LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

MAISTO SAUGOS IR GYVŪNŲ HIGIENOS KATEDRA

Vilmos Laivienės

BIOTECHNOLOGINIŲ PRIEMONIŲ PANAUDOJIMO

GALIMYBĖS DEOKSINIVALENOLIO DETOKSIKACIJAI

KVIEČIUOSE

Magistro darbas

Darbo vadovė:

lektorė dr. ELENA BARTKIENĖ

Kaunas

2007

2

LIETUVOS VETERINARIJOS AKADEMIJA

GYVULININKYSTĖS TECHNOLOGIJOS FAKULTETAS

MAISTO SAUGOS IR GYVŪNŲ HIGIENOS KATEDRA

Magistro darbas atliktas 2005-2007 metais Lietuvos veterinarijos akademijos,

Gyvulininkystės fakulteto, Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedroje- ELISA metodu

(2006m.), o KTU Cheminės technologijos fakultetas, Maisto produktų ir technologijos

katedroje, - akustiniu metodu (2006m.).

Magistro darbą paruošė: Vilma Laivienė ________________ (Vardas, pavardė) (parašas)

Magistro darbo vadovas: lektorė dr. Elena Bartkienė _______________ (LVA Maisto saugos ir gyvūnų higienos katedra) (parašas)

Recenzentas (ai): ______________________________________

_____________ (parašas)

3

TURINYS

1. ĮVADAS 5

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Mikotoksinai grūdinėje žaliavoje ir jų detoksikacijos technologiniuose procesuose

galimybės

7 7

2.1.1. Fusarium genties pelėsių išplitimas 7

2.1.2. Deoksinivalenolio reguliavimas tarptautinėje praktikoje 7

2.1.3. Trichotecenų nustatymo metodai 10

2.1.4. Galimas mikotoksinų sumažinimas technologinėmis priemonėmis 11

2.1.5. Kovos su mikotoksinų daroma žala strategijos 13 3. DARBO METODIKA

15

3.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas 15

3.2. Tyrimų objektai, medžiagos ir jų paruošimas analizei

3.2.1. Grūdinės žaliavos charakteristika

3.2.2. Kvietinės duonos su raugu gamyba

3.2.3. Bioetanolio gamybos technologinė schema

16

16

18

20

3.3. Tyrimų metodai 22

3.3.1. Metodai fuzarioze užkrėstiems grūdams įvertinti 22

3.3.1.1. Akustinio metodo charaketristika 22

3.3.1.2. Tradicinis imunofermentinis ELISA metodas 24

3.4.1. Metodai taikyti technologiniuose procesuose

3.4.1.1. Kvietinės duonos su raugais gamyba

3.4.1.2. Bioetanolio gamyba

25

25

26

3.5. Matematinis statistinis tyrimų rezultatų įvertinimas 26

4. TYRIMŲ REZULTATAI 28

4.1. Akustinio metodo panaudojimo galimybių tyrimas 28

4.1.1. Optimalaus akustinio signalo dažnio parinkimas 28

4.1.2. Vystomo akustinio ir tradicinio ELISA metodų palyginamasis įvertinimas 31

4.1.2.1. Fuzarioze užkrėstų kviečių kiekio įtaka akustinio signalo parametro vertėms 31

4.1.2.2. Modelinių Fuzarioze užkrėstų kviečių mėginių vertinimas akustine technika 33

4.2. Biotechnologiniai priemonių panaudojimo galimybės mikotoksinams

detoksikuoti

36

36

4

4.2.1. Duonos gamyboje fermentacinių procesų įtaką DON kiekiui pusgaminiuose ir

gatavuose kepiniuose

4.2.2. Fermentacijos įtaka DON kiekiui žlaugtuose bioetanolio gamybos metu

IŠVADOS

SANTRUMPOS

LITERATŪRA

SUMMARY

PRIEDAI

39

44

45

46

48

50

5

1. ĮVADAS

Integruojant Lietuvos maisto pramonę į ES rinką, svarbus dėmesys skiriamas pagamintos

produkcijos kokybei ir saugai. Grūdų produktai užima 60 procentų žmogaus mitybos racione

ir yra viena iš pagrindinių žaliavų tiek žmogaus, tiek ir pašarų gamyboje (Coker R. D., Nagler

M. J., Blunden G., Sharkey A. J., Derksen G. B., T. B.Whitaker, 1995). Todėl labai svarbu,

kad ji atitiktų ES galiojančius reglamentus. Ypatingas dėmesys skiriamas teršalams -

mikotoksinams, susidarantiems grūdų auginimo ir laikymo metu. Grūdų kokybei užtikrinti

turi būti kontroliuojama visa grūdų gamybos ir perdirbimo grandinė, pradedant nuo pirminės

grūdų gamybos iki grūdų produktų realizavimo vartotojui.

Aukšto žmonių gyvenimo ir sveikatos lygio siekimas yra vienas iš pagrindinių maistui

skirtų teisės aktų siekiamų tikslų. Lietuvos Respublikos maisto įstatymas (Žin., 2000, Nr. 32-

893; 2002, Nr. 64-2574, 2003, Nr. 92-4139, 2004, Nr. 93-3397) įpareigoja maisto įmones

maistui tvarkyti ir jo saugai užtikrinti taikyti rizikos veiksnių analizės ir svarbiųjų valdymo

taškų sistemą (RVASVT). Lietuvos higienos norma HN 15:2005 „Maisto higiena“ (Žin.,

2005, Nr. 110-4023) nustato esminius maisto saugos užtikrinimo bei RVASVT sistemos

reikalavimus. Europos Sąjungos mastu bendrosios maisto produktų higienos taisyklės

išdėstytos Tarybos direktyvoje 93/43/EEB „Dėl maisto produktų higienos“ bei Europos

Parlamento ir Tarybos reglamente (EB) Nr. 178/2002.

Nuo 2006 m. sausio 1 d. įsigaliojusiuose Europos Parlamento ir Tarybos reglamentuose

(EB) Nr. 852/2004, dėl maisto produktų higienos bei Nr. 183/2005, apibrėžiančio pašarų

higienos reikalavimus, akcentuojamas integruotas požiūris į maisto ir pašarų saugą nuo

pirminės jų paruošimo vietos iki pateikimo į rinką ir išdėstyti reikalavimai pirminei gamybai,

bei apibrėžta verslo operatorių atsakomybė. Pagal šių reglamentų reikalavimus, visi grūdų

augintojai privalės vadovautis geros higienos praktikos taisyklėmis. ES valstybės narės

skatinamos perorganizuoti grūdų perdirbimo pramonę, numatant technologines priemones

RVASVT principų užtikrinimui tiek maisto, tiek ir pašarų sektoriuose.

Vadovaujantis šiais principais, toksinų, dar vadinamų mikotoksinais, kuriuos gamina

pelėsiniai grybai, problemos negalima nepaisyti, nes visuomenės sveikatos, žemės ūkio ir

ekonominiu požiūriu ji labai aktuali. Tai rodo ir 2005 m. birželio 6 d. priimtas Europos

bendrijų komisijos reglamentas (EB) Nr. 856/2005, dėl Fusarium toksinų, kuris įsigaliojo ES

nuo 2006 m. liepos 1 dienos.

Pastaruoju metu atkreiptas dėmesys į greitų metodų mikotoksinų aptikimui vystymo

aktualumą ir technologines priemones įtakojančias jų detoksikaciją.

6

Šio darbo tikslas - nustatyti įvairių biotechnologinių priemonių įtaką

deoksinivalenolio (DON) kiekiui fuzarioze užkrėstų kviečių perdirbimo produktuose,

panaudojant šio mikotoksino aptikimui grūdinėje žaliavoje greitą akustinį ir ELISA metodą.

Spręstini uždaviniai:

• Ištirti greito akustinio metodo panaudojimo galimybes DON kviečiuose aptikti;

• Nustatyti kvietinės duonos fermentacinių procesų įtaką DON kiekiui pusgaminiuose ir

gatavuose kepiniuose, naudojant ELISA metodą;

• Įvertinti DON pokyčius bioetanolio gamybos metu ir jų likutį žlaugtuose, skirtuose

pašarams gaminti.

7

2. LITERATŪROS APŽVALGA

2.1. Mikotoksinai grūdinėje žaliavoje ir jų detoksikacijos technologiniuose

procesuose galimybės

2.1.1. Fusarium genties pelėsių išplitimas

Mikotoksinus gaminantys pelėsiniai grybai suardo grūdus, keisdami jų struktūrą, o

pasigaminę toksinai užkrečia maistą bei gyvulių pašarus. Vien tik augaluose pelėsiniai grybai

sukelia apie 10 000 įvairių ligų (J. Miller Jones, 2000). Geriausiu, sukeliamų ligų pavyzdžiu,

galėtų būti kviečių, rugių ir miežių “susiraukšlėjimas” (“šašų” liga), atsirandantis Fusarium

genties pelėsinių grybų (dar vadinamų “lauko pelėsiais”) veiklos pasekoje. Kviečiai

priskiriami prie jautriausių šiam susirgimui javų ir gali būti pavojingu Fusarium genties

pelėsių gaminamų mikotoksinų, tame tarpe ir deoksinivalenolio (DON) arba vomitoksino,

šaltiniu. Manoma, kad XIII a. Vakarų Europoje smarkų gyventojų sumažėjimą sukėlė būtent

rugių pakeitimas fuzariozei neatspariais kviečiais. Deoksinivalenolis pavojingas tiek

žmonėms, tiek ir gyvuliams. Jis gali pažeisti žinduolių organus, silpninti imuninę sistemą ir

mažinti gyvulių produktyvumą. Su grūdų fuzarioze kovoti sunku, nes tam išimtinai įtakos turi

klimatinės sąlygos. Ypač palankios sąlygos Fusarium genties pelėsinių grybų plitimui

susidaro tuose regionuose, kuriuose kritulių iškrinta daugiau nei jų išgaruoja (FAO, Food and

Nutrition paper, 2001). Lietuva taip pat priskiriama tokiems regionams.

2.1.2. Deoksinivalenolio reguliavimas tarptautinėje praktikoje

Pastaruoju metu atkreiptas dėmesys į Fusarium genties pelėsių gaminamus mikotoksinus

ir nuo 2006 m. liepos 01 d. ES pagal priimta Europos bendrijų komisijos reglamentą (EB) Nr.

856/2005, dėl Fusarium toksinų numatoma papildomai reguliuoti pagrindinį jų atstovą –

deoksinivalenolį (DON). Šios rūšies mikotoksinų susidarymą pagrinde nulemia klimatinės

sąlygos, dėl to labai sunku išvengti šių mikotoksinų pirminėje grūdų gamybos grandinėje.

DON yra labiausiai paplitęs augaliniuose produktuose mikotoksinas (antras po

aflatoksino) ir jo acetilo dariniai 3-AcDON ir 15-AcDON bei nivalenolis (NIV) (H. Petterson,

L. Aberg, 2003). Todėl akivaizdu, jog šio mikotoksino analizei turėtų būti skirtas pakankamai

didelis dėmesys.

Su mikotoksinų veikla siejami dideli ekonominiai nuostoliai, žalingas fuzariozinių grūdų

poveikis žmogaus sveikatai, gyvulių produktyvumui ir t.t..

8

Turint omenyje, kad DON daugiausiai yra grūduose, o pastarieji sudaro apie 60 %

žmogaus ir gyvūnų suvartojamo maisto ar pašaro kiekio, galima tik įsivaizduoti problemos

mastą. JAV Žemės ūkio mokslo ir technologijos mikotoksinų tarybos (Council for Agriculture

Science and Technology (CAST) in the US on Mycotoxins) ataskaitoje pateikta mikotoksinų

grūduose problemos piniginė išraiška. Šios ataskaitos 142 puslapyje rašoma: ,,Nustatyta, jog

dėl DON grūdų (daugiausia kviečių ir kukurūzų) nuostoliai per metus vidutiniškai sudaro 637

mln dolerių, pašarų nuostoliai – 18 mln dolerių. Gyvulininkystė kasmet patiria 2 mln dolerių

nuostolių”. Įvertinant, kad tokie nuostoliai skaičiuojami ypač išsivysčiusioje šalyje – JAV, kur

mitybos saugos reguliavimo režimas lyginant su kitomis šalimis gana “švelnus”, ir kad šie

duomenys apima tik kviečius ir kukurūzus, o ne visus javus, pavyzdžiui, miežius ir rugius,

kuriuos taip pat pažeidžia Fusarium pelėsiniai grybai, galima tik įsivaizduoti, kokie dideli

kasmet yra šie nuostoliai visame pasaulyje (bln dolerių!). ES panašūs skaičiavimai kol kas

nėra atlikti, tačiau žinant, kad ES reguliavimo politika mikotoksinų srityje daug griežtesnė nei

JAV, o taip pat vyrauja skirtingos klimato zonos, kritulių kiekis, perdirbimo (džiovinimo)

technologijos ir kad ES padidėjo, prisijungus 10 mažiau išsivysčiusių šalių, nuostolių apimtys

fuzariozės protrūkio metu turėtų siekti apie 1 bln eurų per metus. Pagal FAO, žemės ūkio

produktų nuostoliai dėl visų mikotoksinų išsivysčiusiose šalyse turėtų sudaryti apie 5 %,

mažiau išsivysčiusiose šalyse – nuo 15 iki 20 %, o besivystančiose šalyse – iki 50 %. Kad ir

kokie būtų dabartiniai ekonominiai nuostoliai ES, jie, manoma, didės sugriežtinus

mikotoksinų reguliavimo politiką. Dabartinis grūdų užkrėstumo mikotoksinais lygis ES ir

mirčių atvejai, valgant duoną, pagamintą iš užkrėstų kviečių, praeityje: Tarybų Sąjungoje tuoj

po Antrojo pasaulinio karo (mirtingumas sudarė 60 %), Kašmyro slėnyje Indijoje 1989 m.

(pakenkta 50000 žmonių sveikatai) ir Raudonajame Slėnyje, tai paskatino ES parengti naują

mikotoksinų kiekio reguliavimo reglamentą. Lietuvos, kaip grūdų eksportuotojos, pozicija

nėra stabili ir priklauso nuo leistinų DON normų priimtame reglamente, kuris įsigaliojo nuo

2006 m. liepos 1 dienos. Be poveikio žmonėms, net ir santykinai mažas DON kiekis grūduose

turi neigiamą poveikį gyvuliams. Kiaulėms jis pasireiškia esant pašaruose DON kiekiui

mažesniam nei 350 µg/kg, todėl Europos grūdų pašarų asociacija (EGFA) pasiūlė, kad kiaulių

pašarams gaminti skirtuose grūduose DON kiekis neturi viršyti 750 µg/kg.

Dėl šių priežasčių ypatingas dėmesys pradėtas skirti DON kiekio grūduose kontrolei.

ES vartojamo maisto tyrimai – Mokslinės bendradarbiavimo programos (Scientific Co-

operation Program – SCOOP) veiklos sritis ir šios organizacijos pranešime “Fusarium toksinų

maiste analizės rezultatai ir jų leistinos paros dozės įvertinimas pagal ES senųjų narių

gyventojų tyrimo rezultatus (SCOOP TASK 3.2.10)”, DON skiriamas ypač didelis dėmesys

9

šalia kitų mikotoksinų. Tyrimai parodė, kad ES nepalankaus klimato metais DON kiekis

grūduose gali siekti iki 10000 μg/kg. Todėl reglamento projektas, kuriame patvirtintos

didžiausios leistinos DON koncentracijos grūduose ir jų produktuose apie 1250 - 200 µg/kg

(kaip parodyta 2.1 lentelėje), gali apsunkinti maisto saugos kontrolę grūdų perdirbimo

grandinėje. Yra nemažai pranešimų apie Europoje užaugintuose grūduose randamą DON

kiekį, kuris viršija ES reglamente numatytas jo ribas. Neseniai nustatyta, jog ketvirtadalyje

Danijoje užauginamų žieminių kviečių DON kiekis viršijo 1250 µg/kg (T. Borjesson, J.

Olsson, 2004). Jeigu šis faktas būtų ignoruojamas, kai kurios pramonės šakos tikriausiai

patirtų nemažus nuostolius, galinčius susidaryti dėl pašarų netinkamumo, mažesnio gyvulių

svorio prieaugio ir prastesnės mėsos kokybės.

Tai skatina grūdų supirkėjus ir perdirbėjus būti suinteresuotais eliminuoti fuzarioze

užkrėstus susiraukšlėjusius grūdus (“Scab”) galimai ankstesnėse grūdų perdirbimo grandyje ir

užkirsti kelią DON patekimui į grūdų produktus.

2.1 lentelė. Leistinas DON kiekis grūduose ir grūdų produktuose

Nr. DON grūduose ir grūdų produktuose, išskyrus ryžius ir ryžių produktus

Maksimali koncentracija µg/kg

1. Neperdirbti grūdai1, išskyrus durum kviečius, avižas ir kukurūzus 1250

2. Neperdirbti durum kviečiai, avižos ir kukurūzai2 1750

3. Grūdų miltai, jų tarpe kukurūzų miltai, kukurūzų kruopos, kukurūzų maistas ir kiti panašūs produktai, kaip kruopmilčiai

750

4. Duona, tortai, sausainiai, užkandžiai ir grūdų pusryčiai 500

5. Makaronai (sausi) 750

6. Grūdų pagrindu pagamintas kūdikių ir mažų vaikų maistas3 200

Pastabos: 1 “Neperdirbti grūdai”- tai superkami grūdai, skirti pirmai perdirbimo stadijai 2 Jei iki 2007 liepos 1d. nebus pakeitimų, bus palikta norma 1750 µg/kg 3 Visos maksimalios normų ribos pateiktos sausosiomis medžiagomis

10

2.1.3. Trichotecenų nustatymo metodai

Pasaulinėje praktikoje mikotoksinų nustatymui iki šiol dažniausiai naudoti daug darbo

jėgos ir laiko reikalaujantys cheminiai fizikiniai pamatiniai mikotoksinų analizės metodai,

tai yra: plonasluoksnė chromatografija (PLC), skysčių chromatografija (SC) arba dujų

chromatografija (DC) su įvairiais detektoriais, įskaitant ir masių spektrometriją (MS), o iš

naujesnių metodų – DC su liepsnos jonizacijos detektoriumi (LJD), skirtą kviečiuose esančio

DON, išekstrahuoto CH3CN/H2O ir išgryninto pagal Mycosep metodiką nustatymui. Taip pat

ELISA, PCR ir kt. metodai (Task Force Report, 2003).

Mikotoksinų analizės procedūra, kuri pateikta 2.1 paveiksle, yra sudėtingas procesas

sudarytas iš trijų etapų:

1. Ėminių iš grūdų partijos paėmimas ir laboratorinio ėminio atskyrimas;

2. Tiriamojo ėminio atskyrimas ir smulkinamas, tiriamosios ėminio dalies atskyrimas;

3. Mikotoksinų iš tiriamosios ėminio dalies ekstrahavimas ir jų kiekio nustatymas

(analizuojama laboratoriniais pamatiniais metodais, pavyzdžiui, PLC, SC/MS, DC-

LJD, ELISA, PCR ir t.t.). Šie metodai paprastai apima tokius etapus: ekstrahavimą

tirpikliais, centrifugavimą, filtravimą, džiovinimą, praskiedimą ir kiekybinį įvertinimą.

Esant daugiapakopei mikotoksinų analizei, pakartotinų tyrimų rezultatai gali tarpusavyje

smarkiai skirtis. Be to, šie skirtumai didėja, didėjant mikotoksinų koncentracijai tiriamajame

ėminyje.

2.1 pav. Mikotoksinų analizės procedūra

Partija

Ėminio paėmimas

Tiriamojo ėminio paruošimas

Tiriamoji ėminio

Struktūrą ardanti

procedūra

Bekontaktinė procedūra

Analizė

DON REZULTATAI

11

Vokiečiai, pirmieji pradėję reguliuoti (prieš ES išleidžiant reglamentą) DON kiekį

grūduose (500 µg/kg), nustatė, jog ES galiojančios grūdų ėminių ėmimo procedūros

neatspindi tikrojo mikotoksinų kiekio grūduose ir jas reikia keisti, t.y. didinti laboratorinio

ėminio kiekį arba ėminių DON analizei skaičių. Šiuo požiūriu ypač išryškėja privalumas

greitų ir paprastų metodų, sąlygojančių greitą analizę ir leidžiančių ištirti daugiau grūdų

ėminių su mažesnėmis sąnaudomis (laiko, personalo, cheminių medžiagų ir t.t.). Pastaruoju

metu didelis dėmesys skiriamas greitų ir paprastų metodų kūrimui. ES šioje srityje atsilieka

nuo pagrindinių grūdų eksportuotojų: JAV, Kanados ir kt., kur jau įdiegtos reikiamos grūdų

kontrolės sistemos. Pavyzdžiui, firma Acurum, remiama Kanados grūdų komisijos (CGC),

išvystė vaizdo analizės būdu veikiantį prietaisą su kompiuterinių duomenų apdorojimu

defektuotų grūdų įvertinimui ir apibūdinimui. Tačiau pastaroji technika iki šiol neįvertina

DON kiekybiškai. Be to, ši technika yra brangi ir naudoja mažą mėginio kiekį, kas neatitinka

ES reikalavimų reprezentatyviam mėginiui sudaryti.

Įvertinant tai, kad metodai mikotoksinams tirti sudėtingi ir brangūs, todėl grūdų produktų

gamybos procesuose išskirtinis dėmesys turi būti skiriamas technologinėms priemonėms,

sąlygojančioms mikotoksinų sumažinimą, o tuo pačiu ir RVASVT sistemos užtikrinimą

gamybos procese.

2.1.4. Galimas mikotoksinų sumažinimas technologinėmis priemonėmis

Trichotecenai yra Fusarium, Myrothecium, Trichotehecium, Cephalosporium,

Verticimosporium ir Stachybotrys geno antrinio metabolizmo produktai (Q. K. Beg, M.

Kapoor, L. Mahajan, G. S. Hoondal, 2001). Juos gali pagaminti mikroorganizmai prieš ir po

derliaus 0 ir 35 ºC temperatūroje, kai santykinis drėgnis 80 % - 90 %. Užkrėsti javai yra

pagrindiniai nemakrociklinių trichotecenų šaltiniai maiste ir gyvulių pašaruose, ypač tokiuose

grūdiniuose javuose kaip avižos, kviečiai, kukurūzai ir ryžiai (R. V. Bhat, S. R. Beedu, Y.

Ramakrishna, K. L. Munshi, 1989).

Trichotecenai yra palyginti stabilūs apdorojant maisto gaminius, todėl sunkiai

pašalinami net iš nelabai užkrėstų grūdų. Tyrinėtojų dažniausiai randami DON ir B grupės

trichotecenas. Kitas, T-2 toksinas, yra A grupės trichotecenas. Jis yra labai toksiškas ir

dažniausiai randamas maisto produktuose.

Keletas autorių: Smitas (1990), Skotas (1984,1993), Benetas ir Ričardas (1996),

studijavo šių mikotoksinų detoksifikaciją. Detoksifikacijai buvo pasitelktos fizikinės,

cheminės ir mikrobiologinės procedūros, kurios galėtų sunaikinti, modifikuoti arba absorbuoti

12

šiuos mikotoksinus ir tokiu būdu redukuoti arba eliminuoti jų toksinį poveikį. Grūdams

panaudojant fizikinį procesą galima sumažinti pelėsinių grybų lygį ir jų užkrečiamuosius

metabolitus. Tarp šių procesų valymas ir malimas yra pagrindiniai, bet jų rezultatai skiriasi,

priklausomai nuo mikotoksinų ir kokia procedūra buvo analizuojama. Fermentacijos metu,

gaminant duoną iš kviečių, užkrėstų DON, buvo įrodyta, kad mikotoksinus, ypač DON,

galima pašalinti.

Skotas (1992) atliko mini alkoholinės fermentacijos su Saccharomycies cerevisiae

eksperimentus, panaudojant salyklą, užkrėstą DON ir zearalenonu, kurių rezultatai po 7-9

dienų trukusios fermentacijos parodė, kad DON buvo sunkiai skaidomas (stabilus). Iš

pradinio zearalenono turinio 69% pavirto į ß- zearalenolį (ß-ZEL) ir 8,1% į α- zearalenolį.

Daugiausiai zearalenonas metabolizavosi pirmąją ir antrąją fermentacijos dieną, kas parodo

šių mikotoksinų nestabilumą vykstant fermentacijai. Mielės Saccharomycies cerevisiae

sumažina T-2 toksino ir DON lygius alkoholinės fermentacijos metu.

Kitos mielės Candida lipolytica, panaikina 12% pradinio kiekio T-2 toksino per 23

dienas.

Pagal Benetą ir Richardą (1996), DON nebuvo visiškai panaikintas alkoholinės

fermentacijos metu ir jo kiekis buvo pakankamai didelis tiek kietuose radikaluose, tiek ir

fermentuotame skystyje. Tas pats taikoma ir zearalenonui, ir fumonisinui. Šie rezultatai

parodo, jog kitos procedūros - tankumo skaidymas, veikimas cheminiais reagentais ar tik

plovimas vandeniu, turėtų būti taikomos grūdams, vartojamiems kaip žaliava fermentacijai, o

taip pat, kad fermentacijos poveikis užkratui pašalinti turėtų būti labiau įvertintas.

Taip pat, literatūroje yra duomenų apie alkoholinės fermentacijos poveikį salyklui,

užkrėstam trichotecenais. Salyklas, užkrėstas DON ir T-2 toksinų nuo 0 iki 1000 ng/g, buvo

panaudotas fermentacijai pagal laboratorinę skalę nustatyti minėtų toksinų dezaktyvacijai,

taikant alkoholinę fermentaciją, naudojant Saccharomyces cerevisiae. Fermentacija buvo

atliekama 120 h 14 ºC. Užkrato redukcija buvo įvertinta GC. 41 % pradinio DON ir T-2

toksino užkrato buvo pervesta į galutinę skysčio porciją. 6 % pradinio užkrato buvo nustatyta

augaluose, kuriuose buvo 53 % viso DON ir T-2 toksino užkrato, skaičiuojant kartu augaluose

ir filtruotame pavyzdyje.

Perdirbimas nėra labai efektyvus būdas mikotoksinams šalinti, tačiau jis yra lemiamas

norint kiek galima daugiau užkirsti kelią jų susidarymui.

Kai kurie maisto priedai ir natūralios maisto sudėtinės dalys gali sulaikyti pelėsių

augimą ir sumažinti užterštumą mikotoksinais. Dabartiniai maisto priedai, tokie kaip sodos

bisulfidas, sorbatas, propionatas ir nitratai sumažina aflatoksinų kiekį produkcijoje. Natūralūs

13

maisto komponentai ir prieskoniai, pavyzdžiui, pipirai, garstyčios, cinamonas, česnakas, taip

pat gali būti mikotoksinų inhibitoriais užterštoje produkcijoje.

Sutelkta daug pastangų, siekiant apsaugoti grūdus nuo užterštumo mikotoksinais.

Pasirodė, kad tiek amoniakas, tiek ozonas ardo tuos pačius grūduose esančius mikotoksinų

tipus ir nelieka jokio žalingo poveikio ar nuosėdų produkte.

Fusarium graminearum ir Fusarium culmorum grybai pagrindinės priežastys

atsiradimui DON kviečiuose. DON – trichotecenas mikotoksinas, kuris trukdo DNR, RNR

baltyminę sintezę, o tai gali sukelti gyvuliams apetito nebuvimo sindromą ir t.t..

2.1.5. Kovos su mikotoksinų daroma žala strategijos

Nuolatiniai žemės ūkio ir maisto gamybos tyrimai, taip pat FDA tyrimai leidžia aptikti

pėdsakus užteršto pašaro ir maisto produktų. Užterštų produktų protrūkis, peržengiantis

leistinas ribas ir naikinimas užterštų grūdų likučių, padeda išlaikyti mikotoksinų lygį

pašaruose ir maisto daviniuose gerokai žemesnį nei problemišką.

Žemės ūkio technika, tokia kaip grūdų džiovinimas oru ar kontroliuojamos saugyklos

sąlygos padeda palaikyti drėgmės lygį žemiau kritinio ir tokiu būdu mažėja pelėsių augimas ir

galimas užterštumas mikotoksinais. Atitinkama drėgmė grūdų augimo metu (dėl lietaus,

melioracijos) ir grūdų sėjomaina leidžia sumažinti užterštumą mikotoksinais.

Kai kurie vitaminai, esantys maiste, veikia prieš žalingą mikotoksinų veikimą. Jei

fermeriai nuspręs nedžiovinti grūdų, drėgmė, esanti grūduose gali sukelti pelėsių augimą, tai

galimi nuostoliai ekonominiu požiūriu bei susirgimai.

Namuose labai svarbu mažinti supelėjusio maisto patekimo galimybę į maisto racioną.

Dauguma žmonių išmeta maistą, kuriame galimi pelėsių požymiai. Pavyzdžiui, sūris yra

išimtis, kur supelėję paviršiai gali būti pritaikomi. Kai aflatoksinai įsiskverbia į produktą 4 cm

nuo paviršiaus, giliai nupjaudami garantuojame, kad produktas bus saugus. Jei yra apipelėję

visi sūrio paviršiai, galime jį apipjaustyti ir apipjaustytas dalis išmesti, nes taip bus saugiau.

Maistas, kuris yra skystas, pavyzdžiui, sultys, džemai ir kt., tokiu atveju neturėtu būti

vartojami maistui. Dauguma toksinų yra termostabilūs, todėl tolimesnis šildymas nepadaro

maisto saugiu. Šaldymas taip pat nesustabdo toksinų veikimo.

Duona, kurioje nėra konservantų, pelėja greičiau. Pagaliau, mes galime rinktis ką pirkti,

ar duoną su konservantais ir pasitenkinti nerizikingu mažu kalcio propionato poveikiu arba

pirkti duoną be konservantų. Duona be konservantų pelėja greičiau, sukeldama 100 % riziką,

dėl natūralaus kancerogeno aflatoksino. Tačiau mes galime sušaldyti duoną, kad sumažintume

14

pelėsių ir mikotoksinų gamybą, tačiau duona greičiau sužiedėja šaltoje temperatūroje. Jei yra

pakankamai vietos šaldytuve, riešutų ir grūdų produktų laikymas šaltai padeda apsaugoti nuo

pelėsių augimo ir išlaikyti jų optimalią kokybę.

Taigi, dėl pelėsiais užteršto maisto mes turime keletą rizikos galimybių. Mes galime

pasirinkti kokią norime riziką pirkdami atitinkamus produktus turguje arba prisiimdami

atsakomybę laikyti produktus saugiai namuose. Augdami ir vystydamiesi ant grūdų, ypač Fusarium genties pelėsiniai grybai ne tik

juos užteršia toksinais, bet ir blogina juslines, technologines savybes, mažina grūdų ir jų

produktų maistinę vertę. FAO duomenimis dėl fuzariozės padarytos žalos grūdams, kasmet

pasaulis patiria bilijonus dolerių nuostolių. Užkrėsti grūdai turi neigiamą poveikį gyviems

organizmams. Be to, net ir mažas DON kiekis grūduose, veikia gyvulius: kiaulės vemia ir

joms krenta svoris. Ryšium su tuo iškyla aktuali DON nustatymo ir detoksifikavimo

technologiniuose procesuose problema. Šios problemos skatina vystyti pažangias

biotechnologines priemones mikotoksinams detoksifikuoti ir bekontakčius metodus, kuriuos

būtų galima pritaikyti DON kontrolei maisto grandyje.

15

3. DARBO METODIKA

3.1. Pagrindinės tyrimų kryptys ir jų pagrindimas

Sprendžiant mikotoksinų detoksikacijos problemą fuzarioze užkrėstų kviečių perdirbimo

procesuose, išbandytos įvairios biotechnologinės priemonės: duonos raugų gamyboje –

pienarūgštis rūgimas, o bioetanolio gamyboje – grūdinės žaliavos sucukrinimas ir spiritinis

rūgimas. DON aptikimui fuzarioze užkrėstuose kviečiuose išbandytas greitas bekontaktis

akustinis metodas. Pagrindiniai tyrimų etapai pateikti 3.1 paveiksle.

Fuzarioze užkrėsti kviečiai su padidintu

DON kiekiu

Greito akustinio metodo DON aptikimui

pritaikymas

DON detoksikacijos galimybių tyrimai

įvairiuose fermentaciniuose

procesuose

Bioetanolio gamyboje

Kvietinės duonos raugų gamyboje

Optimalaus akustinio

signalo dažnio parinkimas

2005 m. LŽI kviečių kolekcijos tyrimai,

įvertinant riklausomybę tarp Ap ir ELISA metodų;

Ap verčių ir susiraukšlėjusių kviečių grūdų kiekio modelinėse

sistemose

Raugų fermentacija įvairiomis pieno

rūgšties balterijomis

Grūdinės žaliavos sucukrinimas įvairiais

fermentiniais preparatais

3.1 pav. Pagrindiniai tyrimų etapai

Pirmojo darbo etapo metu tirtos akustinio metodo panaudojimo galimybės DON

aptikimui fuzarioze užkrėstuose kviečiuose:

• parinktas akustinio signalo (Ap) dažnis, kuris naudotas tolesniuose akustiniuose

tyrimuose;

• atliktas vystomo akustinio metodo palyginamasis įvertinimas su tradiciniu ELISA

metodu;

• įvertinta susiraukšlėjusių kviečių grūdų kiekio masėje įtaka akustinio signalo amplitudės

vertėms.

16

Pastaba. Kadangi kviečių grūdų drėgnis, gali turėti įtakos akustinio signalo parametro

vertėms, eksperimento metu jis buvo pastovus (13,0 %). Kiti kviečių kokybės rodikliai,

galintys įtakoti akustinių tyrimų tikslumą: priemaišų kiekis grūdinėje žaliavoje, grūdų

stambumas, eksperimento metu buvo eliminuoti tokiu būdu: kviečiai sijoti pro Nr.8 sietą

(2 x 20 mm), kad pašalinti šiukšlines priemaišas ir smulkesnius grūdus. Stambioji frakcija,

likusi ant sieto, naudota tolesniam tyrimui.

Antrojo darbo etapo metu išbandytos įvairios biotechnologinės priemonės

mikotoksinams detoksikuoti technologinių procesų metu:

• duonos raugų gamyboje – pienarūgštis rūgimas;

• bioetanolio gamyboje – grūdinės žaliavos sucukrinimas ir spiritinis rūgimas.

3.2. Tyrimų objektai, medžiagos ir jų paruošimas analizei

3.2.1. Grūdinės žaliavos charakteristika

Tiriant akustinio metodo panaudojimo galimybes DON aptikimui fuzarioze užkrėstuose

grūduose, analizuoti kviečių grūdai, užauginti 2005 metais Lietuvos žemdirbystės instituto

bandimąjame ūkyje. Kviečių mėginiai su nustatytais DON kiekiais ELISA metodu pateikti

3.1 lentelėje.

Šie kviečių mėginiai analizuoti tiek akustiniu, tiek ir tradiciniu ELISA metodu. Pagal

gautus tyrimų rezultatus parinktas optimalus akustinio signalo dažnis ir atliktas vystomo

akustinio bei tradicinio ELISA metodo palyginamasis įvertinimas.

Papildomai fuzarioze užkrėstų grūdų tyrimai atlikti su modelinėmis kviečių sistemomis.

Tam į prasijotus per Nr.8 sietą (2 x 20 mm) sveikus kviečių grūdus, gautus iš AB „Kauno

grūdai“ (13,0 % drėgnio), buvo įmaišomi fuzariozės pažeisti (susiraukšlėję) kviečiai – iš

Olandijos malūno. Jų charakteristikos pateiktos 3.2. lentelėje.

Kviečių mėginiai ruošti tyrimui, susiraukšlėjusius kviečių grūdus (užkrėstus fuzarioze)

maišant su sveikais kviečių grūdais. Į kiekvieną sveikų grūdų mėginį pridedama atitinkamai

10 %, 20 %, 30 %, 40 % ir 50 % susiraukšlėjusių grūdų. Analizės mėginiai: K – sveiki

kviečiai, Fmax – maksimalus kiekis susiraukšlėjusių kviečių grūdų ir jų mišiniai: K+10% Fmax,

K+20% Fmax, K+30% Fmax, K+40% Fmax, K+50%. Gauti kviečių mišinių mėginiai, kurių

kiekvieno masė – 200 g, naudoti tolesniam tyrimui.

17

3.1 lentelė. Kviečių mėginiai

Mėginio Nr. DON kiekis, μg/kg 268 139 270 98 271 69 272 16 273 29 276 119 277 113 280 112 281 28 288 62 306 76 310 56 312 123 334 86 336 83 338 81 389 32 390 105 391 27 392 236 393 97 394 162

3.2 lentelė. Fuzariozės pažeistų (susiraukšlėjusių) kviečių charakteristikos

Grūdinė žaliava

Drėgnis, %

Krakmolo kiekis, %

s.m.

1000 grūdų masė, g

DON kiekis*,

ppm

DON, % s.m.

DON kviečiai 9,2 64,7 37,6 2,3 0,254 * nustatyta ELISA metodu

Pagal kviečių modelinių sistemų tyrimų rezultatus įvertinta susiraukšlėjusių kviečių

grūdų kiekio masėje įtaka akustinio signalo amplitudės vertėms.

Fuzarioze užkrėstų kviečių grūdai (3.2. lentelė) buvo sumalti WZ-1 tipo laboratoriniu

malūnu (ZBPP, Lenkija) ir naudoti tolesniame eksperimente, kaip žaliava kvietinei duonai ir

bioetanoliui laboratorinėmis sąlygomis gaminti.

18

3.2.2. Kvietinės duonos su raugu gamyba

Kvietinė duona gaminta tradiciniu būdu su raugais, kurie buvo fermentuoti įvairiomis

pieno rūgšties bakterijomis:

1) Lactobacillus bulgaricus kamienų mišinys 148/3;

2) Lactobacillus acidophilus kamienų mišinys 336.

Pastaba: P/r bakterijų suspensija iki naudojimo laikyta 4 oC temperatūroje.

Pieno rūgšties bakterijų kultūros gautos iš KTU Maisto instituto pieno rūgšties bakterijų

kolekcijos. Jų charakteristikos pateiktos 3.3 lentelėje.

3.3 lentelė. Pieno rūgšties bakterijų kultūrų charakteristikos

Pieno rūgšties bakterijų kultūros

Tipas Optimali temperatūra,

oC

Metabolizmo produktai

Lactobacillus bulgaricus

homofermentinės 45 Acto rūgštis, pieno rūgštis (2,5-3,5 %), acetaldehidas

Lactobacillus acidophilus

homofermentinės 37 Acto rūgštis, pieno rūgštis (iki 2,2 %)

Kepinių receptūra ir technologinio proceso parametrai pateikti 3.4 lentelėje.

3.4 lentelė. Kvietinių kepinių receptūra ir technologinio proceso parametrai

Receptūriniai komponentai: Komponentų kiekis DON miltai, viso, g: raugui tešlai

400 120 280

Mielės 1,8 Druska 1,5 Pieno rūgšties bakterijų suspensija, ml 5 Vanduo pagal apskaičiavimus Technologinio proceso parametrai: raugo drėgnis, % 45 tešlos drėgnis, % 45 tešlos rauginimo temperatūra, oC 32 ±2 tešlos rauginimo trukmė, min. 210 kepimo temperatūra, oC 120 kepimo trukmė, min. 60

19

Technologinė kvietinės duonos iš DON užterštų miltų gamybos schema pateikta 3.2

paveiksle.

DON miltai

Rauginimas 37oC (L. acidophilus), 45oC (L. bulgaricus)

Drėgnis 45 %, Trukmė 22 val.

Tešlos maišymas Vanduo Mielės Druska

Drėgnis 45 %

Rauginimas Temperatūra 32±2oC,

trukmė 210 min.

Kepimas Temperatūra 120oC,

trukmė 60 min.

30 % 70 % + vanduo

Raugas

3.2 pav. Technologinė kvietinės duonos su raugu gamybos schema

Bandomiesiems duonos kepimams tešla buvo ruošiama iš 400 g miltų. Kvietinės duonos

gamyba buvo vykdoma toliau išvardintomis stadijomis.

Raugo ruošimas. Ruošiamo raugo drėgnis 45 %. Į indą sudedama 30 % DON miltų ir

supilamas apskaičiuotas vandens kiekis. Į gautą masę supilama 5 ml paruoštos pieno rūgšties

bakterijų suspensijos. Masė gerai išmaišoma. Rauginimas vykdomas termostate optimalioje

pieno rūgšties bakterijų kultūroms temperatūroje: 37 oC (L. acidophilus) ir 45 oC (L.

bulgaricus). Rauginimo trukmė apie 22 val. (išrūgusio raugo pH 3,5).

Tešlos ruošimas. Į maišymo indą supilamas likęs DON miltų kiekis (70 %), supilamas

apskaičiuotas vandens kiekis, sudedamos mielės, druska ir išrūgęs raugas. Tešla išmaišoma

iki vienalytės konsistencijos ir rauginama termostate 32 ±2 oC temperatūroje 210 min.

Išrūgusios tešlos pH 4,4.

Duonos kepimas. Duona buvo kepama automatinėje duonkepėje BM-2 (Germatic,

Vokietija). Kepimo temperatūra 120 oC, trukmė 60 min.

Kontrolinė tešla buvo ruošiama be pieno rūgšties bakterijų raugo.

DON kiekis (sausosiomis medžiagomis) buvo įvertintas fermentuotuose kvietiniuose

pusgaminiuose (išrūgusiame rauge, įmaišytoje tešloje, išrūgusioje tešloje) ir gatavuose

20

kepiniuose. Kontrolei duona buvo ruošta be raugo. Pusgaminių rūgimo proceso metu tirtas

bendras titruojamasis rūgštingumas (LST 1439, 1996).

3.2.3. Bioetanolio gamybos technologinė schema

Šiame tiriamojo darbo etape tirta fermentacijos proceso, perdirbant DON užkrėstus

kviečius į techninį etanolį, naudojant karbohidrazių klasės fermentus, įtaka DON kiekiui

žlaugtuose.

Grūdinės žaliavos fermentacija bioetanolio gamybai buvo vykdoma laboratorinėmis

sąlygomis, pritaikius žemų temperatūrų technologinę schemą (3.3 pav.).

Masės paruošimas DON miltai + 90ºC vanduo

Masės šutinimas Temperatūra 90ºC, trukmė 30 min.

Krakmolo suskystinimas Vilzim SKA, pH 6,0-6,5

Temperatūra 65ºC, trukmė 90 min.

Krakmolo sucukrinimas Vilzim SKK, Vilzim SKG, pH 5,0-6,0 temperatūra 55-60ºC, trukmė 120 min.

Sucukrintos masės rauginimas Mielės

Temperatūra 32-34ºC, trukmė 72 h

Raugalo filtravimas ir žliaugtų džiovinimas

3.3 pav. Grūdinės žaliavos fermentacijos bioetanolio gamyboje technologinė schema

21

Nustačius krakmolo kiekį kviečių grūduose, 100 g sumaltų DON užkrėstų kviečių grūdų

(DON miltai) buvo sumaišyta su 90 oC temperatūros vandeniu ir tokios temperatūros vandens

vonioje išlaikyta 30 min.

Fermentiniai preparatai. Grūdinės žaliavos hidrolizei bioetanolio gamybai naudoti skysti

fermentiniai preparatai: α–amilazė (Vilzim SKA) ir gliukoamilazė (Vilzim SKG) bei

papildomai ksilanazės (Vilzim SKK), kurie buvo pagaminti AB "Biosintezė".

Pažymėtina, kad amilazės ir gliukoamilazės fermentiniai preparatai yra tradiciniai,

naudojami grūdinės žaliavos sucukrinimui. Šiame darbe, fermentuojant fuzariozės pažeistus

kviečius, be tradiciškai naudojamų amilolitinių fermentų, panaudota ne krakmolo

polisacharidus skaldanti grybinė ksilanazė (fermentinis preparatas VILZIM SKK). Šių

fermentinių preparatų charakteristikos pateiktos 3.5 lentelėje.

3.5 lentelė. Fermentiniai preparatai ir jų charakteristikos

Fermentinis preparatas

Aktyvus fermentas

Aktyvumas,AV*/m

l

Mikro-organizmas

Optimali temperatūra

ºC

pH Kiekis, AV*/1g

krakmolo

Vilzim SKA

α-amilazė 2350 Bacillus subtilis

60-70 6,0-6,5

1,5 - 2,0

Vilzim SKG

gliuko-amilazė

2500 Aspergillus awamori

55-65 5,0-6,0

3,5 – 4,5

Vilzim SKK β-ksilanazė

2540 Trichoderma reesei

50-60 5,0-6,0

-

*AV – fermentų aktyvumo vienetas, nustatytas pagal AB " Biosintezės " standartinius metodus

Grūdinės žaliavos fermentacijai buvo naudotos presuotos mielės Saccharomyces

cerevisiae.

Suskystinimo proceso trukmė 90 min. (pH 6,0-6,5). Krakmolo ir ne krakmolo

polisacharidų sucukrinimui, suskystinta masė, pridėjus fermentinių preparatų Vilzim SKG

(3.6 lentelė) ir skirtingą Vilzim SKK kiekį, buvo išlaikyta 55-60 ºC temperatūroje 120 min.

Etanolio gamyboje rekomenduojamos fermentų dozės pateiktos 3.6 lentelėje.

3.6 lentelė. Eksperimente naudoti fermentiniai preparatai ir jų kiekiai

Žaliava Vanduo Vilzim SKA, AV/100 g

Vilzim SKG, AV/100 g

Vilzim SKK, AV/100 g

DON miltai 1:5 150 300 250-350

22

Sucukrinta masė buvo atšaldyta iki 32 ±2 oC temperatūros ir, pridėjus 5 g presuotų

kepimo mielių (Saccharomyces cerevisiae), vykdyta masės fermentacija uždarame inde,

turinčiame išvestą vamzdelį, išsiskyrusioms rauginimo metu CO2 dujoms surinkti.

Fermentacijos trukmė – 72 val.

Fermentuotas raugalas buvo filtruojamas per medžiaginį filtrą. Eksperimentas buvo

kartotas du kartus. Vienu atveju gauti žlaugtai buvo išdžiovinti 40 oC temperatūroje, o antru

atveju tirti be džiovinimo. Mėginiuose nustačius drėgmės kiekį, jie analizuoti ELISA metodu

deoksinivalenolio (DON) kiekio nustatymui.

3.3. Tyrimų metodai

3.3.1. Metodai fuzarioze užkrėstiems grūdams įvertinti

3.3.1.1. Akustinio metodo charaketristika

Fusarium pažeistų grūdų struktūrinių savybių, lyginant su kontroliniais kviečių grūdais,

pokyčiams įvertinti naudotas KTU Maisto produktų technologijos katedroje vystomas

akustinis metodas, kuriuo įvertinama perėjusio per tiriamą objektą akustinio signalo

amplitudės vertė (Ap).

Akustinis metodas, priskiriamas prie greičiausių ir perspektyviausių metodų, tinkamų

fuzariozinių grūdų analizei. Tokie grūdai daugiausiai susiraukšlėję ir lyginant su sveikais

grūdais, yra smulkesni bei lengvesni. Paprastai gamybinėje praktikoje susiraukšlėję grūdai

gali būti atskiriami sijojant, o likę grūdai perduodami laikymui, užteršiant talpyklas, ar

perdirbimui. Tačiau grūdų supirkėjai ir perdirbėjai suinteresuoti, kaip užkirsti kelią Fusarium

genties pelėsiniais grybais užkrėstų grūdų patekimui į saugyklas ir įmones, nes tai gali turėti

neigiamos įtakos jų produkcijos saugai ir kokybei. Palyginti nebrangus, bekontaktis akustinis

grūdų analizės metodas yra puiki priemonė, galinti pakeisti kitus daug brangesnius ir lėtesnius

cheminius metodus. Akustinė technika sąlygoja greitą analizę ir leidžia ištirti daugiau grūdų

ėminių su mažesnėmis sąnaudomis (laiko, personalo, cheminių medžiagų) (V. Kunigėlis, M.

Senulis, 2002).

Akustinis metodas realizuotas akustiniame spektrometre, veikiančiame trumpų impulsų

4,95-35,71 kHz diapazone. Prietaiso schema pateikta 3.4 paveiksle.

23

1 1 2

3

1 0

4

79 5

8 6

1

1 2

2.4 pav. Akustinio spektrometro schema: 1 - personalinis kompiuteris, 2 – sinusinių signalų generatorius, 3- elektrinių videoimpulsų generatorius, 4 – dažnio keitimo šaltinis, 5 – dažnomatis, 6, 8 – siuntimo ir priėmimo akustinė antena, 7, 9 – maitinimo šaltiniai, 10 – oscilografas, 11 – skaitmeninis voltmetras, 12 – mėginio laikiklis

Pagal šią schemą, elektrinių videoimpulsų generatoriaus Г 5-56 (3) skleidžiami impulsai

(9 V amplitudė ir 200 μs trukmės) moduliuojami generatoriumi Г 6-28 (2) į nepertraukiamus

sinusinius elektrinius signalus. Generatoriaus (2) dažnis keičiamas dažnio keitimo prietaisu

(4) ir patikslinamas dažnomačiu (5). Sumoduliuoti elektriniai signalai perduodami į akustinę

siuntimo anteną (6). Priimti impulsai išdetektuojami pikiniu detektoriumi, esančiu priėmimo

antenoje (8) ir užfiksuojami oscilografu (10). Išdetektuoti impulsai generavimo metu

sumažinami moduliuojančiu impulsu iki nulio, po to jų vertė išmatuojama skaitmeniniu

voltmetru (11). Išmatuota impulso vertė perduodama į kompiuterį (1). Siunčiamosios

akustinės antenos (6) ir priimamosios akustinės antenos (8) stiprintuvams naudojami

nuolatinės įtampos (± 20 V) maitinimo šaltiniai (7) ir (9).

Kiti kontrolės ir standartizavimo tikslais taikomi metodai yra daug sudėtingesni ir

ilgesni, reikalauja daugiau sąnaudų, be to, tiriamąjį ėminį reikia ne tik smulkinti, bet ir atlikti

ekstrahavimą ir t.t.

24

3.3.1.2. Tradicinis imunofermentinis ELISA metodas

Dėl ypatingo mėginio išgryninimo ir brangios įrangos reikalaujančių cheminių metodų,

pastaruoju metu paplito alternatyvūs metodai – imunocheminiai. ELISA metodas naudojamas

mikotoksinų analizei. Šis metodas pagrįstas tuo, kad tam tikruose polimerų (imunosorbentų)

paviršiuose absorbuojami specifiniai antikūnai, žymėti fermentais (B. Bakutis, V.

Baliukonienė, A. Paškevičius, 2005).

Tvirtafazis imunosorbcicinis testas atliekamas keturiais etapais:

Pirmas etapas – savitųjų (žinomų) antikūnų adsorbcija imunosorbentų (tvirtosios fazės)

paviršiuje. Paprastai naudojamos bespalvės skaidrios polichlorvinilinės (silochrominės ar

akytojo stiklo) plokštelės su duobutėmis, kurių dugnai plokšti. Antikūnai nekovalentiškai

sujungiami su duobučių sienelės paviršiumi, juose lieka laisvi antikūnų aktyvieji centrai

(Fab), todėl jie išsaugo gebėjimą specifiškai sąveikauti su atitinkamais antigenais.

Antrasis etapas – pridedama žinomų antikūnų, kurie sąveikauja su antigenu, esančiu

mėginyje (tiriamoje medžiagoje), jei jie specifiški antigeno molekulėms, pirmojo etapo metu

adsorbuotoms plokštelės duobelės paviršiuje, ties tvirtosios fazės (plokštelės polimeras) ir

skysčio (antigeno tirpiklis) riba. Po to, norint iš sistemos pašalinti kitus, su antikūnais

nesujungtus komponentus, duobelės labai gerai perplaunamos tirpalu, kuriame yra silpno

nejoninio detergento.

Trečiasis etapas - tvirtoji fazė (plokštelių paviršius su prisitvirtinusiais antikūnų –

antigeno kompleksais) apdorojama homologiniais antikūnais, specifiškais vartotiems

antigenams, žymėtaisiais fermentais. Tokie žymėtieji antikūnai jungiasi su antikūnų –

antigeno kompleksų, susidariusių antrojo etapo metu, antigenais. Mėginyje esantis jų

perteklius plaunant pašalinamas.

Ketvirtasis etapas – testo vertinimas: rezultatai vertinami, atsižvelgiant į žymens

prigimtį.

Antigeno ir antikūnų kompleksas susidaro, jeigu jie yra specifiški vienas kitam. Jei

mėginyje yra antigenų, specifiškų pridėtiesiems antikūnams, sorbento paviršiuje prisitvirtina

"antikūnų-antigeno-antikūnų" kompleksas. Fermento veikimą lengva nustatyti kolorimetriniu

ar fluorometriniu būdu. Naudojami chromogenai, reaguojantys spalvinėmis reakcijomis. Jie

turi būti labai jautrūs, stabilūs ir lengvai reaguoti. Pakitusią spalvą kartais pakanka įvertinti

plika akimi, o tiksliau nustatoma fotometriniais įrenginiais. Fotometriniai matavimai

atliekami prie 450 nm bangos ilgio. Absorbcija yra atvirkščiai proporcinga DON

koncentracijai mėginyje.

25

DON radimo riba grūduose ir pašaruose – 18,5 μg/kg. DON išgavimo rodiklis – 85-110 %.

3.4.1. Metodai taikyti technologiniuose procesuose

3.4.1.1. Kvietinės duonos su raugais gamyba

Kvietinės duonos gamybos metu buvo vertinamas pusgaminių titruojamasis

rūgštingumas, lakiųjų rūgščių kiekis ir pusgaminių bei gatavų kepinių drėgnis (LST 1492,

1997).

Titruojamo rūgštingumo nustatymas: reagentai: 0,1N NaOH; fenolftaleinas (1 % spiritinis

tirpalas); distiliuotas vanduo; metodika: 5 g raugo/tešlos išmaišoma su 50 ml distiliuoto

vandens, įlašinama 3-5 lašai fenolftaleino (1 % spiritinis tirpalas) ir titruojama iki išnyks

rausvai rožinė spalva. Rūgštingumas Xp apskaičiuojamas pagal formulę:

Xp = 2 * a* k (o), (3.1)

čia: a – 0,1 N NaOH tirpalo kiekis, sunaudotas mėginio nutitravimui, ml,

k – NaOH titro pataisos koeficientas (k = 1).

Pusgaminių ir gatavų kepinių drėgniui tirti naudoti analizės metodai pateikti 3.7 lentelėje.

3.7 lentelė. Pusgaminių ir gatavų kepinių kokybės rodiklių tyrimo metodai

Rodikliai Metodo esmė Informacijos šaltinis

Pusgaminių drėgnis

Tiriamas mėginys džiovinamas (105± 1) oC temperatūroje iki pastovios masės (~2 val.). Masės sumažėjimas apskaičiuojamas masės procentais.

LST 1492:1997 [11]

Duonos minkštimo drėgnis

Susmulkintas tiriamas mėginys 45 min. džiovintas (130± 2) oC temperatūroje. Masės sumažėjimas apskaičiuojamas masės procentais.

LST 1492:1997 [11]

26

3.4.1.2. Bioetanolio gamyba

Krakmolo kiekio nustatymas grūduose poliarimetriniu metodu:

Reagentai: 1,124 % HCl; 2,5 % (NH4)MoO4; distiliuotas vanduo.

Metodika: 0,01 g tikslumu pasveriama 5 g sumaltų grūdų į 100 ml matavimo kolbą. Į ją

įpilama 25 ml 1,124 N HCl ir mišinys sukamuoju judesiu maišomas. Po to, įpilama 25 ml

1,124 N HCl ir atsargiai maišoma, kad medžiagos dalelių neliktų ant sienelių. Kolba įdedama

į verdančio vandens vonią ir intensyviai virinama 15 min. Po virinimo į kolbą įpilama 25 ml

šalto distiliuoto vandens ir tirpalo nuskaidrinimui 6 ml 2,5 % amonio molibdato tirpalo.

Kolbos turinys pripilamas distiliuoto vandens iki žymės ir gautas tirpalas filtruojamos pro

popierinį filtrą į sausą kolbą. Pirmieji 20 ml atmetami, o likęs filtratas naudojamas

poliarizacijos plokštumos sūkio kampo matavimui poliarimetru.

Grūdų krakmolo kiekis X1 masės procentais, perskaičiavus į absoliučiai sausas

medžiagas, apskaičiuojamas pagal 3.2 formulę:

WaKX−××

=100

1001

[3.2]

čia: K - perskaičiavimo koeficientas, nustatytas eksperimentiniu budu, naudojant

druskos rugšties tirpalą: kviečiams -1,898; kukurūzams -1,879; rugiams -1,885; miežiams -

1,912; avižoms -1,914; ryžiams -1,866; soroms -1,818; kvietrugiams -1,894.

Perskaičiavimo koeficientai (K) nustatyti 200 mm ilgio vamzdeliu. Jeigu naudojama 100

mm ilgio kiuvetė, pagal formulę gautas rezultatas dauginamas iš 2.

a - poliarimetro (ar sacharimetro) rodmenys skalės laipsniais;

W - malinio drėgnis procentais.

3.5. Matematinis statistinis tyrimų rezultatų įvertinimas

Eksperimento metu tyrimo duomenų patikimumui vertinti, buvo apskaičiuoti jų

aritmetiniai vidurkiai, standartinis nuokrypis, dispersija, matavimo paklaida, variacijos

koeficientas, koreliacijos bei determinacijos koeficientai, parametrų taškiniai įverčiai,

naudojant „Microsoft Excel“ programą.

27

Aritmetinis vidurkis .vidx apskaičiuotas pagal formulę:

∑=

=n

iivid x

nx

1.

1 (3.3)

čia: n - mėginių skaičius.

Reikšmių standartinis nuokrypis S skaičiuotas pagal formulę:

( )1

2

1 1

2

−

⎟⎠

⎞⎜⎝

⎛−

=∑ ∑= =

nn

xxnS

n

i

n

iii

(3.4)

Tiriant grūdus akustiniu spektrometru matavimai kartoti 10 kartų. Pagal juos atliktas

matematinis statistinis duomenų apdorojimas, įvertinant metodo tikslumą.

28

4. TYRIMŲ REZULTATAI

4.1. Akustinio metodo panaudojimo galimybių tyrimas

Fuzariozės pažeisti kviečių grūdai susiraukšlėja ir lyginant su sveikais kviečių grūdais yra

smulkesni bei lengvesni. Vystantis šiam pelėsiui ant grūdų, gaminasi DON toksinas, dėl to

pakinta grūdų struktūrinės savybės, kurios blogina juslines ir technologines savybes, mažina

grūdų ir jų produktų maistinę vertę. Todėl tikslinga išvystyti greitą akustinį metodą fuzarioze

užkrėstų kviečių grūdų struktūriniams pokyčiams aptikti, pagal kuriuos būtų galima greitai

įvertinti DON kiekį grūduose.

Kad galėtume kiekybiškai įvertinti šio toksino kiekį, pirmiausia reikia nustatyti, ar yra

koreliacinis ryšys, tarp vystomo akustinio metodo ir DON kiekio, nustatyto tradiciniu ELISA

metodu, bei įvertinti, koks šio ryšio stiprumas. Ieškant šios priklausomybės, buvo ištirta

kviečių grūdų kolekcija, užauginta 2005 metais Dotnuvos Žemdirbystės instituto

bandomąjame ūkyje. Priklausomybės įvertintos KTU Maisto produktų technologijos

katedroje esančiu akustiniu spektrometru, matuojant praėjusio per tiriamą kviečių grūdų

mėginį (apie 200g) akustinio signalo amplitudės vertes (Ap).

4.1.1. Optimalaus akustinio signalo dažnio parinkimas

Pritaikant akustinį metodą naujam tyrimo objektui - fuzariozės užkrėstiems kviečių

grūdams, reikia įvertinti atliktų matavimų tikslumą ir patikimumą. Kaip parodė ankstesni

darbai, tam didelę įtaką turi akustinio signalo dažnis, kuriam esant vykdomi matavimai (G.

Juodeikienė, V. Kunigėlis, D. Vidmantienė, W. J. de Koe, 2004).

Eksperimentui naudojant akustinį spektrometrą, praėjusio akustinio signalo vertės (Ap)

matuotos 4,95-35,71 kHz dažnių diapazone, padalintame į 64 matavimų taškus, analizės

trukmė 5 min.

Fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų tyrimo metu išmatuotos Ap vertės, esant įvairiems šio

signalo dažniams, pateiktos 4.1. lentelėje ir 4.1. paveiksle.

29

4.1 lentelė. Ap priklausomybė nuo dažnio, tiriant kviečių grūdus Dažnis, kHz Akustinio signalo amplitudė 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 vid

4.715 1.1634 1.098 1.0653 0.8366 1.0653 1.4209 1.0817 1.3767 1.0653 1.0653 1.4209 1.1509 5.2299 1.0997 1.0831 1.0831 1.133 1.0665 1.318 1.0997 1.2756 1.0831 1.0665 1.3392 1.1498 5.7449 1.1105 1.0473 1.0473 1.158 1.0473 1.4521 1.0631 1.3843 1.2055 1.0473 1.4521 1.1832 6.2599 0.9334 0.9201 0.8802 0.9733 0.9334 1.0871 0.9201 1.0871 0.8935 0.8669 1.1046 0.9636 6.7749 1.0423 1.0002 0.9861 1.0423 0.9861 1.39 0.9861 1.3467 0.9721 0.8974 1.39 1.0945 7.2899 0.9999 0.96 0.9733 1.0796 0.9334 1.3048 0.96 1.2844 0.8935 0.8669 1.3048 1.0510 7.8049 1.1299 1.0432 1.101 1.0721 1.0865 1.332 1.1154 1.2905 0.9998 0.9709 1.332 1.1339 8.3199 1.1386 1.0278 1.1525 1.1386 1.0971 1.332 1.1109 1.2905 1.0555 0.9862 1.332 1.1511 8.8348 1.2021 1.1877 1.2166 1.2021 1.1877 0.8517 1.1877 0.8652 1.1732 1.101 0.8652 1.0946 9.3498 1.0245 1.0245 1.0122 1.0368 1.0245 1.2069 1.0245 1.1881 1.0615 0.9876 1.2069 1.0725 9.8648 0.6948 0.6948 0.6948 0.7195 0.6948 1.0665 0.736 1.0499 0.6865 0.67 1.0333 0.7946

10.3798 0.9032 0.9032 0.8935 0.971 0.845 1.0156 0.8741 1.0156 0.8547 0.8547 1.0156 0.9224 10.8948 0.9177 0.9177 0.8902 0.936 0.936 1.0002 0.9543 0.9847 0.8444 0.8719 1.0002 0.9321 11.4098 0.8143 0.8297 0.822 0.8375 0.8143 0.9143 0.853 0.9143 0.8065 0.8065 0.9143 0.8479 11.9247 0.8159 0.7876 0.7947 0.8442 0.8159 0.8577 0.8301 0.8317 0.7805 0.7734 0.8317 0.8149 12.4397 0.7533 0.7473 0.7293 0.7594 0.7353 0.7744 0.7894 0.7625 0.7413 0.7233 0.7863 0.7547 12.9547 0.7422 0.7207 0.7207 0.7583 0.7261 0.7871 0.7691 0.7759 0.7207 0.71 0.7423 0.7430 13.4697 0.781 0.8023 0.7917 0.7863 0.7863 0.7917 0.8504 0.7259 0.7863 0.7436 0.7698 0.7832 13.9847 0.6429 0.6514 0.6344 0.6641 0.6259 0.7433 0.7109 0.6958 0.6344 0.6684 0.7243 0.6723 14.4997 0.6698 0.6825 0.6867 0.7121 0.6698 0.7201 0.6994 0.7107 0.674 0.7037 0.7201 0.6954 15.0146 0.6916 0.6752 0.6587 0.6793 0.6628 0.6859 0.6793 0.6766 0.6752 0.6875 0.7136 0.6805 15.5296 0.6834 0.6473 0.6473 0.6513 0.6434 0.6996 0.6983 0.7172 0.6434 0.6473 0.6731 0.6683 16.0446 0.6845 0.6667 0.6612 0.6462 0.6267 0.6785 0.6889 0.6446 0.6384 0.6539 0.67 0.6600 16.5596 0.6721 0.6778 0.6717 0.6457 0.6218 0.6255 0.6775 0.6338 0.6457 0.6417 0.6671 0.6528 17.0746 0.6762 0.6898 0.6679 0.6602 0.6238 0.656 0.6966 0.656 0.6481 0.6562 0.656 0.6624 17.5896 0.6866 0.6929 0.6889 0.6822 0.6646 0.6703 0.689 0.6781 0.6922 0.6739 0.6701 0.6808 18.1046 0.6711 0.6777 0.6577 0.6835 0.6669 0.651 0.7044 0.6891 0.6627 0.6794 0.6834 0.6752 18.6195 0.6752 0.6544 0.6461 0.6794 0.6711 0.6275 0.7002 0.6733 0.6544 0.6835 0.6592 0.6658 19.1345 0.6628 0.6506 0.6385 0.6791 0.6466 0.6334 0.6953 0.6444 0.6425 0.6791 0.6334 0.6551 19.6495 0.6595 0.6311 0.6234 0.658 0.6272 0.6217 0.6772 0.6214 0.6195 0.6503 0.6293 0.6381 20.1645 0.6445 0.652 0.6332 0.637 0.6445 0.5976 0.7118 0.5833 0.637 0.6744 0.6048 0.6382 20.6795 0.6016 0.6149 0.585 0.6281 0.6283 0.5539 0.6713 0.5539 0.5983 0.6215 0.5539 0.6010 21.1945 0.5896 0.6084 0.6053 0.6366 0.6021 0.5391 0.6585 0.5427 0.6015 0.6428 0.5553 0.5984 21.7094 0.5601 0.5824 0.5629 0.6019 0.5629 0.5094 0.6269 0.4976 0.5712 0.6074 0.5212 0.5640 22.2244 0.5405 0.5716 0.5405 0.5872 0.5509 0.468 0.6002 0.4571 0.5638 0.5976 0.506 0.5439 22.7394 0.5302 0.5652 0.5527 0.5977 0.5552 0.4593 0.6052 0.4387 0.5702 0.5902 0.5056 0.5427 23.2544 0.5121 0.5405 0.5357 0.5736 0.5215 0.4319 0.5831 0.4123 0.5571 0.576 0.5005 0.5222 23.7694 0.4889 0.5183 0.5206 0.5432 0.5025 0.4229 0.5364 0.418 0.5138 0.5477 0.4859 0.4998 24.2844 0.5132 0.5296 0.5249 0.5579 0.5132 0.4251 0.5673 0.4062 0.5508 0.5673 0.4675 0.5112 24.7993 0.4887 0.5072 0.4979 0.5349 0.4771 0.3887 0.5349 0.3887 0.5372 0.5488 0.4297 0.4849 25.3143 0.4794 0.5049 0.4771 0.491 0.4609 0.3806 0.5164 0.3851 0.528 0.5396 0.4303 0.4721 25.8293 0.4544 0.4796 0.4521 0.4934 0.42 0.3744 0.5071 0.3744 0.5025 0.5048 0.4014 0.4513 26.3443 0.4342 0.4499 0.4208 0.4655 0.3918 0.369 0.4834 0.3646 0.4812 0.4723 0.3821 0.4286 26.8593 0.4055 0.4143 0.3967 0.4386 0.3835 0.3567 0.443 0.3525 0.465 0.443 0.3739 0.4066 27.3743 0.3916 0.4111 0.3785 0.4111 0.3611 0.3423 0.4328 0.3465 0.4567 0.4307 0.3592 0.3929 27.8893 0.3811 0.4024 0.3471 0.3917 0.3513 0.3311 0.4258 0.3353 0.4194 0.4236 0.3518 0.3782 28.4042 0.3707 0.3964 0.36 0.3878 0.3472 0.3098 0.4242 0.3138 0.4264 0.4114 0.3419 0.3718 28.9192 0.3635 0.376 0.3531 0.3739 0.328 0.3013 0.4073 0.2857 0.4115 0.4198 0.3247 0.3586 29.4342 0.3556 0.3832 0.3407 0.362 0.3386 0.2958 0.413 0.2919 0.4109 0.4194 0.2998 0.3555 29.9492 0.3457 0.3585 0.335 0.35 0.3265 0.279 0.4011 0.2712 0.4075 0.4054 0.3025 0.3439 30.4642 0.3139 0.3322 0.3078 0.3363 0.2976 0.2852 0.3546 0.2654 0.3729 0.3689 0.2812 0.3196 30.9792 0.283 0.3003 0.2791 0.308 0.2676 0.2802 0.3253 0.2573 0.3445 0.3445 0.2841 0.2976 31.4941 0.3058 0.3424 0.2895 0.3139 0.2773 0.2667 0.3831 0.2515 0.375 0.3852 0.2705 0.3146 32.0091 0.2466 0.2806 0.2595 0.2855 0.2352 0.2393 0.3146 0.222 0.3049 0.3227 0.2358 0.2679 32.5241 0.2322 0.2562 0.2472 0.2728 0.2291 0.2367 0.2939 0.2141 0.2984 0.2999 0.2302 0.2555

4.1 lentelės tęsinys 30 psl.

30

4.1 lentelės tęsinys. Ap priklausomybė nuo dažnio, tiriant kviečių grūdus Dažnis, kHz Akustinio signalo amplitudė 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 vid 33.0391 0.2202 0.236 0.2268 0.2558 0.211 0.2096 0.2716 0.2065 0.2782 0.2821 0.2186 0.2379 33.5541 0.2014 0.2321 0.2369 0.2428 0.2061 0.2055 0.2795 0.183 0.2818 0.2664 0.1999 0.2305 34.0691 0.2067 0.2284 0.2284 0.2252 0.2023 0.2105 0.2741 0.1706 0.2708 0.2697 0.1892 0.2251 34.584 0.1711 0.1978 0.2079 0.2134 0.1739 0.1663 0.2501 0.1593 0.2336 0.2354 0.1663 0.1977 35.099 0.1697 0.1895 0.1955 0.2041 0.174 0.1634 0.2359 0.1395 0.2256 0.2308 0.1504 0.1889

0

0.20.4

0.6

0.8

11.2

1.4

1.6

0 5 10 15 20 25 30 35

Akustinio signalo dažnis, kHz

Akus

tinio

sig

nalo

am

plitu

dė, s

.v.

17,59 kHz

4.1 pav. Akustinio signalo amplitudės (Ap) verčių priklausomybė nuo dažnio, tiriant kviečių grūdus akustiniu spektrometru

Įvertinant tai, kad esant labai žemam 5-9 kHz akustinių bangų dažniui, prietaisas fiksuoja

įvairius triukšmus, o esant dažniams, didesniems kaip 30 kHz, signalo sklidimui turi įtakos

oro sukūriai, otimalus dažnis buvo ieškotas 10-30 kHz intervale. Esant įvairiems dažniams,

gauti rezultatai buvo apdoroti matematiniais ir statistiniais metodais. Optimalus dažnis

parinktas taške, kuriame nustatytos minimalios matuojamo parametro (Ap) standartinio

nuokrypio, dispersijos, matavimo paklaidos ir variacijos koeficiento vertės. Optimalaus

dažnio parinkimo rezultatai pateikiami 4.2. lentelėje.

4.2. lentelė. Optimalaus dažnio parinkimo rezultatų suvestinė

Grūdai Optimalus dažnis, kHz

Standartinis nuokrypis

Dispersija Matavimo paklaida

Variacijos koeficientas

Kviečiai 17,59 0,0099 0,0001 0,003 0,0146

31

Optimalus dažnis tokiu pat būdu buvo parinktas kviečiams – 17,59 kHz. Tolesni tyrimai

vykdyti, naudojant kviečių grūdams analizuoti nustatytą optimalų akustinio signalo dažnį.

4.1.2. Vystomo akustinio ir tradicinio ELISA metodų palyginamasis įvertinimas 4.1.2.1. Fuzarioze užkrėstų kviečių kiekio įtaka akustinio signalo parametro vertėms

Vystomo akustinio metodo palyginimui su tradiciniu ELISA metodu tirta kviečių

kolekcija su žinomu DON kiekiu (3.1 lentelė).

22 kviečių mėginiuose DON koncentracija svyravo ribose nuo 16 μg/kg iki 236 μg/kg.

Mėginių pasiskirstymas (kas 20 μg/kg) šiame intervale pateiktas 4.2 paveiksle.

0 1 2 3 4 5 6

<20

41-60

81-100

121-140

161-180

201-220

DO

N k

once

ntra

cija

, ppm

Mėginių skaičius

4.2 pav. DON kiekio (μg/kg ) pasiskirstymas LŽI bandomajame ūkyje 2005 metais išaugintuose kviečiuose

Įvertinus kviečių mėginių pasiskirstymą intervale 16-236 μg/kg pagal esantį DON kiekį,

atliktas matematinis statistinis įvertinimas. Skaičiavimo rezultatai pateikti 4.3 lentelėje.

Atlikus matematinį statistinį įvertinimą, nustatyta, kad daugumai mėginių (šiuo atveju 12

iš 22) buvo nustatytas DON kiekis, kuris svyravo ribose nuo 61 iki 120 μg/kg. Nustatyti tik 2

mėginiai, kuriuose DON kiekis didesnis nei 140. Nei vienas mėginys neviršijo Europos

Sąjungoje reglamentuoto DON kiekio (1250 μg/kg).

32

4.3 lentelė. Kviečių mėginių pasiskirstymo pagal DON kiekį matematinis statistinis įvertinimas

Bendras mėginių skaičius

Minimali koncentracija

(μg/kg)

Maksimali koncentracija

(μg/kg)

Mediana (μg/kg)

Vidurkis (μg/kg)

22 16 236 82,5 86,2 koncentracija

(μg/kg) mėginių skaičius

procentinis dažnis

(%)

mėginių skaičiaus augimas

augimo dažnis

(%) <20

21-40 41-60 61-80 81-100 101-120 121-140 141-160 161-180 181-200 201-220

>220

1 4 1 3 5 4 2 0 1 0 0 1

4,5 18 4,5 14 23 18 9 0

4,5 0 0

4,5

1 5 5 4 8 9 6 2 1 1 0 1

4,5 23 23 18 36 41 27 9

4,5 4,5 0

4,5 suma 22 100 43 195

Ištyrus juos akustinius spektrometru, pirmiausia buvo ieškoma koreliacinės

priklausomybės bendrai visoms kviečių veislėms. Išanalizavus visus kviečių mėginius

akustiniu spektrometru, nustatyta atvirkštinė tiesinė priklausomybė tarp DON kiekio ir

akustinio signalo Ap (4.3 pav.). Iš 4.3 paveikslo matyti, kad didėjant DON kiekiui akustinio

signalo Ap vertės mažėja.

y = -0.0002x + 0.6944R2 = 0.7352

0.63

0.64

0.65

0.66

0.67

0.68

0.69

0.70

0.71

0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240

Don kiekis, mg/kg

Akus

tinio

sig

nalo

am

plitu

dė, s

.v.

4.3 pav. Akustinio signalo amplitudės (Ap) priklausomybė nuo DON kiekio, įvertinto

tradiciniu ELISA metodu (2005 metų LŽI kviečių kolekcija)

33

Ši priklausomybė aprašyta regresine lygtimi: y = a + bx, kurios koeficientai pateikti 4.4

lentelėje. Apskaičiuoti regresinės lygties koeficientai ir R (R2 = 0,7352) rodo, kad analizuojant

kviečių grūdų kolekcijos mėginius egzistuoja stiprus koreliacinis ryšys tarp DON kiekio ir

Ap.

4.4 lentelė. Priklausomybės tarp Ap ir DON kiekio matematinis statistinis

įvertinimas Regresinės lygties

koeficientai Kviečių veislė a b

Koreliacijos koeficientas

2005 LŽI kviečių mėginiai -0,0002 0,6944 0,7352

Gauti tyrimo rezultatai rodo stiprią koreliaciją tarp vystomo akustinio ir tradicinio ELISA

metodų. Išanalizavus įvairius kviečių grūdų mėginius, nustatyta, kad didėjant DON kiekiui

grūduose, akustinio signalo amplitudės vertės mažėja.

4.1.2.2. Modelinių fuzarioze užkrėstų kviečių mėginių vertinimas akustine technika

Analizuojant fuzariozės pažeistus grūdus, buvo siekiama nustatyti kokią įtaką turi 10%,

20%, 30%, 40%, 50 % ir maksimalus susiraukšlėjusių kviečių kiekis sveikų kviečių grūdų

mėginyje akustinio signalo amplitudės (Ap) vertėms.

Akustinio signalo (Ap), perėjusio per kviečių tiriamuosius mėginius, į kuriuos buvo

įmaišyta 10, 20, 30, 40 ir 50% susiraukšlėjusių grūdų, amplitudės pateiktos 4.4 paveiksle.

Iš 4.4 paveikslo matyti, kad visais trimis atvejais, didėjant susiraukšlėjusių grūdų kiekiui

kviečių mėginiuose, akustinio signalo amplitudės vertės mažėja. Nustatyta stipri koreliacinė

priklausomybė tarp susiraukšlėjusių grūdų kiekio ir akustinio signalo (Ap) verčių, tiriant

akustiniu spektrometru - R2= 0,996. Įdėjus į tiriamąjį mėginį 10 % susiraukšlėjusių grūdų,

akustinio signalo amplitudė pakito 0,036 s.v.

Gauti rezultatai rodo, kad fuzariozinių grūdų kiekis sveikuose kviečiuose gerai koreliuoja

su akustinio signalo parametrų vertėmis (R2 = 0,735-0,992). Didėjant susiraukšlėjusių kviečių

kiekiui mišiniuose, Ap vertės mažėja.

34

0.61460.5790

0.52820.4634

0.40950.3539

0.3088

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

K K+ 10% K+20% K+30% K+40% K+50% DON

Kviečių mėginiai

Akus

tinio

sig

nalo

am

plitu

dė, s

.v.

4.4 pav. Akustinio signalo Ap vertės, tiriant kviečių mišinius akustiniu spektrometru: (K − nepažeisti kviečiai ir mišiniai (proc.) su fazarioze stipriai pažeistais kviečių grūdais Fmax: 1 − K+10% Fmax, 2 − K+20% Fmax, 3 − K+30% Fmax, 4 − K+40% Fmax, 5 − K+50% Fmax)

Nustačius, kad akustinio signalų parametrų vertės priklauso nuo pridėto susiraukšlėjusių

grūdų kiekio, kviečių mišiniai papildomai buvo tirti standartiniu ELISA (Ridascreen®)

metodu Lietuvos veterinarijos akademijoje, tikslu įvertinti priklausomybę tarp Ap verčių DON

kiekio. Gauti DON tyrimų rezultatai ELISA metodu pateikti 4.5 lentelėje.

4.5 lentelė. DON kiekis kviečių mėginiuose

Kviečių mėginiai DON kiekis, mg/kg K 0 1 9,1 2 25,8 3 27,0 4 72,0 5 72,7

Fmax 79,2

Nustatyta stipri tiesinė priklausomybė tarp DON užterštų kviečių ir akustinio signalo

parametrų (Ap) verčių (4.5 pav.). Paveiksle matyti, kad didėjant DON kiekiui, akustinio

signalo Ap vertės mažėja.

35

R2 = 0.9261

0.2

0.3

0.3

0.4

0.40.5

0.5

0.6

0.6

0.7

0 10 20 30 40 50 60 70 80

DON koncentracija, mg/kg

Aku

stin

io s

igna

lo a

mpl

itudė

, s.v

.

4.5 pav. Priklausomybė tarp akustinio signalo amplitudės verčių (Ap) ir DON kiekio kviečiuose, nustatyto ELISA metodu

Apskaičiuoti tiesinės regresinės lygties parametrų taškiniai įverčiai ir koreliacijos

koeficientas pateikti 4.5 lentelėje.

4.5 lentelė. Priklausomybės tarp akustinių signalų ir ELIZA metodo matematinis statistinis įvertinimas

Regresinės lygties koeficientai Signalas

a b

Koreliacijos koeficientas

Akustinis perėjimo (Ap) -0,0033 0,6019 0,926

Atliktas tyrimas su kviečių mišiniais, kuriuose buvo pridėtas atitinkamas (didėjantis kas

10 %) fuzariozinių grūdų kiekis, parodė, kad akustinio signalo Ap vertės mažėja, didėjant

DON kiekiui.

Apibendrinant atliktą eksperimentą su kviečių mišiniais, į kuriuos buvo pridėtas

atitinkamas fuzariozinių grūdų kiekis, galima teigti, kad didėjant susiraukšlėjusių grūdų

kiekiui ir DON koncentracijai juose, Ap vertės mažėja.

Tai rodo, kad akustinį metodą sėkmingai galima taikyti fuzarioze pažeistų kviečių grūdų

aptikimui.

36

4.2. Biotechnologinių priemonių panaudojimo galimybės mikotoksinams detoksikuoti

Šioje darbo dalyje nagrinėjama fermentacijos procesų įtaka DON detoksikacijai

įvairiuose technologiniuose procesuose:

• kvietinės duonos gamybos metu, naudojant raugams gaminti įvairias pieno rūgšties

bakterijas (termofilines ir mezofilines);

• bioetanolio gamybos metu gaunamuose žlaugtuose, kai grūdinės žaliavos sucukrinimui

naudojami įvairūs fermentiniai preparatai: be tradicinių – amilazių ir gliukoamilazių,

įvairūs ksilanazių kiekiai.

Pastaba: abiems atvejais tiek duonos raugų fermentacijos metu, tiek ir bioetanolio gamybos

metu naudoti fuzarioze užkrėsti kviečiai su padidintu DON kiekiu.

4.2.1. Duonos gamyboje fermentacinių procesų įtaka DON kiekiui pusgaminiuose ir

gatavuose kepiniuose

Tiriant fermentacijos proceso įtaką deoksinivalenolo (DON) kiekiui kvietinės duonos

pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose, kai raugas ir tešla ruošti iš fuzarioze užkrėstų kviečių

miltų, atlikti kvietinės duonos su skirtingais grynų p/r bakterijų kultūrų raugais bandomieji

kepimai pagal tradicinę technologinę schemą - su tirštu raugu. Pagal literatūroje sutinkamus

duomenis tirštuose rauguose (45 % drėgnis) daugiau susidaro acto nei pieno rūgšties

(stipresnis rūgšties kvapas) nei skystuose. Tešlos ruošimui buvo naudojamas maksimalus

raugo kiekis (30 % nuo miltų masės). Didėjant raugo kiekiui tešloje nuo 12 iki 30 proc.,

intensyvėja tešlos fermentacijos procesas (L. J. Auerman, 2005).

Šio eksperimento metu buvo siekiama įvertinti fermentacijos įtaką DON kiekiui duonos

pusgaminiuose (rauge ir tešloje) ir gatavuose kepiniuose, ruošiant raugus su skirtingomis

grynų p/r bakterijų kultūromis. Raugo fermentacijai pasirinktos mezofilinės homofermentinės

(L. acidophilus) ir termofilinės homofermentinės (L. bulgaricus) pieno rūgšties bakterijos.

Šios pieno rūgšties bakterijų kultūros yra populiarios duonos gamyboje ir pasižymi skirtingu

biocheminiu aktyvumu bei organinių rūgščių susidarymo intensyvumu. Jos buvo gautos iš

KTU Maisto instituto mikrobiologijos laboratorijoje esančios kolekcijos. Pieno rūgšties

bakterijų charakteristikos pateiktos 2 priede.

37

Miltai kvietinės duonos ruošimui pagaminti iš fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų ir jie buvo

naudojami tiek raugo, tiek ir tešlos ruošimui. Kontrolei ruošta duona vienfaziu būdu (be

raugų).

Eksperimento metu atlikta DON kiekio analizė įvairiuose kvietinės duonos gamybos

technologinio proceso stadijose: išrūgusiuose rauguose ir tešlose (po įmaišymo ir rauginimo)

bei gatavuose kepiniuose.

Apie rūgimo proceso intensyvumą pusgaminiuose (rauguose ir tešlose) buvo sprendžiama

pagal rūgštingumo rodiklį. DON kiekiai, nustatyti kvietiniuose pusgaminiuose ir gatavuose

kepiniuose, bei pusgaminių technologiniai rodikliai pateikti 4.6 lentelėje ir 4.6 ir 4.7

paveiksluose.

4.6 lentelė. DON kiekiai kvietiniuose pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose bei

pusgaminių (raugų ir tešlos) technologinių rodiklių (drėgnio ir rūgštingumo) vertės

Technologinio proceso

etapai

Masės

drėgnis, %

DON

mg/kg

DON

mg/kg s.m.

RūgštingumasoN

Kontrolinė tešla po

įmaišymo

45,4 1,8 3,30 4,4

Kontrolinė tešla po

rauginimo

45,6 1,7 3,12 7,2

Raugas (I) L. acidophilus 45,2 1,9 3,29 17,2

Raugas (II) L. bulgaricus 45,2 1,9 3,29 17,9

Tešla + (I) po rauginimo 45,4 1,7 3,11 8,2

Tešla + (II) po rauginimo 45,4 1,6 2,93 8,2

Kontrolinė duona (be

raugo)

5,5 2,2 2,82 -

Duona su (I) raugu 3,0 2,8 2,88 -

Duona su (II) raugu 3,0 2,6 2,68 -

38

02468

1012141618

K TR RI RII T+RI T+RII

Mėginiai

Rūg

štin

gum

as

4.6 pav. Pusgaminių (raugų ir tešlos) rūgštingumo (N) kitimas pusgaminiuose ir gatavuose kepiniuose technologinio proceso metu: K – tešla iš fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų miltų (be raugo) , TR – tešla po rauginimo, RI – raugas su L. acidophilus, RII – raugas su L. bulgaricus, T+RI – tešla, ruošta su raugu, naudojant L. acidophilus, T+RII – tešla, ruošta su raugu, naudojant L. Bulgaricus

Pusgaminių rūgštingumo tyrimai (4.6 pav.) rodo, kad raugų fermentacijos procesas,

lyginant su kontrole, sąlygoja didesnį organinių rūgščių gatavoje tešloje susidarymą.

0

0.51

1.52

2.53

3.5

K TR RI RII T+RI T+RII D D+RI D+RII

Mėginiai

DO

N, m

g/kg

4.7 pav. DON kiekio kitimas pusgaminiuose (tešlose ir rauguose) ir gatavuose kepiniuose technologinio proceso metu: K– tešla iš fuzarioze užkrėstų kviečių grūdų miltų (be raugo), TR – tešla po rauginimo, RI – raugas su L. acidophilus, RII – raugas su L. bulgaricus, T+RI – tešla, ruošta su raugu naudojant L. acidophilus, T+RII – tešla, ruošta su raugu naudojant L. Bulgaricus, D – gatava duona (kontrolinis kepimas), D+RI - gatava duona (kontrolinis kepimas) raugas su L. Acidophilus, D+RII - gatava duona (kontrolinis kepimas) raugas su L. Bulgaricus

39

Tiriamų tešlų, kurios buvo ruoštos su raugu naudojant tiek su L. acidophilus, tiek L.

bulgaricus, rūgštingumas nustatytas 8,2 oN, kai kontrolinės tešlos rūgimo metu rūgštingumas

pasiekė 7,2 oN. Pastebėta, kad raugo, fermentuoto L. bulgaricus rūgštingumas nustatytas 0,7 oN didesnis nei raugo fermentuoto L. acidophilus ir sudarė 17,9 oN. Tačiau šis raugų,

fermentuotų skirtingomis pieno rūgšties bakterijomis, rūgštingumo skirtumas neturėjo įtakos

galiniam tešlos rūgštingumui.

DON tyrimų rezultatai rodo, kad raugo fermentacijos proceso įtaka šio mikotoksino

sumažėjimui pasireiškė tiek tešlose (po rauginimo), tiek gatavuose kepiniuose. DON kiekis

išrūgusioje kontrolinėje tešloje, lyginant su įmaišyta kontroline tešla, sumažėjo 5,45 %, o

tiriamosiose tešlose, ruoštose su L. acidophilus ir L. bulgaricus fermentuotais raugais,

vidutiniškai 8,48 %. Tiriamuose gatavuose kepiniuose taip pat pastebėta, kad ruošiant tešlą su

termofiliniais raugais (L. bulgaricus) ir su mezofiliniais raugais (L. acidophilus) efektyviau

sumažėja DON kiekis nei gaminant kontrolinius kepinius (be raugo), atitinkamai 2,12 % ir

4,96 %. Nustatyta, kad efektyvesnę įtaką DON detoksikacijai tešlose, o taip pat kepiniuose

turėjo termofilinėmis pieno rūgšties bakterijomis fermentuoti raugai nei mezofilinėmis. Atlikti

DON tyrimų rezultatai neišryškino priklausomybės tarp rūgštingumo rodiklio verčių ir DON

kiekio sumažėjimo fermentuotuose pusgaminiuose. Matomai DON detoksikacijai įtakos turi

ne organinės rūgštys, o kiti mielių ir pieno rūgšties bakterijų metabolizmo produktai.

Pažymėtina, kad svaresnių išvadų darymui reikėtų padidinti technologinių eksperimentų ir tuo

pačiu DON tyrimų ELISA metodu skaičių.

Iš tyrimų rezultatų matyti, kad raugų gamybos procesas turėjo įtakos DON kiekio

sumažėjimui išrūgusioje tešloje. Tiriamuose kvietinės duonos kepiniuose, ruoštuose su L.

acidophilus ir L. bulgaricus fermentuotais raugais, lyginant su kontroliniu mėginiu (be raugo),

taip pat pastebėtos DON kiekio sumažėjimo tendencijos.

Tokiu būdu gaminant kvietinę duoną tradiciniu būdu naudojant fermentuotus raugus

galima deoksinivalenolio (DON) detoksikacija. Tam įtakos turi pieno rūgšties bakterijų

kultūros rūšis ir jos parinkimui reikia skirti svarbų dėmesį. Atkreiptinas dėmesys į

termofilines pieno rūgšties bakterijas ir jų platesnį taikymą duonos gamybos procesuose.

4.2.2. Fermentacijos įtaka DON kiekiui žlaugtuose bioetanolio gamybos metu

Grūdų ūkis – strateginė žemės ūkio šaka. Nuo jos išsivystymo ir teisingo valstybinio

reguliavimo priklauso kitų žemės ūkio šakų efektyvumas. Lietuvoje grūdų derlius sudaro

mažiau nei 10 mln. t. (Agro Rinka, 2006).

40

4.8 pav. Grūdų derlius Europos šalyse 2004-2005 metais

Grūdų auginimas respublikoje, palyginus su ES ir kitomis šalimis, neturi pranašumų,

todėl jų eksportas nėra didelis, tačiau Lietuvoje skirtingai nei ES (4.8 pav.) didėja

kombinuotųjų pašarų gamyba. Statistikos departamento duomenimis, kombinuotųjų pašarų

gamyba Lietuvoje 2005 m, lyginant su 2004 m, išaugo 4,786 tūkst. t (1,2 proc.), tačiau

lyginant su 2003 m ir 2002 m – atitinkamai 77,398 (24,4 proc.) ir 84,316 tūkst. t (27,2 proc.).

Gyvulinikystės reikmėms sunaudojama kasmet vidutiniškai beveik 1 mln. t. grūdų,

nenaudojant baltyminių bei kitų šėrimui reikalingų priedų.

Be to, užsienio rinkoje galima daugiau parduoti grūdų produktų ir grūdinės žaliavos

degalų gamybai. Pažymėtina, kad degalų gamyba sparčiai vystosi ir Lietuvoje. Kaip atliekos

bioetanalio gamyboje lieka žlaugtai, kurie gali būti sėkmingai naudojami kombinuotųjų

pašarų gamyboje. Svarbu, kad šios bioetanolio gamybos metu gautos atliekos būtų saugios

pašarų gamybai.

Šiame darbo skyriuje pateikti DON žlaugtuose tyrimo rezultatai, kurie buvo gauti

bioetanolio iš fuzarioze užkrėstų kviečių gamybos metu, naudojant įvairius fermentinių

preparatų derinius.

Tradicinėje bioetanolio gamyboje naudojami amilazės (Vilzim SKA) ir gliukoamilazės

fermentai (Vilzim SKG). Šiuo atveju be amilazės ir gliukoamilazės fermentų, papildomai

naudota ksilanazė įvairiais kiekiais: Vilzim SKK 250 AV; 300 AV; 350 AV. Fermentinių

preparatų charakteristikos bioetanoliui gaminti pateiktos 3 priede.

41

4.9 pav. Kombinuotųjų pašarų gamyba ES-25 2005 metais (mln. t.)

Eksperimento metu atliktos penkios bioetanolio gamybos, kurių metu naudoti skirtingi

fermentinių preparatų deriniai:

Kontrolė (be fermentų);

I gamyba - I(SKA + SKG): Vilzim SKA (1,5 AV/g krakmolo), kur aktyvus fermentas α-

amilazė derinyje su Vilzim SKG (4 AV/g krakmolo), kur aktyvus fermentas gliukoamilazė.

II gamyba – II (I + SKK 250 AV): Vilzim SKA (1,5 AV/g krakmolo) derinyje su Vilzim SKG

(4 AV/g krakmolo) bei Vilzim SKK (2,5AV/100 g), kur aktyvus fermentas ksilanazė;

fermentuota 55-60 ºC temperatūroje 120 min.

III gamyba - III(I + SKK 300 AV): Vilzim SKA (1,5 AV/g krakmolo) derinyje su Vilzim

SKG (4 AV/g krakmolo) bei Vilzim SKK (3,0AV/100 g); fermentuota 32-34 ºC

temperatūroje 72 val.

IV gamyba - IV(I + SKK 350 AV): Vilzim SKA (1,5 AV/g krakmolo) derinyje su Vilzim

SKG (4 AV/g krakmolo) bei Vilzim SKK (3,5AV/100 g); fermentuota 32-34 ºC

temperatūroje 72 val.

Technologiniai bioetanolio gamybos bandymai su įvairiais fermentiniais preparatais

kartoti du kartus; vienu atveju žliaugtai buvo išdžiovinti 40 oC temperatūroje; antru atveju

gauti žlaugtai tirti be džiovinimo, nustačius juose drėgmės kiekį. Gauti DON žlaugtuose tyrimų

rezultatai pateikti 4.7 lentelėje.

42

4.7 lentelė. DON kiekio tyrimo rezultatai žliaugtuose bioetanolio gamybos metu

Mėginiai Masės drėgnis,

%

I eksperimentas DON kiekis,

mg/kg

II eksperimentas DON kiekis, mg/kg s.m.

Kontrolė 45,2 1,8 3,30 I (SKA + SKG) 34,6 1,6 2,43 II (I + SKK 250 AV) 31,8 1,6 2,34 III (I + SKK 300 AV) 36,8 1,0 1,58 IV (I + SKK 350 AV) 34,4 1,2 1,83

Tyrimai parodė, kad bioetanolio gamybos atliekuose - žlaugtuose, lyginant su pradine

žaliava – fuzarioze užkrėstais kviečiais, galima sumažinti DON kiekį nuo 26,4 iki 52,4 %, (4.7.

lentelė). Tuo pačiu įvertinta tradiciškai naudojamų amilolitinių (Vilzim SKA ir Vilzim SKG) ir

ksilanolitinio (Vilzim SKK) fermentinių priedų įtaka DON kiekiui žlaugtuose. Eksperimentas

parodė, kad DON užkrėstos žaliavos sucukrinimui naudojant amilolitinius fermentus, gamybos

atliekose DON nustatyta 26,4 % mažiau nei kontroliniame mėginyje (4.10. pav.).

3.3

2.43 2.34

1.581.83

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

K I II III IV

Mėginiai

DO

N k

ieki

s, m

g/kg

4.10 pav. DON kiekis žliaugtuose naudojant bioetanolio gamybai įvairius fermentinių

preparatų derinius: K- kontrolinis mėginys (be fermentinių preparatų); I – mėginys su amilolitinių fermentų priedu; II, III, IV- mėginiai su amilolitinių ir įvairiu ksilanazių kiekiu (250; 300; 350 AV)

Taip pat pastebėta, kad naudojant ksilanazės priedą grūdinės žaliavos sucukrinimui,

lyginant su kontrole be fermentų, o taip pat su amilolitiniais fermentais, nustatytas DON kiekio

žlaugtuose sumažėjimas, atitinkamai 44,54 % ir 24,69 %.

Fermentacijos įtaką DON kiekio sumažėjimui galima paaiškinti metabolizmo produktų

susidarymu, kurie tirpina šį mikotoksiną ir tokiu būdu po filtracijos žlaugtuose lieka mažesnis

43

šio mikotoksino kiekis. Įvairūs fermentai sąlygoja skirtingą metabolitų, tirpinančių DON,

susidarymą. Kaip rodo atlikti tyrimai, daugiausiai jų susidaro naudojant grūdinės žaliavos

sucukrinimui papildomus ksilanazių priedus (prie amilaziu ir gliukoamilazių). Be to, pastabėta,

kad didinant ksilanazių priedų kiekį fermentacijos metu detoksikacijos efektas didėja.

44

IŠVADOS

1. Ištyrus 2005 metų LŽI bandomąjame ūkyje užaugintą kviečių kolekciją, nustatyta stipri

atvirkštinė koreliacinė priklausomybė tarp vystomo akustinio ir tradicinio ELISA metodų:

didėjant DON kiekiui grūduose, akustinio signalo amplitudės vertės mažėja (R2 = 0,735).

Optimalus akustinio signalo dažnis kviečių tyrimui akustiniu būdu 17,59 kHz.

2. Atlikti tyrimai modelinėse kviečių grūdų sistemose parodė, kad perėjusio mėginį

akustinio signalo amplitudės vertės koreliuoja tiesine atvirkštine priklausomybe su

susiraukšlėjusiu kviečių grūdų kiekiu mišinyje (R2 = 0,996). Nustatyta, kad nuo 10 %

susiraukšlėjusių grūdų, akustinio signalo amplitudės vertė pakito 0,036 s.v.

3. Nustatyta, kad gaminant kvietinę duoną tradiciniu būdu stebima deoksinivalenolio

(DON) detoksikacijos tendencija. Didžiausias šio mikotoksino sumažėjimas nustatytas tešlos,

ruoštos su raugais (fermentuotais L. acidophilus L. bulgaricus kultūromis), rūgimo metu,

atitinkamai 5,75 % ir 11,21 %. Efektyvesnę įtaką DON detoksikacijai tiek tešloje, tiek

gatvuose kepiniuose turėjo termofilinėmis pieno rūgšties bakterijos L. bulgaricus fermentuoti

raugai nei L. acidophilus.

4. Nustatyta, kad raugų fermentacijos procesas sąlygoja didesnį organinių rūgščių

raugintoje kvietinėje tešloje susidarymą. Ši tendencija ypač pastebima, kai raugai

fermentuojami termofilinėmis pieno rūgšties bakterijomis L. bulgaricus nei L. acidophilus.

Tačiau masės rūgštingumas neturėjo įtakos DON detoksikacijai ir šio mikotoksino kiekio

sumažėjimui nei raugintoje kvietinėje tešloje, nei gatavuose kepiniuose.

5. Eksperimentu įrodyta, kad bioetanolio gamybos metu DON galima detoksikuoti,

parinkus optimalius fermentinių preparatų derinius grūdinei žaliavai sucukrinti. Didžiausias

DON kiekio sumažėjimas žlaugtuose (44,5%), lyginant su kontrole, nustatytas pridedant prie

tradicinių amilazės ir gliukoamolazės fermentų mišinio optimalų ksilanazės fermentinio

preparato kiekį (Vilzim SKK 350 AV).

6. Rekomenduojama sudaryti bioetanoliui gaminti fermentinių preparatų kompoziciją,

sąlygojančią maksimalią DON detoksikaciją ir galimai mažesnį šio mikotoksino perėjimą į

žlaugtus, skirtus pašarams gaminti. DON kiekiui kviečiuose aptikti tikslinga įdiegti į grūdų

priėmimo linijas greitą bekontaktinį akustinį metodą, kas leistų žymiai padiditi šio

mikotoksino analizės efektyvumą ir užtikrinti pašarų saugą.

45

SANTRUMPOS

DON – deoksinivalenolis

NIV – nivalenolis

EGFA – Europos grūdų pašarų asociacija

ES – Europos Sąjunga

PLC – plonasluoksnė chromatografija

SC – skysčių chromatografija

DC – dujų chromatografija

MS – masių spektrometrija

LJD – liepsnos jonizacijos detektorius

s.m. – sausosios medžiagos

46

LITERATŪRA

1. Agro Rinka Nr. 11 (50). 2006.

2. Auerman L.J. Technologija chlebopekarnovo proizvodstva. – 9-je izd., M.: Legkaja i

piščevaja promišlenost. P. 406. 2005.

3. Bakutis B., Baliukonienė V., Paškevičius A. Use of biological method for

detoxification of mycotoxins (Biologinio metodo taikymas mikotoksinų

detoksikacijai). BOTANICA LITHUANICA. ISSN 1392-1665. Supplementum 7.

Vilnius. P. 123-129. 2005.

4. Beg Q.K., Kapoor M., Mahajan L., Hoondal G.S. Microbial xylanazes and their

industrial aplications: A review. Appl Mikrobiol Biotechnol. Nr.56. P. 326-338. 2001.

5. Bennet G. A., Richard J. L. Influence of processing on Fusarium mycotoxins in

contaminated grains. Food Technology. P. 235-238. 1996.

6. Bhat R.V., Beedu S.R., Ramakrishna Y. and Munshi K.L. Outbreak of trichothecene

mycotoxicosis associated with consumption of mould-damaged wheat production in

Kashmir Valley. India. Lancet. P. 35-37. 1989.

7. Börjesson T. and Olsson. Risk assessment for mycotoxins in cereals using Near

Infrared Technology. Poster presented at XI International IUPAC Symposium on

Mycotoxins and Phycotoxins. 2004.

8. Coker R.D., Nagler M.J., Blunden G., Sharkey A.J., Defize P.R., Derksen G.B. and

Whitaker T.B. Design of sampling plans for mycotoxins in food and feeds. Natural

Toxins . Vol. 3. P. 257-262. 1995.

9. FAO Food and Nutrition paper 74. Safety evaluation of certain mycotoxins in food.

2001.

10. Juodeikiene G., Kunigelis V., Vidmantiene D. and de Koe W.J. Veterinarija ir

Zootechnika. Acoustic screening method for the determination of deoxynivalenol

(DON) in wheat. T.25. Nr. 47. ISSN. P. 1392-2130. 2004.

11. Kos G., Lohninger H. and Krska R. Fourier transform mid-infrared spectroscopy

with attenuated total reflection (FT-IR/ATR) as a tool for the detection of Fusarium

fungi on maize. Vibrational Spec. Nr. 29. P.115-119. 2002.

12. Kunigelis V. and Senulis M. Acoustic Investigation of air-filled porous materials.

Acta Acustica united with Acustica. ISSN 1436-7947. Vol. 88. P. 14-18. 2002.

47

13. LST 1439. Duona ir pyrago kepiniai. Rūgštingumo nustatymas. Lietuvos

standartizacijos departamentas. Vilnius. 1996.

14. LST 1492. Duona ir pyrago kepiniai. Drėgmės kiekio nustatymo metodai. Lietuvos

standartizacijos departamentas. Vilnius. 1997.

15. Miller Jones J. Foods safety. Eagen press. St. Paul, Minnesota. USA. 2000.

16. Pettersson H. and Åberg L. Near infrared spectroscopy for determination of

mycotoxins in cereals. Food Control. Nr.14. P 229-232. 2003.

17. Scott P. M. Fermentation of wort containing deoxynivalenol and zearalenone.

Mycotoxins Research. Nr. 8. 58-66. 1992.

18. Scott P. M., Kanhere S. R., Daley E. F., Faber J. M. Analysis of Canadian and

imported berrs for Fusarium mycotoxins by gas chromatography-mass spectrometry.

Food Additives and Contaminants. Nr. 10 (4). P. 381-389.

19. Scott P. M.. Fermentation of food processing on mycotoxins. Journal of Food

Protrction. Nr. 47 (6). P. 489-499. 1984.

20. Smith J. E. et al.Mycotoxins: Formation, analysis and control. Chichester: John

Wiley and Sons. P. 36-41. 1990.

21. Task Force Report N.139. Risks in plant, Animal, and Human Systems. ISBN 1-

887383-22-0. 2003.

48

SUMMARY

The aim of this work was to investigate DON in wheat with Acoustic and ELISA

methods, and look if in biotechnological processes such as the sourdough bread making

process and the bio-ethanol fermentation process have influence on the amount of DON in

dough and bread and on the DON content in DDGS (Distillers Dried Grains with Solubles) as

residue of the bio-ethanol process which is used for feed purposes.

A collection of wheat has been taken from the Lithuanian Agriculture Institute at

Dotnuva and the DON content has been determined by Acoustic and ELISA methods. Both

methods are in reasonable correlation with each other (R2 = 0,735) and applied on the raw

material wheat.

The aim of the second part of the study was to apply different sourdough bacteria (L.

bulgaricus and L. acidophilus) in the bread making process and to determine the DON

content in dough and bread with the ELISA method. The reduction of DON was noticed in

both Lactobacillus applications but was the best by applying L. bulgaricus.

The pH had no influence on the detoxification process in the dough.

In the third part of the study the bio-alcohol fermentation process showed that with an

optimal mixture of amylase- glucoamylase respectively an enzyme preparation (Vilzim SKK

350 AV) a good reduction of DON in DDGS could be obtained. (44, 5%)

With these results it is recommended as to use sourdough processes in the manufacture of

bread in Lithuania which is already common practice to reduce DON in bread and to use

optimal mixtures of enzymes to reduce DON in DDGS destined for feed.

Because the acoustic method is fast, non-invasive and cheap and guaranties food and feed

safety it is recommended as to use this method for monitoring DON in wheat grain.

49

1 priedas

Technologiniai medžiagų skaičiavimai duonai gaminti

Atliekant technologinius medžiagų skaičiavimus duonai gaminti, apskaičiuotas

vandens kiekis raugui ir tešlai ruošti (Gv) pagal 1 formulę:

Gv = Gž (Dt − Dž) / (100 − Dt); [1]

čia:

Gž − žaliavų masė (suminė) raugo ar tešlos maišymui (be druskos), g

Dt − raugo ar tešlos drėgnis, %

Dž − žaliavų drėgnio vidurkis, %

Žaliavų drėgnio vidurkis apskaičiuojamas pagal 2 formulę:

Dž = (Gm x Dm + Gd x Dd + Gmiel x Dmiel) / Gž [2]

čia:

Gm; Gd; Gmiel − miltų, druskos, presuotų mielių kiekis, naudojamos raugo ar tešlos

maišymui, g;

Dm; Dd; Dmiel − miltų, druskos, mielių drėgnis, g.

50

2 priedas

Pieno rūgšties bakterijų svarba duonos raugų gamyboje

Pieno rūgšties bakterijos atlieka svarbų vaidmenį ruginės duonos gamybos procese.

Viena iš pagrindinių funkcijų - suformuoti reikiamą rūgštingumą, užtikrinti optimalaus

aromatinių medžiagų kiekio susidarymą, pagerinti duonos išvaizdą, padidinti jos tūrį ir

minkštimo akytumą. Kultivuojamos kartu su mielėmis abi kultūros turi sudaryti simbiozę,

gerai adaptuotis raugo terpėje ir išlikti ilgą laiką aktyviomis.

Homofermentinės pieno rūgšties (p/r) bakterijos pagrinde gamina pieno rūgštį ir

nedidelį kiekį acto rūgšties, be to nepasižymi dujų sudarymo pajėgumu - nepurena tešlos.

Optimali vystymosi temperatūra mezofilinėms – 25 ÷ 35 oC, termofilinėms – 40 ÷ 50 oC.

Heterofermentinės p/r bakterijos - mezofilinės, vystosi 30-35 oC temperatūroje. Be pieno

rūgšties gamina lakias rūgštis, dujas ir nedidelį kiekį etilo alkoholio. Šie junginiai formuoja

ruginės tešlos bei duonos skonį ir aromatą. Heterofermentinės p/r bakterijos yra energingas

dujų gaminimosi šaltinis ir atlieka svarbų vaidmenį ruginės tešlos purenimo procese. Pagal

šias p/r bakterijų savybes, rekomenduojama raugų gamybai naudoti grynų p/r bakterijų iš

Lactobacillus (L. bulgaricus, L. acidophilus, L. casei, L. brevis, L. sanfrancisco),

Streptococcus thermophilus ir kitų rūšių kultūrų mišinius.

Mielių įvedimas į tešlą didina bendrą rūgščių kiekį, bet sumažina acto rūgšties kiekį, nes

išsiskiria CO2 dujos ir rauge kaupiasi anglies rūgštis. Raugo mikroflora priklauso ir nuo

temperatūros. 40 oC temperatūroje pagreitėja rūgščių formavimasis rauge, padidėja pieno

rūgšties kiekis, kadangi aukštesnėje temperatūroje yra aktyvesnės homofermentinės p/r

bakterijos.

Naudojant grynas p/r bakterijas duonos tešlos gamybai, galima:

1) gauti kokybiškus raugus, ir tuo pačiu stabilesnės kokybės produktą;

2) valdyti rūgimo procesus.

51

3 priedas

Fermentinių preparatų charakteristika bioetanoliui gaminti

Pramonėje naudojami amilazių fermentiniai preparatai gali būti įvairios prigimties:

bakterinės, grybinės, augalinės ir kt.. Šios α–amilazės tarpusavyje labiausiai skiriasi terminiu

stabilumu. Grybinė yra mažiausiai termostabili, bakterinė α–amilazė yra labiausiai atspari

temperatūros poveikiui, o salyklinė amilazė užima tarpinę padėtį.

α–amilazė gaunama iš Bacillus subtilis kamienų, kurie taip pat sintetina proteazę ir β-

gliukanazę. Šie fermentai turi svarbią įtaką krakmolingos žaliavos sucukrinimui. Taip pat jų

naudojimas techninio etanolio gamyboje leidžia gauti stabilią jo išeigą. α–amilazė kartu su

gliukoamilaze naudojama vietoj salyklo ir tai sumažina rūgštingumo augimą rauginamoje

misoje.

α–amilazė – tai endofermentas, kuris skaldo krakmolą iki dekstrinų, hidrolizuodamas α–

1,4–glikozidines jungtis nuo redukuoto grandinės galo. α–amilazė technologiniame etanolio

gamybos procese atlieka labai svarbią funkciją – aprūpina mieles pakankamu sacharidų

kiekiu, tokiu būdu skatina mielių dauginimąsi ir jų augimą.

Gliukoamilazė vadinama amilogliukooksidaze, γ–amilazė. Šie fermentai daugiausiai yra

grybinės kilmės. Gliukoamilazės yra egzofermentai, kurie hidrolizuoja α–1,4–jungtis

krakmolo grandinėje ir nuo neredukuoto galo atskelia β–D–gliukozę. Šie fermentai sukelia

krakmolo degradaciją. Jos taip pat, nors ir žymiai lėčiau, hidrolizuoja α–1,6– ir α–

1,3– ryšius. Tai nulemia gliukoamilazės kaip fermento specifiškumą. Tuo ji ir skiriasi nuo

amilazės, nes gali hidrolizinti glikozidinius ryšius krakmole.

Gliukoamilazė išgaunama iš Aspergillus awamori pelėsinių grybų. Šis grybas kartu su

pagrindiniu fermentu gliukoamilaze sintetina α–amilazę ir β–gliukanazę. Šie fermentai pilnai

hidrolizuoja nekrakmolingus polisacharidus iki angliavandenių.

Gliukoamilazes sudaro du izofermentai (I ir II), kurie skiriasi stabilumu ir savo

gebėjimu hidrolizuoti krakmolą. Gliukoamilazė I absorbuoja ir hidrolizuoja kleisterizuotą

krakmolą. Gliukoamilazė II nepasižymi tokiomis savybėmis. Šio fermento optimalus pH

svyruoja ribose nuo 4,5 iki 5,5, o optimali veikimo temperatūra yra 40 - 60 ºC.

Pridėjus gliukoamilazės preparato, dėl padidėjusio gliukozės kiekio žymiai

suintensyvėja misos rūgimo procesas, nes susidaro palankios sąlygos mielėms daugintis. Tuo

tarpu maltozė, kuri gaunama α–amilazei veikiant krakmolą, kaip maistinė medžiaga mielėms

52

gali būti panaudota tik ją suhidrolizinus fermentu maltaze. Tačiau mielių maltazinis

aktyvumas yra nedidelis.

Ksilanazės. Endo-β-1,4- ksilanazes gamina dauguma mikroorganizmų: bakterijos,

pelėsiniai grybai, mielės, aktinomicetai. Yra pranešimų apie ksilanazes, išgautas iš augalų, t.y.

55 kDa molekulinės masės endoksilanazės išgautos iš europinių kviečių (Triticum aestivum )

miltų.

Optimalus grybinių ksilanazių veikimas nustatytas 3,5-5,5 pH ribose, bet jos stabilios ir

esant pH 3-10. Optimali veikimo temperatūra – 40-50 ºC. Pagal amino rūgščių grandinės seką

ir katalinių centrų išsidėstymą ksilanazės skiriamos į dvi šeimas: 10 ir 11. Šeimos 10

ksilanazės, lyginant su šeima 11, labiau hidrolizina glikozidines ksilano jungtis.

Endo-β-1,4- ksilanazės pirmiausia atakuoja ksilano grandinės vidines β-1,4-

glikozidines jungtis, o paskui atpalaiduoja pakaitus nuo ksilooligosahcaridų. Ksilanazės,

priklausomai nuo jų jautrumo, gali veikti tiek tirpų, tiek vandenyje netirpų ksilaną.

Maisto pramonėje ksilanazės plačiai taikomos duonos, konditerijos gaminių, gaiviųjų

gėrimų, alaus, vyno, etilo alkoholio gamybai.