SADR AJ Sta su bioreaktori ......................................................................... Error! Bookmark not defined. Uloga bioreaktori ........................................................................ Error! Bookmark not defined. Vrsta biokatalizatora .................................................................... Error! Bookmark not defined. Metaboli ko stanje elija.............................................................. Error! Bookmark not defined. Agregatno stane supstrata............................................................. Error! Bookmark not defined. Slo enost supstrata....................................................................... Error! Bookmark not defined. supstrata ...................................................................................... Error! Bookmark not defined. Na in izvodjenja procesa ............................................................. Error! Bookmark not defined. Sterilnost i kontaminacija ............................................................. Error! Bookmark not defined. Banka elije ................................................................................. Error! Bookmark not defined. Faze biotehnolo ke proizvodnje ................................................... Error! Bookmark not defined. Sterilisanje bioreaktora ................................................................ Error! Bookmark not defined. Pranje bioreaktora ........................................................................ Error! Bookmark not defined. priprema supstrata ........................................................................ Error! Bookmark not defined. Obrada bioprodukata.................................................................... Error! Bookmark not defined. Procesi koncentrovanja bioprodukata ........................................... Error! Bookmark not defined. Razvoj populacije mikroorganizama ............................................ Error! Bookmark not defined. Sterilizacije medijuma.................................................................. Error! Bookmark not defined. Utivaj temperature na kinetiku sterilizacije ..................................Error! Bookmark not defined. ar na sterilizacija ....................................................................... Error! Bookmark not defined. Kontinualna sterilizacija............................................................... Error! Bookmark not defined. Kinetika ar ne kultivacije-Mondova kinetika .............................. Error! Bookmark not defined. klasifikacija bioreaktora ............................................................... Error! Bookmark not defined. Biotehnolo ka proizvodnja antibiotika penicilin .......................... Error! Bookmark not defined. Proizvodni mikoorganizam .......................................................... Error! Bookmark not defined. Proces biosinteze penicilina ......................................................... Error! Bookmark not defined. Gajenje u bioreaktoru................................................................... Error! Bookmark not defined. Uslovi biosinteze ......................................................................... Error! Bookmark not defined. Proces izolacije penicilina ............................................................ Error! Bookmark not defined. Upotreba penicilina ...................................................................... Error! Bookmark not defined. ENZIMI .....................................................................................................................................19 Podela enzima ............................................................................................................................19 Imobilizacija enzima ..................................................................................................................21 IN ENJERSKI ASPEKTI BIOPROCESA ................................................................................22 KINETIKA MIKROBIOLO KIH PROCESA ...........................................................................23

1

Page

1

Kinetika rasta mikroorganizama u diskontinualnim ...................................................................24 bioreaktorima ............................................................................................................................24 Dobijanje enzima .......................................................................................................................26 Proizvodnja enzima ..................................................................................................................26 Pre i avanje enzima .................................................................................................................27 Priprema enzima za prodaju .......................................................................................................27 TEHNIKA REKOMBINATNE DNK ........................................................................................28 Proces dobijanja rekombinantne DNK .......................................................................................29 Biotehnolo ki process gajenja kulture ........................................................................................30 Analiza medijuma ......................................................................................................................31 Insulin........................................................................................................................................33 Proizvodnja rekombinantnog humanog inzulina (rhi) .................................................................33 BIOREAKTORI ZA BILJNE ELIJE .....................................................................................34 PORE ENJE SUSPENZIJE BILJNIH ELIJA I KULTURE....................................................35 MIKROBNIH ELIJA ..............................................................................................................35 Osnovni tehnolo ki uslovi neophodni za uzgoj biljnih elija u bioreaktoru: ................................37 BIOREAKTORI KOJI SE NAJ E E KORISTE U PROIZVODNJI SA KULTURAMA BILJNIH ELIJA ......................................................................................................................37 -Bioreaktori za suspenzije biljnih elija-.....................................................................................39 TRENDOVI U PROJEKTOVANJU BIOREAKTORA ZA .......................................................39 BILJNE ELIJE ........................................................................................................................39 IMOBILISANE BILJNE ELIJE I NJIHOVI ............................................................................40 PROIZVODI..............................................................................................................................40 Karakteristike imobiliziranih stanica ..........................................................................................43 Osloba anje produkta ................................................................................................................43 Reaktori za imobilizirane elije: .................................................................................................43 KVASCI ....................................................................................................................................44 Pekarski kvasac..........................................................................................................................44 Uslovi za uzgoj pekarskog kvasca ..............................................................................................45 Kriva rasta .................................................................................................................................46 Aparatura ...................................................................................................................................47 Hemikalije .................................................................................................................................47 Priprema hranjive podloge .........................................................................................................47 Hranjiva podloga za pripremu inokuluma je identi nog sastava. .................................................48 Priprema inokuluma ...................................................................................................................48 Uzgoj pekarskog kvasca u kotlastom bioreaktoru .......................................................................48 Page Propu tanjem azota kroz destiliranu vodu ..................................................................................48

2

2

ta su bioreaktori?Bioreaktori su posebni ure aji u kojima se izvodi glavni deo biotehnolo kog proizvodnog procesa. U bioreaktorima delovanjem biokatalizatora ( ive elije, njeni delovi ili ivi mikroorganizmi) na supstrat nastaje proizvod. Bioreaktori se proizvode od visokootpornog, ner aju eg elika. Mogu biti razli itih konfiguracija, a mogu se razlikovati i po veli ini, od nekoliko desetina litara do nekoliko hiljada litara. Obi no su opremljeni mernom i regulacionom opremom potrebnom za odr avanje optimalnih procesnih parametara, kao to su: temperatura, pH, koncentracija rastvorenog kiseonika ili ugljen-dioksida, me anje, stvaranje pene. Bioreaktori imaju iroku primenu u raznim biotehnolo kim procesima u oblastima prehrambene tehnologije, za tite ivotne sredine, farmacije i biomedicine. Bioreaktori slu e za: 1. proizvodnju proteina odre enog soja elija iz metana, mineralnih frakcija ulja, poljoprivrednog otpada, itd.; 2. proizvodnju hrane (npr. pekarskog kvasca, sir eta, alkoholnih pi a), farmaceutskih proizvoda (antibiotika, vitamina, steroida) i organskih jedinjenja (kiselina, aminokiselina, rastvara a, polisaharida); 3. degradaciju zaga iva a i korisnih sirovina materijala iz otpada, otpadnih voda i izduvnih gasova; 4. remedikaciju zemlji ta (OTA-Report, 1988< Peyton, 1984); 5. proizvodnju energije (vodonik, metan, etanol) i sirovih materijala mikrobnim kva enjem ruda; 6. kori enje mikroorganizama kao katalizatora u organskim reakcijama (biooksidacija, bioredukcija, biofosforhlorisanje) i kao izvora va nih enzima (deterd enti, industrija hrane, medicina). Zahtevi pri projektovanju bioreaktora Pri projektovanju bioreaktora neophodno je da se zadovolje kriterijumi: 1. Sterilini uslovi rada; 2. Zadr avanje biokatalizatora; 3. Optimalno me anje sa minimalnim smicajnim naponima; 4. Adekvatan prenos mase (nutrijenata i kiseonika); 5. Jasno definisani uslovi strujanja; 6. Kontrolisano napajanje supstratom (nutrijentima); 7. Suspendovanje vrste faze; 8. Efikasan prenos toplote. 3

Page

3

ta uti e na projektovanje ili izbor bioreaktora? Najva niji faktori koje treba uzeti u obzir za projektovanje ili izbor bioreaktora su: vrsta elija, metaboli ko stanje elija, kinetika biohemijske reakcije, eljeni proizvod i mesto na kome bioreaktor treba da bude lociran. Vrsta biokatalizatora ive elije koje se koriste u biorektorima mogu biti bakterije, kvasci, gljive, biljne i ivotinjske elije. Svaki od ovih tipova elija zahteva odre ene uslove sredine, odre ene hranljive sastojke i uti e na proizvod biohemijskog procesa. Postoje dva tipa elija: prokariotske i eukariotske tj. proste i slo ene. Prokariotski organizmi su veli ine od 0,2 do 10 m i mogu se na i u razli itim oblicima kao izolovane elije ili micele. Rastu brzo pa zahtevaju odre ene uslove (optimalna temperatura i pH sredina). Mora se obezbediti i dotok odre enih hranljivih materija u bioreaktor. Dotok kiseonika mo e prouzrokovati problem zbog velike brzine rasta elija. Eukariotski organizmi imaju slo enu strukturu. Veli ine su od 5 do 30 m. Mnogo ih je te e kontrolisati nego prokariotske organizme. Posebno kad se na u u obliku micela, da bi se izbegla ve a ili manja mehani ka naprezanja treba izbegavati dovod energije u fermentor preko mehani kih me alica. Mogu se koristiti velike, sporo rotiraju e me alice ili kaskadne me alice. Treba izbegavati rashladne zavojnice i pregrade da bi se spre ile mrtve zone u reaktoru. elije biljaka su krhke i relativno velike, oko 50 m. One rastu sporo i zahtevaju posebne uslove, potrebno je podesiti koli inu odgovaraju ih nutrijenata i hormona koji omogu avaju rast i diferenciranje. Zato su bioreaktori za kultivaciju elija biljaka relativno malih dimanzija. Dotok kiseonika se obi no vr i preko vi eslojnog omota a. Prednost imaju bioreaktori sa unutra njom ili spolja njom cirkulacijom fluida (air-lift bioreaktori). ivotinjske elije su velike od 50 do 100 m, slo ene su strukture i vrlo su osetljive na mehani ka naprezanja. Mogu da se o tete ak i pri formiranju ili rasprskavanjem mehurova. Da bi se to spre ilo esto se primenjuje aeracija kroz silikonsku ili poliuretansku cev ili stvaranje velikog broja mehurova. Da bi se kultivisale osetljive ivotinjske elije bez elijskog zida potrebna je upotreba velikih, sporo rotiraju ih mehani kih me alica, reaktora sa malim odnosom visina-pre nik, dodavanje za titnih agenasa, izbegavanje brzog strujanja kako bi se sudari estica sveli na najmanju mogu u meru. Kod elijskih kultura sisara koje zahtevaju pogodnu povr inu za adheziju i rast mogu se koristiti Roller boce, Roux boce, plo asti razmenjiva i toplote, mikronosa i i makroporozni stakleni

4

Page

4

nosa i.

Organizmi sa rekombinovanim DNK sadr e elije sa razli itim brojem kopija plazmida. elije sa ve im brojem kopija se razmno avaju sporije u odnosu na one sa manjim brojem kopija.

Metaboli ko stanje elija Na izbor reaktora odlu uju u ulogu ima tip i stanje metabolizma elija koje se koriste. Pri aerobnim procesima mora se obezbediti efektivno i adekvatno snabdevanje kiseonika dispergovanjem i kasnijim me anjem u svim zonama bioreaktora. Zbog toga su bioreaktori sa aerobnim procesom esto opremljeni instrumentima za merenje koncentracije kiseonika u te noj i gasovitoj fazi (dispergatorima gasa). Pri anaerobnim procesima dispergovanje gasa nije potrebno. Me anje nije preduslov jer su procesi spori. U toku reakcije moraju se kontrolisati samo temperatura i pH. Fizikohemijske osobine medijuma Na izbor, projektovanje i na in rada bioreaktora uti u i fizikohemijske osobine medijuma. Agregatno stanje supstrata Da bi se obezbedila adekvatna brzina rastvaranja i prenosa u te noj fazi gasoviti supstrati moraju biti dispergovani u medijumu to homogenije. Za dispergovanje se koriste perforirane plo e ili kaskadne me alice. Da bi se postigla potrebna brzina prenosa mase i obezbedilo odgovaraju e vreme boravka mehurova u reaktoru koriste se posebne pregrade i me alice. Kod isparljivih supstrata gubici isparavanjem zbog aeracije se mogu umanjiti kori enjem ili ure aja sa istostrujnim tokovima sa blagim aksijalnim me anjem ili vi estepenih ure aja. vrsti supstrati moraju biti suspendovani jer mogu da o tete osovinu me alice reaktora. Ne treba koristiti sitaste posude, perforirane plo e i otvorene raspr iva e jer se mogu zapu iti. Slo enost supstrata Toplotna sterilizacija slo enih medijuma (npr. ekstrakt kvasca, kukuruzni ekstrakt) je mogu a samo do odre enog stepena. Zaga enje se spre ava procesom sterilizacije, velikom koli inom inokuluma, odr avanjem optimalne temperature i pH, i velikom koncentracijom supstrata i proizvoda. Izbor opreme za aeraciju, me anje, ure aja za uvo enje ar e i kontrolu nastajanja pene zavisi od toga da li je koalescencija mehurova potpomognuta ili spre ena medijumom. Ukoliko je koalescencija potpomognuta medijumom potrebna je upotreba velikih vi estepenih me alica ili kolona sa stati kim me alicama.

5

Page

5

Reologija medijuma Viskozitet medijuma odre uje brzinu prenosa kiseonika, vreme me anja, dovod energije, na in strujanja fluida, nastajanje i koalescenciju mehurova. Visoko viskozni medijumi su povezani sa visokim koncentracijama supstrata, suspenzijama, proizvodima visokih molekulskih masa (celuloza), plesnima koje stvaraju micelije i emulzijama. Za aeraciju treba koristiti dovode gasova malih dimenzija i uvoditi veliku snagu u reaktor. Pogodni su vi estepeni reaktori sa velikim odnosom pre nika me alica/reaktor.

Nastajanje pene Formiranje pene mo e biti zna ajno pri izboru reaktora. Nastajanje pene se mo e izbe i modifikovanjem sastava medijuma i kontrolom spiranja elija, starenja elija i uni tavanja elija prouzrokovanog mehani kim smicanjem ili se mo e smanjiti pomo u antipenu avih agenasa, sni avanjem pH, ubrizgavanjem pare i primenom specijalnih tipova reaktora (npr. reaktori sa potopljenom mlaznicom). Supstrati Na izbor bioreaktora uti u i stepen redukovanja supstrata (npr. kiseonika), brzina potro nje supstrata; nastajanje proizvoda i brzina rasta; inhibicija ili aktivacija biokatalizatora. U slu aju supstrata sa visokim stepenom redukovanja supstrata (nizak sadr aj kiseonika), potrebni su ve a brzina uvo enja kiseonika i specifi na brzina nastajanja toplote nego u slu aju supstrata sa niskim stepenom redukovanja. Moraju se koristiti reaktori sa dobrim sistemom odvo enja toplote, jer je potrebno odr avati temperaturu bioprocesa na optimalnoj i konstantnoj vrednosti. Bioreakcije koje su osetljive na pH vrednost treba da se izvode u reaktorima sa velikim intezitetom me anja, kratkim vremenom me anja i pH regulatorima. Na in izvo enja procesa Na in izvo enja procesa u bioreaktoru mo e biti: ar ni (sve komponente dodaju se u medijum na po etku, a na kraju procesa se izdvaja proizvod), polikontinualni (u toku procesa dodaju se hranljivi sastojci i supstrati) i kontinualni (u toku procesa dodaju se hranjiva i odvaja proizvod). Prema na inu izvo enja procesa razvijeno je vi e razli itih konfiguracija bioreaktora, kao: 1. ar ni bioreaktor sa inokulacijom i punjenjem svim hranljivim sastojcima i supstratima. 2. ar ni bioreaktori sa razli itim brzinama uvo enja ar e i razli itim modelima strujanja u reaktoru. 3. ar ni bioreaktori sa kontinualnim uvo enjem ar e, tako da koncentracija supstrata ostaje

6

Page

6

konstantna. 4. Ponovljeni ar ni procesi; po to je jedna ar na reakcija zavr ena, manja koli ina fermentacionog proizvoda se ostavlja u reaktoru, kao inokulum za slede u ar u.

5. Kontinualni bioreaktor sa me anjem sa ulaznim i izlaznim tokovima reakcionog medijuma; ovaj reaktor se naziva hemostatom u slu aju kada gustina elija i koncentracija supstrata ostaju nepromenjeni. 6. Kaskadni kontinualni bioreaktor sa me anjem, sa ili bez intermedijarnog punjenja i recirkulacijom medijuma i biokatalizatora. 7. Kombinacija bioreaktora sa klipnim strujanjem i kontinualnog reaktora sa me anjem; kontinualni reaktor sa me anjem slu i kao inokulum. Sterilnost i kontaminacija Za sterilne procese mogu se koristiti svi standardni hemijski reaktori ukoliko njihovi filteri, zatvara i, ventili, ure aji za uzimanje uzoraka, senzori i osovine ispunjavaju osnovne zahteve sterilnog procesa: 1. jednostavan geometrijski oblik; 2. minimalan broj ivica i spojeva; 3. eliminacija mrtvih zona; 4. dovodi, ispusti i ventili koji se mogu sterilisati; 5. mogu nost da se pojedina ne zone reaktora zasebno sterili u; 6. spre avanje nadpritiska u reaktoru; 7. minimalan broj ure aja za merenje i uzimanje uzoraka; 8. minimalna hrapavost povr ina; 9. osovine me alica koje mogu da se sterili u. Banka elije elije koje se koriste za industrijsku proizvodnju se mogu izolovati iz prirodnih stani ta, ili se mogu koristiti sojevi iz postoje ih zbirki, to jest banki mikroorganizama. Polazni materijal za proizvodnju biolo kog proizvoda su kulture elija bakterija, kvasca ili sisara koje lu e proteine ili specifi na monoklonska antitela. Proizvo a i koriste sistem zasejane ar e elija. Zasejana ar a elija sastoji se od alikvota jedne kulture. Glavna banka elija MCB ( Master cell bank) dobija se od jedne kolonije (bakterije, kvasac) i ili jedne eukariotske elije koja se uva u kriogenim uslovima da bi se osigurala genetska stabilnost banki elija. Glavna banka elija (MCB) se sastoji od dovoljnog broja ampula sa elijskom kulturom i obezbe uje izvor materijala za radnu banku elija WCB ( Working cell bank). Radna banka elija je odre ena koli ina elija, dobijenih iz jedne ili vi e ampula glavne banke elija, koja se uva u kriogenim uslovima i koristi za pokretanje proizvodnog ciklusa. Po to je genetska stabilnost banke elija veoma zna ajna, glavna banka elija ampula se uva zamrznuta ili liofilizirana i koristi se samo jednom. Nova glavna banka elija mo e se dobiti, u odre enim slu ajevima, iz radne banke elija. Nova glavna banka elija mora da bude testirana i

7

Page

7

da zadovolji odgovaraju e kriterijume. Tako e, zahtev za licencom mora biti odobren pre nego to se MCB generi e iz WCB.

Faze biotehnolo ke proizvodnje Bioproces se odvija kroz nekoliko faza: o sterilizacija perifernih i prate ih delova bioreaktorskog sistema (cevovod, dovodni i odvodni ventili, posude za prikupljanje proizvoda, pumpe, senzori); o sterilizacija i autoklaviranje medijuma termi ki ili upotrebom sterilnih filterskih jedinica; o analiza fenotipa i funkcionalne biokompatibilnosti radne banke elija; o predreaktorska kultivacija elija na nivou flaska odnosno roller boca u stati kim uslovima do postizanja potrebne elijske koncentracije za njihov prenos u radni bioreaktor; o propagacija, razmno avanje elija u radno-proizvodnom bioreaktoru-fermentoru zapremine od 10 do 5000 L u zavisnosti od vrste procesa. Sterilisanje bioreaktora Za bioprocese je potreban rad bioreaktora pod sterilnim uslovima. Bioreaktor i svi ulazno-izlazni delovi treba da budu sterilisani, to zna i: - na po etku procesa treba obezbediti sistem bez kontaminiraju ih mikroorganizama i - treba spre iti curenje mikroorganizama tokom izvo enja fermentacije, kako u samom sistemu, tako i ka spoljnoj okolini. Sterilisanje parom Kod sterilizacije bioreaktora parom neophodno je da se iz njega uklone svi gasovi i vazduh da smrtnost kontaminanata koju treba da izazove vrela para bude ve a. Tako e, kad se vr i sterisanje parom ukoliko je zaostao vazduh u reaktoru dovodi do vi eg pritiska. Sterilizacija u autoklavu Manji reaktori od stakla (3-5 L) mogu se sterilisati u autoklavu. Prednost sterilizacije u autoklavu je to se ceo reaktor sterili e zajedno sa prate im i perifernim delovima, a nedostatak je to esto dolazi do o te enja prilikom preno enja bioreaktora od procesnog mesta do autoklava, vazduh zaostaje u reaktoru i zagrevanje u autoklavu je nekontrolisano i esto traje dugo jer nema me anja medijuma. Automatska sterilizacija punog reaktora (SIP) Sterilizacija na mestu na kome radi reaktor SIP (sterilization in place) vr i se zagrevanjem te nosti (medijum ili voda) u reaktoru da bi se proizvela para neophodna za sterilizaciju. Zagrevanje se vr i uobi ajenim metodama (direktnim uvo enjem pare, toplotnim omota ima, zavojnicama, elektri nim ure ajima) uz me anje. Pri ispu tanju pare iz bioreaktora u vazduh,

8

Page

8

temperatura pare je oko 100C. Priklju ci i ostali prate i elementi moraju se sterilisati posebno.

Automatska sterilizacija praznog reaktora (SIP) Sterilizacija se vr i uvo enjem iste pare u prazan reaktor. Primenjuje se kada je medijum osetljiv na visoke temperature ili kada treba smanjiti vreme zagrevanja (naro ito velikih bioreaktora). Kontinualna sterilizacija vodom i parom Kontinualnom sterilizacijom posti e se kra e vreme (oko 90 s) sterilizacije na vi im temperaturama (vi im od 130C). Za kontinualnu sterilizaciju potrebna je dodatna oprema, koja prethodno mora biti sterilisana (pumpa, razmenjiva i toplote, otpusni ventil). Sterilna filtracija Ulazne i izlazne struje bioreaktora moraju se sterilisati da bi se spre ila kontaminacija u samom reaktoru i da bi se spre ilo zaga enje okoline. Za sterilizaciju se koriste dva tipa filtera: dubinski i membranski. Spaljivanje Ure aji za spaljivanje se koriste za sterilizaciju izlaznih gasova. Pe za spaljivanje patogenih mikroorganizama iz izlaznih struja gasa radi kontinualno s temeraturom od 350 do 450 C. Pranje bioreaktora Nakon bioprocesa neophodno je reaktor o istiti. Iz bioreaktora je potrebno ukloniti ostatke e era, masti i proteina. Nakon i enja, posebnim ure ajima mere se koncentracije odre enih komponenata-kontaminanata (organskih jedinjenja, DNK, proteina, enzima) koje trebaju biti ispod odre enih vrednosti kada je reaktor o i en. Ru no pranje Ru no pranje primenjuje se i za male i za velike bioreaktore. Reaktor se najpre ispere obi nom vodom iz esme, zatim se napuni rastvorom za pranje koji se me a i zagreva. Pranje se vr i u fazama: - pranje rastvorom 0,1-1M NaOH na temperaturi od 60 do 140 C nekoliko sati; - pranje rastvorom 0,1 do 0,5M H3PO4 ili HNO3 na temperaturama do 90C manje od jednog sata; - pranje rastvorima proteaza nekoliko sati.

9

Page

9

Izme u faza i na kraju procesa reaktor se ispira obi nom ili demineralizovanom vodom.

Automatsko pranje bioreaktora (CIP) Pranje reaktora na istom mestu na kome i radi reaktor CIP (cleaninig in place) je naj e e potpuno ili delimi no automatizovano, pa je mnogo br e i lak e u odnosu na ru no pranje. Za automatsko pranje (sanitaciju) reaktor treba da bude dodatno opremljen (posebni ventili, specijalni raspr iva i (brizgaljke), razmenjiva i toplote sa pumpama), a rastvori za pranje se pripremaju u posebnoj zoni procesnog postrojenja CIP kuhinji. Pranje se vr i u nekoliko faza: - ispiranje alkalnim rastvorom; - ispiranje kiselim rastvorom; - ispiranje dejonizovanom vodom ili vodenom parom pod visokim pritiskom. Da bi se obezbedilo automatsko pranje bioreaktora prate i procesni elementi (cevovodi, ventili, pumpe) moraju biti otporni na temperaturu sterilizacije i na sredstva (hemikalije) za pranje i sanitaciju. Priprema supstrata U bioprocesima posebno je va no vrlo precizno doziranje supstrata, koje mora biti izvedeno na sterilan na in. Problemi sterilnosti supstrata izra eniji su pri kontinualnim biotehnolo kim procesima, za koje je potrebno kontinualno uvo enje supstrata. Kod ovog procesa, umesto jedne supstance, kao supstrat uvode se vi ekomponentne sme e (medijum) za kultivaciju mikroorganizama ili elijskih linija. Za kontinualnu pripremu supstrata bitno je precizno doziranje supstrata, koje mora biti izvedeno na sterilan na in. Za precizna doziranja supstrata pokazala su se re enja sa upotrebom peristalti kih pumpi. Obrada bioprodukata Reaktorski medijum je po izlasku iz bioreaktora sme a vrsto-te no koja sadr i elije, elijske produkte u ili van elije, ostatke nutrijenata itd. Ta sme a je vrlo razbla ena suspenzija, koju treba koncentrovati. Tako e, bioproizvod mo e biti: sama elija (biomasa, npr. pekarski kvasac) intracelularan (nastali proizvod ostaje unutar elije, npr. insulin) ekstracelularan (nastali proizvod je izlu en u reaktorski medijum, npr. antibiotici)

1 0

Page

10

Obrada bioprodukata (reaktorskog medijuma) vr i se u nekoliko faza: izdvajanja biomase, razbijanje elijskih membrana, koncentrovanje bioprodukata, izolacija i fino pre i avanje bioprodukata, kona na obrada bioprodukata.

Procesi separacije vrsto-te no Procesi izdvajanja biomase su procesi separacije vrsto-te no pri emu se primenjuju metode centrifugiranja i filtracije. Zavisno od veli ine elija i filterskog sistema, filtracija mo e biti tradicionalna, mikrofiltracija, ultrafiltracija i rezervna osmoza. U cilju pojednostavljenja separacije je razvoj novih kultivacionih medijuma kao npr. medijum bez seruma za razvoj ivotinjskih elija radi dobijanja proteina. Na kraju procesa ostaju samo produkovani proteini, ime je separacija proizvoda (proteina) iz medijuma svedena na pre i avanje jednog proteina. Tako e, u toku pripreme medijuma pre procesa separacije mo e se uticati na pojednostavljenje separacije i to: zagrevanjem (smanjuje se viskoznost, razbija se struktura gela, pove ava se agregacija), hla enjem (pove ava se agregacija, pobolj ava se uklanjanje vode) i hemijski (menjanjem pH). Procesi dezintegracije elija Pri dobijanju intercelularnih bioproizvoda mora se razbiti- otvoriti elijska membrana, uz uslov da se bioproizvod ne o teti. Otvaranje elija mo e se ostvariti mehani kim, mikrobiolo kim (enzimskim) ili hemijskim putem. Najpoznatijiji mehani ki ure aji su kugli ni mlin i homogenizator. Uspe nost razbijanja elijske membrane zavisi od brzine mlevenja kao i od koncentracije i veli ine kuglica u mlinu. Princip rada homogenizatora se svodi na strvaranje visokih smicajnih sila visokim pritiscima koji nastaju u fluidu. Procesi koncentrovanja bioprodukata Nakon izdvajanja elija ili elijskih ostataka, medijum (vrlo razbla ena suspenzija) treba koncentrovati da bi se smanjila radna zapremina pri procesima izolacije i finog pre i avanja bioprodukata. Poznat proces za koncentrovanje bioprodukata je uparavanje. Izvodi se u vakuumu ili u vrlo kratkim vremenskim intervalima. Za biolo ke materijale pogodniji su drugi procesi koncentrovanja, procesi ekstrakcije organskim rastvara ima. Tako postoji reaktivna ekstrakcija, pri kojoj se organskoj fazi dodaje neki alifatski sekundarni amin ija je rastvorljivost u vodi

1 1

Page

11

zanemarljiva (npr. ekstrakcija penicilina u dve protivstrujne kolone), zatim ekstrakcija u dve vodene faze, pri kojoj se za ekstrakciju upotrebljava polietilenglikol K3PO4 pri emu se razdvajaju proteini (npr. kontinualno izdvajanje enzima) i ekstrakcija superkriti nim (te nim) CO2 (npr. etanol). Tako e, za koncentrovanje bioprodukata pogodni su membranski procesi, posebno ultrafiltracija, a u poslednje vreme zna ajna je elektrodijaliza.

Izolacija i fino pre i avanje bioprodukata Za izolaciju i fino pre i avanje bioprodukata naj e e se upotrebljavaju metode kristalizacije i hromatografije. Upotrebljavaju se svi oblici hromatografije: o jono-izmenjiva ka hromatografija, o HPLC (te na hromatografija pod visokim protiskom), i o afinitivna hromatografija (npr.za monoklonska antitela). Razvoj populacije mikroorganizama ar ni rast predstavlja rast elija na podlozi odre enog sastava u toku koga se ne vr i nikakvo dodavanje nutrijenata ili promene sastava podloge nakon zasejavanja elija. elije u toku ar nog rasta prolaze kroz etiri osnovne faze: lag faza, logaritamska faza ili faza eksponencijalnog rasta, stacionarna faza i opadaju a faza.

Lag faza je poznata kao faza mirovanja ili po etna faza. Mikroorganizmi kada se na u u novoj hranjljivoj sredini (podlozi) po inju se prilago avati izmenjenim fizi ko-hemijskim uslovima. U ovoj fazi nema razmno avanja ve samo uve anje elija. Vremensko trajanje lag faze je razli ito, prema vrsti, soju, starosti kulture, njenom fiziolo kom stanju, po etnom broju elija, kao i od fizi ko-hemijskih uslova sredine (pH, temperatura, sastav podloge). Logaritamska ili eksponencijalna faza - U ovoj fazi sve se elije nalaze u aktivnom stanju razmno avanja. Proces razmno avanja je najbr i. Populacija raste konstantnom brzinom. Vreme deljenja od jedne elije do druge uvek je isto. Od jedne elije nastaju dve, od dve nastaju etiri, od etiri osam, od osam esnaest. U eksponencijalnoj fazi sve elije mikroorganizama su ive. Veoma su osetljive na dejstvo spoljapnjih inilaca i najlak e ih je uni titi. Aktivnost elije je pove ana i sinteti e se itav niz va nih sastojaka elije.

1 2

Page

12

Stacionarna faza U ovoj fazi populacija po broju mikroorganizama dosti e svoj maksimum. Broj novonastalih elija i elija koje odumiru je isti. U ovoj fazi dolazi do maksimalnog stvaranja odre enih proizvoda (antibiotika, acetona, etanola, butanola, odre enih vitamina). Faza odumiranja Posle stacionirane faze ivotna sposobnost mikroorganizama opada, jer je do lo do pogor anja uslova sredine, koja je pretrpela znatne fizi ko-hemijske izmene. Broj mikrorganizama koji odumire po inje da prevazilazi broj ivih elija. Ve i broj mikroorganizama nestaje nego to nastaje. Tokom vremena cela populacija odumire, to mo e trajati nekoliko dana (bakterije, mle ne kiseline), nedelja ili godina kod veoma otpornih predstavnika (sporogene bakterije).

Sterilizacije medijuma Sterilizacija medijuma je veoma va na za biotehnolo ki proces. Obuhvata sve metode kojima se ne eljeni mikroorganizmi uni tavaju. Tehnike koje se mogu primeniti za sterilizaciju su: filtracija, flotacija, jonska izmena, centrifugranje. Ove tehnike se primenjuju na manje sisteme, izuzev filtracije koja se se mo e primeniti na industrijskom nivou. Naj e e se koristi sterilizacija medijuma parom. ar na sterilizacija Izvodi se tako to se medijum uvodi u sterilizator, autoklav ili posebno projektovan fermentor. Medijum se zagreva do zadate temperature sterilizacije i definisanog pritiska. Po to se temperatura medijuma menja tokom grejanja i hla anja, kineti ka konstanta se tako e menja. Kontinualna sterilizacija Ima prednost u odnosu na ar nu sterilizaciju. Pri kontinualnoj sterilizaciji lak a je kontrola procesa, manja je potro nja pare, kra e vreme sterilizacije i dobijaju se ve i prinosi fermentacionih proizvoda, zato to se medijum izla e kratko vreme visokoj temperaturi, pa je degradacija medijuma minimalna. Nedostatak kontinualne sterilizacije su ve i investicioni tro kovi. Klasifikacija bioreaktora Na projektovanje bioreaktora uti u koncentracija biomase, zahtevi sterilnosti, me anje, suspendovanje, aeracija, prenos toplote i osetljivost elija na smicajne napone. Bioreaktori se mogu podeliti na osnovu tipa i forme biokatalizatora na nekoliko grupa: 1. Bioreaktori sa slobodnim elijskim kulturama; 2. Bioreaktori sa imobilisanim elijama ili enzimima; 3. Bioreaktori sa zadr avanjem ili recirkulacijom biokatalizatora

1 3

Page

13

Na osnovu konfiguracije bioreaktori se mogu podeliti: 1. Rezervoari (visina/pre nik _ 3) 3. Rezervoari sa unutra njom ili spolja njom cirkulacijom fluida; 4. Kolone sa unutra njom ili spolja njom cirkulacijom fluida. Bioreaktori za aerobne procese s obzirom na vrstu kori ene energije mogu se podeliti: 1. Bioreaktori sa unutra njim mehani kim me anjem; 2. Bioreaktori sa spolja njim dovo enjem te nosti; 3. Bioreaktori u kojima se dovod energije vr i kori enjem komprimovanog vazduha (pneumatsko me anje).

Bioreaktor sa mehani kim me anjem Bioreaktor sa mehani kim me anjem je najjednostavniji i najvi e kori en za gajenje animalnih elija. Sastoji se od cilindri ne posude sa me alicom. Posude su konstruisane tako da im je dno zaobljeno da bi se obezbedilo me anje kori enjem malih brzina. Me alice se projektuju tako da omogu avaju i vertikalan i horizontalan tok fluida. Za bioreaktore manjih razmera koristi se eksterno zagrevanje po principu duplih zidova da bi se odr ala optimalna temperatura koja se kre e oko 37C. Kod reaktora velikih razmera zagrevanje se vr i kroz unutra nje cevi. Izbegava se upotreba greja a jake snage jer bi to moglo o tetiti elije.

Biotehnolo ka proizvodnja antibiotika penicilinaProizvodnja penicilina Prvi otkriveni antibiotik je penicilin. Penicilin je slu ajno otkrio britanski bakteriolog Aleksandar Fleming 1928. U posudu sa gajenim kulturama bakterija stafilokoka upao je komadi plesni Penicillium notatum i uni tio bakterijske kolonije. Fleming je kasnije utvrdio da ta plesan izlu uje neku supstancu koja uni tava bakterije i nazvao je penicilin. Masovna proizvodnja ovog antibiotika po inje 1944. i smatra se jednom od prekretnica u biotehnologiji. U industrijskoj proizvodnji penicilina ve od 1951. Flemingova plesan Penicillium notatum je zamenjena novom vrstom Penicillium chrysogenum, koja je izolovana iz plesnjive bundeve. Penicilin se na industrijskom nivou proizvodi u bioreaktorima, velikim cilindri nim sudovima izgra enim od ner aju eg elika, koji sadr e te ni medijum u kojem se gaji plesan. Bioreaktori su opremljeni mernom i regulacionom tehnikom koja meri bioprocesne parametre i automatski ih kontroli e: temperatura, pH vrednost, koncentracija hranljivih materija i kiseonika, stvaranje pene, i sterilnost podloge i vazduha.

1 4

Page

14

Proizvodni mikroorganizam Mikroorganizam producent u industrijskoj proizvodnji penicilina je plesan Penicillium chrysogenum. Plesni su prave gljive kon astog izgleda, ija su pojedina na vlakna poznata kao hife. Splet kon astih vlakana (hifa) poznat je kao micelijum. Razmno avaju se vegetativno formiranjem spora. Spore (konidije) su elipti nog oblika, veli ine 4x3 m, a nalaze se na sterigama koje dr e metule i konidioforu. Spore se rasejavaju u okolnu sredinu. Klijanjem (germinacijom) spora po inje razvoj plesni. Na vrstim podlogama rastu u obliku kolonija, pre nika su od 4 do 5 cm nakon 10 do 12 dana gajenja, okrugle su, radijalno naborane.

Sojevi Penicillium chrysogenum su visoko produktivni (do 60 g/l). Potrebna je njihova stalna selekcija i kontrola, a temelji se na morfolo kim i fiziolo kim karakteristikama. Sojevi producenti se uvaju na du e vreme. Razvijene su metode uvanja: 1. liofilizacijom, 2. uvanje na sterilnom pesku, 3. uvanje na sterilnim zrnima itarica (zamrznuto). Podloga za uvanje i selekciju sojeva je sastava: maltoza 28 g glukoza 2g pepton (ekstrakt kvasca) 8 g voda 1000 ml pH 5,5-6,0

Pobolj anje produktivnosti sojeva mikroorganizma producenta Prvi sojevi su se proizvodili samo povr inskim gajenjem. Bili su sa vrlo niskim prinosom. Pobolj anje proizvodnih osobina Penicillium chrysogenum je prvih dvadesetak godina postignuto mutacijama i selekcijom (uticajem UV, rendgenskog zra enja ili dejstvom hemikalija). Pobolj anje procesa je tako e postignuto prehranjivanjem sa izvorima C, N, S i P; prekursorima, kontrolom procesa i pobolj anjem izolacije. U novije vreme veliki napredak u pove anju prinosa penicilina se mo e ostvariti geneti kim modifikacijama (rekombinacijom) haploidnih segreganata dobijenih ukr tanjem izme u mutanata razli itih linija sojeva.

1 5

Page

Proces biosinteze penicilina

15

Umno avanje po inje od istog laboratorijskog soja, koji se umno ava presejavanjem u laboratorijske posude sa rastu om zapreminom dok se ne razvije dovoljno biomase za zasejavanje industrijskih bioreaktora. Proces biosinteze se provodi kroz tri faze: 1. Rast micelijuma u germinatoru 2. Rast micelijuma u predfermentoru 3. Rast micelijuma i biosinteza penicilina u bioreaktoru (fermentoru)

Rast micelijuma u germinatoru i predfermentoru Proces zapo inje aktiviranjem proizvodne kulture (spora) u te noj hranljivoj podlozi u malim posudama konusnog oblika (Erlenmajer posudama) 7 do 10 dana na temperaturi 25C. Kada su uspostavljeni op ti uslovi za rast, spore se prebacuju u germinator. U germinatoru gajenje inokuluma traje od 36 do 50 asova, temperatura je od 24 do 26C, aeracija 1 do 1,5 l / min, pH vrednost 6,0 do 7,0; micelij posti e III fazu rasta. Umno avanje biomase se dalje nastavlja prebacivanjem inokuluma iz germinatora u predfermentor, kultivacija traje od 12 do 18 asova pri istoj temperaturi, iste pH vrednosti i aeracije. Micelijum posti e III fazu rasta. Hranljiva podloge je sastava: Kukuruzni ekstrakt 2% Glukoza 2% Laktoza 0,5 % NH4NO3 0,125 % KH2PO4 0,2 % MgSO4 0,025 % Na2SO4 0,05 % CaCO3 0,5 % Voda do 100 % pH 6,0 6,5 Gajenje u bioreaktoru Gajenjem inokuluma u germinatoru i predfermentoru potrebno je dobiti dovoljnu koli inu biomase, koja osigurava pri gajenju u industrijskom bioreaktoru intenzivan rast producenta i visok prinos penicilina.

1 6

Page

16

Gajenje u bioreaktoru se mo e podeliti u dva dela: a) Brzi rast micelijuma, faze rasta II i III, brza potro nja ugljenika i azota, intenzivno disanje (aeracija), porast pH, nema biosinteze penicilina (1). b) Polagani rast micelijuma, polagano asimiliranje izvora ugljenika i azota, faze rasta micelijuma IV, V i VI, smanjeni intenzitet disanja-aeracije, konstantna vrednost pH, maksimalna biosinteza penicilina (2). Uslovi gajenja u bioreaktoru su takvi da se postigne pravovremeni prelaz iz faze (1) u fazu biosinteze penicilina (2)

Sastav hranljive podloge za biosintezu penicilina Hranjivi sastojci koji su potrebni za rast micelijuma i odr avanje biomase su: 1. Makronutrijenti ili makroelementi: ugljenik, azot, kiseonik, vodonik, fosfor, sumpor; 2. Mikronutrijenti ili mikroelementi: Mg, Zn, Fe, K, i dr.; Proizvodni proces pospe uju prekursori. Oni se ugra uju u molekul penicilina i usmeravaju biosintezu u odre eni penicilin. Visoko produktivni sojevi ugra uju do 90%, a nisko produktivni oko 10% prekursora u molekul penicilina. Najbolji prekursori su fenilsir etna kiselina (pri emu nastaje benzilpenicilin) i fenoksisir etna kiselina (fenoksimetilpenicilin). Slo ena podloga za proizvodnju penicilina sadr i: 1. Glukoza ili melasa (kontinualno doziranje) 10% 2. Ekstrakt od mo enja kukuruza 1 do 5% 3. Fenilsir etna kiselina (kontinualno doziranje) 0,5 do 0,8% 4. Biljno ili ivotinjsko ulje kao antipenu avce (kontinualno dodavanje) 0,5% 5. pH podesiti na 6,5 do 7,5 dodatkom baze Uslovi biosinteze U toku procesa koristi se ar ni postupak gajenja sa prehranjivanjem supstrata. Trajanje kultivacije je od 200 do 300 asova. Temperatura je do 48 asova 28C, a posle toga 24C, pH vrednost se odr ava i reguli e sa CaCO3 . Penicillium chrysogenum pri submerznom gajenju mo e rasti u obliku peleta (strukturirane i agregirane hife) ili filamentozno (rastresite hife). Rast u obliku peleta mnogo manje uti e na viskoznost i difuziju, pa je povoljniji za proizvodnju penicilina. Oblik, veli ina i koncentracija peleta se osigurava koncentracijom spora pri gajenju inokuluma. Neophodno je snabdevanje kulture sa kiseonikom. Mala brzina me anja uslovljena je potrebom za osiguranjem strukture peleta (pri ve oj brzini se raspadnu). Kao sredstva za suzbijanje pene koriste se biljna i ivotinjska ulja i masti (sojino, suncokretovo,

1 7

Page

17

kukuruznih klica i dr.). Koriste se i sintetska sredstva (glicerinska, stearinska i oleinska kiselina) Zbog odr avanja uslova gajenja optimalnih za biosintezu penicilina neophodna je sterilnost podloge i vazduha. Sami aparati i oprema treba da su takvi da se lako odr ava sterilnost. Proces izolacije penicilina Nakon to je bioproces zavr en, pristupa se izolovanju penicilina iz te ne podloge, njegovom pre i avanju. Posebna pa nja u proizvodnji penicilina se poklanja pre i avanju to podrazumeva potpuno uklanjanje svih ne isto a, tako da se na kraju dobije proizvod visoke koncentracije i isto e. Proces izolacije penicilina se provodi u tri faze: 1. Filtracija i dodatna obrada filtrata 2. Ekstrakcija teku e-teku e (pre i avanje) 3. Dobijanje kristala soli penicilina i su enje

Filtracija je prvi stepen u procesu izdvajanja penicilina. Filtracija predstavlja razdvajanje elija mikroorganizma i ostalih krupnih estica od filtrata. Obi no se provodi s vakumskim bubanjskim rotacionim filterima. Obradom filtrata se uklanjaju proteini (stabilizatori emulzije pri ekstrakciji) obi no dodatnom filtracijom i talo enjem proteina (solima Al, Fe, Zn ili taninom). Najve i gubici pri izolaciji su pri filtraciji ( ak do 10%). Hla enjem filtrata (+4C) u protivstrujnim izmenjiva ima se spre ava termalna inaktivacija penicilina. Ekstrakcija (pre i avanje penicilina) se sprovodi u protivstrujnim centrifugalnim ekstraktorima ili protivstrujnim ekstraktorima dekanterima. Kao rastvor koriste se amilacetat, butilacetat, butanol (rastvor:filtrat=1:3). Kod pH ekstrakcije 1,9 do 2,0 penicilin je nedisosovan, topljiv u organskom rastvoru, netopljiv u vodi. Brzo se raspada, inaktivira. Pri pH 6,0 do 7,0 penicilin je disosovan i topljiv u vodi. Ekstrakcija se sprovodi brzo (do 30 sekundi) uz istovremeni ulazak u ekstraktor filtrata s penicilinom i kiseline. Centrifugalno polje osigurava brzo provo enje ekstrakcije i razdvajanje emulzije. Pre talo enja, kristalizacije otopini penicilina se dodaje aktivni ugljenik (uklanja ne isto e), pa se ponovo filtrira. Ukoliko su niski prinosi penicilina u biosintezi ekstrakcija se mo e ponovo provesti. Kristalizacija se provodi dodatkom kalijumovih ili natrijumovih soli (acetata) u organskom rastvara u, odnosno povi enjem pH vrednosti na 6,0 do 7,0. Kristali se filtriraju, potom peru rastvorom i su e. Su enjem se uklanja voda iz istog preparata penicilina. Su e se u struji toplog vazduha na sitastoj beskona noj traci. Su enje se mo e sprovesti i liofilizacijom. Liofilizacija je su enje sublimacijom leda u vakumu. Proces je podeljen u dva dela: 1. zamrzavanje materijala u tankom sloju, pri temperaturi -15 S 2. su enjem zamrznutog materijala u vakumu pri niskim temperaturama Odavde penicilin mo e da bude prera en i upakovan za marketing i distribuciju na globalnom tr i tu.

1 8

Page

18

Upotreba penicilina Penicilin ima uzak spektar delovanja. Uni tava G+ bakterije. Koristi se u le enju pneumonije, stafilokokne upale, sifilisa, gonoreje, tetanusa, meningitisa (bakterijskog). Obi no dolazi u obliku injekcija i kapsula. Izaziva alergije (anafilakti ki ok).

ENZIMI Enzimi su prvi put izolovani u istom obliku 1928. godine, od kada broj poznatih enzima raste. Danas je njihov broj ve i od 2000. To su proteini sa molskom masom od 15.000 pa ak i do million. Reakcije u eliji odigravaju se velikom brzinom, to je omogu eno prisustvom prirodnih (biolo kih) katalizatora enzima (gr . en - u; zyme - kvasac). Odlika katalizatora je da ubrzava hemijsku reakciju i usmerava njen tok, ali se tokom te reakcije ne tro i. Enzimi ubrzavaju biohemijske reakcije tako to sni avaju energiju aktivacije koja je potrebna da bi otpo ela odre ena reakcija. Bez enzima je nemogu a razmena materije i energije u eliji.

Podela enzima Podela prema gra i Prema gra i se dele na: proste i slo ene. Prosti enzimi se sastoje samo od proteina, dok slo eni pored proteinskog imaju i neproteinski deo. Slo eni enzimi (holoenzimi) , dakle, se sastoje od: 1. apoenzima (proteinski deo) i 2. neproteinskog dela koji mo e da bude koenzim ili prosteti na grupa.

1 9

Page

19

Najva niji koenzimi su oni koji u estvuju u procesima oksidacije, kao to je npr. NAD (nikotinamid-adenin-dinukleotid), NADP (nikotinamid-adenin-dinukleotid-fosfat). Mnogi koenzimi su vitamini (bitni sastojci, koji se moraju unositi hranom). Prema mestu delovanja Prema mestu gde se stvaraju, a gde deluju dele se na: endoenzime i egzoenzime. Endoenzimi deluju u samoj eliji u kojoj se stvaraju, a egzoenzimi deluju van elije u kojoj se stvaraju. Neki enzimi se sinteti u kao neaktivni proenzimi i aktiviraju se samo kada su potrebni, obi no pomo u drugog enzima. Takvi su, npr. enzimi pankreasa koji u estvuju u varenju hrane i izlu uju se u neaktivnom obliku (da ne bi razlo ili elije koje ih sinteti u), a aktiviraju se tek kad dospeju u tanko crevo gde vare hranu. Prema kataliti kom delovanju.

2 0

Page

Prema vrsti reakcije koju katalizuju dele se na: y oksido-reduktaze, katalizuju rekacije oksido-redukcije; pripadaju im: o dehidrogenaze o oksidaze o preoksidaze o hidroksilaze o oksigenaze y tranferaze, katalizuju preno enje funkcionalnih grupa, aldehidnih ili keto ostataka, grupa koje sadr e fosfor ili sumpor; y hidrolaze, vr e hidrolizu (uvo enje molekula vode) razli itih veza; y liaze, katalizuju odstranjivanje grupa iz jedinjenja na koja deluju ili uvode grupe u jedinjenja namestu gde se nalaze dvogube veze; pripadaju im i: o karboksilaze o aldolaze o dehidrataze itd. y izomeraze, katalizuju prela enje jednog izomera u drugi; ovog grupi pripadaju: o racemaze o cis-trans izomeraze o epimeraze itd. y ligaze, katalizuje reakcije u kojima dolazi do uspostavljanje neke veze (C-O, C-S, C-N ili C-C) izme u dva molekula to je pra eno razlaganjem ATP-a Izolovanje enzima

20

Od stotinak enzima koji se koriste u industriji preko pola se dobija iz gljiva i kvasaca, preko jedne tre ine se dobija iz bakterija a ostatak iz ivotinjskih elija (8%) i biljaka (4 %). Prednosti mikroorganizama za izolovanje enzima su: ni a cena proizvodnje sadr aj enzima je predvidljiv i podlo an kontroli lak e se obezbe uje sirovi materijal konstantnog sastava biljke i ivotinje imaju ve i sadr aj endogenih inhibitora i proteaza

Imobilizacija enzima Prilikom primene enzima u rastvoru enzimi gube deo svoje aktivnosti nakon zavr etka reakcije u postupku izolovanja proizvoda. Pored ovoga gubitka javlja se i problem kontaminacije proizvoda. Ovaj problem se mo e prevazi i primenom imobilizovanih enzima. Imobilizovani enzimi su nerastvorni enzimi. U reakcijama koje se izvode u vodenoj sredini enzimi se mogu u initi nerastvornim umre avanjem ili fiksiranjem enzima za vrsti nosa . U organskoj sredini mogu se koristiti suspenzije liofilizovanih enzima ili enzimi fiksirani za nosa .

Prednosti imobilizovanih enzima su: 1. vi estruko kori enje 2. enzim se lako odvaja od ostatka reakcione smese 3. rigorozna kontrola procesa 4. visoka otpornost na mehani ka o te enja 5. manja kontaminacija 6. proces je br i 7. Automatizacija Nedostaci imobilizovanih enzima su: 1. potreba za istim enzimom poskupljuje proces 2. difuziona ograni enja 3. skupi polimeri 4. faza vi e u pripremi enzima 5. reagensi za imobilizaciju poskupljuju proces 6. gubi se deo aktivnosti tokom imobilizacije Kataliticka sposobnost enzima

2 1

Page

21

Vezana je za njihovu hemijsku gra u i prostornu orijentaciju molekula, koja se naziva konformacija. Konformacija enzima se formira zahvaljuju i primarnoj, sekundarnoj, tercijalnoj i kvaternernoj strukturi. Primarnu strukturu ini visokomolekularni peptidni niz, tj. veliki broj aminokiselina povezan peptidnom vezom. Peptidni niz se specifi no orijenti e u prostoru formiraju i prvo sekundarnu, zatim tercijernu i na kraju kvaternernu strukturu. Prostorna struktura se stabilizuje pomo u vodoni nih mostova, jonskih veza i van der Waals-ovih sila. Od svih struktura najstabilnija je primarna, jer je ine prave hemijske (peptidne) veze. Sve ostale veze u konformaciji su nedovoljno stabilne i relativno se lako raskidaju nepovoljnim faktorima okoline. Zbog toga, enzimi imaju optimalnu kataliti ku efikasnost u uslovima optimalne temperature, pH vrednosti, koncentracije jona, posebno te kih metala.

IN ENJERSKI ASPEKTI BIOPROCESA

Bioproces predstavlja proces u kome se organska sirovina (supstrat) prevodi u proizvod delovanjem ivih elija mikroorganizama ili vi ih organizama ili enzima.Enzimski bioprocesi se mogu prikazati pomo u jedna ine:E A R

(1) a bioproces pomo u ivih elija sa:A C R+C

(2) gde je A supstrat (organska supstanca), R proizvod, E enzim i C iva elija. Osnovna razlika izme u ova dva bioprocesa je u tome to enzim deluje na supstrat tokom nastajanja proizvoda i ne pove ava mu se koli ina, dok se u drugom slu aju ive elije

2 2

Page

22

reprodukuju i pove ava im se koncentracija tokom izvo enja bioprocesa. Izu avanje kinetike bioprocesa je zna ajno da bi se razumelo na koji na in se on odvija. Kad se govori uop teno o kinetici bioprocesa, onda se razlikuje: makrokinetika (na nivou elija, tj. bioreaktora) i mikrokinetika (na nivou molekula, tj. procesa koji se odvijaju unutar elija). Makrokinetika se mo e odnositi na nestacionarne procese, ije se promenljive menjaju sa vremenom, i stacionarne procese, ije se promenljive ne menjaju sa vremenom, tj. kontinualne procese. Diskontinualni ( ar ni) procesi su, po svojoj prirodi, nestacionarni, dok kontinualni procesi mogu biti stacionarni. U diskontinualnim procesima koriste se diskontinualni ( ar ni) bioreaktori, a u kontinualnim proto ni bioreaktori. U kinte kim analizama se, naj e e, koriste modeli idealnih bioreaktora. Idealni diskontinualni ( ar ni) bioreaktor se odlikuje idealnim me anjem reakcione sme e, to ima za posledicu homogen sastav i uniformnu temperaturu reakcione sme e. U ovaj bioreaktor ne dovode se reaktanti, niti se odvodi reakciona sme a. Osnovni tipovi idealnih proto nih reaktora su bioreaktor sa potpunim me anjem i cevni bio-

reaktor. Model prvog bioreaktora zasniva se na pretpostavci o proticanju sa perfektnim me anjem, koja podrazumeva: idealno me anje reakcione sme e, nepromenljivu zapreminu reakcione sme e (tj. jednakost brzine priticanja i isticanja reakcione sme e), homogen sastav i uniformnu temperaturu reakcione sme e i identi nost sastava reakcione sme e u bioreaktoru i reakcione sme e koja isti e iz njega. Model drugog bioreaktora odlikuje se klipnim proticanjem, koje zna i da ne postoji promena aksijalne brzine po popre nom preseku (tj. ne postoji povratno me anje).

Kinetika bioprocesa se naj e e prou ava u diskontinualnim bioreaktorima, ali zbog toga nije mogu e pratiti promene u elijama, tj. na molekulskom nivou (mikrokinetika). Kineti ki parametri, koji se odre uju na ovaj na in, imaju svoju vrednost za projektovanje industrijskih bioreaktora, koji rade diskontinualno, pa ak i kontinualno.

KINETIKA MIKROBIOLO KIH PROCESA U bioprocesima, gde su biokatalizatori ive elije mikroorganizama, odigravaju se istovremeno i me usobno povezano rast, razmno avanje, tro enje supstrata i sinteza primarnih i sekundarnih metabolita. Kinetika ovih procesa prou ava brzine rasta elija mikroorganizama, tro enja limitiraju eg supstrata iz hranljive podloge i sinteze metabolita, kao i uticaj faktora okoline na

2 3

Page

23

njih. Jasno je da se mikrobiolo ki procesi sastoje, u principu, od dva me usobno veoma zavisna sistema, i to ive elije mikroorganizama i okolne sredine, gde se odvijaju svi navedeni procesi. Mikrobiolo ki proces po inje inokulacijom hranljive podloge koja se nalazi u bioreaktoru. Nakon adaptacije inicijalne koli ine iste kulture mikroorganizama (inokuluma), dolazi do rasta i razmno avanja elija i konverzije supstrata iz hranljive podloge u: biomasu, zbog ega se koli ina mikroorganizama pove ava i eljeni proizvod, tj. primarni ili sekundarni metabolit. U oba slu aja, brzina nastajanja biomase i proizvoda je funkcija koncentracije i biohemijske aktivnosti elija mikroorganizama. Kinetika rasta mikroorganizama u diskontinualnim bioreaktorima

Mikroorganizmi rastu i razmno avaju se u veoma irokom spektru fiziolo kih stanja elije i faktora okoline. Npr, ako se u hranljivu podlogu doda mala koli ina ivih elija mikroba, onda u odgovaraju im uslovima okoline elije po inju da rastu, tj. pove avaju se svi sastojci ive elije. Direktna posledica rasta elije je njihovo razmno avanje. Kad se prati promena koncentracije mikroorganizama ili broja elija sa vremenom u diskontinualnom bioreaktoru, onda se dobija kriva rasta, iji je tipi an izgled prikazan na slici 12. Analizom krive rasta, zapa aju se etiri faze, i to: lag ili faza adaptacije, eksponencijalna faza, stacionarna faza i faza odumiranja.

Slika 12 Diskontinualni rast mikroorganizama

2 4

Page

24

Na krivoj se razlikuju etiri postupne karakteristi ne faze sa me ufazama: lag faza, faza ubrzanog razmno avanja, eksponencijalna faza, faza usporenog razmno avanja, stacionarna faza I faza odumiranja. Lag faza tj. faza mirovanja ili po etna faza- mikroorganizmio kada se na u u novoj, sve oj hranljivoj podlozi, po inju se prilago avati izmenjenim fizi ko- hemijskim uslovima, U ovoj fazi nema razmno avanja ve samo uve anje elija. U eliji se odigravaju slo eni procesi Vremensko trajanje lag faze je razli ito, to zavisi od vrste, soja, starosti culture, njenom fiziolo kom stanju, po etnom broju elija, kao I od fizi ko- hemijskih uslova sredine (pH. Temperature, sastav podloge) Faza ubrzanog razmno avanja- ova faza je prelazna, unjoj mikrobi po inju da se razmno avaju I to postupno pove aavaju i brzinu razmno avanja. Eksponencijalna faza- u ovoj fazi sve se elije nalaze u aktivnom stanju razmno avanja. Brzina rasta mikroorganizama ( rC ) u ovoj fazi je najve a i defini e se pomo u jedna ine:

Populacija raste konstantnom brzinom. Vreme deljenja jedne elije do druge, uvek je isto. Od jedne elije nastaju dve, od dve nastaju etiri, od etiri osam, od osam esnaest. Posle odre enog vremena dolazi do nakuplanja ogromnog broja populacije mikroorganizama. U eksponencijalnoj fazi sve elije mikroorganizama su ive. Veoma su osetljive na dejstvo spolja njih inilaca I najlak e ih je uni titi. Osim toga aktivnost elije je pove ana I sinteti e se itav niz va nih sastojaka eliije. Faza usporenog razmno avanja- U ovpj fazi pove anje broja ivih elija populacije se postupno smanjuje. Stacionarna faza- populacija po broju mikroorganizama dosti e svoj maksimum. Broj novonastalih elija I broj koji odumiru je isti. Isti broj elija nastaje I isti broj nestaje. Zbog toga je koncetracija ivih elija konstantna. Mikroorganizmi su ovde manje osetljivi na dejstvo spolja njih faktor Sa aspekta prakti ne primene, ova faza u razvoju populacije mo e biti veoma zna ajna jer ba u njoj dolazi do maksimalnog stvaranja odre enih proizvoda (antibiotika, acetone, etanola, butanola, odre enih vitamina). Faza odumiranja mikroorganizama- posle stacionarne faze ivotna sposobnost mikroba opada, jer je do lo do pogor anja uslova sredine koja je pretrpela znatne fizi ko- hemijske izmene. BRoj koji odumire prevazilazi broj ivoh elija. Brzina pdumiranja tako e zavisi od delovanja spolja njih inilaca I svojstava samih mikroorganizama. Tokom vremena cela populacija odumire, to mo e trajati nekoliko dana (bakterije mle ne kiseline), nedelja ili godina kpd veoma otpornih predstavnika (sporogene bakterije)

2 5

Page

25

Dobijanje enzima Enzimi su prirodni proizvodi i dobijaju se iz razlicitih vrsta bioloskih organizama (od virusa i bakterija do biljaka, zivotinja i coveka). Od enzima koji su nasli primenu u razlicitim oblastima, samo oko 4% se dobijaju iz razlicitih biljnih, a samo oko 8% iz razlicitih zivotinjskih vrsta. Vecina drugih enzima se dobija iz mikroorganizama i to preko jedne polovine iz gljivica i kvasaca, a preko jedne trecine iz bakterija.razlozi za ovo su pre svega je sto se za razliku od zivotinja i biljaka, u celijama mikroorganizama kolicina stvorenog enzima moze lako povecati selekcijom, izborom hranljive podloge i genetskim manipulacijama. Prinos enzima kod mikroorganizama se moze povecati: izborom soja, koriscenjem mutiranih mikroorganizama, sastavom hranljive podloge, temperature, pH, aeracije. Industrijski enzimi dobivaju se iz: 1. Biljaka ( amilaze slada, papain, bromelin, ficin i dr.) 2. ivotinja (enzimi pankreasa, katalaza, renin i dr) 3. Mikroorganizama (amilaze, proteaze, pektinaze, invertaze i td) Danas se jo uvijek dobiva znatan broj enzima iz biljaka i ivotinja. Me utim, iz tehni kih i ekonomskih i javno zdravstvenih razloga mo e se o ekivati dalje pove anje proizvodnje enzima mikrobnog podrijetla. Naime, za dobivanje enzima iz biljaka potrebne su velike povr ine i dosta radne snage. Osim toga broj enzima iz biljaka je ograni en. Enzimi iz ivotinja dobivaju se iz ljezda, koje slu e i za druge svrhe (na pr. iz pankreasa se dobiva insulin), i njihova je koli ina ograni ena. Aktualni problem mogu nosti prijenosa uzro nika gove e spongiformne encefalopatije (GSE), dodatni je razlog za trajni prestanak kori tenja enzima dobivenih iz gove ih organa. Optimizovanje procesa kultivacije Podrazumeva izbor sastava hranljive podloge(vrste I koncentracije izbora ugljenika, azota,fosfora, faktora rasta I dr.) I fizickih parametara koji obezbedjuje maksimalni prinos enzima. Tehnologija rekombinantne DNK omogucava: Industrijsku proizvodnju enzima I drugih proteina koji se inace stvaraju u organizmu coveka I drugih zivih bica u veoma malim kolicinama.

Proizvodnja enzima Dobijanje enzima vrsi se iz mikroorganizama. Prvo se vrsi gajenje (kultivacija) mikroorganizama (najcesce 1-2 dana kod bakterija). Ekstracelularni enzimi se (u sirovom, ne preciscenom obliku) dobijaju prostim uklanjanjem celija centrifugiranjem, dok je kod intracelularnih neophodno razvijanje celije I ekstrakcija enzima. Posle ovoga obicno je potrebno izvrsiti I preciscavanje enzima. 2 6

Page

26

Molekuli enzima su mnogo slozeni da se sintetisu iz cistih hemijskih srestava pa je mnogo lakes koriscenje zivih organizama. Problem je sto se enzimi proizvode iz mikroorganizama koji se veoma tesko gaje u industrijskim uslovima jer mogu stvoriti nezeljen nus-proizvod. Savremeno industrijsko dobijanje(gajenje) enzima pocinje fermentacijom bocica suve ili smrznutih mikroorganizama, koja se zove proizvodnja soja. Ova proizvodnja soja je izabrana za proizvodnju velikih kolicina enzima. Proizvodnja soja se prvo uzgaja u malim pljoskama koja sadrzi hranljive materije. Pljkoska je smestena u incubator koji obezbedjuje optimalnu temperaturu za prethodno smrznute susene celije za klijanje. Kada je pljoska spremna, celija se prenosi u fermentor. Fermentor prethodno sadrzi medijum. Fermentor omogucava da se seme celije reprodukuje(razmnozava) uz koriscenje hrenljivog medijuma koja se u njemu nalazi. Zatim se celija prenosi na veci tenk, glavni fermentor gde je temperature, pH I rastvoreni kiseonik pazljivo kontrolise da bi optimizovao proizvodnju enzima. Dodatne hranljive materije mogu biti dodate kako bi se poboljisala produktivnost. Kada se glavna fermentacija zavrsi,dobija se smesa celija, hranljiva materije I enzima (supa) koja se zatim vodi dalje na filtraciju I preciscavanje.

Pre i avanje enzima Enzimi se u industriji sli no kao u laboratoriji pre i avaju hromatografskim metodama. Za pre i avanje enzima koriste se uglavnom tri tipa hromatografskog pre i avanja: jonoizmenjiva ka hromatografija gel-permeabilna hromatografija afinitetna hromatografija Priprema enzima za prodaju Nakon pre i avanja enzima i koncentrovanja esto se dobija vi a aktivnost enzima od one koja je potrebna u industriji. Osnovni problem je odr ati aktivnost enzima du e vreme. Da bi se to postiglo neophodno je stabilizovati enzim. Industrijski enzimi sadr e relativno malu koli inu aktivnog enzima (manje od 10 %). Ostatak ine neaktivni proteini, stabilizatori, soli i drugo. U cilju stabilizacije enzima primenjuju se tri pristupa: dodavanje aditiva kovalentna modifikacija proteina i imobilizacija enzima Enzimi su znatno stabilniji u suvom stanju nego u rastvoru. Stoga se mnogo e e enzimi isporu uju u suvom obliku. Za prevo enje enzima u suvi oblik primenjuju se dva postupka: y liofilizacija i

2 7

Page

27

y sprej su enje Drugi postupak se zbog ekonomi nosti u industriji mnogo e e koristi. U rastvor enzima se dodaju skrob, laktoza, karboksi metilceluloza i polielektroliti koji pove avaju stabilnost enzima prilikom su enja.

TEHNIKA REKOMBINATNE DNK

Tehnika rekombinatne DNK ili danas poznatije pod nazivom geneti ko in enjerstvo je revolucionarno dostignuce u podru ju prirodnih nauka koje je izazvalo revoluciju u biologiji i to naro ito se odnosi na onaj dio u kome se prou ava nasledjivanje gena i funkcionisanje ivih organizama. Rekombinacija DNK pripada molekularnoj genetici. Zbog toga sto se geneti ko in enjerstvo svakodnevno primjenjuje u razli itim prirodnim naukam kao sto su: biologija, agronomija, medicina, biotehnoligija i mnoge druge... ova tehnika je postala svakodnevnica. Geneti ko in enjerstvo je tehnika pri kojoj se dobijaju novi hribridni molekula van elije i njihovo spajanje sa posrednikom koji se naziva vektor. Nau na dostignu a su postigla da se dva molekula DNK iz razli itih organizama pomije aju u epruvti i unesu u organizam doma ina, gdje bi ta novonastala molekula DNK ispoljila svoje svojstvo. Ovim postupkom se omogu ava uno enje novih hribridnih molekula u organizam doma ina koje prirodnim putem ne postoje ali se mogu razmno avati. Ova tehnika uno enje hribridnih molekula DNK u organizam doma ina se naziva jo i kloniranje. Escherichia coli (skra eno E. coli), koju je otkrio pedijatar i bakteriolog Theodor Escherich, je jedna od glavnih vrsta bakterija koje ive u donjem dijelu probavnog trakta sisavaca. Nu ne su za pravilnu probavu hrane te sudjeluju u radu crijevne flore. Njezina je prisutnost u podzemnim vodama obi no indikator fekalne zaraze. Svrstava se u skupinu Enterobacteriaceae te se esto koristi kao modelni organizam za bakterije uop te.

2 8

Page

28

Ova bakterija igra va nu ulogu u biolo kom in enjerstvu. Za stru njake postaje ,,tvornica za proizvodnju velikih koli ina DNK. Jedna od prvih va nijih primjena tehnologije rekombinantne DNK je bila upravo geneti ka manipulacija E. coli za proizvodnju inzulina kod pacijenata oboljelih od dijabetesa.

Proces dobijanja rekombinantne DNK

Da bi napravili kulturu rekombinatne molekule DNK mora se po tovati pravilo: da jedna od molekula DNK mora da bude plazmidskog ili virusnoh porijekla i ona mora da posjeduje gene koji joj omogu avaju da se automno replicira u celijama. Ovu DNK nazivamo vektorom i ona nam slu i za repliciranje druge DNK. Tu drugu DNK nazivamo stranom jer upravo nju pruo avamo i koju elimo razmno avati ona po pravili nije srodna sa vektorskom DNK niti je srodna sa elijom u koju e u i nakon spajanja sa vektorom Za reakciju spajanja vektorske DNK i strane DNK uzima se postupak rekombinacija in vitro a prozvod postupka naziva se rekombinatnom DNK. Za autonomnu replikaciju strane DNK koriste se bakterijske elije. Uno enje replicirane DNK u bakteriju naziva se transformacijom ili transfekcijom, zavisno od toga da li je vektor plazmidskog ili virusnog porijekla. U tehnologiji rekombinantne DNK postoji 5.faza rada: 1. stvaranje fragmenata DNK, sa ciljem da se u nekom od njih nadje odredjeni gen ili deo molekula DNK 2. ugradjivanje fragmenata DNK u pogodan vektor, to je u stvari rekombinantni deo procesa, 2 9

Page

29

3. uvodjenje vektora u pogodnog doma ina (naj e e E. coli), 4. kultivisanje kompleksa doma in-vektor na hranljivim podlogama radi dobijanja klonova doma ina, tj. dobijanja brojnih kopija fragmenta DNK ugradjenog u vektor 5. ubiranje klonova koji sadr e odredjeni fragment DNK Do fragmeta se mo e do i i seckanjem ali je ovo nasumi no pa su dobijeni fragmenti nedefinisani. Restrikcione endonukleaze prepoznaju specifi ne, naj e e palindromske, sekvence od 4-8 nukleotida i seku DNK na ta no odredjenom mestu u okviru tih nizova. Mesta preseka se zovu restrikciona mesta. Zahvaljuju i komplementarnom karakteru baznog sparivanja u molekulu DNK, restrikcione endonukleaze dovode uvek do prekida oba lanca DNK. Svaka restrikciona endonukleaza ozna ava se prema mikroorganizmu iz koga poti e. Kada se molekul DNK ise e pomo u odredjene restrikcione endonukelaze dobijeni fragmenti imaju jednolan ane krajeve, koji su ,,lepljivi. Na DNK vektora se takodje deluje istim restrikcionim enzimom, a zatim se pomo u enzima ligaze spajaju komplementarni krajevi fragmenta i DNK vektora. Tako dobijeni molekul DNK se naziva rekombinovani ili hibridni molekul. U pomenute svrhe koriste se razli iti tipovi vektora, koji svi imaju sposobnos replikacije (razmno avanja) u bakterijskoj eliji. Klasi ni vektori su plazmidi (kru ni, dvolan ani molekuli DNK koji se nalaze van glavnog hromozoma bakterije i stabilno se nasledjuju), bakteriofagi (virusi koji obavljaju ivotni ciklus u bakteriji) i kozmidi (plazmidna DNK sme tena u omota faga). Izbor vektora zavisi od vrste upotrebljenog restrikcionog enzima. Vektori se unose u eliju doma ina, a to je naj e e E. coli, na vi e na ina: tarnsformacijom, transfekcijom, mikroinjiciranjem.Kompleks doma in-vektor se umno ava kultivacijom in vitro, u cilju dobijanja klonova koji sadr e odredjene fragmente ispitivane DNK. Za odabiranje klonova sa rekombinovanim fragmentom DNK se koristi itav niz postupaka. To mo e da bude selekcija na osnovu promenjenih svojstava rekombinovane bakterije, ili hibridizacija otisaka bakterijskih kolonija sa obele enim DNK probama. Kloniranjem razli itih fragmenata DNK omogu eno je dobijanje genskih, hromozomskih i genomskih biblioteka.

Biotehnolo ki process gajenja kulture

Kulture Escherichia coli koje se ubacuju u bioreactor sadr e veliku gustinu elija. Kultivacija je uradjena na dijalizi bioreaktora koji se sastoji iz dve komore. Unutra nja komora je odvojena od spolja nje membranom. Escherichia coli se nalazi na bazi glicerola I drugih komponenata, koje se razmenjuju pomo u membrane u komore. Inhibitoran material se nalazi id unutra nje do spolja nje membrane sa materijalom koji je naknadno uklonjen sa otpadnih voda iz spolja nje membrane. U po etku, matemati ki modeli su kori eni za opisivanje procesa, optimalnog gajenje kao to su parametari, po etni koncentracija glicerola u dva dijela, eljeni prolaz kroz membranu

3 0

Page

30

koncentracije glicerola u hrani / dialising medij, i vreme da se po ne srednji kurs, odre eni su iz prethodnog eksperimente i prora une. Stvarni rezultati gajenje odgovorali su veoma dobro sa modelom predvi anja. Veoma visoka koncentracije elije 174 g suve mase / 1 je dobijena. Ova elija je koncentracija u rasponu od maksimalne teorijske koncentracije E. coli u kulturi supa (160-200 g / l).Temperatura je bila postavljena na 25 C ili 37 C kao to je prikazano u svakom eksperimentu. Protok vazduha je regulisano izme u 1 i 6 L min-1. Pored istog kiseonika u vazduhu ulaznih tok je(do 100 %).Rast kulture usledio je merenje svetla apsorbancije na 600 nm , merenjem elije mokre te ine, kao i odre ivanje elije suve te ine. Zato 1 ml suspenzije elija je centrifugirano u suvog i pre izmjerenih 1 ml epruvete u 13000 g za 5 min. Nakon uklanjanja pluta, uzorci su mereni za mobilne vla ne mase, a zatim su i na 80 C najmanje 24 h. Adsorbancijom od 600 nm od 1 rezultat u eliji mokre te ine dobijeno 1,7 g i 0.39 g suve mase. Pobolj an dotok kiseonika trebalo bi da na taj na in dovede do ve e gustine elija. Kori enjem 10 L CultiBag RCG koji je opremljen opti kim senzorima za pH iparcijalnog pritiska kiseonika, bio je ispunjen sa 4 L kultivacije medijuma. Po etne koncentracije glukoze od samo 10 g L-1 obezbe ena je brzina prenosa kiseonik koja je bila dovoljna da u potpunosti podr ava aerobni rast tokom po etne faze procesa. Nakon 13,5 sati, kada je po etni nivo glukoze bio iscrpljen, kontinuirano hranjenje sa visokom koncentracijom glukoze po ela sa konstantnom brzinom . Ishrana se pove ala eksponencijalno tokom vremena, koja garantuje odre enu stopu rasta od 0,13 h-1. Shodno tome i parcijalni pritisak kiseonika smanjen je eksponencijalno. Kada je stigao parcijalni pritisak kiseonika ta ku od 50%, kontroler parcijalni pritisak kiseonika je po eo da se odr ava na ovom nivou. Prvo, vazduh protoka je pove an na maksimalno 6 L min-1, i drugo, sadr aj kiseonika je bio postepen pove an od istog kiseonika do maksimalno 100% od ukupne stope protoka gasa. Sa ovom procedurom, kultura je porasla na opti ku gustinu OD600 = 58 na 37 C uz veoma mali obim pove ala se samo oko 150 ml Analiza medijuma Za merenje sadr aja polisaharida je izvedena sa hidrolizom kiselina. Stoga 100 l uzorka su pome an sa 100 l od 2 N HCl i zagreva do 100 C za 2 sata. Neutralizacija je u injeno sa 100 l 2 N NaOH i 100 l 0,5 m Sorensen bafer. Nakon neutralizacije, glukoza koncentracije enzimaticalli meri u polisaharid uzorke.Acetat, laktata i etanol su analizirani pomo u HPLC 1200 hromatografija sistema (Agilent Technologies Inc, Santa Clara, CA) opremljen indeks prelamanja detektor (RID). Kao kolone, HiperRez KSP-ugljikohidrata H + (300 7,7 mm, 8 m, Fisher Scientific Inc) je primenjen. 5 mm surna kiselina je kori en kao t bafer. Vrhovi su integrisani u softverski paket Chemstation Verzija Rev B.04.01 (Agilent). Pre analize, kultura uzoraka E. coli je centrifugiran za 5 min na 13000 g i 4 C i posle filtracije

3 1

Page

31

Primena tehnike rekombinantne DNK u proizvodnji insulina

Uprkos nekim toksi nosti na E.coli,iz kojih smo dobili elije koje sadr e do 18 % enzima ukupnog proteina,sirovi ekstrakt ovih kultura je specifi na aktivnost pribli no 220 puta ve a od ekstakta inficiranih E.coli.

3 2

Page

32

InsulinInsulin je hormon koji lu i lijezda gu tera a (pankreas), a slu i za regulaciju e era u krvi. On pokre e elije da iz krvi uzimaju potrebni e er (glukozu) ili jetru da ga podhranjuje. Pove anje koncentracije glukoze u krvi iznad normalnih vrijednosti predstavlja signal za lu enje isulina. Insulin omogu ava i ubrzava uno enje glukoze iz krvi u mi i ei masno tkivo,gdje biva razgradjeno. U jetri postoje elijske membrane koje su propustljive za glukozu pa zbog toga insulin indikuje sintezu enzima. Ti enzimi katalizuju degradaciju glukoze i njenu polimerzaciju u glukogen. Insulin inhibira i enzime koji katalizuju razlaganje glikogena na glukozu. Nedostatak insulina u organizmu izaziva e ernu bolest (Diabetes melitus). Spada u polipeptide i sadr i 51 aminokiselinu, ima oblik dva lanca medjusobno povezana disufildnim vezama. Prvi postupci izdvajanja insulina bila su ekstrakcijom iz govedje ili svinjske gu tera e. Taj insulin se dosta primjenjivao jer se nije puno razlikovao od ljudskog insulina, ali po to insulin nije bio ist, ve je ima i primjese pankreasa mogao je da dovede do alergijskih reakcija.Zbog toga se istra ivalo da se dobije to istiji insulin koji se ne razlikuje od ljudskog.

Proizvodnja rekombinantnog humanog inzulina (rhi)

Tri nau na otkri a su veoma bitna za primjenu insulina: biosinteza humanog insulina, upotreba penskih brizgalica i otkri e insulinskih analoga. Proizvodnja rekombinatnog humanog insulin po inje od 1980 godina. . Danas se dobija isti insulin tehnologijom rekombinantne DNK tj. proizvodnja uz pomo genetski modificirane bakterije Escherichije coli. Kultura ove bakterije se lako gaji. Bakterija se brzo razmno ava, na svakih 20 minuta dolazi do deobe bakterijske elije. Escherichije coli je poznata kao pontecijalni pathogen koja ima mogu nost zadr avanja proteiskog proizvoda u eliji. S obzirom na brzinu, intenzitet i trajanje djelovanja dijelimo ih na 4 grupe: y Insulini brzog djelovanja - sadr e samo insulin ili lispro-insulin y Insulini srednjedugog djelovanja - sadr e protein protamin i insulin (NHP-insulin) y Insulini srednjedugog djelovanja s brzim nastankom u inka - sadr e kombinacije istog insulin i NHP-insulina y Insulini dugog djelovanja - sadr avaju tzv. "ultralente insulin" ili insulin-glargin . Raznim kombinacijama insulina, cinka, protamina i pufera danas se mogu na initi rastvori insulina s ta no odre enim brzinama djelovanja, intenzitetima i trajanjem djelovanja. Lisproinsulin je ve ta ki insulin sa izmjenjenim redosljedima aminokiselina koji neobi no brzo djeluje. Insulin-glargin, novi oblik insulina koji se nedavno pojavio, jest pegilirani insulin, a zapravo predstavlja insulin-depo.

3 3

Page

33

y Modifikacije inzulina y - utjecaj na brzinu disocijacije agegata terapijskog inzulina u monomere nakon subkutanog injektiranja y - bazalana konc. inzulina u krvnoj plazmi (zdrave osobe): ~1 x 10-9 mol/L y -mijenja se ovisno o vremenu unosa hrane u organizam y Analozi inzulina y - modifikacije terapijskog r.h. Inzulina _ trajanje djelovanja y Regularni terapijski inzulin _ mje avina monomera, dimera i agregata

BIOREAKTORI ZA BILJNE

ELIJE

Komercijalno zanimljivi biljni produkti naj e e se odnose na sekundarne metabolite koji se mogu podeliti u tri grupe: o o o esencijalna ulja glikozidi alkaloidi

Esencijalna ulja - smesa terpena koji se koriste kao spojevi arome i mirisa. Glikozidi - fenolni spojevi, flavanoidi, saponini, tanini, cijanogeni glikozidi itd, a koriste se kao boje u tekstilnoj i prehrambenoj industriji i kao lekovi. Alkaloidi - preko 4 000 razli itih struktura spojeva koji su fiziolo ki aktivni u ljudskom organizmu (npr. kokain, nikotin, morfin) Biljne elije se mogu koristiti i u proizvodnji va nih terapeutskih proteina kao to su o o B) o o o monoklonska antitela proteini koji deluju kao imunogeni (jestive vakcine za koleru, malariju, hepatitis humani serum albumin interferon humani hemoglobin

3 4

Page

34

OSNOVNE KARAKTERISTIKE KULTURE BILJNIH ELIJA U PROIZVODNJI

BIOTEHNOLO KOJ

Pod pojmom kulture biljnih elija u biotehnolo koj proizvodnji podrazumijevaju se: izolovane elije ili male grupe elija u te noj podlozi (suspenzija elija) izolovani biljni organi (kultura organa) izolovani embrioni (kultura embriona)

U proizvodnji metabolita, biljnim elijama glavni problemi su: niska produktivnost elija spori rast geneti ka nestabilnost elijskih linija slaba kontrola diferencijacije elija pote ko e u uspostavljanju fotoautotrofnih uslova rasta

PORE ENJE SUSPENZIJE BILJNIH ELIJA I KULTURE MIKROBNIH ELIJA

Karakteristike Veli ina elija Svojstva elija Brzina rasta Vreme udvostru enja

Kultura mikrobnih elija mala (promer 1-10 m) pojedina ne elije i grupe velika Sati

Suspenzija biljnih elija velika (promer 40-200 m) naj e e grupe (agregati) Mala Dani umerena do visoka Page

Osetljivost na smicanje niska

3 5

35

Stabilnost Nakupljanje produkta

stabilna esto ekstracelularno

nestabilna naja e e intracelularano

PROCES Podloga Gustina inokuluma Temperatura Aeracija Penjenje Vreme uzgoja

Kultura mikrobnih elija naj e e jednostavna

Suspenzija biljnih elija naj e e slo ena visoka (5-10 %) U zavisnosti od niska ponekad sedmice

niska 26-36 C visoka esto izra eno dani

3 6

Page

36

Osnovni tehnolo ki uslovi neophodni za uzgoj biljnih elija u bioreaktoru:

1) homogenost i me anje podloge kako bi se ostvario efikasan prenos hranjivih materija bez talo enja i aglomeracije elija 2) optimalna aeracija s odgovaraju im hidrodinami kim uslovima 3)dugoro no sterilni uslovi zbog sporog rasta biljnih elija 4)uvo enje izvora svetlosti kod heterotrofnih, fotomiksotrofnih i fotoautotrofnih kultura elija radipobolj anja efikasnosti biosinteze Kako bi se ostvarili optimalni uslovi proizvodnje, upotreba biljnih elija u biotehnolo koj proizvodnji iziskuje mutidisciplinarna istra ivanja iz podru ja:

y y y y y

fiziologije biljaka molekularne biologije farmakologije toksikologije hemije i hemijskog in enjerstva

Uz tehnolo ke uslove, preduslovi koji se moraju zadovoljiti da bi se neka kultura biljnih elija upotrebljavala u proizvodnji su: 1) 2) visok prinos eljenog metabolita geneti ka stabilnost elijske linije

Pre odabira tipa bioreaktora potrebno je napraviti: o o metabolita o studije vijabilnosti elija studije dinamike rasta elija s pra enjem biosinteze i izolovanja eljenog studije toka, me anja i prenosa mase

U bioreaktorima se ostvaruju kontrolisani uslovi koji omogu avaju optimalni uzgoj biljnih elija i proizvodnju eljenog metabolita. Prednost uptrebe bioreaktora za uzgoj biljnih elija je mogu nost bolje kontrole preno enja u industrijsko merilo zbog strogo kontrolisanih uslova.

3 7

Page

37

BIOREAKTORI KOJI SE NAJ E KULTURAMA BILJNIH ELIJA

E KORISTE U PROIZVODNJI SA

Tip kulture elija

Vrsta bioreaktora

Proizvod

reaktori s ajmalicin, antrakinon, berberin, biomasa, me alicom ru marinska kiselina, ikonin, vinkristin reaktor s rotiraju im bubnjem air-lift reaktori reaktori s te niim slojem antocijani, biomasa, ikonin ajmalicin, berberin, biomasa, jatrorizin, saponini, vinkristin, F-karoten betalaini, biomasa

Suspenzija elija

Tip kulture stanica Kultura embriona

Vrsta bioreaktora reaktori s me alicom barbotiraju e kolone

Proizvod aliin, kumarini, diferencirana biomasa aliin, kumarini diferencirana biomasa kumarini

Kultura posude s izdanka i embriona aeracijom air-lift reaktori

3 8

Page

38

-Bioreaktori za suspenzije biljnih elija-

Glavni problemi prenosa proizvodnje sa suspenzijom biljnih elija u industrijsko merilo su: promene koje nastaju u dinamici rasta biljnih elija i proizvodnji biomase ograni en prenos mase kiseonika i hranjivih sastojaka nehomogenost sastava dovodi do talo enja i smrti elije osetljivost elija na hidrodinami ke uslove me anje radnog medijuma to uzrokuje smrt elije u industrijskoj proizvodnji najvi e se koriste bioreaktori s me alicom promena u projektovanju klasi nih bioreaktora s me alicom naj e e se odnose na dizajn me ala i raspr iva a vazduha, kako bi se hidrodinami ki uslovi prilagodili biljnim elijama, ali i osigurao dovoljan prenos kiseonika i homogenost radnog medija.

TRENDOVI U PROJEKTOVANJU BIOREAKTORA ZA BILJNE ELIJE

Ekonomska isplativnost odlu uju i je kriterijum za komercijalnu proizvodnju biljnih sekundarnih metabolita u bioreaktorima Kako bi se smanjili investicioni tro kovi uvode se bioreaktori nove generacije pri ijem se dizajnu koriste materijali za jednokratnu upotrebu to znatno smanjuje cenu bioreaktora. Koriste se bioreaktori ija je unutra njost oblo ena sterilnom plastikom (smanjuje se tro ak sterilizacije) wave reaktori

3 9

Page

39

imerzijski reaktor RITA

Osim smanjenja investicionih tro kova razvoj biotehnolo ke proizvodnje zavisi e i od napretku metoda geneti kog in enjerstva

IMOBILISANE BILJNE ELIJE I NJIHOVI PROIZVODI

Imobilizacija je generi ki naziv za metodu ograni avanja slobodnog kretanja bilo kojeg biokatalizatora, a karakterisana je vezanjem biokatalizatora u odre enom ograni enom prostoru da bi se mogao kontinuirano upotrebljavati. Imobilizacija elija na ili u polimerni matriks naj e e uti e na diferencijaciju elija to esto rezultira pove anjem produktivnosti proizvodnje u odnosu na suspenziju elija. Metode imobilizacije: elija vezana (uhva ena) u nosa u: vezana u matrici mikrokapsulirana Stanica vezana na nosa u: o adsorbirana o kovalentno

Biljne elije u suspenzijskoj kulturi relativno su velike (do 100 mm u promjeru) i rastu u skupinama (agregatima); stoga je najpogodnija metoda imobilizacije biljnih elija uklapanje (entrapment) u matricu (polimerni gel). Polimeri koji se naj e e koriste za uklapanje biljnih elija su: 1. 2. 3. 4. 5. 6. Alginat alginat agar i agaroza karagenan poliakrilamid poliuretan membrane

4 0

Page

40

elije ostaju potpuno vijabilne naj e e se koristi kalcijumov alginat kopolimer D-manouronata i L-glukouronata vezanih 1,4-glikozidnom vezom

vodeni rastvor polisaharida formira stabilan gel u prisustvu vi evalentnih kationa (Ca2+, Ba2+ ili Al3+) estice okruglog oblika alginata koje sadr e uklopljene elije dobijaju se kapanjem suspenzije stanice/alginat u medijum sa kalcijum-hloridom koncentracija alginata je 2-5 % koncentracija elija unutar gela je 5-20 % mogu a povratna reakcija otapanjem gela dodatkom keliraju eg agensa (EDTA ili citrat) koji ve e kalcijum i uklopljene elije se osloba aju problemi mehani kog integriteta-nestabilnost matrice zbog kontinuiranog rasta elija Agar ili agaroza kopolimer 1,3-vezane D-galaktopiranoze i 1,4-vezane 3,6-L-galaktopiranoze stvaranje gela hla enjem zagrejanog vodenog rastvora geliraju a temperatura se mo e menjati hemijskom modifikacijom strukture (uvo enjem hidroksietilne skupine) za ve inu biljnih elija pogodna geliraju a temperatura od 30 C koncentracija otopine agaroze je 2-5 % kona na koncentracija biljnih elija je 5-20 % estice gela mogu se dobiti u razli itim oblicima: kao blok koji se mo e razbiti u estice odre ene veli ine ili kao sferi ne estice koje se dobiju disperzijom suspenzije elije/polimer u netoksi noj hidrofobnoj fazi uz me anje Karagenan sadr i ponavljaju e disaharidne jedinice D-galaktoza-4 sulfata i 3,4-anhidro-D-galaktoze jako geliraju i anjonski hidrokoloid sli an alginatu osim to se rastvor polimera mora zagrevati da bi se odr ao u teku em stanju koncentracija karagenana je 2-5 % kuglice se stvaraju kapanjem suspenzije elije/karagenan u medijum sa kalijumovim jonima

4 1

Page

41

Poliakrilamid izvedena prva imobilizacija u njemu toksi an za biljne elije biljne elije se suspenduju u vodenom rastvoru prepolimerizovnog linearnog poliakrilamida delimi no supstituisanog sa acilhidrazidnom funkcionalnom grupom suspenzija je umre ena dodatkom odre ene koli ine dialdehida glioksala dobijeni gel se mehani ki dezintegrir e u manje estice Poliuretan poliuretanske estice sadr e pore u koje se ve u biljne elije koje se mogu koristiti do 21 dan elije se uklapaju umre avanjem prepolimera uretana Membrane upotrebljavaju se razni membranski sastavi naj e e reaktori sa upljim vlaknima

Prednosti imobilizacije biljnih elija ve a koncetracija elija, to pobolj ava kontakt me u elijama i pove ava volumetrijsku produktivnost vi estruka ili ponovljiva upotreba imobilisanih elija u velikim koncentracijama pove ava produktivnost podloga za gajenje se mo e lako promeniti u skladu s potrebama proizvodnjE manja osetljivost na hidrodinami ke uslove kontinuirana mogu nost uklanjanja produkata i/ili toksi nih metabolita ime se pospe uje elijski metabolizam bolja kontrola diferencijacije elija i proizvodnja sekundarnih metabolita olak ana separacija eljenog metabolita upotrebom naprednih separacijskih metoda (npr. u matriks se ugradi magnet te se magnetskom separacijom metaboliti izdvajaju iz podloge)

4 2

Page

42

Karakteristike imobiliziranih elija

pre ivljavanje (vijabilnost) vijabilne elije rastu i dele se nepo eljno kod imobilisanih elija rast elija mo e dovesti do njihovog osloba anja ili destrukcije estica priprema medijuma koji odr avaju elije u vijabilnom stanju kroz du i period, ali da se ne dele pra enje vijabilnosti direktno i indirektno plazmoliza i tehnike bojenja za odre ivanje integriteta plazmatske membrane (npr. bojanje s fluorescein-diacetatom) merenje respiracije pra enje stani nog rasta i deljenja (prati se broj elija ili njihova gustina unutar imobilisanih estica odnosno mitoti ki indeks koji daje broj elija u mitozi) Osloba anje produkta sekundarni produkti esto uskladi teni unutar elija odnosno vakuola imobilizacija ponekad dovodi do osloba anja produkta (spontano osloba anje) -osloba anje indolnih alkaloida u podlogu iz uklopljenih elija Catharanthus roseus da bi se oslobodili produkti iz vakuola imobilisanih elija trebaju pre i dve membrane (plazmatsku membranu i tonoplast) koji okru uje vakuolu 5%-tni dimetilsulfoksid (DMSO) kroz 30 minuta mo e u initi permeabilnima plazmatsku membranu i tonoplast elije ostaju vijabilne (kemijsko osloba anje) sa DMSO se mo e osloboditi oko 90 % intracelularno uskladi tenih produkata metoda je primenljiva samo za rastvorne produkt Reaktori za imobilizirane elije:

4 3

Page

43

jednostavne aparature za ar ni uzgoj (Erlenmeyerove tikvice na tresilici) reaktori s nasutim slojem barbotiraju i reaktori reaktori s lebde im slojem membranski reaktori

KVASCI

Kvasci pripadaju carstvu Fungi, zajedno sa plesima i mesnatim gljivama. Fungi su eukarioti. S obzirom da nemaju hlorofil, nemaju mogu nost obavljanja fotosinteze, pa do hrane dolaze adsorpcijom iz okoline. elije kvasca su okruglog ili jajolikog oblika, veli ine 5-8 m. Razmno avaju se naj e e nepolnim na inom, tj. pupanjem. Na roditeljskoj stanici raste pup, jezgro se deli i jedno odlazi u pup, koji se otkida kada dostigne veli inu osnovne elije. Kvasci zasigurno po brojnosti ine ekonomski najzna ajniju skupinu mikroorganizama. Saccharomyces cerevisiae je najpoznatija vrsta iz roda Saccharomyces, tako da se esto pojam kvasac i Saccharomyces cerevisiae upotrebljavaju kao sinonimi. Ina e kvasci iz roda Saccharomyces su specifi ni po tome to se ubrajaju me u malobrojne kvasce koji mogu rasti i u anaerobnim uslovima. Drugi fermentativni kvasci kao to su oni iz rodova Candida i Kluyveromyces trebaju odre enu koli inu kiseonika za rast. Takvi kvasci zahtevaju strogu kontrolu dobave kiseonika tokom procesa, te stoga imaju manju produktivnost pri proizvodnji etanola. Nadalje kvasci iz roda Saccharomyces manje su osetljivi na visoke koncentracije etanola, pa se upravo zbog toga koriste za proizvodnju etanola. U mnogim industrijskim procesima kvasci se koriste vi e nego bakterije za proizvodnju mnogih heterolognih proteina, zbog injenice da pripadaju u eukariotske organizme. To im omogu uje pravilno provo enje post-translacijskih promena, to ima za posledicu dobijanje proteina eljene biolo ke aktivnosti. Dalje, zna ajna prednost kvasaca u pore enju s bakterijama je ta to u hranjivu podlogu mogu izlu iti u potpunosti pravilno nabrane heterologne proteine. Obzirom da kvasci izlu uju samo ograni en broj proteina, strani proteini mogu biti proizvedeni u relativno istom obliku to ujedno procese izolacije ini manje kompleksnim. Pekarski kvasac U elementarnom sastavu pekarskog kvasca prevladavaju ugljenik (48 %), kiseonik (31 %), azot (8%) i vodonik (7 %). Biomasa se tako e sastoji od kalijuma, fosfora, magnezijuma, kalcijuma, sumpora i ostalih elemenata u tragovima. Populacije kvasca, uz to to imaju veliku ulogu u proizvodnji hleba, piva, vina i alkohola, ali se sve vi e upotrebljavaju i za biotransformacije, u proizvodnji proteina uz modificiranje populacija geneti kim in enjeringom. Iako se kvasac upotrebljava za proizvodnju alkoholnih pi a jo od davnih vremena, biohemijski putevi pri proizvodnji etanola i sama uloga kiseonika u njima jo uvek nije sasvim obja njena.

4 4

Page

44

Kiseonik je sigurno potreban za biosintezu sterola i zasi enih masnih kiselina i vrlo verovatno nikotinske kiseline, pa se mora dodavati u hranjivu podlogu. Kod procesa proizvodnje pekarskog kvasca mora se te iti maksimalom iskori tenja kva eve biomase, dok se kod procesa proizvodnje alkoholnih pi a zahteva minimaliziranje broja elija kvasca, a sam proces je usmeren na pove anje akumulacije metabolita, posebno etanola. Za proizvodnju kvasca u velikim koli inama,