земноводних і ссавців [57, 58,59, 60, 61]. Серинові протеази з колагенолі�тичною дією мають низьку молекулярну ма�су. За властивостями і механізмом дії вонисхожі на трипсиноподібні протеази тварин.Відома властивість серинових протеаз із ро�дини субтилізинів, джерелом яких є деякіштами B. subtilis [62], розщеплювати натив�ний і денатурований колаген. Так, із бак�терії Bacillus sp. B16, якій притаманна нема�тодотоксична активність (на Panagrellus

лагенази, виділені з культуральної рідинитаких мікроорганізмів, як Streptomyces sp.C/51 і Streptomyces sp. A8 [44, 45]. Специфіч�ність цих ферментів ширша, ніж клост�ридіальних, оскільки вони деградують, по�ряд з колагеном, ще й казеїн, кератин,еластин та інші білкові субстрати. Зі штамуStreptomyces sp. 3B [46] було виділено дваметалозалежних ферменти з колагеназноюактивністю. Молекулярна маса їх становила116 і 97 кДа. Вони належать до нейтральнихпротеаз і мають досить вузьку специфіч�ність — активно деградують лише колаген,желатин і синтетичні субстрати — аналогипослідовностей у молекулі колагену. ДляStreptomyces sp. 1349 було показано, що цейштам виділяє в середовище культивуванняпринаймні три ферменти з колагенолітич�ною активністю: два з них є металопротеаза�ми, а один — сериновою протеазою з моле�кулярною масою 30–40 кДа. Ці ферментимають високу субстратну специфічність,активні в досить широкому діапазоні рН —від 5,0 до 11,0 і мають декілька термоопти�мумів: при 37–40 0С і 60 0С [47].

Металозалежні колагенолітичні протеа�зи було знайдено і в бацил. Так, із культу�ральної рідини Geobacillus collagenovoransMO�1 виділено дві металопептидази, які гід�ролізували синтетичні субстрати, що містятьспецифічну послідовність молекули колаге�ну �Gly�Pro�X� [48]. Окрім того, ця бактеріясинтезує серинову колагенолітичну протеа�зу з молекулярною масою 210 кДа, що скла�дається з двох субодиниць 105 кДа кожна.Цей фермент унікальний тим, що має най�вищу молекулярну масу серед мікробнихколагеназ. Він активний стосовно колагенівI і IV типів і желатину, однак не гідролізуєсинтетичні пептидні субстрати FALGPAі Pz�пептид [49].

Багато мікробних ферментів мають висо�ку стійкість до температури і денатуруючихагентів. Зі штаму Aneurinibacillus thermo/aerophillus DSM 10154T було виділено термо�стабільну металозалежну пролінспецифічнуамінопептидазу, яка ефективно гідролізува�ла й колаген. За даними SDS�PAGE, її моле�кулярна маса становить 51 кДа. Ферментмаксимально активний при температурі55 0C і втрачає до 50% вихідної активностіпри 36 і 75 0C [50]. Термостабільний ферме�нтний комплекс, який містив декілька ком�понентів і мав колагенолітичну дію, булоодержано з культуральної рідини Thermo/actinomyces vulgaris [51, 52]. У найбільшійкількості в комплексі містилася сериновапротеаза, яку назвали термітазою (КФ

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

18

моген відіграє певну роль не тільки в деграда�ції колагену, але й у його адгезії на субстраті.

У штамів роду Candida встановлено здат�ність до синтезу як внутрішньо� (C. albicans[68]), так і зовнішньоклітинних протеазіз колагенолітичною дією. Останні, у пере�важній більшості, є кислими протеазами.Так, C. albicans АТСС 1002 синтезує кислуколагеназу з молекулярною масою 46 кДаі оптимумом дії при рН 3,5–4,0, що є чутли�вою до дії пепстатину, сечовини і цистеїну.Зі збільшенням рН до 6,0 відбувається дена�турація ферменту. Активність також зни�жується в разі підвищення температури до55 0С. Нещодавно було виділено кислу кола�геназу з ацидофільного штаму A. sendaiensisNTAP�1 [69]. Окрім оптимуму дії при рН 3,9ця протеаза відзначається термостабіль�ністю. Структура ферменту мономерна, мо�лекулярна маса — 37 кДа. Активність фер�менту інгібується пепстатином, він виявляєспецифічність до нативного колагену і за ти�пом дії належить до карбоксипептидаз.

Деякі фізико�хімічні властивості колаге�наз різного походження подано в таблиці.

Методи виділення і очищення мікробних колагеназ

Для виділення індивідуальних колаге�наз застосовують різні методи. Так, діалізатсупернатанту культуральної рідини C. his/tolyticum після осадження сульфатом амо�нію 90%�го насичення піддавали гель�фільтрації на колонці з сефадексом G�50,а потім — G�75. У результаті очищений пре�парат містив окрім β�токсину (колагеназа)ще й неспецифічні протеїнази. Для одер�жання комерційних препаратів колагеназипроводили багатостадійне очищення нагідроксилапатиті, сефакрилі S�200, а такожіз застосуванням афінної хроматографіїз біоспецифічними лігандами (L�Arg�Affi�Gel202 і забарвленим червоним лігандом)[38]. Отриманий таким чином препарат під�дають іонобмінній хроматографії на ДЕАЕ�целюлозі та гель�фільтрації на SP�сефадексій одержують 6 очищених індивідуальнихколагеназ, які позначають α, β, γ, δ, ε та ζ.

Для очищення колагенази C. albicans вда�ються до центрифугування культуральноїрідини, ультрафільтрації супернатанту крізьмембрани Diaflo марки PU�10, хроматографіїна ДЕАЕ�сефацелі, внаслідок чого отриму�ють очищений у 600 разів фермент [11, 70].

Колагеназу з P. gingivalis виділяютьекстрагуванням із клітин 1%�м розчиномтритону X�100 та гель�хроматографією на се�фадексі G�50 і G�75 [71]. Для очищення кола�

redivivus), виділено позаклітинний білко�вий комплекс, що вбивав до 80% нематоду досліді протягом 24 год. Основним компо�нентом цього комплексу і основним патоген�ним агентом є серинова колагенолітичнапротеаза з молекулярною масою 28 кДа. Цейфермент виявляв максимум активності притемпературі 50 0С і рН 10 [63].

Одним із мікроорганізмів, який синтезуєсеринову протеазу з широкою субстратноюспецифічністю, у тому числі з колаге�нолітичною дією, є патогенний гриб Entomo/phthora coronata [64]. Цей фермент гідролі�зує нативний колаген шкіри людини,а також синтетичні пептиди — аналогиамінокислотних послідовностей колагену.Із цією протеазою схожа за дією на колагенсеринова протеаза, виділена з гриба Mal/branchеa pulchella var. sulfuria [52], однаквона має нижчу активність.

Cеринові протеази з грибів роду Aspergil/lus також виявляють високу колагенолітич�ну активність, проте за специфічністю діївідрізняються від колагенази E. coronata.Відомий штам A. niger, який синтезує аспер�гілопептидазу з високою колагенолітичноюактивністю [65]. Фермент здатен розщеплю�вати синтетичні пептиди зі специфічною ко�лагеновою структурою. Його молекулярнамаса становить 21 кДа, оптимальні умовидії — при температурі 45 0С і значеннях рНсередовища 7,5–7,8. Подібні за властивос�тями аспергілопептидази було виділеноз культуральної рідини A. oryzae [66]. Моле�кулярна маса виділеного ферменту станови�ла 20 кДа, оптимальні умови для вияву ко�лагенолітичної активності — рН 9,0–10,0і 40 0С. Ця протеаза має широку специфіч�ність дії і гідролізує низку білкових субстра�тів — нативний колаген, сироватковий аль�бумін, β�лактоглобулін, пептон.

Серед протеаз з колагеназною активніс�тю виявлено також кислі протеази. Їх виді�ляють з таких мікроорганізмів, як Porphyro/monas gingivalis, Candida albicans таAlicyclobacillus sendaiensis. Так, із клінічно�го ізоляту P. gingivalis 1101 [67] — грамнега�тивної патогенної анаеробної бактерії, якаспричиняє захворювання ротової порожни�ни, — було виділено і очищено протеазу зіспецифічністю до людського колагену і син�тетичних пептидів. Колагеназа інактивува�лась інгібіторами тіолових протеаз (пепста�тин, N�етилмалеімід) і відновлювальнимиагентами (β�меркаптоетанолом). Ферментсинтезується у вигляді зимогену з молекуляр�ною масою 94 кДа і розщеплюється на фраг�менти — 75,5 і 19 кДа. Припускають, що зи�

Огляди

19

заклітинного матриксу тканин з метою от�римання індивідуальних клітин з культуриабо для вирощування культуральних клі�тин. Виділені за допомогою мікробних кола�геназ життєздатні клітини острівків Лан�герганса застосовують у лікуванні діабету[76]. Колагеназу А, одержану з C. his/tolyticum, використовують, наприклад, дляізоляції гепатоцитів із печінки щурів (збері�гається до 80% живих клітин), а також ен�дотеліальних клітин [77]. Колагеназа А та�кож входить до складу мазей «Норуксол» та«Імозимаза», що їх застосовують для фер�ментативного очищення ран від опіків, об�морожень, варикозних виразок. Ці препаратине викликають алергічних реакцій і скоро�чують строки лікування у 1,5–2 рази [78].Колагеназу В того самого продуцента вико�ристовують для ізолювання клітин із тка�нин. Колагеназа із Streptomyces sp. може зас�тосовуватись для лізису пухлинних клітинінвертебрального диска хребта. На основіколагеназ створюють нові засоби для перев’я�зування, у тому числі плівкові покриття.

Використання ферментів у косметицівідкриває можливість для створення косме�тичних засобів лікувально�профілактично�го напряму, які не мають побічної дії (под�разнень, алергії, токсикозів). Колагеназаефективна у складі очищувальних креміві масок, оскільки прискорює процес гідролі�зу колагену в шкірі і сприяє синтезу новогоколагену та «омолоджуванню» шкіри [57].

Використання колагенази дозволить до�сягти високого рівня виробництва і якостіготової продукції в таких галузях, як, нап�риклад, шкіряна промисловість. Тут кола�геназу застосовують як у складі препаратівдля пом’якшення голини, так і на стадіїутилізації відходів виробництва [79]. Усе цесприяє поліпшенню якості голини, оскіль�ки ферментативний процес відбувається зам’яких умов, а тому структура отримуваноїголини виходить якіснішою, ніж при хіміч�ному пом’якшенні. Ферментативні процеситакож зумовлюють зниження температури об�роблення шкіри, зменшують забруднення ви�робничих стоків і агресивні умови праці [80].

Таким чином, деякі колагенази, що проду�куються мікроорганізмами, використовуютьдля наукових і практичних потреб. Для кола�геназ Clostridium histolyticum створено техно�логічні лінії виробництва. Утім, цю групупротеолітичних ферментів виявлено лишеу небагатьох представників світу мікробів,і тому вона викликає заінтересованість і увагу до�слідників для подальшого пошуку і вивчення.

генази з Cytophaga sp. L43�1 використовува�ли ультрафільтрацію й дворазову хромато�графію на ДЕАЕ�сефарозі і таким чиномодержували препарат ферменту, гомогенністьякого підтверджували дані SDS�PAGE [72].

Очищення аспергілопептидази з A. nigerздійснювали шляхом осадження з культу�ральної рідини ацетоном. Препарат, розчине�ний у воді, пропускали через хроматографіч�ну колонку з ДЕАЕ�целюлозою. Гомогенністьпрепарату визначали аналітичним диск�електрофорезом. У результаті виявили двакомпоненти, один з яких видаляли за допомо�гою вторинного осадження ацетоном і отри�мували гомогенну протеазу з колагенолітич�ною дією і молекулярною масою 21 кДа [73].

Практичне застосування колагеназ мікроорганізмів

Колагенолітичні ферменти мікробногопоходження відзначаються здатністю гідро�лізувати колагенові волокна різних типів.Їх можна використовувати для повного абочасткового гідролізу відповідних колагенів,зокрема для вивчення і визначення аміно�кислотного складу тропоколагенової моле�кули [74, 75].

Інші важливі галузі застосування кола�геназ — медицина і біотехнологія. Так, длядезінтеграції сполучної тканини, одержан�ня суспензії клітин або клітинних новоутво�рень зі збереженням життєздатності клітиннеобхідним є вибіркове руйнування позаклі�тинного матриксу без ушкодження поверхніживих клітин. Механічні засоби у цьому разінеефективні через високу стійкість матрик�су порівняно з клітинами. Протеази з широ�кою субстратною специфічністю сильнішеруйнують білкове покриття клітин, аніжматрикс, оскільки колаген практично непіддається їхній дії. Єдиним ефективнодіючим засобом є високоспецифічні колаге�нази, які вибірково руйнують молекули ко�лагену і не діють на інші білки.

Колагенолітичні ферменти мікроорганіз�мів можуть бути використані в медицині —для лікування деяких захворювань печінки,грижі інвертебрального диска хребта, опі�ків, обморожувань, для прискорення від�торгнення струпів і некротичних тканин,трофічних виразок, щоб пришвидшити очи�щення гнійно�некротичних нальотів. Порядіз цим колагенази необхідні для одержанняі культивування клітинних культур людсь�ких і тваринних тканин, які є джереламиактиваторів плазміногену в тромболітичнійтерапії. У біології клітин колагенолітичніферменти застосовують для руйнування по�

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

20

12. Sepulveda P., Murgui A., Lopez/Ribot J. L. etal. Evidence for the presence of collagenousdomains in Candida albicans cell surfaceproteins // Infect. Immun. — 1995. —V. 63, N6. — P. 2173–2179.

13. Sela M. N., Kohavi D., Krausz E. et al.Enzymatic degradation of collagen�guidedtissue regeneration membranes by periodon�tal bacteria // Clin. Oral. Implants. Res. —2003. — V.14, N3. — Р. 263–268.

14. Lamont R. J., Jenkinson H. F. Life below thegum line: pathogenic mechanisms ofPorphyromonas gingivalis // Microbiol. Mol.Biol. Rev. — 1998. — V. 62, N4. —P. 1244–1263.

15. Wittstock M., Flemmig T. F., Schmidt H. et al.Serodiagnosis of Porphyromonas gingivalisinfection by immunoblot analysis with recom�binant collagenase // J. Clin. Microbiol. —1996. — V. 34. — P. 2411–2413.

16. Lawson D. A., Meyer T. F. Biochemical char�acterization of Porphyromonas (Bacteroides)gingivalis collagenase // Infect. Immun. —1992. — V. 60, N4. — P. 1524–1529.

17. Bleeg H. S., Polenik P. Sodium dodecyl sul�fate potentiates collagen degradation by pro�teases from Porphyromonas (Bacteroides) gin/givalis // FEMS Microbiol. Ecol. — 1991. —V. 85, N2. — P. 125–132.

18. Labadie J. Synthesis of collagenase by phy�topathogenic bacterium Corynebacteriumrathayii // J. Appl. Bacteriol. — 1990. —V. 69, N6. — P. 828–833.

19. Labadie J. C., Gaillard B., Potier P. Invol�vement of the collagenase produced by Cory/nebacterium rathayii in its adhesion to colla�gen // FEMS Microbiol. Lett. — 1991. —V. 79, N1. — P. 75–82.

20. Lund T., Granum P. E. The 105�kDa proteincomponent of Bacillus cereus non�haemolyt�ic enterotoxin (Nhe) is a metalloproteasewith gelatinolytic and collagenolytic activi�ty // FEMS Microbiol. Lett. — 1999. —V. 178, N2. — P. 355–361.

21. Beecher D. J., Olsen T. W., Somers E. B.,Wong A. C. L. Evidence for contribution oftripartite hemolysin BL, phosphatidylcholi�ne�preffering phospholipase C, and collage�nase to virulence of Bacillus cereus endoph�thalmitis // Infect. Immun. — 2000. —V. 68. — P. 6269–5276.

22. Chakrabarty A. N., Dastidar S. G., Sen A. et al.Leprosy bacillus — possibly the firstchemoautotrophic human pathogen cultivat�ed in vitro and characterised // Indian J. Exp.Biol. — 2001. — V. 39, N10. — P. 962–983.

23. Dinges M. M., Orwin P. M., Schlievert P. M.Exotoxins of Staphylococcus aureus // Clin.

1. Неклюдов А. Д. Пищевые волокна живот�ного происхождения. Коллаген и его фрак�ции как необходимые компоненты новых иэффективных пищевых продуктов //Прикл. биохимия и микробиология. —2003. — T. 39, №3. — С. 261–272.

2. Ramachadran G. N., Reddi A. H. Biochemistryof collagen. — N.Y. and London: PlenumPress, 1976. — 576 p.

3. Bond M. D., Van Wart H. E. Relationshipbetween the individual collagenases ofClostridium histolyticum: evidence for evo�lution by gene duplication // Biochemistry.— 1984. — V. 23, N13. — P. 3092–3099.

4. Mandl J., Zipper H., Ferguson L. T. Clostri/dium histolyticum collagenase: its purifica�tion and properties // Arch. Biochem.Biophys. — 1958. — V. 74. — P. 465–472.

5. Bruggemann H., Baumer S., Fricke W. F. etal. The genome sequence of Clostridiumtetani, the causative agent of tetanus disease// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 2003. —V. 100, N3. — P. 1316–1321.

6. Awad M. M., Ellemor D. M., Bryant A. E. etal. Consruction and virulence testing of acollagenase mutant of Clostridium perfrin/gens // Microb. Pathog. — 2000. — V. 28,N2. — P. 107–117.

7. Shimamoto S., Moriyama R., Sugimoto K. etal. Partial characterization of an enzymefraction with protease activity which con�verts the spore peptidoglycan hydrolaze(SleC) precursor to an active enzyme duringgermination of Clostridium perfringens s40spores and analysis of a gene clusterinvolved in the activity // J. Bacteriol. —2001. — V. 183, N2. — P. 3742–3751.

8. Jakson R. J., Dao M. L., Lim D. V. Cell�asso�ciated collagenolytic activity by group BStreptococci // Infect. Immunol. — 1994. —V. 62, N12. — P. 5647–5651.

9. Jakson R. J., Lim D. V., Dao M. L.Identification and analysis of a collagenolyt�ic activity in Streptococcus mutans //Curr.Microbiol. — 1997. — V. 34, N1. —P. 49–54.

10 Harrington D. J., Russell R. R. B. Identifica�tion and characterization of two extracellularproteases of Streptococcus mutans // FEMSMicrobiol. Lett. — 1994. — V. 121, N2. —P. 237–242.

11. Nishimura M., Nikawa H., Yamashiro H. etal. Cell�associated collagenolytic activity byCandida albicans // Mycopathologia. —2002. — V. 153, N3. — P. 125–128.

ЛІТЕРАТУРА

Огляди

21

strain Arthrobotrys tortor Jarowaja //Mycopathologia. — 2002. — V. 153, N3. —P. 157–162.

36. Демина Н. С., Лысенко С. В. Коллагеноли�тические ферменты, синтезируемые мик�роорганизмами // Микробиология. —1996. — T. 65, N3. — С. 293–304.

37. Bond M. D., van Wart H. E. Characterization ofthe individual collagenases from Clostridiumhistolyticum // Biochemistry. — 1984. —V. 23, N13. — P. 3085–3091.

38. Bond M. D., van Wart H. E. Purification andseparation of individual collagenases ofClostridium histolyticum using red dye lig�and chromatography // Biochemistry. —1984. — V. 23, N13. — P. 3077–3085.

39. Jung C. M., Matsushita O., Katayama S. et al.Identification of metal ligands in the Clostridi/um histolyticum ColH collagenase // J. Bacte�riol. — 1999. — V. 181. — P. 2816–2822.

40. Matsushita O., Jung C.M., Katayama S. et al.Gene duplication and multiplicity of collage�nases in Clostridium histolyticum // Ibid. —1999. — V. 181. — P. 923–933.

41. Yoshihara K., Matsushita O., Minami J.,Okabe A. Cloning and nucleotide sequenceanalysis of the colH gene from Clostridiumhistolyticum encoding a collagenase and agelatinase // Ibid. — 1994. — V. 176,N21. — P. 6489–6496.

42. Nguyen T. T., Dumas J., Keil/Dlouha V. NewAchromobacter collagenase and its immuno�logical relationship with a vertebrate collage�nase // Biochim. Biophys. Acta. — 1988. —V. 955, N1. — P. 43–49.

43. Keil/Dlouha V., Keil B. Subunit structure ofAchromobacter collagenase //Ibid. — 1978. —V. 522, N1. — Р.218–228.

44. Демина Н. С., Лысенко С. В. Коллагеноли�тическая активность Streptomyces sp. //Микробиология. — 1992. — T. 61, N4. —С. 629–633.

45. Chakraborty R., Chandra A.L. Collagenolyticactivity of a soil actinomycete // Folia Mic�robiol. (Praha). — 1982. — V. 27, N6. —P. 471–474.

46. Petrova D., Derekova A., Vlahov S.Purification and properties of individualcollagenases from Streptomyces sp. strain3B // Ibid. — 2006. — V. 51, N2. —P. 93–98.

47. Іванко О. В., Варбанець Л. Д. Очистка та фі�зико�хімічні властивості колагенази Strep/tomyces sp.1349 і кератинази Streptomycessp.1382 // Мікробіол. журн. — 2004. —T. 66, N2. — С. 11–24.

48. Miyake R., Shigeri Y., Tatsu Y. et al. Twothimet oligopeptidase�like Pz peptidases

Microbiol. Rev. — 2000. — V. 13, N1. —P. 16–34.

24. Vrahy B., Hnatkova Z., Letel A. Occurence ofcollagendegrading microorganisms in asso�ciations of mesophilic heterotrophic bacteriafrom various soils // Folia Microbiol (CSSR). —1988. — V. 33, N6. — P. 458–461.

25. Kabadjova P., Vlahov S. Investigation on col�lagenolytic activity of some Streptomycesstrains isolated from Bulgarian soils //Докл. Бълг. АН. — 1995. — V. 48, N9–10. —P. 115–118.

26. Слабоспицкая А. Т., Крымовская С. С., Рез/ник С. Р. Коллагенолитическая активностьбактерий рода Bacillus, выделенных изразличных экологических источников //Микробиол. журн. — 1989. — T. 51,N6. — С. 54–56.

27. Chacraborty R., Chandra A.L. Purificationand characterization of a streptomycete col�lagenase // J. Appl. Bacteriol. — 1986. — V.61, N4. — P. 331–337.

28. Endo A., Murakawa S., Shimizu H.,Shiraishi Y. Purification and properties ofcollagenase from Streptomyces species // J.Biochem (Tokyo). –1987. — V. 102, N1. —P. 163–170.

29. Sasagawa Y., Izaki K., Matsubara Y. et al.Molecular cloning and sequence analysis ofthe gene encoding the collagenase fromCytophaga sp. L43�1 strain // Biosci.Biotechnol. Biochem. — 1995. — V. 59,N11. — P. 2068–2073.

30. Takeuchi H., Shibano Y., Morihara K. et al.Structural gene and complete amino acidsequence of Vibrio alginolyticus collagenase //Biochem. J. — 1992. — V. 281. — P. 703–708.

31. Hare P., Scott/Burden T., Woods D. R.Characterization of extracellular alkalineproteases and collagenase induction in Vibrioalginolyticus // J. Gen. Microbiol. — 1983. —V. 129. — P. 1141–1147.

32. Gousterova A., Lilova A., Trenev M. et al.Thermophilic actinomycetes as producers ofcollagenase // Докл. Бълг. АН. — 1998. —V. 51, N3–4. — P. 71–74.

33. Christov P., Gousterova A., Goshev I. et al.Optimization of the biosynthetic conditionsfor collagenase production by certain ther�mophilic actinomycete strains // Ibid. —2000. — V. 53, N1. — P. 115–118.

34. Oh K. H., Seong C. S., Lee S. W. et al.Isolation of a psychrotrophic Azospirillumsp. and characterization of its extracellularprotease // FEMS Microbiol. Lett. — 1999. —V. 174, N1. — P. 173–178.

35. Tosi S., Annovazzi L., Tosi I. et al.Collagenase production in an antarctic

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

22

60. Lecroisey A., Boulard C., Keil B. Chemical andenzymatic characterization of the collagenasefrom insect Hypoderma lineatum // Eur. J.Biochem. — 1979. — V. 101. — P. 385–393.

61. Stolow M. A., Bauzon D. D., Li J. et al.Identification and characterization of anovel collagenase in Xenopus laevis: possibleroles during frog development // Mol. Biol.Cell. — 1996. — V. 7. — P. 1471–1483.

62. Lim D. V., Jakson R. J., Pullvongruenigen C.M. Purification and assay of bacterialcollagenases // J. Microbiol. Methods. —1993. — V. 18, N3. — P. 241–253.

63. Qiuhong N., Xiaowei H., Baoyu T. et al.Bacillus sp. B16 kills nematodes with a ser�ine protease identified as a pathogenic factor// Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2006. —V. 69, N6. — P.722–730.

64. Hurion N., Fromentin H., Keil B. Specificityof the collagenolytic enzyme from the fun�gus Entomophthora coronata: comparisonwith the bacterial collagenase from Achromo/bacter iophagus // Arch. Biochem. Biophys. —1979. — V.192, N2. — Р. 438–445.

65. Stevenson K. J., Gaucher G. M. The substratespecificity of thermomycolase, an extracel�lular serine proteinase from the ther�mophilic fungus Malbranchea pulchella var.Sulfurea // J. Biochem. — 1975. — V. 51,N3. — Р.527–542.

66. Nordwig A., Jahn W. F. A collagenolyticenzyme from Aspergillus oryzae. Purifi�cation and properties // Eur. J. Biochem. —1968. — V. 3, N4. — Р. 519– 529.

67. Kuramitsu H. K., Yoneda M., Madden T.Proteases and collagenases of Porphyromo/nas gingivalis // Adv. Dent. Res. — 1995. —V. 9. — P. 37–40.

68. Hidenori K., Yoshisato H., Sachio H.,Tamaki C. Isolation and characteristics ofcollagenolytic enzyme produced by Candidaalbicans // Infect. Immunol. — 1986. —V. 53, N2. — P. 312–316.

69. Tsuruoka N., Nakayama T., Ashida M. et al.Collagenolytic serine�carboxyl proteinasefrom Aliciclobacillus sendaiensis strainNTAP�1: purification, characterization,gene cloning, and heterologous expression// Appl. Environ. Microbiol. — 2003. —V. 69, N1. — P. 162–169.

70. Kaminishi H., Hagihara Y., Hayashi S., ChoT. Isolation and characteristics of col�lagenolytic enzyme produced by Candidaalbicans // J. Infect. Immun. — 1986. —V. 53, N2. — P. 312–316.

71. Lawson D. A., Meyer T. F. Biochemical char�acterization of Porphyromonas (Bacteroi/des) gingivalis collagenase // Infect.

produced by a collagen�degrading ther�mophile, Geobacillus collagenovorans MO�1// J. Bacteriol. — 2005. — V. 187, N12. —P. 4140–4148.

49. Okamoto M., Yonejima Y., Tsujimoto Y. et al.A thermostable collagenolytic protease witha very large molecular mass produced bythermophilic Bacillus sp. strain MO�1 //Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2001. —V. 57, N1–2. — Р.103–108.

50. Murai A., Tsujimoto Y., Matsui H., WatanabeK. An Aneurinibacillus sp. strain AM�1 pro�duces a proline�specific aminopeptidase usefulfor collagen degradation // J. Appl. Micro�biol. — 2004. — V. 96, N4. — P. 810–818.

51. Хайдарова Н. В., Руденская Г. Н., Степа/нов В. М., Егоров Н. С. Продукция протеи�наз в процессе развития культуры Strepto/myces thermovulgaris T�54 // Прикл.биохимия и микробиология. — 1991. —T. 27, N3. — С. 375–380.

52. Tsushiya K., Nakamura Y., Sakashita H.,Kimura T. Purification and characteriza�tion of a thermostable alkaline protease fromalkalophilic Thermoactinomyces sp. HS682// Biosci. Biotechnol. Biochem. — 1992. —V. 56. — P. 246–250.

53. Petrova D. H., Shishkov S. A., Vlahov S. S.Novel thermostable serine collagenase fromThermoactinomyces sp. 21E: purificationand some properties // J. Basic Microbiol. —2006. — V. 46, N4. — P. 275–285.

54. Петрова И. С. Протеолитические ферментыактиномицетов. — М.: Наука, 1976. — 60 с.

55. Narahashi Y., Yoda K. Alkaline Proteinase Eof Streptomyces griseus K�11 // J. Biochem. —1976. — V. 79, N5. — Р. 1119–1122.

56. Galas E., Kaluzewska M. T. Proteinases ofStreptomyces fradiae. I. Preliminary charac�terization and purification // Acta Micro�biol. Pol. — 1989. — V. 38, N3. — P. 247–258.

57. Климова О. А., Чеботарев В. Ю. Препаратыколлагенолитических протеаз беспозво�ночных: биохимические аспекты медицин�ского и косметологического применения// Бюллетень експерим. биологии и меди�цины. — 2000. — T. 130, N7. — С. 70–75.

58. Carbonnaux C., Ries/Kautt M., Ducruix A.Relative effectiveness of various anions onthe solubility of acidic Hypoderma lineatumcollagenase at pH 7,2 // Protein Sci. —1995. — V. 4. — P. 2123–2128.

59. Chen Y. L., Lu P. J., Tsai I. H. Collagenolyticactivity of crusfacean midgut serine pro�teases. Comparison with the bacterial andmammalian enzymes // Comp. Biochem.Physiol. — 1991. — V. 100, N4. —P. 763–768.

Огляди

23

КОЛЛАГЕНОЛИТИЧЕСКИЕ ФЕРМЕНТЫ МИКРООРГАНИЗМОВ

Е. В. МацелюхЛ. Д. Варбанец

Институт микробиологии и вирусологии НАНУкраины, Киев

Е/mail: varbanets@serv.imv.kiev.ua

Микробные коллагенолитические фермен�ты гидролизуют белки семейства коллагенов.В работе представлены данные о cпособностирасщеплять коллаген ферментами, выделен�ными из разных групп микроорганизмов — бак�терий, грибов, актиномицетов и дрожжей. Рас�смотрены физико�химические свойства,методы выделения и очистки ферментных пре�паратов коллагеназ. Проанализированы суще�ствующие и возможные пути использованияэтих ферментов в промышленности и меди�цине.

Ключевые слова: коллагенолитические ферментымикроорганизмов, физико�химические свойства,методы выделения и очистки, практическое приме�нение.

MICROBIAL COLLAGENOLYTICENZYMES

О. V. Matselyukh,L. D. Varbanets

Institute of Microbiology and Virology ofNational Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

E/mail : varbanets@serv.imv.kiev.ua

Microbial collagenolytic enzymes are able tohydrolyze such a hard insoluble protein sub�strate as collagen. In this article are gathereddata concerning the ability to degrade collagenamongst various groups of microorganisms,such as bacteria, fungi, actinomycetes andyeasts. The physical and chemical properties ofcollagenolytic enzyme preparations and methodsof their separation and purification have beenexamined. The possible application ways of theseenzymes in industry and medicine have been dis�cussed.

Key words: microbial collagenolytic enzymes, physi�cal and chemical properties, methods of isolation andpurification, practical application.

Immun. — 1992. — V. 60, N4. —Р. 1524–1529.

72. Sasagawa Y., Kamio Y., Matsubara Y. et al.Purification and properties of collagenasefrom Cytophaga sp. L43�1 strain // Biosci.Biotechnol. Biochem. — 1993. — V. 57,N11. — P. 1894–1898.

73. Barthomeuf C., Pourrat H., Pourrat A.Collagenolytic activity of a new semi�alkalineprotease from Aspergillus niger // J.Ferment. Bioengin. — 1992. — V. 73, N3. —P. 233 –236.

74. Mookhtiar K. A., Mallya S. K., Wart H. E.Properties of radiolabeled type I, II and IIIcollagens related to their use and as sub�strates in collagenase assays // Anal.Biochem. — 1986. — V. 158. — P. 322 –338.

75. Aubert/Foucher E., Font B., Eichenberger D.et al. Purification and characterization ofnative type XIV collagen // J. Biol. Chem. —1992. — V. 267, N22. — P.15759–15764.

76. Леонович С. И., Слука Б. А., Игнато/вич И. Н., Горанов В. А. Трансплантациякультуры островковых клеток поджелу�дочной железы в красный костный мозг //Белорус. мед. журн. — 2004. — Т. 1,№37. — С. 38–41.

77. Timar F., Botyanszki J., Suli/Vargha H. еt al.The antiproliferative action of a melphalanhexapeptide with collagenase�cleavable site// Cancer Chemother. Pharmacol. — 1998. —V. 41, N 4. — P. 292–298.

78. Lisi P., Brunelli L. Extensive allergic contactdermatitis from a topical enzymatic prepara�tion (Noruxol) // Contact Dermatitis. —2001. — V. 45, N3. — P. 186–187.

79. Гребешова Р. Н., Рышкова Т. М., ФедороваЛ. Г. и др. Интенсификация процессов об�работки кожевенного сырья с использова�нием щелочной протеазы // Биотехноло�гия. — 1998. — V. 4, N6. — С. 788 –791.

80. Dalev P. G., Simeonova L. S. An enzymebiotechnology for the total utilization ofleather waster // Biotechnol. Lett. — 1992. —V. 14, N6. — P. 531–534.

Огляди

25

вторичного метаболизма. Идентифицирова�но около 20 000 индивидуальных фенолов иежегодно выделяются новые. Углеродныйскелет молекул различных фенолов колеб�лется от С1 до С6–С3–С6, включает одно илинесколько бензольных колец, а химическаяи биологическая активность связана с при�сутствием в них одной или нескольких гид�роксильных и карбонильных групп. Наиболеемногочисленными и распространеннымисреди растительных фенолов являются фла�воноиды (С6–С3–С6). Их молекула состоитиз двух шестичленных колец А и В, соеди�ненных трехуглеродным фрагментом.В большинстве случаев этот фрагмент обра�зует третье кольцо, гетероцикл, с участиематома кислорода (рис. 1).

Нумерация атомов необходима для обоз�начения места заместителей. Она начинает�ся с гетероатома кислорода в гетероциклеи кольце А (1–8), в кольце В — с места при�соединения к трехуглеродному фрагменту(11–61). По разным классификациям разли�чают 8–12 классов флавоноидов [1–3]. Наи�более высокой и разнообразной биологичес�кой активностью обладают фенолы,содержащие несколько гидроксильныхгрупп, расположенных в орто� (например,у атомов 6 и 7 кольца А), пара� (у атомов 5и 8) или мета� (у атомов 6, 7 и 8) положе�нии. Такие фенолы способны подвергатьсяобратимому окислению до хинонов черезпромежуточную стадию свободного радика�ла (семихинона, феноксила) (рис. 2). Конс�танты скорости реакции незамещенных фе�нолов с радикалами аскорбата составляют

Чай — излюбленный и наиболее распрост�раненный во всем мире напиток с пятитысяче�летней историей. Регулярное употреблениеэтого уникального по составу напитка с его не�повторимым вкусом и ароматом придает бод�рость, повышает работоспособность, не вызы�вая привыкания и зависимости, не даваяпобочных эффектов. Во многих странах питьечая — это часть культуры, утренний чай —традиция. В Японии — целая чайная церемо�ния, приобретающая в цзен�буддизме религи�озный характер. Чай культивируется в высо�когорных районах Гималаев (Дарджилинг,Ассам), в субтропических и тропических райо�нах Индии, Китая, Шри�Ланки (Цейлон),Японии, Индонезии, Кении. Высшие сортачайного листа собирают вручную. Чай (Came/lia sinensis L., по�китайски Tcha) — рекор�дсмен в мире растений по содержанию фено�лов–антиоксидантов, определяющих свойстваприготовленного из него напитка. Наиболь�шее потребление чая в расчете на одного чело�века — в Ирландии (3,16 кг/год), Великобри�тании (2,53 кг/год), Кувейте (2,52 кг/год).В 1996 г. в мире было произведено 2,61 млн. тчайного листа, в том числе 2 млн. т (76%) чер�ного чая, 581 тыс. т зеленого чая (22%) и54 000 т красного чая oolong (2%). В Индииполучено 704 тыс. т чайного листа, в Китае —560 тыс. т, в Кении — 188 тыс. т. [6].

Химическая структура

Фенольные соединения — важный пос�тоянный компонент тканей растений (2–4%состава и более) — являются продуктами

В. А. БАРАБОЙ

E/mail: rguiberman@mail.ru

УДК 612.393:577.151.6

КАТЕХИНЫ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ: КАТЕХИНЫ ЧАЙНОГО РАСТЕНИЯ: СТРУКТУРА, АКТИВНОСТЬ, ПРИМЕНЕНИЕСТРУКТУРА, АКТИВНОСТЬ, ПРИМЕНЕНИЕ

Рассмотрены технология получения различных видов чая и механизмы биологического действия наиболееактивных его компонентов — катехинов. Предпринята попытка объяснить их исходя из антиоксидантныхсвойств этих физиологически активных соединений, что обусловливает наличие у них антимутагенных и про�тивоопухолевых эффектов. Особое внимание уделено химическим и биологическим свойствам наиболее актив�ного из катехинов — EGCG.

Ключевые слова: чай, катехины, антиоксидантная активность.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

26

(30–42% сухого веса) полифенолов, глав�ным образом катехинов [7, 8]. Наряду с по�лифенолами чай содержит кофеин (3,5%),теофиллин, теобромин, сапонины, эфирныемасла (небольшие количества), белки, ами�нокислоты (15%), неусвояемые углеводы(25%), а также витамины, микроэлементы,в том числе фтор [7]. Юные листочки чайно�го растения — апикальная почка и два пер�вых листа — содержат в 2,7 раза больше по�лифенолов, больше кофеина, чем старыелистья, и идут на изготовление высших сор�тов чая. Летом все листья чая содержат в 1,4раза больше фенолов, чем осенью. В старыхлистьях наибольшая концентрация дубиль�ных веществ.

Основную массу полифенолов чая состав�ляют катехины (флаван�3�олы). От другихклассов полифенолов они отличаются отсут�ствием в положении 4 как карбонильной,так и гидроксильной групп. Это наиболеевосстановленные из флавоноидов и, следо�вательно, обладающие наибольшим антиок�сидантным потенциалом, склонные к ауто�окислению и ферментативному окислению,предшественники галлотаннинов [11]. По�мимо катехинов в чае присутствуют глико�зиды флавонолов — кверцетина, кемпферо�ла, мирицетина [12], а также неролидол,β�ионон, δ�каденин и β�кариофиллен, обла�дающие наряду с индолом и индол�3�карби�нолом умеренной цитотоксической актив�ностью in vitro [13]. В чайном растении естьтакже небольшое количество флавандиолови фенольных кислот [14]. Чайные катехины —это (+)�катехин (К), (–)�эпикатехин (ЕС),(+)�галлокатехин (GC), (–)�эпигаллокатехин(EGC), (–)�эпикатехин�3�галлат (ECG) и (–)�эпигаллокатехин�3�галлат (EGCG). Катехи�ны содержат по два о�гидроксила в кольцахА и В. Галловая кислота располагает тремярядом расположенными гидроксильнымигруппами. Поэтому появление третьего гид�роксила в кольце А превращает катехин в гал�локатехин, а в кольце В — в катехингаллат.EGCG — наиболее галлированный катехин(всего 6 гидроксильных групп), обладающийи максимальной антиоксидантной (АО�), и би�ологической активностью [3, 5, 14]. Стакан зе�леного чая содержит около 142 мг EGCG, 65 мгEGC, 17 мг EC и 76 мг кофеина [15].

Виды чая. Технология получения.Процессинг

Зеленый чай получают из чайного листа,не подвергшегося переработке. Содержит до40–42% катехинов. Некоторое значение

105 М�1 с�1 [4]. Полифенолы, по крайней меревысокомолекулярные, называют еще дуби�льными веществами (таннинами) из�за спо�собности прочно связываться с белками кожи(шкуры) животных. Наконец, термин «био�флавоноиды» ассоциируется с высокой био�логической активностью этих соединений.

Классы флавоноидов различают по на�личию или отсутствию двойной связи>C2=C3<, карбонильной группы >C4 =О, поприсоединению кольца В ко 2�му или 3�муатому углерода [3, 5]. В листьях чайного рас�тения (в зеленом чае) содержится ~36%

А

КатехинБ

Рис. 1. Структура катехинов:А — Углеродный скелет флавоноидов и ну�

мерация атомов в кольцах;Б —

R1=R2=H–(+) катехин (+)–C;R1=OH; R2=H–эпигаллокатехин (EGC);R1=H; R2=OH–эпикатехингаллат (ECG);R 1=R 2=OH–эпигаллокатехингаллат

(EGCG)

Рис. 2. Схема обратимого окисления оK и рKдифенолов

Огляди

27

кислоты на 1 моль глюкозы. Его основнымструктурным элементом является пентади�галлоил�глюкоза. Конденсированные тан�нины образуются как из катехинов, так и,главным образом, из проантоцианидинов(флаван�3,4�олов), в воде они нерастворимы.Таннины защищают растения от атаки пато�генных грибов, поедания птицами, преж�девременного прорастания. Поступая с пи�щей в организм человека и животных,таннины уменьшают массу тела, усвоениебелков, жиров, аминокислот, углеводов, ви�таминов, железа и других металлов,действуя как энтеросорбенты. Таннины об�разуют прочные поперечные связи с белка�ми за счет –ОН�групп таннина и карбониль�ных групп белков (это основа дубильногоэффекта) [72]. При прохождении через пи�щеварительный тракт таннины оказываютдезинфицирующее, противовоспалительноедействие на слизистые оболочки, стимули�руют перистальтику.

Чаи oolong и puchong — продукты дози�рованной полуферментации высококачест�венного чайного сырья. Это высшие сортачая, обладающие более высокой АО�актив�ностью, чем зеленый чай. Существует ещеи так называемый белый чай, получаемыйбез пара, подогрева и сворачивания на солнце,с более высоким содержанием полифенолови более высокой эффективностью. Жасми�новый чай готовится в Южном Китае из по�луферментированного чайного листа с добав�лением цветков жасмина [11, 64, 73].

Технология массового производства сор�тов зеленого и черного чая, к сожалению,идет по пути ускорения процесса, что в боль�шинстве случаев таит опасность ухудшениякачества продукта. Пока желаемый опти�мум соотношения скорости и качества либоне найден, либо является секретом фирм.

Биологическая активность катехинов

Антиокислительная активностьСумма чайных катехинов обладает высо�

чайшей АО�активностью: она в 25–100 развыше таковой α�токоферола и аскорбатав сравнимых условиях [10]. EGCG — самыймощный из известных АО растительногопроисхождения [11]. Взаимодействуя со сво�бодными радикалами, катехины, как и дру�гие фенольные соединения, нейтрализуютих, сами превращаясь в стабильные долго�живущие радикалы, не продолжающие цепи[16]. Они действуют в соответствии со следу�ющими механизмами: антирадикальным(против OH′ и О2–); антилипопероксидным

имеют условия произрастания чайной куль�туры. Высокогорные чаи (например, сорт«Дарджилинг») отличаются более высокимсодержанием катехинов и лучшими вкусо�выми качествами. Сорт чая тем выше, чемменьше в нем грубых старых листьев. Выс�шие сорта изготавливают из верхушечнойпочки и первых двух молодых листочков.

Черный чай получают после высушива�ния и ферментации чайного листа. В натив�ном листе фенолы и ферменты их окисленияполифенолоксидазы пространственно разоб�щены. В процессе высушивания (теплымвоздухом, на солнце или в специальных пе�чах в течение 20–40 мин при температуре35–80 0С) достигается контакт субстратовс ферментом, развивается окислительнаядеструкция и в то же время окислительнаяконденсация катехинов. Глубина фермента�ции регулируется вариациями температурыи длительности сушки.

В зеленом чае ферментация и окислениеполностью исключаются, используют лишьвысушивание на солнце, поэтому содержаниекатехинов, в особенности EGCG, значитель�но выше, чем в черном чае [64]. Процессинг(ферментация) приводит к образованию сна�чала катехин�хинонов, а затем олигоме�ров — теафлавинов (2–6%) и теарубигинов(свыше 20%), также обладающих высокойантиоксидантной активностью [65]. Но в це�лом активность черного чая ниже, чем зеле�ного [66]. Количество неизмененных кате�хинов составляет в нем 5–10% [67]. Однаконекоторые авторы утверждают, что АО�ак�тивность черного чая даже выше, а теафла�вин наиболее сильно угнетает продукциюокиси азота, снижая его синтез с помощьюiNOS [68]. Теафлавины — димерные катехи�ны, они придают черному чаю оранжево�красную окраску [65]. Теафлавин (TF�1),теафлавин�3�моногаллат и теафлавин�31�моногаллат (TF�2), а также теафлавин�3,31�дигаллат (TF�3) — основные теафлавинычерного чая. Продукты дальнейшей окисли�тельной полимеризации — теарубигины. Те�афлавины и теарубигины отвечают за АО�,противовоспалительную, ингибиторную,росттормозящую активность черного чая[65, 69, 70]. Для управления процессом фер�ментации предлагается, в частности, способбыстрого и глубокого замораживания чай�ного листа [71].

Продолжающийся процессинг приводитк образованию гидролизуемых галлотанни�нов с молекулярной массой 500–3 000 и бо�лее конденсированных таннинов (> 3 000).Галлотаннин содержит 8–10 молей галловой

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

28

флавоноиды и особенно катехины чая обра�зуют прочные комплексы с ионами метал�лов, препятствуя их каталитической актив�ности и тем самым обеспечивая АО�эффект.Очевидно, конечный результат (+ или –)встречи катехинов с ионами Fe (ІІ) и Cu (ІІ)определяется соотношением их концентра�ций и активностей. Избыток свободных ио�нов металлов (относительно редкий в усло�виях in vivo) способен обращать АО�эффектфенолов [36]. Комплексы фенолов с ионамиметаллов образуются за счет карбонильныхи гидроксильных групп, и это препятствуетвсасыванию и каталитической активностиметаллов [37, 38]. Методом ЭПР с использо�ванием стабильных радикалов ААРН и ДФПГи генерации синглетного кислорода в систе�мах рибофлавина и гематопорфирина пока�зано, что радикалперехватывающая актив�ность галлированных катехинов ECG и,особенно, EGCG в отношении четырех типоврадикалов значительно выше, чем негалли�рованных катехинов. Таким образом, при�сутствие галлоильного остатка в положении3 кольца А играет существенную роль в АО�эффекте, так же как введение ОН�группыв положение 51 кольца В [22, 39–41]. Вооб�ще структура кольца В, количество рядомрасположенных гидроксилов играет важ�нейшую роль в формировании АО�эффекта.Механизм его заключается в образованиио�хинонной структуры, о чем свидетельствуетпоявление двух карбонильных сигналов ЭПР.(–)�Галлокатехин и этилгаллат не образуюткарбонильных сигналов и, следовательно,их АО�механизм отличен от такового (+)�ка�техина и (–)�эпикатехина [42]. (–)�EG приокислении образует антоцианоподобное сое�динение с длительным АО�эффектом [43].

Стабильность катехинов, других феноль�ных соединений и соответственно сила идлительность их АО�активности существен�но зависят от рН среды. В кислых средах(рН<4) все чайные катехины высокоста�бильны. В пределах рН 4–7 их стабильностьобратно пропорциональна величине рН. Вприсутствии аскорбиновой кислоты стой�кость катехинов к окислению значительновозрастает. В щелочной среде галлокатехи�ны нестабильны и в течение нескольких ми�нут деградируют почти полностью [44]. Поэ�тому при переходе пищевого комка изкислой среды желудка в щелочной рН ки�шечника (>8) катехины становятся неста�бильными и легко деградируют. (–)�Эпикате�хин и (–)�эпикатехингаллат в этих условияхболее стабильны, чем (–)� эпигаллокатехини (–)�эпигаллокатехингаллат [45].

(против R′ — алкилрадикала, ROO′ — пе�роксирадикала и RO′ — алкоксирадикала);антикислородным (против О2 и 1О2); хелати�рования металлов [17]. Катехины действуюттакже как перехватчики радикалов окисиазота [18], защищая от пероксинитритопос�редованного нитрования и окисления[19,20]. In vitro катехины успешно перехва�тывают стабильные радикалы 1,1�дифенил�2�пикрилгидразила (ДФПГ) и ABTS, инги�бируют липопероксидацию и активностьлактатдегидрогеназы [21, 22]. EGCG и ECGэффективно предотвращают Н2О2�индуци�рованное повреждение эндотелиоцитов бы�ка в культуре [23].

В условиях in vivo EGCG в концентрациях,наблюдающихся в плазме крови человекапри систематическом потреблении зеленогочая, эффективно тушит водные радикалы,ограничивая тем самым их переход в липид�ный компартмент. На водно�липидной повер�хности EGCG осуществляет восстановление(рециклизацию) окисленного витамина Е,что подтверждено методом электронного па�рамагнитного резонанса (ЭПР) [24]. Мето�дом ЭПР показано также, что EGCG и EGCспонтанно образуют радикальные, т. е. мак�симально активные, формы (галлил�ради�кал и анион�радикал) в водных растворахс низким рН без внешнего окислителя (ио�ны цинка II выступают в роли стабилизато�ров). Радикал OH′ (наиболее агрессивный)не образуется из�за отсутствия свободныхионов металлов [25]. АО�активность катехи�нов проявляется и в защите от окислениялипопротеинов низкой плотности (LDL),клеток — от предварительно окисленногоLDL [26, 27]. Эту защитную активность ка�техины проявляют в относительно низкихдозах и концентрациях (0,1–3 мкМ снижа�ют на 50% токсичность окисленного LDL).Эффект достигается за счет следующих ме�ханизмов: а) предотвращения окислительнойатаки мембранных липидов посредствомэкономии (и регенерации) α�токоферола;б) ингибирования липоксигеназ; в) ингиби�рования клеточных ферментов, участвую�щих в сигнальной трансдукции [28]. Катехинингибирует также продукцию окислитель�ных радикалов моноцитами периферичес�кой крови [29]. Кроме того, катехины и ихдимеры ингибируют активацию факторатранскрипции NF�kB [30], который участвуетв механизмах атеросклероза и пролиферации.

Однако в присутствии ионов Fe(II) [31,32], Cu(II) [26, 33, 34], а также Н2О2 [35] АО�эффект катехинов обращается в прооксидан�тный. В то же время хорошо известно, что

Огляди

29

Экстракты зеленого чая ингибируют ки�шечное всасывание глюкозы, ионов натрия[57], защищают тирозин от нитрования(эпикатехин в концентрации 0,02 моля ин�гибирует эффект 1 моля пероксинитрита[58]). На крысах Sprague�Dawley полученаэффективная модель диабета: при содержа�нии на диете, богатой фруктозой, в течение12 недель у крыс, по сравнению с контролем,развились гипертензия, гипергликемияи гиперинсулинемия. Инсулинстимулиро�ванное потребление глюкозы и связываниеинсулина с адипоцитами (изолированнымииз эпидидимиса крыс) существенно снизи�лись. Транспорт глюкозы в адипоцитах так�же снизился. Потребление зеленого чая (5 глиофилизированного чая, растворенныхв 100 мл деионизированной дистиллирован�ной воды) в качестве питья вместо воды пол�ностью устраняло метаболические дефектыи гипертензию [59]. Введение в культуруклеток РС12 гидроксидопамина индуцируетапоптоз клеток (in vitro модель нейродегене�рации — паркинсонизма). В этих условияхEGCG и ECG эффективно ингибируют апо�птоз [58].

Катехины зеленого чая с успехом ис�пользуют для защиты от порчи и самоокис�ления скоропортящихся пищевых продуктов,например мяса макрели [61], обеспечиваяисключительную стабильность рыбопродук�тов при хранении. (+)�Катехин, вводимыйper os крысам в течение 2–3 недель, резкоуменьшает ожирение печени, вызванноежирной пищей, отравлением оротовой кис�лотой и алкоголем [62]. Экстракты зеленогочая защищают печень также от токсическо�го действия липополисахарида и D�галакто�замина, ингибируя TNF α�индуцированныйапоптоз гепатоцитов [63].

Таким образом, биологическая актив�ность и пищевая ценность чая обусловленыпрежде всего высокой АО�активностью чай�ных катехинов и в силу этого их способ�ностью противодействовать самоокислениюскоропортящихся продуктов вне организмаи свободнорадикальному окислению какфактору риска многих форм патологии.

Ингибиторная активность. Метаболизм и действие в организме

человека и животных

Полифенолы чая легко связываютсяв организме с белками начиная с богатыхпролином белков слюны. Связывание кате�хинов с мембранными белками, рецепторами,ферментами может приводить к различным

Комплекс катехинов чайного растенияиз�за их высокой АО�активности, хорошейрастворимости в жидкостях организма обла�дает выраженной противолучевой актив�ностью в эксперименте на лабораторныхмышах и крысах — при внутрибрюшинномвведении как перед рентгеновским облуче�нием в дозе ЛД95–99, так и после него [3].

АО�активность чайных катехинов, учи�тывая постоянное употребление чая сотнямимиллионов людей, является важным факто�ром сдерживания, ограничения процессовсвободнорадикального окисления и липид�ной пероксидации в организме, факторомпредупреждения и замедления атеросклеро�за сосудов, ишемической болезни сердца,гипертонической болезни и их исходов,а также других форм свободнорадикальнойпатологии (диабета типа II, катаракты, рев�матоидного артрита и др). EGCG эффективноснижает уровень холестерола и триглицери�дов в плазме [46], защищает кардиомиоци�ты от ишемических повреждений [47],снижает агрегацию тромбоцитов и артери�альное давление, всасывание холестеролав кишечнике [48]. По другим данным, пот�ребление катехинов чая не изменяет уровняхолестерола и триглицеридов в плазме кро�ви мышей. Однако уровень липидных пе�роксидов, площадь атероматозных полейв аорте, масса аорты, содержание холестеро�ла и триглицеридов в ее стенке существенноснижаются (на 27% и 50% соответственно)[49]. Некоторые авторы (их немного) вообщеотрицают ингибирование липидной перок�сидации in vivo при регулярном потребле�нии чая [50]. По данным [51], суточное пот�ребление чая обратно пропорциональноснижению гомоцистеина — существенногофактора сердечно�сосудистой патологии.Концентрат зеленого чая обладает и противо�воспалительным действием, в частности об�легчает тяжесть течения колита [52] и арт�рита [53]. Длительное потребление чая,особенно зеленого, способствует снижениюмассы тела (за счет уменьшенного усвое�ния белков, углеводов). Активность АО�ферментов в организме и содержаниевосстановленного глутатиона в печениувеличиваются [54]. Экстракты зеленогочая ингибируют на 73,6% окисление лино�левой кислоты, на 65–75% — концентра�цию супероксидных радикалов. 1 мгэкстракта (400 мг катехинов) инактивируетгидроксильные радикалы на 30–50%, а 4 мгэкстракта — на 100% [55, 56], выступаяв качестве синергиста кверцетина и другихфлавонолов.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

30

но эта часть введенной дозы оказывает ос�новное действие. Катехины в кишечникевсасываются (~35%) и поглощаются клетка�ми слизистой оболочки, где метаболизиру�ются с образованием глюкуронидов, сульфа�тов и 3�о�метилкатехинов. Дополнительноеметилирование и сульфурация осуществля�ются в печени. Глюкурониды и сульфаты 3�о�метилкатехина экскретируются с жел�чью [84].

В последние 15–20 лет выполнено мно�жество эпидемиологических исследований(«случай–контроль», рандомизированныхи проспективных), в том числе с использо�ванием двойного слепого метода, с целью ус�тановления связи между потреблением зеле�ного и черного чая и заболеваемостью(смертностью) от сердечно�сосудистых и он�кологических болезней. Полученные дан�ные противоречивы. В большинстве работпоказано, что систематическое ежедневноепотребление зеленого и oolong чая (2–5 ча�шек в день), подобно потреблению другихфлавоноидов (кверцетина) снижает частотуишемической болезни сердца, гипертони�ческой болезни, инфарктов и инсультов (исмертности от них) — за счет угнетенияокисления липидов низкой плотности(LDL), снижения концентрации холестеролав плазме, систолического артериальногодавления, агрегации тромбоцитов. Однаков нескольких тщательно выполненных ис�следованиях такой эффект был на грани дос�товерности либо вообще отсутствовал [5, 85].

Особенно пристальное внимание ученыхпривлекло изучение антимутагенного и про�тивоопухолевого действия чайных катехинов,прежде всего наиболее мощного из них —EGCG. В клеточных культурах антиканце�рогенный эффект чайных катехинов дости�гается в 100% случаев, как и антимутагенезв тесте Эймса. Катехины уменьшают транс�формацию клеток 3Т3, тормозят кожныйканцерогенез при местном применении хи�мических канцерогенов и УФ�радиации(особенно активна в этих экспериментахтанниновая кислота). EGCG и другие чай�ные катехины тормозят рост транспланти�руемых опухолей у крыс, прогрессию добро�качественных папиллом в плоскоклеточныйрак кожи. Катехины подавляют нитрозами�новый канцерогенез пищевода, легких, же�лудка у мышей [86]. Основные механизмыантиканцерогенеза EGCG — это уменьше�ние метаболической активации полицикли�ческих углеводородов, 3,4�бензпирена, нит�розаминов за счет АО�эффекта; усилениедетоксикации канцерогенов, уменьшение

биологическим последствиям. EGCG и дру�гие катехины ингибируют металлопротеи�назы матрикса клеток (ММР�2 и ММР�9),ангиогенные факторы роста и их рецепторы,препятствуя новообразованию сосудов [74].EGCG и EGC время� и дозозависимо ингиби�руют ДОФА�декарбоксилазу [75], орнитин�декарбоксилазу [76], 5�липоксигеназу [77],урокиназу [78] и множество других ферментов.С другой стороны, катехины чая стимулиру�ют активность UDP�глюкуронозилтрансфера�зы печени [79], участвующей в глюкурони�зации (конъюгации) катехинов. На долючая приходится 63% потребляемых с пищейфлавоноидов. В течение первых 3–5 минпосле заваривания в горячей воде 69–85%флавоноидов переходит в растворимое сос�тояние [80].

Связывание с белками слюны, пищии пищеварительных соков частично предох�раняет катехины чая от щелочной деструк�ции в кишечнике и способствует их всасываниюв плазму крови. После внутрижелудочноговведения крысам декофеинированногоэкстракта зеленого чая в плазме появляются~14% EGC и 31% EC, в то время какEGCG — менее 1% [34]. Основная часть это�го катехина удаляется с фекалиями, будучинеусвоенной. У добровольцев через 1,4–2,4 чпосле приема в 500 мл воды 1,5–3–4,5 г су�хого декофеинированного экстракта зелено�го чая в плазме обнаруживали 326 мкг/лEGCG, 550 мкг/л EGC и 190 мкг/л EC. Пери�оды полувыведения (Т1/2) составили5,0–5,5 ч для EGCG и 2,3–3,4 ч для EGCи EC. 90% катехинов из плазмы экскрети�руются с мочой в первые 8 ч (EGC и EC) припотреблении пяти чашек чая в день. В фека�лиях часть катехинов разлагается кишеч�ной микрофлорой. Поскольку слюна челове�ка содержит катехолэстеразу, EGCG ужев ротовой полости частично превращаетсяв EGC и начинает всасываться. Потреблениечая в малых количествах эффективнее, чемв больших [80]. EGCG и другие чайные кате�хины определяются в плазме человека мето�дом хемилюминесцентной жидкостной хро�матографии высокого разрешения [82].Галловая кислота из выпитого чая всасыва�ется весьма быстро (Т1/2 = 1,19 ± 0,07 ч) и эли�минируется (Т1/2 = 1,06 ± 0,06 ч) неизменен�ной (36,4 ± 4,5%) либо в виде метаболита4�о�метилгалловой кислоты (39,6 ± 5,1%) [83].

Установлено, что в плазме крови волон�теров присутствует всего ~1,68% потреблен�ных неизмененных катехинов — вследствиеих неполного всасывания, быстрой деструк�ции, метаболизма и секвестрации, но имен�

Огляди

31

тельного и урогенитального тракта на 60%и 32% соответственно [97]. В исследовании[98] показано, что потребление зеленого чаяснижает риск атрофических гастритов, ракажелудка, кожи наряду с ишемической бо�лезнью сердца и многими микробнымиинфекциями. Потребление черного чая жен�щинами существенно снизило у них заболе�ваемость раком сигмовидной и прямой ки�шок; у мужчин эффект отсутствовал [99].В то же время восьмилетнее исследованиес участием 25 000 жителей Японии не под�твердило связи между потреблением зелено�го чая и раком желудка [100]. К такому жевыводу пришли авторы работы [101]. Упот�ребление горячего чая (с температурой вы�ше 60 0С) увеличивает частоту рака пищево�да [102].

Вместе с тем, мнение специалистов еди�нодушно: чайный катехин EGCG — этоновое мощное противораковое средство при�родного происхождения, весьма перспек�тивное в качестве химиотерапевтическогопрепарата. В пользу такого вывода говорятмногочисленные выявленные механизмыдействия EGCG: нейтрализация активныхформ кислорода, в том числе пероксильныхрадикалов ROO′ [54]; ингибирование жела�тиназ (металлопротеиназ), орнитиндекар�боксилазы, урокиназы и других биохими�ческих маркеров инициации и промоцииопухолей [11, 92]; цитохромов 450 и другихферментов метаболической активации кан�церогенов [92]; клеточного цикла и индук�ции апоптоза опухолевых клеток [11, 92];синтеза ДНК и образования пероксильныхрадикалов в опухолевых клетках [66]; ангио�генеза и активности сосудистых факторовроста [11]; пролиферации опухолевых кле�ток и прогрессии опухоли путем связыванияEGCG с тирозинкиназой — рецептором эпи�дермального фактора роста [92]; активностиNO�синтазы и угнетения активации тран�скрипционного фактора NF�kB [20, 92]; фак�тора транскрипции АР�1, ответственного заэффект тумор�промоции [92, 98]; агрегациитромбоцитов и синтеза тромбоксанов с защи�той клеток эндотелия от повреждения [14].

Однако у человека противоопухолевыйэффект EGCG ниже ожидаемого из�за недос�таточной концентрации его в крови и плаз�ме после перорального поступления. Огра�ничивают эффективность этого катехинанизкая его всасываемость, интенсивный ме�таболизм (биотрансформация, конъюгация)с потерей активности. В итоге усваиваетсяменее 3,5% введенной дозы EGCG. Если ориен�тироваться на эффективность в отношении

связывания и алкилирования ДНК [67].Причем во всех случаях наиболее эффектив�ным был EGCG. В концентрациях менее100 мкМ/л он дозозависимо предотвращаетхромосомные повреждения, вызванные все�ми активными формами кислорода [20]. Ин�гибируя активность орнитиндекарбоксилазы,факторов роста, циклооксигеназы, теломе�разную и топоизомеразную активность, ак�тивируя Т�клетки�киллеры, чайные катехи�ны препятствуют росту опухолевого зачаткаи усиливают иммунную реакцию организма[87]. EGCG ингибирует адгезию опухолевыхклеток (линии 3LD рака легких мышей)к монослою клеток эндотелия легких быка[88]. Кофеин, присутствующий в чае, во всехисследованных случаях выступал как синер�гист катехинов, не действуя на нормальныеклетки [89]. Наконец, катехины и, главнымобразом, EGCG ингибируют ангиогенези пролиферацию клеток эндотелия — клю�чевую стадию роста и метастазирования ра�ковых опухолей [90], активность сосудис�тых факторов роста [11]. Существует,видимо, и общий механизм антипролифера�тивного (антиатероматозного и антиканце�рогенного) действия EGCG, состоящий в не�обратимом связывании его с фактором ростатромбоцитов. Это уменьшает связываниефактора роста с соответствующими рецепто�рами и угнетает митогенез [91]. EGCG такжеиндуцирует и усиливает апоптоз опухоле�вых клеток, ингибирует их инвазию [11],блокирует клеточный цикл опухолевыхклеток в G0|G1�фазе [92]. Полифенолы зеле�ного чая на 45% снижают частоту рака лег�кого у мышей, обусловленного табачнымдымом [11], угнетают рост рака предста�тельной железы путем остановки клеточно�го цикла в той же фазе, усиления апоптозаклеток [93]. Эти эффекты опосредованы че�рез ген WAF1/p21 [94]. Потребление зелено�го чая существенно (на 71–75%) тормозитрост колоректального рака [95]. Шестиме�сячное потребление зеленого чая обеспечи�вает регрессию лейкоплакий слизистой обо�лочки ротовой полости на 37,9% [96].

Обширные эпидемиологические исследо�вания на больших когортах людей в Японии,США, Китае, Финляндии, Канаде и другихстранах в большинстве случаев обнаружилиобратную корреляцию между количествомежедневно потребляемого чая (главным об�разом зеленого) и заболеваемостью ракомжелудка, поджелудочной железы, мочевоготракта, женских половых органов, лейке�мией. Употребление двух и более чашек чаяежедневно снижает частоту рака пищевари�

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

32

1. Haslam E. Plant polyphenols. Vegetable tan�nins revisited. — Cambridge: Univ. Press.Cambridge, 1989. — 230 p.

2. Запрометов М. Н. Фенольные соединения. —М.: Наука, 1993. — 272 с.

3. Барабой В. А. Биологическое действие рас�тительных фенольных соединений. — К:Наук. думка, 1976. — 230 с.

4. Rosinsky V., Michael Ch., Bors W. // Arch.Biochem. Biophys. — 2000. — V. 38. —P. 74–80.

5. Барабой В. А. Биоантиоксиданты. — К.:Книга плюс, 2006. — 513 с.

6. Trevisanato S. J., Kim Y./J. // Nutr. Revs. —2000. — V. 58. — P. 1–10.

7. Graham H. N. Green tea composition, con�sumption and polyphenol chemistry // Prev.Med. — 1992. — V. 21. — P. 334–350.

8. Lee K. W., Lee H. J. Antioxidant Activity ofBlack Tea vs. Green Tea // J. Nutr. — 2002. —V. 132. — P. 785–5.

9. Liu Y. L., Juan I./M., Chen Y. L. et al.Composition of polyphenols in fresh tealeaves and assosiating of their oxygen�radi�cal�absorbing capaciti with antiproliferativeactions in fibroblast cells // J. Agric. FoodChem. — 1996. — V. 44. — P. 1387–1394.

10. Vinson J. A., Dabbagh Y. A., Serry M. M.,Jang I. Plant Flavonoids, Especially TeaFlavonols, Are Powerfull AntioxidantsUsing an in Vitro Oxidation Model for HeartDisease // Ibid. — 1995. — V. 43. — P. 2800–2802.

11. Webb T. Green tea experiments in lab, clinicyield mixed results // J. Nat. Cancer Inst. —2000. — V. 92. — P. 1038–1059.

12. Price K. R., Rhodes M. J. C., Barnes K. A.Composition and Content of FlavonolGlycosides in Green Beans and Their Fateduring Processing // J. Agric. Food Chem. —1998. — V. 46. — P. 2517–2522.

13. Kuba J., Morimitsu Y. Cytotoxicity of greentea flavor compotens against two solid tumorcells // Ibid. — 1995. — V. 43. — P. 1626–1628.

14. Hertog M. G. L., Hollman P. C. H., Putte B.Content of potentially anticarcinogenicflavonoids of tea infusions, wine, and fruitjuices // Ibid. — 1993. — V. 41. —P. 1242–1246.

15. Jang C. S., Wang Z. Y. Tea and cancer // J. Nat.Cancer Inst. — 1993. — V. 85. — P. 1038–1049.

16. Bors W., Hellers W., Michel C., Saran M.Radical chemistry of flavonoid antioxidants// Antioxidants in therapy and preventivemedicine / Ed. B. Emerit. — N.Y.: PlenumPress, 1990. — V.1. — P. 165–170.

17. Bombardelli E., Morazzoni P. The flavo�noids: new perspectives in biological activi�

клеточных линий рака человека [103], то из�за плохой усвояемости катехина требуетсявыпивать в сутки 1,5 л зеленого чая. Однакопри этом неизбежны побочные эффекты засчет кофеина, который содержится в коли�честве 70 мг на чашку чая [104]. Токсич�ность самих чайных катехинов минималь�на, побочные эффекты чрезвычайно редки.Поскольку синтезировать EGCG пока неудается [11], ведутся синтез, поиск и испы�тания среди его аналогов [105].

Вышеперечисленные механизмы дейст�вия EGCG в большей или меньшей степениобусловлены АО�эффектом. Но в последнеевремя появляются данные несколько иногопорядка, которые, возможно, будут способ�ствовать прогрессу в этой чрезвычайно важ�ной области. Как уже отмечалось, EGCGобразует в организме конъюгаты — глюку�рониды, сульфаты и метилаты. Причем глю�курониды лишены АО�активности, тогдакак сульфаты и метилаты ее частично сохра�няют. Весьма возможно, что метилированиеследует рассматривать как звено механизмадействия EGCG, а не как факт инактивации[106]. Чайные катехины — акцепторы ме�тильных групп от S�аденозил�L�метионина(SAM), они ингибируют метаболизм метио�нина и гомоцистеина. Катализируемое кате�хол�о�метилтрансферазой (КОМТ) о�метили�рование катехинов чая ингибируетсяв зависимости от концентрации S�аденозил�L�гомоцистеином (деметилированным про�дуктом SAM). Противоопухолевое действиезеленого чая проявляется только при нали�чии хотя бы слабой активности КОМТ [107].Дальнейшие исследования внесут ясностьи в этот вопрос.

Таким образом, следует отметить, чтоуникально высокая концентрация и антиок�сидантная активность фенольных соедине�ний (катехинов) делает чай, его листья нетолько ценнейшим пищевым продуктомс высоким профилактическим действием,но и важным средством лечения наиболеераспространенных заболеваний человека,в патогенезе которых важную роль играетактивация свободнорадикального окисления,в частности липидной пероксидации. Воз�можность создания на основе катехинов чая(прежде всего EGCG) эффективных лечеб�ных препаратов ограничивают его низкаярастворимость и короткое время полужизнив организме. Предпринимаемые ныне по�пытки создать на основе катехинов чая бо�лее растворимые и долгоживущие производ�ные являются весьма перспективными.

ЛИТЕРАТУРА

Огляди

33

Clin. Biol. Res. — 1988. — V. 280. —P. 157–171.

30. Mackenzie G. G., Carrasquedo F., Delfino J. M.et al. Epicatechin, catechin and dimeric pro�cyanidins inhibit PMA�induced NF�B activa�tion at multiple steps in Jurkat T cells //FASEB J. — 2004. — V.18. — P.167–169.

31. Yen G./Ch., Chen H./J., Penn H. H.Antioxidant and prooxidant effects of vari�ous tea extracts // J. Agric. Food Chem. —1997. — V. 45. — P. 30–34.

32. Roedig/Penman A., Gordon M. H. Antioxi�dant properties of catechins and green teaextracts in model food emulsions // Ibid. —1997. — V. 45. — P. 4267–4270.

33. Cao G., Sofic E., Prior R. L. Antioxidantcapacity of tea and common vegetables //Ibid. — 1996. — V. 44. — P. 3426–3431.

34. Hayarawa F., Kimura T., Fujita M. et al.DNA cleavage reaction and linoleic acid per�oxidation induced by tea catechins in thepresence of cupric ion // Biochim. Biophys.Acta. — 1997. — V. 1336. — P. 123–131.

35. Yen G./Ch., Chen H./Y., Peng H./H. Antioxi�dant and pro�oxidant effects of various teaextracts // J. Agric. Food Chem. — 1997. —V. 45. — P. 30–34.

36. Guo Q., Zhao B., Li M. et al. Studies of pro�tective mechanisms of four components ofgreen tea polyphenols against lipid peroxida�tion in synaptosomes // Biochim. Biophys.Acta. — 1996. — V. 1304. — P. 210–222.

37. Wiseman S. A., Balentine D. A., Frei B.Antioxidants in tea // Crit. Rev. Food Sci. —1997. — V. 37. — P. 705–718.

38. Hurrell R. F., Reddy M., Cook J. D. Inhibitionof non�haem iron absorption in man bypolyphenol�containing beverages // Br. J.Nutr. — 1999. — V. 81. — P. 289–95.

39. Guo Q., Yhao B., Shen Sh., Hou J. ESP studyof the structure�antioxidant activity rela�tionship of tea catechins and their epimers// Biochim. Biophys. Acta. — 1999. —V. 1427. — P. 13–23.

40. Huang S./W., Frankel E. N. AntioxidantActivity of Tea Catechins in Different LipidSystems // J. Agric. Food Chem. — 1997. —V. 45. — P. 3033–3038.

41. Unten L., Koketsu M., Kim M. Antidiscolo�ring activity of green tea polyphenols onβ–carotene // Ibid. — 1997. — V. 45. — P.2009–2012.

42. Sawai Y., Sakaya K. NNMR analyticalapproach to clarify the antioxidative molec�ular mechanism of catechins using 1,1�daphenyl�2�picrylhydrazyl // Ibid. —1998. — V. 46. — P. 111–114.

43. Kondo K., Kurichara M., Mijata M. et al.Inhibition of LDL oxidation by cocoa // Arch.Biochem. Biophys. — 1999. — V. 362. — P. 79–86.

ties and therapeutics // Chim. Oggi. —1993. — V. 11. — P. 25–28.

18. Van Acker S. A. B. E.,Tromp M. N. J. L.,Haennen G. R. M. M. Flavonoids as scav�engers of nitric oxide radical // Biochem.Biophys. Res. Comm. — 1995. — V. 214. —P. 755–759.

19. Schroeder P., Zhang H., Klotz L. O. et al.(�)�Epicatechin inhibits nitration and dimer�ization of tyrosine in hydrophilic as well ashydrophobic environments // Ibid. — 2001. —V. 289. — P. 1334–1338.

20. Lin Y. L., Lin J./K. Epigallocatechin�3�gal�late blocks the induction of nitric oxide syn�thase by down�regulating lipopolysaccha�ride�induced activity of transcription factorNFkB // Molek. Pharmacol. — 1997. —V. 52. — P. 465–472.

21. Yokosawa T., Dong E., Nakagawa T., Kashi/wagi H. In vitro and in vivo studies of theradical�scavenging activity of tea // J.Agric. Food. Chem. — 1998. — V. 46. —P. 2143–2150.

22. Pannala A. S., Chan T. S., O’Brien P. J., Rice/Evans C. A. Flavonoid B�ring chemistry andantioxidant activity: fast reaction kinetics// Biochem. Biophys. Res. Comm. — 2001. —V. 282. — P. 1161–1168.

23. Chang W. C., Hsu F. L. Inhibition of plateletactivation and endothelial cell injury by fla�van�3�ol and saikosaponin compounds //Prostaglandins, Leukot. Essent. FattyAcids. — 1991. — V. 44. — P. 51–56.

24. Aldini G., Yeun K. J., Krinsky N.J., Russell R. M.(�)�Epigallocatechin�(3)�gallate spares plas�ma lipid�soluble antioxidants, recycled vita�min E and prevents oxidative damage of bothaqueous and lipid compartments in plasma// FASEB J. — 2002. — V. 16. —Abstr. 1. — P. 2066.

25. Hageman A. E., Dean R. T., Davies M. J.Radical chemistry of epigallocatechin gal�late and and its relevance to protein damage// Arch. Biochem. Biophys. — 2003. —V. 414. — P. 115–120.

26. Hatta A., Frei B. Oxidative modification andantioxidant protection of human low densitylipoprotein at high and low oxygen partialpressures // J. Lipid Res. — 1995. — V. 36. —P. 2385–2393.

27. Luo M., Kannar K., Waldquist M. C., O’Bri/en R. C. Inhibition of LDL oxidation by greentea extract // Lancet. — 1997. — V. 349. —P. 3360–361.

28. Negre/Salvagre A., Salvagre R. Quercetinprevents the cytotoxicity of oxidized LDL onlymphoid cell lines // Free Radic. Biol. Med. —1992. — V. 12. — P. 101–106.

29. Berg P. A., Daniel P. T. Effects of flavonoidcompounds on the immune response // Piod.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

34

health and disease / Ed. C.A. Rice�Evans, L.Packer. — N.Y.: Marcel Dekker, 1998. —P. 469–481.

57. Sawsan I. K., Elias A. H. B., Zepure M. C. Teaextract inhibits intestinal absorbtion of theglucose and sodium in rat // Compt. Rend.Physiol. — 1994. — 108 c. — P. 359–365.

58. Schaefer P., Klotz L./O., Buchczyk D. P. et al.Epicatechin selectively prevents nitrationbut not oxidation reactions of peroxynitrite// Biochem. Biophys. Res. Comm. — 2001. —V. 285. — P. 782–787.

59. Wu L./Y., Juan Ch./Ch., Hwang L. S. et al.Effect of green tea supplementation oninsulin sensitivity in Sprague�Dawley rats //Eur. J. Nutr. — 2004. — V. 43. — P. 116–124.

60. Nie G., Jin Ch., Cao Y. et al. Distinct effectsof tea catechins on 6�hydroxydopamine indu�ced apoptosis in PC12 cells // Arch. Biochem.Biophys. — 2002. — V. 397. — P. 84–90.

61. He Y., Shahidi F. Antioxidant activity ofgreen tea and its catechins in a fish meatmodel system // J. Agric. Food Chem. —1997. — V. 45. — P. 4262–4266.

62. Gaidos A., Gaidos/Toro K. M., Horn R. Actionde la (+)�katechine sur le tissue hepatique derat blank soumis l’ethanol // Compt. Rend.Soc. Biol. — 1970 (1971). — V. 164. —P. 1967–1970.

63. He P., Noda Y., Sugiyama K. Green tea sup�presses lipopolysaccharide�induced liverinjury in d�galactosamine�sensitized rats //J. Nutr. — 2001. — V. 131. — P. 1560–1567.

64. Opplinger P. Das neue Buch vom grunenNee. — Augsburg: Midena, 1999. — 125 p.

65. Yang Ch. S., Cheng J. Y., Yang G./Y., Chhabra S. K.Tea and tea polyphenols in cancer prevention// J. Nutr. — 2000. — V. 130. — P. 472–478.

66. Lee K. W., Lee H. J. Antioxidant Activity ofBlack Tea vs. Green Tea // Ibid. — 2002. —V. 132. — P. 785–795.

67. Dreosti I. E. Bioactive ingredients: antioxi�dants and polyphenols in tea // Nutr. Revs. —1996. — V. 54. — P. 551–558.

68. Sarkar A., Bhaduri A. Black tea is a powerfulchemopreventor of reactive oxygen andnitrogen species: comparison with its indi�vidual catechin constituents and green tea //Biochem. Biophys. Res. Comm. — 2001. —V. 284. — P. 173–178.

69. Lu J., Ho Ch./T., Ghai B., Chen K. Y.Differential effects of teaflavin monogal�lates on cell growth, apoptosis, and cox�geneexpression in cancerous and normal cells //Cancer Res. — 2000. — V. 60. — P. 6465–6471.

70. Liao J., Yang G./Y., Li C. Growth inhibition,apoptosis induction,and H2O2 production inhuman bronchial cancer cell lines by blackteaflavins and green tea catechins // PAACancer Res. — 1999. — V. 40. — P. 513–553.

44. Chen Z. Y., Zhu Q. Y., Wong Y. F. et al.Stabilizing effect of ascorbic acid on greentea catechins // J. Agric. Food Chem. —1998. — V. 46. — P. 2512–2516.

45. Zhu Q. Y., Zhang A., Tsang D. et al. Stabilityof green tea catechins // Ibid. — 1997. —V. 45. — P. 4624–4628.

46. Loest H. B., Noh S. K., Koo S. J. Green teaextract inhibits the lymphatic absorption ofcholesterol and {alpha}�tocopherol inovariectomized rats // J. Nutr. — 2002. —V. 132. — P. 1282–1288.

47. Townsend P. A., Scarabelli T. M., Pasini E. etal. Epigallocatechin�3�gallate inhibitsSTAT�1 activation and protects cardiacmyocytes from ischemia reperfusion�induced apoptosis // FASEB J. — 2004. —V. 18. — P. 1621–1623.

48. Chisaka T., Matsuda H., Kabomuta Y.,Mohizuki M. The effect of crude drugs onexperimental hypocholesteremia; mode ofaction of (�)�epigallocatechin gallate in tealeaves // Chem. Pharm. Bull. — 1988. —V. 36. — P. 227–233.

49. Miura Y., Chiba T., Tomita Y. et al. Tea cate�chins prevent the development of atheroscle�rosis in apoprotein E�deficient mice // J.Nutr. — 2001. — V. 131. — P. 27–32.

50. Hodgson J. M., Groft K. D., Mori T. A.Regular ingestion of tea does not inhibit ivolipid peroxidation in humans // Ibid. —2002. — V. 132. — P. 55–58.

51. Nygaard O. S., Refsum H., Uelaud P. M.Association of serum lipids with cofee, tea,and egg consumption in free living subjects// Am. J. Clin. Nutr. — 1997. — V. 65. —P. 136–143.

52. Varilek G. W., Yang F., Lee E. J., Lee J. P.Green tea polyphenol extract attenuatesinflammation in interleukin�2�deficientmice, a model of autoimmunity // J. Nutr. —2001. — V. 131. — P. 2034–2039.

53. Adcock C., Collin P., Duttle D. J. Catechinsfrom green tea inhibit bovine and humancartilage proteoglycan and type II collagendegradation in vivo // Ibid. — 2002. —V. 132. — P. 341–346.

54. Lin Y./L., Cheng Ch./Y., Lin Y./P. et al. Compo�sition of polyphenols in green tea leaves andassociations of their oxygen�radical�absorb�ing capacity with antiproliferative action infibroblast cells // J. Agric. Food Chem. —1998. — V. 46. — P. 1893–1899.

55. Yen G./Ch., Chen H./Y. Antioxidant activityof various tea extracts in relation to their anti�mutagenicity // Ibid. — 1995. — V. 43. —P. 27–32.

56. Samman S., Wall P. M. L., Cook N. C.Flavonoids and coronary heart disease:Dietary perspectives // Flavoonoids in

Огляди

35

humans // J. Nutr. — 2001. — V. 131. —P. 1207–1210.

84. Donovan J. L., Crespy V., Manach C. et al.Catechin Is Metabolized by Both the SmallIntestine and Liver of Rats // Ibid. — 2001. —V. 131. — P. 1753–1757.

85. Yang C. S., Landau J. M. Effects of TeaConsumption on Nutrition and Health //Ibid. — 2000. — V. 130. — P. 2409–2412.

86. Барабой В. А. Фенольные соединения, кан�церогенез и опухолевый рост // Актуаль�ные проблемы биологии и медицины. —1993. — Т. 1. — С. 107–120.

87. Keloff G. J., Crowell J. A., Steele V. T. et al.Progress in Cancer Chemoprevention:Development of Diet�Derived Chemopreven�tive Agents // J. Nutr. — 2000. — V. 130. —P.467–471.

88. Isemura M., Suzuki Y., Satoh K. et al. Effectsof catechins on the mouse lung carcinomacell adhesion to the endothelial cells // CellBiol. Int. — 1993. — V. 7. — P. 559–564.

89. Berger S. J., Gupta S., Belfi Ch. A. et al. Greentea constituent (�)�epigallocatechin�3�gallateinhibits topoisomerase I activity in humancolon carcinoma cells // Biochem. Biophys.Res. Commun. — 2001. — V. 288. —P. 101–105.

90. Singh A. K., Seth P., Antony P. et al. Greentea constituents epigallocatechin�3�gallateinhibits angiogenic differentiation ofhuman endothelial cells // Arch. Biochem.Biophys. — 2002. — V. 401. — P. 29–37.

91. Weber A./A., Neuhaus Th., Skah A. et al.Mechanisms of the inhibitiory effects of theepigallocatechin�3�gallate on platelet�derived growth factor –BB�induced cell sig�naling and mitogenesis // FASEB J. —2004. — V. 18. — P. 128–130.

92. Ahmad N., Mukhtar H. Green tea polyphe�nols and cancer: biologic mechanisms andpractical implications // Nutr. Revs. —1999. — V. 57. — P.78–83.

93. Gupta S., Hussain T., Mukhtar H. MolekulareLeitungsbahn bei durch (�)�Epigallocate�chin�3�Gallat�induziertem ellzyklusstill�stand und Apoptose der rostatakar�zinomzellen bei Menschen // Arch. Biochem.Biophys. — 2003. — V. 410. — P. 177–185.

94. Sakanoto K., Ahmad N., Gupta S. Synergy ofblack and green tea polyphenols with genis�tein in inhibitory human prostate cancer cellgrowth // PAA Cancer Res. — 1999. —V. 40. — P. 531–599.

95. Weyant M. J., Carothers A. M., DannenbergA. J., Bertagnolli M. M. (+)�Catechin inhibitsintestinal tumor formation and suppressesfocal adhesion kinase (FAK) activation inthe Min/+ mouse // Cancer Res. — 2001. —V. 61. — P.118–125.

71. Джемухадзе К. М., Бузун Т. А., МилешкоЛ. Ф., Бокучава В. К. Биохимические осно�вы повышения питательных и пищевкусо�вых свойств чая // Тез. научн. сообщ. IVВсеcоюз. биохим. съезда. — М.: Наука. —1976. — Т. 1. — С. 138.

72. Jansman A. J. M. Tannins in feedstuffs forsimple stomached animals // Nutr. Res.Revs. — 1993. — V. 6. — P. 209–236.

73. Han Chi, Xu Yong. The effect of Chinese teaon occurrence of esophageal tumor inducedby N�nitrosomethylbenzylamine in rats // Clin.J. Prev. Med. — 1989. — V. 23. — P. 67–70.

74. Tosetti F., Ferrari N., Flora S., Albini A. An�gioprevention: angiogenesis is a commonand key target for cancer chemopreventiveagents // FASEB J. —2002. — V. 16. — P. 2–14.

75. Bertoldi M., Gonsalvi M., Voltattorni C. B.Green tea polyphenols:. novel irreversibleinhibitors of dopa decarboxylase //Biochem. Biophys. Res. Commun. —2001. — V. 284. — P. 90–93.

76. Agarwal R., Katiyar S. K., Zaidi S. J. A.,Mukhtar H. Inhibition offskin tumor pro�moter�caused induction of epidermalornithine decfrboxylase in SENCAR mice bypolyphenolic fraction isolated from greentea // Cancer Res. — 1992. — V. 52. —P. 3582–3588.

77. Schewe T., Kuhn H., Sies H. Flavonoids ofcocoa inhibit reombinant human 5�lipoxyge�nase // J. Nutr. — 2002. — V. 132. —P. 1825–1829.

78. Cao Y., Cao R. Angiogenesis inhibited bydrinking tea // Nature. — 1999. — V. 398. —N6726 — P. 381.

79. Bu/Abbas A., Clifford M. N., Ioannides C.,Walker R. Stimulation of rat hepatic UDP�glucuronosyl transferase activity followingtreatment with green tea // Food Chem.Toxicol. — 1995. — V. 33. — P. 27–30.

80. Keli S. O., Hertog M. G. L., Feskens E. J. M.,Kroumhout D. Dietary flavonoids, antioxi�dant vitamins, and incidence of stroke. TheZutphen Study // Arch. Intern. Med. —1996. — V. 156. — P. 637–642.

81. Yang C. S., Chen L., Lee M./Y. et al. Blood andurine levels of tea catechins after ingestionof different amounts of green tea by humanvolonters // Cancer Epidemiol. Biomark.Prev. — 1998. — V. 7. — P. 351–354.

82. Nakagawa K., Miyazawa T. Chemilumines�cence�high performance liquid chromato�graphic determination of tea catechin, (�)�epigallocatechin�3�gallate, at picomole le�vels in rat and human plasma // Anal.Biochem. — 1997. — V. 48. — P. 41–49.

83. Shahrzad S., Aoyagi K., Winter A. et al.Pharmacokinetics of gallic acid and its rela�tive bioavailability from tea in healthy

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

36

КАТЕХІНИ ЧАЙНОЇ РОСЛИНИ: СТРУКТУРА, АКТИВНІСТЬ,

ЗАСТОСУВАННЯ

В. А. Барабой

E/mail:rguiberman@mail.ru

Розглянуто технологію одержання різнихвидів чаю та механізми біологічної дії най�більш активних його компонентів — катехінів.Зроблено спробу пояснити зазначені механіз�ми виходячи з антиоксидантних властивостейцих фізіологічно активних сполук, що зумов�лює наявність у них антимутагенних і проти�пухлинних ефектів. Особливу увагу приділенохімічним та біологічним властивостям найак�тивнішого з катехінів — EGCG.

Ключові слова: чай, катехіни, антиоксидантна ак�тивність.

CATECHINS OF TEA: STRUCTURE, ACTIVITY, APPLICATION

V. A. Baraboy

E/mail:rguiberman@mail.ru

In a review d technology of production of dif�ferent kinds of tea and also the mechanisms ofbiological action of his the most active compo�nents — catechins are considered. An attempt toexplain these mechanisms on the basis of antiox�idant properties of these physiological activesubstances is undertaken, which are cause thepresence of them antimutagen and antineoplas�tic effects. In detail chemical and biologicalproperties of the most active from catechins —EGCG are considered.

Key words: tea, catechins, antioxidant activity.

96. Li N., Sun H., Han C., Chen Y. The chemo�preventive effects of tea on human oral pre�cancerous mucosa lesions // Proc. Soc. Exp.Biol. Med. — 1999. — V. 220. — P. 218–224.

97. Zheng W., Doyle T. J., Kushi L. H. et al. Teaconsumption and cancer incidence in aprospective cohort study of postmenopausalwomen // Am. J. Epidemiol. — 1996. —V. 144. — P. 175–181.

98. Sano T., Sasako M. Green tea and gastriccancer // N. Engl. J. Med. — 2001. —V. 344. — P. 675–676.

99. Ilyasova D., Arab L., Martinchik A. Black teaconsumption reduces risk of rectal canceramong women in Moskow // FASEB J. —2001. — V. 15. — Adstr. 1. — A401.

100. Tsubono Y., Nishino Y., Komatsu Sh. Greentea and the risk of gastric cancer in Japan// N. Engl. J. Med. — 2001. — V. 344. —P. 632–643.

101. Acts J. C. W., Hollman P. C. H., Bas Buenode Mesqita H. Dietary catechins aqndepithelial cancer incidence // Int. J.Cancer. — 2001. — V. 92. — P. 298–302.

102. Dong Z., Ma W./Y., Huang C. Inhibition oftumor�promoter induced activator protein1 activation and cell transformation by teapolyphenols, (–)�epigallocatechin gallateand theaflavins // Cancer Res. — 1997. —V. 57. — P. 4414–4419.

103. Yang Ch. S., Chung J. Y., Yang G. Y. Tea andtea polyphenols in cancer prevention // J.Nutr. — 2000. — 130. — P. 472–478.

104. Chen L., Lee M. Y., Yang C. S. Absorption,distribution, elimination of tea polyphe�nols in rats // Drug Metab. Dis. — 1997. —V. 25. — P. 1045–1050.

105. Zaweri N. T., Chao W./R. Synthetic analogsof green tea catechins and their in vitro andin vivo growth inhibition activity //Clin.Cancer Res. — 1999. — V. 5. —P. 3844–3868.

106. Moyers S. B., Kumar N. B. Green teapolyphenols and cancer chemoprevention:multiple mechanisms and endpoints forphase II trials // Nutr. Revs. — 2004. —V. 62. — P. 204–211.

107. Wu A. H., Tseng C. C., van den Berg D., YuM. C. Tea intake, COMT genotype, andbreast cancer in Asian�American women //Cancer Research. — 2003. — V. 63. —P. 7526–7529.

37

у розвиткові автоімунних захворювань [5].Визначення вмісту цих авто�АТ у сироватцікрові людей було використано для діагнос�тики різних автоімунних захворювань, а та�кож для прогнозування розвитку хвороби [6].

Масштаби пошуку молекулярних марке�рів автоімунних порушень у людини значнорозширились після відкриття каталітичноактивних авто�АТ, здатних каталізуватигідроліз авто�АГ [7]. Каталітично активніантитіла, які називають натуральними аб�зимами, можна класифікувати за їхньоюсубстратною специфічністю на низькоспе�цифічні та високоспецифічні. Низькоспеци�фічні абзими, що здатні гідролізувати ДНК,РНК та синтетичні олігонуклеотиди, буловиявлено у сироватці крові хворих на авто�імунні та деякі інші захворювання, а такожу молоці й молозиві клінічно здоровихжінок [8]. Вони отримали назву ДНК�зимів.Окрім каталітичної активності, характерноюознакою ДНК�зимів є висока цитотоксична

Імунна система ссавців не тільки забез�печує захист організму від впливу шкідли�вих чинників довкілля, але й задіяна у регу�ляції біологічних функцій, які визначаютьйого гомеостаз [1]. У підтриманні гомеоста�зу важливу роль відіграють антитіла (АТ),спрямовані як до чужорідних антигенів, такі до антигенів власного організму (авто�АГ).Антитіла, які взаємодіють з авто�АГ, маютьназву автологічних антитіл (авто�АТ) [1,2].Авто�АТ виявлено як в організмі клінічноздорових людей, так і в осіб з автоімуннимизахворюваннями [3]. У клінічно здоровихлюдей авто�АТ представлені, головним чи�ном, низькоафінними поліспецифічнимиімуноглобулінами класу М або високоспеци�фічними низькоафінними імуноглобуліна�ми класу G (антиідіотипні АТ), що залученідо регуляції імунної відповіді [3, 4]. У па�цієнтів з автоімунними захворюваннями ви�явлено високоспецифічні авто�АТ класуIgG, які можуть безпосередньо брати участь

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНІ СТАТТІУДК 577.112.083:577.112.4:577.151.05

ІМУНОГЛОБУЛІНИ МОЛОЗИВА ІМУНОГЛОБУЛІНИ МОЛОЗИВА ЯК МОЛЕКУЛЯРНІ МАРКЕРИ ЯК МОЛЕКУЛЯРНІ МАРКЕРИ ДОКЛІНІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ ДОКЛІНІЧНОЇ ДІАГНОСТИКИ

АВТОІМУННИХ ПОРУШЕНЬ У ПОРОДІЛЬАВТОІМУННИХ ПОРУШЕНЬ У ПОРОДІЛЬ

Ю. Я. Кіт1

М. О. Старикович1

Р. О. Білий1 1Інститут біології клітини НАН України, ЛьвівН. Р. Скорохід1 2Львівський обласний перинатальний центрЛ. Б. Янів2

Р. С. Стойка 1 E/mail: kit@сellbiol.lviv.ua

З метою виявлення нових молекулярних маркерів автоімунних порушень у породіль проаналізовано анти�генну специфічність, каталітичну і цитотоксичну активність імуноглобулінів, одержаних із молозива 25 клі�нічно здорових породіль осадженням цих білків 50%�м сульфатом амонію. Встановлено, що препарати імуно�глобулінів суттєво відрізняються між собою за цитотоксичною активністю щодо лейкемічних Т�клітин лініїJurkat, здатністю гідролізувати плазмідну ДНК та гістон Н1, а також за вмістом авто�АТ до дволанцюгової ДНКта гістонів. Зроблено висновок про те, що функціональні властивості імуноглобулінів молозива залежать відіндивідуальних особливостей стану гуморального імунітету у породіль. Ці властивості можуть бути використанідля комплексного визначення пов’язаних із вагітністю та пологами ранніх автоімунних порушень у жінок.

Ключові слова: молозиво здорових породіль, імуноглобуліни, цитотоксична активність, каталітична активність, рівень авто�АТ.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

38

Наведені вище аргументи свідчать проте, що функціональна активність імуногло�булінів молозива може вказувати на зміниу гуморальному імунітеті породіль. Ці влас�тивості можуть бути використані для комп�лексного визначення пов’язаних із вагітністюта пологами ранніх автоімунних порушеньу жінок. У роботі наведено результати ана�лізу антигенної специфічності, цитотоксич�ної та каталітичної активності препаратівімуноглобулінів, одержаних із молозива25 клінічно здорових породіль.

Матеріали і методи

Препарати Ig із молозива породільЗразки молозива (2 мл) отримували

у Львівському обласному пренатальномуцентрі МОЗ України. Для виділення антитіл(АТ) молозиво центрифугували протягом20 хв при 2000 g, після чого відділяли ліпід�ну та клітинну фракції. Препарати Ig одер�жали триразовим переосадженням білківмолозива 50%�м сульфатом амонію [18].Для цього до 0,5 мл молозива додавали крап�лями 0,5 мл насиченого розчину сульфатуамонію і осаджували Ig центрифугуваннямпри 2 000 g упродовж 5 хв. Осад розчинялив об’ємі 0,5 мл дистильованою водою і повтор�но осаджували Ig 50%�м сульфатом амонію.Після триразового переосадження фракціїIg протягом 18 год діалізували проти забу�ференого фосфатного розчину (ЗФР) (0,01 MNa2HPO4, 0,01 M NaH2PO4, 0,145 M NaCl,pH 7,4 ). Концентрацію білка у препаратахвизначали за методом Лоурі [19]. Білковийсклад отриманих препаратів аналізувалиелектрофорезом у градієнті концентраціїПААГ (6–17,5%) у присутності 0,1% SDS [20].Препарати Ig зберігали при –20 0С у присут�ності 10%�го гліцеролу (Sigma, США).

Вплив препаратів Ig на ріст клітин у культурі

У роботі використовували лейкемічні Т�лімфоцити людської лінії Jurkat, одержа�ні з колекції Інституту експериментальноїпатології, онкології та радіології ім. Р. Є. Ка�вецького НАН України (Київ). Клітиникультивували у флаконах Карреля у середо�вищі RPMI�1640 (Sigma, США) у присут�ності 10%�ї ембріональної сироватки(Sigma, США) та 50 мкг/мл гентаміцину(Sigma, США) до досягнення клітинами суб�конфлюентного стану. Для досліду висівали6,5·105 клітин у 96�лункові планшети і після2 год інкубації у лунки додавали Ig у кінце�вій концентрації 0,7 мг/мл та інкубували

активність їх щодо пухлинних і трансфор�мованих клітин та активованих лімфоцитівлюдини [9, 10]. Оскільки у сироватці кровіклінічно здорових людей ДНК�зими не ви�явлено, їхня присутність в організмі людейсвідчить про порушення, що можуть приз�водити до розвитку автоімунних захворю�вань [8, 11].

Прикладом високоспецифічних каталі�тичних авто�АТ є абзими із протеолітичноюактивністю, що отримали назву протабзимів[8]. Каталітична активність протабзимів,виявлених у сироватці крові людей з авто�імунними захворюваннями, спрямованапереважно на гідроліз авто�АГ, задіяниху розвитку того чи іншого захворювання.Наприклад, у хворих на гострий алергічнийтироїдит антитиреоглобулінові авто�АТздатні гідролізувати тиреоглобулін. У хво�рих на алергічний міокардит виявлено авто�АТ, які гідролізують міозин, а у хворих нарозсіяний склероз — авто�АТ з гідролізую�чою активністю щодо основного білка мієлі�ну [12]. Вузька субстратна специфічністьробить протабзими перспективними моле�кулярними маркерами у прогнозуванні роз�витку автоімунних захворювань [8].

Відомо, що зміни в гормональному таімунному статусі жінок, пов’язані з вагітніс�тю, пологами та лактацією, можуть призво�дити до розвитку автоімунних захворювань[13]. Унаслідок порушення автоімунної то�лерантності в організмі жінки з’являютьсявисокоспецифічі авто�АТ та абзими, визна�чення вмісту яких може бути корисним дляпрогнозування виникнення автоімуннихзахворювань.

Оскільки лактація є частиною репродук�тивного циклу жінки, функціональна ак�тивність імуноглобулінів молозива та молокаможе відображати індивідуальні особли�вості стану її гуморального імунітету. У мо�лозиві людини присутні усі класи імуногло�булінів [14]. Серед імуноглобулінів молокавиявлено високоафінні та поліреактивні ав�то�А, а також абзими з різною каталітичноюактивністю [15, 16, 17]. Подібно до авто�АТта абзимів сироватки крові вони можуть функ�ціонувати як фактори імунного захисту абояк патогенні чинники. Окрім того, функціо�нальна активність імуноглобулінів може ре�алізуватися через взаємодію їх із білкамимолока, здатними впливати на проліфера�цію, диференціацію та апоптоз клітин різно�го типу [14]. Утворення комплексів із цимибілками може змінювати функціональну ак�тивність імуноглобулінів та активність са�мих комплексоутворювальних білків.

Експериментальні статті

39

Протеазну активність препаратів Ig виз�начали згідно [22]. Для цього 5 мкг Ig інку�бували із 5 мкг гістону Н1 протягом 2 годпри 37 0С у 10 мМ трис�HCl, pH 8,0. Білкирозділяли електрофорезом у 12% ПААГза присутності 0,1% SDS, гелі зафарбовува�ли Coomassie R�250.

Імуноцитохімічний аналіз препаратівIg проводили, як описано [23], із деякимимодифікаціями. Клітини лінії Jurkat попе�редньо промивали ЗФР, щоб видалити куль�туральне середовище, готували цитологічнімазки, фіксували їх метанолом протягом90 с і висушували при кімнатній темпера�турі. Після цього мазки інкубували із препа�ратами Ig (розведення 1:75) при 4 0C упро�довж ночі. Після інкубації мазки промивалиЗФР двічі по 10 хв та інкубували з міченимиFITC IgG кози, специфічними до Н�лан�цюгів IgA людини (Sigma, США) у розве�денні 1 : 50 протягом 1,5 год при 37 0С. Мазкипромивали ЗФР, фарбували флуоресцент�ним барвником DAPI (1 мкг/мл) протягом1 хв, знову промивали ЗФР, дистильованоюводою і фотографували під мікроскопомМікмед К�2�12 (ЛОМО, РФ) при відповіднихдовжинах хвилі збудження та емісії для ви�явлення флуоресценції.

Результати та обговорення

Препарати імуноглобулінів (Ig) одержу�вали із молозива 25 клінічно здорових по�роділь триразовим переосадженням білківмолозива за умов 50%�го насичення сульфа�ту амонію. Концентрація білка у цих препа�ратах коливалася від 1 мг/мл до 16 мг/млі в середньому становила 2–3 мг/мл. Ре�зультати електрофорезу за денатурувальнихумов показали, що досліджувані препаратиIg складаються переважно з поліпептидів ізмол. масою 80, 62, та 25 кДа (рис. 1), яківідповідають важким (Н) та легким (L) лан�цюгам імуноглобулінів класу IgM та sIgA[14]. У складі препаратів Ig виявлено такожінші білки з мол. масою 50, 30 та 14 кДа.Є підстави припустити, що цими білкамиє важкі ланцюги IgG, бета�казеїн та лакто�альбумін. Останні два білки містяться у знач�ній кількості у молоці людини і, очевидно,виділяються спільно з імуноглобулінами підчас осадження білків молозива сульфатомамонію. На відміну від сироватки крові,у молозиві та молоці людини відзначено ви�сокий вміст димерної форми секреторногоIgA (sIgA) [14, 17]. У свою чергу, sIgA є над�молекулярним комплексом, який складає�ться із Н� і L�ланцюгів IgA (62, 25 кДа),

упродовж 24 год. Для визначення життє�здатності клітин використовували тест ізфарбуванням мертвих клітин 0,1%�м вод�ним розчином трипанового синього.

Вміст АТ зі спорідненістю до ДНКта гістонів

Для визначення вмісту антитіл зі спорід�неністю до дволанцюгової ДНК (анти�дДНКАТ) та гістонів (антигістонові АТ) у препара�тах Ig застосовували метод імуноферментно�го аналізу (ІФА). Антигенами слугувалиДНК тимуса теляти (Sigma, США) та препа�рат тотальних гістонів із тимуса теляти(люб’язно наданий д.б.н. М. Д. Луциком).На полістироловому 96�лунковому планше�ті сорбували ДНК (10 мкг/мл) або гістони(2 мкг/мл) упродовж 16 год при 4 0С. Препа�рати Ig розводили у співвідношенні 1:40у буфері А (1%�й бичачий сироватковийальбумін у ЗФР ) і в об’ємі 200 мкл вносилиу лунки із сорбованими антигенами. Інку�бацію проводили протягом 2 год при 37 0С,після чого лунки тричі промивали буферомА. У лунки вносили кон’югат білка А з пе�роксидазою хрону (Sigma, США) у розведен�ні 1 : 500, інкубували 1 год при 37 0С, післячого промивали буфером А. Як субстрат пе�роксидазної реакції використовували діаміно�бензидин. Реакцію зупиняли 1 М ортофосфор�ною кислотою. Оптичну густину розчинувизначали при довжині хвилі 492 нм наспектрофотометрі NanoDrop ND 1000 (NanoDropTechnologies, США). Рівень авто�АТ у лун�ках вираховували за величиною оптичногопоглинання розчину забарвлених продуктівпероксидазної реакції. Визначення прово�дили у трьох паралельних дослідах. Статис�тичне опрацювання результатів здійснюва�ли за допомогою комп’ютерної програмиOriginPro 7.0.

Каталітична активність препаратів IgКаталітичну активність препаратів Ig

досліджували за їхньою здатністю гідролі�зувати плазмідну ДНК та гістон Н1.

Топоізомеразну активність препаратів Igвизначали, як описано [21]. Як субстрат ви�користовували плазміду pBR 322 (Fermen�tas, Литва). Для аналізу аліквоти Ig у кіль�кості 5 мкг інкубували із 3 мкг плазмідноїДНК у 20 мМ трис�HCl, 75 мМ NaCl, 10 мМMgCl2 упродовж 1 год при 37 0С. Продуктиреакції розділяли електрофорезом у 1%�мугелі агарози у трис�борат�ЕДТА буфері, рН8,6, у присутності 0,001%�го етидію бро�міду. Гель фотографували при ультрафіоле�товому освітленні.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

40

[24]. Головна відмінність полягала в тому,що Ig клінічно здорових людей мали вищуцитотоксичну активність щодо Т�лейкеміч�них клітин людини порівняно з Ig хворих нарозсіяний склероз. При цьому слід зазначи�ти, що деякі з препаратів Ig, виділених із си�роватки крові хворих переважно із важкоюформою, були здатні стимулювати проліфе�рацію лейкемічних клітин. На основі отри�маних результатів було зроблено висновокпро те, що зміни цитотоксичної активностіIg сироватки крові щодо лейкемічних клі�тин можуть бути характерною ознакою ав�тоімунних порушень у хворих на розсіянийсклероз [24].

Беручи до уваги ці результати, було до�сліджено, як впливають Ig молозива поро�діль на ріст людських лейкемічних Т�клітинлінії Jurkat. Цитотоксичний ефект Ig визна�чали за співвідношенням кількості живихі мертвих клітин у культурі порівняноз контролем. Встановлено, що більшістьпрепаратів Ig індукують загибель лейкеміч�них клітин in vitro (рис. 2). При цьому 11 пре�паратів Ig із 25 досліджених пригнічувалиріст клітин більш ніж на 80% від контроль�ного рівня. Два препарати характеризува�лися цитотоксичним ефектом на нижчомурівні (50–60%), ніж у попередніх 11 препа�ратів, у восьми препаратів він був незначним(20–25%), а в одного препарату — у межахконтролю. Як видно із рис. 2, препарати№19 та №25, на відміну від інших препаратів,характеризувалися здатністю стимулювалипроліферацію лейкемічних Т�лімфоцитівлінії Jurkat. Отже, результати проведенихнами досліджень свідчать про те, що препа�рати Ig, одержані з молозива породіль, сут�тєво відрізняються між собою щодо дії налейкемічні Т�клітини лінії Jurkat. Оскількинизький рівень або відсутність цитотоксич�ної активності Ig є характерною ознакоюхворих на розсіяний склероз, можна при�пустити, що стан гуморального імунітетупороділь, у яких Ig молозива мають подібнівластивості, зазнав певних автоімунних по�рушень.

Характерною ознакою автоімунних по�рушень в організмі людини є поява високо�специфічних авто�АТ. Відомо, що в патогенезібагатьох автоімунних захворювань значнуроль відіграють авто�АТ зі спорідненістю доядерних антигенів — дволанцюгової ДНК(дДНК) та гістонів [6]. Ми дослідили препа�рати Ig на присутність анти�дДНК АТ та ан�тигістонових АТ за допомогою ІФА. Якпозитивний контроль застосовували препа�рати IgG сироватки крові хворих на

секреторного компонента (80 кДа) та J�лан�цюгів (14 кДа). Виявлення цих поліпептидівсвідчить про те, що препарати Ig, одержанііз молозива породіль осадженням сульфа�том амонію, збагачені секреторним IgA.

Наступним етапом роботи було дослі�дження препаратів Ig на цитотоксичну та ка�талітичну активність, а також на присут�ність у них авто�АТ зі спорідненістю додволанцюгової ДНК і гістонів. Раніше намибуло встановлено, що Ig, виділені із сироват�ки крові клінічно здорових людей та хворихна розсіяний склероз, різняться за їхнімвпливом на ріст лейкемічних клітин in vitro

Рис. 1. Аналіз препаратів Ig електрофорезому градієнті (6–17,5% ) ПААГ за присутності

0,1% SDS: 1–25 — препарати Ig молозива породіль; М — стандарти молекулярної маси білків

кДа

кДа

кДа

Експериментальні статті

41

На відміну від анти�дДНК АТ, антигісто�нові АТ було виявлено у складі 12 препара�тів Ig молозива породіль (рис. 3). При цьомуу шести препаратах рівень їх був близькимабо перевищував рівень антигістонових АТ,виявлених у препаратах IgG сироваткикрові хворих на розсіяний склероз. Найви�щим вмістом антигістонових АТ характери�зувався препарат № 4, де рівень антигістоно�вих АТ у 2,5 раза перевищував рівень їху препаратах IgG сироватки крові хворих нарозсіяний склероз. Варто зазначити, що, навідміну від інших препаратів Ig, молозивопороділлі №4 окрім антигістонових АТ міс�тило також анти�дДНК АТ. Присутність ав�то�АТ із різною специфічністю у молозивіжінки дає підстави припустити, що в її орга�нізмі можуть відбуватися зміни в імунномустатусі, а отже в подальшому це може приз�водити до виникнення автоімунних абоалергічних захворювань.

Важливою характеристикою авто�АТє їхня каталітична активність щодо авто�АГ.Встановлено, що ДНК�гідролізуючі антиті�ла (ДНК�зими) присутні у крові хворих наавтоімунні та деякі інші захворювання,однак їх не виявлено у крові клінічно здоро�вих людей. ДНК�зими було знайдено у сиро�ватці крові пацієнтів з автоімунними захво�рюваннями (системний червоний вівчак,ревматоїдний артрит, автоімунний тирої�дит, розсіяний склероз та ін.), а також у хво�рих на СНІД, променеву хворобу та деякілімфопроліферативні захворювання (В�лім�фолейкози) [8, 25]. ДНК�гідролізуючі анти�тіла ізотипів sIgA та IgG було також виявле�но у молоці та молозиві клінічно здоровихпороділь [17]. Частота, з якою ці абзимитрапляються у молозиві, та взаємозвязок їхз автоімунними порушеннями у породіль за�лишаються малодослідженими.

Ми провели аналіз ДНК�гідролізуючоїактивності препаратів Ig молозива породіль.Відомо, що ДНК�зимам притаманна топоізо�меразна активність щодо надспіралізованоїДНК плазміди [26]. ДНК�зими, подібно дотопоізомераз, каталізують розриви в однійіз двох ниток ДНК, що призводить до утво�рення релаксованої форми ДНК плазміди.Оскільки ці дві форми ДНК мають різнуелектрофоретичну рухливість, їх можнарозділити електрофорезом у гелі агарози.Було встановлено, що препарати Ig №4, 8,18 та 21 гідролізують надспіралізовану плаз�мідну ДНК подібно до ДНК�зимів, виділенихіз сироватки крові пацієнтів з автоімуннимизахворюваннями (рис. 4). В інших препаратахIg топоізомеразну активність не виявлено.

розсіяний склероз, а як негативний — пре�парати IgG сироватки крові клінічно здоро�вих донорів. Було встановлено, що вміст ан�ти�дДНК АТ в усіх препаратах Ig молозивапороділь, окрім препарату Ig №4, суттєво невідрізнявся від вмісту анти�дДНК АТ у пре�паратах IgG, виділених із сироватки кровіздорових донорів (рис. 3). Вміст анти�дДНКАТ у препараті № 4 був достовірно вищим,ніж у інших препаратах АТ, хоча й був ниж�чим, ніж у препаратах IgG, виділених із си�роватки крові хворих на розсіяний склероз.

Рис. 2. Рівень виживання ТKклітин лінії Jurkat підвпливом препаратів Ig (1–25), очищених із молоK

зива породіль. К — контроль (за відсутності Ig)

Рис. 3. Імуноферментний аналіз (ІФА) відносноговмісту автоKАТ зі спорідненістю до дволанцюгової

ДНК (антиKдДНК АТ) та гістонів (антигістоновіАТ) у препаратах Ig.

На діаграмі показано співвідношення вмісту авто�АТ у препаратах Ig, визначеного за величиною оп�тичного поглинання забарвлених продуктів перок�сидазної реакції: 1–25 — препарати Ig молозивапороділь; К1+, К2+ — препарати Ig сироваткикрові хворих на розсіяний склероз; К1–, К2– —препарати Ig сироватки крові клінічно здорових до�норів

антигістонові АТанти�дДНК АТ

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

42

не є вузькоспецифічними щодо субстратіві крім ДНК вони можуть також гідролізува�ти синтетичні олігонуклеотиди та різні типиРНК [7, 26]. Тому не виключено, що ДНК�зими каталітично активних препаратів Ig№4, 8, 21 є авто�АТ зі спорідненістю до одно�ланцюгової ДНК або РНК.

У табл. 1 подано узагальнені результатидослідження антигенної специфічності, ци�тотоксичної та каталітичної активності пре�паратів Ig молозива породіль. Як випливаєіз результатів цього аналізу, функціональнаактивність Ig молозива двох породіль (№4і №21) суттєво відрізняється від функціона�льної активності Ig інших породіль. Спіль�ною ознакою для породіль №4 і №6 є:

– високий вміст секреторних імуногло�булінів класу А;

– низька (або відсутня) цитотоксична ак�тивність щодо людських лейкемічних Т�клітин лінії Jurkat;

– наявність антигістонових АТ;– топоізомеразна та протеолітична ак�

тивність.Наведена сукупність ознак свідчить про

те, що стан гуморального імунітету цих по�роділь відрізняється від стану інших поро�діль, і причиною цих змін можуть бути авто�імунні процеси, пов’язані з вагітністю тапологами. В анамнезі цих породіль виявле�но суттєві відхилення від норми, зокремаперебіг вагітності у них супроводжувавсязагрозою переривання вагітності, токсико�зом, набряками кінцівок, що певною мірою

Іншим типом абзимів, присутність якихв організмі свідчить про автоімунні порушен�ня, є протеїнгідролізувальні авто�АТ (про�табзими). Протабзими класів sIgA і IgG, щоздатні гідролізувати бета�казеїн жіночого такоров’ячого молока, було виявлено у молоціклінічно здорових жінок і в сироватці кровіхворих на СНІД [27, 28]. Нами було встанов�лено, що високоочищені препарати sIgA,виділені з молозива породіль, гідролізуютьгістон Н1 [29]. Антитіла класу IgG із подіб�ною субстратною специфічністю також булознайдено у сироватці крові хворих на розсія�ний склероз (дані не опубліковано). Одержа�ні результати вказують на те, що абзими, якігідролізують гістон Н1, подібно до іншихпротабзимів, можуть слугувати маркерамиавтоімунних порушень в організмі людини.У даній роботі встановлено, що препарати Ig№ 4 та № 21 гідролізують гістон Н1 (рис. 5).Іншим препаратам не притаманна каталі�тична активність щодо цього білка.

Враховуючи ту обставину, що препаратиIg були недостатньо очищені від домішокінших білків молозива, не можна виключи�ти, що каталітична активність деяких із цихпрепаратів може бути наслідком дії домі�шок ензимів молока. Підвищений вміст ав�то�АТ зі спорідненістю до ДНК та гістоніву складі каталітично активних препаратівIg №4 і №21 свідчить на користь присутнос�ті в них абзимів. Відсутність авто�АТ зі спо�рідненістю до дволанцюгової ДНК у складіпрепаратів Ig № 8, 18, 21 не виключає мож�ливості функціонування ДНК�зимів. Відомо,що, на відміну від протабзимів, ДНК�зими

Рис. 4. Гідроліз плазмідної ДНК під впливом препаратів Ig молозива породіль:

3, 7, 17, 20 — препарати Ig, у яких топоізомеразнаактивність відсутня;

4, 8, 18, 21 — препарати Ig, яким притаманна топо�ізомеразна активність;

К — плазміда pBR322. Стрілками вказано положен�ня на гелі релаксованої (РП) та надспіралізованої(СП) форм плазмідної ДНК

Рис. 5. Гідроліз гістону Н1 під впливом препаратівIg молозива породіль:

3, 22 — препарати Ig, у яких протеолітична актив�ність відсутня;

4, 21 — препарати Ig, здатні гідролізувати гістонН1; К — гістон Н1. Стрілкою вказано положення на

гелі гістону Н1

1

Н1

2221К43

СП

РП

К21201817874

Експериментальні статті

43

нуклеопротеїнів ядра можуть слугуватидіагностичними маркерами розвитку дея�ких автоімунних захворювань [6, 23]. Длявизначення положення ядер фіксованіклітини лінії Jurkat фарбували флуоресцен�тним барвником DAPI. Встановлено, щоу препаратах Ig №4, 21 і 24 присутні авто�АТ класу IgA зі спорідненістю до біострук�тур Т�клітин лінії Jurkat (рис. 6). У препа�раті Ig породіллі № 20 авто�АТ класу sIgAз подібною антигенною специфічністю невиявлено. Накладання фазово�контрастнихта флуоресцентних зображень клітин дозво�лило продемонструвати, що антигени авто�sIgA антитіл препаратів Ig №4 містятьсяу ядрі клітин і, ймовірно, є компонентами

підтверджує припущення щодо розвитку ав�тоімунних порушень.

Важливою ознакою автоімунних пору�шень у людини є поява у сироватці крові ав�то�АТ до внутрішньоклітинних автоанти�генів [23]. Враховуючи ту обставину, щоsIgA є головним компонентом фракції Ig мо�лозива людини, було проведено досліджен�ня спорідненості sIgA�антитіл препаратів Igдо антигенів Т�клітин лінії Jurkat. Викорис�тано препарати Ig породіль №4, 20, 21, 24,у яких вміст sIgA, згідно з даними, наведе�ними на рис.1, був найвищим. Для виявлен�ня sIgA застосовували FITC�мічені IgG кози,моноспецифічні до Н�ланцюгів sIgA люди�ни. Відомо, що авто�АТ зі спорідненістю до

Таблиця 1. Характеристика функціональної активності препаратів Ig, виділених із молозива породіль

Донори молозива

№ п/п

Цитотоксична активність Ig

Мітогеннаaктивність

Ig

Вміст анти�ДНК

АТ

Вміст анти�гістонових

АТ

Топоізоме�разна

активністьIg

Протеолітич�на

активність Igщодо гістону

Н1

1 + + +

2 + +

3 + + + +

4 + + + ++ + + + +

5 + + +

6 + + +

7 + + +

8 + +

9 + + +

10 + +

11 + + +

12 + + + + +

13 + + + ++

14 + +

15 +

16 + +

17 + +

18 + + +

19 + +

20 + + + + +

21 + + + + + + + +

22 +

23 + + +

24 +

25 + + +

Примітка: «+» — низький, «++» — середній, «+++» — високий рівень прояву функціонального марке�ра у препаратах Ig.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

44

1. Полетаев А. Г. Иммунологический гомун�кулус (иммункулус) в норме и при патоло�гии // Биохимия. — 2002. — Т. 67, №5. —С. 721–730.

2. Mackay I. R. Autoimmunity: Paradigms ofBurnet and complexities of today // Immun.Cell. Biol. — 1992. — V. 70, N3. —P. 159–171.

3. Avrameas S. Natural autoantibodies. Fromhorror autotoxicus to gnothi seauton //Immunol. Today. — 1991. — V. 12, N5. —P. 154–159.

4. Bouvet J/P., Dighitro G. From naturalpolyreactive autoantibodies to a la Cartemonoreactive antibodies to infection agents:is it a small world after all? // Infection andImmunity. — 1998. — V. 66, N1. — C. 1–4.

5. Dawson K., Bell D. Production and patho�genic effect of anti�DNA antibodies: rele�vance to antisense research // AntisenseRes. Devel. — 1991. — V. 1, N4. —C. 351–360.

6. Kurien B. T., Scofield R. H. Autoantibodydetermination in the diagnosis of systemiclupus erythematosus // Scan. J. Immunol. —2006. — V. 64, N3. — P. 227–235.

7. Невинский Г. А., Канышкова Т. Г., Бунева В. Н.Природные каталитически активные ан�титела (абзимы) в норме и при патологии// Биохимия. — 2002. — Т. 65, №11. —С. 1473–1487.

8. Gabibov A., Ponomarenko N., Tretyak E. et al.// Catalytic autoantibodies in clinical auto�immunity and modern medicine // Auto�imm. Rev. — 2006. — V. 5, N5. —P. 324–330.

9. Сучков С. В. Сравнительное исследованиекаталитических (ДНК�гидролизирующих)и цитотоксических свойств анти�ДНК ау�тоантител // Бюл. эксперим. биол. мед. —2001. — Т. 131, №4. — С. 420–423.

10. Kozyr A. V., Sashchenko L. P., Kolesnikov A. V.et al. Anti�DNA autoantibodies reveal toxi�city to tumor cell lines // Immunol. Lett. —2002. — V. 80, N1. — P. 41–47.

11. Gabibov A. Antibody catalysis: Biochemist�ry, immunology, pathology // Ibid. —2006. — V. 103, N1. — P. 1–2.

12. Nevinsky G., Bunetva N. Catalytic antibodiesin healthy humans and patients withautoimmune and viral diseases // J. Cell.Mol. Med. — 2003. — V. 7, N3. —P. 265–276.

13. Сervera R., Font J., Balasch J. Pregnancyoutcome in systemic lupus erythematosus:

хроматину. Водночас антигени авто�sIgAантитіл препаратів Ig № 21 і № 24 розміщеніголовним чином у цитоплазмі та плазма�тичній мембрані Т�клітин лінії Jurkat.

Аналіз результатів проведених дослі�джень дає підстави зробити висновок про те, щофункціональні властивості імуноглобулінівмолозива можуть відображати індивіду�альні особливості стану гуморального імуні�тету у породіль. Проте отримані результатипоки що не дозволяють однозначно стверд�жувати, які саме характеристики антитілмолозива — цитотоксичність, спорідненістьдо автоантигенів чи каталітична актив�ність — можуть слугувати маркерами у ран�ній діагностиці автоімунних порушень у по�роділь. Щоб відповісти на це запитання,потрібно провести комплексне дослідженнястану здоров’я ширшої вибірки породіль,яких за сумою виявлених нами ознак можнавіднести до групи ризику.

Автори висловлюють подяку д.б.н. М. Д. Лу�цику за надані ним препарати гістонів. Ро�боту виконано за фінансової підтримкиспільного проекту НАН України та Сибір�ського відділення Російської АН.

Рис. 6. Аналіз антигенної специфічності секреторних IgA препаратів Ig молозива породіль

щодо лейкемічних ТKклітин лінії Jurkat:К — клітини, не інкубовані з препаратами Ig (конт�

роль);4, 21 — клітини, інкубовані з Ig препаратів №4 та 21; ФМК — фазово�контрастна мікроскопія препаратів

клітин;A�IgA — флуоресцентна мікроскопія препаратів

клітин після оброблення їх FITC�мічени�ми IgG кози, специфічними до Н�ланцюгівIgA людини;

DAPI — флуоресцентна мікроскопія препаратівклітин, зафарбованих DAPI

ЛІТЕРАТУРА

Експериментальні статті

45

Mol. Med. — 2003. — V. 7, N3. —P. 265–276.

26. Nevinky G. A., Buneva V. N. Human cathalyt�ic RNA� and DNA�hydrolyzing antibodies //J. Immunol. Methods. — 2002. — V. 269,N1–3. — P. 235–249.

27. Odintsova E. S., Buneva V. N., Nevinsky G. A.Casein�hydrolyzing activity of sIgA antibod�ies from human milk // J. Mol. Recognit. —2005. — V. 18, N5. — P. 413–421.

28. Одинцова Е. С., Харитонова М. А., Барано/вский А. Г. и др. Протеолитическая актив�ность IgG антител из крови больных синд�ромом приобретенного иммунодефицитачеловека // Биохимия. — 2006. — Т. 71,№3. — С. 320 — 332.

29. Кіт Ю. Я., Стойка Р. С. Каталітично ак�тивні антитіла (абзими) молока людиниі деякі механізми регуляції їх активності// Матеріали IX Укр. біохім. з’їзду, 24–27жовтня 2006 р., Харків. — Т. 1. — 20 с.

good news for the new millennium // Auto�immun. Rev. — 2002. — V. 1, N6. —P. 354–359.

14. Канышкова Т. Г., Бунева В. А., Невинс/кий Г. А. Биологические функции молокачеловека и его компонентов // Успехисовр. биологии. — 2002. — Т. 122, №3. —С. 259–271.

15. Quan C. P., Berneman A., Pires R., Bouvet J. P.Natural polyreactive secretory immuno�globulin A autoantibodies as a possible barri�er to infection in humans // Infect. Im�mun. — 1997. — V. 65, N10. —Р. 3997–4004.

16. Кит Ю. Я., Семенов Д. В., Канышкова Т. Г.и др. Секреторные иммуноглобулины А мо�лока человека обладают сродством к оли�гонуклеотидам и нуклеиновым кислотам// Биохимия. — 1999. — Т. 64, №1. —С. 52–59.

17. Кіт Ю. Я., Стойка Р. С. Каталiтично ак�тивні антитіла (абзими) молока людини //Укр. біохім. журн. — 2007. — Т. 79,№2. — С. 5–16.

18. Иммуноглобулины / Под ред. Г. Леитменаи Р. Гуда. — М.: Мир, 1981. — C. 212–230.

19. Lowry O. H., Rosebrough N. J // Protein mea�surement with the folin phenol reagent // J.Biol. Chem. — 1951. — V. 193, N1. —P. 265–270.

20. Laemmly U. K. A cleavege of structugal pro�tein during the assambly of the head of bac�teriofage T4 // Nature. — 1970. — V. 227,N5259. — P. 2244–2750.

21. Nevinsky G. A., Kanyshkova T. G., SemenovD. V. et al. Secretory immunoglobulin A fromhealthy human mothers’ milk catalyzesnucleic acid hydrolysis // Appl. Biochem.Biotechnol. — 2000. — V. 83, N1–3. —P. 115–129.

22. Polosukhina D. I., Buneva V. N., Doronin B. M.et al. Hydrolysis of myelin basic protein byIgM and IgA antibodies the sera of patientswith multiple sclerosis // Med. Sci.Monit. — 2005. — V. 11, N8. —P. 266–272.

23. Herrington C. S., McGee J. O. D. DiagnosticMolecular Pathology. — Oxford.: IRL Press,1992. — 536 p.

24. Старикович М. А., Кит Ю. Я., Хавунка М. Я.и др. Цитотоксическая активность имму�ноглобулинов плазмы крови клиническиздоровых людей и больных рассеяннымсклерозом // Цитокины и воспаление. —2006. — Т. 5, №4. — С. 26–31.

25. Nevinsky G. A, Buneva V. N. Catalytic anti�body in healthy humans and patients withautoimmune and viral diseases // J. Cell

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

46

IMMUNOGLOBULINS OF COLOSTRUM AS NOVEL MOLECULAR MARKERS

OF PRECLINICAL DIAGNOSTICS OF AUTOIMMUNE DISORDERS

IN PARTURIENT WOMEN

Yu. Ya. Kit1, M. O. Starykovych1, R. O. Bilyy1, N. R. Skorohyd1,

L. B.Yanyv2, R. S. Stoika1

1Institute of Cell Biology of NationalAcademy of Sciences of Ukraine, Lviv

2Lviv Regional Perinatal Center

E/mail: kit@cellbiol.lviv.ua

Analysis of antigen specificity, catalytic andcytotoxic activity of colostrum immunoglobu�lins was carried out in order to detect novel mole�cular markers of autoimmune disorders.Immunoglobulins were isolated from parturientwomen colostrums by precipitation with 50%ammonium sulfate. It was shown that prepara�tions of immunoglobulins possessed significant�ly different cytotoxic activity towards Jurkatleukemia T�cells, various hydrolyzing abilitytowards plasmid DNA and histone H1, and alsodiffered by content of auto�antibodies to double�stranded DNA and histones. We concluded thatfunctional properties of colostrums immuno�globulins depended on individual peculiarities ofparturient women humoral immunity. Theseproperties can be used for complex detection ofearly autoimmune disorders linked with preg�nancy and delivery.

Key words: colostrum of healthy women, immunoglo�bulins, cytotoxic activity, catalytic activity, level ofauto�AB.

ИММУНОГЛОБУЛИНЫ МОЛОЗИВА КАК МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МАРКЕРЫ

ДОКЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ АУТОИМУННЫХ НАРУШЕНИЙ

У РОЖЕНИЦ

Ю. Я. Кит1, М. О. Старикович1, Р. О. Билый1, Н. Р. Скорохид1,

Л. Б. Янив2, Р. С. Стойка 1

1Институт биологии клетки НАН Украины, Львов

2Львовский областной перинатальный центр

E/mail: kit@сellbiol.lviv.ua

С целью выявления новых молекулярныхмаркеров аутоимунных нарушений у роженицпроведен анализ антигенной специфичности,каталитической и цитотоксической активнос�ти иммуноглобулинов, полученных из молози�ва осаждением 50%�м сульфатом аммония.Установлено, что препараты иммуноглобули�нов существенно различаются по цитотокси�ческой активности относительно лейкемичес�ких Т�клеток линии Jurkat, способностигидролизовать плазмидную ДНК и гистон Н1,а также по содержанию ауто�АТ к двухцепоч�ной ДНК и гистонам. Сделан вывод о том, чтофункциональные свойства иммуноглобулиновмолозива зависят от индивидуальных особен�ностей состояния гуморального иммунитетарожениц. Эти свойства могут быть использова�ны для комплексного определения ранних ау�тоиммунных нарушений у женщин, связан�ных с беременностью и родами.

Ключевые слова: молозиво здоровых рожениц, им�муноглобулины, цитотоксическая активность, ка�талитическая активность, уровень ауто�АТ.

Експериментальні статті

47

нози, D�глюкуронової і піровиноградноїкислот (3:2:1:1:1:1) та структурою повторю�ваної ланки вуглеводного ланцюга. Різницяміж цими ЕПС полягає в тому, що ацильова�ний полісахарид містить жирні кислоти(С12–С18) [1].

Глюкуронова й піровиноградна кислотиє бічними замісниками повторюваної ланкивуглеводного ланцюга, з’єднаними із залиш�ками рамнози і манози, відповідно. Залежновід умов культивування продуцента у складіетаполану міститься 25–35% мінеральнихкомпонентів (одновалентних катіонів). На�явність мінеральних компонентів у складіетаполану зумовлена структуруванням цьо�го ЕПС у процесі його біосинтезу катіонами,що містяться в середовищі культивуванняпродуцента [1]. Реологічні властивості роз�чинів етаполану, що визначають його прак�тичну значущість (здатність до емульгуван�ня, підвищення в’язкості за присутностіодно� і двовалентних катіонів у разі зниженняpH, за низьких швидкостей зсуву, у системіCu2+�гліцин), залежить від співвідношенняу його складі ацильованих і неацильованихкомпонентів, а також від співвідношенняжирних кислот в ацильованому полісаха�риді [1].

Слід зазначити, що сукупність таких рео�логічних властивостей не характерна для жод�ного з відомих мікробних полісахаридів.

Мікробні екзополісахариди (ЕПС) вик�ликають великий інтерес у дослідників зав�дяки унікальним фізико�хімічним власти�востям цих полімерів, що визначають їхвикористання у нафтодобувній, харчовій,хімічній промисловості, сільському госпо�дарстві, медицині.

Acinetobacter sp. В�7005 є продуцентомкомплексного екзополісахариду, названогонами етаполаном [1]. На основі етаполанурозроблено спосіб ізоляції припливу пласто�вих вод, який дає змогу в разі застосування1 т етаполану видобути додатково близько240 т нафти та знизити її обводнення з 84 до15%. З використанням етаполану як голов�ної складової частини розроблено технологіївиготовлення косметичних кремів під за�гальною назвою «Екол», технічного мийно�го засобу БІМС�1. Встановлено можливістьі доцільність застосування етаполану підчас виробництва хліба та хлібопродуктів.Завдяки спроможності етаполану адсорбу�вати та виводити з організму солі важкихметалів його рекомендовано для профілак�тичного харчування [1].

Етаполан складається з нейтрального(мінорний компонент) і двох кислих поліса�харидів, один з яких є ацильованим. Ацильо�ваний і неацильований полісахариди іден�тичні за молярним співвідношеннямD�глюкози, D�манози, D/галактози, L/рам�

УДК 579.841:577.15

УДОСКОНАЛЕННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ УДОСКОНАЛЕННЯ БІОТЕХНОЛОГІЇ МІКРОБНОГО ЕКЗОПОЛІСАХАРИДУ МІКРОБНОГО ЕКЗОПОЛІСАХАРИДУ

ЕТАПОЛАНУ НА ЕТАНОЛІЕТАПОЛАНУ НА ЕТАНОЛІ

Визначено особливості енергетичного й конструктивного метаболізму С2�субстратів у Acinetobacter sp. В�7005 — продуцента екзополісахариду етаполану, виявлено сайти метаболічного лімітування і розробленопідходи до їх усунення.

Показано, що «вузьким» місцем метаболізму етанолу в Acinetobacter sp. В�7005 є асиміляція ацетату: ре�акція, що каталізується ацетил�КоА�синтетазою, є швидкістьлімітувальною. Встановлено умови культивуван�ня бактерій, що дають змогу усунути лімітування С2�метаболізму і підвищити у три рази активність ацетил�КоА�синтетази.

За таких умов синтезується високоацильований етаполан зі ступенем ацилювання 3–15%. Середня молеку�лярна маса полісахариду становить 1,5 млн. і не змінюється у процесі виділення й очищення препарату. Підви�щений вміст жирних кислот і висока молекулярна маса етаполану зумовлюють поліпшення реологічних влас�тивостей його розчинів, що визначають практичну значущість цього полісахариду.

Ключові слова: екзополісахариди, біосинтез, метаболізм етанолу, регуляція С2�метаболізму, фізико�хімічні властивості.

Т. П. Пирог Інститут мікробіології і вірусології НАН України, КиївЮ. В. Корж E/mail: tapirog@usuft.kiev.ua

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

48

NH4NO3 — 0,3; MgSO4 ⋅ 7H2O — 0,4; CaCl2 ·2H2O — 0,1; FeSO4 · 7H2O — 0,01; середовиKще 4: KH2PO4 — 3,4; КOH — 0,9; КCl — 4,4;NH4NO3 — 0,6; MgSO4 · 7H2O — 0,4; CaCl2 ⋅2H2O — 0,1; FeSO4 · 7H2O — 0,01; середовиKще 5: KH2PO4 — 1,7; КOH — 0,45; NH4NO3 —0,3; MgSO4 · 7H2O — 0,4; CaCl2 · 2H2O — 0,1;FeSO4 · 7H2O — 0,01; середовище 6: KH2PO4 —2,0; КOH — 0,55; КCl — 5,6; NH4NO3 — 0,6;MgSO4 · 7H2O — 0,4; CaCl2 · 2H2O — 0,1;FeSO4 · 7H2O — 0,01. Середовища різнилисяміж собою молярністю фосфатного буфера,загальною кількістю солей, наявністю Nа+,концентрацією одновалентних катіонів.Так, молярність буфера становила (М): сере�довища 1 і 2 — 0,05; 3 і 4 — 0,025; 5 і 6 —0,0125. У середовища додатково вносили0,5% (об’ємна частка) дріжджового автолі�зату та 0,006−0,009 % пантотенату кальцію(вітамін В5). Штами В�7005 і В�7005 (1НГ)є ауксотрофами за цим вітаміном [2,3],який є попередником коензиму А. Джереломвуглецю та енергії слугував етанол у концент�рації 1% (об’ємна частка).

Як посівний матеріал використовуваликультуру з експоненційної фази росту (16−24 год), вирощену на мінеральних середови�щах 1÷6 із різними джерелами вуглецю.Джерелом вуглецю та енергії у процесі одер�жання посівного матеріалу і біосинтезу ЕПСбули: а) 0,5 % етанолу (об’ємна частка); б)1% етанолу (об’ємна частка) за наявностіабо відсутності ацетату калію (0,1% або0,01%); в) 1,6% ацетату калію. Кількість по�сівного матеріалу становила 5% від об’ємусередовища.

Ензиматичні аналізи. Визначення ак�тивності ферментів здійснювали в безклі�тинних екстрактах. Одержання безклітин�них екстрактів проводили як описанов роботі [4].

Ключові ферменти С2/метаболізму тагліоксилатного циклу. Активність алко�гольдегідрогенази (КФ 1.1.1.1), ацетальде�гіддегідрогенази (КФ 1.2.1.3 і КФ 1.2.1.4),ацетил�КоА�синтетази (КФ 6.2.1.1), ізоцит�ратліази (КФ 4.1.3.1) та малатсинтази (КФ4.1.3.2) визначали як описано в роботі [4].

Ферменти циклу трикарбонових кис/лот. Активність цитратсинтази (КФ 4.1.3.7)аналізували за зниженням концентраціїацетилфосфату у присутності коензиму А таоксалоацетату, як описано в роботі [5]. Ак�тивність аконітатгідратази (КФ 4.2.1.3) [6]встановлювали в присутності цис�аконітатуза відновленням НАДФ+ при 340 нм. Актив�ність ізоцитратдегідрогенази (КФ 1.1.1.41)[7], малатдегідрогенази (КФ 1.1.1.37) [8]

Окрім того, для синтезу етаполану може бу�ти використаний широкий набір вуглецевихсубстратів (у тому числі й невуглеводних),тимчасом як інші відомі полісахариди одер�жують тільки на основі вуглеводної сировини.

Здатність до синтезу ЕПС виявлено у ба�гатьох мікроорганізмів, проте рівень синте�зу цих полімерів коливається в широких ме�жах як для різних продуцентів ЕПС, такі для одного продуцента в різних умовах йогокультивування. Створення високоефектив�них технологій одержання практично важ�ливих метаболітів базується на цілеспрямо�ваній регуляції процесу біосинтезу, що у своючергу потребує глибоких знань фізіології,біохімії та генетики продуцентів.

Відомо, що в послідовності метаболічнихреакцій, пов’язаних з утворенням ключо�вих інтермедіатів, існують лімітувальні ре�акції, швидкість яких нижча від інших абоякі супроводжуються великою витратоюенергії чи втратою вуглецю субстрату. Вияв�лення таких сайтів метаболічного ліміту�вання та розроблення на основі знань прин�ципів регуляції метаболізму дасть змогуреалізувати біотехнологічні процеси з най�вищою ефективністю.

Мета роботи полягала у визначенні шля�хів регуляції різних ланок метаболізмуу процесі вирощування штамів Acinetobac/ter sp. В�7005 і В�7005 (1НГ) на С2�субстра�тах для вдосконалення процесу біосинтезуЕПС етаполану.

Матеріали і методи

Об’єкти досліджень. О’єктом дослі�джень був штам Acinetobacter sp. — проду�цент комплексного екзополісахаридногопрепарату етаполану [2], депонований у Де�позитарії Інституту мікробіології і вірусо�логії НАН України під номером В�7005, а та�кож мутантний штам Acinetobacter sp.В�7005 (1НГ), що не утворює ЕПС, який бу�ло одержано з вихідного за допомогою нітро�зогуанідинового мутагенезу [3].

Культивування Acinetobacter sp. ВF7005.Культивування бактерій здійснювали в кол�бах на качалці (220 об/хв) при 30 °С, рН6,8−7,0, упродовж 16−120 год на рідких мі�неральних середовищах такого складу (г/л):середовище 1: KH2PO4 — 6,8; NaOH — 0,9;NaCl — 1,05; NH4NO3 — 0,6; MgSO4 · 7H2O —0,4; CaCl2 · 2H2O — 0,1; FeSO4 · 7H2O — 0,01;середовище 2: KH2PO4 — 6,8; КOH — 1,8;КCl — 1,4; NH4NO3 — 0,6; MgSO4 · 7H2O —0,4; CaCl2 · 2H2O — 0,1; FeSO4 ⋅7H2O — 0,01;середовище 3: KH2PO4 — 3,4; КOH — 0,9;

Експериментальні статті

49

лот — ваговим методом після дезацилюван�ня розчинів ЕПС [16]. Встановлення вмістумінеральних компонентів у складі етаполануздійснювали, обробляючи його катіонітомКУ�2�8 (Н+). Вміст нейтральних моносаха�ридів визначали за допомогою вуглеводногоаналізатора Biotronik LC�2000 [1], а молеку�лярно�масовий склад ЕПС — методоманалітичного градієнтного центрифугуван�ня в розчині хлористого натрію [20]. Якстандарти молекулярних мас використову�вали декстрани фірми Fluka із молекуляр�ною масою 13,5; 20; 40; 70; 110; 500 тис.і 2 млн. Вміст вуглеводнів в отриманихпісля центрифугування фракціях (об’єм1 мл) встановлювали за реакцією з феноломі сірчаною кислотою.

Вміст компонентів певної молекулярноїмаси обчислювали, визначаючи кількістьвуглеводів у відповідних фракціях, і вира�жали в процентах до вихідної (загальної)кількості вуглеводів. Знаючи процентнийвміст у складі ЕПС компонентів різної моле�кулярної маси, розраховували середню мо�лекулярну масу.

Властивості розчинів етаполану оціню�вали за відносною зміною їхньої в’язкості уприсутності 0,1 М КCl, рН 4−4,5 (за умовипереведення ЕПС в Н+�форму), у системіCu2+�гліцин. Відносну зміну в’язкості визна�чали за формулою:

де η1 — в’язкість розчину ЕПС у досліджува�них умовах; η2 — в’язкість розчину ЕПСу дистильованій воді.

Результати та обговорення

Вивчення особливостей С2�метаболізмупід час росту штамів Acinetobacter sp. В�7005та В�7005 (1НГ) на етанолі показало, щоокиснення етанолу до ацетальдегіду каталі�зується НАД+�залежною алкогольдегідроге�назою. Акцепторами електронів в ацетальде�гіддегідрогеназній реакції є НАД+ і НАДФ+.З’ясовано, що в Acinetobacter sp. ацетатзалучається до метаболізму за участю аце�тил�КоА�синтетази; анаплеротичною послідов�ністю реакцій, що поповнюють пул С4�дикарбо�нових кислот, є гліоксилатний цикл [21].

Подальші дослідження було спрямованона визначення активності ферментів циклутрикарбонових кислот (ЦТК) та деякихбіосинтетичних шляхів [22]. У безклітинно�му екстракті Acinetobacter sp. В�7005 і В�7005(1НГ) виявлено високу активність усіх

визначали за відновленням НАД+, а ізоцит�ратдегідрогенази (КФ 1.1.1.42) [5], малат�дегідрогенази (КФ 1.1.1.82) [9] — за віднов�ленням НАДФ+ при 340 нм у присутностіізоцитрату чи малату, відповідно. Актив�ність 2�оксоглутаратдегідрогенази (КФ 1.2.4.2)[10] встановлювали за відновленням НАД+

при 340 нм у присутності 2�оксоглутарату такоензиму А, сукцинатдегідрогенази (КФ1.3.99.1) [6] − за відновленням дихлорфе�ноліндофенолу в присутності феназинмета�сульфату при 600 нм, фумарази (КФ4.2.1.2) — за утворенням фумарату з малатупри 250 нм [5].

Активність ключових ферментів глю/конеогенезу та деяких біосинтетичнихшляхів. Активність фосфоенолпіруватсин�тетази (КФ 2.7.9.2) [11] аналізували колори�метрично за зниженням концентрації піруватув реакційній суміші (реакція з динітрофе�нілгідразином) при 445 нм [11], фосфо�енолпіруваткарбоксикінази (КФ 4.1.1.49)[12], оксалоацетатдекарбоксилази (КФ4.1.1.3) [6] — за утворенням фосфоенолпіру�вату (ФЕП) та пірувату при окисненніНАДН, а глутаматдегідрогенази (КФ 1.4.1.4)[13] — за утворенням глутамату при окис�ненні НАДФН і 340 нм. Активність глута�матдегідрогенази (КФ 1.4.1.2) [14] встанов�лювали за відновленням НАД+ при 340 нму присутності 2�оксоглутарату.

Активність ферментів у безклітиннихекстрактах визначали при температурі 28−30 0С, що є оптимальною для росту данихбактерій, та виражали у нмоль·хв–1·мг–1

білка. Вміст білка в безклітинних екстрак�тах установлювали за Bradford [15].

Визначення швидкості окиснення суб�стратів (етанолу, ацетальдегіду й ацетату)інтактними клітинами Acinetobacter sp. В�7005та В�7005 (1НГ) проводили як описано в ро�боті [4].

Встановлення складу і фізикоFхімічFних властивостей етаполану. Комплекснийполісахаридний препарат етаполан виділялиз культуральної рідини осадженням ізопро�панолом після попереднього відокремленняклітин продуцента та діалізу [1]. Розділенняетаполану на ацильований і неацильованийкомпоненти здійснювали за розробленимраніше методом [16]. Для дезацилюванняпроводили оброблення ЕПС NаОН у присут�ності NаВН4. Вміст вуглеводів в ЕПС визна�чали колориметричним методом за реакцієюз фенолом і сірчаною кислотою [17], пірови�ноградної кислоти — за реакцією з 2,4�диніт�рофенілгідразином [18], уронових кислот —за реакцією з карбазолом [19], жирних кис�

−⋅1 0

0

100%,η η

η

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

50

Аналіз активності ключових ферментівметаболізму етанолу у процесі культивуван�ня Acinetobacter sp. В�7005 на середовищах1 і 2 показав, що активність ацетил�КоА�синтетази в безклітинному екстракті булав 2,7−5 разів нижчою, ніж активність алко�голь� і ацетальдегіддегідрогеназ (табл. 2).Досліджуючи швидкість окиснення С2�суб�стратів інтактними клітинами Acinetobactersp. В�7005 (1НГ), вирощеними на середови�щах 1 та 2, встановили, що після голодуванняклітин упродовж 20 год швидкість диханняза присутності етанолу й ацетальдегіду незмінювалась і становила 152,6−157,8 та153,5−159,4 нмоль О2·хв–1·мг–1 клітин відпо�відно, а за присутності ацетату знижуваласьу 2 і 4 рази на середовищі 2 і середовищі 1,відповідно, порівняно зі швидкістю окис�нення ацетату клітинами, що не голодували.

Отже, під час росту на етанолі в клітинахAcinetobacter sp. В�7005 і В�7005 (1НГ) аце�тат утворюється з вищою швидкістю, ніжзалучається до метаболізму. Тому наші нас�тупні дослідження були спрямовані на по�шук чинників, що забезпечують однаковушвидкість утворення і подальшого мета�болізму ацетату в клітинах бактерій у про�цесі культивування на етанолі.

У результаті ензиматичних і полярогра�фічних досліджень встановлено, що інгібі�

ферментів цього циклу (табл. 1). На нашудумку, наявність обох ключових ферментівгліоксилатного циклу, а також висока ак�тивність ізоцитратдегідрогенази, глутамат�дегідрогенази і низька активність 2�оксо�глутаратдегідрогенази є підтвердженнямтого, що ЦТК в Acinetobacter sp. В�7005 і В�7005 (1НГ) під час росту на етанолі вико�нує переважно біосинтетичну роль.

У процесі асиміляції мікроорганізмамидво� або тривуглецевих субстратів або суб�стратів, катаболізм яких здійснюється черезацетил�КоА чи інтермедіати ЦТК, виникаєнеобхідність синтезу молекул вуглеводів. Ціперетворення відбуваються шляхом глюко�неогенезу. Ензиматичні дослідження пока�зали, що під час росту на етанолі в Acineto/bacter sp. В�7005 і В�7005 (1НГ) піруватутворюється з оксалоацетату в оксалоаце�татдекарбоксилазній реакції, а в утворенніфосфоенолпірувату беруть участь обидваключові ферменти глюконеогенезу — ФЕП�карбоксикіназа і ФЕП�синтаза (табл. 1).

Таблиця 1. Активність ферментів циклу трикарбонових кислот

та деяких біосинтетичних шляхів уAcinetobacter sp. ВK7005 та ВK7005 (1НГ)

Фермент

Активність, нмоль·хв–1·мг–1 білка

В�7005 В�7005(1НГ)

Цитратсинтаза 421,3±25,1 405,6±21,6

Аконітаза 340,8±18,0 349,0±19,4

НАД+�залежна ізоцит�ратдегідрогеназа 0 0

НАДФ+�залежна ізоцит�ратдегідрогеназа 729,7±38,5 717,8±33,8

2�Оксоглутаратдегідро�геназа 96,2±4,8 93,4±5,3

Сукцинатдегідрогеназа 183,4±13,9 197,5±15,8

Фумараза 192,1±9,6 186,8±9,9

НАД+�залежна малат�дегідрогеназа 654,2±32,7 643,1±32,1

НАДФ+�залежна малат�дегідрогеназа 81,9±5,1 79,8±4,3

НАД+�залежна глута�матдегідрогеназа 653,9±33,5 642,6±31,8

НАДФ+�залежна глута�матдегідрогеназа 247,3±15,6 257,2±16,3

Оксалоацетатдекар�боксилаза 457,3±28,6 446,6±23,3

Фосфоенолпіруваткар�боксикіназа 58,5±2,9 48,7±3,5

Фосфоенолпіруватсин�тетаза 584,4±32,9 487,0±35,4

Таблиця 2. Активність ключових ферментів метаболізму етанолу в процесі культивування

Acinetobacter sp. ВK7005

Примітки: 1. Культивування бактерій здійсню�вали на середовищі 1 з 0,0006% В5.2. Для визначення активності ацетил�КоА�син�тетази, ізоцитратліази і малатсинтази бактеріївирощували на середовищі 2 з 0,0009 % В5. У дуж�ках наведено дані культивування штаму на сере�довищі 1 з 0,0006 % В5.

Ферменти

Активність(нмоль·хв–1·мг–1 білка)під час культивування

бактерій

24 год 48 год

НАД+�залежна алко�гольдегідрогеназа 365,7±19,6 289,5±17,5

НАД+�залежна ацет�альдегіддегідрогеназа 119,5±7,6 93,7±6,5

НАДФ+�залежна ацет�альдегіддегідрогеназа 253,7±15,7 197,3±11,3

Ацетил�КоА�синте�таза

135,7±8,7(74,5±5,2) 134,1±8,7

Ізоцитратліаза 130,0±7,8(50,5±2,9)

144,9±9,4(7,4±0,4)

Малатсинтаза 58,2±3,7 67,4±3,7

Експериментальні статті

51

тату в середовище з етанолом або використо�вуючи посівний матеріал, вирощений наацетаті чи етанолі у присутності ацетату.Встановлено, що додавання екзогенного аце�тату під час одержання інокуляту і біосинте�зу ЕПС дало змогу збільшити у 2,5−3 разиактивність ацетил�КоА�синтетази та швид�кість дихання за присутності ацетату і реа�лізувати процес синтезу етаполану на неза�буферених середовищах 3 і 5, в якихзагальний вміст солей було знижено у 2 і 4рази (до 5,1–2,95 г/л) [25].

Умови культивування продуцента впли�вають не тільки на синтез ЕПС, а й на фізи�ко�хімічні властивості кінцевого продукту[26]. У різних умовах культивування мо�жуть змінюватися хімічний склад ЕПС,їхня молекулярна маса, співвідношеннядекількох полісахаридів, що впливає на ре�ологічні властивості ЕПС, які визначаютьпрактичну значущість цих полімерів. Рані�ше було з’ясовано, що необхідною умовоюдля синтезу ацильованого полісахаридує наявність у середовищі культивуванняпродуцента етаполану 100 мМ К+ [1]. Вста�новлено, що тільки етаполан з високимвмістом ацильованого компонента (>50%)характеризувався сукупністю реологічнихвластивостей, необхідних для практичноговикористання. Оскільки вміст К+ у середо�вищах 3 і 5 становить 40 та 20 мМ відповід�но, на наступному етапі досліджували рео�логічні властивості синтезованого за такихумов етаполану. Згідно з попередніми дани�ми такої концентрації К+ недостатньо длясинтезу ацильованого ЕПС з необхіднимиреологічними властивостями.

Результати дослідження, що їх наведенов табл. 4, свідчать, що ЕПС, синтезовані насередовищах з різним вмістом К+, маютьпрактично однакові реологічні характерис�тики. Отже, культивування продуцента нанезабуференому середовищі з низькимвмістом солей (і катіонів калію) не впливалона властивості синтезованого етаполану.Для з’ясування причин, що зумовлюють цеявище, ми детальніше дослідили хімічнийсклад одержаних полісахаридів.

Встановлено, що незалежно від умовкультивування продуцента (вміст мінераль�них компонентів, співвідношення С/N і мо�лярність буфера в середовищі культивування)нативні ЕПС характеризувалися практичнооднаковим вмістом вуглеводів (44,5−46,7%)та піровиноградної кислоти (3,2−3,7%)(табл. 5). Співвідношення глюкози, манози,галактози та рамнози у складі всіх ЕПС булооднаковим і становило 3:2:1:1.

торами ацетил�КоА�синтетази є іони натрію,а також продукти окиснення етанолу й аце�тальдегіду — НАДН і НАДФН; активатора�ми ферменту є катіони калію і магнію [23].

Виходячи з отриманих результатів миприпустили, що одним із можливих шляхіврегуляції метаболізму ацетату в клітинахштамів В�7005 і В�7005 (1НГ) під час ростуна етанолі може бути вилучення Nа+ із сере�довища культивування і підвищення в ньо�му концентрації К+ і Мg2+. Для усуненняінгібувального впливу інтермедіатів окис�нення етанолу й ацетальдегіду на актив�ність ацетил�КоА�синтетази було зниженопочаткову концентрацію етанолу в середо�вищі з подальшим додаванням його части�нами у процесі культивування бактерій. По�казано, що в разі зниження у два разиконцентрації етанолу (до 0,5 %) спостеріга�лось підвищення швидкості дихання клітинза присутності ацетату, причому її величинапрактично не відрізнялася від швидкостіокиснення етанолу й ацетальдегіду. Окрімтого, швидкість окиснення ацетату істотноне змінювалась у процесі тривалого голоду�вання клітин. Слід зазначити, що за почат�кової концентрації етанолу 0,5 % у середо�вищі вміст пантотенату кальцію можна булознизити до 0,0006 %, при цьому не було пот�реби підвищувати концентрацію Mg2+.

У табл. 3 наведено активність ключовихферментів метаболізму етанолу у штамуAcinetobacter sp. В�7005, вирощеному за різ�них умов культивування. Встановлено, що зізниженням початкової концентрації етанолув середовищі, за відсутності сполук натріюі наявності 100 мМ К+ активність ацетил�КоА�синтетази підвищувалася більш ніж у дварази. За таких умов стала можливою ре�алізація процесу біосинтезу етаполану на не�забуферених середовищах 4 і 6 (0,025−0,125М). Отримання аналогічного результату припочатковій концентрації етанолу 1,0% забез�печувало підвищення вмісту вітаміну В5 в се�редовищі до 0,0009%, концентрації Mg2+ — до5 мМ і катіонів калію — до 100 мМ.

Таким чином, у результаті дослідженьрегуляції активності ацетил�КоА�синтетазинам вдалось істотно знизити молярність бу�фера зі збереженням вмісту солей у середо�вищі культивування, що тільки частковоусувало лімітування С2�метаболізму у про�дуцента етаполану.

Відомо, що ацетил�КоА�синтетаза є інду�цибельним ферментом, індуктором якогоє ацетат [24]. У зв’язку із цим ми припусти�ли, що можна повністю зняти лімітуванняС2�метаболізму внесенням екзогенного аце�

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

52

середовищах 3 і 5, зумовлено зменшеннямкількості одновалентних катіонів (зокрема ка�тіонів калію) у цих середовищах. Так, ранішенами було встановлено, що у процесі культиву�вання продуцента етаполану відбуваєтьсяструктурування синтезованих ЕПС катіонами,що містяться у живильному середовищі [1].

Проте полісахариди різнилися за кіль�кістю уронових (7,5−13,8 %), жирних (5,9−8,8%) кислот, мінеральних компонентів(6,2−28,6 %), а також за вмістом ацильованогокомпонента (70−100 %). Ми припускаємо,що зниження вмісту мінеральних компо�нентів у складі етаполану, синтезованого на

Таблиця 3. Вплив умов культивування Acinetobacter sp. ВK7005 на активність ключових ферментів метаболізму етанолу

Примітка. Культивування бактерій здійснювали на середовищі 2 (у середовищі відсутні сполуки Nа+,вміст К+ — 100 мМ).

Умови культивування Активність, нмоль·хв–1·мг–1 білка

концент�рація В5, %

концент�рація Мg2+,

мМ

початковаконцент�рація ета�нолу, %

НАД+�залежнаалкоголь�

дегідрогеназа

НАД++НАДФ+�залежна аль�

дегіддегідрогена�за

ацетил�КоА�синтетаза

ізоцит�ратліаза

0,0006 1,6 1,0 354,8±17,7 367,3±21,2 95,0±5,6 98,4±6,3

0,0009 1,6 1,0 349,9±22,9 356,7±24,4 130,9±7,6 130,0±7,9

0,0009 5,0 1,0 359,6±17,9 349,7±24,0 180,9±9,6 185,4±11,8

0,0009 1,6 0,5 265,9±16,1 277,9±15,4 219,8±11,0 225,4±13,8

0,0006 1,6 0,5 279,4±13,9 285,7±19,0 225,3±15,2 230,7±15,5

Таблиця 4. Реологічні властивості 0,03%Kх розчинів етаполану, синтезованого за різних умов культивування

Примітка. Концентрація етанолу 1 %; у середовища 3 і 5 додатково вносили 0,1 % ацетату калію дляодержання інокуляту і біосинтезу ЕПС.

Таблиця 5. Хімічний склад нативного і дезацильованого етаполану, синтезованого на середовищах різного складу

Примітки: 1. Концентрація етанолу 1 %; у середовище 5 додатково вносили 0,1% ацетату калію дляодержання інокуляту і біосинтезу ЕПС.

2. « – » — не визначали.3. Дезацильований ЕПС одержано в результаті лужного оброблення нативного препарату.

Середовище Концентрація К+

у середовищі, мМ Відносне збільшення в’язкості, %

за присутності 0,1 М KCl у системі Cu2+�гліцин

2 100 325,7±21,0 1400,3±78,0

3 40 480,3±35,2 1865,0±93,2

5 20 315,6±18,8 1700,5±100,5

Компонентний склад ЕПС ЕПСВміст складових компонентів (%) в ЕПС,

синтезованих на середовищах

1 2 3 5

Вуглеводинативний 44,5 45,0 46,7 45,9

після дезацилювання 60,0 59,1 58,6 55,7

Піровиноградна кислотанативний 3,3 3,7 3,4 3,2

після дезацилювання 4,8 4,4 4,7 4,8

Уронові кислотинативний 7,5 7,7 11,4 13,8

після дезацилювання 20,0 22,0 20,6 –

Жирні кислотинативний 6,5 6,8 8,8 5,9

після дезацилювання 0 0 0 0

Мінеральні компонентинативний 24,3 28,6 7,2 6,2

після дезацилювання 3,5 3,9 – –

Експериментальні статті

53

Таким чином, на основі досліджень особ�ливостей метаболізму у штаму Acinetobactersp. В�7005 і В�7005 (1НГ) визначено шляхирегуляції С2�метаболізму, що уможливиловдосконалення технології біосинтезу етапо�лану на етанолі. Ключовими елементами цієїтехнології є: відсутність у середовищі куль�тивування катіонів натрію, підвищенняв ньому концентрації пантотенату кальціюдо 0,0009%, а також наявність 0,1% ацетатукалію під час одержання інокуляту і біосин�тезу полісахариду. Це дало змогу здійснитибез зниження показників синтезу процесодержання етаполану на незабуференому сере�довищі, в якому вміст солей зменшено в 4 рази(з 11 до 2,95 г/л). За умов усунення ліміту�вання С2�метаболізму молекулярна маса ета�полану становила 1,5 млн. і не знижуваласьу процесі його виділення й очищення, а вмістжирних кислот в ацильованому полісаха�риді досягав 15%. Підвищений вміст жир�них кислот у складі етаполану і висока мо�лекулярна маса зумовлюють поліпшенняреологічних властивостей, що визначаютьпрактичну цінність цього полісахариду.

Після дезацилювання нативних ЕПСвміст уронових кислот збільшувався у 2−3 ра�зи і становив 20−22 % для всіх досліджува�них полісахаридів (табл. 5). У попередніхроботах було з’ясовано, що реальний вмістуронових кислот у складі нативних ЕПСвдається виявити тільки після їх дезацилю�вання [1]. Підвищення вмісту уронових кис�лот у цьому разі можна пояснити тим, щопід час дезацилювання відбувається ди�соціація високомолекулярних конгломе�ратів ЕПС, змінюється конформація поліса�харидних молекул і просторова структураЕПС, внаслідок чого уронові кислоти стаютьдоступнішими для взаємодії з різними реа�гентами. Варто зазначити, що після дезаци�лювання у складі етаполану суттєво знижу�вався вміст мінеральних компонентів. Насьогодні причини, що зумовлюють це яви�ще, залишаються невідомими. На з’ясуван�ня цих причин буде спрямовано наші по�дальші дослідження.

Дослідження молекулярної маси етапо�лану, синтезованого за різних умов культи�вування, показало, що середня молекулярнамаса полісахаридів, одержаних на середови�щах 3 та 5, практично не змінювалась у про�цесі виділення й очищення і становила 1,5 млн.(табл. 6). Це можна пояснити тим, що одер�жані полісахариди є високоацильованими,а в результаті ацилювання вуглеводноголанцюга формується щільна структураЕПС, яка залишається без змін у процесі об�роблення розчинів етаполану органічнимирозчинниками. Слід зазначити, що аналізмолекулярно�масового складу етаполану,синтезованого в різних умовах культивуван�ня, показав наявність компонентів з моле�кулярною масою від 13,5 тис. до 2 млн., при�чому основну масу препарату становилифракції з молекулярною масою понад 2 млн.У попередніх дослідженнях встановлено,що тільки високомолекулярному етапола�ну, у складі якого міститься не більше 35%фракцій з молекулярною масою до 2 млн.,притаманні необхідні для практичного ви�користання реологічні властивості [1].

Дослідження реологічних властивостейЕПС показало, що розчини етаполану, син�тезованого на середовищі 5 з 20 мМ К+, навсіх етапах його виділення й очищення ха�рактеризувалися вищою в’язкістю у присут�ності 0,1 М КСl і в системі Cu2+–гліцин(1 200 та 1 500−2 000% відповідно) порівня�но з ЕПС, синтезованими на середовищі зі100 мМ К+ (1 000 та 800−1 000% відпо�відно).

Таблиця 6. Молекулярна маса етаполану, синтезованого за різних умов культивування

Примітка. Концентрація етанолу 1 %; у середо�вище 5 додатково вносили 0,1% аце�тату калію для одержання інокулятуі біосинтезу ЕПС.

Се�редо�

ви�ще

Випарений кон�центрат ЕПС

ЕПС після осаджен�ня і висушування

серед�ня мо�леку�лярнамаса,млн.

фракції з молеку�

лярною ма�сою до

2 млн., %

середнямолеку�

лярнамаса,млн.

фракції з молеку�

лярною ма�сою до

2 млн., %

1 1,44 31,7±2,19 0,48 82,7±4,89

2 1,44 29,9±1,92 0,50 71,2±3,56

3 1,61 23,7±1,59 1,54 25,7±1,80

5 1,57 25,4±1,27 1,48 27,8±1,39

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

54

terium Phormidium laminosum // J. Bacte�riol. — 1988. — V. 170, N10. — P. 4897− 4902.

14. Nakamura I., Ohmura Y., Kamihara T.Effect of thiamin�induced vitamin B6 defi�ciency on NAD� and NADP�linked glutamatedechydrogenases in Yeast // J. Gen. Micro�biol. — 1983. — V. 129, №4. — P. 945−952.

15. Bredford M. A rapid sensitive method forthe quantitation of microgram quantities ofprotein utilizing the principle of protein�dyebinding // Anal. Biochem. — 1976. — 72,N3. — P. 248− 254.

16. Пирог Т. П., Гринберг Т. А., Пинчук Г. Э. и др.Разделение экзополисахаридов, синтезиру�емых Acinetobacter sp., на ацилированный инеацилированный компоненты // Микроби�ология. — 1994. — Т.63, № 5. — С.840−846.

17. Dubois M., Gilles K., Hamilton J. et al.Colorimetric method for determination ofsugars and related substances // Anal.Chem. — 1956. — V.28, N3. — P. 350−356.

18. Sloneker J. N., Orentas D. G. Pyruvic acid —a unique component of an exocellular bacter�ial polysaccharide // Nature. — 1962. —V.194, N4827. — P. 47 8−479.

19. Dische Z. A new specific color reaction ofhexuronic acids // J. Biol. Chem. — 1947. —V.167, N1. — P. 189−198.

20. Votselko S. K., Pirog T. P., Malashenko Y. R.,Grinberg T. A. A method for determining themass�molecular composition of microbialexopolysaccharides // Microbiol. Methods. −1993. — V. 18. — P. 349−356.

21. Пирог Т. П., Соколов И. Г., Кузьминская Ю. В.,Малашенко Ю. Р. Некоторые особенностиметаболизма этанола у мутантного штам�ма Acinetobacter sp., не образующего экзо�полисахариды // Микробиология. —2002. — Т.71, № 2. — С. 222− 229.

22. Пирог Т. П., Кузьминская Ю. В. Особеннос�ти центрального метаболизма штаммаAcinetobacter sp, растущего на этаноле //Там же. — 2003. — Т.72, № 4. — С. 459–465.

23. Пирог Т. П., Кузьминская Ю. В. Регуляцияметаболизма ацетата у штамма Acinetobac/ter sp., растущего на этаноле // Прикл. био�хим. и микробиол. — 2003. — Т. 39,№2. — С. 180−188.

24. Kumari S., Beatty C. M., Browning D. F. et al.Regulation of acetyl coenzyme A synthetasein Escherichia coli // J.Bacteriol. — 2000. —V. 182, N15. — P. 4173−4179.

25. Пирог Т. П., Корж Ю. В. Влияние ацетатана синтез экзополисахарида этаполана прикультивировании Acinetobacter sp. В�7005на среде с этанолом // Мікробіол.журн.–2006. — Т.68, № 5. — С. 12− 19.

26. Пирог Т.П., Кузьмінська Ю.В. Вплив умовкультивування мікроорганізмів�проду�центів екзополісахаридів на їхній синтезта фізико�хімічні властивості // Біополімериі клітина. — 2003. — Т. 19, № 5. — С. 393−413.

1. Пирог Т. П. Принципы регуляции состава и фи�зико�химических свойств экзополисахаридов,синтезируемых Acinetobacter sp.: Дисс. ... докт.биол.наук: 03.00.20.− К., 1999. — 450 с.

2. Гринберг Т. А., Пирог Т. П., Малашенко Ю. Р.,Пинчук Г. Э. Микробный синтез экзополи�сахаридов на С1−С2�соединениях. — К.: На�ук. думка, 1992. — 212 с.

3. Пирог Т. П., Столяр С. М., Малашенко Ю. Р.Получение и исследование мутантныхштаммов Acinetobacter sp., не образующихэкзополисахариды // Микробиология. —2000. — Т.60, № 5. — С. 674−680.

4. Пирог Т. П., Кузьмінська Ю. В., Коваленко М. О.Метаболізм С2−С6�субстратів в умовахміксотрофного росту штамів Аcinetobactersp. В�7005 та В�7005 (1НГ) // Укр. біохім.журн. — 2004. — Т.76, № 1. — С. 33−38.

5. O’Brien R. W., Stern J. R. Requirement forsodium in the anaerobic growth of Aerobacteraerogenes on citrate // J. Bacteriol. — 1969. —V.98, N2. — P. 388−393.

6. O’Brien R. W., Geisler J. Citrate metabolismin Aerobacter cloacae // Ibid. — 1974. —V. 119, N3. — P. 661−665.

7. Kornberg A. Isocitric dehydrogenase of yeast(DPN) // Methods in enzymology (Ed.Colowick S.P. and Kaplan N.O.). — New York:Acad. Press, 1955. — V. 1. — P. 707–709.

8. Kitto G.B. Intra� and extramitochondrialmalate dehydrogenase from chiken and tunaheart // Methods in enzymology (Ed.Lowenstein J.M.).− New York and London:Acad. Press, 1969. — V. 13. — P. 106− 116.

9. Johnson H. S., Hatch M. D. Properties andregulation of leaf nicotinamide�adenine din�ucleotide phosphate�malate dehydrogenaseand «malic» enzyme in plants with the C4�dacarboxylic acid pathway of photosynthesis// Biochem. J. —1970. — V.119, N2. —P. 273−280.

10. Mukherjee B. B., Matthews J., Horney D. L.,Reed L.J. Resolution and reconstitution ofthe Escherichia coli �ketoglutarate dehydro�genase complex // J. Biol. Chem. — 1965. —V. 240, N5. — P. 2268− 2269.

11. Cooper R. A., Cornberg H. L. Phosphoenolpy�ruvate synthetase // Methods in enzymology(Ed. Lowenstein J.M.). − New York: Acad.Press, 1969. — V. 13. — P. 309− 314.

12. Huei/Che Chang, Lane M. D. The enzymaticcarboxylation of phosphoenolpyruvate. II. Pu�rification and properties of liver mitochondrialphosphoenolpyruvate carboxykinase // J. Biol.Chem. — 1966. — V. 241, N10. — P. 2413−2420.

13. Martinez/Bilbao M., Martinez A., Urkijo I.etal. Induction, isolation and some propertiesof the NADPH�dependent glutamate dehydro�genase from the nonheterocystous cyanobac�

ЛІТЕРАТУРА

Експериментальні статті

55

IMPROVEMENT OF BIOTECHNOLOGY OFMICROBIAL EXOPOLYSACCHARIDE

ETHAPOLAN ON ETHANOL

T. P. Pirog, Ju. V. Korzh

Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Science

of Ukraine, Kiev

E/mail: tapirog@usuft.kiev.ua

The study is devoted to investigating of thebasic stages of С2�compounds assimilation inАcinetobacter sp. В�7005, to reveal «bottleneck»of С2�metabolism and to develop of approaches totheir removal to improve process of microbialexopolysaccharide ethapolan synthesis.

Limitation of ethanol metabolism in Acinetobactersp. В�7005 by the rate of acetate assimilation ina reaction catalyzed by acetyl�CoA�synthetase,was shown. Basing on the investigations of С2�metabolism regulation the cultivation condi�tions were developed which allowed to increasethe acetyl�CoA�synthetase activity in Acineto/bacter sp. В�7005.

Ethapolan synthesized under these condi�tions was characterized by high level of acyla�tion (3−15%). Molecular mass of this polysac�charide was 1,5 million and was not changedduring purification. Improved reological proper�ties of ethapolan were associated with high mol�ecular mass and increasing fatty acids content.

Key words: exopolysaccharides, biosynthesis, metab�olism of ethanol, regulation of C2�metabolism, physi�cal and chemical properties.

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОKЛОГИИ МИКРОБНОГО ЭКЗОПОЛИСАХАK

РИДА ЭТАПОЛАНА НА ЭТАНОЛЕ

Т. П. Пирог, Ю. В. Корж

Институт микробиологии и вирусологии им. Д. К. Заболотного НАН Украины, Киев

E/mail: tapirog@usuft.kiev.ua

Определены особенности энергетическогои конструктивного метаболизма С2�субстратову Acinetobacter sp. В�7005 — продуцента экзо�полисахарида этаполана, выявлены сайты ме�таболического лимитирования и разработаныподходы к их устранению.

Показано, что «узким» местом метаболиз�ма этанола в Acinetobacter sp. В�7005 являетсяассимиляция ацетата: реакция, катализируе�мая ацетил�КоА�синтетазой, — скоростьлими�тирующая. Установлены условия культивиро�вания бактерий, позволяющие устранитьлимитирование С2�метаболизма и повыситьв три раза активность ацетил�КоА�синтетазы.

В таких условиях синтезируется высокоа�цилированный этаполан со степенью ацилиро�вания 3−15%. Средняя молекулярная массаполисахарида составляет 1,5 млн. и не изменя�ется в процессе выделения и очистки препара�та. Повышенное содержание жирных кислот имолекулярная масса этаполана обусловливаютулучшение реологических свойств его раство�ров, определяющих практическую ценностьэтого полисахарида.

Ключевые слова: экзополисахариды, биосинтез,метаболизм этанола, регуляция С2�метаболизма,физико�химические свойства.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

56

Нами запропоновано культуру тканинE. plantagineum як джерело сировини дляотримання червоних шиконінових пігмен�тів. Перспективним є розроблення промис�лової біотехнології одержання шиконіновихпохідних.

Матеріали і методи

Насіння. Для проведення досліджень ви�користано насіння E. plantagineum урожаю2003 р., отриманого з колекції Національно�го ботанічного саду ім. М. М. Гришка НАНУкраїни (м. Київ).

Знезаражування. Знезаражування на�сіння проводили за допомогою хлоровмісноїрідини «Купава» та етилового спирту за та�кою методикою: насіння заливали 25%�мрозчином «Купави» з додаванням поверхнево�активної речовини TWEEN (0,2 мл на 100 мл)для кращого змочування насіння. Знезара�жування тривало 20 хв за постійного перемі�шування. Насіння тричі відмивали стериль�ною дистильованою водою і переносилив 96%�й C2H5ОН на 2 хв, після чого ще двічівідмивали дистилятом. Далі в стерильнихумовах насіння переносили в маленькі про�бірки з живильним середовищем (по однійнасінині) для проростання.

Культивування. Культуру тканин отри�мували з насіннєвих проростків на агаризо�

Синяк подорожниковий — Echium plan/tagineum L. ( E. licopsis L.) належить до ро�дини Boraginaceae, представники якої здав�на привертають увагу як лікарські, барвні,алкалоїдовмісні, глікозидовмісні, вітамінні,ефіроолійні, кормові, харчові та декора�тивні рослини [1].

E. plantagineum — трав’яниста рослина�дворічник, 20–60 см заввишки. Зростає пе�реважно в Криму, на Кавказі та ЗахідномуЗакавказзі. Підземна частина рослини міс�тить від 0,17 до 0,35% червоного пігментушиконіну [2]. Шиконін та його похідні здав�на використовували на Сході як найцінні�ший червоний барвник (технічний, харчо�вий, косметичний), що виявляє й лікарськівластивості [3, 4]. Рослинні пігменти фе�нольного походження нетоксичні та перс�пективні для використання їх як дефіцитнихприродних харчових червоних барвників,оскільки застосовувані наразі антоціаниє нестійкими. Синтетичні ж сполуки визна�но шкідливими [5].

Природна рослинна сировина для одер�жання нафтохінонових пігментів у промис�лових масштабах в Україні відсутня. Ши�конін японського виробництва, що йогоодержують із культури тканин горобинникачервонокореневого, є досить дорогим. Цінайого на світовому ринку сягає 4 500 дол.США за 1 кг.

УДК 581.143.6:576.5+663.1

ОДЕРЖАННЯ КУЛЬТУРИ ТКАНИН ОДЕРЖАННЯ КУЛЬТУРИ ТКАНИН СИНЯКА ПОДОРОЖНИКОВОГО СИНЯКА ПОДОРОЖНИКОВОГО

((Echium plantagineum Echium plantagineum L.) — ПРОДУЦЕНТА L.) — ПРОДУЦЕНТА ШИКОНІНОВИХ ПІГМЕНТІВШИКОНІНОВИХ ПІГМЕНТІВ

Одержано культуру тканин E. plantagineum із корінців насіннєвих проростків на агаризованому живильно�му середовищі 5С01. Культивування на живильному середовищі LS�м ініціювало біосинтез червоних шиконіно�вих пігментів. Відселектовано варіант калюсної культури (3Ер), що накопичує 2,11% похідних шиконіну відсухої біомаси, вихід якої на 14�ту добу росту становить16 г/л живильного середовища. Методами тонкошаровоїхроматографії (на пластинках Sorbfill УФ 254) та хроматографії на колонці (Silica gel 60) досліджено спектр ши�конінових похідних у процесі становлення культури. Встановлено, що органогенна культура на перших етапахкультивування на живильному середовищі LS�м разом із червоними фракціями шиконінових пігментів синте�зувала й сині. Проте через 1,5 року культивування клітини калюсу синяка синтезували тільки червоні фракціїшиконінових пігментів.

Ключові слова: Echium plantagineum L., культура тканин рослин, червоні пігменти, похідні шиконіну,клітинні лінії — продуценти біологічно активних речовин.

Пороннік О. О.

Шаблій В. А. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, КиївКунах В. А. E/mail: oksana_poronnik@ukr.net

Експериментальні статті

57

Промивали дистильованою водою і елююва�ли похідні шиконіну гексаном в іншу колбуБунзена.

Кількісний аналіз шиконінових пігменFтів. Оцінюючи кількісний вміст шиконінута його ефірів у екстрактах калюсів, вико�ристовували фотоелектроколориметричнийметод аналізу. Для досягнення цієї мети миотримали калібрувальну криву, побудовануза наважками очищених нафтохінонів. Оп�тичну густину вимірювали при довжиніхвилі λ = 526 нм (log e526=3,87) в етанолі [7].

Адсорбційна хроматографія на силікаFгелі. Колонки розміром 1,5×7,0 набивалиSilica gel 60 у хлороформі, зрівноважувалисистемою розчинників гексан — етилацетат(50:1) до повної стабілізації базової лінії.Зразок сухої тканини масою 400 мкг нано�сили на колонку в гексані й елюювали в сту�пінчастому градієнті системи розчинниківгексан — етилацетат у співвідношеннях:50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 2:1, 0:1. Отриму�вали сім фракцій, які аналізували методомтонкошарової хроматографії. Фракції І і ІІмали жовте забарвлення (жовті пігменти),відповідно фракції ІІІ, ІV і V — червоне забарв�лення (червоні пігменти), останні дві фрак�ції — синє забарвлення (сині пігменти).

Було розроблено умови швидкого виді�лення фракцій синіх пігментів. До етаноль�ного екстракту культури тканин додавали2–3% етанольного розчину Cu(OAc)2, прогрі�вали 3 хв при температурі 50–60 0С до повно�го осадження червоних пігментів, після чо�го наносили екстракт на колонку розміром1,5×7,0 (Silica gel 60). Eлюцію проводилиступінчасто системами бензол — етилацетат —оцтова кислота у співвідношеннях 3:1:0,1і 3:1:0,2. Отримали дві фракції: перша —розчин комплексу солей міді з червонимипігментами, друга — із синіми пігментами.

Тонкошарову хроматографію (ТШХ)здійснювали на пластинках Sorbfill УФ 254у системі розчинників гексан – етилацетат –оцтова кислота, 100:15:1 [9].

Гідроліз шиконінових похідних. Гекса�новий розчин шиконінових похідних змішу�вали з 0,1 н. NaOH, ресуспендували. Пігментикількісно переходили з гексану в луг, забарв�люючи його в інтенсивно�блакитний колір.NaOH нейтралізували 0,1 н. НСІ і екстрагу�вали похідні шиконіну петролейним ефірому ділильній воронці.

Спектральний аналіз. Кожну фракцію,яку в чистому вигляді було виділено із ко�лонки, висушували у роторному випарю�вачі, перерозчиняли у рівних об’ємах етано�лу і вносили до вимірювального приладу.

ваному живильному середовищі з мінераль�ною основою, розробленою А. Г. Волосови�чем зі співавторами (1979). Склад викорис�таного варіанта середовища 5С01 див. [6 ].

Біосинтез шиконінових пігментів іні�ціювали на модифікованому середовищіЛінсмайєр–Скуга (LS�м) [7].

Пророщували насіння та ініціювали ка�люсоутворення у пробірках об’ємом 30 мл,що містили 5 мл агаризованого живильногосередовища. Отриману культуру тканинE. plantagineum вирощували в плоскодон�них колбах об’ємом 100 мл, що містили 25 млсередовища, при температурі 25–27 0С безосвітлення за відносної вологості повітря70–80%.

Усі матеріали і складові живильних се�редовищ були вітчизняного виробництва.

Первинний добір культури на підвищенFня продуктивності за шиконіном. Неве�ликі частинки калюсу занурювали у рідкийпарафін «Парекс». Через декілька хвилинвідбувалась екстракція червоних пігментів.Перевагу надавали варіантам калюсу, щодавали найяскравіше забарвлення парафі�нового екстракту [8].

Матеріали та обладнання для біохімічнихдосліджень. Для рідинної хроматографії ви�користовували Silica gel 60 (Merck, Німеччина),пластинки для тонкошарової хроматографіїSilufoll (Czechlab, Чехія) та Sorbfill (Росія),Аl2О3 (Czechlab, Чехія). Хроматографію про�водили на хроматографі LKB Bromma (8300Uvicord II, Чехія). Для спектрофотометрич�ного аналізу застосовували спектрофотометрSpecord UV VIS (Carl Zeiss Jena), кількіснийвміст шиконіну визначали на фотоелектро�калориметрі Фотометр КФК�3. Решта реак�тивів —вітчизняного виробництва.

Методи біохімічних досліджень

Екстракція. Висушену до повітряно�су�хого стану при температурі 40 0С і подрібне�ну біомасу вичерпно екстрагували етаноломв апараті Сокслета, екстракт упарювалив ротаційному випарювачі. Залишок зали�вали етанолом при температурі 50–70 0С.Ресуспендували і змивали розчинником ши�коніновий осад зі стінок колби. Готували2–3%�й етанольний розчин Cu(OAc)2 абоCuCO3 і додавали його до розчину шиконіно�вих похідних, прогрівали 3 хв при темпера�турі 50–60 0С. Фільтрували розчин на скля�ному фільтрі під водострумним насосом.Фільтрат промивали етанолом, ацетоном,гексаном. Темно�фіолетовий осад висушува�ли і обробляли розведеною HCl (5–10%).

Трансгенные технологии составляют од�но из наиболее спорных достижений совре�менной науки, вызывая неослабевающую

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

58

тури пройшла відмінно. Культура активноросла, спостерігали також окремі червонозабарвлені мікроділянки калюсу. Калюс буввідносно щільним, складався з клітиннихагрегатів (глобул) розміром 1–3 мм.

Протягом другого пасажу на середовищіLS�м спостерігали масове утворення дрібнихниткоподібних корінців. Поверхневий шарцих корінців наприкінці пасажу синтезувавневелику кількість шиконіну, про що свід�чило червоне забарвлення. Калюс при цьомутакож набув бурого забарвлення (рис. 1, в).Утворення корінців можна пояснити дієюіндолілоцтової кислоти (ІОК), що входить доскладу середовища LS�м. Відомо, що невисо�ка концентрація ІОК (0,28–0,3 мг/л) спри�чинює ризогенез [11]. У цей період намипроведено первинний добір культури на під�вищений вміст шиконіну за допомогою рід�кого парафіну [8]. Як найперспективнішийза вмістом шиконіну й інтенсивністю ростувизначено варіант калюсу 3Ер, який утво�рював найменше корінців (рис. 2).

Отримані з різних насінин калюсні тка�нини синяка мали значні фенотипні відмін�ності (табл. 1). Порівняльні дані з продуктив�ності за похідними шиконіну подано в табл. 2.Через 20 пасажів варіант 5Ер загинув.

Відселектований калюс культури E. plant/agineum 3Ер накопичує 2,11% шиконіну насуху масу, маючи приріст біомаси 16 г/л затривалості пасажу 14 діб. Саме цей варіантотриманої калюсної культури тканин синя�ка використаний нами в подальшому длявирощування у вигляді суспензії, що є про�міжним етапом у створенні біотехнологіїодержання червоних пігментів.

Біохімія вторинних метаболітів. Підчас становлення культури тканин рослини

Аналіз проводили у двох режимах: перший —при ультрафіолетовому освітленні (200–300 нм),другий — у видимій частині спектра(300–700 нм).

Статистична обробка. Застосовували за�гальноприйнятий метод варіаційної статисти�ки [10]. Обчислення критерію Стьюдента вико�нували на ПК за допомогою програми Origin.

Результати та обговорення

Одержання первинних калюсів. Пер�винні калюси одержали з корінців насіннє�вих проростків синяка подорожникового насередовищі 5С01, яке розроблено для рослин�них культур тканин�суперпродуцентів [6].

Перші проростки синяка з’явились черезмісяць після перенесення на живильне сере�довище. З 35 насінин утворилося 6 пророст�ків. Проростки довжиною 2–3 см, що пере�бували на живильному середовищі тогосамого складу і торкались поверхні середо�вища, протягом 1–2 днів утворили калюс(варіанти 1Ер, 2Ер, 3Ер, 4Ер та 6Ер). Одназ насінин дала карликову рослинку розмі�ром 3 мм, яка на середовищі 5С01 упродовжтривалого часу не росла і не розвивалась.І тільки через два місяці утворився первиннийкалюс (варіант 5Ер). Первинні калюси, утво�рені з проростків різних насінин синяка, напочатку культивування були ідентичними.Вони складались із світло�коричневих клітин�них агрегатів розміром 2–3 мм (рис. 1, а). Од�нак через три пасажі варіант 1Ер загинув.

Через чотири місяці культивування пер�винний калюс було перенесено на живильнесередовище LS�м, розроблене для рослиннихкультур тканин, що продукують шиконін[7] (рис. 1, б). Адаптація всіх варіантів куль�

а вб

Рис. 1. Первинний калюс культури тканин синяка подорожникового Echium plantagineum:а — перетворення насіннєвого корінця на калюс (живильне середовище 5С01); б — 3�й пасаж калюсу на живиль�ному середовищі LS�м; в— 5�й пасаж: клітини калюсу починають синтезувати пігменти (стрілкою позначено чер�воний корінець)

полемику вокруг создаваемых ими возмож�ностей и порождаемых проблем. Поднимае�

Експериментальні статті

59

E. plantagineum у процесі її пасажування наживильному середовищі LS�м спостерігалимінливість кількісного і якісного складу ефі�рів шиконіну. Так, протягом перших па�сажів одразу після перенесення калюсу з жи�вильного середовища 5С01 на LS�м калюсформував багато червоноколірних корінців.Кірковий шар корінців синтезував шиконінта його похідні. Сам калюс також почав син�тезувати шиконінові пігменти (рис. 3).

Однак якісний склад етанольних екст�рактів калюсу і утворених корінців відріз�нявся. На тонкошарових хроматограмахв екстрактах, виділених із корінців, спос�терігали лише фракцію червоних пігментів,тимчасом як у калюсі поряд із червонимибули також і сині пігменти (рис. 4). Такийумовний розподіл шиконінових ефірів булозроблено на основі кольору плям на тонко�шаровій хроматограмі. Синтез клітинамипервинного калюсу E. plantagineum синіх

вба

Рис. 2. Селекція на підвищений вміст шиконінових пігментів калюсу культури Echium plantagineum L. на живильному середовищі LSKм: а, б, в — різні етапи селекції

Варіант калюсу E. plan/

tagineum

Характеристика агрегатів тканини

Розмір Структу�ра

Забарв�лення

Інтен�сивність

росту

2Ер

До2 см Щільна

Поверхнячастковочервоно�

бура,у розрізі —

світло�жовта

Інтен�сивний

3Ер

До3 мм

Се�редньої щіль�ності

Яскраво�червоне

Інтен�сивний

4Ер

До6 мм Щільна Буро�чер�

вонеПовіль�

ний

5ЕрДо

1 см

Середньої щіль�ності

Червоно�бурувате

Се�редній

6Ер

До5 мм Пухка Світле Інтен�

сивний

Таблиця 1. Фенотипні відмінності варіантів калюсуEchium plantagineum, отриманих з різних насінин

Таблиця 2. Вміст шиконінових ефірів, % від сухої маси

Па�саж№

Варіант калюсу Echium plantagineum

2Ер 3Ер 4Ер 5Ер 6Ер

5 Сліди 0,38±0,019 Сліди Сліди Сліди

13 0,36±0,018

0,94±0,047

0,39±0,019

0,95±0,047 Сліди

17 0,30±0,015

1,25±0,062

0,27±0,013

1,00±0,050 Сліди

19 0,29±0,014

1,24±0,062

0,85±0,042

0,52±0,026 Сліди

20 0,64±0,032

1,18±0,059

0,46±0,023

0,59±0,029

0,33±0,016

22 0,40±0,020

1,22±0,061

0,51±0,025 – 0,20±

0,010

в

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

60

пігментів, не характерних для культур —продуцентів червоних шиконінових пігмен�тів, можна пояснити стресовими умовами,в яких перебувають клітини рослини підчас калюсоутворення. При цьому змінюєть�ся реалізація генетичної інформації (акти�вуються репресовані або сплячі гени, діютьгени�модифікатори), припиняється синтезодних і починається утворення інших речо�вин вторинного синтезу. Проте з часом від�бувається пристосування рослинних клітин(калюсу) до нових умов існування і можемати місце зворотний процес, коли нетиповідля цієї рослини речовини, раніше чипізніше, припиняють синтезуватись і в ка�люсі [12].

Після гідролізу етанольного екстрактубіомаси синяка в 0,1 н. КОН з наступнимхроматографічним аналізом методом тонко�шарової хроматографії на силікагелі (див.розділ Матеріали і методи) було виявленоодну речовину червоного забарвлення(рис. 5). Методом спектрального аналізув ультрафіолетовій та видимій частинахспектра було встановлено максимуми по�глинання, а саме 275 нм, 490 нм, 520 нм

1 2

54321

Рис. 3. Тонкошарова хроматографія складу шиконінових похідних у різних частинах

первинного калюсу: 1 — етанольний екстракт калюсу E. plantagineum; 2 — етанольний екстракт корінців.Стрілками позначено:

червоні пігменти;сині пігменти

Рис. 4. Тонкошарова хроматографія етанольногоекстракту калюсу культури E. plantagineum:

1 — етанольний екстракт; 2 — етанольний екстракт після проведення гідролі�зу 0,1 н. розчином КОН

Рис. 5. Тонкошарова хроматографія етанольнихекстрактів різних пасажів варіанту 3 Ер

калюсної культури E. plantagineum: 1 — 3 Ер/7; 2 — 3 Ер/10; 3 — 3 Ер/13; 4 — 3 Ер/15; 5 — 3 Ер/17

1 2

Експериментальні статті

61

сорбційної хроматографії на колонці Silicagel 60 (рис. 4) і проаналізовано методомспектрального аналізу в ультрафіолетовій тавидимій частинах спектра. Максимуми пог�линання відповідають бензехінофуранам, асаме: 265 нм, 270 нм, 282 нм та 320 нм [13].

Порівняння якісного складу цих пігмен�тів у різних варіантах калюсної культури напізніших етапах культивування показало,що спектр барвників стає стабільним, тим�часом як кількість шиконінових пігментівможе варіювати.

Таким чином, у культуру in vitro введеносиняк подорожниковий E. plantagineum L.Первинні калюси отримали з корінців на�сіннєвих проростків на середовищі 5С01,створеному для рослинних культур тканин�суперпродуцентів. Одержані калюсні ткани�ни адаптовано до середовища LS�м, розроб�леного для синтезу шиконінових похідних.

Визначено якісний склад пігментів, щосинтезують клітини отриманих калюсів.З’ясовано, що на перших етапах становлен�ня культури тканин E. plantagineum клітиниразом із червоними синтезують сині пігмен�ти, які також належать до похідних ши�коніну. Однак через 1,5 року культивуванняв культурі виявлено тільки червоні пігмен�ти. Це явище можна пояснити процесамиадаптації клітин рослини E. plantagineum до

і 556 нм, які відповідають шиконінам [13].Тому нами зроблено висновок, що червоні тасині пігменти є похідними шиконіну.

У процесі подальшого пасажування і про�ведення селекції калюсів, спрямованої навідбір зразків, в яких ризогенез був відсут�ній, кількість синіх пігментів у етанольно�му екстракті калюсів знижувалась на фоністабільного загального вмісту шиконіновихпохідних (рис. 6).

Нами було виділено окремо фракціюсиніх пігментів з етанольного екстракту ме�тодом титрування CuAc2, який з шиконіна�ми утворює нерозчинний осад в органічнихрозчинниках [7], і подальшим хроматогра�фуванням на колонці (Silica gel 60). Порів�няння етанольного екстракту калюсу E. plan/tagineum та очищеної фракції синіхпігментів на тонкошаровій хроматограмі на�ведено на рис. 7.

Було підібрано також умови для розді�лення пігментів на колонці Silica gel 60 безпопереднього осадження у вигляді нероз�чинного комплексу (див. розділ Матеріалиі методи). Попередній метод розділенняє досить зручним і швидким, оскільки ба�зується на двостадійній елюції, однак він,на відміну від останнього, не забезпечує роз�ділення інших ефірів шиконіну .

Окрім шиконінових ефірів культура тка�нин синяка синтезувала два пігменти жов�того кольору, які було виділено методом ад�

1 2 3

21

Рис. 7. Тонкошарова хроматографія бензехінофуранів калюсної культури

тканин E. plantagineum: 1 — сумарний склад бензехінофуранів; 2, 3 — очищені методом адсорбційної хроматогра�

фії на силікагелі фракції бензехінофуранів

Рис. 6. Тонкошарова хроматографія одержаноїфракції синіх пігментів:

1 — етанольний екстракт калюсу E. plantagineum;2 — очищена фракція синіх пігментів.Стрілками позначено:

червоні пігменти;сині пігменти

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

62

сухій масі, маючи приріст біомаси 16 г/л затривалості пасажу 14 діб. Цей варіант калю�су використано нами в подальшому для ви�рощування синяка у вигляді суспензійноїкультури, що є проміжним етапом у ство�ренні біотехнології одержання червонихнафтохінонових пігментів.

Особлива подяка співробітникам відділуквітникарства Національного ботанічногосаду ім. М. М. Гришка НАН УкраїниС. Машковській та Р. Іваннікову за наданедля роботи насіння синяка подорожниково�го E. plantagineum L.

умов in vitro. Спостерігали також утворенняневеликої кількості жовтих пігментів із кла�су бензехінофуранів. На пізніх стадіях ста�новлення різні варіанти калюсу маливідмінності тільки в кількості червонихпігментів, якісний склад був подібним.

Методом добору дрібних клітинних агре�гатів проведено початкову селекцію напідвищену продуктивність за похіднимишиконіну. Відібрано найбільш перспектив�ний за показниками продуктивності варіанткультури тканин (клітинна лінія E. plan/tagineum 3Ер).

Відселектована клітинна лінія синяка3Ер накопичує 2,11% похідних шиконіну у

1. Доброчаева Д. Н. Бурачникоцветные(Boraginales Hutch.) Европейской частиСССР: Дис. … докт. биол. наук: 03.00.12 —К., 1977. — С. 269–290.

2. Растительные ресурсы СССР. Цветковыерастения, их химический состав, использо�вание. Семейства Caprifoliaceae — Plantagi/naceae / Под ред. П. Д. Соколова. — Л.: Нау�ка, 1990. — С. 109–133.

3. Papageorgiou V. P., Assimopoulou A. N., Coula/douros E. A. et al. The Chemistry and Biologyof Alkannin, Shikonin, and Related Naphtha�zarin Natural Products //Angew. Chem. Int.Ed. — 1999. — V. 38. — P. 270–300.

4. Pietrosiuk A., Syklowska/Baranek K., Wieden/feld H. et al. The shikonin derivatives andpyrrolizidine alkaloids in hairy root culturesof Lithospermum canescens (Michx.) Lehm. //Plant Cell Rep. — 2006. — V. 25. —P. 1052–1058.

5. Барабой В. А. Растительные фенолы и здо�ровье человека. — М: Наука, 1984. — 160 с.

6. Кунах В. А., Можилевская Л. П., Потап/чук Е. А. и др. Получение культуры тканейUngernia Victoris и её особенности при выра�щивании на питательных средах различно�го состава // Биотехнология. — 2007. —№ 1. — С. 14–21.

7. Давыденков В. Н., Патудин А. В., Попов Ю. Г.и др. Культура клеток Arnebia euchroma(Royle) Jonst — новый источник полученияшиконина // Хим.�фарм. журн. — 1991. —№ 1. — С. 53–55.

8. Zakhlenjuk O.V., Kunakh V.A. Arnebiaeuchroma: In vitro culture and the produc�tion of shikonin and other secondarymetabolites // Biotechnology in agricultureand forestry. — V. 41. — Berlin; Heidel�berg: Springer�Verl., 1998. — P. 28–44.

9. Федореев С. А., Денисенко В. А., Булга/ков В. П. Исследование химического соста�ва хиноидных пигментов из клеточнойкультуры ВК�39 Lithospermum erythrorhi/zon // Хим.�фарм. журн. — 1993. — №1. —С. 33–37.

10. Поллард Дж. Справочник по вычислитель�ным методам статистики. — М.: Финансыи статистика, 1982. — 344 с.

11. Голубенко А. В. Морфогенез та особливостівегетативного розмноження видів родуGentiana L. in vitro: Автореф. дис. … канд.біол. наук.: 03.00.12. — К., 2005. — С. 17.

12. Кунах В. А. Біотехнологія лікарських рос�лин. Генетичні та фізіолого�біохімічні ос�нови. — К.: Логос, 2005. — 730 с.

13. Bang Y. H., Jai S. R. Monoamine OxidaseIngibitory Nahptoquinones from the Rootsof Lihtospermum erythrorhizon // Arch. Pharm.Res. — 2005. — V. 28, N 4. — P. 400–404.

ЛІТЕРАТУРА

Експериментальні статті

63

GENERATION OF Echium plantagineum L.TISSUE CULTURE

WHICH IS PRODUCENT OF SHIKONIN PIGMENTS

О. О. PoronniкV. А. ShablijV. А. Кunakh

Institute of Molecular Biology and Geneticsof National Academy of Sciences of Ukraine,

Kyiv

E/mail: oksana_poronnik@ukr.net

E. plantagineum tissue culture has been gen�erated from the roots of seed shoots on 5C01agarized nutrient medium. Cultivation on theLS�m nutrient medium induced biosynthesis ofthe red shikonin pigments. Variant of callus tis�sue (3Ep), accumulating 2.11% of shikoninderivatives per dry biomass whose yield on the14th day of growth constituted up to 16 mg/L ofnutrient medium was selected. Through the thinlayer chromatography (in Sorbfill UV 254 pla�tes) and column chromatography (Silica gel 60)there was evaluated the spectrum of shikoninderivatives in the course of culture establish�ment. Organogenic culture at the first steps ofculturing on the LS�m nutrient medium wasfound to synthesize alongside with red fractionsof shikonin pigmentes the blue ones as well. Butafter 1,5 year of cultivation Echium callus cellssynthesized exclusively red fractions of shiko�nin pigments.

Key words: Echium plantagineum L., plant tissue cul�ture, red pigments, shikonin derivatives, cell lines,producents of biologically active substances.

ПОЛУЧЕНИЕ КУЛЬТУРЫ СИНЯКА ПОДОРОЖНИКОВОГО

(Echium plantagineum L.) — ПРОДУЦЕНТА ШИКОНИНОВЫХ

ПИГМЕНТОВ

О. А. ПоронникВ. А. Шаблий

В. А. Кунах

Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев

E/mail: oksana_poronnik@ukr.net

Получена культура тканей E. plantagineumиз корешков семенных проростков на агаризо�ванной питательной среде 5С01. Культивиро�вание на питательной среде LS�м инициировалобиосинтез красных шикониновых пигментов.Отселектирован вариант каллюсной культуры(3Ер), накапливающий 2,11% производныхшиконина от сухой биомассы, выход которойна 14�е сутки роста составляет 16 г/л пита�тельной среды. Методами тонкослойной хро�матографии (на пластинках Sorbfill УФ 254)и хроматографии на колонке (Silica gel 60) ис�следован спектр шикониновых производных впроцессе становления культуры. Установлено,что органогенная культура на первых етапахкультивирования на питательной среде LS�мнаряду с красными фракциями шикониновыхпигментов синтезировала и синие. Однако че�рез 1,5 года культивирования клетки каллусасиняка синтезировали только красные фрак�ции шикониновых пигментов.

Ключевые слова: Echium plantagineum L., культу�ра тканей растений, красные пигменты, производ�ные шиконина, клеточные линии — продуцентыбиологически активных веществ.

64

Визначення концентрації гліцеролу маєособливо велике значення у виноробстві.Необхідність і важливість детекції цьогопродукту бродіння можна пояснити тим, щоз усіх компонентів вина кількісно він посту�пається лише етиловому спирту. Загальнакількість гліцеролу, яка формується упро�довж процесу ферментації сусла, становитьвід 1:10 до 1:15 кількості спирту з кінцевоюконцентрацією від 1 до 10 г/л [2]. Вагомуроль гліцерол відіграє у формуванні смакувин, наданні їм маслянистості та м’якості[2–4]. Саме тому точні відомості про наяв�ність та концентрацію гліцеролу в алкоголь�них напоях є важливим показником їхньоїякості.

Визначення вмісту гліцеролу є такожважливим у клінічній діагностиці для конт�ролю рівня триацилгліцеридів у крові,оскільки моніторинг цих сполук має прог�ностичне значення для зменшення ризикузахворювань серцево�судинної системи [5].

Сучасні стандартні методи визначення глі�церолу, такі як рідинна хроматографія та спект�рофотометричні підходи на основі хімічнихі ферментативних реакцій, зокрема оксидаз�но�пероксидазний метод [6, 7], потребують

Гліцерол є одним із метаболітів спирто�вого бродіння, його широко використовуютьу виробництві та фармакології. Ще в 1857 ро�ці Л. Пастер у своїх класичних досліджен�нях алкогольного бродіння показав, щокрім головних продуктів бродіння — спиртута вуглекислоти — утворюються побічніпродукти, у тому числі й гліцерол (2,5–3,6 гна 100 г збродженого цукру) [1]. Великакількість гліцеролу утворюється у процесібродіння сусла в присутності бісульфітунатрію. У цьому разі оцтовий альдегід, якийзазвичай є акцептором водню, зв’язуєтьсябісульфітом, а його місце у ланцюгу пере�творень займають діоксіацетофосфат та 3�фос�фогліцероловий альдегід; вони отримуютьводень від відновленого коферменту НАД·Н2,утворюючи 1�гліцерофосфат, який у резуль�таті дефосфорилювання перетворюється нагліцерол. Таке бродіння називається гліце�ропіруватним і має найбільшу інтенсивністьу перші фази процесу бродіння. Воно віді�грає важливу роль у синтезі багатьох вто�ринних продуктів, які впливають на якістьвина [1]. Гліцерол також утворюється в томуразі, якщо бродіння сусла відбуваєтьсяв лужному середовищі.

НОВІ МЕТОДИ

Проведено порівняльний аналіз ефективності використання різних за способом одержання та характеристи�ками препаратів гліцеролоксидази для створення амперометричного біосенсора, призначеного для визначеннявмісту гліцеролу. Вибрано препарат ферменту, після іммобілізації якого на поверхню перетворювача сенсор де�монструє найкращі аналітичні характеристики. Визначено рН�оптимум роботи амперометричного біосенсора,показано, що величина буферної ємності та концентрація фонового електроліту не впливають на його роботу. Задопомогою створеного амперометричного біосенсора на основі іммобілізованої гліцеролоксидази здійсненоаналіз гліцеролу у модельних розчинах.

Горюшкіна Т. Б.1, 2

Шкотова Л. В.1 1Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, КиївГайда Г. З.3 2Київський національний університет імені Тараса ШевченкаКлепач Г. М.3, 4 3Інститут біології клітини НАН України, ЛьвівГончар М. В.3 4Дрогобицький державний педагогічний університет ім. Івана ФранкаСолдаткін О. П.1 Е/mail: dzyad@yahoo.comДзядевич С. В.1

УДК 577.15 + 543.6 + 543.9 + 543.55

НОВИЙ АМПЕРОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР НОВИЙ АМПЕРОМЕТРИЧНИЙ БІОСЕНСОР

НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРОЛОКСИДАЗИ НА ОСНОВІ ГЛІЦЕРОЛОКСИДАЗИ

ДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ГЛІЦЕРОЛУДЛЯ ВИЗНАЧЕННЯ ВМІСТУ ГЛІЦЕРОЛУ

Ключові слова: амперометричний біосенсор, гліцеролоксидаза, гліцерол, іммобілізація, електрохімічнаполімеризація.

Нові методи

65

наявності кваліфікованого персоналу, склад�ного й дорогого обладнання, необхідного дляпроведення рідинної хроматографії та спект�рофотометрії. Ще одним недоліком зазначе�них методів є потреба у досить складній по�передній підготовці проб для аналізу.

Відомі фірми Boehringer Mannheim (Ні�меччина) та Sigma (США) пропонують тест�на�бори для ферментативного аналізу гліцеролу.Висока вартість наборів часто зумовлена не�обхідністю використання кількох ферментівта коферментів або косубстратів. Наприклад,мультиферментна система [8] включає триферменти — гліцеролкіназу, піруваткіназу талактатдегідрогеназу, а також потребує при�сутності коферменту — NADH і двох косуб�стратів — ATP та фосфоенолпірувату:

гліцеролкіназаГліцерол + ATP ——→Гліцеролфосфат + ADP;

піруваткіназаФосфоенолпіруват + ADP → Піруват + ATP;

лактатдегідрогеназаПіруват + NADН(Н+) ——→ Лактат + NAD+.

За цим методом концентрацію гліцеролувизначають за зменшенням кількості спо�житого NADH, який реєструють фотомет�рично при довжині хвилі 340 нм.

Іншим методом для визначення вмістугліцеролу є двоферментний, у першому ва�ріанті якого використовують гліцеролкіна�зу і гліцерол�3�фосфатдегідрогеназу, а моні�торинг реакції здійснюють за утвореннямNADH(Н+) при 340 нм:

гліцеролкіназаГліцерол + ATP ——→ Гліцерол�3�фосфат +

+ ADP

гліцерол�3Р�дегідрогеназаГліцерол�3�фосфат + NAD+ ——→ Дигідроксі�

ацетонфосфат ++ NADН(Н+).

У другому варіанті двоферментного мето�ду гліцерол�3�фосфатдегідрогеназна реакціязамінена на гліцерол�3�фосфатоксидазну,що покладено в основу діагностичного набо�ру для визначення гліцеролу:

гліцерол�3Р�оксидазаГліцерол�3�фосфат + О2 ——→ Дигідроксі�ацетонфосфат + Н2О2

пероксидазаН2О2 + хромоген (�2Н) ——→ Барвник + 2Н2О.

Третій метод для визначення вмісту глі�церолу — дегідрогеназний — ґрунтується навизначенні кількості NADH(Н+), генерова�ного в результаті ферментативної реакції,каталізованої гліцеролдегідрогеназою:

гліцеролдегідрогеназаГліцерол + NAD+ ——→ Гліцеральдегід +

NADН(Н+).

Використання цього методу в аналітичнійпрактиці є ускладненим, оскільки реакціяокиснення гліцеролу гліцеролдегідрогена�зою є оборотною, а фермент — недостатньоселективний.

Традиційні ферментативні підходи длявизначення гліцеролу недостатньо селек�тивні, як і в разі дегідрогеназних реакцій,або неекономічні у повсякденному викорис�танні їх в лабораторії. З огляду на це сьогод�ні є актуальним питання створення більшзручного, точного, селективного, швидкогота дешевого методу визначення вмісту гліце�ролу в різноманітних харчових продуктах.

Розроблення та створення ферментнихбіосенсорів для визначення вмісту гліцеро�лу може вирішити проблеми, пов’язані з пе�реліченими вище недоліками, та задоволь�нити усім вищезазначеним вимогам.Головна перевага біосенсорів — висока спе�цифічність, швидкість отримання резуль�татів, легкість оброблення даних та низькасобівартість аналізу.

На цей час розроблено й досліджено чи�мало біосенсорів, призначених для детекціїгліцеролу. Їх було створено на основі фер�ментів гліцеролдегідрогенази [4, 9] та гліце�ролкінази, коіммобілізованої з гліцерол�3�фосфатоксидазою [2]. В останньому випадкуголовним недоліком створеного біосенсорабула його низька стабільність: після трьохднів зберігання в робочому буфері залиша�лось 10% активності ферментів. У разі вико�ристання гліцеролдегідрогенази істотнимнедоліком біосенсора, який суттєво підви�щує собівартість аналізу, є те, що цей фер�мент не містить у своєму складі кофактору(НАД), а тому його потрібно вводити в систе�му додатково. При цьому НАД може легкодифундувати з ферментативної мембрани,спричинюючи значне зниження чутливостібіосенсора [9].

Створення амперометричного біосенсорана основі гліцеролоксидази (ГО) може статигідною уваги альтернативою вищезазначе�ним датчикам, адже цей фермент ужемістить у своїй структурі природний кофак�тор — ФАД.

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

66

Схема А — фракціонування ацетоном.До БЕ (питома активність ГО —0,16–0,2 мкмоль·хв–1·мг–1 білка) додавалиохолоджений (–25 0С) ацетон до 10 %, інку�бували 30 хв при –10 0С, центрифугували(15 000 об/хв, rсер = 8 см, 30 хв, –10 0С).Осад відкидали, до супернатанту додавалипорцію (1:1) ацетону — до 55 %, інкубували30 хв при –10 0С, осад збирали центрифугу�ванням, суспендували у ББ. Суспензіюосвітлювали центрифугуванням, осад відки�дали. Екстракт 55%�го осаду містив ГО.

Схема К — колонкова хроматографія.БЕ наносили на колонку з бацитрацин�си�лохромом, зрівноважену ББ, з інгібіторамипротеаз, промивали сорбент 3�кратнимоб’ємом буфера ББ. Проскок і промивні роз�чини містили ГО.

Хроматографічне очищення ферментуна аніонообмінному сорбенті. Розчини, щомістили первинноочищені препарати ГОз питомою активністю 0,25–0,5 мкмоль·хв–1·мг–1

білка, наносили на колонку з аніонітнимсорбентом целюлозної природи — DЕАЕ�Toyopearl 650 M (TSK�Gel, Японія), зрівно�важену ББ. ГО елюювали 0,2–1М NaCl або20%�м (від насичення, при 0 0С) розчиномсульфату амонію у вихідному ББ, у кожнійфракції визначали питому активність ГО.Фракції елюатів, у яких активність ГО булавищою за 1,5 мкмоль·хв–1·мг–1 білка, об’єд�нували. Фермент концентрували і додатко�во очищували осадженням сульфатомамонію до 70% (від насичення, при 0 0С).Осад збирали центрифугуванням, розчиня�ли в мінімальному об’ємі ББ, визначали ак�тивність ГО і каталази [15]. До препаратівГО додавали різні стабілізувальні додаткиі зберігали при 0 0С.

Як полімерну матрицю для електрохі�мічного нанесення ферменту використову�вали мономер 3,4�етилендіокситіофен (ЕДТ)виробництва фірми Baytron M (Німеччина)та поліетиленгліколь ММ=1450 фірми Sig�ma (США).

Також у роботі застосовували реагенти:Na2HPO4 · 7H2O, KH2PO4, KCl, NaOH тагліцерол вітчизняного виробництва. Усі ре�активи, як вітчизняного, так й імпортноговиробництва, були кваліфікації «ос. ч.»і «х. ч.».

Вимірювання. Усі електрохімічні експе�рименти було виконано за допомогою тра�диційної триелектродної системи, в якійдрукований електрод SensLab (SensLabGmbH, Leipzig, Німеччина) об’єднував у собівсі три електроди: платиновий робочий, до�поміжний та електрод порівняння [16].

На сьогодні на ринку ферментів ГО від�сутня, а відтак актуальною проблемою зали�шається пошук продуцентів ГО і розроблен�ня ефективних методів очищення цьогоферменту. ГО виявлена у низки плісеневихгрибів роду Aspergillus, Penicillium [10],Neurospora [11], Botrytis [12], а також акти�номіцетів. У високоочищеному стані фер�мент виділено тільки із трьох видів — Asper/gillus japonicus [5], Penicillium sp. [13]і Botrytis allii [14]. У попередніх досліджен�нях нами було проведено скринінг серед по�тенційних продуцентів ГО — штамів плісе�невих грибів, обрано джерело ферменту —гриб B. allii 100(5), визначено оптимальніумови культивування клітин продуцентадля забезпечення максимального синтезуГО [15], розроблено методи отриманнябезклітинних екстрактів і схеми виділеннята очищення ферменту, запропоновано спо�соби стабілізації препаратів ГО та показаноможливість біоаналітичного використанняферменту [20].

Метою даної роботи було розробленняамперометричного біосенсора на основі пла�тинового друкованого електрода SensLab(SensLab GmbH, Leipzig, Німеччина) з іммо�білізованою ГО та оптимізація його робочиххарактеристик.

Матеріали і методи

У роботі використовували препарати ГО,одержані з плісеневого гриба B. аllii, штам100 (5) [15]. Клітини гриба вирощували 3 до�би в колбах об’ємом 500 мл при 28 0С на шей�кері за постійної аерації (200 об/хв) на сере�довищі з рН 3,0–3,5 такого складу, г/л:КNO3 — 3,5, KH2PO4 — 3, NaCl — 0,5,MgSO4·7H2O — 0,5, СаCl2 — 0,03, CuSO4 · 5H2O —0,001, гліцерол 60, меляса — 2 (компонентисередовища розчиняли у водопровідній во�ді); клітини гриба відмивали водою, ресус�пендували у 50 мМ боратному буфері (ББ),рН 9,18, заморожували і зберігали при–20 0С. Для отримання безклітинного екст�ракту (БЕ) міцелій гриба руйнували меха�нічним розтиранням у ступці, з охолоджен�ням, у присутності інгібіторів протеаз —2 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти(ЕДТА), 0,5 мМ фенілметилсульфонілфто�риду, 0,1 мМ м�амінофенілборної кислоти та10 мкМ лейпептину. БЕ відокремлювали відуламків клітин центрифугуванням (15 000 об/хв,rсер=8 см, 30 хв, 4 0С), визначали активність[15] та концентрацію білка за Лоурі.

Первинне очищення ГО із БЕ проводилиза схемами А або К.

Нові методи

67

Платинові друковані електроди SensLabдосліджували на відтворюваність та працез�датність у діапазоні потенціалу від 0 до+300 мВ (швидкість розгортання потенціа�лу становила 20 мВ/с). Циклічну вольтам�перометрію було виконано на потенціостатіПІ�50�11 (Україна).

Амперометричне вимірювання припостійному потенціалі проводили в елект�рохімічній комірці об’ємом 5 мл за допомо�гою потенціостата ПІ�50�11(Україна) тапрограматора ПР�8 (Україна).

Іммобілізація ГО електрохімічною поліKмеризацією у поліK(3,4KетилендіокситіофеKні) (ПЕДТ). Процес електрохімічної поліме�ризації становить особливий інтерес,оскільки є технологічно зручним. Він дозво�ляє вибирати і підтримувати розмір, формуй товщину матриці та забезпечує чіткийконтроль за процесом осадження [17].

ПЕДТ належить до родини політіофенів —електропровідних полімерів з відносно но�вими та досить цікавими властивостями.Виконані з ними дослідження [18] демон�стрували слабку провідність, невелику змі�ну заряду, підвищену стабільність і дужедобру здатність до формування плівки. EДTє комерційним продуктом фірми Baytron,який нещодавно надійшов на ринок відфірми Bayer AG (Німеччина).

Гомогенна плівка ПEДT фіксується наповерхні робочого електрода, заполімеризо�ваного електрохімічно ЕДТ, за умов нейт�рального рН та температури. Формуванняплівки відбувається краще у водних та, як�що є можливість, гідрофільних полімерахтипу полівінілпіролідон (ПВП) чи поліети�ленгліколь (ПЕГ), розчинених у воді з елект�рополімеризуючим розчином. При цьомупідвищується гідрофільність полімеру, щонаноситься. Окиснення та відновлення зале�жать від прикладеного потенціалу, якийконтролює формування позитивного зарядув структурі полімеру. Для ПEДT є докази,що поліаніони як олігонуклеотиди можутьбути ефективно утримані у полімерній сітці,що працює за слабкої іонної сили [19].

Для електрохімічної полімеризації в ро�боті використовували суміш компонентів,приготованих у 20 мМ фосфатному буферіз рН 6,2, яка складалася з 10–2 М 3,4�ети�лендіокситіофену, 10–3 М поліетиленгліко�лю та розчину ГО.

Полімеризацію ЕДТ здійснювали, при�кладаючи потенціал від +0,2 В до +1,5 В зішвидкістю 0,1 В/с протягом 15 циклів.

Визначення гліцеролу у модельних розKчинах. Вимірювання проводили у 100 мМ К,

Na�фосфатному буферному розчині, рН 7,2,при кімнатній температурі у відкритіймісткості за інтенсивного перемішування.Концентрації субстратів змінювали, додаю�чи певні аліквоти концентрованих розчинів.

Після отримання кожного відгуку сен�сор відмивали буферним розчином достабілізації базового сигналу.

Результати та обговорення

В основі роботи амперометричної систе�ми для визначення вмісту гліцеролу лежитьферментативна реакція:

гліцеролоксидазаГліцерол + О2 ——→ Гліцеральдегід + Н2О2.

Процес ферментативного перетвореннягліцеролу супроводжується утвореннямелектрохімічно активної речовини — перок�сиду водню, який окиснюється з утворен�ням електронів, які, у свою чергу, можнареєструвати за допомогою амперометрично�го перетворювача:

Н2О2 ——→О2 + 2Н+ + 2е–.

Відсутність комерційного препаратуферменту спонукала виділити ГО з обраногоштаму�продуцента плісеневого гриба B. allii[штам 100(5)] [15]). Запропоновані схеми ви�ділення та очищення ферменту із безклітин�ного екстракту гриба, які включали стадіюпервинного очищення ГО за схемами А(фракціонування ацетоном) або К (колонко�ва хроматографія) з наступним хромато�графічним очищенням ферменту на аніоно�обмінному сорбенті, дозволили одержатипрепарати ГО з питомою активністю до5,7 мкмоль·хв–1·мг–1 білка, тобто очиститифермент у 30 разів [20]. Було доведено стабі�лізувальний вплив іонів Mn2+ (5–10 мМ),Са2+ (1–2 мМ),сульфату амонію (20–70% віднасичення при 0 0С), 1 мМ EДTA, сахарози(50%) та поліетиленіміну (ПEI) (0,05%) наактивність ГО у розчині, тому саме ці сполу�ки додавали до очищених препаратів ГО, якібуло використано для іммобілізації наелектродах у процесі створення гліцеролсе�лективного біосенсора (табл. 1).

На першому етапі роботи з конструюван�ня біосенсора на поверхню амперометричногоперетворювача було іммобілізовано всі одер�жані препарати ГО. У ході порівняльногоаналізу біосенсорів досліджували їхні діапа�зони роботи, граничні концентрації гліцеро�лу, що визначаються сенсором, а також їхнюстабільність під час зберігання (табл. 2).

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

68

гліцеролу в експериментальну комірку.Форма відгуків була типовою для фермент�них біосенсорів. Окрім того, з рисунка видно,що величини відгуків на додавання однаковихкількостей гліцеролу були теж однакові.

На подальшому етапі роботи було визна�чено рН�оптимум роботи амперометричногобіосенсора з іммобілізованою ГО №1. Опти�мум роботи амперометричного біосенсораз ГО, іммобілізованою у ПЕДТ, спостерігає�ться при рН 7,2 (рис. 3). Отримані результа�ти добре корелюють з даними літератури,згідно з якими рН�оптимум роботи ГО у роз�чині становить близько 7,0 [13, 21].

На рис. 1 наведено калібрувальні кривілабораторних прототипів амперометричнихбіосенсорів, одержаних на основі різнихпрепаратів ГО.

Виходячи з отриманих результатів, дляподальшої роботи було обрано препарат ГО№1, який характеризувався лінійною залеж�ністю величини відгуку біосенсора від кон�центрації гліцеролу в діапазоні 0,05–25,6 мМ,мінімальною концентрацією гліцеролу, щовизначається, — 0,05 мМ та кращою ста�більністю порівняно з іншими препаратами.

На рис. 2 зображено відгуки амперомет�ричного біосенсора на послідовне внесення

Таблиця 1. Характеристика препаратів гліцеролоксидази, які було досліджено у процесі створення біосенсорів для визначення гліцеролу

№пре�па�

рату

Cхема первин�

ного очи�щення

Характеристика препаратів ГОКількість ГО у біомембрані

Активність

Стабілізувальні додатки у 50 мМ ББ, рН 9,18Домішкикаталази

мкг од. 10–3

відносна,од./мл

питома,од./мг

1 А 1,4 1,4 70% СА; 5 мМ MnCl2; 1 мМ EДTA; 0,05%ПEI – 0,84 4,2

2 А 0,8 5,7 70% СА; 1мM CaCl2; 1 мМ EДTA; 0,05%ПEI – 0,42 2,4

3 А 1,0 2,0 70% СА; 1 мM CaCl2; 0,05%ПEI + 1,5 3,0

4 К 1,5 1,7 1 М NaCl; 1 мM MnCl2 – 2,7 4,6

5 К 1,0 2,0 0,3 М NaCl; 1 мM CaCl2; 0,05%ПEI – 1,5 3,0

6 А 0,3 3,0 1М NaCl; 1 мM MnCl2 ;50% сахароза – 0,3 0,9

7 К 1,6 2,5 70% СА; 5 мМ MnCl2; 0,05%ПEI – 2,0 4,9

8 К 0,9 1,5 70% СА; 5 мМ MnCl2; 0,05%ПEI + 1,8 2,7

9 К 1,3 1,8 70% СА; 5мМ MnCl2; 0,05%ПEI + 2,2 3,9

Примітка. СА — сульфат амонію; ПЕІ — поліетиленімін; ЕДТА — етилендіамінтетраоцтова кислота.

Таблиця 2. Порівняльний аналіз лабораторних прототипів амперометричних біосенсорів, створених на основі різних препаратів гліцеролоксидази

№ препа�рату ГО

Активністьпри

іммобілізаціїу чутливумембрану

Мінімальнадетектована

концентраціягліцеролу

Лінійнийдіапазон роботи

сенсораСтабільність сенсора під час зберігання

1 + 0,05 мМ 0,05–25,6 мМ 75% активності через 15 діб, 14% — через 40 діб

2 – – – –

3 + 0,002 мМ 0,002–6,4 мМ 30% активності через 4 доби

4+

Низький сигнал

0,002 мМ 0,002–0,05 мМ 10% активності через 3 доби

5 – – – –

6 – – – –

7 – – – –

8 + 0,2 мМ,з часом 0,8 мМ 0,2–25,6 мМ 10% активності через 5 діб

9 + 0,2 мМ 0,2–25,6 мМ 10% активності через одну добу

Нові методи

69

сенсора знижується в середньому на 2,5% за до�бу, а після 50 днів зберігання сенсора відгук надодавання гліцеролу був майже відсутній(рис. 6).

Таким чином, здійснено порівняльнийаналіз ефективності використання різних заспособом одержання та характеристикамипрепаратів ГО з метою створення амперо�метричного біосенсора для визначення вміс�ту гліцеролу. Встановлено, що біосенсор наоснові препарату ГО №1 (схема первинногоочищення А, питома активність — 5 од./мг,стабілізувальні додатки — 70%�й сульфатамонію; 5 мМ MnCl2; 1 мM EДTA; 0,05%�йполіетиленімін у 50 мМ боратному буфері,рН 9,18) демонструє найкращі робочі харак�теристики — лінійний діапазон у межах

Дослідження впливу концентрації фоново�го електроліту в буфері та буферної ємності нароботу амперометричного біосенсора показа�ло, що їх зміна істотно не впливає на величинувідгуку (рис. 4, 5). Це є типовою ситуацією дляферментних амперометричних біосенсорів.

Було вивчено стабільність амперометрично�го біосенсора на основі іммобілізованої гліцеро�локсидази і встановлено, що величина відгуку

Рис. 3. Залежність величини відгуку амперометKричного біосенсора на основі гліцеролоксидази,

іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенням, від рН розчину.

Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному бу�фері, потенціал +300 мВ відносно електроду

порівняння. Концентрація гліцеролу в комірці:3,2 мМ (1); 1,6 мМ (2); 0,8 мМ (3); 0,4 мМ (4)

Рис. 1. Калібрувальні криві лабораторних протоKтипів амперометричних біосенсорів, одержанихелектрохімічною полімеризацією у ПEДT на осK

нові різних препаратів гліцеролоксидази. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному

буфері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносновнутрішнього електроду порівняння

Рис. 5. Залежність величини відгуку амперометKричного біосенсора на основі гліцеролоксидази,

іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенKням, від концентрації буферного розчину.

Концентрація гліцеролу в комірці: 1,6 мМ (1);0,8 мМ (2); 0,4 мМ (3); 0,2 мМ (4); 0,1 мМ (5)

Рис. 4. Залежність величини відгуку амперометричKного біосенсора на основі гліцеролоксидази,

іммобілізованої у ПЕДТ електрохімічним нанесенKням, від концентрації фонового електроліту в буфері. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному буфері,

рН 7,2, потенціал +300 мВ відносно електроду порів�няння. Концентрація гліцеролу в комірці: 6,4 мМ (1);

3,2 мМ (2); 1,6 мМ (3); 0,8 мМ (4); 0,4 мМ (5)

Рис. 2. Відгук амперометричногобіосенсора з іммобілізованоюелектрохімічною полімериK

зацією у ПEДT гліцеролоксидаKзою на 25,6 та 51,2 мМ гліцеролу

Гліцерол, мМ

Концентрація фонового електроліту, мМ

Концентрація фосфатного буфера, мМ

рН

Від

гук

біо

сен

сор

а, н

А

Від

гук

біо

сен

сор

а, н

А

Від

гук

біо

сен

сор

а, н

А

Від

гук

біо

сен

сор

а, н

А

1

5

4

32

1

43

2

1

54

3

2

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

70

0,05–25,6 мМ гліцеролу і мінімальну конце�нтрацію гліцеролу, що визначається, —0,05 мМ, та зберігає 75% своєї активностічерез 15 діб після іммобілізації у чутливумембрану.

Визначено рН�оптимум роботи створено�го амперометричного біосенсора на основііммобілізованої електрохімічною полімери�зацією ГО у ПEДT, який становить 7,2. По�казано, що величина буферної ємності таконцентрації фонового електроліту в буферіне впливає на роботу біосенсора. За допомо�гою створеного амперометричного біосенсо�ра на основі іммобілізованої ГО проведеноаналіз концентрації гліцеролу в модельнихрозчинах.

Роботу виконано за фінансової підтрим�ки НАН України в рамках комплексної нау�ково�технічної програми «Сенсорні системидля медико�екологічних та промислово�тех�нологічних потреб».

Рис. 6. Стабільність амперометричного біосенсорана основі іммобілізованої електрохімічною полімеK

ризацією гліцеролоксидази у ПEДT. Вимірювання проводили у 100 мМ фосфатному бу�

фері, рН 7,2, потенціал +300 мВ відносновнутрішнього електроду порівняння

1. Родопуло А. К. Биохимия виноделия. — М.:Пищевая промышленность, 1971.

2. Compagnone D., Esti M., Messia M. C. et al.Development of a biosensor for monitoring ofglycerol during alcoholic fermentation //Biosensors Bioelectron. — 1998. — V.13. —P. 875–880.

3. Жилякова Т. А., Гержикова В. Г., Семен/чук В. А. Исследование динамики накопленияглицерина в ходе брожения виноградногосусла // Виноградарство и виноделие. —2003. — T. 3. — С. 18–21.

4. Kiba N., Azuma N., Furusawa M. Chemilumi�nometric method for the determination ofglycerol in wine by flow�injection analysiswith co�immobilized glycerol dehydrogena�se/NADH oxidase // Talanta. — 1996. —V.43. — P. 1761–1766.

5. Uwajima T., Shimizu Y., Terada O. Glyceroloxidase, a novel copper hemoprotein fromAspergillus japonicus. Molecular and catalyt�ic properties of the enzyme and its applicationto the analysis of serum triglycerides // J. Biol.Chem. — 1984. — V. 259. — P. 2748–2753.

6. A.c. № 1636773 СССР, МКИ5 G 01 N 33/52.Способ определения пероксидазной актив�ности биологических объектов / М. В. Гончар,А. А. Сибирный (СССР). — № 4363857/14;Заявл. 13.01.88; Опубл. 23.03.91, Бюл.№ 11. — 6 с.

7. Гончар М. В. Чутливий метод кількісноговизначення пероксиду водню та субстратівоксидаз у біологічних об’єктах // Укр.біохім. журн. — 1998. — Т. 70, № 5. —С. 157–163.

8. West S. I. Analitical enzymes: diagnostics. —London: Macmillan Press Ltd., 1998. —P. 63–68.

9. Laurinavicius V., Kurtinaitiene B., Gureivi/ciene V. et al. Amperometric glyceridebiosensor // Anal. Chim. Acta. — 1996. —V. 330. — P. 159–166.

10. Uwajima T., Akita H., Ito K. et al. Some char�acteristics of new enzyme «GlycerolOxidase» // Agric. Biol. Chem. — 1979. —V. 43. — P. 2633–2634.

11. Hill P., Martin S. M. Cellular proteolyticenzymes of Neurospora crassa. Purificationand some properties of five intracellularproteinases // Eur. J. Biochem. — 1975. —V. 56, N1. — P. 271–281.

12. Куплетская М. Б., Лихачев А. Н. Глицери�ноксидазная активность грибов рода Botrytismicheli // Микология и фитопатология. —1996. — Т. 30, Вып. 5–6. — С. 55–58.

13. Lin S. F., Chiou C. M., Tsai Y. C. Purificationand characterization of a glycerol oxidasefrom Penicillum sp. TS–622 // J. EnzymeMicrob. Technol. — 1996. — V. 18. —P. 383–387.

14. Пат. 2117702С1 Россия, МПК6 C12N9/04//(C12N9/04, C12R1:645). Способ по�лучения глицеролоксидазы /ООО «Им�пакт» (Россия). — № 95115005/13; Заявл.22.08.95; Опубл. 20.08.98.

15. Павлішко Г., Гайда Г., Гончар М. Скринінгштамів продуцентів, очищення та первин�на характеристика гліцеролоксидази із плі�сеневих грибів // Вісник Львів. ун�ту. —Сер. Біол. — 2004. — Вип. 38. — С. 67–73.

16. Шкотова Л. В., Сластья Е. А., Жиляко/ва Т. А. та ін. Амперометричний біосенсор

ЛІТЕРАТУРА

Доба

Від

гук

біо

сен

сор

а, %

Нові методи

71

НОВЫЙ АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИЙ БИОСЕНСОР НА ОСНОВЕ ГЛИЦЕРОЛОКK

СИДАЗЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГЛИЦЕРОЛА

Т. Б. Горюшкина1, 2, Л. В. Шкотова1,Г. З. Гайда3, Г. М. Клепач3, 4, М. В. Гончар3,

А. П. Солдаткин1, С. В. Дзядевич1

1Институт молекулярной биологии и генетикиНАН Украины, Киев

2Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко

3Институт биологии клетки НАН Украины, Львов4Дрогобычский государственный

педагогический университет им. Ивана Франко

Е/mail: dzyad@yahoo.com

Проведен сравнительный анализ эффек�тивности использования различных по спосо�бу получения и характеристикам препаратовглицеролоксидазы для создания амперометри�ческого биосенсора для определения содержа�ния глицерола. Выбран препарат фермента,после иммобилизации которого на поверх�ность преобразователя сенсор демонстрируетлучшие аналитические характеристики. Оп�ределен рН�оптимум работы биосенсора, пока�зано, что величина буферной емкости и концен�трация фонового электролита не влияют на егоработу. С помощью созданного амперометри�ческого биосенсора на основе иммобилизиро�ванной глицеролооксидазы осуществлен ана�лиз глицерола в модельных растворах.

Ключевые слова: амперометрический биосенсор,глицеролоксидаза, глицерол, иммобилизация,электрохимическая полимеризация.

NOVEL AMPEROMETRIC BIOSENSORBASED ON GLYCEROL OXIDASE

FOR GLYCEROL DETERMINATION

T. B. Goriushkina1, 2, L. V. Shkotova1, G. Z. Gayda3, H. M. Klepach3, 4,

M. V. Gonchar3, O. P. Soldatkin1, S. V. Dzyadevych1

1Institute of Molecular Biology and Genetics, ofNational Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv

2Taras Shevchenko Natoinal University, Kyiv3Institute of Cell Biology, of National Academy

of Sciences of Ukraine, L’viv4Ivan Franko State Pedagogical University,

Drogobych

Е/mail: dzyad@yahoo.com

The paper presents comparative effectivenessanalysis of glycerol oxidase preparations, used fordevelopment of amperometric biosensor for glyc�erol determination, which are different in methodof preparation and in characteristics. Enzymepreparation, whose immobilization on transducersurface results in sensor demonstrating its bestoperational characteristics, was selected. PH�optimum for the operation of the developedamperometric biosensor was determined; the val�ues of buffer volume and background electrolyteconcentration in buffer were shown to have noeffect on the work of glycerol biosensor. Theanalysis of glycerol concentration in sample solu�tions was carried out using the developed ampero�metric biosensor based on glycerol oxidase.

Key word: amperometric biosensor, glycerol oxidase,glycerol, immobilization, electrochemical polymeriza�tion.

для аналізу етанолу у вині та у виноградномусуслі в процесі його ферментації // Укр. біохім.журн. — 2005. — T. 77, №1. — С. 96–103.

17. Шкотова Л. В., Горюшкіна Т. Б., Сластья Е. А.та ін. Амперометричний біосенсор дляаналізу лактату у вині та у виноградномусуслі у процесі його ферментації // Там са�мо. — 2005. — T. 77, №5. — C.123–130.

18. Ghosh S., Rasmusson J,. Inganas O. Supra�molecular self�assembly for enhanced con�ductivity in conjugated polymer blends:ionic crosslinking in blends of Poly (3,4�ethy�lenedioxythiophene)�Poly (styrenesulfonate)and Poly (vinylpyrrolidone) // Adv. Mater. —1998. — V. 10, N14. — P. 1097–1099.

19. Piro B., Pham M/C., Ledoan T. Electrochemi�cal method for entrapment of oligonucleoti�

des in polymer�coated electrodes // J. Biom.Mat. Res. — 1999. — V. 46, N4. —P. 566–572.

20. Гайда Г. З., Павлішко Г. М., Cмуток О. В.та ін. Гліцеролоксидаза плісеневого грибаBotrуtis allii: виділення, характеристиката біоаналітичне використання //Дослідження у галузі сенсорних систем татехнологій / За ред. акад. Г. В. Єльської,акад. В. Д. Походенка. — К.: Ін�т. мол.біології і генетики НАН України, 2006. —С. 5–12.

21. Isobe K. Oxidation of ethylene glycol andglycolic acid by glycerol oxidase // Biosci.Biotechnol. Biochem. — 1995. — V. 59,N4. — P. 576–81.

72

видатного біофізика професора Аарона Ка�цир�Качальського.

У 1973 р., за чотири місяці до початкувійни Судного дня, Е. Кацир змінив Залма�на Шазара на посту президента державиІзраїль. Період його президентства був озна�менований драматичними подіями — відвійни Судного дня до першого приходу довлади правих та приїзду в Єрусалим єги�петського президента Анвара Садата. Фор�мально Садат був гостем Е. Кацира, однакчерез специфіку інституту президентства вІзраїлі його роль у цих доленосних епізодахісторії країни залишилась не поміченою.

Після закінчення президентського тер�міну Е. Кацир повернувся до наукової робо�ти в інституті Вейцмана та університетіТель�Авіва, де з 1982 р. очолював відділеннябіотехнології.

Ефраїм Кацир (Качальський) як ученийзробив значний внесок у дослідження білківта їхніх структурних елементів — аміно�кислот.

Його наукові заслуги було відзначенопремією імені А. Вейцмана (1950), Держав�ною премією Ізраїлю (1959), премією іменіРотшильда (1960), а також різнимипреміями та золотими медалями в багатьохкраїнах світу, у тому числі Німеччині таЯпонії. Він був одним із засновників Інсти�туту імені А. Вейцмана у Реховоті, заснувавжурнал «Мада», організував та очолив нау�ковий відділ в Армії оборони Ізраїлю, йогознають як автора робіт з біохімії іммобілізо�ваних ферментів.

Вже після своєї відставки з поста прези�дента у 1978 р. він створив кафедру біотех�нології в Тель�Авівському університеті, якусам і очолив. Е. Кацир (Качальський) —член Лондонського королівського товарист�ва, Національної академії наук США, нау�кових академій та товариств інших країн, атакож почесний доктор низки ізраїльськихта закордонних університетів (у тому числіГарвардського, Оксфордського, Університе�ту Буенос�Айреса, Федерального техно�логічного інституту в Цюріху та інших). Йо�го обрано почесним членом Українськогобіохімічного товариства.

Нині, попри нещодавно перенесене тяж�ке захворювання, він продовжує займатисяактивною науковою та педагогічною діяль�ністю у Вайцманівському інституті наукі в Університеті Тель�Авіва.

ЕФРАЇМ КАЦИР (КАЧАЛЬСЬКИЙ) —ВИДАТНИЙ ДОСЛІДНИК У ГАЛУЗІ

БІОХІМІЇ ТА БІОТЕХНОЛОГІЇ

Є. Л. Левицький

Інститут біохімії ім. О. В. ПалладінаНАН України, Київ

Професор Ефраїм Кацир (Качальський) —видатний учений в галузі біохімії, біофізики,біотехнології. Народився у Києві 16 травня1916 р. У 1918 р. його родина переїхалав Палестину та оселилася в Єрусалимі. Еф�раїм виріс у цьому місті, закінчив гімназію,а потім магістратуру в Єврейському універ�ситеті, вивчав хімію, ботаніку, зоологію табактеріологію. У 1941 році успішно склавекзамен на здобуття докторського ступеня збіології. У наступні роки працював асистен�том у відділі теоретичної та макромолеку�лярної хімії.

Ефраїму було 32 роки, коли його запро�сили на роботу в Інститут ім. А. Вейцмана.Тут він створив і впродовж 24 років очолю�вав відділення біофізики, обіймаючи прицьому посаду спочатку професора Єврейсь�кого університету, а згодом — головного на�укового експерта міністерства оборони.

1972 р. в аеропорту ім. Бен�Гуріона теро�ристами було вбито його старшого брата —

СТОРІНКИ ІСТОРІЇ

Сторінки історії

73

Досліджуючи конформаційні змінив біологічних макромолекулах, Ефраїм Ка�цир (Качальський) установив, що білки таферменти більш ефективно функціонуютьу розчинах з меншою в’язкістю. Тому втра�ти внутрішньоклітинної води негативновпливатимуть на ефективність функціону�вання клітин. Це відкриття спростовує дум�ку про те, що спочатку нам слід дочекатисязневоднення, а вже потім починати пити во�ду. Оскільки бажано, щоб усі клітини вико�нували свої фізіологічні функції, то доціль�ніше наситити організм водою, ніж чекати,доки механізми боротьби зі зневодненнямвикличуть почуття спраги. Окрім того, ор�ганізму набагато легше розібратися з неве�ликими надлишками води, аніж страждативід її нестачі та видавати невеликимипорціями життєво важливим органам, нех�туючи при цьому інтересами менш значнихфункцій тіла. Наслідком постійної цирку�ляції густої крові в серцево�судинній сис�темі може бути невиправна катастрофа.

Зараз учений разом зі своїми колегамиплідно працює над вивченням молекуляр�них механізмів білкового пізнавання, до�сліджуючи взаємодію між специфічнимибілками та випадковими популяціями пеп�тидів.

74

На запитання, чи існують можливі ризикипід час вирощування ГМО�рослин, ученийвідповів, що, на думку екологів, генетичнозмінені форми рослин можуть випадковопроникнути у дику природу. Зокрема підчас перехресного запилення бур’яни можутьотримати від ГМО�рослин ген стійкості дошкідників і пестицидів. У такому разі роз�множення бур’янів стане неконтрольова�ним, і вони витіснять багато видів рослин,не здатних до конкурентної боротьби з ни�ми. Комахи, що харчуються або запилюютьГМО� рослини, одержать для означеного ви�ду гени, що може призвести до непередбаче�них негативних наслідків. Окрім цього,у природі можуть з’явитися нові патогеннівіруси і штами мікроорганізмів.

Даючи відповідь на запитання, чи існу�ють харчові ризики якщо використовуватиГМО у харчуванні, А. П. Галкін навів прик�лад, що обійшов майже всі ЗМІ: вживаннятрансгенного продукту, одержаного пере�садженням гена бразильського горіха в ДНКсої, спричинило у багатьох людей алергічніреакції на чужорідний білок. Сорти рослин,що є стійкими до пестицидів (наприклад,ГМ�соя і кукурудза), накопичують шкідливіречовини та їхні метаболіти, що може вик�ликати отруєння. Під час вживання ГМ�про�дуктів можливе горизонтальне перенесеннятрасгенних конструкцій у геном симбіонт�них людині мікроорганізмів. Ті ж самі бак�терії мікрофлори кишечнику можуть одер�жати ген стійкості до антибіотиків. Світовеспівтовариство приділяє велику увагу роз�робленню обґрунтованих підходів щодооцінки потенційного ризику використанняГМО у харчуванні. Передові країни маютьяк розроблену систему наукових дослідженьу галузі біобезпеки й аналізу перспективрозвитку біотехнології, так і відрегульованунаціональну правову базу стосовно застосу�вання ГМО. Відповідні закони і нормативніакти діють у США, Канаді, Німеччині, Нор�вегії, Росії, Естонії, Угорщині, Чехії. Цяправова база є різноманітною, однак такіміжнародні організації, як Продовольча ісільськогосподарська організація ООН —ФАО, намагаються гармонізувати її й поши�рити інформацію в країни Азії, Африки,Східної Європи, у тому числі й в Україну.

«Демократична Україна», 27 січня2007 року

Використання генетично модифікованихорганізмів у харчуванні —

користь чи ризик?

Дедалі бурхливішого розвитку набуваєринок трансгенних або генетично модифіко�ваних організмів (ГМО), тобто організмів зізміненими ознаками, внаслідок застосуван�ня спеціальних технологій. На запитання:«Як Ви ставитесь до продуктів, що містятьГМО?», більшість українців скажуть: «Нега�тивно». Тим часом трансгени давно сталичастиною нашого життя. Кожен не раз кош�тував продукти з додаванням сої — сири, ков�баси, низькокалорійне печиво, шоколадні ба�тончики… Адже нині майже вся соя — цепродукт генної інженерії. У багатьох країнахсвіту новостворені ГМО використовують дляпотреб сільського господарства, виробницт�ва, харчової промисловості чи медицини. Чо�му? На подібні запитання під час інтерв’ю га�зеті «Демократична Україна» погодився дативідповідь керівник відділу біоінженеріїІнституту біоорганічної хімії та нафтохіміїНАН України, д �р біол. наук А. П. Галкін.

Відповідаючи на питання про значенняГМО у нашому повсякденному житті, він на�голосив, що застосування ГМО дає змогу ви�рішувати найгостріші проблеми в сільськомугосподарстві, а саме: значно підвищити вро�жайність культурних рослин і уникнутивтрат під час зберігання, поліпшити харчовівластивості рослинних продуктів (збільшен�ня вмісту вітамінів, рослинних білків, іншихкорисних речовин з одночасним зменшеннямвмісту залишків агрохімікатів), зменшитиекологічне навантаження на довкілля, знач�но знизивши використання гербіцидів, пес�тицидів, стимуляторів росту рослин, міне�ральних добрив та інших хімікатів.

ННООВВИИННИИ

Огляди

75

новим непрямим підтвердженням ефектив�ності популярних нині низькокалорійнихдієт. Водночас дослідники не виключають,що рано чи пізно відкриття молекулярнихмеханізмів ефекту довголіття матименаслідком розроблення ліків, що дозволятьподовжити життя без використання вис�нажливих дієт.

До цього можна додати, що вищезгаданіщури, які перебували на низькокалорійнійдієті, але з достатньою кількістю білка,відзначалися дуже агресивною поведінкоюта виснаженим зовнішнім виглядом. Окрімтого, відкриття гена довголіття дозволитьвпливати на його активність не тільки за до�помогою відповідних ліків, але й використо�вуючи новітні досягнення генної інженерії.

Джерело:Panowski S. P., Wolff S., Aguilaniu H. et

al. PHA�4/Foxa mediates diet�restriction�induced longevity of C. elegans // Nature. —

2007. — 2 May. doi:10.1038/nature05837.

Трансгенні комарі допоможуть у боротбі з малярією

Американські вчені вивели трансгеннулінію комарів, що є несприйнятливими дозбудника малярії та більш життєздатними,ніж звичайні комахи. Вчені сподіваються,що комарі зі зміненим геномом поступововитіснять звичайних і це дозволить людствупозбутися малярії. Результати своєї праціамериканські вчені виклали у журналіProceedings of the National Academy ofSciences. У ході дослідів однакова кількістьмодифікованих та звичайних комарів живи�лися кров’ю заражених малярією мишей. Ізчасом серед комах, що вижили, залишилосябільше модифікованих комарів, і післядев’ятого покоління близько 70% усіх ко�марів, які залишилися, були несприйнятли�вими до цієї хвороби. Вчені також увели мо�дифікованим комарам спеціальний ген, щоспричиняє зелений блиск в очах. Ці дослідиполегшують дослідникам вирішення зав�дання підрахунку кількості модифікованихта звичайних комарів. «Наскільки відомо,до сьогодні ніхто не довів, що трансгенні ко�марі є більш життєздатними, ніж зви�чайні», — повідомляють у своїй статті авто�ри дослідження з Університету ДжонаХопкінса у Балтиморі. Тепер, як з’ясувалидослідники, модифіковані комарі живутьдовше та відкладають більше яєць. Однак,

«Ген довголіття» подовжує життя за умов нестачі їжі

Американські дослідники знайшли ген,що відповідає за збільшення тривалостіжиття за умов жорсткого обмеження спожи�вання калорій. Це відкриття дозволяє по�новому оцінити феномен, відомий упродовжостанніх 70 років. У 30�х роках минулогосторіччя вчені дійшли висновку, що суттєвескорочення калорійності корму за збере�ження базових поживних елементів здатнеподовжити життя лабораторних тварин(щурів) майже у півтора рази (MacKey у Ве�ликій Британії, В.М. Нікітін у Харківсько�му університеті).

Цей ефект був ба�гаторазово підтверд�жений у дослідахз круглими черв’я�ками, дрозофілами,а також ссавцями —мишами, собакамита мавпами, однак

його механізм тривалий час залишався неві�домим. Вплив постійного зниженого спожи�вання калорій у людей доки залишаєтьсянез’ясованим. Ученим з американськогоІнституту біологічних досліджень «Салка»вдалося відкрити «ген довголіття» у круг�лих черв’яків�нематод. Результати їхніхдосліджень вміщено в онлайн�версії журна�лу Nature. Відомо, що відносно короткийжиттєвий цикл цих істот значно подов�жується за умов обмеження живлення. Надумку біологів, це явище є адаптаційниммеханізмом, що допомагає тваринам пережи�ти період відсутності харчування та дочека�тися оптимальних умов для продовженняроду. Однак нематоди, у яких відсутній генPHA/4 (defective PHArynx development fam�ily member 4), за відсутності харчування жи�ли не довше, ніж у нормальних умовах.Штучна стимуляція експресії PHA/4, навпа�ки, додатково збільшувала тривалість жит�тя черв’яків. Людина та інші ссавці маютьтри гени, що є близькими за структурою доPHA/4. Ця група генів регулює синтез гор�мону підшлункової залози глюкагону, щовідповідає за підтримання рівня глюкози укрові. Раніше уповільнення процесівстаріння асоціювали з генами, які регулю�ють синтез та функції іншого гормонупідшлункової залози — інсуліну. Найближ�чим часом вчені мають намір дослідитифункції генів, що є близькими до PHA/4,в інших видів тварин. Якщо ці дослідженнядадуть аналогічні результати, це може стати

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

76

Генна терапія дозволяє успішно боротисяз хворобою Паркінсона

Вчені з Нью�йоркського пресвітерськогошпиталю та Корнельського медичного ко�леджу завершили перший етап клінічнихвипробувань генної терапії для лікуванняхвороби Паркінсона. Нова методика вияви�лася досить безпечною та сприяла помітно�му поліпшенню рухової функції пацієнтів,повідомляє журнал Lancet. У клінічнихвипробуваннях брали участь 12 осіб (11 чо�ловіків та одна жінка), у яких була хворобаПаркінсона на розгорнутій стадії. У зонусубталамічного ядра (важливого центру ре�гуляції моторики) однієї із півкуль мозкупацієнтів вводили нешкідливий аденовірус,що несе ген GAD (декарбоксилази глю�тамінової кислоти). GAD — фермент, щоконтролює вироблення нейротрасмітераГАМК (гамма�аміномасляної кислоти), яказумовлює пригнічення гіперактивності ней�ронів. У разі хвороби Паркінсона вироблен�ня ГАМК знижується, що сприяє розвитковідеяких інших симптомів захворювання. «Захвороби Паркінсона відбувається не тількизменшення кількості дофамінових ней�ронів, але й значне зниження активності таконцентрації ГАМК у головному мозкупацієнтів. Це призводить до дисфункції сис�тем мозку, що є відповідальними за коорди�націю рухів», — пояснив керівник дослі�дження Майкл Каплітт (Michael Kaplitt).

Передбачалось, що введення гена GADпідвищить вироблення ГАМК, а це, у своючергу, сприятиме відновленню функціону�вання усієї системи в цілому, — додав він.Упродовж 12 місяців після генної терапіїпроводили регулярну оцінку моторноїфункції пацієнтів з використанням спеціа�льної шкали (UPDRS), а також фіксувализміни активності мозку за допомогою позит�ронної емісійної томографії. Однак головнуувагу приділяли оцінці безпеки нової мето�

коли обидва види ко�марів харчувалисьнезараженою кров’ю,їхні показники булиприблизно однакові.Для того, щоб закрі�питися у природнихумовах, модифіко�вані комарі мають бу�ти більш життєстій�кими, ніж звичайні, навіть коли вониінфіковані збудником малярії. Але й на да�ному етапі досліджень, як зазначають учені,«результати цієї роботи є вельми важливи�ми для контролю над малярією за допомо�гою використання генетично модифікова�них комарів». Ці комахи запобігаютьрозвиткові збудника малярії. Таким чином,якщо цю хворобу буде усунено з якого�не�будь регіону, їй буде важче знову в ньомупоширитись. Малярія, що передається най�простішими роду Plasmodium, широко роз�повсюджена у деяких районах Азії, Афри�ки, Центральної та Південної Америки.Збудник передається людині під час укусукомара роду Anopheles. Щороку на маляріюхворіють близько 300 млн. людей, з них1 млн. помирає. 90% хворих помираютьу країнах Екваторіальної Африки. Тамкожні 30 с від малярії гине одна дитина.

Джерело: Marrelli M. T., Li C., Rasgon J. L., Jacobs/

Lorena M. Transgenic malaria�resistant mos�quitoes have a fitness advantage when feeding

on Plasmodium�infected blood // PNAS. —2007. — 10.1073/pnas.0609809104.

Продукти із клонованих тварин у США визнано безпечними

Молоко та м’ясо деяких клонованих тва�рин є безпечними для споживання і можутьпродаватись на американських ринках. Проце йдеться у проекті постанови, що його бу�ло розповсюджено Агенцією з контролю надпродуктами харчування та лікарськими за�собами США (FDA). У разі затвердженняцієї постанови у США можуть реалізуватисьпродукти харчування, вироблені з клонова�них корів, свиней, але не овець. «Ніякогоособливого ризику для споживання люди�ною не виявлено у клонах великої рогатоїхудоби, свиней або кіз», — говориться у рі�шенні FDA, яке зараз виноситься на су�спільне обговорення, після чого агенціяприйме остаточне рішення.

Огляди

77

однак у ході операцій або після пологів ви�користання таких ліків може бути небезпеч�ним. У цих випадках їм уводять отриманийштучно антитромбін. Однак його одержанняіз плазми крові дорого коштує, і до сьогоднізалишається ризик перенесення певних за�хворювань, зокрема хвороби Кройцфель�да–Якоба, за якої руйнується мозок. GTCBiotherapeutics стверджує, що одна коза,якій було прищеплено ген людини, що від�повідає за синтез антитромбіну, дає стількиж білка, скільки отримують з 90 тис. до�норських кіз. «Ця технологія потенційноздатна радикально змінити спосіб одержан�ня дешевих біологічних ліків для фармацев�тичного ринку», — заявив представник ком�панії Том Ньюберрі. Європейські медики,схоже, із цим згодні. Професор Ізабель Уо�кер, гематолог із Королівської лікарні длялюдей похилого віку у Глазго, заявила: «Цедуже добрий день для всіх європейськихпацієнтів з дефіцитом антитромбіну. І дляїхніх лікарів — теж». Остаточну санкцію навикористання ліків Європейське управлін�ня з контролю над ліками має дати протягомцього року.

За матеріалами сайтуwww.genoterra.ru

дики. «За рік спостережень ми не побачилипобічних ефектів лікування — ані імуно�логічних порушень, ані інфекцій, аніпомітних ознак токсичності», — заявивКаплітт. Більш того, спостерігалося суттєвеполіпшення моторної функції пацієнтів, якна тлі використання специфічних лікарсь�ких засобів, так і в «безлікарський» період.У середньому, їхні показники покращилисяна 27% порівняно з вихідними, повідомилидослідники. За словами вчених, поліпшен�ня рухової функції пацієнтів відзначалосятільки та тому боці тіла, що контролюється«генетично зміненою» півкулею мозку. «Ре�зультати досліджень є обнадійливими, од�нак для їх підтвердження потрібне більшмасштабне клінічне дослідження», — резю�мував керівник цього дослідження МайклКаплітт.

Джерело: Kaplitt M.G., Feigin A., Tang C. et al.

Safety and tolerability of gene therapy withan adeno�associated virus (AAV) borne GADgene for Parkinson’s disease: an open label,

phase I trial // Lancet. — 2007. — V. 369(9579). — P. 2097–105.

Трансгенна коза дасть Європі нові ліки

На полиці європейських аптек незаба�ром надійде препарат, виготовлений з моло�ка генетично модифікованих тварин, пові�домляє BBC. Препарат Atryn, виготовленийз молока трансгенних кіз, призначений длятих, у кого порушена робота гена анти�тромбіну, що відповідає за запобігання утво�рення тромбів у крові. Він виготовляєтьсяамериканською компанією GTC Biothera�peutics, і раніше Європейське управлінняз контролю над ліками дало негативнийвідгук на ці ліки. Однак, вислухавши пора�ди експертів, управління змінило своєрішення та видало ліцензію на використан�ня препарату. Активна речовина в цьомупрепараті добувається із молока кіз, якимбуло введено ген антитромбіну людини, щовідповідає за профілактику утвореннязгустків крові, які, у свою чергу, призво�дять до появи тромбів, що загрожує закупо�рюванням судин. Підраховано, що у одногоіз 3–5 тис. людей цей ген не працює.Унаслідок цього у них не виробляється бі�лок антитромбін, який слугує антикоагу�лянтом крові. Зазвичай такі люди прийма�ють препарати для розрідження крові,

78

Молекулярна медицинаМолекулярна медицинаAN INTRODUCTION TO MOLECULAR MEDICINE

AND GENE THERAPYВступ до молекулярної медицини та генної терапії

За редакцією Thomas F. Kresina

Генна терапія, або використання генетичних маніпуляцій для ліку�вання захворювань, розвинулася завдяки успіхам генетики, молеку�лярної біології, клінічної медицини та геноміки людини. Розвиток мо�лекулярної медицини із застосуванням методів молекулярної біологіїдля лікування захворювань та встановлення точного діагнозууможливили успіхи трансплантації органів, фармакотерапії, а такожрозшифрування генома людини. Монографія є фундаментом дляінтерпретації основних експериментальних і нових клінічнихдосліджень у галузях клонування, перенесення та цілеспрямованогодоставлення генів; використання генетичної медицини в умовахклініки; етичних та регуляторних аспектів її застосування, а також но�

вих досліджень у галузі геноміки, біотехнології та біоінформатики. Матеріал розподілено на три ос�новні розділи: вступ до цієї науки, огляд її клінічних застосувань, а також обговорення галузей, щострімко прогресують і пов’язані з генною терапією та молекулярною медициною. Це вичерпнийпосібник, у якому наведено основні підходи до різних видів генетичної терапії.

Інформація, що її подано в монографії, може бути корисною для науковців і дослідників, які пра�цюють у сфері генетики та молекулярної медицини, студентів і аспірантів відповідного профілю,а також для широкого кола читачів.

Обсяг: 386 стор. Видавництво: WileyKLiss. Дата публікації: 27 жовтня 2000 р. Мова: англ.

EXTRACELLULAR MATRIX AND THE LIVER:APPROACH TO GENE THERAPY

Екстраклітинний матрикс та печінка: підхід до використання генної терапії

За редакцією Isao Okazaki, Yosifumi Ninomiya,Tanikawa Kyuichi та Scott I. Friedman

Tokai University School of Medicine, Kanagawa, Japan

Монографія містить повний огляд нових даних, що сприяли прогре�су в розумінні клітинних та молекулярних основ фіброзу печінки, зособливим акцентом на проведення відповідної терапії. Цироз печінкивважали захворюванням, що прогресує і є невиліковним. Однак те�рапія HCV� інтерфероном позитивного хронічного гепатиту та/або ци�розу печінки у багатьох випадках приводила до повного видужання.Книгу присвячено описові нових стратегій у лікуванні усіх видів циро�зу печінки.

Розділи монографії містять шість підрозділів: • основні наукові дані про екстраклітинний матрикс;

ННООВВІІ ППУУББЛЛІІККААЦЦІІЇЇ ЗЗ ББІІООТТЕЕХХННООЛЛООГГІІЇЇТТАА ССУУММІІЖЖННИИХХ ДДИИССЦЦИИППЛЛІІНН

Нові публікації

79

• клітини, що є відповідальними за формування екстраклітинного матриксу; • механізм активації клітин печінки та сигнальної трансдукції;• основні наукові дані про метаболізм екстраклітинного матриксу, включаючи ферменти та їх

інгібітори;• нова стратегія лікування цирозу печінки. Матеріал, поданий у монографії, було репрезентовано на Міжнародній конференції, присвяченій

новим стратегіям лікування усіх видів цирозу печінки, що відбулася 6−9 червня 2001 р. у Токіо.

Обсяг: 502 стор. Видавництво: Academic Press. Дата публікації: жовтень 2003 р. Мова: англ.

GENE AND CELL THERAPY: THERAPEUTIC MECHAKNISMS AND STRATEGIES. Second Edition

Генна та клітинна терапія: механізми і стратегія.Друге видання

Nancy Smyth TempletonBaylor College of Medicine, Houston, TX

У монографії вміщено нові та переглянуто вже опубліковані дис�кусійні матеріали, що стосуються широкого кола питань, пов’язаних ізсистемами доставлення генів, вірусними векторами, видами клітинноїтерапії, застосуванням у клініці, специфічними захворюваннями, норма�тивно� регуляторних актами, вимогами FDA, генною експресією тощо.

За висловлюванням автора, «генна терапія допомагає у лікуваннігенетичних та інфекційних захворювань шляхом введення нового гене�тичного матеріалу у відповідні клітини організму».

Хоча в цьому виданні акцент зроблено на власних дослідженнях автора, книга може слугуватипідручником, оскільки містить широкий спектр актуальних проблем, концепцій і гіпотез, що інтен�сивно обговорюються з урахуванням міждисциплінарного підходу. Особливий інтерес становить во�на для осіб, що займаються вивченням вірусних, зокрема лентівірусних, векторів.

У монографії докладно аналізуються інструментальні методи, технології, а також аспекти, якістосуються майбутнього досліджень на рівні генів і клітини, що є особливо корисним для непро�фесіоналів, студентів та фахівців з різним рівнем підготовки у даній галузі знань, з метою розуміннясучасного статусу генної і клітинної терапії та прогнозування сталих темпів її розвитку.

Обсяг: 896 стор. Видавництво: CRC; друге видання. Дата публікації: 17 грудня 2003 р. Мова: англ.

STEM CELL AND GENEKBASED THERAPY: FRONTIERS IN REGENERATIVE MEDICINE

Стовбурова клітина та генна терапія: межі регенеративної медицини

За редакцією Alexander Battler та Jonathan Leor

Нездатність організму людини самостійно відновлювати ушкодженіоргани та тканини становить велику медичну та соціальну проблему. Заостанні декілька років у цій сфері намітився певний прогрес, і успіхи, до�сягнуті в галузі експериментальних стратегій регенерації тканин, особли�во клітинної трансплантації та дослідження стовбурових клітин, малинаслідком розроблення потенційних методів лікування багатьох ранішефатальних захворювань. Ці інновації є перспективними для лікуванняабо профілактики кінцевої стадії дегенерації органів. Клітинна терапія

БІОТЕХНОЛОГІЯ, Т. 1, №3, 2008

80

і тканинна інженерія життєздатними трансплантатами, здатними до росту та ремоделювання, змог�ли забезпечити нові перспективні рішення серйозних проблем дефіциту донорських органів.

Регенеративна медицина — терапія стовбуровими клітинами та генна терапія — пропонують но�вий підхід для відновлення функції ушкоджених органів і тканин. Було надруковано декілька книг,що стосуються специфічних аспектів заміщення органів або тканин, але жодна з них не торкаласянових основних аспектів регенеративної медицини. Тому ця монографія є цінним доповненням доіснуючої в даній галузі наукової літератури. У ній описано основні підходи до вирішення проблем ре�генеративної медицини, що уможливлює взаємопроникнення методичних досягнень у різних галу�зях медицини, даючи змогу професіоналам охорони здоров’я не тільки набувати знань безпосередньовід впровадження регенеративної медицини, але й у близькому майбутньому допомогати пацієнтамвідповідного профілю.

Обсяг: 438 стор. Видавництво: Springer; перше видання. Дата публікації: 21 грудня 2005 р. Мова: англ.

GENE THERAPY FOR CANCER (CANCER DRUG DISCOVERY AND DEVELOPMENT)

Генна терапія раку ((синтез, розроблення та впровадження протипухлинних препаратів)

За редакцією Kelly K. Hunt, Stephan A. Vorburger та Stephen G. Swisher

Можливість лікування раку — захворювання, що його часто визнача�ють як наслідок генетичних дефектів, −шляхом уведення генів, мішеннюдії яких і є саме ці порушення, було сприйнято з величезним ентузіазмом.Однак через дедалі зростаючу кількість невдалих спроб терапії цього за�хворювання, включаючи застосування векторних систем, які не досягалисистемних метастазів, терапевтичних генів з дублювальними механізма�ми, що, за результатами клінічних випробувань, спричиняло виникненняклітинної резистентності та токсичності, ці випробування було передчас�

но перервано. У трьох вичерпних розділах монографії описано наявні сучасні методи генної терапіїраку з акцентом саме на зазначені недоліки генної терапії. У першій частині наведено різні системидоставлення генів, включаючи носії або вектори, а також їхні відповідні характеристики та методиотримання. У другій частині обговорюються стратегії й мішені лікування раку, зокрема молеку�лярні методи летальної терапії клітин, корекції онкогенних генетичних дефектів, а також активаціїімунної системи або пухлинного мікрооточення. Автори дають коротке резюме механізмів основнихонкогенних порушень, з наголосом на особливу роль розроблення методів векторної інженерії ген�них мутацій через специфічне розповсюдження вектора у клітині пухлини зі специфічними пору�шеннями. У третій частині монографії наведено висловлювання експертів клінічних випробуваньз генної терапії щодо труднощів, які виникають у разі застосування цього методу лікування ракув клінічних умовах, а також розглянуто підходи для проведення генної терапії на стадіях клінічно�го тестування і результати, що їх було одержано під час клінічних випробувань.

Обсяг: 600 стор. Видавництво: Humana Press; перше видання. Дата публікації: 1 лютого 2007 р. Мова: англ.

Огляди

81