Biosynthesis of keto-carotenoids

in Dictyococca• cinnabarlmu

Summary. - l. in the chlorophycean cui tures.

Ow~ GRIBANOVSKJ..SASSU

The biosynthesis of keto-carotenoids was followed alga Dictyococcus cinnaharinus, grown in submerged

2. The incorporation of labelled precursors was measured as well as the variation of their specifìc activity.

3. According to the obtained results a pathway for the biosynthesis of keto-carotenoids from P-carotene via isocryptoxanthin and isozeaxanthin has been postulated.

Riassunto (Biosintesi di cheto-carotenoidi nell'alga Dictyococcus cinna­barinus). - l. f: studiata la biosintesi dei cheto-carotenoidi nell'alga Die-­tyococcus cinnabarinus.

2. f: determinata l'incorporazione dei precursori marcati e la variazione dell'attività specifica.

3. In base ai risultati ottenuti ~ proposta una possibile via biosintetica dei cheto-carotenoidi.

Pathways for the biosynthesis of keto-carotenoide (V .Al" NIBL & LEEU• WENBOEK, 1947; CoaEN-BAZIBE, SISTBOIII & ST.AII'(EB, 1957), has not yet been well defìned. Keto-groups in carotenoide of the spheroidenone type Reems to be introduced by an enzymatic stricùy oxygen-dependent reaction, although no hydroxylated intèrmediatea were detected (SBI'(EOUB, 1962 a, b; EIMB.JELLEN & LtAAEN-]El'(SEN, 1964). According to TaoMMEl'( & WACKERNAGEL (1964), p-carotene is the biosynthetic precursor of echi· nenone and canthaxanthin in CrustaceM. Different mechanisms probably exist for the formation of carotenoide synthesized by anaerobio bacteria (LIAAEN-]ENSEN, SAN PIETRO & VERNOI'(, 1963). In carotenoide of the capsanthin type, the formation of the ke-to-group is considered to result by a pinakolin rearrangement of an intermediate diol (ENTSCBEL & KARRER, 1960); rhodoxanthin in Reseda odorata seems to be formed from

..tnn. 1•1. Super. Sanil4 (1973) t, 224-281

3

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226 l·:~ t•.t; RJ F.:"iZ I·. t: 111\:ErtCilt.

lutciu (SOHE~SEX, 1(}~8} and in EpifOccum nif{rum from Zl'axanthin (F o l'· I'EN & GRIIIA NOYSKI-SA~S I ' 1969; GlllBA:'IO\SK J -SAS~ll & .FOPI'EN, 1lJhll) .

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Echincnunc ( 4-o'(O· P·<'arotcnc) a nel nthrr kctu·carotl·noid,- ha \1' h t·t·u i"olatl'd f rom lh c al~a D ictyoroccus cinn11l1Utinu., (D~;l'- 'l'lt:E et ul. , 1Yttll) .

Tbc prndu etion ol' ccl•inc non e hy a chloropl•ycean a lga h arl not het•n prn i­ouFl~· d c..:C'rilled; tht•rd'ore, J s tartrd a srri t•, ol' studics 011 carotcnngl'nc-i~.

and in particular on the h io,;ynthl·sis of kr to-caro tenoick A stud~ on th e e fl't:ct of adding difl'crcnt S U !-(<lT" t o the cultun mediu111

of D . ci111wbarinus ;;howcd th at , in thr p re,..cnet• of g luco;;e, t hc cnlour of tiH' cultut'C changcd from grccn t o ycllow-red . In these cultun•,; no proclu ctiun of chloroph yll or of « stricll y photo1-ynthetic » carotcnoid, could be deuwu· strated; keto-carot<>noids rcpre:;cnted 80-90~0 and echincnont• al ont' a ccount · ed for aboul 50% of thc total pigmcnt ( D ENTICE, CHJBANOV!)KI-5 ,\ SSt.: l'V.

LozANO REn:s, 1908). E lectron m icroscopic s tudie.5 showed that, in 1 ht•se coutli tio11s chiuro·

plast s disintegrate, and in tlu•ir piace large vacuolc•,; fillrd wi th carotcnoids appear (DE~TICE, GnmAXO\' KJ-SAssu & LoZA ·o HEYES, 1%8; ARA:"CIA

& T UTTOBELLO, 1969). For thc s tudy of a possiLlc m etalwlic pathway for Liu:<) nthesis of kcto·

carotcnoids. thc efl'cct of the inhibìtor d ipht·uy lamiu•• ,,·as prc, ·io u, ly s tudietl in this alga. Diph•~nylaminc chang•?d th (' pa tlern of' carotcnoid levcls and blockcd phytocnc dehydrogruation. Lycopene was not dctcct eu under a11~

of the expcrimrntal condition,., tcs t cd , hut con ... istent a mounl " of zeal'arotCIH' wt:r c found. Th e tuta l amuunt of kf'to-carolcnoids reprcst'nted on ly 30(;;, of total pigm(•nts in cu lt urcs conta iniug lO ll~'l dipht·nylamine, Lui ~ IH'\\'

xanthophylls appcarcd: isocr yptoxanthin anò i~ozca:-.autllin auù tht• forma­tion of /]-carotene was stimulated (G niBANOVSKt-SMiìSll, 1972) . Sincc iso­

cryptoxanthin and isozeaxanthin ha\'c tht'ir hydroxyl group s in the sam t' pos ition as tbc ket o g roup s of the keto-carot cnoids, wc postulateù that thc~c xanthophylls rnigbt belong t o t he samc synthctic pathway as the k<·to-caro­tenoìds in D. cinnabarinus. \Vith thi;; in mind another study was carricù out, in which thc incorporation of lahclled precursor;; was mcasured as wcll as t.hc variation of th t'i r specifi c acti,·ity. Ou the ba~is of tbc res ults ohtain­ed a possiblc biosynthetic pat.hway for carolcnoid fo rmation is po~tulated .

.\lATF.flJAL S AXD METHODS

Tbc labellcd /]·carotene used as precursor was "ynthesizc d biologicall~·

hy incubating the fungus Epicoccum nigrum with dl (2· 14C) mcvaJuna tc lacl·

one (GRIBA:"OYSKI & FoPP EN, 1968).

. 11111. ! st. SuJU r. Sn11 ì ltì (19o3) 9, ~2;, ~a~

GRJB.<\NOVSKI-5.<\SSU 227

The mycelium was harvcsted after 24 hr, fil tered over a Buchner funnel and wash ed gently. The terpenoids were extract ed with acetone in a blcndor, an d the resulting suspension was filtered. The residue was extracted again with acetone and the process was repeated four or five times. The terpenoids of the bulked ac·etone oxtracts wcre diluted with water, extracted severa! times with ether, washcd with water, dried over anhydrous Na2504 and evaporated to dry ncss under N2• T he resulting lipid extract was saponified by the usual procedure, and the unsaponifìable materia! was extracted into ether. After washing the ethereal extract cont· aining the unsaponifìable fraction free from alkali, the solution was dried over Na2504 and taken to dry ness under N2 •

The sterols were removed from the unsaponifiahle fraction by preci· pitation as their digitonides. In brief the unsaponifìahle fraction was dis­solvcd in aqueous 95% (vfv) ethanol and heated to boiling, thereafter a hoiling solution of 2% (w/v) digitonin in aqueous 90% (v/ ) e thanol was added, and hoiling was continued until a white precipitate appeared. Preci­pitation was completed by leaving the solution overnight at OOC. The digi· tonides were removed by centrifugation and washed with mi..xtures of etha­nol and ether. Tbc washings were added to the supernatant.

The combined supernatant and washings were treated with ether, which caused precipitation of the excess digitonin, which was removed by centri­fuga tion. The supernatant solution containing the labelled carotenoids was dried over Na2S04 a nd taken to dry ness under N 2• The carotenoids were separated and purificated on chromatographic columns. For the separation of P-car otene a column of alumina, Brockmann Grade III, was developed with hexane. The first fraction containing the labelled P-caro· tene was recltromatographed on an alumina Brockmann Grade III column and taken to dryness under N2• The P-carotene was then rccrystallized to a constant melting point and a constant specifìc radioactivity as de· scrihed elsewhere (FOPPEN & GRIBANOVSKI-SASSu, 1968).

The culture technique used for the alga was that described by GRIBA· NOVSKI (1972). The same incuhation conditions were used with labelled and unlabelled car otenoids: 0.15 ml of an etbanol solution containing caro­tenoids aml one drop of Tween 80 were added to the cultures at the 9th or 10th day of growth, when the pH of the medium was again neutral. The same amount of ethanol and Tween 80 was added to contro! cultures. The methods of extraction and purifìcation of carotenoids were descrihed by DENTICE et al. (1966). After saponification of the crude extract , the caro· tenoids used as labelled precursore were separated on chromatographic columns of cellulose and MgO-celite (2 : l) and eluted with light petroleum (h.p. 40°-70<-C) containing vary ing amounts of acetone. The P-carotene was rechromatographed on an alumina column, eluted with light petroleum·

d r111. fHI . .<;,.per. Sani l<ì ( 197 3} 9, 225- 232

l

d

228 F.SI'ERI E:-IZE E RI CERCHI::

ether (99 : l ) and t hen recrystallized from the light petroleum to a constant m elting point and a constant specifìc r adioactivity. T he other carote­noids were subj ectcd t o further purification on silica gel G plates in different solvent systems until a constant specifìc radioactivity was reached.

T he radioactivity was measured b y a Liquid Scintillat ion Spectrometer (Mark l , Nuclear Chicago, Des Plaines, Ili.; U.S.A.) u sing a Bray solut ion (BRAY, 1960) as scintillation liquid .

The carotenoid pigments were decolorized by exposing t bem to sunligh t before counting.

T LC was car ried out on 0.25 mm t hick layers of silica gel G activated at l 200C for 45 m in. The solvent systems used were: l ) Hexane-acetone (88 : 12); 2) Hexane-ether (3 : 7); 3) Methylenechloride-ethyl acetate (4: l). The plates were scann ed for radioactivit y using a Packard Radiochromato­gram Scanner Model 7200.

RESULTS AND DISCUSSION

Labelled isocrypt oxan thin, isozcaxanthin and echinenonc were syn· tbesized biologically b y i ncuhating D. cinna.barinus with radioactivc {3· carotene for 7 days.

T Lis labelled {l-carotene used as prccursor was synthcsized b iologically by incuhating tbc fungus, Epicoccum m~grum, with dl-(2-1'1C) mevalonate lactone for 24 hr (GmBANOVSKI·SAssu AND FoPPEN, 1968). Labelled {l-carotene was prepared in this manncr Lceause t hc alga does not t akc u p mevalonic acid from the culture medium. Thc inability to absorb mevalonic acid was probably due t o impermeability of thc chloroplast membrane (RoCERS, SHAB & GooowlN, 1965).

ln thc presence of dipbenylamine t hc absorption of glucosc was vcry slow initially and t hc pH of thc culture mcdium fcll to 4 .5. T hc pH rctu rncd to its originai value aftcr 9 days and glucosc uptakc increascd (Gtu BA:>;OVSKI, 1972). Probably t lae acidity of t bc mcd ium caused a rapid degradatiou of addcd carotenoids; the addition t o t hc culture mcd ium at the time uf the inoculum rcsultcd in a complete loss of thc added pigments. Subst rates were thercforc added t o tbc culture m edium after 9 days of growt h.

At tbc 9th day of growth labclleù /1-carot cne was aùded to thc culture m edium containing lO fLM d ipbenylarniue; the incorporat ion was measurcd aftcr 3-4 and 5 d ays of incuhation. Ali pigmen ts were found labellcd antl t he spceifìc radioactivity of t bc carotcnoids, especially that of isozeaxanthin , incrcased fr om tbc t hird day to th e fìfth day. Thc specific activity of thc {J-carutene fell Ly ncarly 70% ovcr the same period of t ime (Tablc l). T bese results suggest that {l-carotene may be a precursor of tbc otber carotcnoids.

T bc data reported in Tablc 2 refcr t o cultures without diphenylamine. Tbe labelled isocry ptoxanthin was added at the 10th day of growth. Undcr

Ann. I sl. Su]Jer. Sanilù (1973) t , 225 Z32

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230 F.SPERTEI'iZE E RJCERCII E

Incorporation of labelled isocryptoxanthin into the carotenoids o{ D. Cinnabarinus

CAIIOTENOJ I)S

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The labellecl i•ocryptuxanlhin , dpm 31,2~0. S. A. 521 dpm/ !•g. wa• addr<l to the ctùur." nt tbc lOth day of the growth. The iocorporatiou wa" m•·uured afttr 2 duys.

these conditions, tbe synthesis of carotenoids, mostly keto-carotenoids, commenced. Determination of the specific radioactivity at different times was not possihle since it was not measurahle heforc 40 hr of incuhation yet by 50 hr cellular lysis had begun. The extraction was pcrformed after 2 days, while pigmentation was stili increasing. The results obtained showed that in these cultures ali carotenoids became labelled. lt is signi6cant that isozeaxanthin occurred only in the presence of isocryptoxanthin. P-carotene, 3.4-oxo-p-carotene and Astacene are present only in small amount.

Incubating witb labelled isozeaxanthin did not give well defined results, since isozeaxanthin absorption was very slow and incomplete, and the small amount of pigment present made its purification impossiblc.

Similar difficultics were also encountered with labelled echinenone: tht' absorption b y the algae was very slow and tbe echinenone became easily altered. On scanning for radioactivity after thin layer chromatography of total pigments in different solvent s systems, a slight, diffuse radioactivity was found over thc whole plate but a high peak of radioactivity was never­theless observed in the echinenone zone.

On the basis of these results the following hypothesis for the synthcsis of carotenoids in Dictyococcus cinnabarinus can be advanced:

l) The p-carotene is formed probably directly from neurosporcnc via zeacarotene and y-carotene.

2) Although P-carotene is a precursor of a li carotenoids, isocryp to­xanthin and isozeaxanthin are probably the immediate precursors of keto­carotcnoids. Echinenone may be an intermediate metabolite in the forma­tion of 3,4-dioxo-P-carotene, isolated and characterized by DENTICE et al. (1966) . The synthesis of this carotenoid (a compound always found in trace amounts) might occur via 3-hydroxy-echinenone, by a process similar

A1111. f s/. SuJltr. Sat~iltì ( 19i :l) 9, 2~5 23~

GRIBANOVSJU- SASSU 231

to the formation of astacene from astaxanthin (Fig. 1). In fact the ketonic groups present in position 4 in echinenone and in positions 4 and 4' in can­thaxanthin facilitate the introduction of a hydroxyl group in positions 3 and 3' whìch results in the forma t ion of 3-hydroxy-echinenone and astaxanthin respectively. 3,4-dioxo· P·carotene and astacene could then be formed by an oxidation of hydroxyl groups at ketonic groups.

-l·HYOIIOXY·-4· OXD ·}·CAROTENE

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Fig. l. - The propo!ed pathway of the biosyntheais of keto-carotenoids in Dicty ococ,cus

cinnabarinus.

The study of the synthesis of carotenoids in D. cinnabarinus confìrms again that signifìcant variations in the synthesis of carotenoids in algae appear towards the end of the biosynthetic pathway, i. e. in this alga from neurosporene onwards, at the level of isomerization and P-ionone oxidation.

The Author is very indebted to Prof. Goodwin for constructive criticism of the manu­script, and thanks Mrs. A. Contenti, G. Amici ond G. Nusdorfi , for their technical assistonce and Mr. V. Adriani for the preparation of cultures.

Received July 25, 1973. Accepted August 8, 1973.

clnn. I s l. Super. Sa nìlà ( 1973) t , ~~5-232

l , l

l

232 ESPERIENZE E RJCERCDE

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-~nn . la/. Super. Sanità (197J} t , ~tr, 23~

Presenza di particelle simil-virali in un ceppo pleomorfo di Penicillium citrinum

PlBllO AUGUSTO BATTAGLIA • • ANTONIO CASSONE ••• AltTONIO TONOLO • e LA V IlA. VOLTERRA • (con la collaborazione tecnica di G1t1SJLPPB IGNAZZITTO •)

LalxJrotori di Chimico Biolosko

Ria88unto. - Viene dimostrata, con osservazioni al microscopio elet­tronico, la presenza di particelle simil-virali in un ceppo pleomorfo di Peni­cillium citrinum. Le particelle sono chiaramente presenti nelle sezioni di ife del ceppo non sporificante. Tuttavia, particelle simil-virali compaiono, anche, sia nell'estratto del micelio che nel brodo di coltura del ceppo spori­ficante. In tutti i casi le particelle misurano 25-28 mtJ. ed hanno struttura icosaedrica.

Summary (Presence of virus-lilu pareicles in a pleomorphic strain of Penicillium citrinum). - Tbc presence of virua-like particlea in a pleomorphic strain of Penicillium cilrinum is demonstrated through obser­vations at the electron microscope. The particles are clearly seen in the sections of iphae of the non-sporifying strain. Virus-lik.e particles appear, however, both in the extract of tbc mycelium and in tbc broth culture of the sporifying strain. In ali casca the particles are 25-28 m11 in size and bave an icosahedric structure.

INTRODUZIONE

La presenza di particelle simil-virali in funghi è un fenomeno orma1 ampiamente descritto (HOLLINGS & STONE, 1971; SPIRE, 1971; BozARTH,

1972). Campionamenti casuali hanno dimostrato che almeno il 15% delle specie fungine contengono micovirus (B oZARTH, 1972). Un affinamento delle tecniche di indagine, che permetta di evidenziare anche la presenza di basse concentrazioni di virus, potrebbe, tuttavia, portare alla conclusione che il fenomeno è molto più diffuso di quanto oggi si conosca.

• Istituto Superiore di Sanità. •• Istituto di .Microbiologia dell'Università di Roma.

Ann. 1st. Su11er. Sanità (1973) t , 233-230

23-l F.SI'.ER .. :~u: F. RICF.RCtu:

1 n questo lavoro si descriv<' il rinvenimento di una particella simil­v iralc c la sua diversa distribuzione in un ceppo pleomorfo (BISTI , 1959) di Penicillium citrinum. L e particelle vengono considerate simil-virali perehè, pur p ossedendo numerose caratteristiche tipiche dci viruf', non hanno un ciclo rt>plicativo noto .

MATEltiALl E METODI

cl presente lavoro si è usato un ceppo di Penicillium cttnnum, che aveva la caratteristica di segregare aree di micelio bianco sterile (BonnÈ et al. , 1971). Il ceppo veniva fatto crescere sia su terreno solido che su terreno liquido, utilizzando, rispettivamen te, agar patate e brodo patate glucosa to (glucosio 2% ) pH 7.

Estrazione del virus.

li virus è stato estratto dal micelio seguendo, nella maggior parte dei casi, il metodo di BANKS et al. (1968), che consiste essenzialmente nel trattare il materiale con cicli alternati di centrifugazione a bassa ed alta velocità. Soltanto in pochi casi si è usato il metodo di precipitazione con P.E.G . in alta forza ionica, proposto da H ERBERT (1963). P er l'estrazione dal brodo si è seguito il metodo di separazione di fasi in polimeri acquosi, descritto da ALBERTSSON (1967).

M ieroscopia elettronica.

a) colorazione negativa.

L'estratto cellulare, ottenuto sia per schiacciamcnto di ife, che per estra­ziont> dal micelio o dal terreno di coltura, era colorato direttamente, con una soluzione al 2% di molibdato di ammonio (pH 6) oppure con PTA l %, su reticelle di sottile strato di carbonio evaporato c subito osservato al micro­scopio elettronico.

b) sezioni ultrasottili.

Conidi e frammenti di ife, prelevati da varie zone delle colonie di Peni­cillium citrinum , erano prefissate per 30 min con una mistura di TAPO (tris, 1-aziridinyl ossido di fosfina) l % , acroleina l % c glutaraldeide 0,3% in tampone fosfato 0,1 M p H 7 ,2. Dopo lavaggio in tampone, il materiale era successivamente fissato per una notte a + 4oC con acido osmico (4% ) e per 6 ore successive con acetato di uranile (0,5 % ) in tampone Michaelis pH 5,2. I successivi trattamenti di disidratazione erano eseguiti secondo le tecniche descritte altrove (HAYAT, 1970; DJACZENKO & CASSONE, 1972). Le sezioni erano colorate con citrato di piombo, secondo REYNOLDS, 1963).

Ann. ! st . .';UJICr . Suniltì (1973) t, 2!3- 239

BATTAGLIA , C.~SSONE, TONOLO , VOLTERRA E ICNAZZITTO 235

R ISULTATI

In un precedente lavoro (BoRRÉ et al., 1971), effettuato su un Penicillium citrinum isolato in n atura, si postulava la esistenza di una correlazione biu­nivoca tra comparsa di « ciuffetti» di mi celio bianco aereo privo di conidi e presenza di particelle virati. P er verificare la validità di tale asserzione, è stato selezionato un clone di Penicillium citrirtum, che presentasse contem­poraneamente i seguenti due caratteri : micclio sporificante-micelio bianco

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200 m)J -

Fig. l - Numerose particelle simil-virali racchiuse da tmo membronn frammentata. Notare la contem­poranea presenza di particelle piene c vuote (colorante pene­tra to).

Fig. 2 - Sezioni ultrasottili di Penicillium citrinum (ifa del ce-ppo st erile). In alcuni casi le part icelle si­rnil-virali presentano un denso « core ». Colorazione effettua ta con ci trato di piombo per 15 minuti. cw = parete cellulare, vp = viropla ~rni.

sterile. Il m.icelio bianco sterile, pur segregando a volte settori sporificati normalmente, in tutto identici a l ceppo parentale, risultava essere abbastanza stabile. Le ife, osservate al microscopio ottico, spesso apparivano rigonfie, non omogenee per dimensioni (il diametro, infatti, variava da 1,6 a 3.2 f-L) ·

. l nn . Jsl . S uper. Sani/Il ( 1!)73) 9, ~:!3-~:lo

236 ESPERIENZE E R ICERCHE

Al contrario, le ife del ceppo sporificante erano tutte dello stesso diametro (1,6 !L)· F enomeni del genere sono stati descritti anche in altre specie di funghi affetti da virus (KOLTJ N et al. , 1973).

Il liquido, fuoriuscito a seguito dello schiacciamento di ife provenienti da micelio sterile, colorato negativamente, conteneva particelle simil-virali (Fig. 1). Queste ultime sono state anche osservate in sezioni ultrasottili di ife dello ~tesso ceppo (Fig. 2, 3). Nella stragrande maggioranza delle osser­vazioni, le masse virali (viroplasmi) erano presenti in cellule evidentemente in degenerazione con perdita della matrice citoplasmatica, v acuolizzazione imponente e assottigliamento con degradazione della parete cellulare. Gli ammassi virali si presentavano liberi nello spazio cellulare (Fig. 2), o racchiusi in strutture membranose (Fig. 3).

Dall'esame delle sezioni ultrasottili di ife del ceppo sterile, le dimensioni delle par ticelle virali risultavano comprese, costantemente, nell'ambito di 25-28 ID fL- Molte delle particelle si presentavano come capsidi vuoti, altre mostravano internamente una zona densa, d 'aspetto regolare e di dimensioni comprese tra i 15 e i 20 mfL (Fig. 2, 3).

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Fig. :1- Sezioni ultnu;ottili di P<•nicillium cìtrinum

(ifa del ceppo sterile). I n alcuni casi le parti­celle simil-vira li pre­sentano un den~o <<co­

lorc». Notare la pn·­senza di corpi mem­branosi (mh ). Colora­zione effettuata con citrato di piombo prr 15 minuti. cw = pa­rete ce llul arr, vp = viroplasmi, prn =­membrana citopla­smatica, mb = corpi membranosi.

BATTAGLIA, CASSONE, TONOLO, VOLTERRA E ICNAZZI'ITO 237

In colorazione negativa (Fig. 4) queste particelle presentavano una chiara simmetria icosaedrica e dimensioni costantemente comprese nell'am· bito di 26-28 IDfL; particelle piene e capsidi vuoti erano dello stesso diametro ed in alcune particelle c'era qualche evidenza di una struttura interna defi­nita (Fig. 4b). Invece, nessuna evidenza si è ottenuta per una suddivisione in doppio capside, né per la presenza di eventuali proiezioni capsidiche (Wooo, 1973).

Nelle sezioni ultrasottili di ife provenienti dal ceppo sporificante e nei conidi dello stesso, non sono state osservate particelle simil-virali del tipo descritto per le ife del ceppo sterile. Tuttavia altri dati sembrano indicare che anche nel ceppo sporificante esistano particelle simil-virali.

Le pesanti alterazioni a carico delle cellule provenienti da micelio non sporificante (ivi comprese quelle della parete cellulare) ed il fatto che il vi.rus vi fosse ubiquitariamente distribuito, potevano· far supporre che allo stadio

Cl b

Fig. 4 - Particelle simil-virali nell'estratto di PeniciUium citrinum {vedi testo). In a le frecce puntano le particelle con una chiara simmetria icosaedrica. In b le frecce indicano particelle piene in cni ~ possibile individuare componenti tipo capsomeri. Colorazione effettuata con ammonio molibdato 1,5.% .

di generalizzato danneggiamento seguisse la lisi della cellula, ipotesi che sembrava comprovata dalla presenza nel micelio bianco sterile di ife rigonfie ed estremamente fragili. In questo caso il virus sarebbe dovuto passare nel terreno di coltura. Per accertare la presenza del virus (nel caso questa even­tualità fosse risultata vera) si presentava la difficoltà di operare su volumi relativamente grandi di liquido (5-10 l), in cui le particelle simil-virali dove­vano essere presenti a basse concentrazioni, poichè estremamente diluite. In queste condizioni il metodo di estrazione seguito da BANKS et al. (1968), anche se valido per l'estrazione del virus dal micelio, si è rivelato non adatto allo scopo. Per superare questo ostacolo si è utilizzato il metodo di separazione

.J.nn.. 1st. S uvu. S anitd (19 73) t, 233--239

23B };S I'ERIEI"ZE E HI CE IICIIE

di fasi in polimeri acquosi (ALBERTSSON, 1967). II metodo ha r esclusivo \'an­taggio di operare su grandi volumi di liquido, concentrando il virus in una quantità di soluzione che è cento volte più piccola di quella di partenza. Au ­mentando, così, la sensibilità , risultava molto più probabile reperire il viruo. Si sono efi'ettuate estrazioni dal ceppo n on sporificante, operando contempo­raneamente sul micelio, con il metodo di BANKS et al. (1968), e sul brodv. seguendo la tecnica di ALBERTSSON (1967). Gli esperimenti sono stati condotti partendo dal secondo giorno di incubazione, quando, cioè, si era già sviluppata una sulliciente massa di micelio. Ne risultò che le particelle simil-virali erano sempre presenti nel micelio, mentre comparivano nel terreno di coltura al quinto giorno di incubazione.

DISCUSSIONE

Gli esperimenti conclusi confermano inequivocahilmentc l'esistenza di particelle simil-virali nel ceppo di Penicillium citrinum studiato.

Sebbene i dati relativi alla struttura di queste particelle debbano essere considerati ancora preliminari, è tuttavia notevole che esse presentino strut­tura e dimensioni comparabili, sia in colorazione negativa , che in sezioni ultrasottili di materiale fissato chimicamente. Inoltre la morfologia della particella simil-virale è chiaramente rapportabile a quella già descritta da altri Autori, per esempio, in Penicillium stoloniferum (ELLIS & KLEJ NSCH-1\UDT, 1967; BANKS et al. , 1968; HOLLINGS & STONE, 1971; BozARTn , 1972) ed è in conformità con le generalità morfologiche degli altri micovirus (Bo­ZARTH, 1972; Wooo, 1973).

Il prelievo a tempi diversi di frammenti di ife da una colonia in accresci­mento ed il ritrovamento, in ogni sezione, dei virus, sono un dato inconfu­tabile a favore della diffusione delle particelle simil-viraH da una cellula all'altra di una stessa ifa. Inoltre, per lo meno alcune delle alterazioni osser­vate nelle ife virogene, sembrano specifiche di un evento moltiplicativo virale (viroplasmi) e non si trovano nelle ife in degenerazione fi siologica. È proba­bile, altresì, che questi virus si replichino nel citoplasma, secondo un'evenienza comune ai micovirus, ma questo deve essere ancora confermato.

Come nel Penicillium stoloniferurn (BANKS et al. , 1968) la particella simil­viralc descritta è in grado di passare nel terreno di coltura, tramite, vero­similmente, la lisi della parete cellulare fungina. Danni ultrastrutturali della parete sono stati, in effetti, osservati nelle ife infette.

Resta, infine, da analizzare il dato contraddittorio della presenza di particelle simil-virali nel ceppo sporificantc, per estrazione da micelio c da terreno di coltura, mentre le sezioni dello stesso ceppo, osservate al micro­scopio elettronico, ne appaiono prive. La contraddizione potrebbe essere

Ann. I sl. Super. Sanità (1973) t, 233 230

DATT.o\GLIA, C.o\SSONE, TOl'iOLO, VOLTERRA E IG:'I AZZITTO 239

soltanto apparente, se si considera che le particelle simil-virali, rinvenute sia nel brodo che nel micelio del ceppo sporifìcante, sono per lo più rappre· sentate da capsidi vuoti. I capsidi potrebbero sfuggire facilmente all 'ossee· vazione in citoplasma normale, quindi denso, come è quello delle ife e, soprat· tutto dei conidi del ceppo sporificante. Considerata anche la quantità relativa delle osservazioni fatte, è altresì possibile che le particelle virali presenti nel ceppo sporificante siano sfuggite all'osservazione microscopica. Tuttavia, se fJuesto è vero, si deve dedurre che nel ceppo sporifìcante le particelle simil· virali siano in numero molto minore che non nel ceppo sterile, vista la faci· lità del ritrovamento del virus io questo ultimo.

Quindi la differenza tra i due ceppi potrebbe risiedere unicamente nell a quantità delle particelle simil-virali presenti: solo quando il numero delle particelle simil-virali supera una determinata soglia, il ceppo sporifi caotc segrega il micelio sterile, affetto da una pesante infezione virale; viceversa, se nel ceppo sterile si isola per caso u no stipite ifale io cui si vengono a tro­vare poche particelle simil-virali, si origina un settore sporifìcato.

Si ringraziano i Sig.ri llruno Pa squetti e Mario )fari (Istituto di Microbiologia de ll'Uni· versita di Roma) per In preziosa a~si.tenzn tecnica. Per la Fig. l si r ingrazia il Sig. F rnn· cesco T ungu cci dci Laboratori di Fi.ica dell'Istituto Superiore di Sanità.

Ricevuto il 12 dicembre 1973.

Acceuato il 27 dicembre 1973.

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