33

BAB IIIMETODELOGI PENELITIAN

1. 2. 3. 3.1. Pendekatan PenelitianPenelitian yang berjudul Formulasi Pasta Gigi Pencegah Karies Gigi Berbahan Aktif Minyak Atsiri dari Daun Kemangi (Ocimum basilicum L) ini merupakan penelitian yang dilakukan secara eksperimental dengan menggunakan instumen laboratorium dan menghasilkan data dan nilai numerik yang menggambarkan bobot variabel yang diteliti. Instrumen laboratorium yang digunakan adalah micrometer scrub, viskometer rion, dan pH meter. Validasi data penelitian menggunakan instrumen laboratorium berupa kalibrasi dengan menggunakan standar.

3.2. Bahan yang ditelitia. Gambaran umumBahan yang diteliti berupa minyak atsiri dari tanaman kemangi (Ocimum basilicum L.). Minyak atsiri dari tanaman kemangi didapat dari proses destilasi. Determinasi tanaman dilakukan di Fakultas Kehutanan Universitas Mulawarman dengan mencari beberapa sumber informasi dari penelitian-penelitian yang terkait dengan daun kemangi untuk dicocokan dengan tanaman yang digunakan. Tujuan dari determinasi ini adalah untuk memastikan tanaman yang digunakan dalam penelitian merupakan tanaman yang dimaksud yaitu tanaman Ocinum basilicum L. b. Lokasi pengambilan bahan Bahan yang diteliti adalah tanaman kemangi (Ocimum basilicum L.) yang tumbuh di daerah Desa Bangun reja, Kecamatan Tenggarong Sebrang, Provinsi Kalimantan Timur. Bagian yang akan diteliti adalah daun.3.3. Variabel Penelitian 3.3.1. Proses penentuan variabel Variabel dalam penelitian ini meliputi konsentrasi efektif minyak atsiri, variasi konsentrasi basis dan konsentrasi minyak atsiri sebagai variabel bebas. Aktivitas antibakteri sediaan pasta gigi yang berupa zona hambat terhadap bakteri uji, stabilitas fisik berupa organoleptik, homogenitas, daya sebar, viskositas, dan pH merupakan variabel terikat.

1. 2. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.3.1. 3.3.2. Definisi Operasional Variabel dan Parameter PenelitianSecara operasional beberapa istilah yang terkait dengan variabel penelitian ini adalah :a. Aktivitas antibakteri formulasi pasta gigi minyak atsiri daun kemangi adalah kemampuan sediaan pasta gigi dari minyak atsiri daun kemangi dalam menghambat bakteri Streptococcus mutans penyebab karies gigi. b. Variasi konsetrasi minyak atsiri daun kemangi adalah variasi konsentrasi minyak atsiri yang digunakan dalam formulasi.c. Stabilitas fisik adalah suatu kemampuan sediaan pasta gigi untuk dapat mempertahankan keutuhan fisik yang meliputi organoleptik, homogenitas, viskositas, konsistensi, dan pH sediaan gel selama 6 minggu.d. Homogenitas adalah susunan yang homogen dan tidak terlihat adanya butir-butir kasar dari sediaan pasta gigi.e. Daya sebar adalah kemampuan basis dan zat aktif menyebar memberikan efek terapi.

3.4. Pengumpulan Data3.4.1. Jenis dan Sumber DataData penelitian diperoleh dari data formulasi variasi konsentrasi basis, data formulasi dengan variasi konsentrasi minyak atsiri, dan data uji daya hambat sediaan pasta gigi minyak atsiri daun kemangi terhadap Streptococcus mutans. Data formulasi variasi konsentrasi basis dan data formulasi dengan variasi konsetrasi minyak atsiri diperoleh dari hasil eksperimen laboratorium yang berupa data parameter stabilitas sediaan pasta gigi sebelum dan sesudah penyimpanan, seperti hasil uji organoleptis, uji stabilitas, daya sebar, viskositas, pH, dan homogenitas. Data uji daya hambat didapat dari hasil eksperimen laboratorium yang berupa penentuan diameter hambat yang dilakukan dengan metode difusi agar.

1. 2. 3. 3.1. 3.2. 3.3. 3.4. 3.4.1. 3.4.2. Teknik Pengumpulan Dataa. Pengujian AntibakteriPengujian aktivitas antibakteri terhadap minyak atsiri daun kemangi dan sediaan pasta gigi minyak atsiri daun kemangi (Ocimum basilicum L) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans dapat dilihat dalam Tabel 3.1. dan 3.2 berikut:Tabel 3.1. Perlakuan Variasi Konsentrasi Minyak Atsiri Daun KemangiK1MAK1K1FMAK2K1MAK3

K2MAK1K2MAK2K2MAK3

K3MAK1K3MAK2K3MAK3

Keterangan :K1-3MAK1-5 : Perlakuan variasi konsentrasi 1-3 minyak atsiri replikasi 1-3.

Tabel 3.2. Perlakuan Variasi Konsentrasi pasta gigi minyak atsiri daun kemangiKtFMAKU1R1KtFMAKU2R1KtFMAKU3R1

KtFMAKU1R2KtFMAKU2R2KtFMAKU3R2

KtFMAKU1R3KtFMAKU2R3KtFMAKU3R3

Keterangan :KtMAKU1-3R1-3 : Perlakuan variasi konsentrasi terbaik formula pasta gigi uji 1-3 replikasi 1-3.

b. Stabilitas Fisik Basis Pasta GigiTabel 3.3. Uji OrganoleptikFormulaPemerianMinggu ke-

123456

F1Warna

Bau

Konsistensi

F2Warna

Bau

Konsistensi

F3Warna

Bau

Konsistensi

Keterangan:(+) = Tidak ada perubahan(-) = Ada perubahan

Tabel 3.4. Uji HomogenitasFormula Replikasi

123

Minggu ke-Minggu ke-Minggu ke-

123456123456123456

F1

F2

F3

Keterangan:(+) = Homogen(-) = Tidak homogenTabel 3.5. Uji Daya SebarFormula Replikasi

123

Minggu ke-Minggu ke-Minggu ke-

123456123456123456

F1

F2

F3

Keterangan:(+) = Menyebar (-) = Tidak menyebar

Tabel 3.6. Uji pHFormula Replikasi

123

Minggu ke-Minggu ke-Minggu ke-

123456123456123456

F1

F2

F3

Keterangan : (+) = Tidak ada perubahan(-) = Ada perubahan

c. Aktivitas AntibakteriData aktivitas antibakteri diperoleh dengan cara mengamati ada atau tidaknya zona hambat disekitar paper disc terhadap bakteri uji yaitu Streptococcus mutans dan yang dibandingkan dengan kontrol negatif.Tabel 3.7. Diameter Zona minyak atsiri daun kemangiKonsentrasi Replikasi (%)Rata-rata Diameter Zona Hambat (mm)

Kontrol negatifK1

K2

K3

Konsentrasi AA1

A2

A3

Konsentrasi BB1

B2

B3

Konsentrasi CC1

C2

C3

Keterangan : K1-3: Kontrol replikasi 1-3 A-C1-3 : Uji Konsentrasi minyak atsiri A-C replikasi 1-3

Tabel 3.9. Diameter Zona Hambat pasta gigi minyak atsiri daun kemangiFormulaReplikasi (%)Rata-rata Diameter Zona Hambat (mm)

Kontrol negatifK1

K2

K3

Formula AA1

A2

A3

Formula BB1

B2

B3

Formula CC1

C2

C3

Keterangan : K1-3: Kontrol replikasi 1-3 A-C1-3 : Uji Konsentrasi formola pasta gigi A-C replikasi 1-3

3.5. Teknik Analisis DataUntuk melihat konsentrasi efektif sediaan pasta gigi minyak atsiri sebagai antibakteri terhadap bakteri uji dapat diketahui dari data diameter zona hambat pertumbuhan bakteri uji dengan menggunakan uji anava satu arah. Anava dapat dilihat pada Tabel 3.10. berikut :Tabel 3.9. Rumus-rumus Anava Satu ArahSumber variansiDbJKKTFhitungFtabel

5%1%

Perlakuank-1

Sisa / Galat(n-1)-(k-1)JKsisa = JKT JKP

Totaln-1JKT = Xt2 FK

Keterangan:FK= Faktor KoreksiJKT= Jumlah Kuadrat TotalJKP= Jumlah Kuadrat PerlakuanDb= Derajat BebasKT= Kuadrat TengahJKsisa= Jumlah Kuadrat Sisa

Hipotesisnya adalah:H0 diterima jika FH Ftabel :Tidak ada perbedaan daya hambat pada semua perlakuanH0 ditolak jika FH Ftabel: Ada perbedaan daya hambat pada semua perlakuanMetode uji lanjutan yang akan digunakan terlebih dahulu dilakukan perhitungan nilai Koefisien Keragaman (KK):a. Jika hasil KK besar, (minimal 10% untuk perlakuan homogen) dan (minimal 20% untuk heterogen) digunakan Uji Duncan (uji paling teliti)b. Jika hasil KK, (antara 5-10% untuk perlakuan homogen) dan (antara 10-20% untuk heterogen) digunakan Uji BNT (uji ketelitian sedang)c. Jika hasil KK kecil, (maksimal 5% untuk perlakuan homogen) dan (maksimal 10% untuk heterogen) digunakan Uji BNJ (uji kurang teliti).BAB IVPROSEDUR PENELITIAN

4. 4.1. 4.2. Fokus Penelitian Fokus penelitian ini adalah :a. Mengetahui konsentrasi efektif minyak atsiri daun kemangi dalam menghambat bakteri Streptococcus mutans.b. Mengetahui konsentrasi basis yang dibutuhkan untuk menghasilkan karakteristik pasta gigi yang stabil selama masa penyimpanan.c. Mengetahui stabilitas fisika (organoleptik, homogenitas, viskositas, daya sebar, dan pH) sediaan pasta gigi minyak atsiri daun kemangi sebelum dan sesudah penyimpanan.d. Mengetahui aktivitas antibakteri dari formulasi sediaan pasta gigi yang mengandung minyak atsiri daun kemangi (Ocimum basilicum L.) terhadapStreptococcus mutans penyebab karies gigi.

4.3. Prosedur Pengumpulan Dataa. Prosedur UmumDaun kemangi segar ditimbang sebanyak x gram, kemudian dicuci dengan air mengalir untuk menghilangkan segala jenis kotoran yang melekat. Kemudian daun kemangi dilayukan selama 24 jam untuk mengurangi kadar air. Daun kemangi setelah 24 jam ditimbang kembali untuk memperoleh bobot setelah pengeringan. Proses destilasi berlangsung selama 6 jam. Minyak atsiri yang berhasil diperoleh kemudian ditambahkan dengan natrium sulfat (Na2SO4) anhidrat untuk menghilangkan kandungan air. Kemudian ditentukan rendamen minyak atsiri yang berhasil didapatkan.

b. Prosedur Khusus 1) Steriliasi Alat dan BahanCawan petri, botol pengencer, paper disc, labu erlenmeyer, media agar (NA) disterilisasi di dalam autoklaf dengan mengatur tekanan sebesar 1 atm dan suhu sebesar 121C setelah sebelumnya dicuci bersih, dikeringkan dan dibungkus dengan kertas.2) Penyiapan Bakteri UjiBiakkan murni bakteri Streptococcus mutans hasil inokulasi disuspensikan dengan menambahkan NaCl fisiologis 0,9% steril menghasilkan suspensi bakteri Streptococcus mutans sehingga diperoleh suspensi bakteri yang siap digunakan untuk uji. Skema penyiapan bakteri uji dapat dilihat pada Gambar 4.4. berikut:

Biakkan murni bakteriSuspensi bakteri siap ujiDisuspensikan dengan NaCl 0,9%

Gambar 4.1. Skema Penyiapan Bakteri Uji3) Pembuatan MediumDalam membuat medium nutrient agar sebanyak 250 mL ditimbang sejumlah agar sebanyak 3,75 g, ekstrak daging 0,75 g dan pepton 1,25 g. Kemudian dilarutkan dengan air suling yang dimasukkan dalam erlenmeyer. Setelah itu dilakukan pemanasan, selama pemanasan harus selalu diaduk dengan batang pengaduk hingga seluruhnya larut kemudian disterilkan di dalam autoklaf pada suhu sebesar 121C.4) Uji Daya Antibakteri Minyak Atsiri Daun Kemangi Terhadap Bakteri Streptococcus mutansa) Penyiapan larutan ujiDari hasil destilasi dibuat berbagai variasi pengenceran dengan caramelarutkan destilat murni dengan etanol 99,9%. Dibuat beberapa variasi konsentrasi destilat minyak atsiri, meliputi konsentrasi 100 % (sebagai kontrol positif), 3, 9, dan 27 %, dengan cara melarutkan minyak atsiri ke dalam etanol 99,9% hingga mencapai konsentrasi yang diinginkan.b) Uji efektivitas minyak atsiri daun kemangi terhadap S.mutans dengan difusi agar.Medium NA steril sebanyak 10 mL dituang ke dalam botol pengencer kemudian diinokulasi suspensi bakteri dan dihomogenkan lalu dituang ke dalam cawan petri, selanjutnya dibiarkan hingga memadat. Selanjutnya paper disc yang telah dicelupkan ke dalam larutan uji dengan berbagai variasi konsentras diletakkan di atas medium sesuai dengan pola yang telah dibuat pada masing-masing konsentrasi. kontrol negatif yang digunakan adalah etanol 99,9% dan kontrol positif adalah minyak atsiri 100%. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Selanjutnya diamati zona hambat yang terbentuk dan dilakukan pengukuran daerah hambatan dengan menggunakan mikrometer sekrup. Dimana konsentrasi terendah yang terbentuk zona hambat adalah harga konsentrasi minimumnya.

5) Formulasi pasta gigiTabel 4.4. formula pasta gigiBahanFungsi (fase)

GliserinHumektan (A)

NaCMCGelling agent (A)

Aqua destilataSolvent (B)

natrium metabisulfitAntioksidan (B)

Minyak atsiri daun kemangiZat aktif (C)

NipaginPengawet (C)

Kalsium karbonatAbrasive (C)

Colloidal silica dioxideGelling agent (C)

GliserinHumektan (D)

Natrium lauril sufatSurfaktan (D)

MentholKorrigen (D)

NaCMC dicampurkan dengan gliserin sampai benar-benar basah (Fase A), ditambahkan air yang berisi natrium metabisulfit dengan natrium sakarin (fase B) sampai membentuk massa gel. Ditambahkan minyak atsiri kedalam massa gel. Secara terpisah dicampur nipagin dan Colloidal silica dioxide dan kalsium karbonat sampai homogen (fase C). Fase C kemudian dicampur kedalam fase A dan fase B diaduk hingga membentuk massa pasta. Kemudian nipagin yang telah dilarutkan kedalam etanol dan natrium lauril sulfat dalam gliserin (fase D) ditambahkan dan dilakukan pengadukan hingga membentuk pasta dan homogen.

6) Stabilitas Fisik Basis Pasta Gigia) Uji organoleptis Pengamatan sediaan akhir yang meliputi bau, rasa, dan warna yang diamati secara objektif dan kontinu selama 6 minggu. Pengamatan ini bertujuan untuk melihat terjadinya perubahan secara signifikan pada sediaan akhir yang telah dibuat. b) Uji homogentitasPengujian ini dilakukan dengan pengolesan sediaan pada kaca objek, lalu mengamati penampilan permukaan, apakah terdapat bagian yang terpisah atau tidak. c) Uji pHPengujian pH dilakukan dengan tujuan untuk memastikan pH pada sediaan pasta gigi yang telah dibuat sesuai dengan standar yang telah ditetapkan oleh SNI mengenai pH pada sediaan pasta gigi. Pengukuran pH dilakukan dengan menggunakan pH meter, sebelum sediaan dicelupkan, alat dikalibrasi terlebih dahulu dengan mencelupkan elektroda ke larutan dapar pH 7 kemudian pH 4, lalu dicoba kembali pada pH 7. Setelah itu dilakukan pengukuran pH sediaan.d) Uji daya sebarUji daya sebar dilakukan dengan menimbang 0,5 g sediaan pasta gigi, kemudian diletakan pada cawan petri terbalik. Diletakakan beban 20 g dan ditunggu selama 1 menit.e) Uji viskositasSediaan pasta gigi dimasukkan ke dalam wadah viskometer kemudiaan diukur viskositasnya menggunakan viskometer Brookfield LVT, spindel F, rpm tiga selama satu menit, setiap minggu selama enam minggu pada suhu kamar. 7) Uji daya antibakteri sediaan pasta gigi minyak atsiri daun kemangiSebanyak Z gram masing-masing dari 3 variasi konsentrasi sediaan pasta gigi minyak atsiri daun kemangi dilarutkan dengan menggunakan aquades hingga diperoleh larutan stok pada konsentrasi A%, B%, dan C%. Kemudian dari larutan stok tersebut dilakukan pengenceran menjadi masing-masing 3 variasi konsentrasi yang dikehendaki.Medium NA steril sebanyak 10 mL dituang ke dalam botol pengencer kemudian diinokulasi suspensi bakteri dan dihomogenkan lalu dituang ke dalam cawan petri, selanjutnya dibiarkan hingga memadat. Selanjutnya paper disc yang telah dicelupkan ke dalam larutan uji diletakkan di atas medium sesuai dengan pola yang telah dibuat pada masing-masing konsentrasi. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam. Selanjutnya diamati zona hambat yang terbentuk dan dilakukan pengukuran daerah hambatan dengan menggunakan mikrometer sekrup. Dimana konsentrasi terendah yang terbentuk zona hambat adalah harga konsentrasi minimumnya.8) Penentuan konsentrasi efektifPenentuan konsentrasi efektif antibakteri sediaan pasta gigi minyak atsiri daun kemangi (Ocimum basilicum L) terhadap pertumbuhan bakteri Streptococcus mutans dapat dilihat dalam skema Gambar 4.2. berikut

Formula AA1%A1%A1%

+ bakteri

Statiska Konsentrasi efektif

Gambar 4.2. Skema Penentuan Konsentrasi Efektif Pasta Gigi Minyak Atsiri Daun Kemangi (Ocimum basilicum L)

4.4. Prosedur Analisis Data1. Data yang diperoleh berupa uji daya antibakteri minyak atsiri dengan mengukur diameter zona bening pada cawan petri, uji daya sebar, uji pH, uji viskositas, uji homogenitas, dan uji daya antibakteri sediaan pasta gigi minyak atsiri. 2. Data tersebut diolah dengan menggunakan software dan manual. Software digunakan untuk mengetahui adanya kebermaknaan dalam perbedaan hasil diameter zona hambat tiap konsentrasi uji dengan kontrol negatif. Manual digunakan untuk uji homogenitas, uji daya sebar dan uji Viskositas dan uji pH.3. Hasil perhitungan disimpulkan ada tidaknya perbedaan perbedaan hasil diameter zona hambat tiap konsentrasi uji dengan kontrol negatif.4. Jika terdapat perbedaan yang signifikan antara perlakuan maka dilanjutkan dengan uji lanjutan untuk mengetahui perlakuan mana yang paling baik.5. Hasil akhir uji lanjutan menggambarkan hasil diameter zona hambat dan sediaan yang terbaik dalam eksperimen.