Univerzitet u Sarajevu

Farmaceutski fakultet

Biomarkeri oksidativnog stresa u urinu kod pacijenata sa hepatitisom B i C

-seminarski rad-

Mentor: Studenti:

Sarajevo, 21.12.15

Sadržaj1.0. Uvod................................................................................................................................................3

1.1. Slobodni radikali..........................................................................................................................4

1.2. Hepatits B i C................................................................................................................................5

1.3. Virusne infekcije i oksidativni stres..............................................................................................5

2.0. Metode za procjenu oksidativnog stresa.........................................................................................6

2.1. Indirektne markeri, mjerenje antioksidanasa..............................................................................7

3.0. Hepatitis C virusna infekcija i oksidativni stres................................................................................8

3.1. Biomarkeri...................................................................................................................................9

3.2. Uticaj hepatitisa na enzime..........................................................................................................9

3.3. Upotreba biomarkera................................................................................................................10

3.4. Biohemijske analize- biomarkeri................................................................................................10

3.5. 80HdG u urinu i krvi...................................................................................................................11

4.0. Zaključak........................................................................................................................................12

5.0. Literatura.......................................................................................................................................12

~ 2 ~

Sažetak

Oksidativni stres dovodi do stvaranja slobodnih radikala koji štetno djeluju na ćelijsku

membranu prvenstveno. Organizam se suprotstavlja sa različitim enzimskim sistemina i

antioksidansima. Mjerenje ovih komponenti u urinu nam omogućava da pratimo stanje

oksidativnog stresa u organizmu, a kako je pokazano da se oksidativni stres nalazi u podlozi

mnogih virusnih infekcija ovo nam je odličan alat za praćenje i prognozu bolesti. Ciljevi

seminara: objasniti mehanizme oksidativnog stresa te ukazati na patogenezu virunsih infekcija

sistemom oksidativnog stresa te ukazati na mogućnosti koje nam daje mjerenje biomarkera

oksidativnog stresa u urinu.

Ključne riječi: oksidativni stres, biomarkeri, hepatitis, lipidna peroksidacija, MDA, SOD-1

~ 3 ~

1.0. Uvod

Davne 1954. objavljen je prvi rad koji je doveo u vezu toksično dejstvo kiseonika kao posljedicu

djelovanja slobodnih kiseoničkih radikala. Nakon dvije godine slobodni radikali se ocjenjuju kao

glavni krivci za proces starenja čime počinju opsežna istraživanja ovih supstanci. Nastanak i

stvaranje slobodnih radikala u organizmu predstavlja fiziološki proces. Tokom normalne

metaboličke aktivnosti ćelije dolazi do stvaranja slobodnih kiseoničkih(ROS- reactive oxygen

species) ali i azotnih radikala(RNS- reactive nitrate species). Ove supstance imaju kako

negativne tako i pozitivne efekte na ljudski organizam. U nižim koncentracijama imaju ulogu u

ćelijskom komuniciranju kao i u zaštiti ćelije od drugih štetnih efekata. Međutim kada

proizvodnja slobodnih radikala premaši granični nivo dolazi do narušavanja redoks potencijala

ćelije i samim tim do ispoljavanja negativnih efekata u vidu oštećenja ćelijsklih lipida, proteina i

nukleinskih kiselina. (1)

1.1. Slobodni radikaliSlobodni kiseonički radikali su molekuli ili dijelovi molekula koji imaju jedan ili više slobodnih

elektrona u svojim orbitama što ih čini izuzetno reaktivnim. Nama najznačajniji su ROS,

slobodni kiseonički radikali. Primarni kiseonički radikal je superoksidni anion(O2-) koji daljim

reakcijama dovodi do stvaranja drugih slobodnih radikala. Najveći dio superoksidnog aniona

nastaje u respiratornom lancu na nivou mitohondrija i smatra se da negdje oko 3% kiseonika

iscuri u mitohondrijama u vidu superoksidnog aniona. Djelovanjem enzimskog sistema

superoksid dismutaze dolazi do redukcije superoksida u vodonikov-peroksid. Prisustvo veće

koncentracije ovih supstanci dovodi do reakcija u kojima nastaje i hidroksilni(OH) radikal

reakcijom sa vodonikovim peroksidom ili oksidacijom željeza pa je tako u situacijama kada

imamo povećanu koncentraciju željeza(kao što je slučaj sa hepatitisom) povećano i stvaranje

slobodnih radikala. Supeoksidni jon u reakciji sa polinezasićenim masnim kiselinama fosfolipida

dovodi do stvaranja hidroperoksil radikala čime se započinje proces lipidne peroksidacije. Ovaj

proces završava stvaranjem malonildialdehida(MDA) koji je metagen ali ima i baktericidno

dejstvo. Ireverzibilno oštećenje DNK slobodnim radikalima predstavlja prvi korak u procesima

kao što su kancerogeneza, mutageneza i starenje. (1)

~ 4 ~

Slobodni radikali se neutrališu dejstvom antioksidanasa koju mogu djelovati enzimski i

neenzimski. Unosom antioksidanasa smanjujemo dejstvo štetnih proizvoda oksidativnog stresa

ali i pretjerana konzumacija ovakvih supstanci djeluje toksično na organizam. (2)

Shema 1. Dejstvo slobodnih kiseoničkih radikala(3)

1.2. Hepatits B i CHepatitis virus je RNK virus iz porodice Flaviviridae. Pet vrsta virusa mogu dovesti do hepatitisa

ali samo hepatitis B i C virusi dovode do hronične bolesti. Smatra se da godišnje hepatitis B i C

virusi odnesu oko milion života što ukazuje na značaj razumijevanja i istraživanja ovih virusa i

njihovih posljedica. Hepatitis B se prenosi krvlju i drugim tjelesnim tekućinama dok se C prenosi

skoro isključivo krvlju. Hepatitis B virus dovodi do ozbiljnijih posljedica i smatra se da je

četvrtina svjetske populacije bila u kontaktu sa virusom ili je zaražena. Zbog toga se preporučuje

vakcinacija populacije na HBV. Hronični hepatitisi predstavljaju dugotrajne infekcije jetre koje

vremenom oštećuju jetru dovodeći do ciroze, karcinoma itd. (4)

~ 5 ~

1.3. Virusne infekcije i oksidativni stresIstraživanja koja su povezala oksidativni stres sa virusnim infekcijama započinju ispitivanjem

patogenze HIV infekcije gdje je primjećena smanjena koncentracija glutationau ćelijama

inficiranim HIVom. Patogenetski mehanizam dejstva je ustaljen i isti za sve viruse. U suštini

virusi dovode do poremećaja redoks homeostaze u ćeliji ali i do pojačanog stvaranja reaktivnih

kiseoničkih radikala u inficiranim fagocitima. Mitohondrije i endoplazmatski retikulum su

mjesta gdje se pojačano proizvode ROS, uz propratno trošenje antioksidativnih kapaciteta.

Slobodni kiseonički radikali započinju proces lišidne peroksidacije i oštećenja nukleinskih

kiselina, prvenstveno DNK. Poremećaj redoks homeostaze će eventualno dovesti do indukcije

ćelijske smrti odnosno apoptoze. (1)

Shema 2. Oksidacija nukleinskih kiselina (3)

2.0. Metode za procjenu oksidativnog stresa

~ 6 ~

Oksidativni stres se može ispitati na tri načina. Mjerenjem slobodnih radikala, oštećenja na

proteinima, lipidima i nukleinskim kiselinama, te mjerenje aktivnosti enzimskih antioksidanasa.

Nastanak slobodnih kiseoničkih radikala može biti određeno direktno spektrometrijski. Međutim

materije koje se koriste tokom ovog ispitivanja su toksične za ljude pa se metod izbjegava. Za

mjerenje oštećenja ćelija mjeri se peroksidacija lipida u ćelijskoj membrani. Lipidnom

peroksidacijom dolazi do razgradnje lipida na veliki broj primarnih oksidativnih produkata kao

što su konjugovani dieni (lipid hidroperoksidaze), i sekundarnih oksidativnih produkata

uključujući tu malondialdehid (MDA), F2- izoprostan ili izdahnuti pentan, heksan ili etan. Često

se primjenjuje mjerenje konjugovanih diena, kao primarnih produkata lipidne peroksidacije.

Iako se često koristi u istraživanjima MDA je sekundarni produkt. Često se koristi u mjerenjima

i koncentracija tiobarbituratskih reaktivnih vrsta. Modifikacije na proteinima se ogledaju u tome

da slobodne kiseoničke grupe dovode do stvaranja karbonilnih grupa na mjestima gdje se inače

nalaze amino grupe. Pa upravo mjerenje karbonila može biti pokazatelj oksidativnog stresa.

Pogotovo se koristi karbonil/protein odnos. Na ovaj način se mogu dobiti podaci i o

kumulativnom dejstvu slobodnih radikala. Alternativna metoda koji se koristi je kvantifikovanje

oksidovane aminokiseline (npr. o-o-ditirozin). Prednost ove metode je u tome što je to

neinvazivni metod (uzorak urina), ali je interpretacija rezultata ograničena. Promjene na DNK

molekulima su različite i kreću se od cijepanja lanaca, oštećenja proteinskih veza pa sve do

bazičnih modifikacija. Najčešće korišteni marker u praksi je nuklotid 8-hidroksi-2-

deoksiguanozin (8-OHdG) koji nastaje oksidacijom guanine za koju su zaslužni upravo slobodni

kiseonički radikali. (2)

2.1. Indirektne markeri, mjerenje antioksidanasaLipidna peroksidacija dovodi do oštećenja na nivou ćelijske membrane između ostalog i mišića

pa se smatralo da bi mioglobin i kreatin kinaza mogli biti biomarkeri oksidativnog stresa. Iako

teoretski tačno praktično nisu imali konkretne rezultate jer su ove supstance jako nespecifične,

odnosno povišene su usljed najrazličitijih stanja. Enzimska antioksidantna aktivnost (SOD, CAT,

GPX) često biva ispitivana tokom najrazličitijih istraživanja. Na ovaj način se može procijeniti

kvalitet antioksidantne odbrane organizma u mirovanju, al ii nakon napora. Kvantifikovanje

antioksidantnih vitamina (A, C i E) u plazmi je uobičajen metod za procjenu antioksidantne

odbrane i utvrđivanja nedostatka pomenutih vitamina. Isto kao antioksidantni enzimi i

koncentracija antioksidantnih vitamina se mijenja usljed oksidativnog stresa i može se koristiti

~ 7 ~

kao indirektni marker oksidativnog stresa. Drugi antioksidanti koji se mogu koristiti u tehnikama

određivanja oksidativnog stresa su: tiol-proteini (GSH kao najvažniji tiol-protein u GSH),

mokraćna kiselina (nedovoljna pouzdanost), alantoin (kao oksidovani proizvod mokraćne

kiseline). Mjerenje ukupnog anioksidatnog kapaciteta (TAC- total antioxidant capacity) koji

govori o veličini odgovora svih antioksidanata. (5)

Shema 3. Interakcije i oštećenje DNK(6)

3.0. Hepatitis C virusna infekcija i oksidativni stres

Oksidativni stres se smatra jednim od osnovnih mehanizama oštećenja jetre bilo koje etiologije.

Sama patofiziologija hepatitisa je dosta nerazjašnjena i komplikovana ali se sigurno zna da

oskidativni stres, odnosno slobodni kiseonički radikali doprinose održavanju infekcije, fibrozi

tkiva te kancerogenezi. Istraživanja su pokazala da je kod djece ne samo sa hepatitisom B nego i

sa C virusnom infekcijom primijećena smanjena aktivnost katalaze kao i superoksid dismutaze

uz povećanje oksidativnog stresa što govori u prilog insuficijenciji antioksidativnih mehanizama.

Ono što je karakteristično jeste to da je oksidativni stres izraženiji kod infekcija sa C serotipom

virusa hepatitisa iako je hepatitis B vitus ozloglašeniji. Smatra se da je ovo posljedica

opterećenosti željezom koja prati infekcije ja HCV. Oboljeli od hepatitisa C imaju povećan nivo

biomarkera lipidne peroksidacije u serumu, perifernim makrofagima kao i biopsijskom

materijalu jetre. Čak i kod asimptomatskih stanja možemo naći da fluktuacija ALT(alanin

aminotransferaze) korelira sa negativnim dešavanjima na nivou redoks homeostaze. Jedno

~ 8 ~

istraživanje je pokazalo da je čak 61% oboljelih od hepatitisa C imalo povišene markere

oksidativnog stresa. Smatra se da je upravo akumulacija željeza u hepatocitima zaslužna za

nagomilavanje hidroksi radikala koji dalje stimuliše lipidnu peroksidaciju i nastanak novih

kiseoničkih radikala. Svemu se pridodaju i Kupferove ćelije, makrofazi hepatalnog sistema, koji

luče hemijske citokine kojima kostimulišu dalje stvaranje oksidativnih radikala. Stanja koje se

dovode u vezu sa ovakvim patogenetskim mehanizmom jesu fibroza jetre, B-ćelijski limfom, te

hepatocelularni karcinom. Jedno od stanja koje povezano takođe jeste steatoza jetre, odnosno

masna jetra, gdje stepen promijene direktno korelira sa stepenom oksidativnog stresa. Slobodni

kiseonički radikali mogu djelovati i mutageno na DNK i upravo je to mehanizam kojim može

doći do inicijacije tumora a uz odgovarajuće djestvo promotorskih elemenata doći će do

akumulacije tih mutacije, proliferacije ćelija i potpunog razvitka hepatocelularnog karcinoma. (1)

3.1. Biomarkeri Novija istraživanja upućuju na to da bi se biomarkeri oksidativnog stresa kao i markeri upale

mogli koristiti za procjenu stanja pacijenta sa hepatitisom i predviđanje toka bolesti. Naime

istraživanja su pokazala do usljed infekcije dolazi do nakupljanja upalnih parametara kao i

kiseoničkih radikala koji oštećuju DNK i doprinose kancerogenezi te da je kod pacijenata sa

višim intrahepatalnim oksidativnim stresom bila povećana incidenca rekurence hepatitisa C. Ovo

ukazuje da bi se biomarkeri mogli korisititi kao prognostički mehanizam za procjenu

rekurentnosti hepatitisa C konkretno. U istraživanju su praćeni 8-0HdG DNK adukti, 4-HNE

proteinski adukti te ekspresija APE(apurinic endonukeaza). (7)

Jedno istraživanje je ispitivalo povezanost klastogenih faktora kao biomarkera oksidativnog

stresa kod hroničnog hepatitisa C. Klastogene materije su supstance koje dovode do

hromozomskih aberacija. Klastogene materije se posmatraju obično kod osoba koje su bile

izložene radijaciji ili koje imaju neke hronične upalne bolesti. Međutim kako i ove supstance

ispoljavaju svoje dejstvo preko slobodnih radikala njihovo mjerenje dobija značaj i kod

hroničnog hepatitisa C. Test na klastogene efekte je senzitivni esej koji korelira sa oksidativnim

stresom i nekrotičnim promjenama. (8)

3.2. Uticaj hepatitisa na enzimeIstraživanja su ukazala na povišene nivoe nekeih odbrambenih enzima kao što su hem

oksigenza(HO-1) i tioredoxin(trx) kod pacijenata sa hroničnim hepatitisom C. Ovaj virus takođe

~ 9 ~

predstavlja opasnost za antioksidasne sisteme u organizmu kao što su HO-1 te NADH

dehidrogenaza quinon1 što doprinosi daljem oštećenju parenhima. Sa druge strane uočen je pad

drugih odbrambenih enzima manganaza ili superoksid dismutaza, glutataion reduktaza, glutation

peroksidaza. (6)

3.3. Upotreba biomarkeraUpravo ovakvi enzimski sistemi se najčešće koriste kao biomarkeri u urinu prilikom ispitivanja

oksidativnog stresa, u ovom slučaju kod pacijenata sa hepatitis B ili C infekcijom. Obično se u

ispitivanju odrede i serumski alanin aminotransferaza(ALT) kao i apspartat

aminotransferaza(AST). Od biomarkera u urinu određuju se nivo malondialdehida(MDA), nivo

superoksid dismutaze(SOD-1) te katalaze čije su funkcije već objašnjene. Dakle kao odbrambeni

mehanizam organizma na djelovanje oksidativnog stresa doći će do pojačane proizvodnje

protektivnih enzima kao što su katalaza, SOD-1. Superoksid dismutaza je ubikvitarni citosolni

čistač slobodnih radikala olakšavajući dismutaciju ovih supstanci do molekularnog kisika i

hidrogen peroksida, koji se dalje metaboliziraju do bezazlenih molekula vode i kisika

djelovanjem glutation peroksidaze te katalaze. Katalaza je enzim koji se nalazi na

peroksizomima i ima ulogu u snižavanju rizika od nastanka hidroksilne radikalne formacije

putem Fentonove reakcije. Brojne studije su ispitivale nivoe ovih markera u serumu ali

ispitivanja biomarkera oksidativnog stresa kod pacijenata sa hepatitisom je novina. (9)

3.4. Biohemijske analize- biomarkeriSOD-1 aktivnost se mjeri po Fridovichu. Ova metoda podrazumijeva upotrebu ksantina kao i

ksantin oksidaze koji generišu superoksidne radikale koji onda reaguju sa p-iodonitrotetrazolium

violetom čime se dobija crveni formazan koji se spektroskopski može odrediti, talasna dužina mu

je 505nm. Izražava se jedinicama po miligramu kreatinina. Aktivnost katalaze se mjeri tako što

se prati smanjenje koncentracije hidrogen peroksida na 230nm metodom po Beutleru. Kao

marker lipidne peroksidacije mjerimo i MDA u urinu reakcijom po Okhawi. U reakciji se koristi

0,1 ml uzorka, 0,2 ml 8.1% natrijum dodecil sulfata, 1.5ml 20% acetatne kiseline i 1.5ml 0,8%

vodenog rastvora tiobarbituratne kiseline. Izražava se u nmol po miligramu kreatinina. U

idealnim uslovima istraživači bi mjerili markere lipidne peroksidacije i antioksidanse u jetrenom

tkivu a ne u krvi i urinu da bi dobili pravu sliku uticaja oksidativnog stresa na jetrena oštećenja

kod hepatitisa B i C. Iglena biopsija jetre nosi veliki rizik od različitih komorbiditeta čak i od

~ 10 ~

mortaliteta stoga su nam krv i urin metoda izbora. Mogućnost ponavljanih analiza kao

omogućava praćenje ovakvih pacijenata kroz duži vremenski period što je dodatna prednost

analize urina. Opet, ove rezultate treba tumačiti pažljivo jer oni nisu apsolutno reprezentativni.

Jedan od najsigurnijih biomarkera lipidne peroksidacije i oksidativnog stresa u urinu jeste MDA

i pokazano je da je kod pacijenata sa hepatitisom B kao i kod pacijenata sa hepatitisom C bio

povišen, zajedno sa povišenjem serumskog ALT-a. Ovo omogućava praćenje virusne progresije

kod pacijenata. Nivoi antioksidativnih enzima kao što su SOD-1 i CAT pokazuju značajnu

povezanost sa ćelijskim odgovorom na virusnu etiologiju i oksidativni stres. Istraživanja su

pokazala da nivoi ovih enzima budu smanjeni kod djece sa hepatitisom B ali i kod djece sa

hepatitisom C, gdje treba posebno obratiti pažnju na metabolizam željeza i slobodne radikale.

Osim sa virusnim hepatitisom smanjenje ovih biomarkera je uočeno i kod drugih jetrenih

oboljenja gdje stradaju hepatociti. Masna promjena jetre je samo jedno od takvih stanja. Osim

hroničnog hepaitisa i akutni dovodi do pada koncentracije ovih enzima. Osim pada

antioksidativne odbrane, smanjenje ovih enzima može ukazati i na smanjenu sintetsku

sposobnost jetre. (9)

3.5. 80HdG u urinu i krviNajčešće mjerena je 8OHdG, koristeći esej HPLC povezana sa elektrohemijskom detekcijom,

nakon enzimatske hidrolize izolirane DNK. Dostupnost ovog osjetljivog eseja je bila bitan razlog

da se 80HdG usvoji u mnogim laboratorijama kao biomarker oksidativnog oštećenja DNA.

Drugi faktori koji opravdavaju mjerenje 80HdG su njeno stvaranje u DNK kod nekoliko

reaktivnih grupa, kao što su atom kisika i hidroksilna grupa, njena utvrđena mutagenost kroz

pretvaranje GC i multipli mehanizmi koji su se razvili da odstrane 80HdG iz DNK ili da

preveniraju njeno inkorporiranje u u ćelijsku DNK što dokazuje da ćelija percipira 80HdG kao

prijeteće oštećenje koje koje se mora brzo odstraniti. Nivoi 80HdG nisu kvantitativni marker

oštećenja DNK svim reaktivnim grupama, jer je 80 HdG manji produkt djelovanja reaktivnog

azotnih (peroksinitrit, nitritna kiselina)ili hlornih grupa na DNK (hipohlorna kiselina).

Djelovanje reaktivne kisične grupe na ostatke guanina u DNK ne stvara samo 80HdG, već i

druge produkte kao Fapy-guanin. Odnos 8OHdG prema Fapy-guaninu je pod uticajem redoks

stanja ćelije (smanjen je pri niskim koncentracijama kisika) i prisustva jona prelaznih metala.

Prema tome, moguće je da su nivoi 80HdG u DNK više rezultat promjena u redoks stanju i

dostupnosti jona prelaznih metala nego djelovanja oksidativnog stresa na DNK. Drugim

~ 11 ~

riječima, identična količina djelovanja slobodnih radikala može dati različite nivoe 80 HdG,

ovisno o okruženje DNK. Druga mana analiziranja 80HdG je u odnosu sa problemima opisanim

ranije, 80HdG se lako formira umjetno, oksidacijom guanina tokom izolacije, hidrlize i analize

DNK. Osim toga, 8OHdG se monogo bolje oksidira od guanina, što omogućava njenu senzitivnu

elektrohemijsku detekciju na niskim voltažama,ali kao rezultat i 8OHdG može biti lako uništena

u DNK reaktivnim grupama kao peoksinitrit, nitritna kiselina i hipohlorna kiselina. Nekoliko

drugih produkata oksidacije DNK je veoma podložno umjetnom stvaranju. Ako su nivoi 8OHdG

u ćelijskoj DNK niski, to može biti zbog toga što su ovi drugi produkti oštećenja DNK u većoj

količini i više doprinose ukupnom efektu oksidativnog oštećenja DNK. Drugim riječima,

8OHdG možda igra manju ulogu u ukupnom mutagenom potencijalu oksidiranih DNK baza i u

tom slučaju više pažnje treba posvetiti biološkim posljedicama drugih oksidiranih baza, od kojih

se za neke već zna da su mutageni. (10)

4.0. Zaključak

Značaj razjašnjenja djelovanja oksidativnog stresa kod pacijenata sa virusnim infekcijama jeste u

cilju poboljšanja terapije i eventualnog zaustavljanja progresije bolesti. Biomarkeri koji se

koriste predstavljaju vrlo dostupnu i efektivnu metodu u praćenju stepena oksidativnog stresa što

nam može pokazati aktivnost bolesti. Idealni bi bili uzorci jetre ali je to neizvodivo za pacijente

pa se stoga ispituju različiti enzimski sistemi u urinu kao i antioksidansi. Porast jednih, odnosno

pad drugih ukazuje na rast slobodnih kiseoničkih radikala u organizmu a njihove posljedice su

nam dobro poznate i istražene. Još samo da ih okrenemo u svoju korist.

5.0. Literatura

~ 12 ~

1- Brkic S et al. Virusne infekcije i oksidativni stres(2010.); [online] preuzeto sa

http://www.doiserbia.nb.rs/img/doi/0042-8450/2010/0042-84501012015B.pdf dana

21.12.2015.

2- Stankovic M, Radovanovic D, Oksidativni stres i fizicka aktivnost(2012.) [online]

preuzeto sa http://www.sportlogia.com/no5/srp1.pdf dana 21.12.2015.

3- DocsSlide, Oksidacijski stres(2012.); [online] preuzeto sa

http://documents.tips/documents/oksidacijski-stres.html dana 21.12.2015.

4- Hepatos, Hepatitis B i C-osnovne činjenice(2014.); [online] preuzeto sa

http://www.hepatos.hr/o-hepatitisu/hepatitis-b-i-c-osnovne-injenice.html dana

21.12.2015.

5- Belupo, Oksidacijski stres(2015.); [online] preuzeto sa

http://www.belupo.com/Default.aspx?sid=4763 dana 21.12.2015.

6- Paracha UZ et al. Oxidative stress and hepatitis C virus(2015.); [online] preuzeto sa

http://virologyj.biomedcentral.com/articles/10.1186/1743-422X-10-251 dana

21.12.2015

7- Maki A et al. Predictive power of biomarkers of oxidative stress and inflammation in

patients with hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma.(2007.); [online]

preuzeto sa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17195915 dana 21.12.2015.

8- Emerit I et al. Clastogenic factors as biomarkers of oxidative stress in chronic hepatitis C.

(2000.); .); [online] preuzeto sa http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11025369 dana

21.12.2015.

9- Kokoglu OF et al., Oxidative Stress Biomarkers in Urine of Patients with Hepatitis B and

C(2012.); [online] preuzeto sa

http://www.balkanmedicaljournal.org/sayilar/75/buyuk/7.pdf dana 21.12.2015.

10- Halliwell B, Why and how should we measure oxidative DNA damage in

nutritional studies? How far have we come?(2000.); [online] preuzeto sa

http://ajcn.nutrition.org/content/72/5/1082.full dana 21.12.2015.

~ 13 ~