B KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR152/2009 af 27. …

Denne tekst tjener udelukkende som dokumentationsvaeligrktoslashj og har ingen retsvirkning EUs institutioner paringtager sig intet ansvar for dens indhold De autentiske udgaver af de relevante retsakter inklusive deres betragtninger er offentliggjort i den

Europaeligiske Unions Tidende og kan findes i EUR-Lex Disse officielle tekster er tilgaeligngelige direkte via linkene i dette dokument

B KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR1522009

af 27 januar 2009

om proslashveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder

(EOslashS-relevant tekst)

(EUT L 54 af 2622009 s 1)

AEligndret ved

Tidende

nr side dato

M1 Kommissionens forordning (EU) nr 2782012 af 28 marts 2012 L 91 8 2932012 M2 Kommissionens forordning (EU) nr 512013 af 16 januar 2013 L 20 33 2312013 M3 Kommissionens forordning (EU) nr 6912013 af 19 juli 2013 L 197 1 2072013 M4 Kommissionens forordning (EU) nr 7092014 af 20 juni 2014 L 188 1 2762014 M5 Kommissionens forordning (EU) 2017645 af 5 april 2017 L 92 35 642017 M6 Kommissionens forordning (EU) 2017771 af 3 maj 2017 L 115 22 452017

Berigtiget ved

C1 Berigtigelse EUT L 37 af 1322015 s 24 (6912013)

02009R0152 mdash DA mdash 24052017 mdash 006001 mdash 1

KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR1522009

af 27 januar 2009



M3

Artikel 1

Udtagning af proslashver som led i den offentlige kontrol af foder navnlig for saring vidt angaringr bestemmelse af bestanddele herunder materiale der indeholder eller bestaringr af eller er fremstillet af genetisk modificerede organismer fodertilsaeligtningsstoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 18312003 ( 1 ) uoslashnskede stoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Raringdets direktiv 200232EF ( 2 ) foreshytages efter de metoder der er anfoslashrt i bilag I

Den proslashveudtagningsmetode der er anfoslashrt i bilag I finder anvendelse paring kontrol af foder for saring vidt angaringr bestemmelse af pesticidrester som defineret i Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 3962005 ( 3 ) og kontrol af overensstemmelse med forordning (EU) nr 6192011

B

Artikel 2

Klargoslashring af proslashver til analyse og angivelse af resultater foretages efter de metoder der er beskrevet i bilag II

Artikel 3

Analyser som led i den offentlige kontrol af foder foretages efter de metoder der er beskrevet i bilag III (Analysemetoder til kontrol af sammensaeligtningen af fodermidler og foderblandinger) bilag IV (Anashylysemetoder til kontrol af indholdet af godkendte tilsaeligtningsstoffer i foder) bilag V (Analysemetoder til kontrol for uoslashnskede stoffer i foder) og bilag VI (Analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele som led i den offentlige kontrol af foder)

Artikel 4

Naeligringsvaeligrdien af foderblandinger til fjerkraelig beregnes som angivet i bilag VII

Artikel 5

De i bilag VIII beskrevne analysemetoder til kontrol for ulovlig foreshykomst af fodertilsaeligtningsstoffer der ikke laeligngere er tilladt anvendes til verifikationsformaringl

B


( 1 ) EUT L 268 af 18102003 s 29 ( 2 ) EFT L 140 af 3052002 s 10 ( 3 ) EUT L 70 af 1632005 s 1

Artikel 6

Direktiv 71250EOslashF 71393EOslashF 72199EOslashF 7346EOslashF 76371EOslashF 76372EOslashF 78633EOslashF 81715EOslashF 84425EOslashF 86174EOslashF 9370EOslashF 93117EF 9864EF 199927EF 199976EF 200045EF 200270EF og 2003126EF ophaeligves

Henvisninger til de ophaeligvede direktiver gaeliglder som henvisninger til naeligrvaeligrende forordning og laeligses efter sammenligningstabellerne i bilag IX

Artikel 7

Denne forordning traeligder i kraft paring tyvendedagen efter offentliggoslashrelsen i Den Europaeligiske Unions Tidende

Den anvendes fra den 26 august 2009

Denne forordning er bindende i alle enkeltheder og gaeliglder umiddelbart i hver medlemsstat

B


BILAG I

PROslashVEUDTAGNINGSMETODER

1 FORMAringL OG ANVENDELSESOMRAringDE

Proslashver der er bestemt til offentlig kontrol af foder udtages i overensshystemmelse med de nedenfor anfoslashrte metoder De saringledes fremkomne proslashver skal betragtes som repraeligsentative for de portioner der proslashvetages af

Formaringlet med repraeligsentativ proslashveudtagning er at udtage en broslashkdel af et parti paring en saringdan maringde at fastlaeligggelsen af de saeligrlige karakteristika ved denne broslashkdel repraeligsenterer gennemsnitsvaeligrdien af partiets karakterishystika Der udtages proslashver af partiet ved gentagne gange at udtage enkeltshyproslashver paring forskellige steder i partiet Disse enkeltproslashver kombineres ved sammenblanding saring de udgoslashr en samleproslashve hvorfra der klargoslashres repraeligsentative slutproslashver ved hjaeliglp af repraeligsentativ proslashveneddeling

Hvis det ved en visuel kontrol viser sig at en del af det foder der skal udtages proslashver af er af en anden kvalitet end resten af foderet i samme parti adskilles de paringgaeligldende dele fra resten af foderet og behandles som et saeligrskilt delparti Hvis det ikke er muligt at opdele foderet i saeligrskilte delpartier udtages proslashver som fra et parti I saringdanne tilfaeliglde naeligvnes dette i proslashveudtagningsrapporten

Saringfremt det konstateres at foder der udtages proslashver af i overensstemshymelse med bestemmelserne i denne forordning og som ikke opfylder EUs krav udgoslashr en del af et parti foder af samme klasse eller betegshynelse antages det at alt foder i det paringgaeligldende parti er beroslashrt medmindre en naeligrmere gennemgang ikke giver belaeligg for at den resteshyrende del af partiet ikke skulle opfylde EUs krav

2 DEFINITIONER

mdash Parti (lot eller batch) En identificerbar maeligngde foder hvorom det er fastslaringet at det har faeliglles karakteristika saringsom oprindelse type emballagetype pakkevirksomhed afsender eller maeligrkning og i tilfaeliglde af en produktionsproces en produktionsenhed fra eacutet anlaeligg hvor der anvendes ensartede produktionsparametre eller et antal af saringdanne enheder naringr de er fremstillet fortloslashbende og oplagres sammen

mdash Portion der proslashvetages af Et parti eller en identificerbar del af partiet eller delpartiet

mdash Plomberet proslashve En proslashve der er plomberet paring en maringde som forhindrer enhver adgang til proslashven uden at bryde eller fjerne plomben

mdash Enkeltproslashve En maeligngde som er udtaget paring et enkelt sted i den portion der proslashvetages af

mdash Samleproslashve En samling af enkeltproslashverne udtaget fra den portion der proslashvetages af

mdash Reduceret proslashve En del af en samleproslashve fremkommet ved repraeligshysentativ reduktion af denne

mdash Slutproslashve En del af den reducerede proslashve eller af den homogeniseshyrede samleproslashve

mdash Laboratorieproslashve Proslashve bestemt til laboratorieundersoslashgelse (som modtaget af laboratoriet) der kan vaeligre en slutproslashve en reduceret proslashve eller en samleproslashve

M3


3 ALMINDELIGE BESTEMMELSER

mdash Proslashveudtagningspersonale Proslashverne skal udtages af personer som er autoriseret hertil af den kompetente myndighed

mdash Proslashven plomberes paring en maringde som forhindrer enhver adgang til proslashven uden at bryde eller fjerne plomben Plombens etiket skal vaeligre klart identificerbar og synlig Alternativt kan proslashven anbringes i en beholder der kan lukkes paring en saringdan maringde at den ikke kan aringbnes uden at medfoslashre uoprettelig skade paring beholderen saring man undgaringr genanvendelse af beholderen

mdash Identifikation af proslashven Proslashven skal vaeligre maeligrket paring en uudslettelig maringde og skal identificeres paring en saringdan maringde at der er en utvetydig forbindelse til proslashveudtagningsrapporten

mdash Fra hver enkelt samleproslashve udtages mindst to slutproslashver mindst eacuten til offentlig kontrol (haringndhaeligvelsesformaringl) og en til lederen af fodershystofvirksomheden (kontraproslashve) Endelig kan der udtages eacuten slutshyproslashve til referenceformaringl Hvis hele samleproslashven homogeniseres udtages slutproslashverne af den homogeniserede samleproslashve medmindre denne fremgangsmaringde er i modstrid med medlemsstaternes forskrifter for saring vidt angaringr rettighederne for lederen af en foderstofvirksomhed

4 APPARATUR

41 Det apparatur der anvendes til proslashveudtagning skal vaeligre udfoslashrt i mateshyrialer der ikke kan forurene de produkter der skal udtages proslashver af Apparatur der er bestemt til at blive anvendt flere gange skal vaeligre let at rengoslashre for at undgaring krydsforurening

42 Anbefalet apparatur til udtagning af proslashver af foder i fast form

421 Manuel proslashveudtagning

4211 Skovl med flad bund og lodrette sider

4212 Proslashveudtagningsspyd med lang spalte eller inddelt i kamre Proslashveudshytagningsspyddets dimensioner skal vaeligre afpasset efter de forhold hvorshyunder den del der udtages proslashver af befinder sig (beholderens dybde saeligkkenes dimensioner osv) og efter stoslashrrelsen af de partikler foderet bestaringr af

Hvis proslashveudtagningsspyddet har flere aringbninger for at sikre at proslashverne udtages paring forskellige steder langs spyddet skal aringbningerne vaeligre adskilt af kamre eller sekventielt forskudte aringbninger

422 Mekanisk proslashveudtagning

Passende mekanisk apparatur kan anvendes til udtagning af proslashver af foder i bevaeliggelse Passende betyder at der mindst udtages proslashver af hele flowets tvaeligrsnit

Proslashveudtagning af foder i bevaeliggelse (med hoslashj flowhastighed) kan udfoslashres med automatisk proslashvetagningsudstyr

423 Proslashvedeler

Til neddeling af proslashver paring en repraeligsentativ maringde anvendes apparatur der deler proslashverne i tilnaeligrmelsesvis lige store dele hvis det er muligt og hensigtsmaeligssigt

M3


5 KVANTITATIVE KRAV FOR SAring VIDT ANGAringR ANTAL ENKELTshyPROslashVER

mdash De kvantitative krav i punkt 51 og 52 for saring vidt angaringr antallet af enkeltproslashver gaeliglder for portioner der proslashvetages af med en vaeliggt paring op til 500 tons og hvoraf der kan udtages proslashver paring en repraeligshysentativ maringde Den anfoslashrte fremgangsmaringde for proslashveudtagning gaeliglder ogsaring for maeligngder som er stoslashrre end den foreskrevne maksishymale stoslashrrelse af portioner der proslashvetages af hvis der ses bort fra det hoslashjeste antal enkeltproslashver som er angivet i nedenstaringende tabelshyler og antallet af enkeltproslashver fastlaeliggges ved hjaeliglp af den kvadrashytrodsformel der er fastsat i den relevante del af fremgangsmaringden (jf punkt 53) og den mindste stoslashrrelse af samleproslashven oslashges proportioshynelt hermed Dette forhindrer ikke at et stort parti kan opdeles i mindre delpartier og at der udtages proslashver af hvert delparti i overshyensstemmelse med fremgangsmaringden i punkt 51 og 52

mdash Stoslashrrelsen af portionen der proslashvetages af skal vaeligre saringledes at der kan udtages enkeltproslashver af alle dens bestanddele

mdash I tilfaeliglde af meget store partier eller delpartier (gt 500 tons) og partier som transporteres eller oplagres paring en saringdan maringde at der ikke kan udtages proslashver i overensstemmelse med den fremgangsshymaringde der er fastsat i punkt 51 og 52 anvendes den i punkt 53 fastsatte fremgangsmaringde

mdash Hvis lederen af foderstofvirksomheden i henhold til lovgivningen har pligt til at overholde bestemmelserne i denne forordning som led i et obligatorisk overvaringgningssystem kan lederen af foderstofvirksomshyheden afvige fra de kvantitative krav som er fastsat i dette afsnit for at tage hensyn til operationelle karakteristika forudsat at lederen af foderstofvirksomheden over for den kompetente myndighed har godtgjort aeligkvivalensen af fremgangsmaringden for proslashveudtagning med hensyn til repraeligsentativitet og efter godkendelse fra den kompetente myndighed

mdash I saeligrlige tilfaeliglde hvis det ikke er muligt at anvende den fastsatte proslashveudtagningsmetode for saring vidt angaringr de kvantitative krav paring grund af uacceptabel forretningsmaeligssig beskadigelse af partiet (som foslashlge af emballeringsform transportmiddel opbevaringsforhold osv) kan der anvendes en alternativ proslashveudtagningsmetode under forudsaeligtning af at den er saring repraeligsentativ som muligt og beskrives og dokumenteres fuldt ud

51 Kvantitative krav for saring vidt angaringr enkeltproslashver i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter der er homogent fordelt i foderet

511 Uemballeret foder i fast form

Stoslashrrelsen af den portion der proslashvetages af Mindste antal enkeltproslashver

le 25 tons 7

gt 25 tons Kvadratroden af 20 gange det antal tons som den portion der proslashvetages af vejer () op til 40 enkeltproslashver

() Er den fremkomne stoslashrrelse ikke et helt tal afrundes til naeligrmeste hoslashjere hele tal

M3


512 Uemballeret foder i flydende form


le 25 tons eller le 2 500 liter 4 ()

gt 25 tons eller gt 2 500 liter 7 ()

() Hvis det ikke er muligt at goslashre vaeligsken homogen oslashges antallet af enkeltproslashver

513 Emballeret foder

Foder (i fast og flydende form) kan vaeligre emballeret i saeligkke poser daringser toslashnder mv der i tabellen er omhandlet som enheder Af store enheder (ge 500 kg eller liter) udtages proslashver i overensstemmelse med bestemmelserne for uemballeret foder (jf punkt 511 og 512)

Stoslashrrelsen af den portion der proslashvetages af

Mindste antal enheder hvoraf (mindst) eacuten enkeltproslashve skal udtages ()

1 til 20 enheder 1 enhed ()

21 til 150 enheder 3 enheder ()


gt 400 enheder C1 frac14 af kvadratroden af antallet af enheder som udgoslashr den portion der proslashvetages () op til 40 enheder

() I tilfaeliglde af at aringbningen af en enhed kan paringvirke analysen (feks letfordaeligrshyveligt varingdt foder) udgoslashres en enkeltproslashve af den uaringbnede enhed

() For enheder hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter udgoslashres en enkeltproslashve af indholdet af eacuten original enhed


514 Foderblokke og mineralske sliksten

C1 For hver 25 enheder der proslashvetages udtages mindst eacuten blok eller slikshysten dog hoslashjst 4 blokke eller sliksten

M3 For blokke eller sliksten der ikke vejer over 1 kg stykket udgoslashres en enkeltproslashve af indholdet af eacuten blok eller eacuten sliksten

515 Grovfoderfoderplanter

Stoslashrrelsen af den portion der proslashvetages af Mindste antal enkeltproslashver ()

le 5 tons 5

gt 5 tons Kvadratroden af 5 gange det antal tons som den portion der proslashveshytages af udgoslashr () op til 40 enkeltproslashver

() Det erkendes at det i visse situationer (feks ved ensilage) ikke er muligt at udtage de kraeligvede enkeltproslashver uden at foraringrsage uacceptabel beskadigelse af partiet En alternativ proslashveudtagningsmetode kan anvendes i saringdanne situashytioner og inden ikrafttraeligdelsen af denne forordning vil der blive udarbejdet en vejledning om proslashveudtagning af saringdanne partier


M3


52 Kvantitative krav for saring vidt angaringr enkeltproslashver i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer der saeligdvanligvis er uhomogent fordelt i foderet

Disse kvantitative krav for saring vidt angaringr enkeltproslashver skal anvendes i foslashlgende situationer

mdash kontrol med forekomst af aflatoksin meldroslashje andre mykotoksiner og skadelige botaniske urenheder i fodermidler

mdash kontrol af krydsforurening fra en bestanddel herunder genmodifishyceret materiale eller stof der saeligdvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler

Hvis kontrolmyndigheden har staeligrk mistanke om at der forekommer en uhomogen fordeling og i tilfaeliglde af krydsforurening fra en bestanddel eller et stof i en foderblanding kan de kvantitative krav i nedenstaringende tabel anvendes


lt 80 tons Jf de kvantitative krav i punkt 51 Antal enkeltproslashver som skal udtages ganges med 25

ge 80 tons 100

53 Kvantitative krav for saring vidt angaringr enkeltproslashverne i tilfaeliglde af meget store partier

I tilfaeliglde af store portioner der proslashvetages af (gt 500 tons) er antallet af enkeltproslashver der skal udtages = 40 enkeltproslashver + kvadratroden af antal tons i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter der er homogent fordelt i foderet eller 100 enkeltproslashver + kvadratroden af antal tons i forbindelse med kontrol af bestanddele eller stoffer der saeligdvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler

6 KVANTITATIVE KRAV FOR SAring VIDT ANGAringR SAMLEPROslashVER

Der skal vaeligre eacuten samleproslashve for hver portion der proslashvetages af

Fodertype Minimumsstoslashrrelse af samleproslashven () ()

61 Uemballeret foder 4 kg

62 Emballeret foder 4 kg ()

M3




63 Flydende eller halvflydende foder

4 liter

64 Foderblokke eller mineralske sliksten

641 med en stykvaeliggt paring over 1 kg 4 kg

642 med en stykvaeliggt paring hoslashjst 1 kg vaeliggten af 4 originale blokke eller sliksten

65 Grovfoderfoderplanter 4 kg ()

() Hvis det foder der udtages proslashver af er af stor vaeligrdi kan der udtages en mindre maeligngde samleproslashve under forudsaeligtning af at dette beskrives og dokumenteres i proslashveudtagningsrapporten

() I henhold til bestemmelserne i Kommissionens forordning (EU) nr 619 2011 af 24 juni 2011 om proslashveudtagnings- og analysemetoder til offentlig kontrol af foder for saring vidt angaringr forekomst af genetisk modificeret materiale som er under godkendelse eller for hvilket godkendelsen er udloslashbet (EUT L 166 af 2562011 s 9) skal samleproslashven til kontrol af forekomst af genetisk modificeret materiale indeholde mindst 35 000 froslash korn C1 Dette betyder at for majs skal stoslashrrelsen af samleproslashven vaeligre mindst 105 kg og for sojaboslashnner 7 kg For andre froslash og korn saringsom byg hirse havre ris rug hvede og rapsfroslash svarer stoslashrrelsen af samleshyproslashven paring 4 kg til mere end 35 000 froslashkorn

() I tilfaeliglde af emballeret foder er det heller ikke altid muligt at opnaring en stoslashrrelse paring 4 kg for samleproslashven afhaeligngigt af stoslashrrelsen af de enkelte enheder

() For saring vidt angaringr grovfoder eller foderplanter med lav massefylde (feks hoslash halm) skal samleproslashven vaeligre paring mindst 1 kg

7 KVANTITATIVE KRAV FOR SAring VIDT ANGAringR SLUTPROslashVER

Slutproslashver

Der kraeligves analyse af mindst eacuten slutproslashve Maeligngden af slutproslashven der skal analyseres maring ikke vaeligre mindre end

Foder i fast form 500 g () () ()

Flydende eller halvflydende foder 500 ml ()

() I henhold til bestemmelserne i forordning (EU) nr 6192011 skal slutproslashver til kontrol af forekomst af genetisk modificeret materiale indeholde mindst 10 000 froslashkorn C1 Dette betyder at for majs skal stoslashrrelsen af slutshyproslashven vaeligre mindst 3 000 g og for sojaboslashnner 2 000 g For andre froslash og korn saringsom byg hirse havre ris rug hvede og rapsfroslash svarer stoslashrrelsen af slutproslashven paring 500 g til mere end 10 000 froslashkorn

() Hvis stoslashrrelsen af samleproslashven er betydeligt mindre end 4 kg eller liter (jf fodnoterne i afsnit 6) kan der ligeledes udtages en mindre maeligngde slutshyproslashve under forudsaeligtning af at dette beskrives og dokumenteres i proslashveudshytagningsrapporten

() I tilfaeliglde af proslashveudtagning af baeliglgfrugter korn og noslashdder til bestemmelse af indholdet af pesticidrester skal minimumsstoslashrrelsen af slutproslashven vaeligre 1 kg i overensstemmelse med bestemmelserne i Kommissionens direktiv 200263EF (EFT L 187 af 1672002 s 30)

M3


8 PROslashVEUDTAGNINGSMETODE FOR MEGET STORE PARTIER ELLER PARTIER SOM OPBEVARES ELLER TRANSPORTERES PAring EN MAringDE SAring PROslashVEUDTAGNING I HELE PARTIET IKKE ER MULIG

81 Generelle principper

Hvis transport eller opbevaring af et parti forhindrer udtagning af enkeltshyproslashver i hele partiet boslashr proslashveudtagning af saringdanne partier foretages naringr partiet er i flow

I tilfaeliglde af store lagerbygninger der er bestemt til oplagring af foder boslashr virksomhederne opfordres til at installere udstyr i lagerbygningerne som (automatisk) foretager proslashveudtagning i hele det oplagrede parti

Ved anvendelse af de fremgangsmaringder for proslashveudtagning som er omhandlet i dette afsnit 8 underrettes lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repraeligsentant om den paringgaeligldende fremgangsmaringde for proslashveudtagning Hvis lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repraeligsentant anfaeliggter denne fremgangsmaringde for proslashveudtagning skal lederen af foderstofvirksomheden eller dennes repraeligsentant give den kompetente myndighed mulighed for at udtage proslashver af hele det paringgaeliglshydende parti for vedkommendes regning

82 Store partier som transporteres med skib

821 Dynamisk proslashveudtagning af store partier som transporteres med skib

Proslashveudtagning af store partier i skibe foretages bedst mens produktet er i flow (dynamisk proslashveudtagning)

Proslashveudtagningen skal foretages pr lastrum (enhed der fysisk kan adskilles) Lastrummene toslashmmes imidlertid ikke hver for sig saring den oprindelige fysiske adskillelse eksisterer ikke laeligngere efter overfoslashrslen til lagerfaciliteter Proslashveudtagning kan derfor foretages enten paring baggrund af den oprindelige fysiske adskillelse eller paring baggrund af opdelingen efter overfoslashrslen til lagerfaciliteterne

Losningen af et skib kan vare flere dage Normalt gennemfoslashres proslashveudshytagningen med regelmaeligssige mellemrum under hele losningens varigshyhed Det er dog ikke altid muligt eller hensigtsmaeligssigt at en officiel inspektoslashr er til stede med henblik paring proslashveudtagning i loslashbet af hele lossearbejdet Det er derfor tilladt at gennemfoslashre proslashveudtagning paring en del af hele partiet Antallet af enkeltproslashver bestemmes under hensynshytagen til stoslashrrelsen af den portion der proslashvetages af

Hvis der er udtaget proslashver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse og det konstateres at denne del af partiet ikke opfylder EUs krav antages det at alt foder i det paringgaeligldende parti er beroslashrt medmindre en naeligrmere gennemgang ikke giver belaeligg for at den resteshyrende del af partiet ikke skulle opfylde EUrsquos krav

Selv om den officielle proslashve udtages automatisk skal der vaeligre en inspektoslashr til stede Saringfremt den automatiske proslashveudtagning gennemshyfoslashres med forudindstillede parametre som ikke kan aeligndres under proslashveudtagningen og enkeltproslashverne indsamles i en plomberet beholder som forhindrer eventuelt svig er inspektoslashrens tilstedevaeligrelse kun noslashdvendig ved paringbegyndelsen af proslashveudtagningen hver gang proslashvebeshyholderen skal udskiftes og ved afslutningen af proslashveudtagningen

M3


822 Proslashveudtagning af partier som transporteres med skib ved statisk proslashveudtagning

Hvis proslashveudtagningen udfoslashres paring en statisk maringde anvendes den samme fremgangsmaringde som den der gaeliglder for lagerfaciliteter (siloer) som er tilgaeligngelige ovenfra (jf punkt 841)

Proslashveudtagningen gennemfoslashres paring den tilgaeligngelige del (ovenfra) af partietlastrummet Antallet af enkeltproslashver bestemmes under hensynshytagen til stoslashrrelsen af den portion der proslashvetages af Hvis der er udtaget proslashver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegshynelse og det konstateres at denne del af partiet ikke opfylder EUs krav antages det at alt foder i det paringgaeligldende parti er beroslashrt medmindre en naeligrmere gennemgang ikke giver belaeligg for at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EUrsquos krav

83 Proslashveudtagning af store partier der er oplagret i lagerbygninger

Proslashveudtagningen gennemfoslashres paring den tilgaeligngelige del af partiet Antallet af enkeltproslashver bestemmes under hensyntagen til stoslashrrelsen af den portion der proslashvetages af Hvis der er udtaget proslashver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse og det konstateres at denne del af partiet ikke opfylder EUs krav antages det at alt foder i det paringgaeligldende parti er beroslashrt medmindre en naeligrmere gennemgang ikke giver belaeligg for at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EUrsquos krav

84 Udtagning af proslashver fra lagerfaciliteter (siloer)

841 Udtagning af proslashver fra siloer som er (let) tilgaeligngelige ovenfra


842 Udtagning af proslashver fra siloer som ikke er tilgaeligngelige ovenfra (lukshykede siloer)

8421 S i l o e r s o m i k k e e r t i l g aelig n g e l i g e o v e n f r a ( l u k k e d e s i l o e r ) m e d e n s t oslash r r e l s e p aring gt 1 0 0 t o n s

Der kan ikke udtages proslashver af foder der er oplagret i saringdanne siloer paring en statisk maringde Hvis der skal udtages proslashver af foder i en saringdan silo og det ikke er muligt at flytte partiet skal der derfor traeligffes aftale med virksomhedslederen om at vedkommende meddeler inspektoslashren hvornaringr den paringgaeligldende silo vil blive toslashmt saring der kan udtages proslashver mens foderet er i flow

8422 S i l o e r s o m i k k e e r t i l g aelig n g e l i g e o v e n f r a ( l u k k e d e s i l o e r ) m e d s t oslash r r e l s e p aring lt 1 0 0 t o n s

Fremgangsmaringden for proslashveudtagning indebaeligrer overfoslashrsel til en beholder af en stoslashrrelse paring 50-100 kg hvorfra proslashven udtages Stoslashrrelsen af samleproslashven skal svare til hele partiet og antallet af enkeltproslashver skal beregnes paring baggrund af maeligngden i den silo hvorfra der overfoslashres foder til en beholder med henblik paring proslashveudtagning Hvis der er udtaget proslashver af en del af et parti foder af samme klasse eller betegnelse og det konstateres at denne del af partiet ikke opfylder EUs krav antages det at alt foder i det paringgaeligldende parti er beroslashrt medmindre en naeligrmere gennemgang ikke giver belaeligg for at den resterende del af partiet ikke skulle opfylde EUrsquos krav

M3


85 Udtagning af proslashver af uemballeret foder i store lukkede beholdere

Der kan som regel kun udtages proslashver af saringdanne partier naringr beholderne aflaeligsses Det er i visse tilfaeliglde ikke muligt at aflaeligsse beholderne ved indfoslashrsel eller kontrol og proslashveudtagningen boslashr derfor gennemfoslashres naringr beholderne aflaeligsses

9 FREMGANGSMAringDE VED UDTAGNING KLARGOslashRING OG EMBALLERING AF PROslashVERNE

91 Generelt

Proslashverne udtages og klargoslashres saring hurtigt som muligt under hensyntagen til de forholdsregler som er noslashdvendige for at undgaring at produktet forandres eller forurenes Instrumenter og ogsaring overflader og beholdere som er beregnet til at rumme proslashverne skal vaeligre rene og toslashrre

92 Enkeltproslashver

Enkeltproslashver skal udtages tilfaeligldigt fra hele den portion der proslashvetages af Deres stoslashrrelse skal vaeligre tilnaeligrmelsesvis ens

Enkeltproslashvens stoslashrrelse skal vaeligre paring mindst 100 g eller 25 g i tilfaeliglde af grovfoder eller foderplanter med lav massefylde

I tilfaeliglde af at der i henhold til den fremgangsmaringde for proslashveudtagning der er fastsat i afsnit 8 skal udtages faeligrre end 40 enkeltproslashver fastshylaeliggges stoslashrrelsen af enkeltproslashverne paring baggrund af den stoslashrrelse der kraeligves for samleproslashver (jf afsnit 6)

I tilfaeliglde af proslashveudtagning af proslashver af mindre partier af emballeret foder hvor der i henhold til de kvantitative krav skal udtages et begraelignset antal enkeltproslashver skal en enkeltproslashve udgoslashres af indholdet af eacuten original enhed hvis indhold ikke overstiger 1 kg eller 1 liter

I tilfaeliglde af proslashveudtagning af emballeret foder der bestaringr af smaring enheder (feks lt 250 g) afhaelignger antallet af enkeltproslashver af enhedernes stoslashrrelse

921 Uemballeret foder

Hvor det er passende kan proslashveudtagningen foretages mens partiet er i bevaeliggelse (paringlaeligsning eller aflaeligsning)


Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til proslashveudtagning er udvalgt udtages en del af indholdet af hver enhed ved hjaeliglp af spyd eller skovl Om noslashdvendigt skal proslashverne udtages efter at enhederne er toslashmt hver for sig

923 Flydende eller halvflydende foder som er homogent eller kan goslashres homogent

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til proslashveudtagning er udvalgt homogeniseres indholdet om noslashdvendigt og der udtages en maeligngde fra hver enhed

Enkeltproslashverne kan eventuelt udtages under aftapning af partiet

M3


924 Flydende eller halvflydende foder som ikke kan goslashres homogent

Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal enheder til proslashveudtagning er udvalgt udtages proslashver fra forskellige niveauer

Enkeltproslashver kan ligeledes udtages naringr partiet aftappes men de foslashrste fraktioner kasseres

Under alle omstaeligndigheder maring den samlede udtagne maeligngde ikke vaeligre mindre end 10 liter


Efter at det i afsnit 5 fastsatte antal blokke eller sliksten til proslashveudshytagning er udvalgt kan der udtages en del af hver blok eller sliksten I tilfaeliglde af mistanke om en uhomogen blok eller sliksten kan hele blokken eller slikstenen udtages som proslashve

For blokke eller sliksten der ikke vejer over 1 kg stykket udgoslashres en enkeltproslashve af indholdet af eacuten blok eller eacuten sliksten

93 Klargoslashring af samleproslashver

Enkeltproslashverne sammenblandes saring de udgoslashr en enkelt samleproslashve

94 Klargoslashring af slutproslashver

Samleproslashven blandes omhyggeligt ( 1 )

mdash Hver proslashve anbringes i en egnet beholder Alle noslashdvendige forholdsshyregler tages for at undgaring at proslashven forurenes eller forfalskes eller at sammensaeligtningen aeligndres under transport eller opbevaring

mdash Ved kontrol af bestanddele eller stoffer der er homogent fordelt i foderet kan samleproslashven reduceres paring en repraeligsentativ maringde til mindst 20 kg eller 20 liter (reduceret proslashve) ( 2 ) helst ved anvenshydelse af en mekanisk eller en automatisk proslashvedeler Ved kontrol af forekomst af pesticidrester i baeliglgfrugter korn og traelignoslashdder er minishymumsstoslashrrelsen af den reducerede proslashve 3 kg Hvis fodertypen umuliggoslashr anvendelse af en proslashvedeler eller hvis der ikke er en proslashvedeler til raringdighed kan proslashven reduceres ved firdeling (kvartshyning) Fra de reducerede proslashver klargoslashres slutproslashverne (til kontrol- kontraproslashve- og referenceformaringl) af tilnaeligrmelsesvis samme stoslashrrelse og under overholdelse af de kvantitative krav i afsnit 7 Ved kontrol af bestanddele herunder genetisk modificeret materiale eller stoffer der saeligdvanligvis er uhomogent fordelt i fodermidler skal samleshyproslashven vaeligre

mdash fuldstaeligndigt homogeniseret og derefter opdelt i slutproslashver eller

mdash reduceret til mindst 2 kg eller 2 liter ( 3 ) ved anvendelse af en mekanisk eller automatisk proslashvedeler Kun i tilfaeliglde hvor fodershytypen forhindrer anvendelse af en proslashvedeler kan proslashven om noslashdvendigt reduceres ved firdeling Med henblik paring kontrol af forekomst af genetisk modificeret materiale i henhold til forordning (EU) nr 6192011 skal den reducerede proslashve indeholde mindst 35 000 froslashkorn for at opnaring de slutproslashver der kraeligves til haringndhaeligvelses- kontraproslashve- og referenceformaringl paring mindst 10 000 froslashkorn (jf fodnote () i afsnit 6 og fodnote () i afsnit 7)

M3


( 1 ) Eventuelle klumper findeles (om noslashdvendigt ved at udskille dem og derparing foslashre dem tilbage til samleproslashven)

( 2 ) Undtagen i tilfaeliglde af grovfoder eller foderplanter med lav massefylde ( 3 ) Undtagen i tilfaeliglde af grovfoder eller foderplanter med lav massefylde

95 Emballering af proslashver

Beholdere eller pakninger plomberes og forsynes med etiketter paring en saringdan maringde at de ikke kan aringbnes uden at plomben beskadiges Hele etiketten skal anbringes inden for plomben

96 Forsendelse af proslashver til laboratoriet

Proslashven sendes saring hurtigt som muligt til det udpegede analyselaboratoshyrium sammen med de for analysen noslashdvendige oplysninger

10 REGISTRERING AF PROslashVEUDTAGNING

Hver proslashve skal registreres saringledes at portionen der proslashvetages af og dens stoslashrrelse utvetydigt kan identificeres

Desuden skal enhver afvigelse fra den fremgangsmaringde for proslashveudtagshyning der er fastsat i denne forordning registreres

De registrerede oplysninger stilles til raringdighed for det officielle kontrolshylaboratorium samt for lederen af foderstofvirksomheden ogeller det laboratorium som er udpeget af foderstofvirksomheden

M3


BILAG II

ALMINDELIGE BESTEMMELSER VEDROslashRENDE ANALYSEMEshyTODER FOR FODER

A KLARGOslashRING AF PROslashVER TIL ANALYSE

1 Formaringl

De nedenfor beskrevne fremgangsmaringder omhandler klargoslashring til analyse af proslashver der efter udtagning sendes til kontrollaboratorierne i overensstemmelse med bilag I

Laboratorieproslashverne klargoslashres saringledes at de i henhold til analysemetoshyderne afvejede maeligngder er homogene og repraeligsentative for slutproslashshyverne

2 Forholdsregler

Fremgangsmaringden for klargoslashring af proslashven afhaelignger af hvilke analyseshymetoder der skal anvendes og hvilke bestanddele eller stoffer der skal kontrolleres Det er derfor yderst vigtigt at sikre at den fremgangsmaringde for klargoslashring af proslashven der foslashlges passer til den anvendte analysemeshytode og til de bestanddele eller stoffer der skal kontrolleres

Alle noslashdvendige arbejdsgange udfoslashres saring det saring vidt muligt undgarings at forurene proslashven og aeligndre dens sammensaeligtning

Formaling blanding og sigtning gennemfoslashres saring hurtigt som muligt og saringledes at proslashven udsaeligttes mindst muligt for luft og lys Der anvendes ikke kvaeligrne og andre formalingsapparater med vaeligsentlig tilboslashjelighed til at frembringe varme i proslashven

Saeligrligt varmefoslashlsomt foder boslashr formales manuelt Det sikres tillige at apparaturet i sig selv ikke forurener

Kan klargoslashringen ikke foretages uden vaeligsentlige aeligndringer af proslashvens vandindhold bestemmes vandindholdet foslashr og efter klargoslashringen efter den metode der er fastsat i del A i bilag III

3 Fremgangsmaringde

31 Generel fremgangsmaringde

Testdelproslashven udtages af slutproslashven Neddeling efter keglemetoden og firdeling (kvartning) kan ikke anbefales da disse metoder giver risiko for uhomogene delproslashver

311 F o d e r d e r k a n f o r m a l e s d i r e k t e

mdash Den sigtede slutproslashve blandes og opsamles i en egnet ren og toslashr beholder med lufttaeligt lukning Slutproslashven blandes igen for at sikre fuldstaeligndig homogenisering umiddelbart foslashr afvejning til analyse (testdelproslashve)

312 F o d e r d e r k a n f o r m a l e s e f t e r t oslash r r i n g

mdash Medmindre andet er angivet for analysemetoden toslashrres slutproslashven saring den faringr et vandindhold paring 8-12 i overensstemmelse med den fremgangmaringde for fortoslashrring der er anfoslashrt i punkt 43 om metoden til bestemmelse af vandindhold i del A i bilag III Der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 311

M3


313 F l y d e n d e e l l e r h a l v f l y d e n d e f o d e r

mdash Slutproslashven opsamles i en ren toslashr og egnet beholder med lufttaeligt lukning Slutproslashven blandes grundigt for at sikre fuldstaeligndig homoshygenisering umiddelbart foslashr afvejning til analyse (testdelproslashve)

314 A n d e t f o d e r

mdash Slutproslashver der ikke kan klargoslashres i overensstemmelse med en af de ovenfor beskrevne fremgangsmaringder behandles paring anden maringde saring der skabes sikkerhed for at de maeligngder der afvejes til analyse (testdelproslashve) er homogene og repraeligsentative for slutproslashverne

32 Saeligrlig fremgangsmaringde i tilfaeliglde af undersoslashgelse ved visuel eller ved mikroskopisk kontrol eller i tilfaeliglde hvor samleproslashven er homogeniseret

mdash I tilfaeliglde af en undersoslashgelse ved visuel kontrol (uden anvendelse af mikroskop) anvendes hele laboratorieproslashven til undersoslashgelsen

mdash I tilfaeliglde af en mikroskopisk undersoslashgelse kan laboratoriet reducere samleproslashven eller reducere den reducerede proslashve yderligere Slutshyproslashver til kontraproslashve- og eventuelt referenceformaringl udtages efter en fremgangsmaringde svarende til den fremgangsmaringde der foslashlges for slutproslashver til kontrolformaringl

mdash Hvis hele samleproslashven er homogeniseret udtages slutproslashverne fra den homogeniserede samleproslashve

4 Opbevaring af proslashverne

Proslashverne opbevares ved en temperatur der ikke aeligndrer deres sammenshysaeligtning Proslashver der er bestemt til analyse af vitaminer eller saeligrligt lysfoslashlsomme stoffer opbevares under saringdanne betingelser at proslashven ikke paringvirkes negativt af lys

B KRAV TIL REAGENSER OG APPARATUR DER ANVENDES I FORBINDELSE MED ANALYSEMETODERNE

1 Medmindre andet er angivet for analysemetoderne skal alle reagenser vaeligre af analysekvalitet (pa) Ved udfoslashrelse af en sporstofanalyse kontrolleres reagensernes renhed ved en blindproslashve Resultatet af blindshyproslashven er afgoslashrende for om der kraeligves yderligere oprensning af reagenserne

2 Til alle former for fremstilling af oploslashsninger fortynding skylning eller vaskning der er angivet i forbindelse med analysemetoderne uden at oploslashsnings- eller fortyndingsmidlets art er omtalt anvendes vand Som generel regel gaeliglder det at der anvendes demineraliseret eller destilleret vand I saeligrlige tilfaeliglde som angivet i de beskrevne analysemetoder er det noslashdvendigt at underkaste vandet saeligrlige oprensningsprocesser

3 Standardapparatur der normalt findes paring kontrollaboratorier er ikke omtalt i forbindelse med analysemetoderne derimod omtales specialshyinstrumenter og -udstyr samt instrumenter og udstyr hvis brug der stilles saeligrlige krav til Instrumenter og apparatur skal vaeligre rene isaeligr ved bestemmelse af meget smaring stofmaeligngder

M3


C ANVENDELSE AF ANALYSEMETODERNE OG ANGIVELSE AF RESULTATER

1 Ekstraktionsprocedure

Der er flere metoder der omfatter en specifik ekstraktionsprocedure Som hovedregel kan der anvendes andre ekstraktionsprocedurer end den i metoden angivne under forudsaeligtning af at den anvendte ekstrakshytionsprocedure bevisligt frembyder en ekstraktionseffektivitet for den analyserede matrix der svarer til effektiviteten af den i metoden omtalte fremgangsmaringde

2 Oprensningsprocedure

Der er flere metoder der omfatter en specifik oprensningsprocedure Som hovedregel kan der anvendes andre oprensningsprocedurer end den i metoden angivne under forudsaeligtning af at den anvendte oprensshyningsprocedure bevisligt giver analyseresultater for den analyserede matrix der svarer til de resultater som opnarings med den i metoden omtalte fremgangsmaringde

3 Antal bestemmelser

I forbindelse med analyse af uoslashnskede stoffer gaeliglder det at hvis resulshytatet af den foslashrste bestemmelse er vaeligsentligt (gt 50 ) lavere end den specifikation der skal kontrolleres er yderligere bestemmelser ikke paringkraeligvet saringfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer I andre tilfaeliglde er det noslashdvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af proslashver Gennemsnittet af de to bestemmelser hvor der tages hensyn til maringleusikkerheden anvendes til at verificere om kravene er opfyldt

Ved kontrol af det angivne indhold af et stof eller en ingrediens gaeliglder det at hvis resultatet af den foslashrste bestemmelse bekraeligfter det angivne indhold dvs hvis analyseresultatet ligger inden for det acceptable variashytionsomraringde for det angivne indhold er yderligere bestemmelser ikke paringkraeligvet saringfremt der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer I andre tilfaeliglde er det noslashdvendigt at foretage en ekstra analyse (anden bestemmelse) for at udelukke muligheden for intern krydsforurening eller utilsigtet sammenblanding af proslashver Gennemsnittet af de to bestemmelser hvor der tages hensyn til maringleusikkerheden anvendes til at verificere om kravene er opfyldt

I visse tilfaeliglde er det acceptable variationsomraringde fastsat i lovgivningen som feks i Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 7672009 af 13 juli 2009 om markedsfoslashring og anvendelse af foder om aeligndring af Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 18312003 og om ophaeligvelse af Raringdets direktiv 79373EOslashF Kommissionens direktiv 80511EOslashF Raringdets direktiv 82471EOslashF 83228EOslashF 9374EOslashF 93113EF og 9625EF og Kommissionens beslutning 2004217EF ( 1 )

4 Afrapportering af anvendt analysemetode

Analyserapporten skal angive den anvendte analysemetode

5 Afrapportering af analyseresultater

Analyseresultatet angives som anfoslashrt i analysemetoden med et tilstraeligkshykeligt antal betydende cifre og korrigeres om noslashdvendigt til samme vandindhold som slutproslashven havde foslashr proslashveklargoslashringen

M3


( 1 ) EUT L 229 af 192009 s 1

6 Maringleusikkerhed og genfindingsprocent i forbindelse med analyse af uoslashnskede stoffer

For saring vidt angaringr uoslashnskede stoffer som omhandlet i direktiv 200232EF boslashr et produkt til foderbrug anses for ikke at overholde det fastsatte maksimumsindhold hvis analyseresultatet beregnet ved et vandindhold paring 12 vurderes at overstige maksimumsindholdet under hensyntagen til den ekspanderede maringleusikkerhed og korrektion for genfinding Det vurderes om maksimumsindholdet er overholdt ved at vurdere analyseshyresultatet korrigeret for genfinding og fratrukket ekspanderet maringleusikshykerhed Dette gaeliglder kun i tilfaeliglde hvor analysemetoden tillader vurdeshyring af maringleusikkerheden og korrektion for genfinding (hvilket feks ikke er tilfaeligldet ved mikroskopering)

Analyseresultatet skal afrapporteres som foslashlger (hvis den anvendte analysemetode tillader vurdering af maringleusikkerhed og genfindingsproshycent)

a) ved korrektion for genfinding den angivne genfindingsprocent Ved en genfindingsprocent paring 90-110 er korrektion for genfinding ikke paringkraeligvet

b) som raquox +ndash Ulaquo hvor x er analyseresultatet og U er den ekspandeshyrede maringleusikkerhed idet der anvendes en daeligkningsfaktor paring 2 hvilket giver et konfidensniveau paring ca 95

Analyseresultatet kan dog hvis resultatet af analysen er vaeligsentligt (gt 50 ) lavere end den specifikation der skal kontrolleres hvis der anvendes tilfredsstillende kvalitetsprocedurer og hvis analysen udelukshykende har til formaringl at kontrollere at gaeligldende lovgivning er overholdt indberettes uden korrektion for genfinding ligesom det i saringdanne tilfaeliglde kan undlades at indberette genfindingsprocent og maringleusikkershyhed

M3


BILAG III

ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF SAMMENSAEligTNINGEN AF FODERMIDLER OG FODERBLANDINGER

A BESTEMMELSE AF VANDINDHOLD

1 Formaringl og anvendelsesomraringde

Denne metode goslashr det muligt at bestemme vandindholdet i foder For saring vidt angaringr foder indeholdende flygtige stoffer saringsom organiske syrer skal det bemaeligrkes at der sammen med vandindholdet ogsaring bestemmes betydelige maeligngder flygtige stoffer

Metoden er ikke beregnet paring analyse af mejeriprodukter der anvendes som fodermidler analyse af mineralske stoffer og blandinger der overshyvejende bestaringr af mineralske stoffer analyse af animalsk og vegetabilsk fedt eller analyse af olieholdige froslash og frugter

2 Princip

Proslashven toslashrres under naeligrmere angivne betingelser som er afhaeligngige af foderets art Vaeliggttabet bestemmes ved vejning For fast foder med hoslashjt vandindhold er yderligere fortoslashrring noslashdvendig

3 Apparatur

31 Formalingsapparat udfoslashrt i et materiale der ikke er fugtabsorberende og som er let at goslashre rent muliggoslashr en hurtig og ensartet formaling uden maeligrkbar varmeudvikling saring vidt muligt forhindrer kontakt med den omgivende luft og opfylder kravene i punkt 411 og 412 (f eks mikrohammermoslashller mikroformalingsapparater med vandkoslashling demonshytable keglemoslashller langsomtloslashbende keglemoslashller og tandskivemoslashller)

32 Analysevaeliggt med 1 mg aflaeligsningsnoslashjagtighed

33 Toslashrre vejekar af korrosionsbestandigt metal eller glas med lufttaeligt lukning nyttearealet skal vaeligre stort nok til at proslashven kan fordeles med ca 03 gcm

2

34 Elektrisk opvarmet temperaturreguleret toslashrreskab (plusmn 2 o C) som sikrer

hurtig regulering af temperaturen og med god ventilation ( 1 )

35 Elektrisk opvarmet justerbart vakuumtoslashrreskab med oliepumpe som enten er forsynet med en anordning til tilfoslashrsel af toslashrret varmluft eller med et toslashrremiddel (feks calciumoxid)

36 Ekssikkator med tyk perforeret plade af metal eller porcelaelign indeholshydende et virksomt toslashrringsmiddel

4 Fremgangsmaringde

NB De under dette punkt beskrevne arbejdsgange skal udfoslashres straks efter aringbningen af de pakninger som indeholder proslashverne Analyserne skal foretages mindst to gange

B


( 1 ) Til toslashrring af korn mel gryn og grutning skal toslashrreskabet have en saringdan varmekapacitet at det naringr det er indstillet paring en temperatur paring 131

o C igen naringr op paring denne temperatur paring mindre end 45 minutter efter at det maksimale antal proslashver som skal toslashrres samtidig er sat ind i skabet Ventilationen skal vaeligre af en saringdan beskaffenhed at hvis samtlige proslashver af bloslashd hvede som skabet kan rumme toslashrres samtidig i to timer maring resultaterne sammenlignet med de efter 4 timers toslashrring opnaringede resultater hoslashjst afvige med 015

41 Klargoslashring

411 F o d e r b o r t s e t f r a d e t u n d e r p u n k t 4 1 2 o g 4 1 3 n aelig v n t e

Der udtages mindst 50 g af proslashven som mdash om noslashdvendigt mdash formales eller neddeles paring fornoslashden vis for at undgaring varierende fugtighedsgrader (se punkt 6)

412 K o r n o g g r y n

Der udtages mindst 50 g af proslashven Den formales saring kornstoslashrrelsen ved sigtning med masker paring 05 mm tillader passage af mindst 50 og at der ved sigtning med runde masker paring 1 mm bliver hoslashjst 10 tilbage

413 F l y d e n d e e l l e r g r oslash d a g t i g t f o d e r f o d e r o v e r v e j e n d e b e s t aring e n d e a f f e d t

Der udtages ca 25 g af proslashven afvejet med 10 mg noslashjagtighed som blandes med en tilsvarende maeligngde vandfrit sand afvejet med 10 mg noslashjagtighed indtil der fremkommer en homogen vare

42 Toslashrring


Et vejekar med laringg (33) vejes med 1 mg noslashjagtighed Ca 5 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed i det tarerede kar og fordeles jaeligvnt Karret stilles efter aftagning af laringget ind i et til 103

o C opvarmet toslashrreshyskab For at temperaturen i toslashrreskabet ikke skal falde for staeligrkt skal karret stilles hurtigt ind i skabet Der toslashrres i 4 timer idet toslashrringstiden regnes fra det tidspunkt hvor temperaturen i toslashrreskabet atter er kommet op paring 103

o C Efter aringbning af toslashrreskabet lukkes karret med laringget tages ud af skabet henstilles til afkoslashling i 30-45 minutter i ekssikkatoren (36) og vejes derefter med 1 mg noslashjagtighed

For proslashver af foder overvejende bestaringende af fedt foretages yderligere en toslashrring paring 30 minutter i toslashrreskabet ved 130

o C Forskellen mellem de to vejeresultater maring ikke overstige 01 vandindhold

422 K o r n m e l g r y n o g g r u t n i n g

Et vejekar med laringg (33) vejes med 05 mg noslashjagtighed Ca 5 g af den formalede proslashve afvejes med 1 mg noslashjagtighed i det tarerede kar og fordeles jaeligvnt Karret stilles efter aftagning af laringget ind i et til 130

o C opvarmet toslashrreskab For at temperaturen i toslashrreskabet ikke skal falde for staeligrkt skal karret stilles hurtigt ind i skabet Der toslashrres i 2 timer idet toslashrringstiden regnes fra det tidspunkt hvor temperaturen i toslashrreskabet atter er kommet op paring 130

o C Efter aringbning af toslashrreskabet lukkes karret med laringget tages ud af skabet henstilles til afkoslashling i 30ndash45 minutter i ekssikkatoren (36) og vejes derefter med 1 mg noslashjagtighed

423 Foderblandinger indeholdende mere end 4 saccharose eller lactose fodermidler saringsom johannesbroslashdskraring hydrolyserede kornprodukter maltshyspirer sukkerroesnitter fiskepressevand og sukker samt foderblandinger med mere end 25 mineralske salte inkl krystalvand

Et vejekar med laringg (33) vejes med 05 mg noslashjagtighed Ca 5 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed i det tarerede kar og fordeles jaeligvnt Karret stilles efter aftagning af laringget ind i et til 80-85

o C opvarmet vakuumtoslashrreskab (35) For at temperaturen i toslashrreskabet ikke skal falde for staeligrkt skal karret stilles hurtigt ind i skabet

Trykket indstilles til 100 torr og proslashven toslashrres i 4 timer ved dette tryk enten under tilfoslashrsel af varm toslashr luft eller ved hjaeliglp af et toslashrringsmiddel (ca 300 g til 20 proslashver) I sidstnaeligvnte tilfaeliglde afbrydes forbindelsen til

B


vakuumpumpen saring snart det foreskrevne tryk er naringet Toslashrringstiden regnes fra det tidspunkt hvor temperaturen i toslashrreskabet atter er kommet op paring 80ndash85

o C Efter toslashrringstidens udloslashb bringes toslashrreskabet forsigtigt op paring atmosfaeligrisk tryk Efter aringbning af toslashrreskabet lukkes karret straks med laringget tages ud af skabet henstilles til afkoslashling i 30ndash45 minutter i ekssikkatoren (36) og vejes derefter med 1 mg noslashjagtighed Der toslashrres i yderligere 30 minutter under vakuum i toslashrreshyskabet ved 80ndash85

o C og derefter vejes paring ny Forskellen mellem de to vejeresultater maring ikke overstige 01 vandindhold

43 Fortoslashrring

431 F o d e r b o r t s e t f r a d e t u n d e r p u n k t 4 3 2 n aelig v n t e

Fast foder med hoslashjt vandindhold og hvis formaling er vanskelig skal fortoslashrres som foslashlger

50 g af den ikke-formalede proslashve (om noslashdvendigt foretages en grov neddeling af presset eller klumpet foder) afvejes med 10 mg noslashjagtighed i en egnet beholder (f eks en aluminiumskaringl paring 20 times 12 cm med en kant paring 05 cm) Der toslashrres i toslashrreskab ved 60-70

o C indtil vandindshyholdet er reduceret til mellem 8 og 12 Beholderen tages ud af toslashrreshyskabet og henstilles utildaeligkket til afkoslashling i laboratoriet i 1 time hvorshyefter der vejes med 10 mg noslashjagtighed Alt efter foderets art foretages som beskrevet i punkt 411 derefter straks en formaling og der toslashrres som beskrevet i punkt 421 eller 423

432 K o r n

Korn med et vandindhold paring over 17 skal fortoslashrres som foslashlger

50 g af de ikke-formalede korn afvejes med 10 mg noslashjagtighed i en egnet beholder (f eks en aluminiumskaringl paring 20 times 12 cm med en kant paring 05 cm) og toslashrres i toslashrreskab i 5-7 minutter ved 130

o C hvorefter proslashven tages ud af toslashrreskabet Proslashven henstilles utildaeligkket til afkoslashling i laboshyratoriet i 2 timer hvorefter der vejes med 10 mg noslashjagtighed Straks efter formales som beskrevet i punkt 412 og toslashrres som beskrevet i punkt 422

5 Beregning af resultater

Proslashvens vandindhold (X) i procent beregnes efter foslashlgende formler

51 Toslashrring uden fortoslashrring

X frac14 ethm Auml m 0 THORN m Uuml 100

hvor

m = proslashvens begyndelsesvaeliggt i gram m 0 = den toslashrre proslashves vaeliggt i gram

52 Toslashrring med fortoslashrring

X p frac14 Iuml ethm 2 Auml m 0 THORN Uuml m 1 m 2

thorn m Auml m 1 B Uuml 100 m frac14 100 Uuml Iacute

1 Auml m 1 Uuml m 0 m Uuml m 2

Icirc

hvor

m = proslashvens begyndelsesvaeliggt i gram m 1 = proslashvens vaeliggt i gram efter fortoslashrring m 2 = proslashvens vaeliggt i gram efter formaling m 0 = den toslashrre proslashves vaeliggt i gram

B


53 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ikke overstige 02 vandindhold i absolut vaeligrdi

6 Bemaeligrkning

Hvis det viser sig at vaeligre noslashdvendigt med formaling og der i den forbindelse maring paringregnes en aeligndring af materialets vandindhold skal analyseresultaterne for foderets bestanddele korrigeres i overensstemshymelse med originalproslashvens vandindhold

B BESTEMMELSE AF VANDINDHOLDET I ANIMALSK OG VEGETABILSK FEDT


Denne metode goslashr det muligt at bestemme animalske og vegetabilske fedtstoffers og oliers vandindhold (vand og flygtige stoffer)

2 Princip

Proslashven toslashrres ved 103 degC indtil vaeliggten ikke mere formindskes (vaeliggtshytabet mellem to paring hinanden foslashlgende vejninger maring hoslashjst vaeligre paring 1 mg) Vaeliggttabet bestemmes ved vejning

3 Apparatur

31 Fladbundet beholder af korrosionsbestandigt materiale diameter 8-9 cm hoslashjde ca 3 cm

32 Termometer med forstaeligrket kugle og udvidelsesrum i den oslashverste ende inddelt i grader fra ca 80 degC til mindst 110 degC laeligngde ca 10 cm

33 Sandbad eller elektrisk varmeplade

34 Ekssikkator indeholdende et effektivt toslashrremiddel

35 Analysevaeliggt

4 Fremgangsmaringde

Ca 20 g af den homogeniserede proslashve afvejes med 1 mg noslashjagtighed i den toslashrre tarerede beholder (31) hvori termometret (32) er anbragt Proslashven opvarmes paring sandbadet eller varmepladen (33) under stadig omroslashring med termometret saring den naringr en temperatur paring 90 degC i loslashbet af ca 7 minutter

Varmen daeligmpes efter den hyppighed med hvilken boblerne stiger op fra beholderens bund Temperaturen maring ikke overstige 105 degC Bliv ved med at roslashre og skrabe bunden indtil der ikke dannes flere bobler

For at sikre at fugtigheden helt er fjernet gentages opvarmningen til 103 degC plusmn 2 deg flere gange med afkoslashling til 93 degC mellem de paring hinanden foslashlgende opvarmninger Derefter henstilles til afkoslashling til rumtemperatur i ekssikkatoren (34) og vejes Denne proces gentages indtil vaeliggttabet mellem to afvejninger ikke overstiger 2 mg

NB Hvis proslashvens vaeliggt oslashges efter gentagne opvarmninger er dette tegn paring oxidering af fedtstoffet I saring fald beregnes resultatet af den afvejning der er blevet foretaget umiddelbart inden vaeliggtforoslashgelsen begyndte


Proslashvens vandindhold (X) i procent beregnes efter foslashlgende formel

X frac14 ethm 1 Auml m 2 THORN Uuml 100 m

B


hvor

m = proslashvens vaeliggt i gram m 1 = beholderens og indholdets vaeliggt i gram inden opvarmning m 2 = beholderens og indholdets vaeliggt i gram efter opvarmning

Resultater paring under 005 opfoslashres som raquomindre end 005 laquo

Repeterbarhed


C BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF RAringPROTEIN


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af raringprotein i foder paring basis af nitrogenindholdet (Kjeldahls metode)

2 Princip

Proslashven destrueres med svovlsyre under tilstedevaeligrelse af en katalysator Syreoploslashsningen goslashres alkalisk med en natriumhydroxidoploslashsning Ammoniakken destilleres og opsamles i en noslashjagtigt afmaringlt maeligngde svovlsyre idet den overskydende maeligngde svovlsyre titreres med en standardnatriumhydroxidoploslashsning

Alternativt destilleres den frigjorte ammoniak i et overskud af borsyshyreoploslashsning hvorefter der titreres med en saltsyre- eller svovlsyreoploslashsshyning

3 Reagenser

31 Kaliumsulfat

32 Katalysator kobber(II)oxid (CuO) eller kobber(II)sulfatpentahydrat (CuSO 4 5H 2 O)

33 Granuleret zink

34 Svovlsyre ρ20 = 184 gml

35 Svovlsyre standardoploslashsning c(H 2 SO 4 ) = 025 molliter



38 Indikator af methylroslashdt 300 mg methylroslashdt oploslashses i 100 ml ethanol σ = 95-96 (vv)

39 Natriumhydroxidoploslashsning (teknisk kvalitet kan bruges) β = 40 g100 ml (mv 40 )

310 Natriumhydroxid standardoploslashsning c(NaOH) = 025 molliter


312 Granuleret pimpsten vasket i saltsyre og udgloslashdet

313 Acetanilid (smeltepunkt = 114 o C N-indhold = 1036 )

314 Saccharose (nitrogenfri)

315 Borsyre (H 3 BO 3 )

316 Indikatoroploslashsning af methylroslashdt 100 mg methylroslashdt oploslashses i 100 ml ethanol eller methanol

B


317 Oploslashsning af bromcresolgroslashnt 100 mg bromcresolgroslashnt oploslashses i 100 ml ethanol eller methanol

318 Borsyreoploslashsning (10ndash40 gliter afhaeligngigt af det anvendte apparatur)

Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse skal borsyreoploslashsninshygerne tilfoslashres methylroslashdt- og bromcresolgroslashntindikatorer Fremstilles 1 liter borsyreoploslashsning tilsaeligttes der inden tilpasning af volumen 7 ml indikatoroploslashsning af methylroslashdt (316) og 10 ml oploslashsning af bromshycresolgroslashnt (317)

Borsyreoploslashsningens pH-vaeligrdi vil kunne variere fra batch til batch afhaeligngigt af vandet der bruges Det vil ofte vaeligre noslashdvendigt at justere med en lille maeligngde alkali for at opnaring en positiv blindproslashve

NB En god justering opnarings normalt ved at tilsaeligtte ca 3ndash4 ml NaOH (311) til 1 liter borsyreoploslashsning paring 10 gliter Oploslashsningen opbeshyvares ved rumtemperatur og beskyttes under opbevaringen mod lys og ammoniakdampe

319 Standardsaltsyreoploslashsning c(HCl) = 010 molliter

NB Der kan anvendes oploslashsninger i andre koncentrationer (35 36 37 310 311 og 319) forudsat at der korrigeres herfor i beregninshygerne Koncentrationen skal altid angives med fire decimaler

4 Apparatur

Apparat egnet til destruktion destillation og titrering efter Kjeldahls metode

5 Fremgangsmaringde

51 Destruktion

1 g af proslashven afvejes med 0001 g noslashjagtighed og overfoslashres til destrukshytionskolben Der tilsaeligttes 15 g kaliumsulfat (31) en passende maeligngde katalysator (32) (03ndash04 g kobber(II)oxid eller 09ndash12 g kobber(II)sulshyfatpentahydrat) 25 ml svovlsyre (34) og eventuelt nogle faring korn pimpshysten (312) og blandes

Kolben opvarmes forsigtigt i begyndelsen og omrystes om noslashdvendigt af og til forsigtigt indtil proslashven er forkullet og skummet forsvundet Derefter opvarmes kraftigere indtil vaeligsken koger jaeligvnt Opvarmningen er tilstraeligkkelig hvis den kogende syre fortaeligtter sig paring kolbens vaeligg Det maring forhindres at siderne bliver overophedet og at organiske partikler klaeligber til dem

Naringr oploslashsningen bliver klar og lysegroslashn fortsaeligttes kogningen i ydershyligere to timer Derefter henstilles kolben til afkoslashling

52 Destillation

Der tilsaeligttes forsigtigt tilstraeligkkeligt vand til at sulfaterne oploslashses fuldshystaeligndigt Kolben henstaringr til afkoslashling hvorefter der om noslashdvendigt tilsaeligttes nogle faring zinkkorn (33) Der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 521 eller 522

521 D e s t i l l a t i o n i s v o v l s y r e

I destillationsapparatets opsamlingskolbe anbringes en noslashjagtigt afmaringlt maeligngde paring 25 ml svovlsyre (35 eller 37) afhaeligngigt af det formodede nitrogenindhold Der tilsaeligttes nogle faring draringber indikator af methylroslashdt (38)

B


Destruktionskolben forbindes med destillationsapparatets svaler og svalerens nederste del nedsaelignkes i vaeligsken i opsamlingskolben til en dybde af mindst 1 cm (se bemaeligrkning 83) 100 ml natriumhydroxidopshyloslashsning (39) overfoslashres forsigtigt til destruktionskolben uden at der mistes ammoniak (se bemaeligrkning 81) Kolben opvarmes indtil ammoshyniakken er destilleret over

522 D e s t i l l a t i o n i b o r s y r e

Foretages titreringen af destillatets ammoniakindhold manuelt foslashlges den nedenfor beskrevne fremgangsmaringde Er destillationsenheden fuldt automatiseret saring ogsaring titreringen af destillatets ammoniakindhold sker automatisk foslashlges brugsanvisningen til destillationsenheden

En opsamlingskolbe med 25-30 ml af borsyreoploslashsningen (318) anbringes under svalerens afloslashbsaringbning saringledes at tilfoslashrselsroslashret befinder sig under overfladen i den overskydende borsyreoploslashsning Destillationsshyenheden indstilles til at give 50 ml natriumhydroxidoploslashsning (39) Destillationsenheden betjenes i overensstemmelse med brugsanvisninshygen og den ammoniak der er frigivet ved tilfoslashrslen af natriumhydroxishydoploslashsningen afdampes Destillatet opsamles i forlaget med borsyre Destillatmaeligngden (dampdestillationstiden) afhaelignger af maeligngden af nitrogen i proslashven Brugsanvisningen foslashlges

NB I en halvautomatisk destillationsenhed sker tilfoslashrslen af overskyshydende natriumhydroxid samt dampdestillationen automatisk

53 Titrering

Der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 531 eller 532

531 S v o v l s y r e

Den overskydende svovlsyre i opsamlingskolben titreres med natriumhyshydroxidoploslashsning (310 eller 311) afhaeligngigt af koncentrationen af den anvendte svovlsyre indtil aeligkvivalenspunktet er naringet

532 B o r s y r e

Med en burette titreres opsamlingskolbens indhold med standardsaltsyshyreoploslashsningen (319) eller med standardsvovlsyreoploslashsningen (36) og den anvendte titrantmaeligngde aflaeligses

Anvendes kolorimetrisk endpointbestemmelse er aeligkvivalenspunktet naringet ved det foslashrste tegn paring pinkfarvning af indholdet Buretteaflaeligsningen anslarings med 005 ml noslashjagtighed En oplyst magnetisk omroslashrerplade eller en fotometrisk detektor vil kunne lette visualiseringen af aeligkvivashylenspunktet

Processen kan goslashres automatisk ved anvendelse af en dampdestillationsshyenhed med automatisk titrering

Brugsanvisningen til den enkelte destillationsenhed eller destillationsshyenhedtitrator foslashlges

NB Anvendes et automatisk titreringssystem begynder titreringen umidshydelbart efter at destillationen er begyndt og borsyreoploslashsningen paring 1 (318) anvendes

B


Goslashres der brug af en fuldautomatisk destillationsenhed kan den automatiske titrering af ammoniakken ogsaring foretages med endpointshybestemmelse idet der saring anvendes et potentiometrisk pH-system

I dette tilfaeliglde anvendes en automatisk titrator med pH-meter pH-metret skal vaeligre korrekt kalibreret i omraringdet pH 4-pH 7 i overshyensstemmelse med almindelige laboratorie-pH-kalibreringsprocedushyrer

pH-titreringsaeligkvivalenspunktet narings ved en pH-vaeligrdi paring 46 som er det sted paring titreringskurven hvor haeligldningen er stejlest

54 Blindproslashve

For at sikre at reagenserne er nitrogenfrie foretages der en blindproslashve (destruktion destillation og titrering) ved brug af 1 g saccharose (314) i stedet for proslashven


Beregningerne foretages som beskrevet i punkt 61 eller 62

61 Titreringsberegning jf 531

Indholdet af raringprotein udtrykt i vaeliggtprocent beregnes efter foslashlgende formel

ethV 0 Auml V 1 THORN Uuml c Uuml 0014 Uuml 100 Uuml 625 m

hvor

V o = maeligngde (ml) NaOH (310 eller 311) forbrugt i blindproslashven V 1 = maeligngde (ml) NaOH (310 eller 311) forbrugt ved titreringen af

proslashven c = koncentration (molliter) af natriumhydroxid (310 eller 311) m = proslashvens vaeliggt i gram


621 T i t r e r i n g m e d s a l t s y r e


ethV 1 Auml V 0 THORN Uuml c Uuml 14 Uuml 625 m

hvor

m = testportionens vaeliggt i gram c = koncentration (molliter) af standardsaltsyreoploslashsningen (319) V 0 = maeligngde (ml) saltsyre anvendt i blindproslashven V 1 = maeligngde (ml) saltsyre anvendt i testportionen

622 T i t r e r i n g m e d s v o v l s y r e



B


hvor

m = testportionens vaeliggt i gram c = koncentration (molliter) af standardsvovlsyreoploslashsningen (36) V 0 = maeligngde (ml) svovlsyre (36) anvendt i blindproslashven V 1 = maeligngde (ml) svovlsyre (36) anvendt i testportionen

7 Kontrol af metoden

71 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ikke overstige

mdash 02 i absolut vaeligrdi for raringproteinindhold paring under 20

mdash 10 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for raringproteinindhold paring 20ndash40

mdash 04 i absolut vaeligrdi for raringproteinindhold paring over 40

72 Noslashjagtighed

Analysen (destruktion destillation og titrering) foretages paring 15ndash20 g acetanilid (313) under tilstedevaeligrelse af 1 g saccharose (314) 1 g acetanilid kraeligver 1480 ml svovlsyre (35) Genfindingsprocenten skal vaeligre mindst 99

8 Bemaeligrkninger

81 Apparaturet kan vaeligre manuelt halvautomatisk eller automatisk Hvis apparaturet kraeligver overfoslashrsel mellem destruktions- og destillationstrinet skal saringdan overfoslashrsel kunne ske uden tab Hvis destillationsapparatets kolbe ikke har skilletragt tilsaeligttes natriumhydroxiden lige inden kolben forbindes med svaleren idet vaeligsken haeligldes langsomt ned langs siden

82 Hvis destruktionsproduktet stoslashrkner gentages bestemmelsen med brug af en stoslashrre maeligngde svovlsyre (34) end angivet ovenfor

83 For produkter med lavt nitrogenindhold kan maeligngden af svovlsyre (37) der skal bruges i opsamlingskolben om noslashdvendigt mindskes til 10 eller 15 ml og fyldes op med vand til 25 ml

84 Til rutineanalyser kan der anvendes alternative analysemetoder til bestemmelse af raringprotein men Kjeldahls metode som beskrevet her i del C er referencemetoden Det skal for hver enkelt matrix godtgoslashres at de resultater der opnarings med den alternative metode (feks DUMAS) svarer til dem der opnarings med referencemetoden Eftersom resultaterne der opnarings med en alternativ metode kan afvige en smule fra de resulshytater der opnarings med referencemetoden selv efter aeligkvivalenskontrol er det noslashdvendigt i analyserapporten at angive hvilken analysemetode der er anvendt til bestemmelse af raringprotein

D BESTEMMELSE AF URINSTOF


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af urinstof i foder

B


2 Princip

Proslashven opslaeligmmes i vand under tilsaeligtning af et klaringsmiddel Suspenshysionen filtreres Filtratets indhold af urinstof bestemmes efter tilsaeligtning af 4-dimethylaminobenzaldehyd (4-DMAB) ved maringling af ekstinktionen ved en boslashlgelaeligngde paring 420 nm

3 Reagenser

31 4-Dimethylaminobenzaldehydoploslashsning 16 g 4-DMAB oploslashses i 100 ml 96 ethanol og der tilsaeligttes 10 ml saltsyre (ρ 20 = 119 gml) Dette reagens kan hoslashjst holde sig i to uger

32 Carrez-reagens I 219 g zinkacetat Zn(CH 3 COO) 2 2H 2 O og 3 g isedshydike oploslashses i vand Der fyldes op med vand til 100 ml

33 Carrez-reagens II 106 g kaliumferrocyanid K 4 Fe(CN) 6 3H 2 O oploslashses i vand Der fyldes op med vand til 100 ml

34 Aktivt kul der ikke absorberer urinstoffet (skal kontrolleres)

35 Urinstof 01 oploslashsning (wv)

4 Apparatur

41 Mekanisk rysteapparat ca 35ndash40 omdrejninger i minuttet

42 Reagensglas 160 times 16 mm med slibprop

43 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde

51 Analyse af proslashven

2 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed og kommes sammen med 1 g aktivt kul (34) i en 500 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 400 ml vand og 5 ml Carrez-reagens I (32) og blandes i ca 30 sekunder hvorefter der tilsaeligttes 5 ml Carrez-reagens II (33) Vaeligsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet Der fyldes op med vand til maeligrket omrystes og filtreres

5 ml af de klare og farveloslashse filtrater udtages med pipette og haeligldes i reagensglassene med slibprop hvorefter der tilsaeligttes 5 ml 4-DMAB- oploslashsning (31) og blandes Glassene anbringes i vandbad ved 20

o C (+- 4

o C) Efter 15 minutter maringles ekstinktionen i proslashveoploslashsningen i spektrofotometret ved 420 nm ved sammenligning med reagensernes blindproslashveoploslashsning

52 Kalibreringskurve

Der udtages volumener paring 1 2 4 5 og 10 ml af urinstofoploslashsningen (35) disse haeligldes i 100 ml maringlekolber og der fyldes op med vand til maeligrket Der udtages 5 ml af hver oploslashsning hver af dem tilsaeligttes 5 ml 4-DMAB-oploslashsning (31) der homogeniseres og ekstinktionen maringles som angivet ovenfor ved sammenligning med en kontroloploslashsning som indeholder 5 ml 4-DMAB og 5 ml vand uden urinstof Kalibreringsshykurven tegnes


Bestem maeligngden af urinstof i proslashven ved benyttelse af kalibreringskurven

Resultatet angives i procent af proslashven

7 Bemaeligrkninger

71 Hvis indholdet af urinstof er stoslashrre end 3 reduceres analyseproslashven til 1 gram eller den oprindelige oploslashsning fortyndes saring meget at der ikke er mere end 50 mg urinstof i 500 ml

B


72 Hvis indholdet af urinstof er ringe foroslashges proslashvens volumen i det omfang filtratet vedbliver at vaeligre klart og farveloslashst

73 Hvis proslashven indeholder simple kvaeliglstofforbindelser som for eksempel aminosyrer foretages maringlingen af ekstinktionen ved 435 nm

E BESTEMMELSE AF FLYGTIGE KVAEligLSTOFHOLDIGE BASER

I BESTEMMELSE VED MIKRODIFFUSION


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvaeliglshystofholdige baser udtrykt som ammoniak i foder

2 Princip

Proslashven ekstraheres med vand og oploslashsningen klares og filtreres De flygtige kvaeliglstofholdige baser udskilles efter tilsaeligtning af kaliumcarboshynatoploslashsning ved mikrodiffusion opfanges i en borsyreoploslashsning og titreres med svovlsyre

3 Reagenser

31 Trichloreddikesyre 20 oploslashsning (wv)

32 Indikator 33 mg bromcresolgroslashnt og 65 mg methylroslashdt oploslashses i 100 ml ethanol 95ndash96 (vv)

33 Borsyreoploslashsning 10 g borsyre oploslashses i en 1 liter maringlekolbe indeholshydende 200 ml ethanol 95ndash96 (vv) og 700 ml vand 10 ml af indishykatoren (32) tilsaeligttes Oploslashsningen blandes og bringes om noslashdvendigt under tilsaeligtning af natriumhydroxidoploslashsning til at antage en lyseroslashd farve 1 ml af denne oploslashsning kan binde op til 300 μg NH 3

34 Maeligttet kaliumcarbonatoploslashsning 100 g kaliumcarbonat oploslashses i 100 ml kogende vand Efter afkoslashling filtreres oploslashsningen

35 Svovlsyre 001 molliter

4 Apparatur


42 Conwayskaringle (se skitse) af glas eller plastic

43 Mikroburetter inddelt i 1100 ml

5 Fremgangsmaringde

10 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml maringlekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet Der tilsaeligttes 50 ml trichloreddikesyreoploslashsning (31) fyldes op med vand til maeligrket omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter

1 ml borsyreoploslashsning (33) afpipetteres i Conwayskaringlens midte hvorshyefter 1 ml af proslashvefiltratet overfoslashres til skaringlens ring Skaringlen tildaeligkkes delvist med det let indfedtede laringg 1 ml af den maeligttede kaliumcarbonashytoploslashsning (34) kommes hurtigt ned i ringen og skaringlen lukkes saring den er lufttaeligt Skaringlen drejes forsigtigt i vandret stilling saring de to reagenser blandes Der inkuberes i mindst 4 timer ved rumtemperatur eller i 1 time ved 40

o C

De i borsyreoploslashsningen indeholdte flygtige baser titreres derefter med svovlsyre (35) ved anvendelse af en mikroburette (43)

Paring samme maringde udfoslashres en blindproslashve under udeladelse af analyseproslashshyven

B



1 ml 001 molliter svovlsyre svarer til 034 mg ammoniak


Repeterbarhed


mdash 10 i relativ vaeligrdi ved indhold paring mindre end 10 ammoniak

mdash 01 i absolut vaeligrdi ved indhold paring 10 ammoniak og derover

7 Bemaeligrkning

Har proslashven et indhold paring mere end 06 ammoniak fortyndes det oprindelige filtrat

B


II BESTEMMELSE VED DESTILLATION


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af flygtige kvaeliglshystofholdige baser udtrykt som ammoniak i fiskemel som praktisk talt ikke indeholder urinstof Metoden anvendes kun ved indhold paring mindre end 025 ammoniak

2 Princip

Proslashven ekstraheres med vand og oploslashsningen klares og filtreres De flygtige kvaeliglstofholdige baser udskilles efter tilsaeligtning af magnesiushymoxid ved kogetemperatur og opfanges i en bestemt maeligngde svovlsyre idet den overskydende maeligngde svovlsyre tilbagetitreres med en natriumshyhydroxidoploslashsning

3 Reagenser


32 Magnesiumoxid

33 Skumdaeligmpende emulsion (feks silikone)


35 Natriumhydroxidoploslashsning 01 molliter

36 Methylroslashdtoploslashsning 03 i 95ndash96 (vv) ethanol

4 Apparatur


42 Destillationsapparatur af Kjeldahl-typen

5 Fremgangsmaringde

10 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed og kommes sammen med 100 ml vand i en 200 ml maringlekolbe og blandes eller omrystes i 30 minutter i rysteapparatet Der tilsaeligttes 50 ml trichloreddikesyreoploslashsning (31) fyldes op med vand til maeligrket omrystes kraftigt og filtreres gennem et foldefilter

Afhaeligngigt af det formodede indhold af flygtige kvaeliglstofholdige baser udtages en maeligngde af det klare filtrat (normalt 100 ml) Det fortyndes til 200 ml og der tilsaeligttes 2 g magnesiumoxid (32) samt nogle faring draringber skumdaeligmpende emulsion (33) Oploslashsningen skal reagere alkashylisk over for lakmuspapir i modsat fald tilsaeligttes yderligere magnesiushymoxid (32) Der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 52 og 53 for analysemetoden til bestemmelse af indholdet af raringprotein (del C i dette bilag)





Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ikke overstige 10 ammoniak i relativ vaeligrdi

F BESTEMMELSE AF AMINOSYRER (BORTSET FRA TRYPTshyOPHAN)


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af frie (syntetiske og naturlige) og totale (peptidbundne og frie) aminosyrer i foder ved

B


brug af en aminosyreanalysator Metoden kan anvendes til foslashlgende aminosyrer cyst(e)in methionin lysin threonin alanin arginin asparashyginsyre glutaminsyre glycin histidin isoleucin leucin phenylalanin prolin serin tyrosin og valin

Metoden skelner ikke mellem salte af aminosyrer og kan ikke differenshytiere mellem D- og L-former af aminosyrer Den er ikke anvendelig til bestemmelse af tryptophan- eller hydroxyanaloger af aminosyrer

2 Princip

21 Frie aminosyrer

Frie aminosyrer ekstraheres med fortyndet saltsyre Kvaeliglstofholdige makromolekyler der ekstraheres samtidig udfaeligldes med sulfosalicylsyre og fjernes ved filtrering Den filtrerede oploslashsnings pH-vaeligrdi justeres til 220 Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk paringvisning ved 570 nm

22 Totale aminosyrer

Den valgte metode afhaelignger af de aminosyrer der skal undersoslashges Cyst(e)in og methionin skal oxideres til henholdsvis cysteinsyre og methioninsulfon inden hydrolyse Tyrosin skal bestemmes i hydrolysater af uoxiderede proslashver Alle de oslashvrige aminosyrer der er naeligvnt i punkt 1 kan bestemmes i enten den oxiderede eller den uoxiderede proslashve

Oxidering sker ved 0 o C med en phenolholdig permyresyre Overskyshy

dende oxideringsreagens destrueres med natriumdisulfit Den oxiderede eller uoxiderede proslashve hydrolyseres med saltsyre (320) i 23 timer Hydrolysatets pH-vaeligrdi justeres til 220 Aminosyrerne adskilles ved ionbytningskromatografi og bestemmes ved reaktion med ninhydrin ved fotometrisk paringvisning ved 570 nm (440 nm for prolin)

3 Reagenser

Der skal anvendes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne lt 10 μS)

31 Hydrogenperoxid w (wv) = 30

32 Myresyre w (wv) = 98ndash100

33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid

36 5-Sulfosalicylsyre-dihydrat

37 Saltsyre massefylde ca 118 gml

38 Tri-natriumcitrat-dihydrat

39 22-Thiodiethanol (thiodiglycol)

310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin

312 Petroleumsether kogepunktsinterval 40ndash60 o C

313 Norleucin eller anden forbindelse der er egnet til brug som intern standard

B


314 Nitrogengas (lt 10 ppm oxygen)

315 1-Octanol

316 Aminosyrer

3161 Standardstoffer som anfoslashrt i punkt 1 Rene forbindelser der ikke indeshyholder krystalvand Toslashrres under vakuum over P 2 0 5 eller H 2 SO 4 i 1 uge inden brug

3162 Cysteinsyre

3163 Methioninsulfon

317 Natriumhydroxidoploslashsning c = 75 molliter

300 g NaOH (35) oploslashses i vand og der fyldes op til 1 liter



319 Phenolholdig myresyreoploslashsning

889 g myresyre (32) blandes med 111 g vand og der tilsaeligttes 473 g phenol (33)

320 Hydrolyseblanding c = 6 mol HClliter indeholdende 1 g phenolliter

Der tilsaeligttes 1 g phenol (33) til 492 ml HCl (37) og fyldes op med vand til 1 liter

321 Ekstraktionsoploslashsning c = 01 mol HClliter indeholdende 2 thiodigshylycol 82 ml HCl (37) oploslashses i ca 900 ml vand hvorefter der tilsaeligttes 20 ml thiodiglycol (39) og fyldes op med vand til 1 liter (37 og 39 maring ikke blandes direkte)

322 5-Sulfosalicylsyreoploslashsning szlig = 6

60 g 5-sulfosalicylsyre (36) oploslashses i vand og der fyldes op med vand til 1 liter

323 Oxideringsreagens (permyresyre-phenol)

05 ml hydrogenperoxid (31) blandes med 45 ml phenolholdig myresyshyreoploslashsning (319) i et lille baeliggerglas Inkuberes ved 20ndash30

o C i 1 time for at danne permyresyre Herefter afkoslashles oploslashsningen i isbad (15 minutter) inden den tilsaeligttes proslashven

Advarsel Undgaring kontakt med huden og baeligr beskyttelsesbeklaeligdning

324 Citratbuffer c = 02 mol Na + liter pH 220

1961 g natriumcitrat (38) 5 ml thiodiglycol (39) 1 g phenol (33) og 1650 ml HCl (37) oploslashses i ca 800 ml vand pH justeres til 220 Der fyldes op med vand til 1 liter

325 Elueringsbuffere fremstillet ifoslashlge betingelserne for den benyttede analysator (49)

326 Ninhydrinreagens fremstillet ifoslashlge betingelserne for den benyttede analysator (49)

327 Standardoploslashsninger af aminosyrer Oploslashsningerne opbevares ved lt 5

o C

B


3271 Standardstamoploslashsning af aminosyrer (3161)

c = 25 μmolml af hver i saltsyre

Kan farings i handelen

3272 Standardstamoploslashsning af cysteinsyre og methioninsulfon c = 125 μmolml

02115 g cysteinsyre (3162) og 02265 g methioninsulfon (3163) oploslashses i citratbuffer (324) i en 1 liter maringlekolbe og der fyldes op til maeligrket med citratbuffer Oploslashsningen opbevares ved lt 5

o C i hoslashjst 12 maringneder Denne oploslashsning benyttes ikke hvis standardstamoploslashsningen (3271) indeholder cysteinsyre og methioninsulfon

3273 Standardstamoploslashsning af den interne standard feks norleucin c = 20 μmolml

06560 g norleucin (313) oploslashses i citratbuffer (324) i en maringlekolbe og der fyldes op med citratbuffer til 250 ml Oploslashsningen opbevares ved lt 5

o C i hoslashjst 6 maringneder

3274 Kalibreringsoploslashsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater c = 5 nmol50 μl cysteinsyre og methioninsulfon og c = 10 nmol50 μl af de oslashvrige aminosyrer 22 g natriumchlorid (310) oploslashses i et 100 ml baeliggerglas med 30 ml citratbuffer (324) Der tilsaeligttes 400 ml standardshystamoploslashsning af aminosyrer (3271) 400 ml standardstamoploslashsning af cysteinsyre og methioninsulfon (3272) og hvis benyttet 050 ml stanshydardstamoploslashsning af intern standard (3273) pH justeres til 220 med natriumhydroxid (318)

Oploslashsningen overfoslashres kvantitativt til en 50 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med citratbuffer (324) og blandes

Oploslashsningen opbevares ved lt 5 o C i hoslashjst 3 maringneder

Se ogsaring bemaeligrkning 91

3275 Kalibreringsoploslashsning af standardaminosyrer til brug med hydrolysater fremstillet under punkt 5331 og til brug med ekstrakter (52) Kalishybreringsoploslashsningen fremstilles efter punkt 3274 men der tilsaeligttes ikke natriumchlorid


4 Apparatur

41 100 eller 250 ml rundbundet kolbe med tilbagesvaler

42 100 ml borsilikatglasflaske med skruelaringg forsynet med gummiteflonpakshyning (feks Duran Schott) til brug i toslashrreskab

43 Toslashrreskab med motordreven ventilation og temperaturindstilling med en noslashjagtighed paring plusmn 2

o C

44 pH-meter (aflaeligsning med tre decimaler)

45 Membranfilter (022 μm)

46 Centrifuge

47 Rotationsvakuumfordamper

48 Mekanisk rysteapparat eller magnetomroslashrer

B


49 Aminosyreanalysator eller HPLC-udstyr med ionbyttekolonne anordning til ninhydrin-postkolonne-derivatisering og fotometrisk detektor

Kolonnen pakkes med sulfoneret polystyrenresin der kan adskille aminosyrerne fra hinanden og fra andre ninhydrinpositive stoffer Pumperne til buffer- og ninhydrinoploslashsningen skal i den tid der omfatter saringvel standardkalibreringskoslashrslen som proslashveanalysen have en flowstashybilitet paring plusmn05

Nogle aminosyreanalysatorer kan benyttes hvor hydrolysatet har en natriumkoncentration paring c = 08 molliter og indeholder den resterende myresyre fra oxideringstrinnet Andre analysatorer giver ikke tilfredsshystillende adskillelse af visse aminosyrer hvis hydrolysatet indeholder overskydende myresyre ogeller hoslashje natriumionkoncentrationer I saring fald reduceres syrevolumen ved inddampning til ca 5 ml efter hydroshylysen og inden pH-justeringen Inddampningen foretages under vakuum ved hoslashjst 40

o C

5 Fremgangsmaringde

51 Klargoslashring af proslashven

Proslashven formales saring den kan passere gennem en 05 mm sigte Meget fugtige proslashver skal inden formalingen enten lufttoslashrres ved hoslashjst 50

o C eller frysetoslashrres Proslashver med et hoslashjt fedtindhold ekstraheres med petroshyleumsether (312) inden formaling

52 Bestemmelse af frie aminosyrer i foder og forblandinger

En passende maeligngde (1ndash5 g) af den klargjorte proslashve (51) afvejes med en noslashjagtighed paring 02 mg i en konisk kolbe og der tilsaeligttes 1000 ml ekstraktionsoploslashsning (321) Blandingen rystes i 60 minutter paring mekashynisk rysteapparat eller magnetomroslashrer (48) Efter henstand og bundfaeligldshyning afpipetteres 100 ml af supernatanten i et 100 ml baeliggerglas

Der tilsaeligttes 50 ml sulfosalicylsyreoploslashsning (322) under omroslashring og der omroslashres fortsat med magnetomroslashrer i 5 minutter Supernatanten filtreres eller centrifugeres for at fjerne eventuelt bundfald 100 ml af den klarede oploslashsning kommes i et 100 ml baeliggerglas og pH justeres til 220 med natriumhydroxidoploslashsning (318) Oploslashsningen overfoslashres med citratbuffer (324) til en maringlekolbe af passende stoslashrrelse og der fyldes op til maeligrket med citratbufferoploslashsningen (324)

Hvis der bruges en intern standard tilsaeligttes 100 ml intern standard (3273) for hver 100 ml slutoploslashsning og der fyldes op til maeligrket med bufferoploslashsningen (324)

Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 54

Hvis ekstraktet ikke kromatograferes samme dag skal det opbevares ved lt 5

o C

53 Bestemmelse af totale aminosyrer

531 O x i d e r i n g

01ndash1 g af den klargjorte proslashve (51) afvejes med en noslashjagtighed paring 02 mg i

mdash en 100 ml rundbundet kolbe (41) til aringben hydrolyse (5323) eller

B


mdash en 250 ml rundbundet kolbe (41) hvis der kraeligves en lav natriumshykoncentration (5331) eller

mdash en 100 ml flaske med skruelaringg (42) til lukket hydrolyse (5324)

Den afvejede proslashveportion skal have et kvaeliglstofindhold paring ca 10 mg og et vandindhold paring hoslashjst 100 mg

Kolbenflasken anbringes i isbad og nedkoslashles til 0 o C hvorefter der

tilsaeligttes 5 ml oxideringsblanding (323) og omroslashres ved hjaeliglp af en glasspatel med boslashjet spids Kolbenflasken der indeholder spatelen lukkes med lufttaeligt film Isbadet med den lukkede beholder anbringes i et koslashleskab ved 0

o C og henstaringr i 16 timer Efter 16 timer tages det ud af koslashleskabet og det overskydende oxideringsreagens destrueres ved tilsaeligtshyning af 084 g natriumdisulfit (34)

Der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 5321

532 H y d r o l y s e

5321 H y d r o l y s e a f o x i d e r e d e p r oslash v e r

Den oxiderede proslashve (531) tilsaeligttes 25 ml hydrolyseblanding (320) Alle proslashverester der maringtte sidde fast paring beholderen og spatelen skal omhyggeligt vaskes ned

Alt efter den benyttede hydrolysemetode fortsaeligttes som beskrevet i punkt 5323 eller 5324

5322 H y d r o l y s e a f u o x i d e r e d e p r oslash v e r

01ndash1 g af den klargjorte proslashve (51) afvejes med en noslashjagtighed paring 02 mg i en 100 ml eller 250 ml rundbundet kolbe (41) eller en 100 ml flaske med skruelaringg (42) Den afvejede proslashveportion skal have et kvaeliglshystofindhold paring ca 10 mg Der tilsaeligttes forsigtigt 25 ml hydrolyseblanshyding (320) som blandes med proslashven Der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 5323 eller 5324

5323 Aring b e n h y d r o l y s e

Der tilsaeligttes tre glasperler til blandingen i kolben (klargjort som beskrevet i punkt 5321 eller 5322) Den opvarmes til kogning og holdes under konstant kogning med tilbagesvaler i 23 timer Efter afslutshyning af hydrolysen skylles tilbagesvaleren med 5 ml citratbuffer (324) Kolben aftages og afkoslashles i isbad


5324 L u k k e t h y d r o l y s e

Flasken med blandingen klargjort som beskrevet i punkt 5321 eller 5322 anbringes i et toslashrreskab (43) ved 110

o C For at forhindre trykshyopbygning (paring grund af udvikling af gasser) og undgaring eksplosion laeliggges skruelaringget i den foslashrste time loslashst paring flasken Flasken maring ikke lukkes med skruelaringget Efter en times forloslashb lukkes flasken med skruelaringget og henstaringr i toslashrreskabet (43) i 23 timer Efter afslutning af hydrolysen tages flasken ud af toslashrreskabet skruelaringget aringbnes forsigtigt og kolben anbringes i isbad hvor den henstaringr til afkoslashling

Alt efter metoden for justering af pH-vaeligrdien (533) overfoslashres kolbens indhold kvantitativt med citratbuffer (324) til et 250 ml baeliggerglas eller til en 250 ml rundbundet kolbe


B


533 J u s t e r i n g a f p H - v aelig r d i e n

Alt efter aminosyreanalysatorens (49) natriumtolerance foretages justeshyringen af pH-vaeligrdien som beskrevet i punkt 5331 eller 5332

5331 F o r k r o m a t o g r a f i s y s t e m e r ( 4 9 ) d e r k r aelig v e r e n l a v n a t r i u m - k o n c e n t r a t i o n

Det er tilraringdeligt at bruge en intern standardstamoploslashsning (3273) hvis der benyttes aminosyreanalysatorer der kraeligver en lav natriumkoncenshytration (hvor syreindholdet skal reduceres)

I saring fald tilsaeligttes 200 ml af den interne standardstamoploslashsning (3273) til hydrolysatet foslashr inddampningen

Der tilsaeligttes 2 draringber 1-octanol (315) til det efter punkt 5323 eller 5324 frembragte hydrolysat

Volumen reduceres ved hjaeliglp af rotationsfordamperen (47) til 5ndash10 ml under vakuum ved 40

o C Hvis volumen ved et uheld reduceres til under 5 ml kasseres hydrolysatet og analysen gentages

pH justeres til 220 med natriumhydroxidoploslashsning (318) og der fortshysaeligttes som beskrevet i punkt 534

5332 F o r a n d r e a m i n o s y r e a n a l y s a t o r e r ( 4 9 )

Det efter 5323 eller 5324 frembragte hydrolysat neutraliseres delvis ved under omroslashring at tilsaeligtte 17 ml natriumhydroxidoploslashsning (317) samtidig med at temperaturen holdes under 40

o C

pH justeres til 220 med natriumhydroxidoploslashsning (317 og 318) ved rumtemperatur Der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 534

534 P r oslash v e o p l oslash s n i n g t i l k r o m a t o g r a f i

Hydrolysatet (5331 eller 5332) justeret til en pH-vaeligrdi paring 220 overshyfoslashres med citratbuffer (324) kvantitativt til en 200 ml maringlekolbe og der fyldes op til maeligrket med buffer (324)

Hvis en intern standard anvendes og denne ikke allerede er tilsat tilsaeligttes der 200 ml intern standard (3273) og fyldes op til maeligrket med citratbuffer (324) Der blandes omhyggeligt


Hvis proslashveoploslashsningen ikke kromatograferes samme dag skal den opbeshyvares ved lt 5

o C

54 Kromatografi

Inden kromatografi opvarmes ekstraktet (52) eller hydrolysatet (534) til rumtemperatur Blandingen rystes og en passende maeligngde filtreres gennem et 022 μm membranfilter (45) Der foretages ionbytningskroshymatografi af den fremstillede klarede oploslashsning ved brug af en aminosyshyreanalysator (49)

Indsproslashjtningen kan foretages manuelt eller automatisk Hovedsagen er at der altid tilsaeligttes samme maeligngde oploslashsning plusmn 05 til kolonnen til analyse af standardoploslashsninger og proslashveoploslashsninger undtagen i tilfaeliglde hvor der bruges en intern standard Forholdet mellem natrium og aminoshysyre i standard- og proslashveoploslashsningerne skal vaeligre saring ens som muligt

B


Kalibreringshyppigheden afhaelignger normalt af stabiliteten af ninhydrinshyreagenset og det anvendte analysatorsystem Standard- eller proslashveoploslashsshyningen fortyndes med citratbuffer (324) saringledes at der for standarden fremkommer et topareal paring 30ndash200 af arealet af toppene for aminoshysyrerne i proslashveoploslashsningen

Kromatografien af aminosyrerne vil variere lidt afhaeligngigt af den anvendte type analysator og kolonnematerialet Systemet skal kunne adskille aminosyrerne fuldstaeligndigt fra hinanden og fra oslashvrige ninhydshyrinpositive stoffer Kromatografisystemet skal i sit arbejdsomraringde give lineaeligrt respons paring aeligndringer i maeligngderne af aminosyrer der tilsaeligttes kolonnen

Hvis der analyseres en aeligkvimolaeligr oploslashsning (af de aminosyrer der skal bestemmes) skal der ved kromatografien opnarings nedenstaringende forhold mellem dal og tophoslashjde Den aeligkvimolaeligre oploslashsning skal indeholde mindst 30 af den stoslashrste maeligngde af hver aminosyre der kan maringles praeligcist med aminosyreanalysatoren (49)

Ved adskillelsen af threonin og serin maring forholdet mellem dal og tophoslashjde for den laveste af de to sammenhaeligngende aminosyretoppe ikke vaeligre stoslashrre end 210 (Hvis der kun bestemmes cyst(e)in methioshynin threonin og lysin vil utilstraeligkkelig adskillelse fra nabotoppe indvirke uheldigt paring bestemmelsen) For alle oslashvrige aminosyrer skal adskillelsen vaeligre bedre end 110

Systemet skal sikre at lysin adskilles fra artefakter fra andre lysinligshynende stoffer og ornithin


Arealet af toppene i proslashve- og standardoploslashsningerne maringles for hver enkelt aminosyre og maeligngden (X) beregnes i gram aminosyre pr kg proslashve

X frac14 A Uuml c Uuml M Uuml V B Uuml m Uuml 1 000

Ved anvendelse af en intern standard multipliceres med D C

A = topareal for hydrolysat eller ekstrakt B = topareal for standardkalibreringsoploslashsning C = topareal for intern standard i hydrolysat eller ekstrakt D = topareal for intern standard standardkalibreringsoploslashsning M = molarvaeliggt af den aminosyre der skal bestemmes c = standardoploslashsningens koncentration i μmolml m = proslashvens vaeliggt i gram (korrigeret til oprindelig vaeliggt hvis toslashrret eller

affedtet) V = ml totalhydrolysat (534) eller ml beregnet total fortyndingsvolushy

men af ekstraktet (61)

Saringvel cystin som cystein bestemmes som cysteinsyre i hydrolysater af den oxiderede proslashve men beregnes som cystin (C 6 H 12 N 2 O 4 S 2 M 24030 gmol) ved anvendelse af M 12015 gmol (= 05 times 24030 gmol)

Methionin bestemmes som methioninsulfon i hydrolysater af den oxideshyrede proslashve men beregnes som methionin ved anvendelse af M af methionin (14921 gmol)

B


Tilsat fri methionin bestemmes efter ekstraktion som methionin hvorved der benyttes samme M til beregningen

61 Totale fortyndingsvolumen af ekstrakter (F) til bestemmelse af frie aminosyrer (52) beregnes som foslashlger

F frac14 100 ml Uuml eth10 ml thorn 5 mlTHORN

10 ml Uuml V 10

V = slutekstraktets volumen

7 Evaluering af metoden

Metoden er blevet afproslashvet ved en international ringanalyse i 1990 med anvendelse af fire forskellige typer foder (svinefoderblanding slagtefjershykraeligblanding proteinkoncentrat og en forblanding) Resultaterne af middel- og standardafvigelse efter fjernelse af outliers er vist i tabellerne under dette punkt

Middelvaeligrdi i gkg

Referencemateriale Aminosyre

Threonin Cyst(e)in Methionin Lysin

Svinefoderblanshyding

694 n = 15

301 n = 17

327 n = 17

955 n = 13

Slagtefjerkraeligshyblanding

931 n = 16

392 n = 18

508 n = 18

1393 n = 16

Proteinkoncenshytrat

2232 n = 16

506 n = 17

1201 n = 17

4774 n = 15

Forblanding 5842 n = 16

mdash 9021 n = 16

9803 n = 16

n = antal deltagende laboratorier

71 Repeterbarhed

Repeterbarheden for de undersoslashgte aminosyrer udtrykt som raquostandardshyafvigelse inden for laboratorierlaquo for de ovennaeligvnte proslashver er gengivet i nedenstaringende tabel

Standardafvigelse inden for laboratorier (S r ) i gkg




013 n = 15

010 n = 17

011 n = 17

026 n = 13


020 n = 16

011 n = 18

016 n = 18

028 n = 16


048 n = 16

013 n = 17

027 n = 17

099 n = 15

Forblanding 130 n= 16

mdash 219 n = 16

206 n = 16


B


Variationskoefficient () for standardafvigelsen inden for laboratoshyrier (S r )




19 n = 15

33 n = 17

34 n = 17

28 n = 13


21 n = 16

28 n = 18

31 n = 18

21 n = 16


27 n = 16

26 n = 17

22 n = 17

24 n = 15


mdash 24 n = 16

21 n = 16


72 Reproducerbarhed

Resultaterne af standardafvigelse mellem laboratorier for ovennaeligvnte undersoslashgelser er vist i nedenstaringende skema

Standardafvigelse mellem laboratorier (S R ) i gkg




028 n = 15

030 n = 17

023 n = 17

030 n = 13


048 n = 16

034 n = 18

055 n = 18

075 n = 16


085 n = 16

062 n = 17

157 n = 17

124 n = 15


mdash 620 n = 16

662 n = 16


Variationskoefficient () for standardafvigelsen mellem laboratorier (S R )




41 n = 15

99 n = 17

70 n = 17

32 n = 13


52 n = 16

88 n = 18

109 n = 18

54 n = 16


38 n = 16

123 n = 17

130 n = 17

30 n = 15


mdash 69 n = 16

67 n = 16


B


8 Anvendelse af referencematerialer

Det undersoslashges om metoden er brugt korrekt ved at foretage gentagne maringlinger af certificerede referencematerialer naringr saringdanne forefindes Det anbefales at kalibrere med certificeret aminosyrekalibreringsoploslashsning

9 Bemaeligrkninger

91 Paring grund af forskelle mellem aminosyreanalysatorer skal slutkoncentrashytionerne af kalibreringsoploslashsningerne af standardaminosyrerne (se punkt 3274 og 3275) og hydrolysatet (se punkt 534) betragtes som en retningslinje

Apparatets lineaeligre responsskala skal kontrolleres for alle aminosyrer

Standardoploslashsningen fortyndes med citratbuffer for at opnaring toparealer midt paring skalaen

92 Hvis der anvendes HPLC-udstyr til at analysere hydrolysaterne skal koslashrselsbetingelserne optimeres i henhold til fabrikantens anbefaling

93 Hvis metoden anvendes paring foder der indeholder mere end 1 chlorid (koncentrat mineralfoder fodertilskud) vil der kunne ske en undervurshydering af methionin og der skal foretages en saeligrlig behandling

G BESTEMMELSE AF TRYPTOPHAN


Denne metode goslashr det muligt at bestemme det samlede indhold af tryptshyophan (totaltryptophan) og frit tryptophan i foder Der differentieres ikke mellem D- og L-former

2 Princip

Til bestemmelse af totaltryptophan hydrolyseres proslashven i basisk miljoslash i en maeligttet bariumhydroxidoploslashsning og holdes opvarmet til 110

o C i 20 timer Efter hydrolysen tilsaeligttes der intern standard

Til bestemmelse af frit tryptophan ekstraheres proslashven i svagt sur vaeligske under tilstedevaeligrelse af intern standard

Tryptophanet og den interne standard i hydrolysatet eller i ekstraktet bestemmes ved HPLC med fluorescensdetektor

3 Reagenser

31 Der benyttes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne lt 10 μScm)

32 Standardstof tryptophan (renhedsgradindhold ge 99 ) toslashrret i vakuum over phosphorpentoxid

33 Internt standardstof α-methyltryptophan (renhedsgradindhold ge 99 ) toslashrret i vakuum over phosphorpentoxid

34 Bariumhydroxidoctahydrat (man skal passe paring ikke at udsaeligtte Ba(OH) 2 8H 2 O for meget for luft da der ellers dannes BaCO 3 som kan interferere med bestemmelsen) (se bemaeligrkning 93)

35 Natriumhydroxid

36 Orthophosphorsyre w (ww) = 85

37 Saltsyre ρ 20 = 119 gml

38 Methanol svarende til HPLC-kvalitet


B


310 Natriumhydroxidoploslashsning c = 1 molliter 400 g NaOH (35) oploslashses i vand og der fyldes op med vand (31) til 1 liter

311 Saltsyre c = 6 molliter

492 ml saltsyre (37) fortyndes til 1 liter med vand





314 Orthophosphorsyre c = 05 molliter

34 ml orthophosphorsyre (36) fortyndes til 1 liter med vand (31)

315 Koncentreret oploslashsning af tryptophan (32) c = 250 μmolml

I en 500 ml maringlekolbe oploslashses 02553 g tryptophan (32) i saltsyre (313) og der fyldes op til maeligrket med saltsyre (313) Oploslashsningen opbevares ved - 18

o C i hoslashjst 4 uger

316 Koncentreret oploslashsning af intern standard c = 25 μmolml

I en 500 ml maringlekolbe oploslashses 02728 g α-methyltryptophan (33) i saltsyre (313) og der fyldes op til maeligrket med saltsyre (313) Oploslashsshyningen opbevares ved - 18


317 Standardkalibreringsoploslashsning af tryptophan og intern standard

200 ml koncentreret oploslashsning af tryptophan (315) og 200 ml koncenshytreret oploslashsning af intern standard (α-methyltryptophan) (316) fortyndes med vand (31) og methanol (38) til omtrent samme volumen og omtrent samme methanolkoncentration (10ndash30 ) som det faeligrdige hydrolysat

Oploslashsningen skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

Der soslashrges for beskyttelse mod direkte sollys under fremstillingen

318 Eddikesyre

319 111-Trichlor-2-methyl-2-propanol

320 Ethanolamin w (ww) gt 98

321 Oploslashsning af 1 g 111-trichlor-2-methyl-2-propanol (319) i 100 ml methanol (38)

322 Mobil fase til HPLC 300 g eddikesyre (318) + 900 ml vand (31) + 500 ml af oploslashsningen (321) af 111-trichlor-2-methyl-2-propanol (319) i methanol (38) (1 g pr 100 ml) pH justeres til 500 med ethanolamin (320) Der fyldes op med vand (31) til 1 000 ml

4 Apparatur

41 HPLC-udstyr med spektrofluorometrisk detektor

42 HPLC-kolonne 125 mm times 4 mm C 18 3 μm pakkemateriale eller tilsvarende

43 pH-meter

44 Polypropylenflaske 125 ml med vid hals og skruelaringg

B


45 Membranfilter 045 μm

46 Autoklav 110 (plusmn 2) o C 14 (plusmn 01) bar


48 Vortex-blander

5 Fremgangsmaringde

51 Klargoslashring af proslashver



52 Bestemmelse af frit tryptophan (ekstrakt)

En passende maeligngde (1ndash5 g) af den klargjorte proslashve (51) afvejes med en noslashjagtighed paring 1 mg i en konisk kolbe Der tilsaeligttes 1000 ml saltsyre (313) og 500 ml koncentreret oploslashsning af intern standard (316) Der omrystes eller blandes i 60 minutter paring mekanisk rysteshyapparat eller magnetomroslashrer (47) Efter henstand og bundfaeligldning afpishypetteres 100 ml af supernatanten i et baeliggerglas Der tilsaeligttes 5 ml orthophosphorsyre (314) pH justeres til 3 med natriumhydroxid (310) Der tilsaeligttes saring meget methanol (38) at slutkoncentrationen af methanol bliver 10ndash30 Oploslashsningen overfoslashres til en maringlekolbe af passende stoslashrrelse og fortyndes med vand til et volumen der passer til kromatografien (ca samme volumen som standardkalibreringsoploslashsshyningen (317))

Nogle faring ml af oploslashsningen filtreres gennem et 045 μm membranfilter (45) inden den indsproslashjtes paring HPLC-kolonnen Derefter foretages kromatografi som beskrevet i punkt 54

Standardoploslashsninger og ekstrakter beskyttes mod direkte sollys Hvis ekstrakterne ikke kan analyseres samme dag kan de opbevares ved 5

o C i hoslashjst 3 dage

53 Bestemmelse af totaltryptophan (hydrolysat)

Med en noslashjagtighed paring 02 mg afvejes 01ndash1 g af den klargjorte proslashve (51) i polypropylenflasken (44) Den afvejede proslashveportion skal have et kvaeliglstofindhold paring ca 10 mg Der tilsaeligttes 84 g bariumhydroxidoctashyhydrat (34) og 10 ml vand Der blandes paring vortex-blander (48) eller magnetomroslashrer (47) Den teflonbelagte magnetpind efterlades i blandinshygen Flaskens vaeliggge skylles med 4 ml vand Skruelaringget skrues loslashst paring flasken der saeligttes ind i autoklaven (46) med kogende vand i 30ndash60 minutter Autoklaven lukkes og der autoklaveres ved 110 (plusmn 2)

o C i 20 timer

Temperaturen i autoklaven saelignkes til lige under 100 o C inden den

aringbnes For at undgaring udkrystallisering af Ba(OH) 2 8H 2 O tilsaeligttes der til den varme blanding 30 ml stuevarmt vand Der omrystes eller omroslashres forsigtigt og tilsaeligttes 200 ml koncentreret intern standardopshyloslashsning (α-methyltryptophan) (316) Flasken afkoslashles i vandisbad i 15 minutter

Derefter tilsaeligttes 5 ml orthophosphorsyre (314) Medens flasken stadig staringr i koslashlebadet neutraliseres der med saltsyre (311) under omroslashring og pH justeres til 30 med saltsyre (312) Der tilsaeligttes saring meget methanol at slutkoncentrationen af methanol bliver 10ndash30 Oploslashsningen overshyfoslashres til en maringlekolbe af passende stoslashrrelse og fortyndes med vand til et volumen der passer til kromatografien (feks 100 ml) Der maring ikke ske udfaeligldning under methanoltilsaeligtningen

B



Standardoploslashsninger og hydrolysater beskyttes mod direkte sollys Hvis hydrolysaterne ikke kan analyseres samme dag kan de opbevares ved 5


54 HPLC-bestemmelse

Nedenstaringende betingelser for isokratisk eluering er vejledende andre betingelser kan benyttes forudsat at de giver tilsvarende resultater (se ogsaring bemaeligrkning 91 og 92)

HPLC-kolonne (42) 125 mm times 4 mm C 18 3 pakkemateriale μm eller tilsvarende

Kolonnetemperatur Rumtemperatur

Mobil fase (322) 300 g eddikesyre (318) + 900 ml vand (31) + 500 ml af oploslashsningen (321) af 111-trichlor- 2-methyl-2-propanol (319) i methanol (38) (1 g pr 100 ml) pH justeres til 500 med ethanolamin (320) Der fyldes op med vand (31) til 1 000 ml

Flow 1 mlminuttet

Total gennemloslashbstid ca 34 minutter Detektionsboslashlgelaeligngde excitation 280 nm emission 356 nm

Injektionsvolumen 20 μl


Maeligngden af tryptophan (X) beregnes i gram pr 100 g proslashve

X frac14 A Uuml B Uuml V 1 Uuml c Uuml V 2 Uuml M C Uuml D Uuml V 3 Uuml 10 000 Uuml m

A = topareal for intern standard standardkalibreringsoploslashsning (317) B = topareal for tryptophan ekstrakt (52) eller hydrolysat (53) V 1 = volumen i ml (2 ml) af den maeligngde koncentreret tryptophanopshy

loslashsning (315) der er tilsat til kalibreringsoploslashsningen (317) c = koncentration i μmolml (= 250) af den koncentrerede tryptophashy

noploslashsning (315) der er tilsat til kalibreringsoploslashsningen (317) V 2 = volumen i ml af den maeligngde koncentreret oploslashsning af intern

standard (316) der er tilsat til ekstraktet (52) (= 500 ml) eller til hydrolysatet (53) (= 200 ml)

C = topareal for intern standard ekstrakt (52) eller hydrolysat (53) D = topareal for tryptophan standardkalibreringsoploslashsning (317) V 3 = volumen i ml (= 200 ml) af den maeligngde koncentreret oploslashsning

af intern standard (316) der er tilsat til standardkalibreringsoploslashsshyningen (317)

m = proslashvens vaeliggt i gram (korrigeret til oprindelig vaeliggt hvis den er toslashrret ogeller affedtet)

M = tryptophans molarvaeliggt (= 20423 gmol)

7 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ikke overstige 10 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat)

B


8 Resultater af ringanalyse

Der er gennemfoslashrt en EF-ringanalyse (4 ringanalyse) hvor 3 proslashver blev analyseret i op til 12 laboratorier med henblik paring certificering af hydrolysemetoden Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse paring hver proslashve Resultaterne er vist i nedenstaringende tabel

Proslashve 1 Svinefoder


suppleret med L-tryptophan

Proslashve 3 Foderkoncentrat til

svin

L 12 12 12

n 50 55 50

Middelvaeligrdi [g kg]

242 340 422

s r [gkg] 005 005 008

r [gkg] 014 014 022

CV r [] 19 16 19

S R [gkg] 015 020 009

R [gkg] 042 056 025

CV R [] 63 60 22

L = antal laboratorier der har indleveret resultater n = antal enkeltvaeligrdier efter fjernelse af outliers (Cochran-Dixon

outlier-test) s r = standardafvigelse for repeterbarhed S R = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CV r = variationskoefficient for repeterbarhed CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed

Der er ogsaring gennemfoslashrt en EF-ringanalyse (3 ringanalyse) hvor 2 proslashver blev analyseret i op til 13 laboratorier med henblik paring certificeshyring af metoden til ekstraktion af frit tryptophan Der blev foretaget 5- dobbelt bestemmelse paring hver proslashve Resultaterne er vist i nedenstaringende tabel

Proslashve 4 Blanding af soja og

hvede


hvede (= proslashve 4) med tilsaeligtning af tryptophan

(0457 gkg)

L 12 12

n 55 60

Middelvaeligrdi [gkg] 0391 0931

s r [gkg] 0005 0012

r [gkg] 0014 0034

CV r [] 134 134

S R [gkg] 0018 0048

R [gkg] 0050 0134

CV R [] 471 511



B


Der er gennemfoslashrt endnu en EF-ringanalyse hvor 4 proslashver blev analyseret i op til 7 laboratorier med henblik paring certificering af tryptshyophan med hensyn til hydrolyse Resultaterne er vist herunder Der blev foretaget 5-dobbelt bestemmelse paring hver proslashve

Proslashve 1 Svinefodershy

blanding (CRM 117)

Proslashve 2 Fiskemel med

lavt fedtindhold (CRM 118)

Proslashve 3 Sojamel

(CRM 119)

Proslashve 4 Skummetshy

maeliglkspulver (CRM 120)

L 7 7 7 7

n 25 30 30 30


2064 8801 6882 5236

S r [gkg] 0021 0101 0089 0040

r [gkg] 0059 0283 0249 0112

CV r [] 104 115 130 076

S R [gkg] 0031 0413 0283 0221

R [gkg] 0087 1156 0792 0619

CV R [] 148 469 411 422



9 Bemaeligrkninger

91 Nedenstaringende saeligrlige kromatograferingsbetingelser kan give bedre adskillelse af tryptophan og α-methyltryptophan

Isokratisk eluering efterfulgt af gradientrensning af kolonnen som foslashlger

HPLC-kolonne 125 mm times 4 mm C 18 5 μm pakkemateriale eller tilsvarende

Kolonnetemperatur 32 o C

Mobil fase A 001 molliter KH2PO4methanol 95 + 5 (v + v) B methanol

Gradientprogram 0 minutter 100 A 0 B 15 minutter 100 A 0 B

17 minutter 60 A 40 B 19 minutter 60 A 40 B


Flow 12 mlminuttet

Total gennemloslashbstid ca 33 minutter

92 Kromatograferingen varierer alt efter hvilken type HPLC og kolonneshymateriale der benyttes Der skal vaeliglges et system der giver adskillelse til basislinjen mellem tryptophan og den interne standard Det er desuden vigtigt at nedbrydningsprodukter adskilles helt fra tryptophan og den interne standard Der koslashres hydrolysater uden intern standard for

B


at kontrollere at der ikke ligger urenheder paring basislinjen under den interne standard Det er vigtigt at gennemloslashbstiden er lang nok til at alle nedbrydningsprodukter elueres da toppe med lang elueringstid ellers kan interferere i efterfoslashlgende kromatograferinger

Kromatografisystemet skal i sit arbejdsomraringde give lineaeligrt respons Det lineaeligre respons kontrolleres med konstant (dvs den normale) koncenshytration af intern standard og varierende koncentrationer af tryptophan Det er vigtigt at baringde toppen for tryptophan og toppen for intern stanshydard ligger inden for HPLCfluorescenssystemets lineaeligre omraringde Hvis blot en af toppene er enten for lille eller for stor gentages analysen med en anden proslashvestoslashrrelse ogeller et andet slutvolumen

93 Bariumhydroxid

Bariumhydroxid bliver med tiden vanskeligere at oploslashse Det medfoslashrer at oploslashsningen til HPLC-bestemmelse bliver uklar hvilket kan betyde at resultaterne for tryptophan bliver for lave

H BESTEMMELSE AF RAringFEDT


Denne metode anvendes til bestemmelse af raringfedtindholdet i foder Den er ikke beregnet til analyse af olieholdige froslash og frugter

Anvendelsen af de to fremgangsmaringder der er beskrevet nedenfor afhaelignger af arten og sammensaeligtningen af foderet og af grunden til at analysen gennemfoslashres

11 Metode A mdash Raringfedt som kan ekstraheres direkte

Denne metode anvendes til vegetabilske fodermidler med undtagelse af dem der er medtaget under metode B

12 Metode B mdash Raringfedt i alt

Denne metode anvendes til animalske fodermidler samt til alle fodershyblandinger Den skal anvendes til alle materialer hvorfra raringfedt ikke kan ekstraheres fuldstaeligndigt uden forudgaringende hydrolyse saringsom gluten gaeligr kartoffelproteiner og produkter der underkastes processer som ekstrudeshyring omdannelse til flager og opvarmning

13 Fortolkning af resultater

I samtlige tilfaeliglde hvor der opnarings et hoslashjere resultat ved anvendelse af metode B end ved metode A skal de resultater der er opnaringet ved metode B accepteres som den sande vaeligrdi

2 Princip

21 Metode A

Proslashven ekstraheres med petroleumsether Oploslashsningsmidlet afdampes og remanensen toslashrres og vejes

22 Metode B

Proslashven behandles med saltsyre under opvarmning Blandingen afkoslashles og filtreres Den vaskede og toslashrrede remanens behandles herefter som beskrevet under metode A

B


3 Reagenser

31 Petroleumsether kogepunktsinterval 40ndash60 o C Bromtallet skal vaeligre

under 1 og inddampningsresten under 2 mg100 ml

32 Natriumsulfat vandfrit


34 Filtreringsmiddel feks kiselgur Hyflo-supercel

4 Apparatur

41 Ekstraktionsapparat Dersom apparatet er udstyret med et haeligvertroslashr (Soxhlet-apparat) indstilles varmekilden saring der sker ca 10 toslashmninger i timen dersom apparatet ikke er udstyret med haeligvertroslashr skal tilbageshyloslashbet vaeligre paring ca 10 ml i minuttet

42 Ekstraktionshaeligtter skal vaeligre fri for stof der er oploslashseligt i petroleumshysether og skal have en poroslashsitet i overensstemmelse med kravene under 41

43 Toslashrreskab enten et vakuumtoslashrreskab indstillet til 75 o C plusmn 3

o C eller et toslashrreskab med luftcirkulation indstillet til 100

o C plusmn 3 o C

5 Fremgangsmaringde

51 Metode A (se punkt 81)

5 g af proslashven afvejes med en noslashjagtighed paring 1 mg overfoslashres til en ekstraktionshaeligtte (42) og tildaeligkkes med en affedtet vatprop

Haeligtten anbringes i et ekstraktionsapparat (41) og der ekstraheres i 6 timer med petroleumsether (31) Petroleumsetherekstraktet opsamles i en toslashr tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten ( 1 )

Oploslashsningsmidlet afdampes Remanensen toslashrres derparing i kolben i 1 12 time i toslashrreskab (43) Efter afkoslashling i ekssikkator vejes remanensen Der toslashrres i yderligere 30 minutter for at sikre at fedtets vaeliggt forbliver konstant (vaeliggttabet mellem to paring hinanden foslashlgende vejninger maring hoslashjst vaeligre paring 1 mg)

52 Metode B

25 g af proslashven afvejes med en noslashjagtighed paring 1 mg (se punkt 82) og overfoslashres til et 400 ml baeliggerglas eller en 300 ml konisk kolbe hvorefter der tilsaeligttes 100 ml saltsyre (33) og stykker af pimpsten Baeliggerglasset tildaeligkkes med et urglas eller hvis der anvendes en konisk kolbe forsynes denne med en tilbagesvaler Blandingen bringes til let kogning over en svag flamme eller paring varmeplade i ca 1 time Mateshyrialet skal forhindres i at saeligtte sig fast paring beholderens sider

Beholderen afkoslashles og der tilsaeligttes saring meget filtreringsmiddel (34) at der ikke opstaringr noget fedttab ved filtreringen Der filtreres gennem et fugtigt fedtfrit dobbelt filtrerpapir Remanensen vaskes med koldt vand indtil filtratet er neutralt Det kontrolleres at filtratet ikke indeshyholder fedt Tilstedevaeligrelse af fedt viser at der inden hydrolysen skal foretages en ekstraktion af proslashven med petroleumsether ved anvendelse af metode A

Det dobbelte filtrerpapir med remanensen laeliggges paring et urglas og toslashrres i toslashrreskab (43) ved 100

o C plusmn 3 o C i 1 frac12 time

B


( 1 ) Saringfremt fedtet senere skal undersoslashges kvalitativt erstattes pimpstensstykkerne af glaskugler

Det dobbelte filtrerpapir med den toslashrre remanens anbringes i ekstrakshytionshaeligtte (42) og tildaeligkkes med en affedtet vatprop Haeligtten anbringes i et ekstraktionsapparat (41) hvorefter der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 51 andet og tredje afsnit

6 Angivelse af resultater

Remanensens vaeliggt angives i procent af proslashven

7 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt af den samme person paring den samme proslashve maring ikke overstige

mdash 02 i absolut vaeligrdi for raringfedtindhold paring under 5

mdash 40 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for indhold paring 5ndash10

mdash 04 i absolut vaeligrdi for indhold paring over 10

8 Bemaeligrkninger

81 For produkter med hoslashjt fedtindhold som er vanskelige at formale eller som ikke egner sig til udtagning af en reduceret homogen proslashve anvendes foslashlgende fremgangsmaringde

20 g af proslashven afvejes med en noslashjagtighed paring 1 mg og blandes med mindst 10 g vandfrit natriumsulfat (32) Derparing ekstraheres med petroshyleumsether (31) som angivet under punkt 51 Det herved opsamlede ekstrakt tilsaeligttes petroleumsether (31) ad 500 ml og blandingen rystes Af oploslashsningen udtages 50 ml som haeligldes i en lille toslashr tareret kolbe indeholdende stykker af pimpsten Oploslashsningsmidlet afdampes derparing toslashrres og fortsaeligttes som beskrevet i punkt 51 sidste afsnit

Ekstraktionsresten i haeligtten befries for oploslashsningsmidlet og formales til en kornstoslashrrelse paring 1 mm hvorefter den haeligldes tilbage i ekstraktionsshyhaeligtten (der tilsaeligttes ikke natriumsulfat) derparing fortsaeligttes som beskrevet i punkt 51 andet og tredje afsnit

Fedtindholdet beregnes som en procentdel af proslashven ved anvendelse af nedenstaringende formel

(10m 1 + m 2 ) times 5

hvor

m 1 = vaeliggt i gram af remanensen efter den foslashrste ekstraktion (den alikvote del af ekstraktet)

m 2 = vaeliggt i gram af remanensen efter den anden ekstraktion

82 For produkter med lavt fedtindhold kan der anvendes en afvejning paring 5 g

83 Foder med hoslashjt vandindhold til selskabsdyr vil det kunne vaeligre noslashdvenshydigt at blande med vandfrit natriumsulfat forud for hydrolyse og ekstrakshytion som ved metode B

84 I punkt 52 vil det kunne vaeligre mere effektivt at anvende varmt vand i stedet for koldt vand til vaskning af remanensen efter filtrering

85 Det kan for visse typer foder vaeligre noslashdvendigt at forlaelignge toslashrringstiden paring 1 frac12 time Overdreven toslashrring undgarings da en saringdan kan foslashre til lave resultater En mikroboslashlgeovn kan ogsaring anvendes

B


86 Praeligekstraktion ved metode A forud for hydrolyse og reekstraktion ved metode B anbefales hvis raringfedtindholdet er hoslashjere end 15 Dette afhaelignger til en vis grad af arten af foderet og af arten af fedtet i foderet

I BESTEMMELSE AF TRAEligSTOF


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af fedtfri organiske stoffer i foder som er uoploslashselige i fortyndede syre- og baseoploslashsninger og som normalt betegnes som traeligstof

2 Princip

Proslashven der om noslashdvendigt er affedtet behandles i kogende oploslashsninger af foslashrst svovlsyre og derefter kaliumhydroxid i bestemte koncentrationer Remanensen adskilles ved filtrering i en glasfilterdigel hvorefter det vaskes toslashrres vejes og foraskes ved 475ndash500

o C Vaeliggttabet ved foraskshyningen svarer til traeligstofindholdet i proslashven

3 Reagenser

31 Svovlsyre c = 013 molliter

32 Skumdaeligmpende middel (feks n-octanol)

33 Filtreringshjaeliglpemiddel (Celite 545 el lign) opvarmet til 500 o C i 4

timer (86)

34 Acetone



37 Kaliumhydroxidoploslashsning c = 023 molliter

4 Apparatur

41 Varmeenhed til kogning med svovlsyre og kaliumhydroxid med holder til filterdiglen (42) og afgangsroslashr med hane til vaeligskeafloslashb samt vakuumpumpe eventuelt med trykluft Enheden forvarmes foslashr daglig brug med kogende vand i 5 minutter

42 Glasfilterdigel med filterplade af sintret glas porestoslashrrelse 40ndash90 μm Inden den foslashrste gang tages i anvendelse opvarmes den i nogle faring minutter til 500

o C og afkoslashles (86)

43 Kogecylinder paring mindst 270 ml med tilbagesvaler

44 Toslashrreskab med termostat

45 Muffelovn med termostat

46 Ekstraktionsapparat med holder til filterdiglen (42) og afgangsroslashr med hane til vaeligskeafloslashb samt vakuumpumpe

47 Forbindelsesringe til samling af varmeenhed (41) filterdigel (42) og kogecylinder (43) og til samling af koldekstraktionsapparat (46) og filterdigel

5 Fremgangsmaringde

I glasfilterdiglen (42) afvejes med 1 mg noslashjagtighed 1 g af den klarshygjorte proslashve (se bemaeligrkning 81 82 og 83) og der tilsaeligttes 1 g filtreringshjaeliglpemiddel (33)

B


Varmeenheden (41) og filterdiglen (42) samles Kogecylinderen (43) forbindes til diglen 150 ml svovlsyre (31) der er opvarmet til kogeshypunktet overfoslashres til kogecylinderen og om noslashdvendigt tilsaeligttes nogle faring draringber skumdaeligmpende middel (32)

Vaeligsken opvarmes til kogepunktet i loslashbet af 5 plusmn 2 minutter og koges livligt i noslashjagtig 30 minutter

Afgangshanen (41) aringbnes og svovlsyren filtreres under vakuum gennem filterdiglen Remanensen paring filterdiglen vaskes under vakuum tre gange med 30 ml kogende vand hver gang Filtret med remanensen suges toslashrt efter hver vask

Afgangshanen lukkes og 150 ml kogende kaliumhydroxidoploslashsning (37) overfoslashres til kogecylinderen Der tilsaeligttes nogle faring draringber skumshydaeligmpende middel (32) Vaeligsken opvarmes til kogepunktet i loslashbet af 5 plusmn 2 minutter og koges livligt i noslashjagtig 30 minutter Remanensen filtreres og vaskes paring samme maringde som efter behandling med svovlsyre

Efter den sidste vask suges bundfaldet toslashrt og diglen med indhold forbindes til koldekstraktionsapparatet (46) Remanensen i diglen vaskes under vakuum tre gange med 25 ml acetone (34) hver gang og suges toslashrt efter hver vask

Filterdiglen med indhold toslashrres i toslashrreskabet ved 130 o C indtil konstant

vaeliggt Efter hver toslashrring afkoslashles diglen i en ekssikkator og vejes straks Herefter anbringes den i muffelovnen og indholdet foraskes ved 475ndash500

o C i mindst 30 minutter Dette gentages indtil konstant vaeliggt (vaeliggttabet mellem to paring hinanden foslashlgende vejninger maring hoslashjst vaeligre paring 2 mg)

Efter hver foraskning afkoslashles diglen foslashrst i ovnen og derefter i ekssikshykatoren inden den vejes

Der foretages en blindproslashve uden proslashve Vaeliggttabet ved foraskningen maring ikke overstige 4 mg


Traeligstofindholdet som procent af proslashven beregnes efter foslashlgende formel


hvor

m = proslashvens vaeliggt i gram m 0 = vaeliggttabet i gram efter foraskning under bestemmelsen m 1 = vaeliggttabet i gram ved foraskning af remanensen af blindproslashven

7 Repeterbarhed


mdash 06 i absolut vaeligrdi for traeligstofindhold paring under 10

mdash 6 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for traeligstofindhold paring 10 og derover

8 Bemaeligrkninger

81 Foder der indeholder over 10 raringfedt skal affedtes med petroleumshysether (35) inden analysen Filterdiglen (42) med indhold forbindes med koldekstraktionsapparatet (46) og vaskes under vakuum tre gange

B


med 30 ml petroleumsether hver gang Proslashven suges toslashr og diglen med indhold forbindes til varmeenheden (41) Derefter fortsaeligttes som beskrevet i punkt 5

82 Foder der indeholder fedt som ikke kan ekstraheres direkte med petroshyleumsether (35) skal affedtes som beskrevet i punkt 81 og efter kogning med syre affedtes endnu en gang Efter kogning med syre og efterfoslashlgende vask forbindes diglen med indhold til koldekstraktionsshyapparatet (46) og vaskes tre gange med 30 ml acetone efterfulgt af tre gange vask med 30 ml petroleumsether Filtret suges toslashrt og analysen fortsaeligttes som beskrevet i punkt 5 med behandlingen med kaliumhydroxid

83 Hvis foderet indeholder over 5 carbonater udtrykt som calciumcarshybonat forbindes diglen (42) med den afvejede proslashve til varmeenheden (41) Proslashven vaskes tre gange med 30 ml saltsyre (36) Efter hver tilsaeligtning skal proslashven henstaring i ca 1 minut inden den filtreres Der vaskes eacuten gang med 30 ml vand hvorefter der fortsaeligttes som beskrevet i punkt 5

84 Hvis der anvendes apparatur i form af et stativ (flere digler forbundet med samme varmeenhed) maring der aldrig foretages to enkeltbestemmelser af samme analyseproslashve i samme proslashveraeligkke

85 Hvis det efter kogning viser sig vanskeligt at filtrere syre- og baseopshyloslashsningerne foslashres der trykluft gennem varmeenhedens afgangsroslashr hvorshyefter filtreringen fortsaeligttes

86 Udgloslashdningstemperaturen maring ikke vaeligre over 500 o C hvilket skal sikre

at diglerne af sintret glas holder laeligngst muligt Der drages omsorg for at undgaring store temperaturudsving under opvarmning og afkoslashling

J BESTEMMELSE AF SUKKER


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af reducerende sukker og totalsukker efter invertering udtrykt som glucose eller ved omregning med faktoren 095 som saccharose Metoden finder anvenshydelse paring foderblandinger Der er fastsat saeligrlige metoder for andre typer foder Om noslashdvendigt bestemmes lactosen saeligrskilt idet der tages hensyn hertil ved beregningen af resultaterne

2 Princip

Sukkeret oploslashses i fortyndet ethanol oploslashsningen klares ved hjaeliglp af Carrez-reagens I og II Efter afdampning af ethanol foretages bestemshymelserne foslashr og efter inverteringen efter Luff-Schoorl-metoden

3 Reagenser

31 Ethanoloploslashsning 40 (vv) massefylde 0948 gml ved 20 o C

neutraliseret til phenolphthalein



34 Methylorange 01 oploslashsning (wv)

35 Saltsyre 4 molliter


B



38 Luff-Schoorl-reagens

Under forsigtig omroslashring haeligldes citronsyreoploslashsningen (382) over i natriumcarbonatoploslashsningen (383) Kobbersulfatoploslashsningen (381) tilsaeligttes og der fyldes op med vand til 1 liter Det henstaringr natten over og filtreres

Koncentrationen af det saringledes opnaringede reagens kontrolleres (Cu 005 molliter Na 2 CO 3 1 molliter) (se punkt 54 sidste afsnit) Oploslashsningens pH-vaeligrdi skal vaeligre ca 94

381 Kobbersulfatoploslashsning 25 g kobbersulfat CuSO 4 5H 2 O frit for jern oploslashses i 100 ml vand

382 Citronsyreoploslashsning 50 g citronsyre C 6 H 8 O 7 H 2 O oploslashses i 50 ml vand

383 Natriumcarbonatoploslashsning 1438 g vandfrit natriumcarbonat oploslashses i ca 300 ml varmt vand Oploslashsningen henstilles til afkoslashling

39 Natriumthiosulfatoploslashsning 01 molliter

310 Stivelsesoploslashsning 5 g oploslashselig stivelse tilsaeligttes 30 ml vand og opblandes i 1 liter kogende vand Der koges i 3 minutter henstilles til afkoslashling og tilsaeligttes eventuelt 10 mg kviksoslashlviodid som konserveringsmiddel


312 Kaliumiodid 30 oploslashsning (wv)

313 Granuleret pimpsten udkogt i saltsyre vasket med vand og toslashrret

314 3-methylbutan-l-ol

4 Apparatur

Mekanisk rysteapparat ca 35ndash40 omdrejninger i minuttet

5 Fremgangsmaringde

51 Ekstraktion af proslashven

25 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed og haeligldes i en 250 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 200 ml ethanol (31) og blandes i 1 time i rysteapparatet Der tilsaeligttes 5 ml Carrez-reagens I (32) og omroslashres i ca 30 sekunder Derefter tilsaeligttes 5 ml Carrez-reagens II (33) og omroslashres paring ny i 1 minut Der fyldes op til maeligrket med ethanol (31) hvorefter der homogeniseres og filtreres 200 ml af filtratet udtages og inddampes til ca halvdelen af volumenet hvorved stoslashrstedelen af ethashynolen fordamper Fordampningsresten overfoslashres kvantitativt ved hjaeliglp af varmt vand til en 200 ml maringlekolbe og afkoslashles der fyldes op til maeligrket med vand og homogeniseres og om noslashdvendigt filtreres Denne oploslashsshyning benyttes til bestemmelse af reducerende sukker samt efter inverteshyring af totalsukker

52 Bestemmelse af reducerende sukker

Med pipette udtages hoslashjst 25 ml af oploslashsningen indeholdende under 60 mg reducerende sukker udtrykt som glucose Om noslashdvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden Resultatet angives i procent glucose

53 Bestemmelse af totalsukker efter invertering

Med pipette udtages 50 ml oploslashsning som overfoslashres til en 100 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes nogle faring draringber methylorangeoploslashsning (34)

B


og derefter forsigtigt og under stadig omroslashring saltsyre (35) indtil der sker et tydeligt omslag til roslashdt Der tilsaeligttes 15 ml saltsyre (36) og kolben anbringes paring vandbad i staeligrk kogning og efterlades der i 30 minutter Der afkoslashles hurtigt til ca 20

o C og tilsaeligttes 15 ml natriumhyshydroxidoploslashsning (37) Der fyldes op med vand til 100 ml og homogeshyniseres Der udtages en maeligngde der ikke overstiger 25 ml og som indeholder mindre end 60 mg reducerende sukker udtrykt som glucose Om noslashdvendigt fyldes op med destilleret vand til 25 ml og indholdet af reducerende sukker bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden Resultatet angives i procent glucose eller ved multiplikation med faktoren 095 saccharose

54 Titrering efter Luff-Schoorl-metoden

Med pipette udtages 25 ml af Luff-Schoorl-reagenset (38) som overshyfoslashres til en 300 ml erlenmeyerkolbe der tilsaeligttes noslashjagtig 25 ml af den klarede sukkeroploslashsning Der tilsaeligttes 2 korn pimpsten (313) og opvarmes under omrystning med haringnden over en fri flamme af middelshyhoslashjde og vaeligsken bringes i kog paring ca 2 minutter Erlenmeyerkolben anbringes umiddelbart derefter paring en metaltraringdsdug som er forsynet med et asbesttraringdnet med et hul paring ca 6 cm i diameter hvorunder man i forvejen har taeligndt en flamme Denne skal vaeligre afpasset saringledes at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes Kolben forbindes med en tilbagesshyvaler Vaeligsken koges i noslashjagtig 10 minutter og afkoslashles straks derefter ved hjaeliglp af koldt vand hvorparing der efter ca 5 minutters forloslashb titreres som foslashlger

Der tilsaeligttes 10 ml kaliumiodidoploslashsning (312) og straks derefter (forshysigtigt paring grund af risikoen for dannelse af skum i stor maeligngde) 25 ml svovlsyre (311) Der titreres saring med natriumthiosulfatoploslashsning (39) indtil der viser sig en matgul farve hvorefter der tilsaeligttes stivelse (310) som indikator og titreringen faeligrdiggoslashres

Den samme titrering foretages med en noslashjagtigt afmaringlt blanding af 25 ml Luff-Schoorl-reagens (38) og 25 ml vand efter at der er tilsat 10 ml kaliumiodidoploslashsning (312) og 25 ml svovlsyre (311) dog uden at bringe den i kog


Ved hjaeliglp af tabellen beregnes den maeligngde glucose i mg der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer udtrykt i mg natriumtshyhiosulfat 01 molliter Resultatet angives i procent af proslashven

7 Specielle fremgangsmaringder

71 For saring vidt angaringr foder med et hoslashjt melasseindhold og andet lidet homogent foder afvejes 20 g som anbringes i en 1 liter maringlekolbe med 500 ml vand Blandes i 1 time i rysteapparatet og klares ved hjaeliglp af Carrez-reagens I (32) og II (33) som beskrevet i punkt 51 idet der dog benyttes en fire gange stoslashrre maeligngde af hvert reagens Der fyldes op til maeligrket med 80 ethanol (vv)

Derefter homogeniseres og filtreres Ethanolen afdampes som beskrevet i punkt 51 Findes der ikke dekstrineret stivelse fyldes der op med destilleret vand

72 For saring vidt angaringr melasse og fodermidler med et hoslashjt indhold af sukker men praktisk talt ingen stivelse (johannesbroslashd toslashrrede sukkerroesnitter osv) afvejes 5 g i en 250 ml maringlekolbe hvorefter der tilsaeligttes 200 ml destilleret vand og blandes i 1 time eller mere om noslashdvendigt i rysteshyapparatet Blandingen klares ved hjaeliglp af Carrez-reagens I (32) og II (33) som beskrevet i punkt 51 Der fyldes op til maeligrket med koldt vand homogeniseres og filtreres Til bestemmelse af totalsukker benyttes fremgangsmaringden der er beskrevet under punkt 53

8 Bemaeligrkninger

81 Det anbefales at tilsaeligtte ca 1 ml 3-methylbutan-l-ol (314) (uden hensyntagen til volumenet) foslashr kogning med Luff-Schoorl-reagenset for at undgaring skumdannelse

B


82 Forskellen mellem indholdet af totalsukker efter invertering udtrykt som glucose og indholdet af reducerende sukker udtrykt som glucose giver multipliceret med 095 procentindholdet af saccharose

83 Til bestemmelse af indholdet af reducerende sukker med undtagelse af lactose kan der anvendes to metoder

831 For at foretage en omtrentlig beregning multipliceres med 0675 det ved en separat bestemmelse konstaterede indhold af lactose og det fundne resultat traeligkkes fra indholdet af reducerende sukker

832 For at foretage en praeligcis beregning af det reducerende sukker med undtagelse af lactosen er det noslashdvendigt at laeliggge den samme analyseshyproslashve til grund ved de to definitive bestemmelser Den ene analyse udfoslashres paring en del af oploslashsningen der opnarings efter punkt 51 den anden paring en del af oploslashsningen der opnarings ved bestemmelsen af lactose efter den hertil fastlagte metode (efter gaeligring af de andre sukkeshyrarter og klaring)

I begge tilfaeliglde bestemmes det tilstedevaeligrende indhold af sukker efter Luff-Schoorl-metoden og beregnes i mg glucose De to vaeligrdier traeligkkes fra hinanden og forskellen angives i procent af proslashven

Eksempel

De to udtagne volumener svarer for hver bestemmelse til en analyseshyproslashve paring 250 mg

I det foslashrste tilfaeliglde forbruges der 17 ml natriumthiosulfatoploslashsning 01 molliter hvad der svarer til 442 mg glucose i det andet tilfaeliglde forbruges der 11 ml hvad der svarer til 276 mg glucose

Forskellen andrager 166 mg glucose

Indholdet af reducerende sukker (uden lactose) beregnet som glucose er altsaring

4 Uuml 166 10 frac14 664

Tabel over vaeligrdierne for 25 ml Luff-Schoorl-reagens

ml Na 2 S 2 O 3 01 molliter 2 minutters opvarmning 10 minutters kogning

Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter

Glucose fructose inverteret sukker

C 6 H 12 O 6

Lactose C 12 H 22 O 11

Maltose C 12 H 22 O 11

Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter

ml mg forskel mg forskel mg forskel ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B


K BESTEMMELSE AF LACTOSE


Metoden goslashr det muligt at bestemme indholdet af lactose i foder der indeholder mere end 05 heraf

2 Princip

Sukkeret oploslashses i vand Oploslashsningen underkastes en gaeligring med Saccharomyces cerevisiae som ikke angriber lactosen Efter klaring og filtrering bestemmes filtratets lactoseindhold efter Luff-Schoorl-metoshyden

3 Reagenser

31 Saccharomyces cerevisiae-opslaeligmning 25 g frisk gaeligr opslaeligmmes i 100 ml vand Suspensionen kan holde sig i hoslashjst 1 uge i koslashleskab

32 Carrez-reagens I 219 g zinkacetat Zn (CH 3 COO) 2 2H 2 O og 3 g isedshydike oploslashses i vand Der fyldes op med vand til 100 ml



Under forsigtig omroslashring haeligldes citronsyreoploslashsningen (342) over i natriumcarbonatoploslashsningen (343) Kobbersulfatoploslashsningen (341) tilsaeligttes og der fyldes op med vand til 1 liter Det henstaringr natten over og filtreres Koncentrationen af det saringledes opnaringede reagens kontrolleres (Cu 005 molliter Na 2 CO 3 1 molliter) Oploslashsningens pH-vaeligrdi skal vaeligre ca 94








39 Stivelsesoploslashsning 5 g oploslashselig stivelse tilsaeligttes 30 ml vand og opblandes i 1 liter kogende vand Der koges i 3 minutter henstilles til afkoslashling og tilsaeligttes eventuelt 10 mg kviksoslashlviodid som konserveringsshymiddel

4 Apparatur

Vandbad forsynet med termostat indstillet til 38ndash40 o C

5 Fremgangsmaringde

1 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed og denne portion anbringes i en 100 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 25ndash30 ml vand Kolben opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad hvorefter der afkoslashles til ca 35

o C Der tilsaeligttes 5 ml gaeligrsuspension (31) og homogeniseres Kolben henstaringr i 2 timer i vandbad ved en temperatur paring 38ndash40

o C Afkoslashles derparing til ca 20

o C

Der tilsaeligttes 25 ml Carrez-reagens I (32) og blandingen rystes i 30 sekunder dernaeligst tilsaeligttes 25 ml Carrez-reagens II (33) og der rystes paring ny i 30 sekunder Der fyldes op med vand til 100 ml blandes og filtreres Med pipette udtages en maeligngde filtrat der ikke

B


overstiger 25 ml og som saring vidt muligt indeholder 40ndash80 mg lactose og dette overfoslashres til en 300 ml erlenmeyerkolbe Om noslashdvendigt fyldes op med vand til 25 ml

Paring samme maringde udfoslashres en blindproslashve med 5 ml gaeligrsuspension (31) Lactoseindholdet bestemmes efter Luff-Schoorl-metoden som foslashlger Der tilsaeligttes noslashjagtig 25 ml Luff-Schoorl-reagens (34) og 2 korn pimpsten (35) Der opvarmes under omrystning med haringnden over en fri flamme af middelhoslashjde og vaeligsken bringes i kog paring ca 2 minutter Erlenmeyshyerkolben anbringes umiddelbart derefter paring en metaltraringdsdug som er forsynet med et asbesttraringdnet med et hul paring ca 6 cm i diameter hvorshyunder man i forvejen har taeligndt en flamme Denne skal vaeligre afpasset saringledes at alene erlenmeyerkolbens bund opvarmes Kolben forbindes med en tilbagesvaler Vaeligsken koges i noslashjagtig 10 minutter Derparing afkoslashles der straks ved hjaeliglp af koldt vand og efter ca 5 minutters forloslashb titreres der som foslashlger




Ved hjaeliglp af nedenstaringende tabel beregnes den maeligngde lactose i mg der svarer til forskellen mellem resultaterne af de to titreringer udtrykt i ml natriumthiosulfatoploslashsning 01 molliter

Resultatet for vandfri lactose angives i procent af proslashven

7 Bemaeligrkning

Til produkter der indeholder mere end 40 gaeligringsdygtigt sukker skal der benyttes mere end 5 ml gaeligrsuspension (31)



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B


L BESTEMMELSE AF STIVELSE

POLARIMETRISK METODE


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af stivelse og nedbrydningsprodukter heraf med hoslashj molekylvaeliggt i foder til kontrol af om reglerne vedroslashrende angivelse af energivaeligrdien (jf bilag VII) og direktiv 9625EF ( 1 ) er overholdt

2 Princip

Metoden er baseret paring dobbeltbestemmelse Ved den foslashrste bestemmelse behandles proslashven med fortyndet saltsyre Efter klaring og filtrering maringles oploslashsningens optiske drejning polarimetrisk

Ved den anden bestemmelse ekstraheres proslashven med 40 ethanol Efter behandling af filtratet med saltsyre klares og filtreres og den optiske drejning maringles under samme betingelser som ved den foslashrste bestemmelse

Forskellen mellem de to maringlinger multipliceret med en kendt faktor giver proslashvens stivelsesindhold

3 Reagenser

31 Saltsyre 25 oploslashsning (ww) massefylde 1126 gml

32 Saltsyre 113 oploslashsning (wv)

Koncentrationen skal kontrolleres ved titrering med 01 molliter natriumhydroxidoploslashsning under tilstedevaeligrelse af 01 (wv) methylshyroslashdt i 94 (vv) ethanol Til neutralisering af 10 ml kraeligves der 3094 ml NaOH 01 molliter



35 Ethanol 40 oploslashsning (vv) massefylde 0948 gml ved 20 o C

4 Apparatur

41 250 ml erlenmeyerkolbe med standardslibhals og tilbagesvaler

42 Polarimeter eller saccharimeter

5 Fremgangsmaringde


Proslashven formales saring den kan passere fuldstaeligndigt gennem en sigte med 05 mm runde masker

52 Bestemmelse af den totale optiske drejning (P eller S) (se bemaeligrkning 71)

25 g af den formalede proslashve afvejes med 1 mg noslashjagtighed i en 100 ml maringlekolbe og der tilsaeligttes 25 ml saltsyre (32) Kolben rystes indtil proslashvematerialet er jaeligvnt fordelt og der tilsaeligttes yderligere 25 ml saltshysyre (32) Derefter nedsaelignkes kolben i et kogende vandbad I de foslashrste 3 minutter rystes kolben kraftigt og med regelmaeligssige mellemrum for at forhindre klumpdannelse Vandmaeligngden i vandbadet skal vaeligre tilstraeligkshykelig til fortsat at holde vandet i kog naringr kolben nedsaelignkes Under

B


( 1 ) EFT L 125 af 2351996 s 35

omrystningen maring kolben ikke tages op af vandbadet Efter noslashjagtig 15 minutter tages kolben op af vandbadet hvorefter der tilsaeligttes 30 ml koldt vand og straks afkoslashles til 20

o C

Der tilsaeligttes 5 ml Carrez-reagens I (33) og omrystes i ca 30 sekunder Derparing tilsaeligttes 5 ml Carrez-reagens II (34) og der omrystes atter i ca 30 sekunder Der fyldes op med vand til maeligrket blandes og filtreres Hvis filtratet ikke er fuldstaeligndig klart hvilket sjaeligldent forekommer skal bestemmelsen gentages med en stoslashrre maeligngde Carrez-reagens I og II feks 10 ml

Oploslashsningens optiske drejning maringles i et 200 mm roslashr med et polarimeter eller et saccharimeter

53 Bestemmelse af den optiske drejning (P eller S) for de i 40 ethanol oploslashselige stoffer

5 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed i en 100 ml maringlekolbe og der tilsaeligttes ca 80 ml ethanol (35) (se bemaeligrkning 72) Kolben henstaringr i 1 time ved rumtemperatur I dette tidsrum rystes kolben kraftigt seks gange saring proslashvematerialet blandes omhyggeligt med ethanolen Der fyldes op med ethanol (35) til maeligrket blandes og filtreres

50 ml af filtratet (svarende til 25 g af proslashven) afpipetteres i en 250 ml erlenmeyerkolbe og der tilsaeligttes 21 ml saltsyre (31) Kolben rystes kraftigt sluttes til en tilbagesvaler og nedsaelignkes i et bad med kogende vand Efter noslashjagtig 15 minutter tages erlenmeyerkolben op af vandbashydet og indholdet skylles over i en 100 ml maringlekolbe med en lille maeligngde koldt vand og afkoslashles til 20

o C

Derparing klares med Carrez-reagens I (33) og II (34) fyldes op med vand til maeligrket blandes og filtreres og den optiske drejning maringles som beskrevet i punkt 52 andet og tredje afsnit


Indholdet af stivelse () beregnes som foslashlger

61 Polarimetriske maringlinger

Stivelsesindhold ethTHORN frac14 2 000ethP Auml P 0 THORN frac12αacirc 20deg

D

P = total optisk drejning i cirkelgrader P = optisk drejning i cirkelgrader af de i 40 (vv) ethanol

oploslashselige stoffer frac12αacirc 20deg

D = den rene stivelses specifikke optiske drejning Til denne faktor D anvendes foslashlgende generelt accepterede vaeligrdier

+1859 o risstivelse

+1857 o kartoffelstivelse

+1846 o majsstivelse

+1827 o hvedestivelse

+1815 o bygstivelse

+1813 o havrestivelse

+1840 o andre typer stivelse og stivelsesblandinger i fodershy

blandinger

62 Saccharimetriske maringlinger

Stivelsesindhold ethTHORN frac14 2 000 frac12αacirc 20deg

D Uuml eth2 N Uuml 0665THORN Uuml ethS Auml S 0 THORN

100 Auml 266 N Uuml ethS Auml S 0 THORN

frac12αacirc 20deg D

B


S = total optisk drejning i saccharimetergrader S = optisk drejning i saccharimetergrader af de i 40 (vv)

ethanol oploslashselige stoffer N = saccharosens vaeliggt i gram i 100 ml vand ved en vejlaeligngde paring

200 mm som giver en optisk drejning paring 100 saccharimetershygrader Denne vaeliggt varierer alt efter saccharimetertype 1629 g for franske saccharimetre 2600 g for tyske saccharimetre 2000 g for blandede saccharimetre

frac12αacirc 20deg D = den rene stivelses specifikke optiske drejning (se punkt 61)

63 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ved indhold paring under 40 stivelse ikke overstige 04 i absolut vaeligrdi og ved indhold paring 40 og derover ikke overstige 1 i relativ vaeligrdi

7 Bemaeligrkninger

71 Hvis proslashven indeholder over 6 carbonater beregnet som calciumcarshybonat skal de destrueres med den noslashjagtige maeligngde fortyndet svovlsyre inden bestemmelsen af den totale optiske drejning

72 For produkter med hoslashjt lactoseindhold feks maeliglkeserum i pulverform eller skummetmaeliglkspulver anvendes efter tilsaeligtning af 80 ml ethanol (35) foslashlgende fremgangsmaringde Kolben tilsluttes en tilbagesvaler og nedsaelignkes i et vandbad paring 50

o C i 30 minutter Efter afkoslashling fortsaeligttes som beskrevet i punkt 53

73 Ved tilstedevaeligrelse i foder i stoslashrre maeligngde kan foslashlgende fodermidler interferere ved bestemmelse af stivelsesindholdet efter den polarimetriske metode som derved kan give forkerte resultater

mdash (sukker)roeprodukter saringsom ekstraherede (sukker)roesnitter (sukshyker)roemelasse ekstraherede (sukker)roesnitter tilsat melasse (sukshyker)roevinasse (roe)sukker

mdash citruskvas

mdash hoslashrfroslash hoslashrfroslashkage hoslashrfroslashskraring

mdash rapsfroslash rapskage rapsskraring rapsskaller

mdash solsikkefroslash solsikkeskraring solsikkeskraring delvis afskallet

mdash kokoskage kokosskraring

mdash kartoffelkvas

mdash toslashrret gaeligr

mdash produkter med stort inulinindhold (feks snitter og skraring af jordskokshyker)

mdash grever

M BESTEMMELSE AF RAringASKE


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af raringaske i foder

B


2 Princip

Proslashven foraskes ved 550 o C remanensen vejes

3 Reagenser

Ammoniumnitrat 20 oploslashsning (wv)

4 Apparatur

41 Varmeplade

42 Elektrisk muffelovn med termostat

43 Foraskningsdigler af kvarts porcelaelign eller platin rektangulaeligre (ca 60 times 40 times 25 mm) eller runde (diameter 60ndash75 mm hoslashjde 20ndash40 mm)

5 Fremgangsmaringde

Ca 5 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed (25 g for produkter der har tendens til at svulme op) i en foraskningsdigel der i forvejen er opvarmet til 550

o C afkoslashlet og tareret Diglen anbringes paring varmepladen og opvarmes gradvist indtil stoffet forkuller Der foraskes som beskrevet i punkt 51 eller 52

51 Diglen stilles ind i den kalibrerede muffelovn der er indstillet paring 550

o C Den henstaringr ved denne temperatur indtil der farings hvid lysegraring eller roslashdlig aske der tilsyneladende er fri for kulpartikler Diglen anbringes i en ekssikkator henstilles til afkoslashling og vejes med det samme


o C Der foraskes i 3 timer Diglen anbringes i en ekssikkator henstilles til afkoslashling og vejes med det samme Der foraskes i yderligere 30 minutter for at sikre at askens vaeliggt forbliver konstant (vaeliggttabet mellem to paring hinanden foslashlgende vejninger maring hoslashjst vaeligre paring 1 mg)


Vaeliggten af remanensen beregnes idet taraen traeligkkes fra


7 Bemaeligrkninger

71 Asken af de stoffer der er vanskelige at foraske skal underkastes en foslashrste foraskning paring mindst 3 timer afkoslashles og tilsaeligttes nogle faring draringber 20 ammoniumnitratoploslashsning eller vand (dog forsigtigt for at undgaring at asken spredes eller danner klumper) Foraskningen fortsaeligttes efter toslashrring i toslashrreskab Gentag processen indtil foraskningen er fuldstaeligndig

72 For stoffer der ikke kan behandles efter den i punkt 71 beskrevne metode benyttes foslashlgende fremgangsmaringde Efter 3 timers foraskning bringes asken ved hjaeliglp af varmt vand over paring et lille askefrit filter Filtret med indhold foraskes i den oprindelige digel Filtratet anbringes i den afkoslashlede digel inddampes til toslashrhed foraskes og vejes

73 Naringr det drejer sig om fedtstoffer afvejes med stoslashrst mulig noslashjagtighed en proslashve paring 25 g i en digel af passende stoslashrrelse Proslashven forkulles ved at antaelignde stoffet ved hjaeliglp af en lunte af askefrit filtrerpapir Fugtes efter forbraeligndingen med den mindste maeligngde vand der er noslashdvendig Toslashrres og foraskes som beskrevet i punkt 5

B


N BESTEMMELSE AF ASKE UOPLOslashSELIG I SALTSYRE


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet i foder af mineshyralske bestanddele som er uoploslashselige i saltsyre Der er fastsat to fremshygangsmaringder alt afhaeligngigt af proslashvens art

11 Fremgangsmaringde A finder anvendelse paring organiske fodermidler og paring de fleste typer foderblandinger

12 Fremgangsmaringde B finder anvendelse paring mineralstoffer og mineralstofshyblandinger saringvel som paring foderblandinger hvis indhold af aske uoploslashselig i saltsyre bestemt efter fremgangsmaringde A er stoslashrre end 1

2 Princip

21 Fremgangsmaringde A Proslashven foraskes asken koges med saltsyre og den uoploslashselige remanens frafiltreres og vejes

22 Fremgangsmaringde B Proslashven behandles med saltsyre Oploslashsningen filtreshyres remanensen foraskes og den fundne aske behandles som beskrevet under fremgangsmaringde A

3 Reagenser




4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde

51 Fremgangsmaringde A

Proslashven foraskes efter den fremgangsmaringde der er beskrevet for bestemshymelse af raringaske Man kan ogsaring benytte den aske der opnarings ved denne bestemmelse

Asken anbringes i et 250ndash400 ml baeliggerglas med 75 ml saltsyre (31) Vaeligsken bringes forsigtigt til kogning og koges sagte i 15 minutter Den varme oploslashsning filtreres gennem et askefrit filtrerpapir og remanensen vaskes med varmt vand indtil den sure reaktion forsvinder Filtret med remanensen toslashrres og der foraskes i en tareret digel ved en temperatur paring mindst 550

o C og hoslashjst 700 o C Afkoslashles i en ekssikkator og vejes

52 Fremgangsmaringde B

5 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed i et 250ndash400 ml baeliggerglas Der tilsaeligttes 25 ml vand og derefter 25 ml saltsyre (31) blandes og ventes indtil opbrusningen ophoslashrer Der tilsaeligttes yderligere 50 ml saltshysyre (31) Det afventes at en eventuel luftudvikling er overstaringet hvorshyefter baeliggerglasset anbringes paring kogende vandbad og efterlades deacuter i 30 minutter eller mere om noslashdvendigt saring eventuelt forekommende stivelse hydrolyseres fuldstaeligndigt Der varmfiltreres gennem et askefrit filter og filtret vaskes med 50 ml varmt vand (se punkt 7 raquoBemaeligrkshyninglaquo) Filtret med remanensen anbringes i en foraskningsdigel og der

B


toslashrres og foraskes ved en temperatur paring mindst 550 o C og hoslashjst 700

o C Asken anbringes i et 250ndash400 ml baeliggerglas med 75 ml saltsyre (31) Derefter fortsaeligttes som beskrevet i punkt 5 andet afsnit


Vaeliggten af remanensen beregnes idet taraen traeligkkes fra Resultatet angives i procent af proslashven

7 Bemaeligrkning

Hvis filtreringen viser sig vanskelig gentages bestemmelsen idet de 50 ml saltsyre (31) erstattes med 50 ml trichloreddikesyreoploslashsning paring 20 (32) og idet filtret vaskes med en varm trichloreddikesyreoploslashsshyning paring 1 (33)

O BESTEMMELSE AF CARBONATER


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af carbonater der normalt udtrykkes som calciumcarbonat i de fleste foderstoffer

I visse tilfaeliglde (feks ferrocarbonat) maring der dog anvendes en saeligrlig metode

2 Princip

Carbonaterne spaltes med saltsyre den frigjorte kuldioxid opsamles i et maringleglas og dens volumen sammenlignes med det volumen der under de samme betingelser frigoslashres af en bekendt maeligngde calciumcarbonat

3 Reagenser

31 Saltsyre massefylde 110 gml

32 Calciumcarbonat

33 Svovlsyre ca 005 molliter farvet med methylroslashdt

4 Apparatur

Scheibler-Dietrich-apparat (se skitse) eller tilsvarende apparat

5 Fremgangsmaringde

Alt efter proslashvens carbonatindhold afvejes en proslashve som angivet nedenfor

mdash 05 g for produkter der indeholder 50ndash100 carbonater udtrykt som calciumcarbonat


mdash 2ndash3 g for oslashvrige produkter

Proslashven anbringes i apparatets specialflaske (4) der er forsynet med et lille roslashr af brudsikkert materiale som indeholder 10 ml saltsyre (31) og flasken forbindes med apparatet Tregangshanen (5) drejes saringledes at roslashret (1) staringr i forbindelse med luften udenfor Ved hjaeliglp af det bevaeliggeshylige roslashr (2) som er fyldt med farvet svovlsyre (33) og forbundet med det gradinddelte roslashr (1) bringes vaeligskens niveau til nulpunktet paring skalaen Hanen (5) drejes saringledes at roslashrene (1) og (3) kommer i forbinshydelse med hinanden og det kontrolleres at vaeligskeniveauet er paring nulpunktet

Saltsyren (31) lades langsomt flyde hen over proslashven idet flasken (4) haeligldes Trykket udlignes ved at saelignke roslashret (2) Flasken (4) rystes indtil kuldioxidudviklingen er helt ophoslashrt

Trykket genoprettes ved at foslashre vaeligsken tilbage til det samme niveau i roslashrene (1) og (2) Der aflaeligses efter faring minutters forloslashb naringr volumenet er blevet konstant

Under de samme betingelser udfoslashres et sammenlignende forsoslashg med 05 g calciumcarbonat (32)

B



Indholdet af carbonater udtrykt som calciumcarbonat beregnes efter foslashlgende formel

X frac14 V Uuml 100 V 1 Uuml 2m

hvor

X = (ww) carbonater i proslashven udtrykt som calciumcarbonat V = ml CO 2 frigjort af proslashven V 1 = ml CO 2 frigjort af 05 g CaCO 3 m = proslashvens vaeliggt i gram

7 Bemaeligrkninger

71 Naringr proslashven vejer mere end 2 g fyldes der forinden 15 ml destilleret vand i flasken (4) og indholdet blandes foslashr forsoslashget paringbegyndes Der benyttes samme vandvolumen til det sammenlignende forsoslashg

72 Anvendes et apparat med et andet volumen end Scheibler-Dietrich-appashyratet maring man afpasse analyseproslashven sammenligningsmaeligngden og resulshytatberegningen herefter

B


P BESTEMMELSE AF TOTALPHOSPHOR

FOTOMETRISK METODE


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af totalphosphor i foder Metoden er specielt egnet til undersoslashgelse af foder med et ringe phosphorindhold I bestemte tilfaeliglde (phosphorrige produkter) kan der anvendes en gravimetrisk metode

2 Princip

Proslashven destrueres enten ved forbraelignding (naringr der er tale om organisk foder) eller ved syreoplukning (mineralske stoffer og flydende foder) og oploslashses i syre Oploslashsningen behandles med vanadatmolybdatreagenset Ekstinktionen af den gulfarvede oploslashsning maringles ved 430 nm i spektrofotometret

3 Reagenser

31 Calciumcarbonat

32 Saltsyre ρ 20 = 110 gml (ca 6 molliter)

33 Salpetersyre ρ 20 = 1045 gml

34 Salpetersyre ρ 20 = 138ndash142 gml

35 Svovlsyre ρ 20 = 184 gml

36 Vanadatmolybdatreagens 200 ml ammoniumheptamolybdatoploslashsning (361) blandes med 200 ml ammoniummonovandatoploslashsning (362) og 134 ml salpetersyre (34) i en 1 liter maringlekolbe hvorefter der fyldes op med vand til maeligrket

361 Ammoniumheptamolybdatoploslashsning 100 g ammoniumheptamolybdat (NH 4 ) 6Mo 7 O 24 4H 2 O oploslashses i varmt vand Der tilsaeligttes 10 ml am- moniakvand (massefylde 091 gml) og fyldes op med vand til 1 liter

362 Ammoniummonovanadatoploslashsning 235 g ammoniummonovanadat NH 4 VO 3 oploslashses i 400 ml varmt vand 20 ml fortyndet salpetersyre (7 ml HNO 3 (34) + 13 ml H 2 O) tilsaeligttes langsomt under stadig omroslashring og der fyldes op med vand til 1 liter

37 Standardphosphoroploslashsning paring 1 mg pr ml 4387 g kaliumdihydroshygenphosphat KH 2 PO 4 oploslashses i vand og der fyldes op med vand til 1 liter

4 Apparatur

41 Foraskningsdigler af kvarts porcelaelign eller platin

42 Elektrisk muffelovn med termostat indstillet paring 550 o C

43 250 ml Kjeldahlkolbe

44 Maringlekolber og mikromaringlepipetter

45 Spektrofotometer

46 Reagensglas ca 16 mm diameter med NS 145 rumindhold 25ndash30 ml

5 Fremgangsmaringde

51 Fremstilling af oploslashsningen

Alt efter proslashvens art fremstilles oploslashsningen som beskrevet i punkt 511 eller 512

511 N o r m a l m e t o d e

1 g eller mere af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed og haeligldes i en Kjeldahlkolbe Der tilsaeligttes 20 ml svovlsyre (35) hvorefter der omryshystes for at gennemvaeligde materialet med syren og for at forhindre at

B


materialet saeligtter sig fast paring kolbens inderside Derparing opvarmes blanshydingen og holdes i kog i 10 minutter Efter en let afkoslashling tilsaeligttes der 2 ml salpetersyre (34) der opvarmes svagt og afkoslashles atter noget Herefter tilsaeligttes paring ny lidt salpetersyre (34) og opvarmes til kogetemperatur og dette gentages indtil oploslashsningen er farveloslashs Derparing afkoslashles der der tilsaeligttes lidt vand og vaeligsken overfoslashres kvantitativt til en 500 ml maringleshykolbe ved skylning af Kjeldahlkolben med varmt vand Efter afkoslashling fyldes der op med vand til maeligrket homogeniseres og filtreres

512 M e t o d e f o r p r oslash v e r d e r i n d e h o l d e r o r g a n i s k e s t o f shyf e r m e n e r f r i f o r c a l c i u m - o g m a g n e s i u m - d i h y d r o shyg e n p h o s p h a t e r

Ca 25 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed i en foraskningsdigel og blandes omhyggeligt med 1 g calciumcarbonat (31) I muffelovnen foraskes der ved 550

o C indtil asken er hvid eller graring (smaring maeligngder kul er ikke et problem) Asken overfoslashres til et 250 ml baeliggerglas Der tilsaeligttes 20 ml vand og saltsyre (32) indtil opbrusningen ophoslashrer Der tilsaeligttes yderligere 10 ml saltsyre (32) Derparing anbringes baeliggershyglasset paring sandbad og der inddampes til fuldstaeligndig toslashrhed for at goslashre kiselsyren uoploslashselig Remanensen oploslashses i 10 ml salpetersyre (33) og opvarmes til kogetemperatur i 5 minutter paring sandbad eller varmeplade idet remanensen dog ikke skal toslashrre helt Vaeligsken overfoslashres til en 500 ml maringlekolbe idet baeliggerglasset gentagne gange skylles med varmt vand Efter afkoslashling fyldes der op med vand til maeligrket homoshygeniseres og filtreres

52 Udvikling af farvningen og maringling af ekstinktionen

En alikvot del af det efter 511 eller 512 udvundne filtrat fortyndes for at faring en koncentration af phosphor paring hoslashjst 40 μgml 10 ml af denne oploslashsning overfoslashres til et reagensglas (46) og der tilsaeligttes 10 ml vanashydatmolybdatreagens (36) Blandingen homogeniseres og henstaringr i mindst 10 minutter ved 20

o C Derparing maringles ekstinktionen i spektrofoshytometret ved 430 nm i forhold til en oploslashsning af 10 ml vand og 10 ml vanadatmolybdatreagens (36)


Af standardoploslashsningen (37) fremstilles oploslashsninger der indeholder henholdsvis 5 10 20 30 og 40 μg phosphor pr ml Til hver 10 ml af disse oploslashsninger tilsaeligttes 10 ml vanadatmolybdatreagens (36) Der homogeniseres og blandingen henstaringr i mindst 10 minutter ved 20

o C Derparing maringles ekstinktionen under de ovenfor i punkt 52 beskrevne betingelser Kalibreringskurven tegnes idet ekstinktionsvaeligrdierne indtegnes op ad ordinaten og den tilsvarende phosphormaeligngde ud ad abscissen Kurven er lineaeligr for phosphorkoncentrationer paring 0ndash40 μgml


Indholdet af phosphor i proslashven bestemmes ved benyttelse af kalibreringskurven


Repeterbarhed


mdash 3 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for phosphorindhold paring mindre end 5

mdash 015 i absolut vaeligrdi for phosphorindhold paring 5 og derover

B


Q BESTEMMELSE AF CHLOR AF CHLORIDER


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af chlor af vandopshyloslashselige chlorider der normalt udtrykkes som natriumchlorid Den kan anvendes paring alt foder

2 Princip

Chloriderne oploslashses i vand Dersom produktet indeholder organisk stof foretages en klaring Oploslashsningen goslashres let sur ved tilsaeligtning af salpeshytersyre og chloriderne bundfaeligldes i form af soslashlvchlorid ved hjaeliglp af en soslashlvnitratoploslashsning Overskuddet af soslashlvnitrat titreres med en ammoshyniumthiocyanatoploslashsning efter Volhards metode

3 Reagenser

31 Ammoniumthiocyanatoploslashsning 01 molliter

32 Soslashlvnitratoploslashsning 01 molliter

33 Maeligttet ammoniumferrisulfatoploslashsning (NH 4 )Fe(SO 4 ) 2

34 Salpetersyre massefylde 138 gml

35 Diethylether

36 Acetone



39 Aktivt kul chloridfrit og ikke-chloridadsorberende

4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde


Alt efter proslashvens art fremstilles en oploslashsning som beskrevet i punkt 511 512 eller 513

Der udfoslashres til sammenligning en blindproslashve uden analyseproslashven

511 P r oslash v e r u d e n o r g a n i s k s t o f

Der afvejes med 1 mg noslashjagtighed en analyseproslashve paring ikke mere end 10 g der ikke indeholder mere end 3 g chlor i form af chlorider og denne anbringes i en 500 ml maringlekolbe med 400 ml vand paring ca 20

o C Vaeligsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet og der fyldes op til maeligrket homogeniseres og filtreres

512 P r oslash v e r d e r i n d e h o l d e r o r g a n i s k s t o f m e d u n d t a g e l s e a f d e i p u n k t 5 1 3 a n f oslash r t e

Ca 5 g af proslashven afvejes med 1 mg noslashjagtighed og anbringes med 1 g aktivt kul i en 500 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 400 ml vand paring ca 20

o C og 5 ml Carrez-reagens I (37) omroslashres i 30 sekunder og tilsaeligttes derefter 5 ml Carrez-reagens II (38) Vaeligsken blandes i 30 minutter i rysteapparatet og der fyldes op til maeligrket homogeniseres og filtreres

B


513 B a g t f o d e r h oslash r f r oslash k a g e r o g h oslash r f r oslash s k r aring p r o d u k t e r m e d e t s t o r t i n d h o l d a f h oslash r f r oslash s k r aring o g a n d r e p r o d u k t e r m e d e t s t o r t i n d h o l d a f p l a n t e s l i m e l l e r a f k o l l o i d a l e s t o f f e r ( f e k s f o r k l i s t r e t s t i v e l s e )

Oploslashsningen fremstilles som beskrevet i punkt 512 men filtreres ikke Oploslashsningen dekanteres (om noslashdvendigt centrifugeres) med pipette udtages 100 ml af supernatanten og dette overfoslashres til en 200 ml maringleshykolbe Der blandes med acetone (36) og fyldes op til maeligrket med denne oploslashsningsvaeligske hvorefter der homogeniseres og filtreres

52 Titrering

Med pipette overfoslashres til en erlenmeyerkolbe 25ndash100 ml af filtratet (alt efter det formodede chlorindhold) der er opnaringet efter punkt 511 512 eller 513 Den alikvote maeligngde maring ikke indeholde mere end 150 mg klor (Cl) Om noslashdvendigt fortyndes med vand op til mindst 50 ml hvorefter der tilsaeligttes 5 ml salpetersyre (34) 20 ml maeligttet ammoniumshyferrisulfatoploslashsning (33) og 2 draringber ammoniumthiocyanatoploslashsning (31) som paringfyldes ved hjaeliglp af en burette der er fyldt til nulpunktshystregen Dernaeligst paringfyldes ved hjaeliglp af en burette soslashlvnitratoploslashsningen (32) saringledes at der opnarings et overskud paring 5 ml Der tilsaeligttes 5 ml diethylether (35) og omrystes kraftigt for at sikre fuldstaeligndig udfaeligldshyning Overskuddet af soslashlvnitrat titreres med ammoniumthiocyanatoploslashsshyning (31) indtil omslaget til den brunroslashde farve har holdt sig i 1 minut


Maeligngden af chlor (X) udtrykt i natriumchlorid beregnes efter foslashlgende formel

X frac14 5845 Uuml ethV 1 Auml V 2 THORN

m

hvor

V 1 = tilsatte ml soslashlvnitratoploslashsning 01 molliter V 2 = ml ammoniumthiocyanatoploslashsning 01 molliter forbrugt ved titreshy

ringen m = proslashvens vaeliggt Hvis blindproslashven viser et forbrug af soslashlvnitratoploslashsning 01 molliter traeligkkes denne vaeligrdi fra volumenet (V 1 ndash V 2 )

7 Bemaeligrkninger

71 Titreringen kan ogsaring foregaring ved potentiometri

72 For meget fedtholdige produkter foretages der en forudgaringende affedtning med diethylether eller petroleumsether

73 For saring vidt angaringr fiskemel kan titreringen foretages efter Mohrs metode

B


BILAG IV

ANALYSEMETODER TIL KONTROL AF INDHOLDET AF GODKENDTE TILSAEligTNINGSSTOFFER I FODER

A BESTEMMELSE AF VITAMIN A


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af vitamin A (retishynol) i foder og forblandinger Ved vitamin A forstarings all-trans-retinylalshykohol og dens cis-isomerer som bestemmes ved denne metode Indholdet af vitamin A udtrykkes i internationale enheder (IU) pr kg En IU svarer til aktiviteten af 0300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0550 μg all-trans-vitamin A-palmitat

Bestemmelsesgraelignsen er 2 000 IU vitamin A pr kg

2 Princip

Proslashven hydrolyseres med kaliumhydroxid oploslashst i ethanol og vitamin A ekstraheres med petroleumsether Oploslashsningsmidlet fjernes ved inddampning og remanensen oploslashses i methanol og fortyndes om noslashdvendigt til den oslashnskede koncentration Vitamin A-indholdet bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV- eller fluoshyrescensdetektor Kromatograferingsparametrene vaeliglges saringledes at all-trans-vitamin A-alkohol og dens cis-isomerer ikke adskilles

3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol

34 Kaliumhydroxidoploslashsning c = 50 g100 ml

35 Natriumascorbatoploslashsning c = 10 g100 ml (se bemaeligrkning 77)

36 Natriumsulfid Na 2 S x H 2 O (x = 7ndash9)

361 Natriumsulfidoploslashsning c = 05 molliter i glycerol β = 120 gliter (for x = 9) (se bemaeligrkning 78)

37 Phenolphthaleinoploslashsning c = 2 g100 ml i ethanol (31)

38 2-Propanol

39 Mobil fase til HPLC blanding af methanol (33) og vand feks 980 + 20 (v + v) Det noslashjagtige forhold bestemmes af den anvendte kolonnes egenskaber

310 Nitrogen oxygenfrit

311 All-trans-vitamin A-acetat ekstra rent med certificeret aktivitet feks 280 times 10

6 IUg

3111 Stamoploslashsning af all-trans-vitamin A-acetat Der afvejes med 01 mg noslashjagtighed 50 mg vitamin A-acetat (311) i en 100 ml maringlekolbe Efter oploslashsning i 2-propanol (38) fyldes der op til maeligrket med samme oploslashsningsmiddel Denne oploslashsning har en nominel koncentrashytion paring 1 400 IU vitamin A pr ml Det noslashjagtige indhold bestemmes efter punkt 5631

312 All-trans-vitamin A-palmitat ekstra rent med certificeret aktivitet feks 180 times 10

6 IUg

B


3121 Stamoploslashsning af all-trans-vitamin A-palmitat Der afvejes med 01 mg noslashjagtighed 80 mg vitamin A-palmitat (312) i en 100 ml maringlekolbe Efter oploslashsning i 2-propanol (38) fyldes der op til maeligrket med samme oploslashsningsmiddel Denne oploslashsning har en nominel koncentration paring 1 400 IU vitamin A pr ml Det noslashjagtige indhold bestemmes efter punkt 5632

313 26-Di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (se bemaeligrkning 75)

4 Apparatur

41 Rotationsfordamper

42 Udstyr af brunt glas

421 Fladbundede eller koniske kolber 500 ml med slib

422 Maringlekolber med slibprop og tynd hals 10 25 100 og 500 ml

423 Skilletragte koniske 1 000 ml med slibprop

424 Paeligrekolber 250 ml med slib

43 Allihn-svaler kappelaeligngde 300 mm med slibhals med adapter til gastilfoslashrsel

44 Foldefiltrerpapir til faseseparation diameter 185 mm (feks Schleicher amp Schuumlll 597 HY 12)

45 HPLC-udstyr med injektionssystem

451 HPLC-kolonne 250 mm times 4 mm C 18 5 eller 10 μm pakkemateriale eller tilsvarende (praeligstationskriterium kun eacuten top for alle retinolishysomerer under HPLC-betingelserne)

452 UV- eller fluorescensdetektor med variabel boslashlgelaeligngde

46 Spektrofotometer med 10 mm kvartskuvetter

47 Vandbad med magnetomroslashrer

48 Ekstraktionsapparat (se figur 1) bestaringende af foslashlgende

481 Cylinderglas paring 1 liter med slibhals og -prop

482 Slibindsats med sidearm og justerbart roslashr der er foslashrt igennem midten Det justerbare roslashr skal vaeligre U-formet i den nedre ende og vaeligre tilspidset i den anden ende saringledes at det oslashverste vaeligskelag i glasset kan overfoslashres til en skilletragt

5 Fremgangsmaringde

NB Vitamin A er foslashlsomt over for lys (UV) og oxidering Alt arbejde udfoslashres afskaeligrmet mod lys (udstyr af brunt glas eller glasudstyr omviklet med aluminiumfolie) og oxygen (skylning med nitrogen) Under ekstraktionen udskiftes luften over vaeligsken med nitrogen (overtryk udlignes ved jaeligvnligt at lette paring proppen)


Proslashven formales saring den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskeshyvidde men varmeudvikling skal undgarings Formalingen foretages umidshydelbart foslashr afvejning og forsaeligbning da der ellers kan garing vitamin A tabt

B


52 Forsaeligbning

Afhaeligngigt af vitamin A-indholdet afvejes der med en noslashjagtighed paring 1 mg 2ndash25 g af proslashven i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (421) Der tilsaeligttes under forsigtig blanding i raeligkkefoslashlge 130 ml ethanol (31) ca 100 mg BHT (313) 2 ml natriumascorbatoploslashsning (35) og 2 ml natriumsulfidoploslashsning (36) Der saeligttes en svaler paring kolben som anbringes i vandbad med magnetomroslashrer (47) Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter Dernaeligst tilsaeligttes der 25 ml kaliumhydroxidoploslashsning (34) gennem svaleren (43) og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omroslashring og under langsom nitrogengennemstroslashmning Svaleren skylles med ca 20 ml vand og kolbens indhold afkoslashles til rumtemperatur

53 Ekstraktion

Forsaeligbningsoploslashsningen overfoslashres kvantitativt til en 1 000 ml skilletragt (423) eller ekstraktionsapparatet (48) ved skylning med i alt 250 ml vand Derefter skylles forsaeligbningskolben foslashrst med 25 ml ethanol (31) og dernaeligst med 100 ml petroleumsether (32) idet skyllevaeligskerne overshyfoslashres til skilletragten eller ekstraktionsapparatet Forholdet mellem vand og ethanol i den samlede vaeligskemaeligngde skal vaeligre ca 21 Der omrystes kraftigt i 2 minutter og blandingen henstaringr til adskillelse i 2 minutter

531 E k s t r a k t i o n m e d s k i l l e t r a g t ( 4 2 3 )

Naringr vaeligsken er skilt i to lag (se bemaeligrkning 73) overfoslashres petroleumshysetherlaget til en anden skilletragt (423) Ekstraktionen gentages to gange med 100 ml petroleumsether (32) og derefter to gange med 50 ml petroleumsether (32)

De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes to gange med 100 ml vand hver gang (ved forsigtig omdrejning saring der ikke dannes emulsion) og derefter flere gange ved rystning med 100 ml vand indtil vandet ikke farves ved tilsaeligtning af phenolphthaleinoploslashsning (37) (fire gange er normalt tilstraeligkkeligt) Det vaskede ekstrakt filtreres over i en 500 ml maringlekolbe (422) gennem et toslashrt foldefilter til faseseparation (44) saringledes at eventuelt opslaeligmmet vand fjernes Skilletragten og filtret skylles med 50 ml petroleumsether (32) og der fyldes op til maeligrket med petroleumsether (32) og blandes omhyggeligt

532 E k s t r a k t i o n m e d e k s t r a k t i o n s a p p a r a t ( 4 8 )

Naringr vaeligsken er skilt i to lag (se bemaeligrkning 73) udskiftes cylinderglasshysets (481) prop med slibindsatsen (482) og den nederste U-formede del af det justerbare roslashr anbringes saring dets munding er lige over skilleshyfladen Ved at saeligtte nitrogentryk paring sidearmen overfoslashres det lette lag af petroleumsether til en 1 000 ml skilletragt (423) Der tilsaeligttes 100 ml petroleumsether (32) til cylinderglasset og det tilproppes og rystes omhyggeligt Naringr vaeligsken er skilt i to lag overfoslashres det lette lag til skilletragten som foslashr Ekstraktionen gentages med endnu 100 ml petroshyleumsether (32) og dernaeligst med 2 portioner 50 ml petroleumsether (32) og alle lagene af petroleumsether overfoslashres til skilletragten

De samlede petroleumsetherekstrakter i skilletragten vaskes som beskrevet i punkt 531 og der fortsaeligttes som beskrevet der

54 Fremstilling af proslashveoploslashsning til HPLC-analyse

En alikvot maeligngde af petroleumsetherekstraktet (fra 531 eller 532) afpipetteres i en 250 ml paeligrekolbe (424) Der inddampes til naeligsten toslashrhed paring rotationsfordamper (41) under reduceret tryk med en vandbadshystemperatur paring hoslashjst 40

o C Trykket udlignes til atmosfaeligretryk ved at

B


der ledes nitrogen (310) ind i kolben og kolben fjernes fra rotationsshyfordamperen Resterende oploslashsningsmiddel fjernes under en nitrogenshystroslashm (310) og remanensen oploslashses straks i en kendt maeligngde (10ndash100 ml) methanol (33) (vitamin A-koncentrationen skal ligge i intervallet 5ndash30 IUml)

55 HPLC-bestemmelse

Separationen af vitamin A finder sted paring en C 18 -kolonne med omvendt fase (451) og koncentrationen maringles med en UV-detektor (325 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation 325 nm emission 475 nm) (452)

Der indsproslashjtes en alikvot maeligngde (feks 20 μl) af methanoloploslashsningen fra punkt 54 og der elueres med den mobile fase (39) Middeltshyophoslashjden (-arealet) for flere indsproslashjtninger af samme proslashveoploslashsning og middeltophoslashjderne (-arealerne) for flere indsproslashjtninger af kalibreshyringsoploslashsningerne (562) beregnes

H P L C - b e t i n g e l s e r

Nedenstaringende betingelser er vejledende andre betingelser kan benyttes forudsat at de giver tilsvarende resultater

HPLC-kolonne (451) 250 mm times 4 mm C 18 5 eller 10 μm pakkeshymateriale eller tilsvarende

Mobil fase (39) blanding af methanol (33) og vand feks 980 + 20 (v + v)

Flow 1ndash2 mlminuttet Detektor (452) UV-detektor (325 nm) eller fluorescensshy

detektor (excitation 325 nmemission 475 nm)

56 Kalibrering

561 F r e m s t i l l i n g a f a r b e j d s s t a n d a r d o p l oslash s n i n g e r

20 ml stamoploslashsning af vitamin A-acetat (3111) eller vitamin A-palmitat (3121) afpipetteres i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (421) og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 52 dog uden tilsaeligtning af BHT Derefter ekstraheres der med petroleumsether (32) som beskrevet i punkt 53 og fyldes op til 500 ml med petroleumshysether (32) 100 ml af denne oploslashsning inddampes til naeligsten toslashrhed paring rotationsfordamper (se punkt 54) resterende oploslashsningsmiddel fjernes under en nitrogenstroslashm (310) og remanensen oploslashses i 100 ml methanol (33) Oploslashsningens nominelle vitamin A-koncentration er 560 IU pr ml Det noslashjagtige indhold bestemmes efter punkt 5633 Arbejdsstandardoploslashsningen skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

Der afpipetteres 20 ml af denne arbejdsstandardoploslashsning i en 20 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol (33) og blandes Denne fortyndede arbejdsstandardoploslashsning har en nominel vitamin A-koncentration paring 56 IU pr ml

562 F r e m s t i l l i n g a f k a l i b r e r i n g s o p l oslash s n i n g e r o g k a l i shyb r e r i n g s k u r v e

Henholdsvis 10 20 50 og 100 ml af den fortyndede arbejdsstandarshydoploslashsning overfoslashres til hver sin 20 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol (33) og blandes Oploslashsningernes nominelle vitamin A-koncentration er 28 56 140 og 280 IU pr ml

Der indsproslashjtes 20 μl af hver kalibreringsoploslashsning flere gange og middeltophoslashjderne (-arealerne) bestemmes Kalibreringskurven tegnes ved hjaeliglp af middeltophoslashjderne (-arealerne) under hensyntagen til resulshytaterne af UV-kontrollen (5633)

B


563 U V - i n d s t i l l i n g a f s t a n d a r d o p l oslash s n i n g e r n e

5631 S t a m o p l oslash s n i n g a f v i t a m i n A - a c e t a t

Der afpipetteres 20 ml stamoploslashsning af vitamin A-acetat (3111) i en 50 ml maringlekolbe (422) hvorefter der fyldes op til maeligrket med 2- propanol (38) Oploslashsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr ml Der afpipetteres 30 ml af denne fortyndede oploslashsning af vitamin A-acetat i en 25 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med 2-propanol (38) Oploslashsningens nominelle vitamin A-koncentration er 672 IU pr ml Oploslashsningens UV-spektrum i omraringdet 300ndash400 nm maringles mod 2-propanol (38) i spektrofotometret (46) Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm

Indholdet af vitamin A beregnes efter foslashlgende formel

IU vitamin Aml = E 326 times 190

(E 1 1 cm for vitamin A-acetat = 1 530 ved 326 nm i 2-propanol)

5632 S t a m o p l oslash s n i n g a f v i t a m i n A - p a l m i t a t

Der afpipetteres 20 ml stamoploslashsning af vitamin A-palmitat (3121) i en 50 ml maringlekolbe (422) hvorefter der fyldes op til maeligrket med 2- propanol (38) Oploslashsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr ml Der afpipetteres 30 ml af denne fortyndede oploslashsning af vitamin A-palmitat i en 25 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med 2-propanol (38) Oploslashsningens nominelle vitamin A-koncentration er 672 IU pr ml Oploslashsningens UV-spektrum i omraringdet 300ndash400 nm maringles mod 2-propanol (38) i spektrofotometret (46) Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm



(E 1 1 cm for vitamin A-palmitat = 957 ved 326 nm i 2-propanol)

5633 A r b e j d s s t a n d a r d o p l oslash s n i n g a f v i t a m i n A

Der afpipetteres 30 ml af den ufortyndede arbejdsstandardoploslashsning af vitamin A som fremstillet under punkt 561 i en 50 ml maringlekolbe (422) hvorefter der fyldes op til maeligrket med 2-propanol (38) Der afpipetteres 50 ml af denne oploslashsning i en 25 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med 2-propanol (38) Oploslashsningens nominelle vitamin A-koncentration er 672 IU pr ml Oploslashsningens UV-spektrum i omraringdet 300ndash400 nm maringles mod 2-propanol (38) i spektrofotometret (46) Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm



(E 1 1 cm for vitamin A-alkohol = 1 821 ved 325 nm i 2-propanol)


Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af proslashveoploslashsningens vitamin A-toppe bestemmes koncentrationen i proslashveoploslashsningen i IUml ved benyttelse af kalibreringskurven (562)

B


Indholdet w af vitamin A i IU pr kg proslashve beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 500 Uuml c Uuml V 2 Uuml 1 000

V 1 Uuml m [UIkg]

hvor

c = vitamin A-koncentrationen i proslashveoploslashsningen (54) i IUml V 1 = volumen af proslashveoploslashsning (54) i ml V 2 = volumen af den i 54 udtagne alikvot i ml m = testportionens vaeliggt i gram

7 Bemaeligrkninger

71 For proslashver med lav vitamin A-koncentration kan man med fordel samle petroleumsetherekstrakterne fra to forsaeligbningsportioner (afvejet maeligngde 25 g) i eacuten proslashveoploslashsning til HPLC-bestemmelse

72 Den proslashve der tages ud til analyse maring ikke indeholde mere end 2 g fedtstof

73 Hvis faserne ikke skiller kan der tilsaeligttes ca 10 ml ethanol (31) for at bryde emulsionen

74 Med torskeleverolie og andre rene fedtstoffer skal forsaeligbningstiden oslashges til 45ndash60 minutter

75 Der kan anvendes hydroquinon i stedet for BHT

76 Ved brug af en normal-fase-kolonne er det muligt at adskille retinolishysomererne I saring fald er det dog ved beregningerne noslashdvendigt at laeliggge hoslashjderne (arealerne) af samtlige cis- og trans-isomerers toppe sammen

77 Der kan anvendes ca 150 mg ascorbinsyre i stedet for natriumascorbashytoploslashsning

78 Der kan anvendes ca 50 mg EDTA i stedet for natriumsulfidoploslashsning

79 Ved analyse af vitamin A i maeliglkeerstatninger skal isaeligr foslashlgende tages i betragtning

mdash Ved forsaeligbning (52) Det kan paring grund af fedtmaeligngden i proslashven vaeligre noslashdvendigt at oslashge maeligngden af kaliumhydroxidoploslashsning (34)

mdash Ved ekstraktion (53) Det kan paring grund af dannelse af emulsioner vaeligre noslashdvendigt at justere forholdet paring 21 mellem vand og ethanol

Det kontrolleres med en genfindingstest paring yderligere en testportion at den anvendte analysemetode giver paringlidelige resultater for denne matrix (maeliglkeerstatning) Er genfindingsprocenten lavere end 80 korrigeres analyseresultatet for genfinding

8 Repeterbarhed


B


9 Resultater af ringanalyse ( 1 )

Forblanding Forblandet foder

Mineralkonshycentrat Proteinfoder Foder til

smaringgrise

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49

Middelvaeligrdi [IU kg]

1702 times 10 6 121 times 10

6 537 100 151 800 18 070

Sr [IUkg] 051 times 10 6 0039 times 10

6 22 080 12 280 682

r [IUkg] 143 times 10 6 0109 times 10

6 61 824 34 384 1 910

CVr [ ] 30 35 41 81 38

S R [IUkg] 136 times 10 6 0069 times 10

6 46 300 23 060 3 614

R [IUkg] 381 times 10 6 0193 times 10

6 129 640 64 568 10 119

CVR [ ] 80 62 86 15 20

L = antal laboratorier n = antal enkeltvaeligrdier Sr = standardafvigelse for repeterbarhed S R = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed

B


( 1 ) Udfoslashrt af arbejdsgruppen for foder under Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA)

B


B BESTEMMELSE AF VITAMIN E


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af vitamin E i foder og forblandinger Indholdet af vitamin E udtrykkes i mg DL-α -tocshyopherolacetat pr kg 1 mg DL-α-tocopherolacetat svarer til 091 mg DL-α-tocopherol (vitamin E)

Bestemmelsesgraelignsen er 2 mg vitamin E pr kg Denne bestemmelsesshygraelignse er kun realistisk ved brug af fluorescensdetektor Ved brug af UV-detektor er bestemmelsesgraelignsen 10 mgkg

2 Princip

Proslashven hydrolyseres med kaliumhydroxid oploslashst i ethanol og vitamin E ekstraheres med petroleumsether Oploslashsningsmidlet fjernes ved inddampshyning og remanensen oploslashses i methanol og fortyndes om noslashdvendigt til den oslashnskede koncentration Vitamin E-indholdet bestemmes ved omvendt- fase-HPLC med anvendelse af UV- eller fluorescensdetektor

3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol








310 DL-α-tocopherolacetat ekstra rent med certificeret aktivitet

3101 Stamoploslashsning af DL-α-tocopherolacetat Der afvejes med 01 mg noslashjagtighed 100 mg DL-α-tocopherolacetat (310) i en 100 ml maringleshykolbe Efter oploslashsning i ethanol (31) fyldes der op til maeligrket med samme oploslashsningsmiddel 1 ml af denne oploslashsning indeholder 1 mg DL-α-tocopherolacetat (UV-kontrol se punkt 5613 stabilisering se bemaeligrkning 74)

311 DL-α-tocopherol ekstra rent med certificeret aktivitet

3111 Stamoploslashsning af DL-α-tocopherol Der afvejes med 01 mg noslashjagtighed 100 mg DL-α-tocopherol (311) i en 100 ml maringlekolbe Efter oploslashsning i ethanol (31) fyldes der op til maeligrket med samme oploslashsningsmiddel 1 ml af denne oploslashsning indeholder 1 mg DL-α-tocopherol (UV-kontrol se punkt 5623 stabilisering se bemaeligrkning 74)


4 Apparatur


B










451 HPLC-kolonne 250 mm times 4 mm C 18 5 eller 10 μm pakkemateriale eller tilsvarende







5 Fremgangsmaringde

NB Vitamin E er foslashlsomt over for lys (UV) og oxidering Alt arbejde udfoslashres afskaeligrmet mod lys (udstyr af brunt glas eller glasudstyr omviklet med aluminiumfolie) og oxygen (skylning med nitrogen) Under ekstraktionen udskiftes luften over vaeligsken med nitrogen (overtryk udlignes ved jaeligvnligt at lette paring proppen)


Proslashven formales saring den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskeshyvidde men varmeudvikling skal undgarings Formalingen foretages umidshydelbart foslashr afvejning og forsaeligbning da der ellers kan garing vitamin E tabt

52 Forsaeligbning

Afhaeligngigt af vitamin E-indholdet afvejes der med en noslashjagtighed paring 001 g 2ndash25 g af proslashven i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (421) Der tilsaeligttes under forsigtig blanding i raeligkkefoslashlge 130 ml ethanol (31) ca 100 mg BHT (312) 2 ml natriumascorbatoploslashsning (35) og 2 ml natriumsulfidoploslashsning (36) Der saeligttes en svaler paring kolben som anbringes i vandbad med magnetomroslashrer (47) Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter Dernaeligst tilsaeligttes der 25 ml kaliumhydroxidoploslashsning (34) gennem svaleren (43) og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omroslashring og under langsom nitrogengennemstroslashmning Svaleren skylles med ca 20 ml vand og kolbens indhold afkoslashles til rumtemperatur

B


53 Ekstraktion










o C Trykket udlignes til atmosfaeligretryk ved at der ledes nitrogen (39) ind i kolben og kolben fjernes fra rotationsshyfordamperen Resterende oploslashsningsmiddel fjernes under en nitrogenshystroslashm (39) og remanensen oploslashses straks i en kendt maeligngde (10ndash100 ml) methanol (33) (koncentrationen af DL-α-tocopherol skal ligge i intervallet 5ndash30 μgml)

55 HPLC-bestemmelse

Separationen af vitamin E finder sted paring en C 18 -kolonne med omvendt fase (451) og koncentrationen maringles med en UV-detektor (292 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation 295 nm emission 330 nm) (452)

B


Der indsproslashjtes en alikvot maeligngde (feks 20 μl) af methanoloploslashsningen fra punkt 54 og der elueres med den mobile fase (38) Middeltophoslashjshyderne (-arealerne) for flere indsproslashjtninger af samme proslashveoploslashsning og middeltophoslashjderne (-arealerne) for flere indsproslashjtninger af kalibreringsshyoploslashsningerne (562) beregnes



HPLC-kolonne (451) 250 mm times 4 mm C18 5 eller 10 μm pakkemateriale eller tilsvarende


Flow 1ndash2 mlminuttet

Detektor (452) fluorescensdetektor (excitation 295 nmemission 330 nm) eller UV detektor (292 nm)

56 Kalibrering (DL-α-tocopherolacetat eller DL-α-tocopherol)

561 D L - α - t o c o p h e r o l a c e t a t s t a n d a r d

5611 F r e m s t i l l i n g a f a r b e j d s s t a n d a r d o p l oslash s n i n g

25 ml stamoploslashsning af DL-α-tocopherolacetat (3101) afpipetteres i en 500 ml fladbundet eller konisk kolbe (421) og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 52 Derefter ekstraheres der med petroleumsether (32) som beskrevet i punkt 53 og fortyndes til 500 ml med petroleumsether 25 ml af denne oploslashsning inddampes til naeligsten toslashrhed paring rotationsforshydamper (se punkt 54) resterende oploslashsningsmiddel fjernes under en nitrogenstroslashm (39) og remanensen oploslashses i 250 ml methanol (33) Oploslashsningens nominelle koncentration er 455 μg DL-α-tocopherol pr ml svarende til 50 μg DL-α-tocopherolacetat pr ml Arbejdsstandardopshyloslashsningen skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen


Henholdsvis 10 20 40 og 100 ml af arbejdsstandardoploslashsningen overfoslashres til hver sin 20 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol (33) og blandes Oploslashsningernes nominelle koncentration er 25 50 100 og 250 μg DL-α-tocopherolacetat pr ml dvs 228 455 910 og 228 μg DL-α-tocopherol pr ml

Der indsproslashjtes 20 μl af hver kalibreringsoploslashsning flere gange og middeltophoslashjderne (-arealerne) bestemmes Kalibreringskurven tegnes ved hjaeliglp af middeltophoslashjderne (-arealerne)

5613 U V - i n d s t i l l i n g a f s t a m o p l oslash s n i n g e n a f D L - α - t o c o p h e r o l a c e t a t ( 3 1 0 1 )

50 ml af stamoploslashsningen af DL-α-tocopherolacetat (3101) fortyndes til 250 ml med ethanol og oploslashsningens UV-spektrum i omraringdet 250ndash320 nm maringles mod ethanol (31) i spektrofotometret (46)

Absorptionsmaksimum skal ligge ved 284 nm

E 1 1 cm 436 ved 284 nm i ethanol

Ved denne fortynding skal der opnarings en ekstinktionsvaeligrdi paring 084ndash088

B


562 D L - α - t o c o p h e r o l s t a n d a r d


Der afpipetteres 2 ml stamoploslashsning af DL-α-tocopherol (3111) i en 50 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol (33) Oploslashsningens nominelle koncentration er 40 μg DL-α-tocopherol pr ml svarende til 440 μg DL-α-tocopherolacetat pr ml Arbejdsstandardopshyloslashsningen skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen


Henholdsvis 10 20 40 og 100 ml af arbejdsstandardoploslashsningen overfoslashres til hver sin 20 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol (33) og blandes Oploslashsningernes nominelle koncentration er 20 40 80 og 200 μg DL-α-tocopherol pr ml dvs 220 440 879 og 220 μg DL-α-tocopherolacetat pr ml


5623 U V - i n d s t i l l i n g a f s t a m o p l oslash s n i n g e n a f D L - α - t o c o p h e r o l ( 3 1 1 1 )

20 ml af stamoploslashsningen af DL-α-tocopherol (3111) fortyndes til 250 ml med ethanol og oploslashsningens UV-spektrum i omraringdet 250-320 nm maringles mod ethanol (31) i spektrofotometret (46) Absorptionsmakshysimum skal ligge ved 292 nm

E 1 1 cm = 758 ved 292 nm i ethanol

Ved denne fortynding skal der opnarings en ekstinktionsvaeligrdi paring 06


Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af proslashveoploslashsningens vitamin E-toppe bestemmes koncentrationen i proslashveoploslashsningen i μgml (beregnet som α-tocopherolacetat) ved benyttelse af kalibreringskurven (5612 eller 5622)

Indholdet w af vitamin E i mgkg for proslashven beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 500 Uuml c Uuml V 2

V 1 Uuml m [mgkg]

hvor

c = vitamin E-koncentration (som α-tocopherolacetat) i proslashveoploslashsshyningen (54) i μgml

V 1 = volumen af proslashveoploslashsning (54) i ml V 2 = volumen af den i 54 udtagne alikvot i ml m = testportionens vaeliggt i gram

7 Bemaeligrkninger

71 For proslashver med lav vitamin E-koncentration kan man med fordel samle petroleumsetherekstrakterne fra to forsaeligbningsportioner (afvejet maeligngde 25 g) i eacuten proslashveoploslashsning til HPLC-bestemmelse



B


74 Efter spektrofotometrisk maringling af oploslashsningen af DL-α-tocopherolacetat eller DL-α-tocopherol ifoslashlge henholdsvis 5613 og 5623 tilsaeligttes der ca 10 mg BHT (312) til oploslashsningen (3101 eller 3102) hvorefter den opbevares i koslashleskab (hoslashjst 4 uger)


76 Ved brug af en normal-fase-kolonne er det muligt at adskille α- β- γ- og δ-tocopherol



79 Vitamin E-acetat hydrolyserer meget hurtigt i basisk miljoslash og er derfor yderst foslashlsomt over for oxidering navnlig under tilstedevaeligrelse af mikromineraler saringsom jern eller kobber Bestemmelse af vitamin E i forblandinger i maeligngder paring over 5 000 mgkg vil kunne resultere i nedbrydning af vitamin E HPLC-bestemmelse med enzymatisk behandshyling af vitamin E-indholdet hvor alkalisk forsaeligbning udelades er derfor at anbefale i verifikationsoslashjemed

8 Repeterbarhed





smaringgrise

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48

Middelvaeligrdi [mgkg]

17 380 1 187 926 315 613

s r [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

sR mgkg] 830 650 555 189 78

S R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127

L = antal laboratorier n = antal enkeltvaeligrdier s r = standardafvigelse for repeterbarhed S R = standardafvigelse for reproducerbarhed r = repeterbarhed R = reproducerbarhed CV r = variationskoefficient for repeterbarhed CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed

B



B


C BESTEMMELSE AF MIKROMINERALERNE JERN KOBBER MANGAN OG ZINK


Denne metode goslashr det muligt at bestemme mikromineralerne jern kobber mangan og zink i foder Bestemmelsesgraelignserne er

mdash jern (Fe) 20 mgkg

mdash kobber (Cu) 10 mgkg

mdash mangan (Mn) 20 mgkg

mdash zink (Zn) 20 mgkg

2 Princip

Proslashven oploslashses i saltsyre efter at eventuelt organisk stof er destrueret Jern kobber mangan og zink bestemmes efter en passende fortynding ved anvendelse af atomabsorptionsspektrofotometri

3 Reagenser

Indledning

Ved fremstillingen af reagenser og analyseoploslashsninger anvendes vand som ikke indeholder de kationer der skal bestemmes Vandet renses enten ved en dobbelt destillation af vandet i et borsilikat- eller kvartsshydestillationsapparat eller ved dobbelt behandling paring ionbytter

Reagenserne skal mindst vaeligre af analysekvalitet Fravaeligr af de mineraler som skal bestemmes kontrolleres ved blindbestemmelse Om noslashdvendigt oprenses reagenserne yderligere

I stedet for stamoploslashsninger som beskrevet nedenfor kan kommercielle stamoploslashsninger anvendes paring betingelse af at de kontrolleres foslashr brug




34 Flussyre 38ndash40 (vv) med et indhold af jern (Fe) paring mindre end 1 mgliter og med en inddampningsrest paring mindre end 10 mg (som sulfat) liter

35 Svovlsyre massefylde 184 gml

36 Hydrogenperoxid ca 100 vol oxygen (30 vaeliggtprocent)

37 Standardjernoploslashsning (1 000 μg Feml) fremstilles som foslashlger (farings en tilsvarende oploslashsning i handelen kan denne anvendes) 1 g jerntraringd oploslashses i 200 ml 6 molliter saltsyre (32) hvorefter der tilsaeligttes 16 ml hydrogenperoxid (36) og fyldes op med vand til 1 liter

371 Arbejdsstandardjernoploslashsning (100 μg Feml) fremstilles ved at fortynde 1 del standardoploslashsning (37) med 9 dele vand

38 Standardkobberoploslashsning (1 000 μg Cuml) fremstilles som foslashlger (farings en tilsvarende oploslashsning i handelen kan denne anvendes)

mdash 1 g kobber i pulverform oploslashses i 25 ml 6 molliter saltsyre (32) hvorefter der tilsaeligttes 5 ml hydrogenperoxid (36) og fyldes op med vand til 1 liter

381 Arbejdsstandardkobberoploslashsning (10 μg Cuml) fremstilles ved at fortynde 1 del stamoploslashsning (38) med 9 dele vand og derefter fortynde 1 del af den saringledes opnaringede oploslashsning med 9 dele vand

B


39 Standardmanganoploslashsning (1 000 μg Mnml) fremstilles som foslashlger (farings en tilsvarende oploslashsning i handelen kan denne anvendes)

mdash 1 g mangan i pulverform oploslashses i 25 ml 6 molliter saltsyre (32) og der fyldes op til 1 liter med vand

391 Arbejdsstandardmanganoploslashsning (10 μg Mnml) fremstilles ved at fortynde 1 del stamoploslashsning (39) med 9 dele vand og derefter fortynde 1 del af den saringledes opnaringede oploslashsning med 9 dele vand

310 Standardzinkoploslashsning (1 000 μg Znml) fremstilles som foslashlger (farings en tilsvarende oploslashsning i handelen kan denne anvendes)

mdash 1 g zink i baringnd eller bladform oploslashses i 25 ml 6 molliter saltsyre (32) og der fyldes op med vand til 1 liter

3101 Arbejdsstandardzinkoploslashsning (10 μg Znml) fremstilles ved at fortynde 1 del stamoploslashsning (310) med 9 dele vand og derefter fortynde 1 del af den saringledes opnaringede oploslashsning med 9 dele vand

311 Lanthanchloridoploslashsning 12 g lanthanoxid oploslashses i 150 ml vand hvorshyefter der tilsaeligttes 100 ml 6 molliter saltsyre (32) og fyldes op med vand til 1 liter

4 Apparatur

41 Muffelovn med temperaturregulering og helst pyrometer

42 Glasudstyr skal vaeligre af modstandsdygtigt borsilikat og det anbefales at det paringgaeligldende apparatur udelukkende anvendes til bestemmelse af mikromineraler

43 Atomabsorptionsspektrofotometer som opfylder de relevante metodeshykrav med hensyn til foslashlsomhed og noslashjagtighed i det kraeligvede omraringde

5 Fremgangsmaringde ( 1 )

51 Proslashver indeholdende organisk stof

511 F o r a s k n i n g o g f r e m s t i l l i n g a f p r oslash v e o p l oslash s n i n g e n t i l a n a l y s e ( 2 )

5111 5ndash10 g af proslashven afvejes med 02 mg noslashjagtighed i en kvarts- eller platindigel (se bemaeligrkning b)) proslashven toslashrres i toslashrreskab ved 105

o C og diglen anbringes i en kold muffelovn (41) Ovnen lukkes (se bemaeligrkning c)) og temperaturen oslashges gradvis til 450ndash475

o C i loslashbet af ca 90 minutter Denne temperatur holdes i 4ndash16 timer (feks natten over) for at fjerne kulstofholdigt materiale hvorefter ovnen aringbnes til afkoslashling (se bemaeligrkning d))

B


( 1 ) Der kan ogsaring anvendes andre destruktionsmetoder forudsat at de bevisligt giver tilsvashyrende resultater (som feks mikroboslashlgedestruktion)

( 2 ) Groslashntfoder (frisk eller toslashrret) indeholder ofte store maeligngder vegetabilsk silicium som kan binde mikromineraler og derfor maring fjernes Til proslashver af denne type foder skal derfor foslashlgende aeligndrede fremgangsmaringde anvendes Det under punkt 5111 beskrevne udfoslashres indtil filtreringen Filtrerpapiret indeholdende den uoploslashselige remanens vaskes 2 gange med kogende vand og anbringes i en kvarts- eller platindigel Der foraskes i muffelovn (41) ved en temperatur paring under 550 degC indtil alt kulstofholdigt materiale er forsvundet fuldstaeligndig Efter afkoslashling tilsaeligttes nogle faring draringber vand og derefter 10-15 ml flussyre (34) og der inddampes til toslashrhed ved ca 150 degC Hvis der stadig er silicium i inddampningsresten genoploslashses denne i nogle faring ml flussyre (34) og inddampes til toslashrhed Der tilsaeligttes 5 draringber svovlsyre (35) og opvarmes indtil der ikke mere afgives hvide dampe Efter tilsaeligtning af 5 ml 6 molliter saltsyre (32) og ca 30 ml vand opvarmes oploslashsningen derefter filtreres denne ned i en 250 ml maringlekolbe og der fyldes op med vand til maeligrket (HCl-koncentration ca 05 moll) Bestemmelsen fortshysaeligttes derefter fra punkt 512

Asken fugtes med vand og overfoslashres til et 250 ml baeliggerglas Diglen skylles med i alt ca 5 ml saltsyre (31) som overfoslashres langsomt og omhyggeligt til baeliggerglasset (en voldsom reaktion kan forekomme paring grund af dannelse af CO 2 ) Der tilsaeligttes saltsyre (31) draringbevis under omroslashring indtil enhver opbrusning er ophoslashrt Der inddampes til toslashrhed under lejlighedsvis omroslashring med en glasspatel

Der tilsaeligttes foslashrst 15 ml 6 molliter saltsyre (32) og dernaeligst 120 ml vand til remanensen Der omroslashres med glasspatelen som skal forblive i baeliggerglasset og dette tildaeligkkes med et urglas Indholdet bringes til svag kogning og holdes paring kogepunktet indtil der tilsyneladende ikke oploslashses mere aske Der filtreres gennem et askefrit filtrerpapir over i en 250 ml maringlekolbe Baeliggerglasset vaskes og der filtreres med 5 ml varm 6 molliter saltsyre (32) samt to gange med kogende vand Maringlekolben fyldes op til maeligrket med vand (HCl-koncentration ca 05 molliter)

5112 Hvis remanensen paring filtret er sort (kulstof) saeligttes den tilbage i ovnen og der foraskes igen ved 450ndash475

o C Denne foraskning som kun kraeligver nogle faring timer (ca 3ndash5 timer) er gennemfoslashrt naringr asken er hvid eller naeligsten hvid Remanensen oploslashses i ca 2 ml saltsyre (31) og inddampes til toslashrhed hvorefter der tilsaeligttes 5 ml 6 molliter saltsyre (32) Der opvarmes oploslashsningen filtreres over i maringlekolben og der fyldes op til maeligrket med vand (ca 05 molliter HCl-koncentration)

Bemaeligrkninger

a) Ved bestemmelse af mikromineraler er det vigtigt at vaeligre opmaeligrksom paring risikoen for forurening isaeligr med zink kobber og jern Derfor skal det udstyr som anvendes til klargoslashring af proslashverne vaeligre fri for disse metaller

For at mindske den almindelige forureningsrisiko arbejdes i en stoslashvfri atmosfaeligre med pinligt rent udstyr og omhyggeligt afvaskede glasshyvarer Bestemmelsen af zink er saeligrligt foslashlsom over for mange typer forurening feks fra glas reagenser stoslashv osv

b) Vaeliggten af den proslashve der skal foraskes beregnes ud fra det omtrentshylige forventede indhold af mikromineraler i foderet i relation til det anvendte spektrofotometers foslashlsomhed For visse typer foder hvis mikromineralindhold er lavt kan det vaeligre noslashdvendigt at starte med en proslashve paring 10ndash20 g og begraelignse den endelige oploslashsning til kun 100 ml

c) Foraskning skal udfoslashres i en lukket ovn uden gennemblaeligsning med luft eller oxygen

d) Pyrometrets temperaturudvisning maring ikke overstige 475 o C

512 S p e k t r o f o t o m e t r i s k b e s t e m m e l s e

5121 F r e m s t i l l i n g a f k a l i b r e r i n g s o p l oslash s n i n g e r

For hvert af de grundstoffer som skal bestemmes skal der ud fra arbejdsstandardoploslashsningerne 371 381 391 og 3101 fremstilles en raeligkke kalibreringsoploslashsninger hver med en HCl-koncentration paring ca 05 molliter og (for saring vidt angaringr jern mangan og zink) en lantshyhanchloridkoncentration svarende til 01 La (wv)

De valgte koncentrationer for mikromineraler skal ligge inden for det anvendte spektrofotometers foslashlsomhedsomraringde Som eksempler er i tabellerne nedenfor angivet sammensaeligtningen af typiske raeligkker af kalishybreringsoploslashsninger Afhaeligngigt af spektrofotometret og dets foslashlsomhed kan det dog vaeligre noslashdvendigt at vaeliglge andre koncentrationer

B


Jern

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5

ml arbejdsstandardoploslashsning (371) (1 ml = 100 μg Fe)

0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7

+ 10 ml lanthanchloridoploslashsning (311) mdash der fyldes op med vand til 100 ml

Kobber

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10

ml arbejdsstandardoploslashsning (381) (1 ml = 10 μg Cu)

0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10

ml arbejdsstandardoploslashsning (391) (1 ml = 10 μg Mn)

0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08

ml arbejdsstandardoploslashsning (3101) (1 ml = 10 μg Zn)

0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


5122 F r e m s t i l l i n g a f p r oslash v e o p l oslash s n i n g t i l a n a l y s e

Til bestemmelse af kobber kan den oploslashsning som er fremstillet efter punkt 511 normalt anvendes direkte Hvis det er noslashdvendigt for at bringe dens koncentration ind i kalibreringsoploslashsningernes omraringde kan en alikvot maeligngde afpipetteres i en 100 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med 05 molliter saltsyre (33)

Til bestemmelse af jern mangan og zink afpipetteres en alikvot maeligngde af den efter punkt 511 fremstillede oploslashsning i en 100 ml maringlekolbe der tilsaeligttes 10 ml lanthanchloridoploslashsning (311) og der fyldes op til maeligrket med 05 molliter saltsyre (33) (se ogsaring punkt 8 raquoBemaeligrkshyninglaquo)

5123 B l i n d b e s t e m m e l s e

Blindbestemmelsen skal indeholde alle trinene under fremgangsmaringden blot skal proslashvematerialet udelades Kalibreringsoploslashsning raquo0laquo maring ikke anvendes som blind

5124 M aring l i n g a f a t o m a b s o r p t i o n

Atomabsorptionen for kalibreringsoploslashsningerne og den oploslashsning der skal analyseres maringles ved anvendelse af en oxiderende luftacetylenshyflamme ved foslashlgende boslashlgelaeligngder

Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

B


Mn 2795 nm

Zn 2138 nm

Hver af maringlingerne gentages fire gange

52 Mineralfoder

Hvis proslashven ikke indeholder organisk materiale er forudgaringende foraskshyning unoslashdvendig Fremgangsmaringden i punkt 5111 foslashlges idet der startes fra andet afsnit Fordampning i tilstedevaeligrelse af flussyre kan udelades


Ved anvendelse af en kalibreringskurve beregnes koncentrationen af mikromineralet i den oploslashsning som skal analyseres og resultatet angives i mg mikromineral pr kg proslashve (ppm)

7 Repeterbarhed


mdash 5 mgkg i absolut vaeligrdi for indhold af det paringgaeligldende mikromineral paring op til 50 mgkg

mdash 10 af det hoslashjeste resultat for indhold af det paringgaeligldende mikromishyneral paring 50ndash100 mgkg

mdash 10 mgkg i absolut vaeligrdi for indhold af det paringgaeligldende mikromishyneral paring 100ndash200 mgkg

mdash 5 af det hoslashjeste resultat for indhold af det paringgaeligldende mikromishyneral paring over 200 mgkg

8 Bemaeligrkning

Tilstedevaeligrelse af store maeligngder phosphater kan interferere paring bestemshymelsen af jern mangan og zink En saringdan interferens skal korrigeres gennem tilsaeligtning af lanthanchloridoploslashsning (311) Hvis imidlertid vaeliggtforholdet Ca + MgP er gt 2 i proslashven kan tilsaeligtning af lanthanchshylorid (311) til den oploslashsning der skal analyseres og til kalibreringsshyoploslashsningerne udelades

D BESTEMMELSE AF HALOFUGINON

DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-(3-hydroxy-2-piperidyl)acetonyl]-quinazolin-4(3H)-on-hydrobromid


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af halofuginon i foder Bestemmelsesgraelignsen er 1 mgkg

2 Princip

Efter behandling med varmt vand ekstraheres halofuginon som fri base med ethylacetat og separeres derefter som hydrochlorid over i en vandig syreoploslashsning Ekstraktet oprenses ved ionbytningskromatografi Indholdet af halofuginon bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor

3 Reagenser

31 Acetonitril svarende til HPLC-kvalitet

32 Amberlit XAD-2-resin

33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat

35 Iseddike

B


36 Halofuginonstandardstof (DL-trans-7-brom-6-chlor-3-[3-hydroxy-2-pipeshyridyl)acetonyl]-quinazolin-4-(3H)-on-hydrobromid E 764)

361 H a l o f u g i n o n s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 1 0 0 μ g m l

50 mg halofuginon (36) afvejes med 01 mg noslashjagtighed i en 500 ml maringlekolbe og oploslashses i ammoniumacetatbufferoploslashsning (318) hvorshyefter der fyldes op med bufferoploslashsning til maeligrket og blandes Denne oploslashsning er stabil i tre uger ved 5

o C ved opbevaring i moslashrke

362 K a l i b r e r i n g s o p l oslash s n i n g e r

Henholdsvis 10 20 30 40 og 60 ml af standardstamoploslashsningen (361) overfoslashres til hver sin 100 ml maringlekolbe Der fyldes op til maeligrket med mobil fase (321) og blandes Disse oploslashsninger har en koncentration paring henholdsvis 10 20 30 40 og 60 μgml halofugishynon Disse oploslashsninger skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

37 Saltsyre ρ 20 = ca 116 gml

38 Methanol

39 Soslashlvnitrat

310 Natriumascorbat

311 Natriumcarbonat

312 Natriumchlorid

313 EDTA (dinatriumethylendiamintetraacetat)

314 Vand svarende til HPLC-kvalitet

315 Natriumcarbonatoploslashsning c = 10 g100 ml

316 Saltmaeligttet natriumcarbonatoploslashsning c = 5 g100 ml

50 g natriumcarbonat (311) oploslashses i vand og fortyndes til 1 liter hvorshyefter der tilsaeligttes natriumchlorid (312) indtil oploslashsningen er maeligttet

317 Saltsyre ca 01 molliter

10 ml HCI (37) fortyndes med vand til 1 liter

318 Ammoniumacetatbufferoploslashsning ca 025 molliter

193 g ammoniumacetat (33) og 30 ml eddikesyre (35) oploslashses i vand (314) og fortyndes til 1 liter

319 Amberlit XAD-2-resin-materiale

En passende maeligngde amberlit (32) vaskes med vand til alle chlorishydioner er fjernet saringledes som det viser sig ved kontrol med soslashlvnitrat (320) paring den kasserede vandige fase Resinet vaskes derefter med 50 ml methanol (38) methanolen kasseres og resinet opbevares under frisk methanol

320 Soslashlvnitratoploslashsning ca 01 molliter

017 g soslashlvnitrat (39) oploslashses i 10 ml vand

321 Mobil fase til HPLC

500 ml acetonitril (31) blandes med 300 ml ammoniumacetatbufferopshyloslashsning (318) og 1 200 ml vand (314) pH justeres til 43 med eddikeshysyre (35) Der filtreres gennem et 022 μm filter (48) og oploslashsningen afgasses (feks ved ultralydsbehandling i 10 minutter) Denne oploslashsning er stabil i en maringned hvis den opbevares moslashrkt i en lukket beholder

B


4 Apparatur

41 Ultralydsbad


43 Centrifuge

44 HPLC-udstyr med ultraviolet detektor med variabel boslashlgelaeligngde eller med diodearraydetektor


45 Glaskolonne (300 mm times 10 mm) med filter af sintret glas og stophane

46 Glasfiberfiltre diameter 150 mm

47 Membranfiltre 045 μm


5 Fremgangsmaringde

NB Halofuginon er som fri base ustabilt i alkaliske oploslashsninger og ethylacetatoploslashsninger Maring ikke henstaring i ethylacetat i over 30 minutter

51 Generelt

511 Der analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken halofuginon eller interfererende stoffer er til stede

512 Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde halofuginon svarende til den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 3 mgkg tilsaeligttes 300 μl af standardstamoploslashsningen (361) til 10 g blindproslashve Der blandes og ventes i 10 minutter inden der fortsaeligttes med ekstrakshytion (52)

NB Til denne metode anvendes en blindproslashve af samme type som analyseproslashven og som ved analyse viser sig ikke at indeholde halofuginon

52 Ekstraktion

10 g af den klargjorte proslashve afvejes med en noslashjagtighed paring 01 g i et 200 ml centrifugeglas hvorefter der tilsaeligttes 05 g natriumascorbat (310) 05 g EDTA (313) og 20 ml vand og blandes Centrifugeglasset anbringes i vandbad (80

o C) i 5 minutter Efter afkoslashling til rumtempeshyratur tilsaeligttes 20 ml natriumcarbonatoploslashsning (315) og blandes Der tilsaeligttes straks 100 ml ethylacetat (34) og glasset rystes kraftigt i haringnden i 15 sekunder Derefter anbringes glasset i 3 minutter i ultralydsshybadet (41) og proppen loslashsnes Der centrifugeres i 2 minutter og ethyshylacetatfasen haeligldes gennem et glasfiberfilter (46) over i en 500 ml skilletragt Ekstraktionen af proslashven gentages med en ny portion paring 100 ml ethylacetat De samlede ekstrakter vaskes i 1 minut med 50 ml saltmaeligttet natriumcarbonatoploslashsning (316) og den vandige fase kasseres

Den organiske fase ekstraheres i 1 minut med 50 ml saltsyre (317) Den nederste syrefase aftappes i en 250 ml skilletragt Den organiske fase ekstraheres igen i 15 minutter med yderligere 50 ml saltsyre og blandes med det foslashrste ekstrakt De samlede syreekstrakter vaskes ved omrystshyning i ca 10 sekunder med 10 ml ethylacetat (34)

B


Den vandige fase overfoslashres kvantitativt til en 250 ml rundbundet kolbe og den organiske fase kasseres Al den resterende ethylacetat inddampes fra syreoploslashsningen ved brug af en rotationsfordamper (42) Vandbadets temperatur maring ikke vaeligre over 40

o C Under et vakuum paring ca 25 mbar vil al den resterende ethylacetat blive fjernet i loslashbet af 5 minutter ved 38

o C

53 Oprensning

531 K l a r g oslash r i n g a f a m b e r l i t k o l o n n e n

Der klargoslashres en XAD-2-kolonne for hvert proslashveekstrakt 10 g behandlet amberlit (319) overfoslashres med methanol (38) til en glaskolonne (45) Der anbringes en lille tot glasuld paring toppen af resinkolonnen Methashynolen aftappes fra kolonnen og resinet vaskes med 100 ml vand idet der standses naringr vaeligsken naringr toppen af resinkolonnen Kolonnen henstaringr for at komme i ligevaeliggt i 10 minutter inden brug Man maring aldrig lade kolonnen loslashbe toslashr

532 O p r e n s n i n g a f p r oslash v e n

Ekstraktet (52) overfoslashres kvantitativt til den klargjorte amberlitkolonne (531) og der elueres eluatet kasseres Elueringshastigheden maring ikke vaeligre over 20 mlminuttet Den rundbundede kolbe skylles med 20 ml saltsyre (317) som derefter benyttes til at rense resinkolonnen Evenshytuelt resterende syreoploslashsning fjernes med luft Skyllevaeligskerne kasseres 100 ml methanol (38) tilsaeligttes til kolonnen og 5ndash10 ml elueres eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe Den resterende methanol henstaringr i 10 minutter for at komme i ligevaeliggt med resinkolonnen og elueringen fortsaeligttes ved en hastighed paring ikke over 20 mlminuttet eluatet opsamles i samme rundbundede kolbe Methanolen inddampes paring rotationsfordamperen (42) vandbadets temperatur maring ikke vaeligre paring over 40

o C Remanensen overfoslashres kvantitativt til en 10 ml maringlekolbe ved brug af den mobile fase (321) Der fyldes op til maeligrket med mobil fase og blandes En alikvot maeligngde filtreres gennem et membranfilter (47) Denne oploslashsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (54)

54 HPLC-bestemmelse

541 P a r a m e t r e


HPLC-kolonne (441)

Mobil fase til HPLC (321)


Detektionsboslashlgelaeligngde 243 nm

Injektionsvolumen 40ndash100 μl

Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres ved at der flere gange indsproslashjtes kalibreringsoploslashsning (362) med 30 μgml indtil der opnarings konstante tophoslashjder (-arealer) og retentionstider

542 K a l i b r e r i n g s k u r v e

Hver kalibreringsoploslashsning (362) indsproslashjtes flere gange og hoslashjden af toppene (arealerne) bestemmes for hver koncentration Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsoploslashsningernes middeltophoslashjder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μgml som abscisse

B


543 P r oslash v e o p l oslash s n i n g

Proslashveekstraktet (532) indsproslashjtes flere gange idet der benyttes samme maeligngde som til kalibreringsoploslashsningerne og middeltophoslashjden (-areashylet) af halofuginontoppene bestemmes


Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af proslashveoploslashsningens halofuginontoppe bestemmes koncentrationen i proslashveoploslashsningen i μgml ved benyttelse af kalibreringskurven (542)

Proslashvens indhold af halofuginon w (mgkg) beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 c Uuml 10

m

hvor

c = proslashveoploslashsningens halofuginonkoncentration i μgml m = testportionens vaeliggt i gram

7 Validering af resultater

71 Identitet

Analyttens identitet kan bekraeligftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor hvormed spektrene for proslashveekstraktet og kalibreringsoploslashsningen (362) indeholdende 60 μgml sammenlignes

711 K o - k r o m a t o g r a f i

Et proslashveekstrakt spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde kalibreshyringsoploslashsning (362) Den tilsatte maeligngde halofuginon skal svare til den skoslashnnede maeligngde halofuginon der er fundet i proslashveekstraktet

Kun hoslashjden af halufuginontoppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde og fortyndingen af ekstraktet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for plusmn 10 af den oprindelige bredde

712 D i o d e a r r a y d e t e k t i o n

Resultaterne vurderes i overensstemmelse med foslashlgende kriterier

a) Den maksimale absorptionsboslashlgelaeligngde for proslashvens og standardens spektre maringlt ved toppens spids paring kromatogrammet skal vaeligre den samme inden for en margin der afhaelignger af detektionssystemets oploslashsningsevne For diodearraydetektion ligger denne typisk inden for plusmn 2 nm

b) Mellem 225 og 300 nm maring proslashvens og standardens spektre registreret ved toppens spids paring kromatogrammet ikke vaeligre forskellige fra hinanden i de dele af spektret der ligger inden for 10ndash100 relativ absorbans Dette kriterium er opfyldt naringr de samme maksima er til stede og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 af standardanalyttens absorbans

c) Mellem 225 og 300 nm maring spektrene ved toppens forside spids og bagside frembragt med proslashveekstraktet ikke vaeligre forskellige fra hinanden i de dele af spektret der ligger inden for 10ndash100 relativ absorbans Dette kriterium er opfyldt naringr de samme maksima er til stede og afvigelsen mellem spektrene i intet obsershyveret punkt overstiger 15 af spektrets absorbans i spidsen

B


Hvis et af disse kriterier ikke er opfyldt er analyttens tilstedevaeligrelse ikke bekraeligftet

72 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring hoslashjst vaeligre paring 05 mgkg for halofuginonindhold paring op til 3 mgkg

73 Genfinding

For den spikede blindproslashve skal genfindingen vaeligre mindst 80


Der er gennemfoslashrt en ringanalyse ( 1 ) hvor 3 proslashver blev analyseret af 8 laboratorier

Resultater

Proslashve A (blind)

ved modtagelse

Proslashve B (mel) Proslashve C (piller)

ved modtagelse

efter 2 maringneder

ved modtagelse

efter 2 maringneder

Middelvaeligrdi [mgkg] ND 280 242 289 245

S R [mgkg] mdash 045 043 040 042

CV R [ ] mdash 16 18 14 17

Genf [ ] 86 74 88 75

ND = ikke paringvist S R = standardafvigelse for reproducerbarhed CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed ( ) Genf = genfinding ( )

E BESTEMMELSE AF ROBENIDIN

13-Bis[(4-chlorbenzyliden)amino]guanidinhydrochlorid


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af robenidin i foder Bestemmelsesgraelignsen er 5 mgkg

2 Princip

Proslashven ekstraheres med sur methanol Ekstraktet toslashrres og en alikvot maeligngde oprenses paring en aluminiumoxidkolonne Robenidinet elueres fra kolonnen med methanol og koncentreres og rumfanget oslashges i passende grad ved tilsaeligtning af mobil fase Indholdet af robenidin bestemmes ved omvendt-fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor

3 Reagenser

31 Methanol

32 Sur methanol

40 ml saltsyre (ρ20 = 118 gml) overfoslashres til en 500 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol (31) og blandes Denne oploslashsning skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

B


( 1 ) The Analyst 108 1983 s 1252-1256


34 Molekylsi

Type 3A 8ndash12 mesh (16ndash25 mm kugler krystallinsk aluminiumsilikat porediameter 03 mm)

35 Aluminiumoxid sur aktivitetskvalitet I til soslashjlekromatografi

100 g aluminiumoxid overfoslashres til en egnet beholder og der tilsaeligttes 20 ml vand Beholderen tilproppes og rystes i ca 20 minutter Vaeligsken opbevares i en godt tilproppet beholder

36 Kaliumdihydrogenphosphatoploslashsning c = 0025 molliter

340 g kaliumdihydrogenphosphat oploslashses i vand (HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket og blandes

37 Dinatriumhydrogenphosphatoploslashsning c = 0025 molliter

355 g vandfrit (eller 445 g dihydrat eller 895 g dodecahydrat) dinashytriumhydrogenphosphat oploslashses i vand (svarende til HPLC-kvalitet) i en 1 000 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket og blandes


Foslashlgende reagenser blandes

650 ml acetonitril (33)

250 ml vand (svarende til HPLC-kvalitet)

50 ml kaliumdihydrogenphosphatoploslashsning (36)

50 ml dinatriumhydrogenphosphatoploslashsning (37)

Der filtreres gennem et 022 μm filter (46) og oploslashsningen afgasses (feks ved ultralydsbehandling i 10 minutter)

39 Standardstof

Rent robenidin 13-bis[(4-chlorbenzyliden)amino)] guanidinhydrochloshyrid

391 R o b e n i d i n s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 3 0 0 μ g m l

30 mg robenidinstandardstof (39) afvejes med en noslashjagtighed paring 01 mg og oploslashses i sur methanol (32) i en 100 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med samme oploslashsningsmiddel og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i moslashrke

392 R o b e n i d i n s t a n d a r d m e l l e m o p l oslash s n i n g 1 2 μ g m l

100 ml af standardstamoploslashsningen (391) overfoslashres til en 250 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes til maeligrket med mobil fase (38) og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i moslashrke


Henholdsvis 50 100 150 200 og 250 ml af standardmellemoploslashsshyningen (392) overfoslashres til hver sin 50 ml maringlekolbe Der fyldes op til maeligrket med mobil fase (38) og blandes Disse oploslashsninger svarer til henholdsvis 12 24 36 48 og 60 μgml robenidin Disse oploslashsninger skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen


B


4 Apparatur

41 Glaskolonne

Fremstillet af brunt glas og forsynet med stophane og med en kapacitet paring ca 150 ml indvendig diameter 10ndash15 mm laeligngde 250 mm



44 HPLC-udstyr med ultraviolet detektor med variabel boslashlgelaeligngde eller med diodearraydetektor som arbejder i omraringdet fra 250 til 400 nm


45 Glasfiberfiltrerpapir (Whatman GFA eller tilsvarende)



5 Fremgangsmaringde

NB Robenidin er lysfoslashlsomt Der anvendes udstyr af brunt glas i alle arbejdsgange

51 Generelt

511 Der analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken robenidin eller interfererende stoffer er til stede

512 Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven (511) som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde robenidin svarende til den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 60 mgkg overfoslashres 30 ml af standardstamoploslashsningen (391) til en 250 ml konisk kolbe Oploslashsningen inddampes til ca 05 ml i en nitrogenstroslashm Der tilsaeligttes 15 g af blindproslashven blandes og ventes i 10 minutter inden der fortshysaeligttes med ekstraktion (52)

NB Til denne metode anvendes en blindproslashve af samme type som analyseproslashven og som ved analyse viser sig ikke at indeholde robenidin

52 Ekstraktion

Ca 15 g af den klargjorte proslashve afvejes med en noslashjagtighed paring 001 g overfoslashres til en 250 ml konisk kolbe og tilsaeligttes 1000 ml sur methanol (32) hvorefter kolben tilproppes og rystes i 1 time paring rysteapparatet (42) Oploslashsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (45) og hele filtratet opsamles i en 150 ml konisk kolbe Der tilsaeligttes 75 mg moleshykylsi (34) tilproppes og omrystes i 5 minutter Derefter filtreres omgaringshyende gennem et glasfiberfiltrerpapir Denne oploslashsning anvendes til oprensningsprocessen (53)

53 Oprensning

531 K l a r g oslash r i n g a f a l u m i n i u m o x i d k o l o n n e n

En lille prop af glasuld anbringes i den nedre ende af en glaskolonne (41) og skubbes helt ned med en glasstang 110 g af den klargjorte aluminiumoxid (35) afvejes og overfoslashres til kolonnen Eksponeringen for luft begraelignses mest muligt paring dette stadium Der bankes let paring kolonnens nederste ende for at faring aluminiumoxiden til at saeligtte sig

B


532 P r oslash v e o p r e n s n i n g

Med pipette overfoslashres 50 ml af det under (52) fremstillede proslashveeksshytrakt til kolonnen Man holder spidsen af pipetten naeligr kolonnevaeligggen og lader oploslashsningen absorbere af aluminiumoxiden Robenidinet elueres fra kolonnen under anvendelse af 100 ml methanol (31) med en gennemstroslashmningshastighed paring 2ndash3 mlminuttet og eluatet opsamles i en 250 ml rundbundet kolbe Methanoloploslashsningen inddampes til toslashrhed under reduceret tryk ved 40

o C ved hjaeliglp af en rotationsfordamper (43) Remanensen oploslashses i 3ndash4 ml mobil fase (38) og overfoslashres kvantitativt til en 10 ml maringlekolbe Kolben skylles med flere portioner paring 1ndash2 ml mobil fase som overfoslashres til maringlekolben Der fyldes op til maeligrket med samme oploslashsningsmiddel og blandes En alikvot maeligngde filtreres gennem et 045 μm membranfilter (47) Denne oploslashsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (54)

54 HPLC-bestemmelse


Foslashlgende betingelser er vejledende andre betingelser kan benyttes forudsat at de giver tilsvarende resultater HPLC-kolonne (441) Mobil fase til HPLC (38) Flow 15ndash2 mlminuttet Detektorboslashlgelaeligngde 317 nm Injektionsvolumen 20ndash50 μl Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres ved at der flere gange indsproslashjtes kalibreringsoploslashsning (393) med 36 μgml indtil der opnarings konstante tophoslashjder og retentionstider




Proslashveekstraktet (532) indsproslashjtes flere gange idet der benyttes samme maeligngde som til kalibreringsoploslashsningerne og middeltophoslashjden (-areashylet) af robenidintoppene bestemmes


Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af proslashveoploslashsningens robenidintoppe bestemmes koncentrationen i proslashveoploslashsningen i μgml ved benyttelse af kalibreringskurven (542)

Proslashvens indhold af robenidin w (mgkg) beregnes efter ved foslashlgende formel

w frac14 c Uuml 200

m

hvor

c = proslashveoploslashsningens robenidinkoncentration i μgml m = testportionens vaeliggt i gram

B



71 Identitet



Et proslashveekstrakt spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde kalibreshyringsoploslashsning (393) Den tilsatte maeligngde robenidin skal svare til den skoslashnnede maeligngde robenidin der er fundet i proslashveekstraktet

Kun hoslashjden af robenidintoppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde og fortyndingen af ekstraktet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for ca 10 af den oprindelige bredde



a) Den maksimale absorptionsboslashlgelaeligngde for proslashvens og standardens spektre maringlt ved toppens spids paring kromatogrammet skal vaeligre den samme inden for en margin der afhaelignger af detektionssystemets oploslashsningsevne Ved diodearraydetektion er den typisk ca 2 nm




72 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ikke overstige 10 af det hoslashjeste resultat for robenishydinindhold paring over 15 mgkg

73 Genfinding



Der er gennemfoslashrt en EF-ringanalyse hvor 4 proslashver af fjerkraelig- og kaninfoder i form af mel eller piller blev analyseret af 12 laboratorier Der blev foretaget dobbeltanalyse af hver proslashve Resultaterne er vist i nedenstaringende skema

B


Fjerkraelig Kaniner

Mel Piller Mel Piller

Middelvaeligrdi [mgkg] 2700 2799 436 401 s r [mgkg] 146 126 144 166 CV r [] 54 45 33 41

S R [mgkg] 436 336 461 391 CV R [] 161 120 106 97

Genfinding [] 900 933 872 802

s r = standardafvigelse for repeterbarhed CV r = variationskoefficient for repeterbarhed S R = standardafvigelse for reproducerbarhed CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed

F BESTEMMELSE AF DICLAZURIL

26-Chlor-alpha-(4-chlorphenyl)-4-[45-dihydro-35-dioxo-124-triazin-2 (3H)-yl]-benzenacetonitril


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af diclazuril i foder og forblandinger Detektionsgraelignsen er 01 mgkg og bestemmelsesshygraelignsen er 05 mgkg

2 Princip

Efter tilsaeligtning af en intern standard ekstraheres proslashven med sur methashynol For foders vedkommende oprenses en alikvot del af ekstraktet paring en C 18 -fastfase-ekstraktionspatron Diclazuril elueres fra patronen med en blanding af sur methanol og vand Efter inddampning oploslashses remashynensen i DMFvand For forblandingers vedkommende inddampes ekstraktet og remanensen oploslashses i DMFvand Indholdet af diclazuril bestemmes ved ternaeligr gradient-HPLC i omvendt fase med anvendelse af UV-detektor

3 Reagenser


32 Ammoniumacetat

33 Tetrabutylammoniumhydrogensulfat (TBHS)



36 N N-Dimethylformamid (DMF)


38 Standardstof diclazuril II-24 26-chlor-alpha-(4-chlorphenyl)-4-[45- dihydro-35-dioxo-124-triazin-2(3H)-yl)-benzenacetonitril med garanshyteret renhed E 771

381 D i c l a z u r i l s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 5 0 0 μ g m l

Med en noslashjagtighed paring 01 mg afvejes 25 mg diclazurilstandardstof (38) i en 50 ml maringlekolbe Der oploslashses i DMF (36) fyldes op til maeligrket med DMF (36) og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie eller der anvendes en brun kolbe og oploslashsningen opbevares i koslashleskab Oploslashsningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C

B


382 D i c l a z u r i l s t a n d a r d o p l oslash s n i n g 5 0 μ g m l

Der overfoslashres 500 ml af standardstamoploslashsningen (381) til en 50 ml maringlekolbe fyldes op til maeligrket med DMF (36) og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie eller der anvendes en brun kolbe og oploslashsningen opbevares i koslashleskab Oploslashsningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C

39 Internt standardstof 26-dichlor-α-(4-chlorphenyl)-4-(45-dihydro-35- dioxo-124-triazin-2-(3H)-yl)-α-methylbenzenacetonitril

391 I n t e r n s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 5 0 0 μ g m l

Med en noslashjagtighed paring 01 mg afvejes 25 mg internt standardstof (39) i en 50 ml maringlekolbe Der oploslashses i DMF (36) fyldes op til maeligrket med DMF (36) og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie eller der anvendes en brun kolbe og oploslashsningen opbevares i koslashleskab Oploslashsshyningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C

392 I n t e r n s t a n d a r d o p l oslash s n i n g 5 0 μ g m l

Der overfoslashres 500 ml af den interne standardstamoploslashsning (391) til en 50 ml maringlekolbe fyldes op til maeligrket med DMF (36) og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie eller der anvendes en brun kolbe og oploslashsningen opbevares i koslashleskab Oploslashsningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C

393 I n t e r n s t a n d a r d o p l oslash s n i n g f o r f o r b l a n d i n g e r p 1 0 0 0 m g m l

(p = nominelt indhold af diclazuril i forblandingen i mgkg)

Med en noslashjagtighed paring 01 mg afvejes p10 mg af det interne standardshystof i en 100 ml maringlekolbe Der oploslashses i DMF (36) i et ultralydsbad (46) fyldes op til maeligrket med DMF og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie eller der anvendes en brun kolbe og kolben opbevares i koslashleskab Oploslashsningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C

310 Kalibreringsoploslashsning 2 μgml

Der afpipetteres 200 ml diclazurilstandardoploslashsning (382) og 200 ml intern standardoploslashsning (392) i en 50 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 16 ml DMF (36) fyldes op til maeligrket med vand og blandes Oploslashsningen skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

311 C 18 -fastfase-ekstraktionspatron feks Bond Elut stoslashrrelse 1 cm 3

sorbentmasse 100 mg

312 Ekstraktionsoploslashsningsmiddel sur methanol

Der afpipetteres 50 ml saltsyre (37) i 1 000 ml methanol (35) og blandes


3131 Eluent A ammoniumacetat-tetrabutylammoniumhydrogensulfat-oploslashsshyning

Der oploslashses 5 g ammoniumacetat (32) og 34 g TBHS (33) i 1 000 ml vand (31) og blandes

3132 Eluent B acetonitril (34)

3133 Eluent C methanol (35)

B


4 Apparatur

41 Mekanisk rysteapparat

42 Udstyr til ternaeligr gradient-HPLC

421 HPLC-kolonne Hypersil ODS 3 μm pakkemateriale 100 mm x 46 mm eller tilsvarende

422 UV-detektor med variabel boslashlgelaeligngde eller diodearraydetektor



45 Vakuummanifold

46 Ultralydsbad

5 Fremgangsmaringde

51 Generelt

511 B l i n d p r oslash v e

Der analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken diclazuril eller interfererende stoffer er til stede Blindproslashven skal vaeligre af samme type som den proslashve der skal undersoslashges og ved analyse maring diclazuril eller interfererende stoffer ikke paringvises

512 G e n f i n d i n g s t e s t

Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde diclazuril svarende til den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 1 mgkg tilsaeligttes der 01 ml af standardstamoploslashsningen (381) til 50 g af en blindproslashve der blandes omhyggeligt og efter henstand i 10 minutter blandes igen flere gange foslashr man garingr videre (52)

Hvis der ikke er en blindproslashve af samme type som analyseproslashven til raringdighed (se punkt 511) kan der alternativt udfoslashres en genfindingstest ved hjaeliglp af standardtilsaeligtningsmetoden I dette tilfaeliglde spikes den proslashve der skal analyseres ved tilsaeligtning af en maeligngde diclazuril svarende til den der allerede er til stede i proslashven Denne proslashve analyseres sammen med den ikke-spikede proslashve og genfindingen kan beregnes ved subtraktion

52 Ekstraktion

521 F o d e r

Med en noslashjagtighed paring 001 g afvejes der ca 50 g proslashve Det overfoslashres til en 500 ml konisk kolbe der tilsaeligttes 100 ml intern standardoploslashsshyning (392) og 200 ml ekstraktionsoploslashsningsmiddel (312) og kolben tilproppes Blandingen rystes natten over paring rysteapparatet (41) Henstilles til bundfaeligldning i 10 minutter En 20 ml alikvot af supernashytanten overfoslashres til en egnet glasbeholder og fortyndes med 20 ml vand Denne oploslashsning overfoslashres til en ekstraktionspatron (311) og ledes igennem ved hjaeliglp af vakuum (45) Patronen vaskes med 25 ml af en blanding af ekstraktionsoploslashsningsmiddel (312) og vand 65 + 35 (v + v) De opsamlede fraktioner kasseres og forbindelserne elueres med 25 ml af en blanding af ekstraktionsoploslashsningsmiddel (312) og vand 80 + 20 (v + v) Denne fraktion inddampes indtil den netop naringr toslashrhed ved hjaeliglp af rotationsfordamperen (43) ved 60

o C Remanensen oploslashses i 10 ml DMF (36) og der tilsaeligttes 15 ml vand (31) og blandes Der filtreres gennem et membranfilter (44) Der fortsaeligttes med HPLC-bestemmelse (53)

522 F o r b l a n d i n g e r

Med en noslashjagtighed paring 0001 g afvejes der ca 1 g proslashve Den overfoslashres til en 500 ml konisk kolbe der tilsaeligttes 100 ml intern standardoploslashsshyning (393) og 200 ml ekstraktionsoploslashsningsmiddel (312) og kolben

B


tilproppes Blandingen rystes natten over paring rysteapparatet (41) Henstilles til bundfaeligldning i 10 minutter En alikvot paring 10 000p ml (p = nominelt indhold af diclazuril i forblandingen i mgkg) af supershynatanten overfoslashres til en rundbundet kolbe af passende stoslashrrelse Der inddampes indtil den netop naringr toslashrhed under reduceret tryk ved hjaeliglp af rotationsfordamperen (43) ved 60

o C Remanensen oploslashses i 100 ml DMF (36) og der tilsaeligttes 150 ml vand (31) og blandes Der fortshysaeligttes med HPLC-bestemmelse (53)

53 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (421) Hypersil ODS 100 mm times 46 mm 3 μm pakkeshymateriale eller tilsvashyrende

Mobil fase Eluent A (3131) Vandig oploslashsning af ammoniumacetat og tetrabutylammoniumshyhydrogen-sulfat

Eluent B (3132) acetonitril

Eluent C (3133) methanol Elueringsmaringde mdash lineaeligr gradient

mdash startbetingelser A + B + C = 60 + 20 + 20 (V + V + V)

mdash efter 10 minutters gradienteluering mdash i 30 minutter til A + B + C = 45 + 20 + 35 (V + V + V)

Der skylles med B i 10 minutter Flow 15 mdash 2 mlminuttet

Injektionsvolumen 20 μl Detektorboslashlgelaeligngde 280 nm

Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres ved at der flere gange indsproslashjtes kalibreringsoploslashsning (310) med 20 μgml indtil der opnarings konstante tophoslashjder og retentionstider

532 K a l i b r e r i n g s o p l oslash s n i n g

Der indsproslashjtes 20 μl af kalibreringsoploslashsningen (310) flere gange og middeltophoslashjden (-arealet) af toppene for diclazuril og intern standard bestemmes


Der indsproslashjtes 20 μl af proslashveoploslashsningen (521 eller 522) flere gange og middeltophoslashjden (-arealet) af toppene for diclazuril og intern standard bestemmes


61 Foder

Diclazurilindholdet w (mgkg) i proslashven beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 h ds Uuml h ic h is Uuml h dc

Uuml c dc Uuml 10 V

m [mgkg]

B


hvor

h d s = tophoslashjde (-areal) for diclazuril i proslashveoploslashsningen (521) h i s = tophoslashjde (-areal) for den interne standard i proslashveoploslashsningen

(521) h d c = tophoslashjde (-areal) for diclazuril i kalibreringsoploslashsningen (310) h i c = tophoslashjde (-areal) for den interne standard i kalibreringsoploslashsshy

ningen (310) c d c = kalibreringsoploslashsningens diclazurilkoncentration i μgml (310) m = testportionens vaeliggt i gram V = proslashveekstraktets volumen ifoslashlge 521 (dvs 25 ml)

62 Forblandinger



Uuml c dc Uuml 002 V Uuml p

m [mgkg]

hvor

h d c = tophoslashjde (-areal) for diclazuril i kalibreringsoploslashsningen (310) h i c = tophoslashjde (-areal) for den interne standard i kalibreringsoploslashsshy

ningen (310) h d s = tophoslashjde (-areal) for diclazuril i proslashveoploslashsningen (522) h i s = tophoslashjde (-areal) for den interne standard i proslashveoploslashsningen

(522) c d c = kalibreringsoploslashsningens diclazurilkoncentration i μgml (310) m = testportionens vaeliggt i gram V = proslashveekstraktets volumen ifoslashlge 522 (dvs 25 ml) p = nominelt indhold af diclazuril i forblandingen i mgkg


71 Identitet

Analyttens identitet kan bekraeligftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor hvormed spektrene for proslashveekstraktet (521 eller 522) og kalibreringsoploslashsningen (310) sammenlignes


Et proslashveekstrakt (521 eller 522) spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde kalibreringsoploslashsning (310) Den tilsatte maeligngde diclazuril skal svare til den maeligngde diclazuril der er fundet i proslashveekstraktet

Kun hoslashjden af diclazuriltoppen og intern standard-toppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde og fortyndingen af ekstraktet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for plusmn 10 af den oprindelige bredde af diclazuriltoppen eller intern standard-toppen for det ikke-spikede proslashveekstrakt




B



c) Mellem 230 og 320 nm maring spektrene ved toppens forside spids og bagside frembragt med proslashveekstraktet ikke vaeligre forskellige fra hinanden i de dele af spektret der ligger inden for 10ndash100 relativ absorbans Dette kriterium er opfyldt naringr de samme maksima er til stede og afvigelsen mellem de to spektre i intet observeret punkt overstiger 15 af absorbansen for spektret i toppens spids


72 Repeterbarhed


mdash 30 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for diclazurilindhold paring 05ndash25 mgkg

mdash 075 mgkg for diclazurilindhold paring 25ndash5 mgkg

mdash 15 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for diclazurilindhold paring mere end 5 mgkg

73 Genfinding

For en spiket (blind)proslashve skal genfindingen vaeligre mindst 80


Der er gennemfoslashrt en ringanalyse hvor 5 proslashver blev analyseret af 11 laboratorier Disse proslashver bestod af to forblandinger den ene var blandet med en organisk matrix (O 100) og den anden med en uorganisk matrix (A 100) Det teoretiske indhold var 100 mg diclazuril pr kg De tre blandede kyllingefoderstoffer var fremstillet af 3 forskellige producenter (NL) (LlZ1K1) Det teoretiske indhold var 1 mg diclazuril pr kg Laboratorierne blev instrueret om at analysere hver af proslashverne eacuten gang eller som dobbeltbestemmelse (Journal of AOAC International bind 77 nr 6 1994 s 1359ndash1361 indeholder naeligrmere oplysninger om denne ringproslashve) Resultaterne er vist i nedenstaringende tabel

Proslashve 1 A 100

Proslashve 2 O 100

Proslashve 3 L1

Proslashve 4 Z1

Proslashve 5 K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12

Middelvaeligrdi 1008 1035 089 115 089

S r (mgkg) 588 764 015 002 003

CV r ( ) 583 738 1732 192 334

S R (mgkg) 759 764 017 011 012

CV R ( ) 753 738 1861 967 1365

Nominelt indhold (mgkg) 100 100 1 1 1

L = antal laboratorier n = antal enkeltvaeligrdier S r = standardafvigelse for repeterbarhed CV r = variationskoefficient for repeterbarhed

B


S R = standardafvigelse for reproducerbarhed

CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed

9 Bemaeligrkninger

Diclazurilresponset skal tidligere vaeligre paringvist at vaeligre lineaeligr i de koncenshytrationsomraringder hvori der maringles

G BESTEMMELSE AF LASALOCIDNATRIUM

Natriumsalt af en monocarboxylsyrepolyether der dannes af Streptomyces lasaliensis


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af lasalocidnatrium i foder og forblandinger Detektionsgraelignsen er 5 mgkg og bestemmelshysesgraelignsen er 10 mgkg

2 Princip

Lasalocidnatrium ekstraheres af proslashven i sur methanol og bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af spektrofluorometrisk detektor

3 Reagenser

31 Kaliumdihydrogenphosphat (KH 2 PO 4 )


33 Orthophosphorsyreoploslashsning c = 20

235 ml ortophosphorsyre (32) fortyndes med vand til 100 ml

34 6-Methyl-2-heptylamin(15-dimethylhexylamin) w (ww) = 99



37 Phosphatbufferoploslashsning c = 001 molliter

136 g KH 2 PO 4 (31) oploslashses i 500 ml vand (311) og der tilsaeligttes 35 ml orthophosphorsyre (32) og 100 ml 6-methyl-2-heptylamin (34) pH-vaeligrdien justeres til 40 med orthophosphorsyreoploslashsning (33) og der fortyndes til 1 000 ml med vand (311)

38 Sur methanol

Der overfoslashres 50 ml saltsyre (36) til en 1 000 ml maringlekolbe fyldes op til maeligrket med methanol (35) og blandes Oploslashsningen skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

39 Mobil fase til HPLC phosphatbuffermethanoloploslashsning 5 + 95 (V + V)

5 ml phosphatbufferoploslashsning (37) blandes med 95 ml methanol (35)

310 Lasalocidnatriumstandardstof med garanteret renhed C 34 H 53 O 8 Na (natriumsalt af en monocarboxylsyrepolyether der dannes af Streptoshymyces lasaliensis) E 763

3101 L a s a l o c i d n a t r i u m s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 5 0 0 μ g m l

50 mg lasalocidnatrium (310) afvejes med en noslashjagtighed paring 01 mg i en 100 ml maringlekolbe og oploslashses i sur methanol (38) og der fyldes op til maeligrket med samme oploslashsningsmiddel og blandes Denne oploslashsning skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

B


3102 L a s a l o c i d n a t r i u m s t a n d a r d m e l l e m o p l oslash s n i n g 5 0 μ g m l

Der afpipetteres 100 ml standardstamoploslashsning (3101) i en 100 ml maringlekolbe fyldes op til maeligrket med sur methanol (38) og blandes Oploslashsningen skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen


Henholdsvis 10 20 40 50 og 100 ml af standardmellemoploslashsningen (3102) overfoslashres til hver sin 50 ml maringlekolbe Der fyldes op til maeligrket med sur methanol (38) og blandes Disse oploslashsninger svarer til henholdsvis 10 20 40 50 og 100 μg lasalocidnatrium pr ml Disse oploslashsninger skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen


4 Apparatur

41 Ultralydsbad (eller vandbad med rysteanordning) med temperaturkontrol


43 HPLC-udstyr med injektionssystem egnet til injektionsvolumener paring 20 μl

431 HPLC-kolonne 125 mm x 4 mm omvendt-fase-C 18 5 μm pakkemateshyriale eller tilsvarende

432 Spektrofluorometer med variabel indstilling af excitations- og emissionsshyboslashlgelaeligngden

5 Fremgangsmaringde

51 Generelt


Til gennemfoslashrelse af genfindingstesten (512) analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken lasalocidnatrium eller interfererende stoffer er til stede Blindproslashven skal vaeligre af samme type som den proslashve der skal undersoslashges og ved analyse maring lasalocidnatrium eller interfererende stoffer ikke paringvises


Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde lasalocidnatrium svarende til den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 100 mgkg overfoslashres der 100 ml standardstamoploslashsning (3101) til en 250 ml konisk kolbe og oploslashsningen inddampes til ca 05 ml Der tilsaeligttes 50 g af blindproslashven og blandes omhyggeligt og efter henstand i 10 minutter blandes der paring ny flere gange inden der fortsaeligttes med ekstrakshytion (52)

Hvis der ikke er en blindproslashve af samme type som analyseproslashven til raringdighed (se punkt 511) kan der alternativt udfoslashres en genfindingstest ved hjaeliglp af standardtilsaeligtningsmetoden I dette tilfaeliglde spikes den proslashve der skal analyseres ved tilsaeligtning af en maeligngde lasalocidnatrium svarende til den der allerede er til stede i proslashven Denne proslashve analyseres sammen med den ikke-spikede proslashve og genfindingen beregnes ved subtraktion

52 Ekstraktion

521 F o d e r

Med en noslashjagtighed paring 001 g afvejes 5ndash10 g af proslashven i en 250 ml konisk kolbe med prop Der tilsaeligttes 1000 ml sur methanol (38) med pipette Proppen saeligttes loslashst paring og der omrystes forsigtigt saring proslashven

B


opslaeligmmes Kolben anbringes i ultralydsbad (41) ved ca 40 o C i 20

minutter hvorefter den fjernes og afkoslashles til rumtemperatur Kolben henstaringr i ca 1 time indtil opslaeligmningen har bundfaeligldet sig hvorparing en alikvot maeligngde filtreres gennem et 045 μm membranfilter (42) ned i en egnet beholder Der fortsaeligttes med HPLC-bestemmelse (53)


Med en noslashjagtighed paring 0001 g afvejes ca 2 g af den ikke-formalede forblanding i en 250 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 1000 ml sur methanol (38) og omrystes forsigtigt saring proslashven opslaeligmmes Kolben med indhold anbringes i ultralydsbad (41) ved ca 40

o C i 20 minutter hvorefter den fjernes og afkoslashles til rumtemperatur Der fortyndes op til maeligrket med sur methanol (38) og blandes omhyggeligt Kolben henstaringr i 1 time indtil opslaeligmningen har bundfaeligldet sig hvorparing en alikvot maeligngde filtreres gennem et 045 μm membranfilter (42) En passende maeligngde af det klare filtrat fortyndes med sur methanol (38) saring der fremkommer en endelig proslashveoploslashsning som indeholder ca 4 μgml lasalocidnatrium Der fortsaeligttes med HPLC-bestemmelse (53)

53 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (431) 125 mm times 4 mm omvendt-fase-C 18 5 μm pakkemateriale eller tilsvarende

Mobil fase (39) Blanding af phosphatbufferoploslashsning (37) og methanol (35) 5 + 95 (v + v)

Flow 12 mlminuttet

Detektionsboslashlgelaeligngde

Excitation 310 nm

Emission 419 nm




Hver kalibreringsoploslashsning (3103) indsproslashjtes flere gange og middeltshyophoslashjderne (-arealerne) bestemmes for hver koncentration Der tegnes en kalibreringskurve med middeltophoslashjderne (-arealerne) som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μgml som abscisse


Proslashveekstrakterne fra 521 eller 522 indsproslashjtes flere gange idet der benyttes samme maeligngde som til kalibreringsoploslashsningerne og middeltshyophoslashjderne (-arealerne) for lasalocidnatriumtoppene bestemmes


Ud fra middeltophoslashjden (-arealet) der er frembragt ved indsproslashjtning af proslashveoploslashsningen (533) bestemmes koncentrationen af lasalocidnashytrium (μgml) ved benyttelse af kalibreringskurven

B


61 Foder

Indholdet af lasalocidnatrium w (mgkg) i proslashven beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor

c = lasalocidnatriumkoncentrationen i proslashveoploslashsningen (521) i μgml V 1 = proslashveekstraktets volumen ifoslashlge 521 i ml (dvs 100) m = testportionens vaeliggt i gram

62 Forblandinger


w frac14 c Uuml V 2 Uuml f

m [mgkg]

hvor

c = lasalocidnatriumkoncentrationen i proslashveoploslashsningen (522) i μgml

V 2 = proslashveekstraktets volumen ifoslashlge 522 i ml (dvs 250) f = fortyndingsfaktor ifoslashlge 522 m = testportionens vaeliggt i gram


71 Identitet

Metoder baseret paring spektrofluorometri er mindre udsatte for interferens end metoder hvor der anvendes UV-detektion Analyttens identitet kan bekraeligftes ved ko-kromatografi


Et proslashveekstrakt (521 eller 522) spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde kalibreringsoploslashsning (3103) Den tilsatte maeligngde lasalocidshynatrium skal svare til den maeligngde lasalocidnatrium der er fundet i proslashveekstraktet Kun hoslashjden af lasalocidnatriumtoppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde lasalocidshynatrium og fortyndingen af ekstraktet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for plusmn 10 af bredden af den oprindelige top for det ikke-spikede proslashveekstrakt

72 Repeterbarhed


mdash 15 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for lasalocidnatriumshyindhold paring 30ndash100 mgkg

mdash 15 mgkg for lasalocidnatriumindhold paring 100ndash200 mgkg

mdash 75 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for lasalocidnatriumshyindhold paring over 200 mgkg

73 Genfinding

For den spikede foder(blind)proslashve skal genfindingen vaeligre mindst 80 For de spikede forblandingproslashver skal genfindingen vaeligre mindst 90

B



Der er gennemfoslashrt en ringanalyse () hvor 2 forblandinger (proslashve 1 og 2) og 5 foderstoffer (proslashve 3ndash7) blev analyseret af 12 laboratorier Der blev foretaget dobbeltanalyse af hver proslashve Resultaterne er vist i nedenshystaringende tabel

Proslashve 1 Forblanshy

ding (kylshylinger)

Proslashve 2 Forblanding (kalkuner)

Proslashve 3 Kalkunshypellets

Proslashve 4 Kyllingeshygranulat

Proslashve 5 Kalkunshy

foder

Proslashve 6 Kyllingeshyfoder A

Proslashve 7 Kyllingeshyfoder B

L 12 12 12 12 12 12 12 n 23 23 23 23 23 23 23


5 050 16 200 765 784 929 483 326

S r [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CV r [ ] 212 252 224 284 244 400 537 S R [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CV R [ ] 566 545 503 934 569 718 1070

Nominelt indhold [mg kg]

5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()

() Indhold oplyst af fabrikanten () Foder tilberedt paring laboratoriet

L = antal laboratorier n = antal enkeltvaeligrdier S r = standardafvigelse for repeterbarhed S R = standardafvigelse for reproducerbarhed CV r = variationskoefficient for repeterbarhed CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed

B


() Analyst 1995 120 s 2175ndash2180

BILAG V

ANALYSEMETODER TIL KONTROL FOR UOslashNSKEDE STOFFER I FODER

A BESTEMMELSE AF FRI GOSSYPOL OG TOTALGOSSYPOL


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af fri gossypol totalgossypol og kemisk naeligrt beslaeliggtede substanser i froslash mel og kager af bomuldsfroslash samt i foderblandinger indeholdende disse fodermidler hvis indholdet af fri gossypol totalgossypol og kemisk naeligrt beslaeliggtede stoffer er paring over 20 mgkg

2 Princip

Gossypol ekstraheres under tilstedevaeligrelse af 3-amino-1-propanol enten med en blanding af propan-2-ol og hexan til bestemmelse af fri gossypol eller med dimethylformamid til bestemmelse af totalgossypol og omsaeligttes med anilin til gossypol-dianilin hvis ekstinktion maringles ved 440 nm

3 Reagenser

31 Propan-2-ol-hexan-blanding 60 volumendele propan-2-ol blandes med 40 volumendele n-hexan

32 Oploslashsningsmiddel A I en 1 liter maringlekolbe fyldes der ca 500 ml propan-2-ol-hexan-blanding (31) 2 ml 3-amino-1-propanol 8 ml isedshydike og 50 ml vand og der fyldes op med propan-2-ol-hexan-blanding (31) til maeligrket Dette reagens er stabilt i 1 uge

33 Oploslashsningsmiddel B I en 100 ml maringlekolbe afpipetteres 2 ml 3-amino- 1-propanol og 10 ml iseddike hvorefter der afkoslashles til rumtemperatur og fyldes op med N N-dimethylformamid til maeligrket Dette reagens er stabilt i 1 uge

34 Anilin Saringfremt ekstinktionen i blindproslashven er stoslashrre end 0022 destilshyleres anilinen over zinkstoslashv idet de foslashrste og sidste 10 af destillatet kasseres I koslashleskab er dette reagens ved opbevaring i vel tillukket brunt glas holdbart i flere maringneder

35 Standardgossypoloploslashsning A I en 250 ml maringlekolbe oploslashses 279 mg gossypolacetat med oploslashsningsmiddel A (32) og der fyldes op til maeligrket med dette 50 ml af denne oploslashsning afpipetteres i en 250 ml maringlekolbe og der fyldes op til maeligrket med oploslashsningsmiddel A Gossypolkoncentrationen i denne oploslashsning er 002 mgml Foslashr brugen henstaringr denne oploslashsning i 1 time ved rumtemperatur

36 Standardgossypoloploslashsning B I en 50 ml maringlekolbe oploslashses 279 mg gossypolacetat i oploslashsningsmiddel B (33) og der fyldes op til maeligrket med dette Gossypolkoncentrationen i denne oploslashsning er 05 mgml

Standardgossypoloploslashsning A og B er stabile i 24 timer saringfremt de beskyttes mod lys

4 Apparatur

41 Mekanisk rysteapparat ca 35 omdrejninger i minuttet

B


42 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde

51 Afvejning af proslashven

Stoslashrrelsen af den afvejede stofmaeligngde afhaelignger af det formodede indhold af gossypol i proslashven Det er fordelagtigt at arbejde med en lille afvejning og med en relativt stor alikvot del af filtratet for at faring en tilstraeligkkelig maeligngde gossypol til en noslashjagtig fotometrisk maringling Til bestemmelse af fri gossypol i froslash mel og kager af bomuldsfroslash maring afvejshyningen ikke vaeligre paring mere end 1 g medens den for foderblandinger kan vaeligre paring op til 5 g En alikvot del af filtratet paring 10 ml er i de fleste tilfaeliglde passende den skal indeholde 50ndash100 μg gossypol Til bestemshymelse af totalgossypol skal afvejningen ligge paring 05ndash5 g saringledes at der i en alikvot del af filtratet paring 2 ml vil vaeligre et indhold paring 40ndash200 μg gossypol

Analyser udfoslashres ved en rumtemperatur paring ca 20 o C

52 Bestemmelse af fri gossypol

Den afvejede stofmaeligngde anbringes i en 250 ml kolbe med slibhals hvis bund er daeligkket med knust glas 50 ml af oploslashsningsmiddel A (32) tilsaeligttes med pipette kolben lukkes og der blandes i 1 time i rysteappashyrat Derparing filtreres gennem et toslashrt filter og filtratet opsamles i en lille kolbe med slibhals Under filtreringen tildaeligkkes tragten med et urglas

Lige store alikvote dele af filtratet indeholdende 50ndash100 μg gossypol afpipetteres i to 25 ml maringlekolber (A og B) Eventuelt fyldes op med oploslashsningsmiddel A (32) til 10 ml Derparing suppleres indholdet af kolben A med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til maeligrket Denne oploslashsning anvendes som referenceoploslashsning ved maringlingen af proslashveoploslashsningen

10 ml oploslashsningsmiddel A (32) afpipetteres i to andre 25 ml maringlekolber (C og D) Indholdet i kolben (C) suppleres med propan-2-ol-hexan- blandingen (31) til maeligrket Denne oploslashsning anvendes som referenceshyoploslashsning ved maringlingen af blindproslashveoploslashsningen

Hver af maringlekolberne (D) og (B) tilsaeligttes 2 ml anilin (34) Der opvarmes i 30 minutter paring kogende vandbad til udvikling af farvningen Derefter afkoslashles til rumtemperatur fortyndes med propan-2-ol-hexan- blandingen (31) til maeligrket og homogeniseres hvorefter det hele henstaringr i 1 time

Derparing maringles i spektrofotometret ved 440 nm i glaskuvetter paring 1 cm tykkelse blindproslashveoploslashsningens (D) ekstinktion i forhold til referenceoploslashsningen (C) og proslashveoploslashsningens (B) ekstinktion i forhold til referenceoploslashsningen (A)

Ekstinktionen af blindproslashveoploslashsningen traeligkkes fra ekstinktionen af proslashveoploslashsningen (= korrigeret ekstinktion) Paring basis af den fundne vaeligrdi beregnes indholdet af fri gossypol som beskrevet i punkt 6

53 Bestemmelse af totalgossypol

En afvejet stofmaeligngde indeholdende 1ndash5 mg gossypol kommes i en 50 ml maringlekolbe derparing tilsaeligttes 10 ml af oploslashsningsmidlet B (33) Samtidig klargoslashres en blindproslashve idet 10 ml af oploslashsningsmidlet B (33) kommes i en anden 50 ml maringlekolbe Begge maringlekolber opvarmes i 30 minutter paring kogende vandbad og der afkoslashles til rumtemperatur

B


Kolbernes indhold fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til maeligrket homogeniseres og henstaringr i 10ndash15 minutter Derparing filtreres og filtratet opsamles i kolber med slibhals

Der afpipetteres 2 ml af proslashvefiltratet i hver af to 25 ml maringlekolber og 2 ml af filtratet fra blindproslashven i hver af to andre 25 ml maringlekolber En kolbe i hver raeligkke fyldes op med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til 25 ml Disse oploslashsninger anvendes som referenceoploslashsninger

Hver af de to andre maringlekolber tilsaeligttes 2 ml anilin (34) Der opvarmes i 30 minutter paring kogende vandbad til udvikling af farvningen Derefter afkoslashles til rumtemperatur fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til 25 ml og homogeniseres hvorefter det hele henstaringr i 1 time

Ekstinktionen maringles som beskrevet i punkt 52 for fri gossypol Paring basis af den fundne vaeligrdi beregnes indholdet af totalgossypol som beskrevet i punkt 6


Beregningen af resultaterne kan foretages paring basis af den specifikke ekstinktion (61) eller ved benyttelse af en kalibreringskurve (62)

61 Paring basis af den specifikke ekstinktion

Den specifikke ekstinktion er under de angivne betingelser som foslashlger

Fri gossypol E 1 1 cm frac14 625

Totalgossypol E 1 1 cm frac14 600

Indholdet af fri gossypol eller totalgossypol i proslashven beregnes efter foslashlgende formel

gossypol E Uuml 1 250

E 1 1cm Uuml p Uuml a

hvor

E = korrigeret ekstinktion som bestemt under punkt 52 p = afvejet stofmaeligngde i gram a = alikvot del af filtratet i ml

62 Ved hjaeliglp af en kalibreringskurve

621 F r i g o s s y p o l

Der klargoslashres 2 raeligkker med hver fem 25 ml maringlekolber I begge raeligkker afpipetteres 20 40 60 80 og 100 ml af standardgossypoloploslashsningen A (35) og rumfanget suppleres til 10 ml med oploslashsningsmidlet A (32) I hver raeligkke stilles en 25 ml maringlekolbe som kun indeholder 10 ml af oploslashsningsmidlet A (32) (blindproslashve)

Kolberne i den foslashrste raeligkke inklusive blindproslashven fyldes op med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til 25 ml (referenceraeligkken)

B


Hver af kolberne i den anden raeligkke inklusive blindproslashven tilsaeligttes 2 ml anilin (34) Der opvarmes i 30 minutter paring kogende vandbad til udvikling af farvningen Derefter afkoslashles til rumtemperatur fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til maeligrket og homogeniseres hvorefter det hele henstaringr i 1 time (standardraeligkken)

Under de i 52 beskrevne betingelser maringles ekstinktionen af standarshydraeligkkeoploslashsningerne ved sammenligning med de tilsvarende oploslashsshyninger i referenceraeligkken Kalibreringskurven tegnes idet ekstinktionsshyvaeligrdierne og gossypolmaeligngderne (i μg) indtegnes over for hinanden

622 T o t a l g o s s y p o l

Der klargoslashres seks 50 ml maringlekolber I den foslashrste afpipetteres 10 ml af oploslashsningsmidlet B (33) og i de oslashvrige henholdsvis 20 40 60 80 og 100 ml af gossypolstandardoploslashsningen B (36) Indholdet i hver af kolberne suppleres med oploslashsningsmidlet B (33) til 10 ml opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad afkoslashles til rumtemperatur fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til maeligrket og homogeniseres

I to raeligkker med seks 25 ml maringlekolber afpipetteres i hver 20 ml af denne oploslashsning Kolberne i den foslashrste raeligkke fyldes op med propan-2- ol-hexan-blandingen (31) til 25 ml (referenceraeligkken)

I hver af kolberne i den anden raeligkke kommes 2 ml anilin (34) Der opvarmes i 30 minutter i kogende vandbad Derefter afkoslashles til rumtemshyperatur fortyndes med propan-2-ol-hexan-blandingen (31) til maeligrket og homogeniseres hvorefter det hele henstaringr i 1 time (standardraeligkken)


63 Repeterbarhed


mdash 15 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for gossypolindhold paring mindre end 500 ppm

mdash 75 ppm i absolut vaeligrdi for gossypolindhold paring 500ndash750 ppm

mdash 10 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for gossypolindhold paring over 750 ppm

B


B BESTEMMELSE AF INDHOLDET AF DIOXINER (PCDDER PCDFER) OG PCBER

KAPITEL I

Proslashveudtagningsmetoder og fortolkning af analyseresultater

1 Anvendelsesomraringde og definitioner

Proslashver til offentlig kontrol af indholdet af polychlorerede dibenzo-p- dioxiner (PCDDer) polychlorerede dibenzofuraner (PCDFer) dioxinligshynende polychlorerede biphenyler (PCBer) ( 1 ) og ikke-dioxinlignende PCBer i foder udtages som beskrevet i bilag I De kvantitative krav i forbindelse med kontrol af stoffer og produkter der er homogent fordelt i foderet jf punkt 51 i bilag I skal overholdes De derved fremkomne samleproslashver betragtes som repraeligsentative for de partier eller delpartier de er udtaget fra Paring grundlag af det indhold der er konstateret i laboshyratorieproslashverne fastslarings det om de ved direktiv 200232EF fastsatte graelignsevaeligrdier er overholdt

Ved anvendelsen af denne del (del B) gaeliglder definitionerne i bilag I til Kommissionens beslutning 2002657EF ( 2 )

( 1 ) Skema over TEF (= toksicitetsaeligkvivalensfaktorer) for PCDDer PCDFer og dioxinligshynende PCBer WHO-TEF til vurdering af risikoen for mennesker baseret paring konklusioshynerne fra Verdenssundhedsorganisationens (WHO) ekspertmoslashde i Genegraveve i juni 2005 om det internationale program for sikkerhed i forbindelse med kemikalier (IPCS) (Martin van den Berg et al The 2005 World Health Organization Re-evaluation of Human and Mammalian Toxic Equivalency Factors for Dioxins and Dioxin-like Compounds Toxishycological Sciences 93(2) 223-241 (2006))

Kongener TEF-vaeligrdi Kongener TEF-vaeligrdi

Dibenzo-p-dioxiner (raquoPCDDerlaquo) og dibenzo-p-furaner

(raquoPCDFerlaquo)

raquoDioxinlignendelaquo PCBer Non-ortho-PCBer + mono-ortho-PCBer

2378-TCDD 1

12378-PeCDD 1 Non-ortho-PCBer

123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003

OCDD 00003 Mono-ortho- PCBer

2378-TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003

Anvendte forkortelser raquoTlaquo = tetra raquoPelaquo = penta raquoHxlaquo = hexa raquoHplaquo = hepta raquoOlaquo = octa raquoCDDlaquo = chlordibenzodioxin raquoCDFlaquo = chlordibenzofuran raquoCBlaquo = chlorbiphenyl

( 2 ) Kommissionens beslutning 2002657EF af 14 august 2002 om gennemfoslashrelsesbestemshymelser til Raringdets direktiv 9623EF for saring vidt angaringr analysemetoders ydeevne og fortolkshyning af resultater (EFT L 221 af 1782002 s 8)

M6


Desuden forstarings i denne del (del B) ved

raquoscreeningsmetoderlaquo metoder til udvaeliglgelse af stikproslashver med indhold af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer der overskrider graelignseshyvaeligrdierne eller indgrebstaeligrsklerne Saringdanne metoder skal give mulighed for omkostningseffektivitet og hoslashj produktivitet med hensyn til antallet af screenede proslashver og derved forbedre mulighederne for at opdage nye haeligndelser med hoslashj eksponering og sundhedsrisici for forbrugerne Screshyeningsmetoder skal baseres paring bioanalytiske metoder eller GC-MS-metoshyder Resultater fra proslashver der overstiger afskaeligringsvaeligrdien og som anvendes til kontrol af at graelignsevaeligrdien er overholdt skal verificeres ved en fuldstaeligndig fornyet analyse af den oprindelige proslashve ved anvenshydelse af en verifikationsmetode

raquoverifikationsmetoderlaquo metoder der giver fuldstaeligndig eller supplerende information saring PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer kan identishyficeres og kvantificeres entydigt paring graelignsevaeligrdi- eller om noslashdvendigt indgrebstaeligrskelniveauet De paringgaeligldende metoder omfatter anvendelse af gaskromatografihoslashjtoploslashsende massespektrometri (GC-HRMS) eller gaskromatografitandemmassespektrometri (GC-MSMS)

2 Partiets eller delpartiets overholdelse af graelignsevaeligrdien

21 For saring vidt angaringr ikke-dioxinlignende PCBer

Partiet eller delpartiet overholder graelignsevaeligrdien hvis analyseresultatet for summen af PCB 28 PCB 52 PCB 101 PCB 138 PCB 153 og PCB 180 (i det foslashlgende benaeligvnt raquoikke-dioxinlignende PCBerlaquo) ikke overshyskrider den graelignsevaeligrdi der er fastsat i direktiv 200232EF idet der tages hensyn til den ekspanderede maringleusikkerhed ( 1 ) Partiet eller delpartiet overholder ikke graelignsevaeligrdien som fastsat i direktiv 200232EF hvis middelvaeligrdien af den oslashvre koncentration ( 2 ) af to analyseresultater opnaringet ved en dobbeltanalyse ( 3 ) under hensyntagen til maringleusikkerheden utvivlsomt overskrider graelignsevaeligrdien dvs den analyserede koncentration fratrukket den ekspanderede maringleusikkerhed anvendes til at vurdere overholdelsen

Den ekspanderede maringleusikkerhed beregnes ved anvendelse af en daeligkningsfaktor paring 2 som giver et konfidensniveau paring ca 95 Et parti eller delparti er ikke-overensstemmende hvis middelvaeligrdien af de maringlte vaeligrdier minus den ekspanderede usikkerhed af middelvaeligrdien ligger over graelignsevaeligrdien

M6


( 1 ) Principperne i raquoGuidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDDF and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometrylaquo (httpeceuropaeufoodsafetyanimal-feed_en) skal foslashlges hvis det er relevant

( 2 ) raquoOslashvre koncentrationlaquo betyder at hver ikke-bestemt kongeners bidrag anses for at vaeligre lig med bestemmelsesgraelignsen raquoNedre koncentrationlaquo betyder at hver ikke-bestemt kongeners bidrag anses for at vaeligre nul raquoMiddelkoncentrationlaquo betyder at hver ikke-bestemt kongeners bidrag anses for at vaeligre lig med halvdelen af bestemmelsesshygraelignsen

( 3 ) Dobbeltanalyse Saeligrskilt analyse af de relevante analytter ved anvendelse af en ekstra delproslashve af samme homogeniserede proslashve Generelt finder kravene vedroslashrende dobbeltshyanalyse i bilag II kapitel C punkt 3 anvendelse For metoder hvor der anvendes

13 C- maeligrket intern standard til de relevante analytter er dobbeltanalyse dog kun et krav hvis resultatet af den foslashrste bestemmelse ikke er overensstemmende En saringdan dobbeltanalyse er noslashdvendig for at udelukke muligheden for intern krydskontaminering eller utilsigtet sammenblanding af proslashver Hvis analysen gennemfoslashres i forbindelse med en haeligndelse med forurening kan bekraeligftelse ved en dobbeltanalyse undlades saringfremt de proslashver der er udtaget til analyse ved hjaeliglp af sporbarhed kan relateres til forureningshaeligndelsen og det konstaterede indhold ligger vaeligsentligt over graelignsevaeligrdien

De regler der er naeligvnt under dette punkt i afsnittene ovenfor gaeliglder for analyseresultatet af proslashver udtaget ved offentlig kontrol For kontraproslashshyveanalyser eller analyser til referenceformaringl gaeliglder de nationale regler

22 For saring vidt angaringr PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer

Partiet eller delpartiet overholder graelignsevaeligrdien hvis resultatet fra en enkelt analyse

mdash udfoslashrt efter en screeningsmetode med en andel af falsk overensstemshymende resultater paring under 5 viser at indholdet ikke overskrider den paringgaeligldende graelignsevaeligrdi for PCDDerPCDFer eller for summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer der er fastsat i direktiv 200232EF

mdash udfoslashrt efter en verifikationsmetode ikke overskrider den paringgaeligldende graelignsevaeligrdi for PCDDerPCDFer eller for summen af PCDDer PCDFer og dioxinlignende PCBer der er fastsat i direktiv 200232EF idet der tages hensyn til den ekspanderede usikkerhed

For screeningsassays fastlaeliggges en afskaeligringsvaeligrdi som laeliggges til grund for beslutninger om hvorvidt proslashverne overholder de paringgaeligldende graelignsevaeligrdier der er fastsat for enten PCDDerPCDFer eller for summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer

Partiet eller delpartiet overholder ikke graelignsevaeligrdien som fastsat ved direktiv 200232EF hvis middelvaeligrdien af den oslashvre koncentration ( 1 ) af to analyseresultater opnaringet ved en dobbeltanalyse ( 2 ) ved anvendelse af en verifikationsmetode under hensyntagen til den ekspanderede maringleushysikkerhed utvivlsomt overskrider graelignsevaeligrdien dvs den analyserede koncentration fratrukket den ekspanderede maringleusikkerhed anvendes til at vurdere overholdelsen


Summen af de anslaringede ekspanderede usikkerheder for de separate analyseresultater vedroslashrende PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer skal anvendes for summen af PCDDerPCDFer og dioxinligshynende PCBer


M6


( 1 ) raquoOslashvre koncentrationlaquo betyder at hver ikke-bestemt kongeners bidrag til toksicitetsaeligkvivalenten (TEQ) anses for at vaeligre lig med bestemmelsesgraelignsen raquoNedre koncentrationlaquo betyder at hver ikke-bestemt kongeners bidrag til TEQ anses for at vaeligre nul raquoMiddelkoncentrationlaquo betyder at hver ikke-bestemt kongeners bidrag til TEQ anses for at vaeligre lig med halvdelen af bestemmelsesgraelignsen

( 2 ) Generelt finder kravene vedroslashrende dobbeltanalyse i bilag II kapitel C punkt 2 anvenshydelse For verifikationsmetoder hvor der anvendes

13 C-maeligrket intern standard til de relevante analytter er dobbeltanalyse dog kun et krav hvis resultatet af den foslashrste bestemmelse ikke er overensstemmende En saringdan dobbeltanalyse er noslashdvendig for at udelukke muligheden for intern krydskontaminering eller utilsigtet sammenblanding af proslashver Hvis analysen gennemfoslashres i forbindelse med en haeligndelse med forurening kan bekraeligftelse ved en dobbeltanalyse undlades saringfremt de proslashver der er udtaget til analyse ved hjaeliglp af sporbarhed kan relateres til forureningshaeligndelsen og det konstaterede indhold ligger vaeligsentligt over graelignsevaeligrdien

3 Resultater over de indgrebstaeligrskler der er fastsat i bilag II til direktiv 200232EF

Indgrebstaeligrskler er et redskab til udvaeliglgelse af proslashver i tilfaeliglde hvor det er noslashdvendigt at identificere en forureningskilde og traeligffe foranstaltshyninger der reducerer eller fjerner den Med screeningsmetoder fastshylaeliggges der relevante afskaeligringsvaeligrdier til udvaeliglgelse af de paringgaeligldende proslashver Er det noslashdvendigt med en betydelig indsats for at identificere en kilde og reducere eller fjerne forureningen er det hensigtsmaeligssigt at bekraeligfte overskridelsen af indgrebstaeligrsklerne ved endnu en analyse under anvendelse af en verifikationsmetode og under hensyntagen til den ekspanderede maringleusikkerhed ( 1 )

KAPITEL II

Klargoslashring af proslashver og krav til analysemetoder der anvendes ved offentlig kontrol af indholdet af dioxiner (PCDDerPCDFer) og dioxinlignende PCBer

i foder

1 Anvendelsesomraringde

Kravene i dette kapitel anvendes naringr foder analyseres med henblik paring offentlig kontrol af indholdet af 2378-substituerede PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer og for saring vidt angaringr klargoslashring af proslashver og analytiske krav til andre forskriftsmaeligssige formaringl herunder kontrol udfoslashrt af fodervirksomhedslederen med henblik paring at sikre overensstemshymelse med bestemmelserne i Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 1832005 ( 2 )

Indholdet af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer i foder kan overvaringges under anvendelse af to forskellige typer analysemetoder

a) Screeningsmetoder

Formaringlet med screeningsmetoder er at udvaeliglge stikproslashver med indhold af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer der overshyskrider graelignsevaeligrdierne eller indgrebstaeligrsklerne Screeningsmetoder skal sikre omkostningseffektivitet og hoslashj produktivitet med hensyn til antallet af screenede proslashver og derved forbedre mulighederne for at opdage nye haeligndelser med hoslashj eksponering og sundhedsrisici for forbrugerne De skal anvendes med henblik paring at undgaring falsk overshyensstemmende resultater De kan omfatte biologiske analysemetoder og GC-MS-metoder

Med screeningsmetoder sammenholdes analyseresultatet med en afskaeligringsvaeligrdi som giver et janej-svar paring om graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen er overskredet Koncentrationen af PCDDer PCDFer og summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer i proslashver der mistaelignkes for at vaeligre ikke-overensstemmende i forhold til graelignsevaeligrdien skal bestemmes eller bekraeligftes efter en verifikationsmetode

Desuden kan screeningsmetoder give en indikation paring indholdet af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer i proslashver Anvendes der bioanalytiske screeningsmetoder udtrykkes resultatet som bioanalyshytiske aeligkvivalenter (BEQ) mens det udtrykkes i toksicitetsaeligkvivashylenter (TEQ) hvis der anvendes fysisk-kemiske GC-MS-metoder

M6


( 1 ) Forklarende bemaeligrkninger og krav vedroslashrende dobbeltanalyse til kontrol af indgrebshystaeligrskler jf fodnote 2 (afsnit om graelignsevaeligrdier)

( 2 ) Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 1832005 af 12 januar 2005 om krav til foderstofhygiejne (EUT L 35 af 822005 s 1)

De numerisk angivne resultater fra screeningsmetoder er egnede til at paringvise overensstemmelse eller mistaelignkt ikke-overensstemmelse eller overskridelse af indgrebstaeligrskler og giver en indikation af koncenshytrationsintervallet i tilfaeliglde af opfoslashlgning efter verifikationsmetoder De egner sig ikke til formaringl som at vurdere baggrundsniveauer foreshytage skoslashn over indtag foslashlge udviklingen i niveauer over tid eller revurdere indgrebstaeligrskler og graelignsevaeligrdier

b) Verifikationsmetoder

Verifikationsmetoder goslashr det muligt entydigt at identificere og kvanshytificere PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer i en proslashve og giver fuldstaeligndig information paring kongenerniveau Disse metoder muliggoslashr saringledes kontrol af graelignsevaeligrdier og indgrebstaeligrskler herunder bekraeligftelse af resultater fra screeningsmetoder Resultaterne kan tillige anvendes til andre formaringl saringsom at bestemme lave baggrundsniveauer i forbindelse med overvaringgningen af foder foslashlge udviklingen i niveauer over tid vurdere eksponeringen og opbygge en database til brug for en eventuel revurdering af indgrebstaeligrskler og graelignsevaeligrdier De er ogsaring vigtige redskaber til at klarlaeliggge kongenermoslashnstre med henblik paring at identificere kilden til en eventuel forurening De paringgaeligldende metoder omfatter anvendelse af GC-HRMS Ogsaring GC-MSMS kan anvendes til at bekraeligfte overholshydelse eller manglende overholdelse af graelignsevaeligrdien

2 Baggrund

Til beregning af TEQ ganges koncentrationerne af de enkelte stoffer i en given proslashve med deres respektive toksicitetsaeligkvivalensfaktor (TEF) (jf fodnote 1 i kapitel I) og summen heraf giver den samlede koncentration af dioxinlignende forbindelser udtrykt i TEQ

I denne del (del B) forstarings ved den accepterede specifikke bestemmelsesshygraelignse for en enkeltkongener det laveste indhold af analyt der kan paringvises med rimelig statistisk sikkerhed og som opfylder identifikationsshykriterierne som beskrevet i internationalt anerkendte standarder feks i standard EN 162152012 (Foderstoffer mdash Bestemmelse af dioxiner og dioxinlignende PCB-forbindelser ved GC-HRMS og af indikator-PCB- forbindelser ved GC-HRMS) ogeller EPA-metode 1613 og 1668 som aeligndret

Bestemmelsesgraelignsen for en enkeltkongener kan identificeres som

a) koncentrationen af en analyt i det proslashveekstrakt som giver en instrushymentrespons for de to forskellige ioner der skal undersoslashges med et signal-stoslashj-forhold paring 31 for det mindst intensive raring data signal eller

b) saringfremt beregningen af signal-stoslashj-forholdet af tekniske grunde ikke giver paringlidelige resultater punktet med laveste koncentration paring en kalibreringskurve som giver en acceptabel (le 30 ) og ensartet (som minimum maringlt i begyndelsen og i slutningen af en analyseraeligkke af proslashver) afvigelse i forhold til den gennemsnitlige relative responsshyfaktor beregnet for alle punkter paring kalibreringskurven i hver proslashveshyraeligkke Bestemmelsesgraelignsen (LOQ) beregnes ud fra punktet med laveste koncentration under hensyntagen til genfindingen af interne standarder og proslashvemaeligngde

M6


Bioanalytiske screeningsmetoder vil ikke give resultater paring kongenernishyveau men giver udelukkende en indikation ( 1 ) af TEQ-niveauet udtrykt i BEQ hvorved der tages hensyn til det forhold at det ikke noslashdvenshydigvis er alle forbindelser i et proslashveekstrakt som giver respons i testen der opfylder samtlige TEQ-princippets forudsaeligtninger

Screenings- og verifikationsmetoder kan kun anvendes til kontrol af en bestemt matrix hvis metoderne er tilstraeligkkeligt foslashlsomme til paring paringlishydelig vis at paringvise forekomst paring indgrebstaeligrskel- eller graelignsevaeligrdinishyveauet

3 Kvalitetssikringskrav

31 Der skal traeligffes foranstaltninger til at undgaring krydskontaminering i alle faser af proslashveudtagnings- og analyseproceduren

32 Proslashverne opbevares og transporteres i beholdere af glas aluminium polypropylen eller polyethylen som egner sig til opbevaring uden at maeligngden af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer i proslashverne paringvirkes Spor af papirstoslashv fjernes fra proslashvebeholderen

33 Opbevaring og transport af foderproslashven skal foregaring saring proslashvens integritet bevares

34 Alle laboratorieproslashver findeles og blandes grundigt hvis det er relevant efter en metode for hvilken det er godtgjort at den resulterer i fuldshystaeligndig homogenisering (feks saring proslashven kan sigtes gennem en 1 mm-sigte) Proslashverne toslashrres foslashr formalingen hvis vandindholdet er for hoslashjt

35 Det kontrolleres at reagenser glasudstyr og andet udstyr ikke paringvirker TEQ- eller BEQ-baserede resultater

36 Der foretages en blindproslashveanalyse ved at gennemfoslashre hele analyseproshyceduren blot med udeladelse af proslashven

37 For saring vidt angaringr bioanalytiske metoder kontrolleres det at alt glasudstyr og alle oploslashsningsmidler der anvendes til analyser er fri for forbindelshyser der interfererer med paringvisningen af maringlforbindelser i maringleomraringdet Glasudstyr skylles med oploslashsningsmidler eller opvarmes til temperaturer der er tilstraeligkkeligt hoslashje til at fjerne spor af PCDDerPCDFer dioxinshylignende forbindelser og interfererende forbindelser fra udstyrets overflader

38 Den proslashvemaeligngde der anvendes til ekstraktionen skal vaeligre tilstraeligkshykelig til at kravene vedroslashrende et tilstraeligkkelig lavt maringleomraringde som daeligkker graelignsevaeligrdi- eller indgrebstaeligrskelkoncentrationerne er opfyldt

39 De specifikke procedurer for klargoslashring af proslashver som anvendes for de paringgaeligldende produkter skal vaeligre i overensstemmelse med internationalt anerkendte retningslinjer

M6


( 1 ) Bioanalytiske metoder er ikke specifikt udformet til kongenerne i TEF-skemaet Der kan i proslashveekstraktet forekomme andre strukturelt beslaeliggtede AhR-aktive forbindelser som bidrager til den samlede proslashvereaktion Resultaterne af bioanalytiske metoder kan derfor ikke vaeligre et estimat men snarere en indikation af TEQ-indholdet i proslashven

4 Krav til laboratorier

41 I henhold til forordning (EF) nr 8822004 skal laboratorier vaeligre akkreshyditeret af et anerkendt organ der fungerer i overensstemmelse med ISO-vejledning 58 saring det sikres at de anvender analysekvalitetssikring Laboratorier akkrediteres ifoslashlge EN ISOIEC 17025-standarden Principshyperne i raquoTechnical Guidelines for the estimation of measurement uncershytainty and limits of quantification for PCDDF and PCB analysislaquo skal foslashlges hvis det er relevant ( 1 )

42 Laboratoriets praeligstationer dokumenteres ved loslashbende vellykket deltagelse i laboratoriesammenligninger vedroslashrende bestemmelse af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer i de relevante fodermatrixer og koncentrationsomraringder

43 Laboratorier der anvender screeningsmetoder til rutinemaeligssig kontrol af proslashver skal etablere et taeligt samarbejde med laboratorier der anvender verifikationsmetoden mdash baringde i forbindelse med kvalitetskontrol og til bekraeligftelse af analyseresultater for mistaelignkte proslashver

5 Grundlaeligggende krav til procedurer for analyse af dioxiner (PCDDerPCDFer) og dioxinlignende PCBer

51 Lavt maringleomraringde og bestemmelsesgraelignser

For PCDDerPCDFer skal de paringviselige maeligngder befinde sig i det oslashvre femtogram-interval (10

ndash 15 g) paring grund af visse af disse forbindelsers ekstremt hoslashje toksicitet For de fleste PCB-kongenere er det tilstraeligkkeshyligt med en bestemmelsesgraelignse i nanogram-intervallet (10

ndash 9 g) Til maringling af de mere toksiske dioxinlignende PCB-kongenere (isaeligr non-ortho-substituerede kongenere) skal den nedre del af maringleomraringdet ligge i den nedre del af pikogram-intervallet (10

ndash 12 g) For alle andre PCB-kongenere er det tilstraeligkkeligt med en bestemmelsesgraelignse i nanogram-intervallet (10

ndash 9 g)

52 Hoslashj selektivitet (specificitet)

521 PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer skal kunne skelnes fra en lang raeligkke andre ledsagestoffer der er fremkommet ved ekstraktionen og som muligvis er interfererende forbindelser i koncentrationer der er op til mange gange hoslashjere end analyttens For GC-MS-metoders vedkommende skal der kunne skelnes mellem forskellige kongenere feks mellem toksiske kongenere (saringsom de 17 2378-substituerede PCDDerPCDFer og 12 dioxinlignende PCBer) og andre kongenere

522 Bioanalytiske metoder skal kunne paringvise maringlforbindelserne som summen af PCDDerPCDFer ogeller dioxinlignende PCBer Ved oprensningen af proslashver skal det tilstraeligbes at fjerne forbindelser der giver falsk ikke-overensstemmende resultater og forbindelser der kan svaeligkke responset og give falsk overensstemmende resultater

53 Hoslashj noslashjagtighed (korrekthed og praeligcision tilsyneladende bioassay-genshyfinding)

531 For saring vidt angaringr GC-MS-metoder skal bestemmelsen give et paringlideligt estimat over den korrekte koncentration i en proslashve Hoslashj noslashjagtighed er noslashdvendig for at undgaring at et resultat af en analyse afvises paring grundlag af lav paringlidelighed af det bestemte TEQ-niveau Noslashjagtighed udtrykkes

M6


( 1 ) raquoGuidance Document on Measurement Uncertainty for Laboratories performing PCDDF and PCB Analysis using Isotope Dilution Mass Spectrometrylaquo (httpeceuropaeufood safetyanimal-feed_en) raquoGuidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measurements in the Field of Contaminants in Feed and Foodlaquo (httpeceuropaeufood safetyanimal-feed_en)

som korrekthed (forskellen mellem den maringlte middelvaeligrdi for en analyt i et certificeret materiale og dens certificerede vaeligrdi udtrykt i procent af den certificerede vaeligrdi) og praeligcision (RSD R relativ standardafvigelse beregnet ud fra resultater der er fremkommet under reproducerbarhedsshybetingelser)

532 For bioanalytiske metoder bestemmes den tilsyneladende bioassay-genshyfinding Ved tilsyneladende bioassay-genfinding forstarings BEQ-niveauet beregnet ud fra TCDD- eller PCB 126-kalibreringskurven korrigeret for blindproslashven og efterfoslashlgende divideret med TEQ-niveauet som bestemt efter verifikationsmetoden Formaringlet er at korrigere for faktorer saringsom tabet af PCDDerPCDFer og dioxinlignende forbindelser i ekstraktionsndash og oprensningsfasen medekstraherede forbindelser som forstaeligrker eller svaeligkker responset (henholdsvis agonistisk og antagonishystisk virkning) kvaliteten af kurvetilpasningen eller forskelle mellem vaeligrdierne for henholdsvis TEF og den relative styrke (REP) Den tilsyneladende bioassay-genfinding beregnes ud fra passende referenceshyproslashver med repraeligsentative kongenermoslashnstre omkring det relevante niveau

54 Validering i naeligrheden af graelignsevaeligrdien og kvalitetskontrol generelt

541 Laboratorierne skal dokumentere en metodes ydeevne i naeligrheden af graelignsevaeligrdien feks 05 1 og 2 gange graelignsevaeligrdien med en accepshytabel variationskoefficient for gentagne analyser som led i valideringsshyproceduren og i forbindelse med rutinemaeligssige analyser

542 Som interne kvalitetskontrolforanstaltninger gennemfoslashres der regelmaeligsshysigt blindproslashvekontrol og spikingforsoslashg eller analyse af kontrolproslashver (om muligt med certificeret referencemateriale) Kvalitetskontrolkort for blindproslashvekontroller spikingforsoslashg eller analyser af kontrolproslashver registreres og kontrolleres for at sikre at den analytiske ydeevne er i overensstemmelse med gaeligldende krav

55 Bestemmelsesgraelignse

551 For bioanalytiske screeningsmetoders vedkommende er fastlaeligggelse af bestemmelsesgraelignsen (LOQ) ikke et ufravigeligt krav men det skal godtgoslashres at metoden goslashr det muligt at skelne blindproslashvevaeligrdien fra afskaeligringsvaeligrdien I forbindelse med fastlaeligggelsen af et BEQ-niveau fastsaeligttes et rapporteringsniveau med henblik paring haringndtering af proslashver som giver et respons under dette niveau Det skal dokumenteres at rapporteringsniveauet adskiller sig mdash som minimum med en faktor tre mdash fra procedureblindproslashver med et respons under maringleomraringdet Det skal derfor beregnes ud fra proslashver med et indhold af maringlforbindelserne omkring det kraeligvede minimumsniveau og ikke ud fra et bestemt signal-stoslashj-forhold eller en assay-blindproslashve

552 LOQ for en verifikationsmetode skal vaeligre paring ca en femtedel af graelignshysevaeligrdien

56 Analysekriterier

For at sikre paringlidelige resultater af verifikations- eller screeningsmetoder skal foslashlgende kriterier vaeligre opfyldt i naeligrheden af graelignsevaeligrdien for henholdsvis TEQ- eller BEQ-vaeligrdien bestemt enten som samlet TEQ eller samlet BEQ (som summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer) eller separat for henholdsvis PCDDerPCDFer og dioxinligshynende PCBer

M6


Screening efter bioanalytiske eller

fysisk-kemiske metoder Verifikationsmetoder

Falsk overensstemmenshyde-andel ( 1 )

lt 5

Korrekthed ndash 20 til + 20

Repeterbarhed (RSD r ) lt 20

Intermediaeligr praeligcision (RSD R )

lt 25 lt 15

( 1 ) I forhold til graelignsevaeligrdierne

57 Specifikke krav til screeningsmetoder

571 Baringde GC-MS-metoder og bioanalytiske metoder kan anvendes til screshyening For GC-MS-metoder skal kravene i punkt 6 vaeligre opfyldt Der er fastsat specifikke krav til cellebaserede bioanalytiske metoder i punkt 7

572 Laboratorier der anvender screeningsmetoder til rutinemaeligssig kontrol af proslashver skal etablere et taeligt samarbejde med laboratorier der anvender verifikationsmetoden

573 Screeningsmetodens ydeevne skal efterproslashves i forbindelse med rutineshymaeligssige analyser ved analysekvalitetskontrol og ved loslashbende metodeshyvalidering Der skal opereres med et fast program for kontrol af overshyensstemmende resultater

574 Kontrol af eventuel haeligmning af celleresponset og cytotoxicitet

20 af proslashveekstrakterne maringles i forbindelse med rutinemaeligssig screshyening med og uden 2378-TCDD tilsat i overensstemmelse med graelignshysevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen med henblik paring at kontrollere om responset maringske haeligmmes af interfererende stoffer i proslashveekstraktet Den maringlte koncentration af den spikede proslashve sammenholdes med summen af koncentrationen af det ikke-spikede ekstrakt og spikingkonshycentrationen Hvis denne maringlte koncentration er over 25 mindre den beregnede (sum-) koncentration er dette en indikation af mulig signalshyhaeligmning og den paringgaeligldende proslashve underkastes en GC-HRMS-verifishykationsanalyse Resultaterne registreres i kvalitetskontrolkort

575 Kvalitetskontrol af overensstemmende proslashver

Ca 2-10 af de overensstemmende proslashver afhaeligngigt af proslashvematrix og laboratoriets erfaring bekraeligftes ved hjaeliglp af GCHRMS

576 Bestemmelse af andelen af falsk overensstemmende resultater fra kvalishytetskontroldata

Andelen af falsk overensstemmende resultater fra screening af proslashver der ligger under og over graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen bestemshymes Den faktiske andel af falsk overensstemmende resultater skal ligge under 5 Naringr der foreligger mindst 20 bekraeligftede resultater pr matrix matrixgruppe fra kvalitetskontrollen af overensstemmende proslashver drages konklusionerne vedroslashrende andelen af falsk overensstemmende resultater paring grundlag af denne database Resultaterne fra proslashver der er analyseret

M6


i ringtest eller i forbindelse med forureningshaeligndelser og daeligkker et koncentrationsomraringde paring op til feks 2 gange graelignsevaeligrdien (ML) kan ogsaring taeliglles med i de mindst 20 resultater der skal laeliggges til grund for evalueringen af andelen af falsk overensstemmende resultater Proslashverne skal daeligkke de mest almindelige kongenermoslashnstre og repraeligshysentere forskellige kilder

Selv om screeningsassays fortrinsvis skal have til formaringl at paringvise proslashver for hvilke indgrebstaeligrsklen er overskredet er kriteriet for bestemmelse af andelen af falsk overensstemmende resultater graelignseshyvaeligrdien under hensyntagen til den ekspanderede maringleusikkerhed ved verifikationsmetoden

577 Potentielt ikke-overensstemmende proslashver fra screening skal altid verifishyceres ved en fuldstaeligndig fornyet analyse af den oprindelige proslashve efter en verifikationsanalysemetode Disse proslashver kan ogsaring anvendes til at evaluere andelen af falsk ikke-overensstemmende resultater For screshyeningsmetoder er andelen af falsk ikke-overensstemmende resultater andelen af resultater for hvilke det ved hjaeliglp af en verifikationsanalyse er bekraeligftet at de opfylder kravene (dvs er overensstemmende) efter at proslashven i en tidligere screening er erklaeligret for potentielt ikke-overensshystemmende Vurderingen af screeningsmetodens hensigtsmaeligssighed baseres paring sammenholdelse af antallet af falsk ikke-overensstemmende proslashver med det samlede antal kontrollerede proslashver Denne andel skal vaeligre tilstraeligkkeligt lille til at screening med fordel kan anvendes

578 Bioanalytiske metoder skal under valideringsbetingelser give en brugbar indikation af TEQ-niveauet beregnet og udtrykt som BEQ

Ogsaring for bioanalytiske metoder der gennemfoslashres under repeterbarhedsshybetingelser er den interne RSD r typisk lavere end reproducerbarheden RSD R

6 Specifikke krav som GC-MS-metoder skal opfylde med henblik paring screening eller verifikation

61 Acceptabel difference mellem WHO-TEQ-resultaters oslashvre og nedre koncentration

Differencen mellem den oslashvre og den nedre koncentration maring ikke overshystige 20 i forbindelse med bekraeligftelse af overskridelse af graelignsevaeligrshydien eller i tilfaeliglde af behov for indgrebstaeligrskler

62 Genfindingskontrol

621 For at validere analyseproceduren tilsaeligttes 13 C-maeligrkede 2378-chlorshy

substituerede PCDDerPCDFer og 13 C-maeligrkede dioxinlignende PCBer

som intern standard helt fra begyndelsen af analysen feks inden ekstraktion Der tilsaeligttes mindst eacuten kongener for hver af de tetra- til octa-chlorerede homologe grupper af PCDDerPCDFer og mindst eacuten kongener for hver af de homologe grupper af dioxinlignende PCBer (alternativt tilsaeligttes mindst eacuten kongener for hver massespektrometrisk udvalgt ionregistreringsfunktion der anvendes til overvaringgning af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer) For verifikationsmetoders vedkommende anvendes alle 17

13 C-maeligrkede 2378-substituerede PCDDerPCDFer og alle 12

13 C-maeligrkede dioxinlignende PCBer som intern standard

M6


622 Der bestemmes ogsaring relative responsfaktorer for de kongenere som der ikke tilsaeligttes en

13 C-maeligrket analog for ved hjaeliglp af relevante kalishybreringsoploslashsninger

623 For vegetabilsk foder og animalsk foder der indeholder under 10 fedt er det obligatorisk at tilsaeligtte interne standarder inden ekstraktionen For animalsk foder der indeholder over 10 fedt tilsaeligttes de interne standarder enten foslashr eller efter fedtekstraktionen Der foretages en hensigtsmaeligssig validering af ekstraktionseffektiviteten afhaeligngigt af det trin hvor de interne standarder tilsaeligttes

624 Inden GC-MS-analyse tilsaeligttes en eller to genfindingsstandarder (surroshygat)

625 Det er noslashdvendigt med genfindingskontrol Niveauet for genfinding af de enkelte interne standarder ved verifikationsmetoder skal ligge paring mellem 60 og 120 Lavere eller hoslashjere genfinding for enkeltkongeshynere navnlig for visse hepta- og octa-chlorerede dibenzo-p-dioxiner og dibenzofuraner kan accepteres paring betingelse af at deres bidrag til TEQ-vaeligrdien ikke udgoslashr mere end 10 af den samlede TEQ-vaeligrdi (baseret paring summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer) Niveauet for genfindelse ved GC-MS-screeningsmetoder skal ligge paring mellem 30 og 140

63 Fjernelse af interfererende stoffer

mdash PCDDerPCDFer skal separeres fra interfererende chlorerede forbinshydelser som feks ikke-dioxinlignende PCBer og chlorerede diphenyshylethere ved hjaeliglp af egnede kromatografiske metoder (helst med florisil- alumina- ogeller carbonkolonne)

mdash Gaskromatografisk separation af isomerer skal vaeligre paring under lt 25 maringlt mellem toppene for 123478-HxCDF og 123678-HxCDF

64 Kalibrering med standardkurve

Kalibreringskurven skal daeligkke det relevante graelignsevaeligrdi- eller indgrebshystaeligrskelniveau

65 Specifikke kriterier vedroslashrende verifikationsmetoder

mdash For saring vidt angaringr GCHRMS

Ved HRMS skal oploslashsningsevnen typisk vaeligre mindst 10 000 for hele masseintervallet ved 10 dal

Opfyldelse af yderligere identifikations- og bekraeligftelseskriterier som beskrevet i internationalt anerkendte standarder feks i standard EN 162152012 (Foderstoffer mdash Bestemmelse af dioxiner og dioxinligshynende PCB-forbindelser samt indikator-PCB-forbindelser ved GCHRMS) ogeller EPA-metode 1613 og 1668 som aeligndret

mdash For saring vidt angaringr GCMS-MS

Overvaringgning af mindst 2 specifikke praeligkursor-ioner hver med et specifikt tilsvarende transitionsprodukt-ion for alle maeligrkede og ikke maeligrkede analytter inden for analysens anvendelsesomraringde

Tilladt maksimumstolerance for relative ionintensiteter paring plusmn 15 for udvalgte transitionsprodukt-ioner sammenholdt med beregnede eller maringlte vaeligrdier (gennemsnit fra kalibreringsstandarder) ved anvendelse af identiske MSMS-betingelser isaeligr kollisionsenergi og kollisionsshygastryk for hver transition af en analyt

M6


Oploslashsningsevnen for hver quadrupol skal enten kunne sidestilles med eller vaeligre bedre end enhedsmasseoploslashsningen (enhedsmasseopshyloslashsning oploslashsningsevne der er tilstraeligkkelig til at adskille to toppe i en masseenhed fra hinanden) for at minimere eventuelle interferenser paring den paringgaeligldende analyt

Opfyldelse af de yderligere kriterier som beskrevet i internationalt anerkendte standarder feks i standard EN 162152012 (Foderstoffer mdash Bestemmelse af dioxiner og dioxinlignende PCB-forbindelser samt indikator-PCB-forbindelser ved GCHRMS) ogeller EPA-meshytode 1613 og 1668 som aeligndret undtagen pligten til at anvende GC-HRMS

7 Specifikke krav til bioanalytiske metoder

Bioanalytiske metoder er metoder baseret paring anvendelse af biologiske principper saringsom cellebaserede assays receptorassays eller immunoasshysays Dette punkt (punkt 7) indeholder krav til bioanalytiske metoder generelt

Med en screeningsmetode klassificeres en proslashve principielt som overshyensstemmende eller som mistaelignkt for at vaeligre ikke-overensstemmende I det oslashjemed sammenholdes det beregnede BEQ-niveau med afskaeligringsshyvaeligrdien (jf punkt 73) Proslashver der giver resultater under afskaeligringsshyvaeligrdien erklaeligres for overensstemmende mens proslashver der ligger paring eller over afskaeligringsvaeligrdien erklaeligres for mistaelignkt for at vaeligre ikke-overensstemmende og noslashdvendiggoslashr analyse efter en verifikationsshymetode I praksis kan et BEQ-niveau paring 23 af graelignsevaeligrdien vaeligre afskaeligringsvaeligrdi saringfremt der sikres en andel af falsk overensstemmende resultater paring under 5 og en acceptabel andel af falsk ikke-overensshystemmende resultater Med saeligrskilte graelignsevaeligrdier for henholdsvis PCDDerPCDFer og summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer er passende bioassay-afskaeligringsvaeligrdier for PCDDerPCDFer en forudsaeligtning for at kunne kontrollere proslashvernes overensstemmelse uden fraktionering Til kontrol af proslashver for hvilke indgrebstaeligrsklerne er overskredet er en passende procentdel af den enkelte indgrebstaeligrskel en egnet afskaeligringsvaeligrdi

Hvis der er udtrykt et vejledende niveau i BEQ skal proslashveresultater ligge i maringleomraringdet og overstige rapporteringsgraelignsen (jf punkt 711 og 716)

71 Evaluering af testresponset

711 G e n e r e l l e k r a v

mdash Ved beregning af koncentrationerne ud fra en TCDD-kalibreringsshykurve vil vaeligrdierne i den oslashverste del af kurven vise en stor spredshyning (en hoslashj variationskoefficient (CV)) Maringleomraringdet er det omraringde hvor CV er paring under 15 Den nedre del af maringleomraringdet (rapporshyteringsniveauet) saeligttes hoslashjere mdash som minimum med en faktor tre mdash end procedureblindproslashverne Den oslashvre del af maringleomraringdet er normalt repraeligsenteret ved EC 70 -vaeligrdien (70 af den hoslashjeste effektive koncentration) men er lavere hvis CV ligger over 15 inden for dette interval Maringleomraringdet fastsaeligttes i forbindelse med validering Afskaeligringsvaeligrdierne (jf punkt 73) skal ligge klart inden for maringleshyomraringdet

mdash Standardoploslashsninger og proslashveekstrakter testes tre eller mindst to gange Ved dobbeltbestemmelse skal en standardoploslashsning eller et kontrolekstrakt der testes i 4-6 huller fordelt over hele pladen give et respons eller en koncentration (kun muligt i maringleomraringdet) baseret paring en CV paring lt 15

M6


712 K a l i b r e r i n g


mdash Indholdet i proslashver anslarings ved at sammenholde testresponset med en kalibreringskurve for TCDD (eller PCB 126 eller en standardblanshyding af PCDDPCDFdioxinlignende PCB) med henblik paring at beregne BEQ-niveauet i ekstraktet og efterfoslashlgende i proslashven

mdash Kalibreringskurver skal indbefatte 8-12 koncentrationer (som minimum dobbeltbestemmelser) idet der skal vaeligre tilstraeligkkeligt med koncentrationer i den nederste del af kurven (maringleomraringdet) Der laeliggges saeligrlig vaeliggt paring kvaliteten af kurvetilpasningen i maringleshyomraringdet R

2 -vaeligrdien er som saringdan af begraelignset eller slet ingen vaeligrdi som grundlag for en goodness-of-fit-vurdering ved ikke-lineaeligr regression Der opnarings et bedre fit ved at minimere forskellen mellem beregnede og observerede niveauer i kurvens maringleomraringde feks ved at minimere summen af kvadrerede residualer

mdash Det anslaringede indhold i proslashveekstraktet korrigeres efterfoslashlgende for det BEQ-niveau der er beregnet for en matrixoploslashsningsmiddel- blindproslashve (for at tage urenheder fra de anvendte oploslashsningsmidler og kemikalier i betragtning) og den tilsyneladende genfinding (som beregnes ud fra BEQ-niveauet i passende referenceproslashver med repraeligsentative kongenermoslashnstre omkring graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen) Til korrektion for genfinding skal den tilsynelashydende genfinding ligge inden for det kraeligvede interval (jf punkt 714) Referenceproslashver der anvendes til korrektion for genfinding skal opfylde kravene i punkt 72

7122 Kalibrering med referenceproslashver

Alternativt kan der anvendes en kalibreringskurve fremstillet paring grundlag af mindst fire referenceproslashver (jf punkt 724) en matrixblindproslashve plus tre referenceproslashver paring 05 1 og 2 gange graelignsevaeligrdien eller indgrebshystaeligrsklen) hvorved behovet for at korrigere for blindproslashve og genfinshyding bortfalder hvis referenceproslashvernes matrix svarer til de ukendte proslashvers matrix I dette tilfaeliglde kan det testrespons som svarer til 23 af graelignsevaeligrdien (jf punkt 73) beregnes direkte ud fra disse proslashver og anvendes som afskaeligringsvaeligrdi Til kontrol af proslashver for hvilke indgrebshystaeligrsklerne er overskredet er en passende procentdel af disse indgrebshystaeligrskler en egnet afskaeligringsvaeligrdi

713 S e p a r a t b e s t e m m e l s e a f h e n h o l d s v i s P C D D e r P C D F e r o g d i o x i n l i g n e n d e P C B e r

Ekstrakter kan opdeles i fraktioner indeholdende henholdsvis PCDDer PCDFer og dioxinlignende PCBer saringledes at TEQ-niveauet (i BEQ) kan angives saeligrskilt for henholdsvis PCDDerPCDFer og dioxinligshynende PCBer Der anvendes fortrinsvis en PCB 126-standardkalibreshyringskurve til evaluering af resultaterne for den fraktion der indeholder dioxinlignende PCBer

714 T i l s y n e l a d e n d e b i o a s s a y - g e n f i n d i n g

Den tilsyneladende bioassay-genfinding beregnes ud fra passende refeshyrenceproslashver med repraeligsentative kongenermoslashnstre omkring graelignsevaeligrshydien eller indgrebstaeligrsklen og udtrykkes som procent af BEQ-niveauet i forhold til TEQ-niveauet Forskellene mellem TEF- og REP-faktorer for dioxinlignende PCBer kan afhaeligngigt af hvilken type assay og TEFer ( 1 ) der anvendes resultere i lave tilsyneladende genfindelsesproshycenter for dioxinlignende PCBer i forhold til PCDDerPCDFer Hvis

M6


( 1 ) Gaeligldende krav er baseret paring TEFerne som er offentliggjort i M Van den Berg et al Toxicol Sci 93 (2) 223-241 (2006)

PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer bestemmes separat er den tilsyneladende bioassay-genfinding derfor 20-60 for dioxinlignende PCBer og 50-130 for PCDDerPCDFer (disse intervaller gaeliglder for TCDD-kalibreringskurven) Eftersom dioxinlignende PCBers bidrag til summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer kan variere afhaeligngigt af forskellige matrixer og proslashver afspejler den tilsyneshyladende bioassay-genfinding for summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer disse intervaller og skal vaeligre paring 30-130 Enhver indvirkning af vaeligsentligt aeligndrede TEF-vaeligrdier paring EU-lovgivshyningen for PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer noslashdvendiggoslashr en aeligndring af disse intervaller

715 K o n t r o l a f g e n f i n d i n g e f t e r o p r e n s n i n g

Tabet af forbindelser under oprensningen kontrolleres i forbindelse med validering En blindproslashve tilsat en blanding af de forskellige kongenere underkastes oprensning (mindst n = 3) og genfinding og variabilitet kontrolleres efter en verifikationsmetode Genfindingen skal vaeligre paring mellem 60 og 120 isaeligr for kongenere der bidrager med over 10 af TEQ-niveauet i forskellige blandinger

716 R a p p o r t e r i n g s g r aelig n s e

Ved indberetning af BEQ-niveauer fastlaeliggges der en rapporteringsshygraelignse ud fra relevante matrixproslashver med typiske kongenermoslashnstre men ikke ud fra standardernes kalibreringskurve idet praeligcisionen i den nederste del af kurven er lav Der skal tages hensyn til virkningerne af ekstraktion og oprensning Rapporteringsgraelignsen saeligttes vaeligsentligt hoslashjere (som minimum med en faktor tre) end procedureblindproslashverne

72 Anvendelse af referenceproslashver

721 Referenceproslashver skal repraeligsentere proslashvematrix kongenermoslashnstre og koncentrationsomraringder for PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer omkring graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen

722 Hver analyseraeligkke skal omfatte en matrixblindproslashve eller hvor dette ikke er muligt en procedureblindproslashve samt en referenceproslashve ved graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen Disse proslashver ekstraheres og analyseres samtidig under identiske betingelser Referenceproslashven skal udvise en klart kraftigere reaktion end blindproslashven saring der er sikkerhed for testens egnethed De paringgaeligldende proslashver kan anvendes til korrektion for blindproslashve og genfinding

723 Referenceproslashver der udvaeliglges til korrektion for genfinding skal vaeligre repraeligsentative for de klargjorte proslashver hvilket betyder at bestemte kongenermoslashnstre ikke maring foslashre til at niveauerne vurderes for lavt

724 Der kan inkluderes ekstra referenceproslashver paring feks 05 og 2 gange graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen for at vise analysemetodens ydeevne inden for det interval der er relevant for kontrollen af graelignseshyvaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen Kombineret kan disse proslashver anvendes til beregning af BEQ-niveauerne i de klargjorte proslashver (jf punkt 7122)

M6


73 Fastlaeligggelse af afskaeligringsvaeligrdier

Relationen mellem bioanalytiske resultater i BEQ og resultater fra verishyfikationsmetoden i TEQ fastlaeliggges feks ved hjaeliglp af matrixtilpassede kalibreringsforsoslashg med referenceproslashver tilsat 0 05 1 og 2 gange ML med seks gentagelser paring hvert niveau (n = 24) Korrektionsfaktorer (blindproslashve og genfinding) kan beregnes skoslashnsmaeligssigt ud fra dette forhold men skal efterproslashves i overensstemmelse med punkt 722

Der fastlaeliggges afskaeligringsvaeligrdier for at kunne afgoslashre om en proslashve overholder de fastsatte graelignsevaeligrdier eller for hvor det er relevant at kunne kontrollere indgrebstaeligrsklerne i forhold til de paringgaeligldende graelignsevaeligrdier eller indgrebstaeligrskler der er fastsat for enten PCDDer PCDFer og dioxinlignende PCBer hver for sig eller for summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer De repraeligsenteres ved det nedre endepunkt i fordelingen af bioanalytiske resultater (korrigeret for blindproslashve og genfinding) som svarer til verifikationsmetodens beslutshyningsgraelignse med et konfidensniveau paring 95 hvilket indebaeligrer en falsk overensstemmende-andel paring lt 5 og en RSD R paring lt 25 Verishyfikationsmetodens beslutningsgraelignse er graelignsevaeligrdien under hensynshytagen til den ekspanderede maringleusikkerhed

Afskaeligringsvaeligrdien (i BEQ) beregnes som beskrevet i enten punkt 731 punkt 732 eller punkt 733 (se figur 1)

731 Anvendelse af det nedre baringnd i forventningsintervallet paring 95 ved verifikationsmetodens beslutningsgraelignse

Afskaeligringsvaeligrdi frac14 BEQ DL Auml s yx Uuml t αf frac14m Auml 2 ffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffiffi 1=n thorn 1=m thorn ethx i Auml xTHORN 2=Q xx q

hvor

BEQ DL er den BEQ der svarer til verifikationsmetodens beslutshyningsgraelignse som er graelignsevaeligrdien under hensyntagen til den ekspanderede maringleusikkerhed

s yx er den residuale standardafvigelse

t αf = m-2 er Student-faktoren (α = 5 f = frihedsgrader enkeltshysidet)

m er det samlede antal kalibreringspunkter (indeks j)

n er antallet af gentagelser paring hvert niveau

x i er proslashvekoncentrationen (i TEQ) for kalibreringspunktet i som bestemt efter en verifikationsmetode

x er gennemsnittet af koncentrationerne (i TEQ) af samtlige kalibreringsproslashver

Q xx frac14 X m

jfrac141 ethx i Auml xTHORN 2 er kvadratsum Auml parameteren i frac14 indeks for kalibreringspunktet i

732 Beregning ud fra bioanalytiske resultater (korrigeret for blindproslashve og genfinding) fra flere analyser af proslashver (nge 6) forurenet i koncentrationer ved verifikationsmetodens beslutningsgraelignse som det nedre endepunkt i fordelingen af data ved den tilsvarende BEQ-middelvaeligrdi

Afskaeligringsvaeligrdi = BEQ DL mdash 164 times SD R

hvor

SD R er standardafvigelse for resultaterne af bioassay ved BEQ DL maringlt under interne reproducerbarhedsbetingelser

M6


733 Beregning som middelvaeligrdi af bioanalytiske resultater (i BEQ korrishygeret for blindproslashve og genfinding) fra flere analyser af proslashver (n ge 6) forurenet i koncentrationer paring 23 af graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrskshylen baseret paring den observation at dette niveau ligger paring omkring den afskaeligringsvaeligrdi der er fastlagt i henhold til punkt 731 eller punkt 732

Beregning af afskaeligringsvaeligrdier med et konfidensniveau paring 95 hvilket indebaeligrer en falsk overensstemmende-andel paring lt 5 og en RSD R paring lt 25

1) fra det nedre baringnd i forventningsintervallet paring 95 ved verifikashytionsmetodens beslutningsgraelignse

2) fra flere analyser af proslashver (n ge 6) forurenet i koncentrationer ved verifikationsmetodens beslutningsgraelignse som det nedre endepunkt i fordelingen af data (i figuren repraeligsenteret ved en klokkelignende kurve) ved den tilsvarende BEQ-middelvaeligrdi

Figur 1

734 Begraelignsninger for afskaeligringsvaeligrdier

BEQ-baserede afskaeligringsvaeligrdier beregnet ud fra RSD R som er tilvejeshybragt i forbindelse med validering med et begraelignset antal proslashver med forskellige matrixkongenermoslashnstre kan vaeligre hoslashjere end de TEQ-baserede graelignsevaeligrdier eller indgrebstaeligrskler fordi der opnarings en hoslashjere praeligcision end den der kan opnarings i rutinemaeligssige analyser naringr et ukendt spektrum af mulige kongenermoslashnstre skal kontrolleres I saringdanne tilfaeliglde beregnes afskaeligringsvaeligrdierne med udgangspunkt i en RSD R paring 25 eller mdash om muligt mdash 23 af graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrskshylen

74 Karakteristika for metodens ydeevne

741 Da interne standarder ikke kan anvendes i bioanalytiske metoder skal der gennemfoslashres repeterbarhedsanalyser for bioanalytiske metoder for at tilvejebringe oplysninger om standardafvigelsen inden for og mellem de enkelte analyseraeligkker Repeterbarheden skal ligge paring under 20 og den interne reproducerbarhed skal ligge paring under 25 Til grund laeliggges de beregnede niveauer i BEQ efter korrektion for blindproslashve og genfinding

M6


742 Det dokumenteres som led i valideringsprocessen at testen kan skelne mellem en blindproslashve og et indhold paring afskaeligringsvaeligrdien saringledes at det er muligt at identificere proslashver over den tilsvarende afskaeligringsvaeligrdi (jf punkt 712)

743 Maringlforbindelser mulige interferenser og hoslashjeste tolererede vaeligrdier for blindproslashver fastlaeliggges

744 Standardafvigelsen i responset eller i den koncentration der beregnes ud fra responset (kun muligt i maringleomraringdet) ved tredobbelt bestemmelse af et proslashveekstrakt maring ikke vaeligre paring over 15

745 De ukorrigerede resultater af referenceproslashvenproslashverne udtrykt i BEQ (blindproslashve samt ved graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen) bruges til at evaluere den bioanalytiske metodes ydeevne over et konstant tidsrum

746 Kvalitetskontrolkort for procedureblindproslashver og for hver enkelt type referenceproslashve registreres og kontrolleres med henblik paring at sikre at den analytiske ydeevne er i overensstemmelse med gaeligldende krav isaeligr for procedureblindproslashverne for saring vidt angaringr den paringkraeligvede minishymumsdifference i forhold til den nedre del af maringleomraringdet og for refeshyrenceproslashverne med hensyn til den interne reproducerbarhed Procedureshyblindproslashver holdes under kontrol for at undgaring falsk overensstemmende resultater ved fratraeligkning af vaeligrdierne

747 Resultaterne fra verifikationsmetoderne af mistaelignkte proslashver samt 2- 10 af de overensstemmende proslashver (mindst 20 proslashver pr matrix) skal indsamles og laeliggges til grund for en evaluering af screeningsmetoshydens ydeevne og relationen mellem BEQ og TEQ Denne database kan anvendes til revurdering af de afskaeligringsvaeligrdier der finder anvendelse paring rutinemaeligssige proslashver til de validerede matrixer

748 En metodes gode ydeevne kan ogsaring dokumenteres ved deltagelse i ringshytest Resultaterne fra proslashver der er analyseret i ringtest og daeligkker et koncentrationsomraringde paring op til feks 2 gange graelignsevaeligrdien kan inklushyderes i evalueringen af andelen af falsk overensstemmende resultater saringfremt laboratoriet kan dokumentere gode praeligstationer Proslashverne skal daeligkke de mest almindelige kongenermoslashnstre og repraeligsentere forskellige kilder

749 I forbindelse med haeligndelser kan afskaeligringsvaeligrdierne revurderes paring baggrund af de specifikke matrix- og kongenermoslashnstre der observeres under den paringgaeligldende haeligndelse

8 Indberetning af resultater

81 Verifikationsmetoder

811 Analyseresultaterne skal omfatte vaeligrdierne for de enkelte PCDDPCDF- og dioxinlignende PCB-kongenere og angives som nedre koncentratioshyner oslashvre koncentrationer og middelkoncentrationer med henblik paring at sikre at indberetningen af resultater omfatter saring mange oplysninger som muligt saring resultaterne kan fortolkes i overensstemmelse med specifikke krav

812 Rapporten skal omfatte oplysninger om den metode der er anvendt til ekstraktion af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer

M6


813 Tallene for genfinding af de enkelte interne standarder stilles til raringdigshyhed hvis genfindingen ligger uden for det interval der er angivet i punkt 625 hvis graelignsevaeligrdien er overskredet (i dette tilfaeliglde genfindingen for en af to analyser) og i oslashvrige tilfaeliglde efter anmodning

814 Da der skal tages hensyn til den ekspanderede maringleusikkerhed naringr det afgoslashres om en proslashve er overensstemmende skal denne parameter vaeligre tilgaeligngelig Analyseresultaterne indberettes derfor som x plusmn U hvor x er analyseresultatet og U er den ekspanderede maringleusikkerhed idet der anvendes en daeligkningsfaktor paring 2 hvilket giver et konfidensniveau paring ca 95 Hvis PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer bestemmes separat anvendes summen af den anslaringede ekspanderede usikkerhed paring de separate analyseresultater vedroslashrende PCDDerPCDFer og dioxinligshynende PCBer paring summen af PCDDerPCDFer og dioxinlignende PCBer

815 Resultaterne angives i samme enheder og med (mindst) samme antal betydende cifre som de graelignsevaeligrdier der er fastsat ved direktiv 200232EF

82 Bioanalytiske screeningsmetoder

821 Resultatet af screeningen udtrykkes som vaeligrende raquooverensstemmendelaquo eller som raquomistaelignkt for at vaeligre ikke-overensstemmendelaquo (raquomistaelignktlaquo)

822 Derudover kan der oplyses et indikativt resultat for PCDDerPCDFer ogeller dioxinlignende PCBer udtrykt i BEQ mdash ikke TEQ

823 Proslashver der giver et respons under rapporteringsgraelignsen udtrykkes som vaeligrende raquounder rapporteringsgraelignsenlaquo Proslashver der giver et respons over maringleomraringdet skal rapporteres som vaeligrende raquoover maringleomraringdetlaquo og den vaeligrdi der svarer til den oslashvre del af maringleomraringdet skal gives i BEQ

824 Rapporten skal for hver enkelt type proslashvematrix give oplysninger om graelignsevaeligrdien eller indgrebstaeligrsklen som vurderingen er baseret paring

825 Rapporten skal indeholde oplysninger om hvilken type test der er anvendt samt om det grundlaeligggende proslashvningsprincip og den anvendte kalibreringsmaringde


827 I tilfaeliglde hvor proslashver mistaelignkes for at vaeligre ikke-overensstemmende skal rapporten indeholde en bemaeligrkning om den foranstaltning der skal traeligffes Koncentrationen af PCDDerPCDFer og summen af PCDDer PCDFer og dioxinlignende PCBer i proslashver med forhoslashjet indhold skal bestemmesbekraeligftes efter en verifikationsmetode

828 Ikke-overensstemmende resultater skal kun indberettes ved hjaeliglp af en verifikationsanalyse

83 Fysisk-kemiske screeningsmetoder



M6


833 Der kan desuden gives vaeligrdier for de enkelte PCDDPCDF- ogeller dioxinlignende PCB-kongenere og TEQ-vaeligrdier angivet som nedre koncentrationer oslashvre koncentrationer og middelkoncentrationer Resulshytaterne angives i samme enheder og med (mindst) samme antal betyshydende cifre som de graelignsevaeligrdier der er fastsat ved direktiv 200232EF


835 I rapporten skal de anvendte GC-MS-metoder vaeligre naeligvnt



838 Ikke-overensstemmelse kan kun konstateres ved hjaeliglp af en verifikationsanalyse

KAPITEL III

Klargoslashring af proslashver og krav til analysemetoder der anvendes ved offentlig kontrol af indholdet af ikke-dioxinlignende PCBer i foder


Kravene i dette kapitel anvendes naringr foder analyseres med henblik paring offentlig kontrol af indholdet af ikke-dioxinlignende PCBer og for saring vidt angaringr klargoslashring af proslashver og analytiske krav til andre forskriftsshymaeligssige formaringl herunder kontrol udfoslashrt af fodervirksomhedslederen med henblik paring at sikre overensstemmelse med bestemmelserne i forordning (EF) nr 1832005

2 Paringvisningsmetoder der kan anvendes

Gaskromatografielektronindfangningsdetektion (GC-ECD) GC-LRMS GC-MSMS GC-HRMS eller tilsvarende metoder

3 Identifikation og bekraeligftelse af de relevante analytter

31 Relativ retentionstid i forhold til interne standarder eller referencestanshydarder (tilladt afvigelse plusmn 025 )

32 Gaskromatografisk separation af de ikke-dioxinlignende PCBer fra intershyfererende stoffer navnlig fra co-eluerende PCBer isaeligr hvis niveauet i de paringgaeligldende proslashver ligger i naeligrheden af de ved lov fastsatte graelignser og en overskridelse skal bekraeligftes ( 1 )

33 Krav til GC-MS-metoder

Overvaringgning af mindst foslashlgende antal molekylaeligrioner eller karakterishystiske ioner fra isotopmoslashnstret

a) to specifikke ioner ved HRMS

M6


( 1 ) Kongenere der erfaringsmaeligssigt ofte co-eluerer er feks PCB 2831 PCB 5269 og PCB 138163164 For saring vidt angaringr GC-MS skal der ogsaring tages hensyn til mulige interferenser fra fragmenter af hoslashjere chlorerede kongenere

b) tre specifikke ioner ved LRMS

c) to specifikke praeligkursor-ioner hver med et specifikt tilsvarende transitionsprodukt-ion ved MS-MS

Tilladte maksimumstolerancer for isotopforholdet for udvalgte massefragmenter

Relativ afvigelse for isotopforholdet for udvalgte massefragmenter fra teoretisk isotopforhold eller kalibreringsstandard for maringlionen (den hyppigst forekommende af de maringlte ioner) og kvalifikatorionenionerne plusmn 15

34 Krav til GC-ECD-metoder

Resultater der overskrider graelignsevaeligrdien bekraeligftes med to GC-kolonner med stationaeligre faser med forskellig polaritet

4 Dokumentation for metodens ydeevne

Metodens ydeevne valideres i naeligrheden af graelignsevaeligrdien (05 til 2 gange graelignsevaeligrdien) med en acceptabel variationskoefficient for gentagne analyser (jf kravene til intern reproducerbarhed (intermediaeligr praeligcision) i punkt 9)


Summen af LOQ ( 1 ) for ikke-dioxinlignende PCBer maring ikke vaeligre hoslashjere end en tredjedel af graelignsevaeligrdien ( 2 )

6 Kvalitetskontrol

Regelmaeligssig blindproslashvekontrol analyse af spikede proslashver kvalitetskonshytrolproslashver og deltagelse i laboratoriesammenligninger vedroslashrende de relevante matrixer


71 Der anvendes egnede interne standarder med fysisk-kemiske egenskaber der er sammenlignelige med de relevante analytters

72 Tilsaeligtning af interne standarder

Tilsaeligtning til produkter (inden ekstraktion og oprensning)

73 Krav til metoder hvor alle seks isotopmaeligrkede ikke-dioxinlignende PCB-kongenere anvendes

a) Resultater korrigeres for genfinding af interne standarder

b) Genfindingsprocenten for isotopmaeligrkede interne standarder skal vaeligre paring mellem 60 og 120

c) En lavere eller hoslashjere genfindelsesprocent er acceptabel for enkeltshykongenere der bidrager til summen af ikke-dioxinlignende PCBer med under 10

74 Krav til metoder hvor ikke alle seks isotopmaeligrkede interne standarder eller andre interne standarder anvendes

a) Genfindingen af de(n) interne standard(er) kontrolleres for hver enkelt proslashve

M6


( 1 ) Principperne i raquoGuidance Document on the Estimation of LOD and LOQ for Measureshyments in the Field of Contaminants in Feed and Foodlaquo (httpeceuropaeufoodsafety animal-feed_en) skal foslashlges hvis det er relevant

( 2 ) Det maring paring det kraftigste anbefales at bidraget fra reagensblindproslashven til indholdet af et forurenende stof i en proslashve er lavere Det er laboratoriets ansvar at kontrollere variashytionen i blindproslashveniveauet isaeligr hvis blindproslashveindholdet fratraeligkkes

b) Genfindingen af interne standarder skal vaeligre paring mellem 60 og 120

c) Resultater korrigeres for genfinding af interne standarder

75 Genfindingen af umaeligrkede kongenere kontrolleres ved hjaeliglp af spikede proslashver eller kvalitetskontrolproslashver med koncentrationer i naeligrheden af graelignsevaeligrdien Genfindingen af disse kongenere anses for acceptabel hvis genfindingsprocenten er paring mellem 60 og 120


I henhold til forordning (EF) nr 8822004 skal laboratorier vaeligre akkreshyditeret af et anerkendt organ der fungerer i overensstemmelse med ISO-vejledning 58 saring det sikres at de anvender analysekvalitetssikring Laboratorier akkrediteres ifoslashlge EN ISOIEC 17025-standarden Desuden skal principperne i raquoTechnical Guidelines for the estimation of measushyrement uncertainty and limits of quantification for PCDDF and PCB analysislaquo foslashlges hvis det er relevant ( 1 )

9 Karakteristika for metodens ydeevne kriterier vedroslashrende summen af ikke-dioxinlignende PCBer ved graelignsevaeligrdien

Massespektrometrisk isotopfortynding ( 1 ) Andre teknikker

Korrekthed ndash 20 til + 20 ndash 30 til + 30

Intermediaeligr praeligcision (RSD )

le 15 le 20

Forskel mellem oslashvre og nedre koncentration (beregshynet)

le 20 le 20

( 1 ) Anvendelse af alle seks 13 C-maeligrkede analoger i overensstemmelse med interne

standarder


101 Analyseresultaterne skal omfatte vaeligrdierne for de enkelte ikke-dioxinshylignende PCBer og summen af PCB-kongenere der er angives som nedre koncentrationer oslashvre koncentrationer og middelkoncentrationer med henblik paring at sikre at indberetningen af resultater omfatter saring mange oplysninger som muligt saring resultaterne kan fortolkes i overensshystemmelse med specifikke krav

102 Rapporten skal omfatte oplysninger om den metode der er anvendt til ekstraktion af PCBer

103 Tallene for genfinding af de enkelte interne standarder stilles til raringdigshyhed hvis genfindingen ligger uden for det interval der er angivet i punkt 7 hvis graelignsevaeligrdien er overskredet og i oslashvrige tilfaeliglde efter anmodning

104 Da der skal tages hensyn til den ekspanderede maringleusikkerhed naringr det afgoslashres om en proslashve er overensstemmende skal denne parameter ogsaring vaeligre tilgaeligngelig Analyseresultaterne indberettes derfor som x plusmn U hvor x er analyseresultatet og U er den ekspanderede maringleusikkerhed idet der anvendes en daeligkningsfaktor paring 2 hvilket giver et konfidensniveau paring ca 95


M6



BILAG VI

ANALYSEMETODER TIL BESTEMMELSE AF ANIMALSKE BESTANDDELE SOM LED I DEN OFFENTLIGE KONTROL AF

FODER


Bestemmelse af animalske bestanddele i foder skal udfoslashres ved lysmikroskopi eller PCR (polymerasekaeligdereaktion) i overensstemshymelse med de bestemmelser der er fastsat i dette bilag

Disse to metoder goslashr det muligt at paringvise tilstedevaeligrelsen af animalske bestanddele i fodermidler og foderblandinger De goslashr det imidlertid ikke muligt at beregne maeligngden af saringdanne bestandshydele i fodermidler og foderblandinger Begge metoder har en paringvisshyningsgraelignse under 01 (ww)

PCR-metoden goslashr det muligt at identificere hvilken taksonomisk gruppe animalske bestanddele der er til stede i fodermidler og foderblandinger tilhoslashrer

Disse metoder skal finde anvendelse i forbindelse med kontrollen med anvendelsen af forbuddene i artikel 7 stk 1 i og bilag IV til forordning (EF) nr 9992001 og i artikel 11 stk 1 i forordshyning (EF) nr 10692009

Afhaeligngigt af hvilken type foder der afproslashves kan disse metoder anvendes inden for en enkelt operationel protokol enten alene eller tilsammen i overensstemmelse med de standardprocedurer (SOP) som er fastsat af EU-referencelaboratoriet for animalske proteiner i foderstoffer (EURL-AP) og offentliggjort paring dets websted ( 1 )

2 METODER

21 Lysmikroskopi

211 Princip

Animalske bestanddele der kan vaeligre til stede i fodermidler og foderblandinger som er sendt til analyse identificeres ud fra typiske kendetegn der kan identificeres ved mikroskopi (bla muskelfibre og andre koslashdpartikler brusk knogler horn haringr boslashrster blod fjer aeligggeskaller fiskeben og skaeligl)

212 Reagenser og udstyr

2121 Reagenser

21211 Koncentreringsmiddel

212111 Tetrachlorethylen (massefylde 162)

21212 Farvningsreagens

212121 Alizarinroslashdtoploslashsning (25 ml 1M saltsyre fortyndes i 100 ml vand og der tilsaeligttes 200 mg alizarinroslashdt til oploslashsningen)

21213 Monteringsmedier

212131 Lud (NaOH 25 wv eller KOH 25 wv)

M2


( 1 ) httpeurlcraweu

212132 Glycerol (ufortyndet viskositet 1 490 cP)

212133 Norland reg Optical Adhesive 65 (viskositet 1 200 cP) eller en harpiks med tilsvarende egenskaber med henblik paring praeligparering af permanente objektglas

21214 Monteringsmedier med farvende egenskaber

212141 Lugoloploslashsning (2 g kaliumiodid oploslashses i 100 ml vand og der tilsaeligttes 1 g jod under hyppig omrystning)

212142 Cystinreagens (2 g blyacetat og 10 g NaOH i 100 ml vand)

212143 Fehlings vaeligske (klargjort foslashr brug af lige dele (11) af to stamopshyloslashsninger A og B Oploslashsning A 69 g kobber(II)sulfatpentahydrat oploslashses i 100 ml vand Oploslashsning B 346 g kaliumnatriumtartratteshytrahydrat og 12 g NaOH oploslashses i 100 ml vand)

212144 Tetramethylbenzidinhydrogenperoxid (1 g 33laquo55rsquotetramethylbenzidin (TMB) oploslashses i 100 ml iseddike og 150 ml vand Foslashr brug blandes 4 dele af denne TMB-oploslashsning med 1 del 3 -hydrogenperoxid)

21215 Skyllevaeligsker

212151 Ethanol ge 96 (teknisk kvalitet)

212152 Acetone (teknisk kvalitet)

21216 Blegemiddel

212161 Natriumhypochloritoploslashsning som farings i handelen (9-14 aktivt chlor)

2122 Udstyr

21221 Analysevaeliggt med 0001 g aflaeligsningsnoslashjagtighed

21222 Formalingsudstyr (moslashlle eller morter)

21223 Sigter med kvadratiske masker med en maskevidde paring 025 mm og 1 mm

21224 Konisk glasskilletragt med et rumindhold paring 250 ml med teflon eller slebet stophane ved keglens bund Stophanens aringbning skal have en diameter paring ge 4 mm Alternativt kan et glasbaeligger med konisk bund anvendes forudsat at laboratoriet har dokumenteret at paringvisningsniveauet svarer til det der opnarings ved at benytte den koniske glasskilletragt

Skilletragt

M2


21225 Stereomikroskop med et endeligt forstoslashrrelsesinterval paring mindst 65 times til 40 times

21226 Sammensat mikroskop med et endeligt forstoslashrrelsesinterval paring mindst 100 times til 400 times med transmitteret lyslysfelt Alternativt kan polariseret lys og differentiel interferenskontrast anvendes

21227 Standardlaboratorieglasudstyr

21228 Udstyr til klargoslashring af objektglas klassiske objektglas konkave objektglas daeligkglas (20 times 20 mm) pincetter tynd spatel

213 Udtagning og forberedelse af proslashver

2131 Proslashveudtagning

Der skal anvendes en repraeligsentativ proslashve som er udtaget i overshyensstemmelse med bestemmelserne i bilag I

2132 Forholdsregler

For at undgaring krydskontaminering paring laboratoriet skal alt genanshyvendeligt udstyr rengoslashres omhyggeligt foslashr brugen Skilletragtens dele adskilles inden rengoslashring Skilletragtens dele og glasudstyr forvaskes manuelt og vaskes derefter i en vaskemaskine Sigter rengoslashres ved brug af en boslashrste med stive syntetiske boslashrster Det anbefales at foretage en afsluttende rengoslashring af sigter med acetone og komprimeret luft efter sigtning af fedtholdigt materiale som feks fiskemel

2133 Forberedelse af andre proslashver end fedt eller olie

21331 Toslashrring af proslashver Proslashver med et vandindhold paring over 14 skal toslashrres inden haringndteringen

21332 Sigtning af proslashver paring forharingnd Det anbefales at sigte (1 mm-sigte) foder i pilleform og kerner paring forharingnd og derefter forberede og analysere begge fraktionerne som separate proslashver

21333 Delproslashveudtagning og formaling Der udtages en delproslashve paring mindst 50 g af proslashven og den formales efterfoslashlgende

21334 Ekstraktion og forberedelse af sedimentet En portion paring 10 g (med en noslashjagtighed paring 001 g) af den formalede delproslashve overfoslashres til skilletragten eller glasbaeliggeret med konisk bund og der tilsaeligttes 50 ml tetrachlorethylen Den portion der overfoslashres til tragten udgoslashr hoslashjst 3 g naringr det drejer sig om fiskemel eller andre rene animalske produkter mineralske ingredienser eller forblandinger som geneshyrerer mere end 10 sediment Blandingen omrystes kraftigt i mindst 30 sekunder og der tilsaeligttes forsigtigt yderligere mindst 50 ml tetrachlorethylen idet den indvendige side af tragten vaskes for at fjerne eventuelle partikler der har sat sig fast Den resulteshyrende blanding henstaringr i mindst 5 minutter foslashr sedimentet skilles fra ved aringbning af hanen

Hvis der anvendes et glasbaeligger med konisk bund omroslashres blanshydingen kraftigt i mindst 15 sekunder og eventuelle partikler der har sat sig fast paring siden af glasbaeliggeret vaskes omhyggeligt ned langs indersiden med mindst 10 ml ren tetrachlorethylen Blanshydingen henstaringr i 3 minutter og omroslashres igen i 15 sekunder og eventuelle partikler der har sat sig fast paring siden af glasbaeliggeret vaskes omhyggeligt ned langs indersiden med mindst 10 ml ren tetrachlorethylen Den resulterende blanding henstaringr i mindst 5 minutter hvorefter den flydende fraktion fjernes og kasseres ved omhyggelig dekantering idet der udvises omhu for ikke at miste noget af sedimentet

M2


Sedimentet toslashrres og vejes med en noslashjagtighed paring 0001 g Hvis mere end 5 af sedimentet bestaringr af partikler paring over 050 mm sigtes det (025 mm-sigte) og begge fraktionerne undersoslashges

21335 Ekstraktion og forberedelse af flotatet Efter at sedimentet er skilt fra med den ovenfor beskrevne metode boslashr der vaeligre to faser tilbage i skilletragten en flydende der bestaringr af tetrachlorethylen og en fast der er dannet af floteringsmateriale (flydelaget) Denne faste fase er flotatet og det skal skilles fra ved at haeliglde tetrachshylorethylenet helt fra tragten ved at aringbne hanen Ved at skilletragten vendes overfoslashres flotatet til en stor petriskaringl og det lufttoslashrres i et stinkskab Hvis mere end 5 af flotatet bestaringr af partikler paring over 050 mm sigtes det (025 mm-sigte) og begge fraktionerne undershysoslashges

21336 Forberedelse af raringmateriale En portion paring mindst 5 g af den formalede delproslashve forberedes Hvis mere end 5 af raringmaterialet bestaringr af partikler paring over 050 mm sigtes det (025 mm-sigte) og begge fraktionerne undersoslashges

2134 Forberedelse af proslashver der bestaringr af fedt eller olie

Foslashlgende protokol foslashlges for forberedelse af proslashver der bestaringr af fedt eller olie

mdash Fedt i fast form opvarmes i en ovn indtil det er blevet flydende

mdash Med pipette overfoslashres 40 ml fedt eller olie fra bunden af proslashven til et centrifugeroslashr

mdash Der centrifugeres i 10 minutter ved 4 000 omdrejninger i minuttet

mdash Hvis fedtet efter centrifugering er fast opvarmes det i en ovn indtil det er blevet flydende

mdash Der centrifugeres endnu en gang ved 4 000 omdrejninger i 5 minutter

mdash Med en lille ske eller en spatel overfoslashres halvdelen af de dekanterede urenheder til objektglas til undersoslashgelse Det anbeshyfales at bruge glycerol som monteringsmedium

mdash De resterende urenheder anvendes til at forberede sedimentet som beskrevet i punkt 2133

2135 Brug af farvningsreagenser

For at lette korrekt identifikation af de animalske bestanddele kan laboranten anvende farvningsreagenser under proslashveforberedelsen i overensstemmelse med retningslinjerne der er udstedt af EURL-AP og offentliggjort paring dets websted

Hvis der anvendes alizarinroslashdtoploslashsning til at farve sedimentet anvendes foslashlgende protokol

mdash Det toslashrrede sediment haeligldes i et reagensglas og skylles to gange med ca 5 ml ethanol (der anvendes vortex-apparat i 30 sekunder oploslashsningsmidlet skal henstaring i ca 1 minut 30 sekunder saring det bundfaeliglder sig foslashr det haeligldes fra)

mdash Sedimentet bleges ved tilsaeligtning af mindst 1 ml natriumhyshypochloritoploslashsning Lad reaktionen fortsaeligtte i 10 minutter Roslashret fyldes med vand sedimentet henstaringr i 2-3 minutter og vandet og de opslaeligmmede partikler haeligldes forsigtigt fra

M2


mdash Sedimentet renses yderligere to gange med ca 10 ml vand (der anvendes vortex-apparat i 30 sekunder lad bundfaeliglde og haeligld hver gang vandet fra)

mdash Der tilsaeligttes 2-10 draringber alizarinroslashdtoploslashsning og blandingen vortexes Reaktionen skal have lov at finde sted i 30 sekunder og det farvede sediment renses to gange med ca 5 ml ethanol efterfulgt af eacuten skylning med acetone (der anvendes hver gang vortex-apparat i 30 sekunder oploslashsningsmidlet skal henstaring ca 1 minut foslashr det haeligldes fra)

mdash Det farvede sediment toslashrres

214 Mikroskopisk undersoslashgelse

2141 Praeligparering af objektglas

Der forberedes praeligparater af sedimentet og afhaeligngigt af laboranshytens valg af enten flotatet eller raringmaterialet Hvis der har vaeligret anvendt sigtning ved proslashveforberedelsen forberedes begge fraktioshynerne (baringde den fine og den grove fraktion) De testportioner af fraktioner der udstryges paring objektglas skal vaeligre repraeligsentative for hele fraktionen

Der praeligpareres et tilstraeligkkeligt antal objektglas for at sikre at en fuldstaeligndig undersoslashgelsesprotokol jf punkt 2142 kan gennemshyfoslashres

Objektglas monteres med passende monteringsmedium i overensshystemmelse med de standardprocedurer der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort paring dets websted Objektglassene skal vaeligre daeligkket med daeligkglas

2142 Observationsprotokoller vedroslashrende paringvisning af animalske partikler i foderblandinger og fodermidler

De praeligparerede objektglas skal observeres i overensstemmelse med de observationsprotokoller der er fastsat i diagram 1 for foderblandinger og fodermidler dog ikke rent fiskemel eller i diagram 2 for rent fiskemel

Mikroskopiobservationerne udfoslashres med sammensat mikroskop paring sedimentet og afhaeligngigt af laborantens valg paring enten flotatet eller raringmaterialet Stereomikroskop kan benyttes som supplement til sammensat mikroskop for de grove fraktioner Hvert objektglas skal screenes i sin helhed ved forskellige forstoslashrrelser

Minimumsantallet af objektglas der skal observeres paring hvert enkelt trin af observationsprotokollen skal overholdes strengt medmindre det ikke med hele fraktionsmaterialet er muligt at naring op paring det fastsatte antal objektglas Hoslashjst 6 objektglas pr bestemmelse skal observeres

For at lette identifikationen af partiklernes type og oprindelse kan laboranten bruge stoslashttevaeligrktoslashjer saringsom beslutningsstoslashttesystemer billedbiblioteker og referenceproslashver

M2


Diagram 1

Observationsprotokol vedroslashrende paringvisning af animalske partikler i foderblandinger og fodermidler bortset fra fiskemel

M2


Diagram 2

Observationsprotokol vedroslashrende paringvisning af animalske partikler i fiskemel

M2



Hvis der efter en foslashrste bestemmelse der er gennemfoslashrt i overshyensstemmelse med den relevante observationsprotokol jf diagram 1 eller diagram 2 ikke er paringvist nogen animalske partikler af en given type (dvs landdyr eller fisk) er det ikke noslashdvendigt med en yderligere bestemmelse og resultatet af analysen indberettes med anvendelse af den terminologi der er fastsat i punkt 2151

Hvis der efter en foslashrste bestemmelse der er gennemfoslashrt i overshyensstemmelse med den relevante observationsprotokol jf diagram 1 eller diagram 2 er paringvist 1-5 animalske partikler af en given type (dvs landdyr eller fisk) foretages der en yderligere bestemmelse paring en ny delproslashve paring 50 g Hvis der efter denne anden bestemshymelse er paringvist 0-5 animalske partikler af den samme type skal resultatet af analysen indberettes med anvendelse af den terminoshylogi der er fastsat i punkt 2152 ellers foretages der en tredje bestemmelse paring en ny delproslashve paring 50 g Hvis summen af partikler af en given type der er paringvist ved de to bestemmelser efter den foslashrste og anden bestemmelse imidlertid er stoslashrre end 15 er det ikke noslashdvendigt med en yderligere bestemmelse og resultatet af analysen indberettes direkte med anvendelse af den terminologi der er fastsat i punkt 2153 Hvis summen af animalske partikler af en given type der er paringvist ved de tre bestemmelser efter den tredje bestemmelse er stoslashrre end 15 indberettes resultatet af analysen med anvendelse af den terminologi der er fastsat i punkt 2153 Ellers indberettes resultatet af analysen med anvenshydelse af den terminologi der er fastsat i punkt 2152

Hvis der efter en foslashrste bestemmelse der er gennemfoslashrt i overshyensstemmelse med den relevante observationsprotokol jf diagram 1 eller diagram 2 er paringvist mere end 5 animalske partikler af en given type (dvs landdyr eller fisk) indberettes resultatet af analysen med anvendelse af den terminologi der er fastsat i punkt 2153

215 Angivelse af resultaterne

Ved indberetningen af resultaterne skal laboratoriet angive hvilken type materiale analysen er blevet udfoslashrt paring (sediment flotat eller raringmateriale) og hvor mange bestemmelser der er blevet foretaget

Laboratorierapporten skal mindst indeholde oplysninger om tilsteshydevaeligrelsen af bestanddele fra landdyr og fra fisk

De forskellige tilfaeliglde afrapporteres paring foslashlgende maringde

2151 Hvis der ikke er blevet paringvist nogen animalske partikler af en given type

mdash Der har ved lysmikroskopi ikke kunnet paringvises partikler fra landdyr i den forelagte proslashve

mdash Der har ved lysmikroskopi ikke kunnet paringvises partikler fra fisk i den forelagte proslashve

2152 Hvis der er blevet paringvist i gennemsnit 1-5 animalske partikler af en given type

mdash Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr bestemmelse kunnet paringvises hoslashjst 5 partikler fra landdyr i den forelagte proslashve Partiklerne blev identificeret som hellip [knogler brusk muskelvaeligv haringr horn hellip] Da dette lave indhold ligger under paringvisningsgraelignsen for mikroskopimetoden kan risiko for et falsk positivt resultat ikke udelukkes

M2


eller hvis det er relevant

mdash Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr bestemmelse kunnet paringvises hoslashjst 5 partikler fra fisk i den forelagte proslashve Partiklerne blev identificeret som hellip [fiskeben fiskeskaeligl brusk muskelvaeligv oslashresten gaeliglle hellip] Da dette lave indhold ligger under paringvisningsgraelignsen for mikroskopimetoden kan risiko for et falsk positivt resultat ikke udelukkes

Hvis der er foretaget sigtning paring forharingnd skal det oplyses i laboshyratorierapporten hvilken fraktion (sigtet fraktion pelleteret fraktion eller kerner) de animalske partikler er blevet paringvist i for saring vidt som paringvisning af animalske partikler udelukkende i den sigtede fraktion kan vaeligre tegn paring en forurening fra omgivelserne

2153 Hvis der er blevet paringvist i gennemsnit mere end 5 animalske partikler af en given type

mdash Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr bestemmelse kunnet paringvises mere end 5 partikler fra landdyr i den forelagte proslashve Partiklerne blev identificeret som hellip [knogler brusk muskelvaeligv haringr horn hellip]


mdash Der har ved lysmikroskopi i gennemsnit pr bestemmelse kunnet paringvises mere end 5 partikler fra fisk i den forelagte proslashve Partiklerne blev identificeret som hellip [fiskeben fiskeshyskaeligl brusk muskelvaeligv oslashresten gaeliglle hellip]

Hvis der er foretage sigtning paring forharingnd skal det oplyses i laboshyratorierapporten hvilken fraktion (sigtet fraktion pelleteret fraktion eller kerner) de animalske partikler er blevet paringvist i for saring vidt som paringvisning af animalske partikler udelukkende i den sigtede fraktion kan vaeligre tegn paring en forurening fra omgivelserne

22 PCR

221 Princip

Deoxyribonukleinsyre (dna)-fragmenter af animalsk oprindelse som kan forekomme i fodermidler og foderblandinger paringvises med en genetisk amplifikationsmetode ved PCR der er maringlrettet mod artsspecifikke dna-sekvenser

PCR-metoden kraeligver at der foslashrst foretages en dna-ekstraktion Derefter amplificeres det fremkomne dna-ekstrakt for at paringvise de dyrearter assayet er maringlrettet mod


2221 Reagenser

22211 Reagenser til dna-ekstraktion

Der maring kun anvendes reagenser der er godkendt af EURL-AP og offentliggjort paring dets websted

22212 Reagenser til genetisk amplifikation

M2


222121 Primere og sonder

Der maring kun anvendes primere og sonder med oligonukleotidsshyekvenser der er valideret af EURL-AP ( 1 )

222122 Mastermix

Der maring kun anvendes mastermix-oploslashsninger som ikke indeholder reagenser der kan foslashre til falske resultater paring grund af tilstedevaeligshyrelsen af animalsk dna ( 2 )

222123 Dekontamineringsreagenser

2221231 Saltsyreoploslashsning (01N)

2221232 Blegemiddel (natriumhypochloritoploslashsning (015 aktivt chlor))

2221233 Ikke-aeligtsende reagenser til dekontaminering af bekosteligt udstyr saringsom analysevaeliggte (feks DNA Erase

TM fra MP Biomedicals)

2222 Udstyr


22222 Formalingsudstyr

22223 Thermocycler der muliggoslashr tidstro PCR

22224 Mikrocentrifuge til mikrocentrifugeroslashr

22225 Mikropipettesaeligt som goslashr det muligt at der afpipetteres fra 1-1 000 μl

22226 Molekylaeligrbiologisk standardudstyr af plast mikrocentrifugeroslashr plastspidser med filter til mikropipetter plader til thermocycler

22227 Frysere til at opbevare proslashver og reagenser




2232 Forberedelse af proslashver

Forberedelsen af laboratorieproslashver indtil dna-ekstraktion skal opfylde kravene i bilag II Der udtages en delproslashve paring mindst 50 g af proslashven og den formales efterfoslashlgende

Proslashveforberedelsen skal foregaring i et andet lokale end dem der er beregnet til dna-ekstraktion og til genetisk amplifikation-reaktioner som beskrevet i ISO 24276

Der forberedes to testportioner paring mindst 100 mg hver

224 Dna-ekstraktion

Dna-ekstraktionen udfoslashres paring hver testportion der er forberedt ved hjaeliglp af den standardprocedure der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort paring dets websted

Der forberedes to ekstraktionskontroller for hver ekstraktionsserie som beskrevet i ISO 24276

mdash en ekstraktionsblindkontrol

mdash en positiv dna-ekstraktionskontrol

M2


( 1 ) Listen over disse primere og sonder for hver dyreart assayet er maringlrettet mod findes paring EURL-APs websted

( 2 ) Der findes eksempler paring mastermix der er funktionelle paring EURL-APs websted

225 Genetisk amplifikation

Den genetiske amplifikation foretages ved anvendelse af de metoshyder som er valideret for de enkelte arter der kraeligver identificering Disse metoder er fastsat i de standardprocedurer der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort paring dets websted Hvert dna-ekstrakt analyseres i mindst to forskellige fortyndinger for at evaluere haeligmning

Der forberedes to amplifikationskontroller pr maringlart som beskrevet i ISO 24276

mdash Der anvendes en positiv dna-maringlkontrol for alle plader eller serier af PCR-assays

mdash Der anvendes en amplifikationsreagenskontrol (ogsaring kaldet no template control (NTC)) for alle plader eller serier af PCR-assays

226 Fortolkning og angivelse af resultater

Ved indberetningen af resultaterne skal laboratoriet som minimum angive vaeliggten af de anvendte testportioner den anvendte ekstrakshytionsmetode antallet af foretagne bestemmelser og metodens paringvisshyningsgraelignse

Resultaterne fortolkes og indberettes ikke hvis den positive dna-ekstraktionskontrol og de positive dna-maringlkontroller ikke giver positive resultater for det maringl assayet vedroslashrer og amplifishykationensreagenskontrollen samtidig er negativ

Hvis resultaterne af de to testportioner ikke er overensstemmende gentages som minimum den genetiske amplifikation Hvis laborashytoriet har mistanke om at dna-ekstrakterne kan vaeligre aringrsag til uoverensstemmelsen foretages der en ny dna-ekstraktion og eftershyfoslashlgende genetisk amplifikation inden resultaterne fortolkes

Den endelige angivelse af resultater skal vaeligre baseret paring integrashytion og fortolkning af resultaterne af de to testportioner i overensshystemmelse med de standardprocedurer der er fastsat af EURL-AP og offentliggjort paring dets websted

2261 Negativt resultat

Et negativt resultat afrapporteres paring foslashlgende maringde

Der blev ikke paringvist noget dna fra X i den forelagte proslashve (X staringr for den dyreart eller gruppe af dyrearter assayet er maringlrettet mod)

2262 Positivt resultat

Et positivt resultat afrapporteres paring foslashlgende maringde

Der blev paringvist dna fra X i den forelagte proslashve (X staringr for den dyreart eller gruppe af dyrearter assayet er maringlrettet mod)

M2


BILAG VII

METODE TIL BEREGNING AF NAEligRINGSVAEligRDIEN AF FODER TIL FJERKRAElig

1 Beregningsmetode og angivelse af naeligringsvaeligrdi

Naeligringsvaeligrdien i foderblandinger til fjerkraelig beregnes efter nedenstaringende formel ud fra procentsatserne for visse bestanddele i foderet Denne vaeligrdi udtrykkes i megajoule (MJ) omsaeligttelig energi (ME) korrigeret for nitrogen pr kg foderblanding

MJkg ME = 01551 times raringprotein + 03431 times raringfedt + 01669 times stivelse + 01301 times totalsukker (udtrykt som saccharose)

2 Tolerancer for de angivne vaeligrdier

Hvis der i forbindelse med den offentlige kontrol konstateres en afvigelse (oslashget eller reduceret naeligringsvaeligrdi af foderet) mellem kontrollens resultat og den angivne naeligringsvaeligrdi kan en mindstetolerance paring 04 MJkg ME tillades


Det resultat der opnarings ved ovenstaringende formel angives med en decimal

4 Proslashveudtagning og analyse

Udtagningen af proslashver af foderblandingen og bestemmelsen af indholdet af bestanddele som angivet i beregningsmetoden foretages i overensstemmelse med Faeligllesskabets proslashveudtagnings- og analysemetoder som led i den offentlige kontrol med foder

Foslashlgende metoder anvendes

mdash Til bestemmelse af indholdet af raringfedt metode B under den i del H i bilag III beskrevne metode til bestemmelse af raringfedt

mdash Til bestemmelse af indholdet af stivelse den polarimetriske metode som beskrevet i del L i bilag III

B


BILAG VIII

ANALYSEMETODER TIL KONTROL FOR ULOVLIG FOREKOMST AF FODERTILSAEligTNINGSSTOFFER DER IKKE LAEligNGERE ER

TILLADT

Vigtigt

Der kan anvendes mere foslashlsomme analysemetoder til paringvisning af ulovlig forekomst i foder af tilsaeligtningsstoffer der ikke laeligngere er tilladt end dem der er beskrevet i dette bilag

De i dette bilag beskrevne analysemetoder anvendes til verifikationsformaringl

A BESTEMMELSE AF METHYLBENZOQUAT

7-Benzyloxy-6-Butyl-3-Methoxycarbonyl-4-Quinolon


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af methylbenzoquat i foder Bestemmelsesgraelignsen er 1 mgkg

2 Princip

Methylbenzoquat ekstraheres fra proslashven med en oploslashsning af methanshysulfonsyre i methanol Ekstraktet oprenses med dichlormethan ved ionbytningskromatografi og derefter igen med dichlormethan Methylshybenzoquatindholdet bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor

3 Reagenser

31 Dichlormethan



Blanding af methanol (32) og vand (svarende til HPLC-kvalitet) 75 + 25 (v + v)


34 Methansulfonsyreoploslashsning c = 2

200 ml methansulfonsyre fortyndes til 1 000 ml med methanol (32)

35 Saltsyreoploslashsning c = 10

100 ml saltsyre (ρ 20 = 118 gml) fortyndes til 1 000 ml med vand

36 Kationbytterresin Amberlite CG-120 (Na) 100ndash200 mesh

Resinet forbehandles inden brug 100 g resin opslaeligmmes med 500 ml saltsyreoploslashsning (35) og opvarmes paring varmeplade til kogning under stadig omroslashring Opslaeligmningen henstaringr til afkoslashling og syren dekanteres fra Derefter filtreres gennem et filtrerpapir under vakuum Resinet vaskes to gange med vand i portioner paring 500 ml og derefter med 250 ml methanol (32) Resinet skylles med yderligere 250 ml methanol og toslashrres ved at der sendes luft gennem filterkagen Det toslashrrede resin opbevares i en tilproppet flaske

37 Standardstof ren methylbenzoquat (7-benzyloxy-6-butyl-3-methoxycarshybonyl-4-quinolon)

B


371 M e t h y l b e n z o q u a t s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 5 0 0 μ g m l

Med en noslashjagtighed paring 01 mg afvejes 50 mg standard (37) som oploslashses i methansulfonsyreoploslashsning (34) i en 100 ml maringlekolbe hvorshyefter der fyldes op til maeligrket og blandes

372 M e t h y l b e n z o q u a t s t a n d a r d m e l l e m o p l oslash s n i n g 5 0 μ g m l

50 ml af methylbenzoquatstandardstamoploslashsningen (371) overfoslashres til en 50 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol (32) og blandes


Henholdsvis 10 20 30 40 og 50 ml af methylbenzoquatstandardshymellemoploslashsningen (372) overfoslashres til hver sin 25 ml maringlekolbe Der fyldes op til maeligrket med mobil fase (33) og blandes Disse oploslashsninger har en koncentration paring henholdsvis 20 40 60 80 og 100 μgml methylbenzoquat Disse oploslashsninger skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

4 Apparatur



43 Glaskolonne (250 mm times 15 mm) forsynet med stophane og med en kapacitet paring ca 200 ml





5 Fremgangsmaringde

51 Generelt

511 Der analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken methylbenshyzoquat eller interfererende stoffer er til stede

512 Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde methylbenzoquat svarende til den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 15 mgkg tilsaeligttes 600 μl af standardstamoploslashsningen (371) til 20 g blindproslashve Der blandes og ventes i 10 minutter inden der fortsaeligttes med ekstrakshytion (52)

NB Til denne metode anvendes en blindproslashve af samme type som analyseproslashven og som ved analyse viser sig ikke at indeholde methylbenzoquat

52 Ekstraktion

Ca 20 g af den klargjorte proslashve afvejes med en noslashjagtighed paring 001 g og overfoslashres til en 250 ml konisk kolbe Der tilsaeligttes 1000 ml methashynolsulfonsyreoploslashsning (34) og omrystes mekanisk (41) i 30 minutter Oploslashsningen filtreres gennem filtrerpapir og filtratet gemmes til vaeligske- vaeligskefordelingen (53)

53 Vaeligske-vaeligskefordeling

250 ml af det under (52) opnaringede filtrat overfoslashres til en 500 ml skilleshytragt indeholdende 100 ml saltsyreoploslashsning (35) Der tilsaeligttes 100 ml dichlormethan (31) til tragten og omrystes i 1 minut Efter at de to lag har faringet tid til at skilles aftappes det nederste lag (dichlormethan) i en 500 ml rundbundet kolbe Ekstraktionen af den vandige fase gentages

B


med yderligere to portioner dichlormethan paring hver 40 ml og disse ekstrakter kombineres med det foslashrste ekstrakt i den rundbundede kolbe Dichlormethanekstraktet inddampes til toslashrhed paring rotationsfordamshyperen (42) ved 40

o C under reduceret tryk Remanensen oploslashses i 20ndash25 ml methanol (32) hvorefter kolben tilproppes og hele ekstraktet gemmes til ionbytningskromatografi (54)

54 Ionbytningskromatografi

541 K l a r g oslash r i n g a f k a t i o n b y t t e r k o l o n n e n

En prop af glasuld anbringes i den nedre ende af en glaskolonne (43) Der klargoslashres en opslaeligmning paring 50 g af det behandlede kationbyttershyresin (36) med 50 ml saltsyre (35) som haeligldes i glaskolonnen hvorshyefter man lader den faring tid til at saeligtte sig Den overskydende syre lades loslashbe ud indtil den staringr lige over resinoverfladen og kolonnen vaskes med vand indtil vaskevandet er neutralt over for lakmuspapir 50 ml methanol (32) overfoslashres til kolonnen og lades sive ned til resinoverfladen

542 S oslash j l e k r o m a t o g r a f i

Det under (53) opnaringede ekstrakt overfoslashres forsigtigt til kolonnen med pipette Den rundbundede kolbe skylles med to portioner paring 5-10 ml methanol (32) og disse skyllevaeligsker overfoslashres til kolonnen Ekstraktet lades loslashbe ned til resinoverfladen og kolonnen vaskes med 50 ml methanol idet det sikres at gennemstroslashmningshastigheden ikke overshystiger 5 ml pr minut Den udstroslashmmende vaeligske kasseres Methylbenshyzoquatet elueres fra kolonnen under anvendelse af 150 ml methansulshyfonsyreoploslashsning (34) og eluatet fra kolonnen opsamles i en 250 ml konisk kolbe


Det under (542) opnaringede eluat overfoslashres til en 1 liter skilletragt Den koniske kolbe skylles med 5ndash10 ml methanol (32) og skyllevaeligskerne kombineres med indholdet i skilletragten Der tilsaeligttes 300 ml saltsyshyreoploslashsning (35) og 130 ml dichlormethan (31) og omrystes i 1 minut Efter at de to faser har faringet tid til at skilles aftappes det nederste (dichlormethan) lag i en 500 ml rundbundet kolbe Ekstraktionen af den vandige fase gentages med yderligere to portioner dichlormethan paring hver 70 ml og disse ekstrakter kombineres med det foslashrste ekstrakt i den rundbundede kolbe

Dichlormethanekstraktet inddampes til toslashrhed paring rotationsfordamperen (42) ved 40

o C under reduceret tryk Remanensen oploslashses i kolben med ca 5 ml methanol (32) og denne oploslashsning overfoslashres kvantitativt til en 10 ml maringlekolbe Den rundbundede kolbe skylles med yderligere to portioner methanol paring hver 1ndash2 ml som overfoslashres til maringlekolben Der fyldes op til maeligrket med methanol og blandes En alikvot maeligngde filtreres gennem et membranfilter (46) Denne oploslashsning gemmes til HPLC-bestemmelsen (56)

56 HPLC-bestemmelse


Foslashlgende betingelser er vejledende andre betingelser kan benyttes forudsat at de giver tilsvarende resultater

mdash HPLC-kolonne (441)

mdash Mobil fase til HPLC blanding af methanol og vand (33)

mdash Flow 1ndash15 mlminuttet

mdash Detektionsboslashlgelaeligngde 265 nm

mdash Injektionsvolumen 20ndash50 μl

B


Kromatografisystemets stabilitet kontrolleres ved at der flere gange indsproslashjtes kalibreringsoploslashsning (373) med 4 μgml indtil der opnarings konstante tophoslashjder eller -arealer og retentionstider




Proslashveekstraktet (55) indsproslashjtes flere gange idet der benyttes samme maeligngde som til kalibreringsoploslashsningerne og middeltophoslashjden (-areashylet) af methylbenzoquattoppene bestemmes


Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af proslashveoploslashsningens methylbenzoquatshytoppe bestemmes koncentrationen i proslashveoploslashsningen i μgml ved benytshytelse af kalibreringskurven (562)

Proslashvens indhold af methylbenzoquat w (mgkg) beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 c Uuml 40

m

hvor

c = proslashveoploslashsningens methylbenzoquatkoncentration i gml m = testportionens vaeliggt i gram


71 Identitet



Et proslashveekstrakt spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde standardshymellemoploslashsning (372) Den tilsatte maeligngde methylbenzoquat skal svare til den skoslashnnede maeligngde methylbenzoquat i proslashveekstraktet

Kun hoslashjden af methylbenzoquattoppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde og fortyndingen af ekstrakshytet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for ca 10 af den oprindelige bredde




B





72 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ikke overstige 10 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for methylbenzoquatindhold paring 4ndash20 mgkg

73 Genfinding



5 proslashver blev analyseret af 10 laboratorier Der blev foretaget dobbeltshyanalyse af hver proslashve

Blind Mel 1 Piller 1 Mel 2 Piller 2

Middelvaeligrdi [mgkg] IP 450 450 890 870

S r [mgkg] mdash 030 020 060 050

CV r [ ] mdash 670 440 670 570

S R [mgkg] mdash 040 050 090 100

CV R [ ] mdash 890 1110 1010 1150

Genfinding [ ] mdash 9200 9300 9200 8900

IP = Ikke paringvist S r = standardafvigelse for repeterbarhed CV r = variationskoefficient for repeterbarhed S R = standardafvigelse for reproducerbarhed CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed

B BESTEMMELSE AF OLAQUINDOX

2-[N-2-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3-methylquinoxalin-N 1 N

4 -dioxid


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af olaquindox i foder Bestemmelsesgraelignsen er 5 mgkg

2 Princip

Proslashven ekstraheres med en blanding af vand og methanol Indholdet af olaquindox bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV detektor

B


3 Reagenser

31 Methanol




Blanding af vand (33) og methanol (32) 900 + 100 (V + Vv)

35 Standardstof rent olaquindox 2-[N-2-(hydroxyethyl)carbamoyl]-3- methylquinoxalin-N

1 N 4 -dioxid E 851

351 O l a q u i n d o x s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 2 5 0 μ g m l

Med en noslashjagtighed paring 01 mg afvejes 50 mg olaquindox (35) i en 200 ml maringlekolbe og der tilsaeligttes ca 190 ml vand Derefter anbringes kolben i 20 minutter i et ultralydsbad (41) Efter ultralydsbehandlingen bringes oploslashsningen til rumtemperatur hvorefter der fyldes op til maeligrket med vand og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbeshyvares i koslashleskab Fremstilles hver maringned

352 O l a q u i n d o x s t a n d a r d m e l l e m o p l oslash s n i n g 2 5 μ g m l

100 ml af standardstamoploslashsningen (351) overfoslashres til en 100 ml maringlekolbe hvorefter der fyldes op til maeligrket med den mobile fase (34) og blandes Kolben omvikles med aluminiumfolie og opbevares i koslashleskab Fremstilles dagligt


Henholdsvis 10 20 50 100 150 og 200 ml af standardmellemshyoploslashsningen (352) overfoslashres til hver sin 50 ml maringlekolbe Der fyldes op til maeligrket med mobil fase (34) og blandes Kolberne omvikles med aluminiumfolie Disse oploslashsninger svarer til henholdsvis 05 10 25 50 75 og 100 μg olaquindox pr ml

Fremstilles dagligt

4 Apparatur

41 Ultralydsbad





5 Fremgangsmaringde

NB Olaquindox er lysfoslashlsomt Alle procedurer udfoslashres i daeligmpet belysshyning eller under anvendelse af udstyr af brunt glas

51 Generelt

511 Der analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken olaquindox eller interfererende stoffer er til stede

512 Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde olaquindox svarende til

B


den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 50 mgkg overfoslashres 100 ml af standardstamoploslashsningen (351) til en 250 ml konisk kolbe hvorefter oploslashsningen inddampes til ca 05 ml Der tilsaeligttes 50 g af blindproslashven og blandes omhyggeligt og efter henstand i 10 minutter blandes der paring ny flere gange inden der fortsaeligttes med ekstraktion (52)

NB Til denne metode anvendes en blindproslashve af samme type som analyseproslashven og som ved analyse viser sig ikke at indeholde olaquindox

52 Ekstraktion

Med en noslashjagtighed paring 001 g afvejes der ca 50 g af proslashven som overfoslashres til en 1 000 ml konisk kolbe hvorefter der tilsaeligttes 100 ml methanol (31) og kolben anbringes i 5 minutter i ultralydsbad (41) Der tilsaeligttes 410 ml vand og kolben anbringes i ultralydsbad i ydershyligere 15 minutter Derefter fjernes kolben fra ultralydsbadet og rystes i 30 minutter paring rysteapparatet (42) og indholdet filtreres gennem et foldet filter 100 ml af filtratet overfoslashres til en 20 ml maringlekolbe hvorshyefter der fyldes op til maeligrket med vand og blandes En alikvot maeligngde filtreres gennem et membranfilter (44) (se bemaeligrkning punkt 9) Der fortsaeligttes med HPLC-bestemmelse (53)

53 HPLC-bestemmelse



Analysekolonne (431)

Mobil fase (34) Blanding af vand (33) og methanol (32) 900 + 100 (V + V)






Hver kalibreringsoploslashsning (353) indsproslashjtes flere gange og middeltshyophoslashjderne (-arealerne) bestemmes for hver koncentration Der tegnes en kalibreringskurve med kalibreringsoploslashsningernes middeltophoslashjder (-arealer) som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μgml som abscisse


Proslashveekstraktet (52) indsproslashjtes flere gange idet der benyttes samme maeligngde som til kalibreringsoploslashsningerne og middeltophoslashjden (-areashylet) af olaquindoxtoppene bestemmes


Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af olaquindoxtoppene i proslashveoploslashsningen bestemmes koncentrationen i proslashveoploslashsningen i μgml ved benyttelse af kalibreringskurven (532)

Olaquindoxindholdet w i mgkg for proslashven beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 c Uuml 1000

m

B


hvor

c = olaquindoxkoncentrationen i proslashveekstraktet (52) i μgml m = testportionens vaeliggt i gram (52)


71 Identitet

Analyttens identitet kan bekraeligftes ved ko-kromatografi eller ved at benytte en diodearraydetektor hvormed spektrene for proslashveekstraktet (52) og kalibreringsoploslashsningen (353) indeholdende 50 μgml sammenlignes


Et proslashveekstrakt (52) spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde kalibreringsoploslashsning (353) Den tilsatte maeligngde olaquindox skal svare til den maeligngde olaquindox der er fundet i proslashveekstraktet

Kun hoslashjden af olaquindoxtoppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde og fortyndingen af ekstraktet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for plusmn 10 af den oprindelige bredde af olaquindoxtoppen for det ikke-spikede proslashveeksshytrakt







72 Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve maring ikke overstige 15 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for olaquindoxindhold paring 10ndash200 mgkg

73 Genfinding


B



Der er gennemfoslashrt en EF-ringanalyse hvor 4 proslashver af foder til smaringgshyrise herunder en blindproslashve blev analyseret i op til 13 laboratorier Resultaterne er vist herunder

Proslashve 1 Proslashve 2 Proslashve 3 Proslashve 4

L 13 10 11 11 n 40 40 44 44

Middelvaeligrdi [mgkg] mdash 146 480 954 S r [mgkg] mdash 082 205 636

S R [mgkg] mdash 162 428 842 CV r [ ] mdash 56 43 67

CV R [ ] mdash 111 89 88

Nominelt indhold [mgkg] mdash 15 50 100

Genfinding ( ) mdash 973 960 954


9 Bemaeligrkning

Selv om metoden ikke er valideret for foder med et olaquindoxindhold paring over 100 mgkg er det muligt at opnaring tilfredsstillende resultater ved at reducere proslashvemaeligngden ogeller fortynde ekstraktet (52) for at opnaring en koncentration inden for kalibreringskurven (532)

C BESTEMMELSE AF AMPROLIUM

1-[(4-amino-2-propyl-5-pyrimidinyl)methyl]-2-picoliniumchloridhydro- chlorid


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af amprolium i foder og forblandinger Detektionsgraelignsen er 1 mgkg og bestemmelshysesgraelignsen er 5 mgkg

2 Princip

Proslashven ekstraheres med en methanol-vand-blanding Efter fortynding med den mobile fase og membranfiltrering bestemmes indholdet af amprolium ved kationbytter-HPLC med anvendelse af UV-detektor

3 Reagenser

31 Methanol



34 Natriumdihydrogenphosphatoploslashsning c = 01 molliter

1380 g natriumdihydrogenphosphatmonohydrat oploslashses i vand (33) i en 1 000 ml maringlekolbe der fyldes op til maeligrket med vand (33) og blandes

35 Natriumperchloratoploslashsning c =16 molliter

22474 g natriumperchloratmonohydrat oploslashses i vand (33) i en 1 000 ml maringlekolbe der fyldes op til maeligrket med vand (33) og blandes

B


36 Mobil fase til HPLC (se bemaeligrkning 91)

Blanding af acetonitril (32) natriumdihydrogenphosphatoploslashsning (34) og natriumperchloratoploslashsning (35) 450 + 450 + 100 (v + v + v) Foslashr anvendelse filtreres der gennem et 022 μm membranfilter (43) og oploslashsningen afgasses (feks i ultralydsbad (44) i mindst 15 minutter)

37 Standardstof rent amprolium 1-[(4-amino-2-propylpyrimidin-5-yl)metshyhyl]-2-methylpyridiniumchloridhydrochlorid E 750 (se punkt 92)

371 A m p r o l i u m s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 5 0 0 μ g m l

50 mg amprolium (37) afvejes med en noslashjagtighed paring 01 mg i en 100 ml maringlekolbe og oploslashses i 80 ml methanol (31) og kolben anbringes i 10 minutter i ultralydsbad (44) Efter ultralydsbehandlingen bringes oploslashsningen til rumtemperatur hvorefter der fyldes op til maeligrket med vand og blandes Oploslashsningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C

372 A m p r o l i u m s t a n d a r d m e l l e m o p l oslash s n i n g 5 0 μ g m l

50 ml af standardstamoploslashsningen (371) afpipetteres i en 50 ml maringleshykolbe og der fyldes op til maeligrket med ekstraktionsoploslashsningsmidlet (38) og blandes Oploslashsningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C


Henholdsvis 05 10 og 20 ml af standardmellemoploslashsningen (372) overfoslashres til hver sin 50 ml maringlekolbe Der fyldes op til maeligrket med mobil fase (36) og blandes Disse oploslashsninger svarer til henholdsvis 05 10 og 20 μg amprolium pr ml Disse oploslashsninger skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

38 Ekstraktionsoploslashsningsmiddel

Blanding af methanol (31) og vand 2 + 1 (v + v)

4 Apparatur


411 HPLC-kolonne 125 mm x 4 mm kationbytter Nucleosil 10 SA 5 eller 10 μm pakkemateriale eller tilsvarende


42 Membranfilter PTFE- 045 μm


44 Ultralydsbad


5 Fremgangsmaringde

51 Generelt


Til gennemfoslashrelse af genfindingstesten (5l2) analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken amprolium eller interfererende stoffer er til stede Blindproslashven skal vaeligre af samme type som den proslashve der skal undersoslashges og ved analyse maring amprolium eller interfererende stoffer ikke paringvises

B



Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde amprolium svarende til den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 100 mgkg overfoslashres der 100 ml standardstamoploslashsning (371) til en 250 ml konisk kolbe og oploslashsningen inddampes til ca 05 ml Der tilsaeligttes 50 g af blindproslashven og blandes omhyggeligt og efter henstand i 10 minutter blandes der paring ny flere gange inden der fortsaeligttes med ekstrakshytion (52)

Hvis der ikke er en blindproslashve af samme type som analyseproslashven til raringdighed (se punkt 511) kan der alternativt udfoslashres en genfindingstest ved hjaeliglp af standardtilsaeligtningsmetoden I dette tilfaeliglde spikes den proslashve der skal analyseres ved tilsaeligtning af en maeligngde amprolium svarende til den der allerede er til stede i proslashven Denne proslashve analyseres sammen med den ikke-spikede proslashve og genfindingen kan beregnes ved subtraktion

52 Ekstraktion

521 F o r b l a n d i n g e r ( i n d h o l d p aring lt 1 a m p r o l i u m ) o g f o d e r

Med en noslashjagtighed paring 001 g afvejes der 5ndash40 g af proslashven afhaeligngigt af amproliumindholdet i en 500 ml konisk kolbe og der tilsaeligttes 200 ml ekstraktionsoploslashsningsmiddel (38) Kolben anbringes i ultralydsbad (44) og henstaringr i 15 minutter Kolben fjernes fra ultralydsbadet og rystes i 1 time paring rysteapparatet eller omroslashres paring magnetomroslashreren (45) En alikvot maeligngde af ekstraktet fortyndes med den mobile fase (36) til et amproliumindhold paring 05ndash2 μgml og blandes (se bemaeligrkning 93) 5ndash10 ml af denne fortyndede oploslashsning filtreres paring et membranfilter (42) Der fortsaeligttes med HPLC-bestemmelse (53)

522 F o r b l a n d i n g e r ( i n d h o l d p aring ge 1 a m p r o l i u m )

Med en noslashjagtighed paring 0001 g afvejes 1ndash4 g af forblandingen afhaelignshygigt af amproliumindholdet i en 500 ml konisk kolbe og der tilsaeligttes 200 ml ekstraktionsoploslashsningsmiddel (38) Kolben anbringes i ultrashylydsbad (44) og henstaringr i 15 minutter Kolben fjernes fra ultralydsbadet og rystes i 1 time paring rysteapparatet eller omroslashres paring magnetomroslashreren (45) En alikvot maeligngde af ekstraktet fortyndes med den mobile fase (36) til et amproliumindhold paring 05ndash2 μgml og blandes 5ndash10 ml af denne fortyndede oploslashsning filtreres paring et membranfilter (42) Der fortshysaeligttes med HPLC-bestemmelse (53)

53 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (411) 125 mm times 4 mm kationbytter Nucleosil 10 SA 5 eller 10 μm pakkemateriale eller tilsvarende

Mobil fase (36) Blanding af acetonitril (32) natriumdihyshydrogenphosphatoploslashsning (34) og natriumshyperchloratoploslashsning (35) 450 + 450 + 100 (v + v + v)




B






Proslashveekstraktet (52) indsproslashjtes flere gange idet der benyttes samme maeligngde som til kalibreringsoploslashsningerne og middeltophoslashjden (-areashylet) af amproliumtoppene bestemmes


Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af proslashveoploslashsningens amproliumtoppe bestemmes koncentrationen i proslashveoploslashsningen i μgml ved benyttelse af kalibreringskurven (532)

Amproliumindholdet w i mgkg for proslashven er givet ved foslashlgende formel

w frac14 V Uuml c Uuml f

m [mgkg]

hvor

V = volumen ekstraktionsoploslashsningsmiddel (38) i ml ifoslashlge 52 (dvs 200 ml)

c = amproliumkoncentrationen i proslashveekstraktet (52) i μgml f = fortyndingsfaktor ifoslashlge 52 m = testportionens vaeliggt i gram


71 Identitet



Et proslashveekstrakt (52) spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde kalibreringsoploslashsning (373) Den tilsatte maeligngde amprolium skal svare til den maeligngde amprolium der er fundet i proslashveekstraktet

Kun hoslashjden af amproliumtoppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde og fortyndingen af ekstraktet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for plusmn 10 af den oprindelige bredde af amproliumtoppen for det ikke-spikede proslashveeksshytrakt




B





72 Repeterbarhed


mdash 15 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for amproliumindhold paring 25ndash500 mgkg

mdash 75 mgkg for amproliumindhold paring 500ndash1 000 mgkg

mdash 75 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat) for amproliumindhold paring mere end 1 000 mgkg

73 Genfinding



Der er gennemfoslashrt en ringanalyse hvor 3 kyllingefoderstoffer (proslashve 1ndash3) 1 mineralfoder (proslashve 4) og 1 forblanding (proslashve 5) blev analyseshyret Resultaterne er vist i nedenstaringende tabel

Proslashve 1 (blindproslashve) Proslashve 2 Proslashve 3 Proslashve 4 Proslashve 5

L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60

Middelvaeligrdi [mgkg] mdash 455 188 5 129 25 140

S r [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [ ] mdash 495 190 346 220

S R [mgkg] mdash 295 118 266 760

CV R [ ] mdash 647 627 519 300

Nominelt indhold [mgkg] mdash 50 200 5 000 25 000

L = antal laboratorier n = antal enkeltvaeligrdier S r = standardafvigelse for repeterbarhed CV r = variationskoefficient for repeterbarhed S R = standardafvigelse for reproducerbarhed CV R = variationskoefficient for reproducerbarhed

B


9 Bemaeligrkninger

91 Hvis proslashven indeholder thiamin forekommer thiamintoppen i kromatoshygrammet kort foslashr amproliumtoppen Ved at foslashlge denne metode skal amprolium og thiamin adskilles Hvis amprolium og thiamin ikke adskilles med den kolonne (411) der anvendes i denne metode erstattes op til 50 af acetonitrildelen af den mobile fase (36) med methanol

92 Ifoslashlge British Pharmacopoeia viser spektret for en amproliumoploslashsning (c = 002 molliter) i saltsyre (c = 01 molliter) maksima ved 246 nm og 262 nm Absorbansen skal vaeligre 084 ved 246 nm og 080 ved 262 nm

93 Ekstraktet skal altid fortyndes med den mobile fase da retentionstiden for amproliumtoppen ellers kan forskydes vaeligsentligt paring grund af aeligndringer i ionstyrken

D BESTEMMELSE AF CARBADOX

Methyl-3-(2-quinoxalinylmethylen)carbazat-N 1 N

4 -dioxid


Denne metode goslashr det muligt at bestemme indholdet af carbadox i foder forblandinger og tilberedninger Detektionsgraelignsen er 1 mgkg og bestemmelsesgraelignsen er 5 mgkg

2 Princip

Proslashven bringes i ligevaeliggt med vand og ekstraheres med methanol-acetonitril For foders vedkommende oprenses en alikvot maeligngde af det filtrerede ekstrakt paring en aluminiumoxidkolonne For forblandingers og tilberedningers vedkommende fortyndes en alikvot maeligngde af det filtrerede ekstrakt til en passende koncentration med vand methanol og acetonitril Indholdet af carbadox bestemmes ved omvendt fase-HPLC med anvendelse af UV-detektor

3 Reagenser

31 Methanol


33 Eddikesyre w = 100

34 Aluminiumoxid neutral aktivitetskvalitet I

35 Methanol-acetonitril 1 + 1 (v + v)

500 ml methanol (31) blandes med 500 ml acetonitril (32)

36 Eddikesyre σ = 10

10 ml eddikesyre (33) fortyndes til 100 ml med vand

37 Natriumacetat


39 Acetatbufferoploslashsning c = 001 molliter pH = 60

082 g natriumacetat (37) oploslashses i 700 ml vand (38) og pH justeres til 60 med eddikesyre (36) Oploslashsningen overfoslashres til en 1 000 ml maringleshykolbe og der fyldes op til maeligrket med vand (38) og blandes


825 ml acetatbufferoploslashsning (39) blandes med 175 ml acetonitril (32)


B


311 Standardstof

Rent carbadox Methyl-3-(2-quinoxalinylmethylen)carbazat-N 1 N

4 - dioxid E 850

3111 C a r b a d o x s t a n d a r d s t a m o p l oslash s n i n g 1 0 0 μ g m l ( s e b e m aelig r k n i n g u n d e r p u n k t 5 raquo F r e m g a n g s m aring d e laquo )

25 mg carbadoxstandardstof (311) afvejes med en noslashjagtighed paring 01 mg i en 250 ml maringlekolbe og oploslashses i methanol-acetonitril (35) ved ultralydsbehandling (47) Efter ultralydsbehandlingen bringes oploslashsshyningen til rumtemperatur hvorefter der fyldes op til maeligrket med methanol-acetonitril (35) og blandes Kolben omvikles med aluminiumfshyolie eller der anvendes brunt glasudstyr og oploslashsningen opbevares i koslashleskab Oploslashsningen er stabil i en maringned ved en temperatur paring le 4

o C


Henholdsvis 20 50 100 og 200 ml af standardstamoploslashsningen (3111) overfoslashres til hver sin 100 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 30 ml vand fyldes op til maeligrket med methanol-acetonitril (35) og blandes Kolberne omvikles med aluminiumfolie Disse oploslashsninger svarer til henholdsvis 20 50 100 og 200 μgml carbadox

Kalibreringsoploslashsninger skal fremstilles umiddelbart foslashr brugen

NB Til bestemmelse af carbadox i foder som indeholder mindre end 10 mgkg skal der fremstilles kalibreringsoploslashsninger med en koncenshytration paring under 20 μgml

312 Blanding af vand og methanol-acetonitril (35) 300 + 700 (v + v)

300 ml vand blandes med 700 ml af methanol-acetonitril-blandingen (35)

4 Apparatur



43 Glaskolonne (laeligngde 300ndash400 mm indvendig diameter ca 10 mm) med sintret glasfritte og aftapningsventil

NB Der kan ogsaring anvendes en glaskolonne med stophane eller en glasshykolonne med en tilspidset ende i dette tilfaeliglde anbringes en lille prop af glasuld i den nedre ende og skubbes helt ned med en glasstav



442 UV-detektor med variabel boslashlgelaeligngde eller diodearraydetektor som arbejder i omraringdet fra 225 til 400 nm



47 Ultralydsbad

B


5 Fremgangsmaringde

NB Carbadox er lysfoslashlsomt Alle procedurer udfoslashres i daeligmpet belysshyning eller under anvendelse af brunt glasudstyr eller glasudstyr omviklet med aluminiumfolie

51 Generelt


Til gennemfoslashrelse af genfindingstesten (512) analyseres en blindproslashve for at kontrollere at hverken carbadox eller interfererende stoffer er til stede Blindproslashven skal vaeligre af samme type som den proslashve der skal undersoslashges og ved analyse maring carbadox eller interfererende stoffer ikke paringvises


Der udfoslashres en genfindingstest ved at analysere blindproslashven (511) som er blevet spiket ved tilsaeligtning af en maeligngde carbadox svarende til den der er til stede i proslashven For at naring op paring et niveau paring 50 mgkg overfoslashres 50 ml af standardstamoploslashsningen (3111) til en 200 ml konisk kolbe Oploslashsningen inddampes til ca 05 ml i en nitrogenstroslashm Der tilsaeligttes 10 g af blindproslashven blandes og ventes i 10 minutter inden der fortshysaeligttes med ekstraktion (52)

Hvis der ikke er en blindproslashve af samme type som analyseproslashven til raringdighed (se punkt 511) kan der alternativt udfoslashres en genfindingstest ved hjaeliglp af standardtilsaeligtningsmetoden I dette tilfaeliglde spikes proslashven ved tilsaeligtning af en maeligngde carbadox svarende til den der allerede er til stede i proslashven Denne proslashve analyseres sammen med den ikke-spikede proslashve og genfindingen kan beregnes ved subtraktion

52 Ekstraktion

521 F o d e r

Med en noslashjagtighed paring 001 g afvejes 10 g af proslashven som overfoslashres til en 200 ml konisk kolbe Der tilsaeligttes 150 ml vand og blandes og blandingen henstaringr i 5 minutter for at komme i ligevaeliggt Der tilsaeligttes 350 ml methanol-acetonitril (35) tilproppes og omrystes i 30 minutter paring rysteapparatet eller omroslashres paring magnetomroslashreren (41) Oploslashsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (42) Denne oploslashsning anvendes til oprensningsprocessen (53)

522 F o r b l a n d i n g e r ( 0 1 ndash 2 0 )

Med en noslashjagtighed paring 0001 g afvejes 1 g af den ikke-formalede proslashve som overfoslashres til en 200 ml konisk kolbe Der tilsaeligttes 150 ml vand og blandes og blandingen henstaringr i 5 minutter for at komme i ligevaeliggt Der tilsaeligttes 350 ml methanol-acetonitril (35) tilproppes og omrystes i 30 minutter paring rysteapparatet eller omroslashres paring magnetomroslashreren (41) Oploslashsningen filtreres gennem et glasfiberfiltrerpapir (42)

En alikvot maeligngde af filtratet afpipetteres i en 50 ml maringlekolbe Der tilsaeligttes 150 ml vand fyldes op til maeligrket med methanol-acetonitril (35) og blandes Carbadoxkoncentrationen i den endelige oploslashsning skal vaeligre cirka 10 μgml En alikvot maeligngde filtreres gennem et 045 μm filter (46)

Der fortsaeligttes med HPLC-bestemmelse (54)

523 T i l b e r e d n i n g e r ( gt 2 )

Med en noslashjagtighed paring 0001 g afvejes 02 g af den ikke-formalede proslashve som overfoslashres til en 250 ml konisk kolbe Der tilsaeligttes 450 ml vand og

B


blandes og blandingen henstaringr i 5 minutter for at komme i ligevaeliggt Der tilsaeligttes 1050 ml methanol-acetonitril (35) tilproppes og homogeniseres Proslashven lydbehandles (47) i 15 minutter efterfulgt af omrystning eller omroslashring i 15 minutter (41) Oploslashsningen filtreres gennem et glasfiberfilshytrerpapir (42)

En alikvot maeligngde af filtratet fortyndes med blandingen af vand og methanol-acetonitril (312) til en endelig carbadoxkoncentration paring 10- 15 μgml (for en 10 tilberedning er fortyndingsfaktoren 10) En alikvot maeligngde filtreres gennem et 045 μm filter (46)


53 Oprensning


Der afvejes 4 g aluminiumoxid (34) som overfoslashres til glaskolonnen (43)


Der saeligttes 15 ml af den filtrerede ekstrakt (521) paring aluminiumoxidsoslashjshylen og de foslashrste 2 ml eluat kasseres De naeligste 5 ml opsamles og en alikvot maeligngde filtreres gennem et 045 μm filter (46)


54 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (411) 300 mm times 4 mm C 18 10 μmpakkemate- riale eller tilsvarende

Mobil fase (310) Blanding af acetatbufferoploslashsning (39) og acetonitril (32) 825 + 175 (v + v)






Hver kalibreringsoploslashsning (3112) indsproslashjtes flere gange og tophoslashjshyderne (-arealerne) bestemmes for hver koncentration Der tegnes en kalishybreringskurve med kalibreringsoploslashsningernes middeltophoslashjder eller -arealer som ordinat og de tilsvarende koncentrationer i μgml som abscisse


Proslashveekstraktet ((532) for foder (522) for forblandinger og (523) for tilberedninger) indsproslashjtes flere gange og middeltophoslashjden (-arealet) for carbadoxtoppene bestemmes

B



Ud fra middelhoslashjden (-arealet) af proslashveoploslashsningens carbadoxtoppe bestemmes carbadoxkoncentrationen i proslashveoploslashsningen i μgml ved benyttelse af kalibreringskurven (542)

61 Foder

Indholdet af carbadox w (mgkg) i proslashven beregnes efter foslashlgende formel

w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor

c = carbadoxkoncentrationen i proslashveekstraktet (532) i μgml V 1 = ekstraktionsvolumen i ml (dvs 50) m = testportionens vaeliggt i gram

62 Forblandinger og tilberedninger



m [mgkg]

hvor

c = carbadoxkoncentrationen i proslashveekstraktet (522 eller 523) i μgml

V 2 = ekstraktionsvolumen i ml (dvs 50 for forblandinger 150 for tilberedninger)

f = fortyndingsfaktor ifoslashlge 522 (forblandinger) eller 523 (tilberedshyninger)

m = testportionens vaeliggt i gram


71 Identitet



Et proslashveekstrakt spikes ved tilsaeligtning af en passende maeligngde kalibreshyringsoploslashsning (3112) Den tilsatte maeligngde carbadox skal svare til den skoslashnnede maeligngde carbadox der er fundet i proslashveekstraktet

Kun hoslashjden af carbadoxtoppen maring vaeligre blevet oslashget efter at der er taget hensyn til baringde den tilsatte maeligngde og fortyndingen af ekstraktet Toppens bredde skal i den halve hoslashjde ligge inden for ca 10 af den oprindelige bredde




B



c) Mellem 225 og 400 nm maring spektrene ved toppens forside spids og bagside frembragt med proslashveekstraktet ikke vaeligre forskellige fra hinanden i de dele af spektret der ligger inden for 10-100 relativ absorbans Dette kriterium er opfyldt naringr de samme maksima er til stede og afvigelsen mellem spektrene i intet obsershyveret punkt overstiger 15 af spektrets absorbans i spidsen


72 Repeterbarhed

For indhold paring 10 mgkg og derover maring forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser udfoslashrt paring samme proslashve ikke overstige 15 i relativ vaeligrdi (af det hoslashjeste resultat)

73 Genfinding



Der er gennemfoslashrt en ringanalyse hvor 6 foderstoffer 4 forblandinger og 3 tilberedninger blev analyseret af 8 laboratorier Der blev foretaget dobbeltanalyse af hver proslashve (Journal of the AOAC bind 71 1988 s 484ndash490 indeholder naeligrmere oplysninger om denne ringanalyse) Resultaterne (ekskl outliers) er vist nedenfor

Skema 1

Resultater fra ringanalysen af foder

Proslashve 1 Proslashve 2 Proslashve 3 Proslashve 4 Proslashve 5 Proslashve 6

L 8 8 8 8 8 8 n 15 14 15 15 15 15

Middelvaeligrdi (mgkg) 500 476 482 497 469 497 Sr (mgkg) 290 269 138 155 152 212

CVr ( ) 58 56 29 31 32 43 SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244 CVR ( ) 78 87 46 52 48 49

Nominelt indhold (mgkg) 500 500 500 500 500 500

Skema 2

Resultater fra ringanalysen af forblandinger og tilberedninger

Forblandinger Tilberedninger

A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8 n 14 14 14 14 16 16 16

Middelvaeligrdi (gkg) 889 929 921 876 946 981 104 Sr (gkg) 037 028 028 044 41 51 77

CVr ( ) 42 30 30 50 43 52 74 SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

B



A B C D A B C

CVR ( ) 42 30 43 63 57 65 74

Nominelt indhold (gkg)

100 100 100 100 100 100 100

L = antal laboratorier n = antal enkeltvaeligrdier Sr = standardafvigelse for repeterbarhed CVr = variationskoefficient for repeterbarhed SR = standardafvigelse for reproducerbarhed CVR = variationskoefficient for reproducerbarhed

B


BILAG IX

SAMMENLIGNINGSTABELLER JF ARTIKEL 6

1 Direktiv 71250EOslashF

Direktiv 71250EOslashF Denne forordning

Artikel 1 stk 1 Artikel 3 Artikel 1 stk 2 Artikel 2 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Bilaget del 1 Bilag II Bilaget del 2 mdash Bilaget del 3 mdash Bilaget del 4 Bilag III del O Bilaget del 5 Bilag III del M Bilaget del 6 Bilag III del N Bilaget del 7 Bilag III del Q Bilaget del 9 Bilag III del K Bilaget del 10 mdash Bilaget del 11 mdash Bilaget del 12 Bilag III del J Bilaget del 14 Bilag III del D Bilaget del 16 mdash



Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Bilaget del I Bilag III del A Bilaget del II Bilag III del E Bilaget del III Bilag III del P Bilaget del IV Bilag III del H



Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Artikel 4 mdash Bilag I del 1 Bilag III del L Bilag I del 2 Bilag III del C Bilag I del 3 mdash Bilag I del 4 mdash Bilag I del 5 Bilag V del A Bilag II mdash



Artikel 1 Artikel 3 Artikel 3 mdash Artikel 4 mdash Bilag I del 1 Bilag III del B Bilag I del 2 mdash Bilag I del 3 Bilag III del I

B




Artikel 1 Artikel 1 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Bilaget Bilag I



Artikel 1 mdash Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Bilaget mdash



Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Bilaget del 1 mdash Bilaget del 2 mdash Bilaget del 3 Bilag IV del C









Artikel 1 Artikel 4 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Bilaget Bilag VII



Artikel 1 Artikel 3

Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Bilaget Bilag IV del D

B


12 Direktiv 93117EF

Direktiv 93117EF Denne forordning

Artikel 1 Artikel 3 og 5 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash

Bilaget del 1 Bilag IV del E Bilaget del 2 Bilag VIII del A

13 Direktiv 9864EF


Artikel 1 Artikel 3 og 5 Artikel 2 mdash

Artikel 3 mdash Artikel 4 mdash

Bilaget del A Bilag III del F Bilaget del C Bilag VIII del B

14 Direktiv 199927EF


Artikel 1 Artikel 3 og 5




Bilaget del A Bilag VIII del C Bilaget del B Bilag IV del F

Bilaget del C Bilag VIII del D



Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 mdash


Bilaget Bilag IV del G



Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Artikel 4 mdash Bilaget del A Bilag IV del A Bilaget del B Bilag IV del B Bilaget del C Bilag III del G

B




Artikel 1 Artikel 1 Artikel 2 Artikel 2 og 3 Artikel 3 mdash Artikel 4 mdash Artikel 5 mdash Bilag I Bilag I og bilag V del B afsnit I Bilag II Bilag II og bilag V del B afsnit II



Artikel 1 Artikel 3 Artikel 2 mdash Artikel 3 mdash Artikel 4 mdash Artikel 5 mdash Artikel 6 mdash Bilaget Bilag VI

B


KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR1522009

af 27 januar 2009



M3

Artikel 1

Udtagning af proslashver som led i den offentlige kontrol af foder navnlig for saring vidt angaringr bestemmelse af bestanddele herunder materiale der indeholder eller bestaringr af eller er fremstillet af genetisk modificerede organismer fodertilsaeligtningsstoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 18312003 ( 1 ) uoslashnskede stoffer som defineret i Europa-Parlamentets og Raringdets direktiv 200232EF ( 2 ) foreshytages efter de metoder der er anfoslashrt i bilag I

Den proslashveudtagningsmetode der er anfoslashrt i bilag I finder anvendelse paring kontrol af foder for saring vidt angaringr bestemmelse af pesticidrester som defineret i Europa-Parlamentets og Raringdets forordning (EF) nr 3962005 ( 3 ) og kontrol af overensstemmelse med forordning (EU) nr 6192011

B

Artikel 2

Klargoslashring af proslashver til analyse og angivelse af resultater foretages efter de metoder der er beskrevet i bilag II

Artikel 3

Analyser som led i den offentlige kontrol af foder foretages efter de metoder der er beskrevet i bilag III (Analysemetoder til kontrol af sammensaeligtningen af fodermidler og foderblandinger) bilag IV (Anashylysemetoder til kontrol af indholdet af godkendte tilsaeligtningsstoffer i foder) bilag V (Analysemetoder til kontrol for uoslashnskede stoffer i foder) og bilag VI (Analysemetoder til bestemmelse af animalske bestanddele som led i den offentlige kontrol af foder)

Artikel 4

Naeligringsvaeligrdien af foderblandinger til fjerkraelig beregnes som angivet i bilag VII

Artikel 5

De i bilag VIII beskrevne analysemetoder til kontrol for ulovlig foreshykomst af fodertilsaeligtningsstoffer der ikke laeligngere er tilladt anvendes til verifikationsformaringl

B


( 1 ) EUT L 268 af 18102003 s 29 ( 2 ) EFT L 140 af 3052002 s 10 ( 3 ) EUT L 70 af 1632005 s 1

Artikel 6



Artikel 7




B


BILAG I







2 DEFINITIONER









M3







4 APPARATUR










423 Proslashvedeler


M3











le 25 tons 7



M3























le 5 tons 5




M3









ge 80 tons 100








M3





4 liter










Slutproslashver







M3














M3















M3





91 Generelt















M3

















M3












M3


BILAG II



1 Formaringl



2 Forholdsregler






3 Fremgangsmaringde







M3
















M3















M3


( 1 ) EUT L 229 af 192009 s 1







M3


BILAG III






2 Princip


3 Apparatur




2





4 Fremgangsmaringde


B




41 Klargoslashring







42 Toslashrring















B





43 Fortoslashrring





432 K o r n








hvor






Icirc

hvor


B


53 Repeterbarhed


6 Bemaeligrkning





2 Princip


3 Apparatur





35 Analysevaeliggt

4 Fremgangsmaringde








B


hvor



Repeterbarhed





2 Princip



3 Reagenser

31 Kaliumsulfat


33 Granuleret zink














B









4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde

51 Destruktion




52 Destillation




B







53 Titrering




532 B o r s y r e






B





54 Blindproslashve







hvor







hvor





B


hvor



71 Repeterbarhed





72 Noslashjagtighed


8 Bemaeligrkninger








B


2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur



43 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde




o C (+- 4







7 Bemaeligrkninger


B








2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur




5 Fremgangsmaringde



o C



B





Repeterbarhed




7 Bemaeligrkning


B





2 Princip


3 Reagenser


32 Magnesiumoxid





4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde







Repeterbarhed





B




2 Princip

21 Frie aminosyrer






3 Reagenser




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin



B



315 1-Octanol

316 Aminosyrer


3162 Cysteinsyre






















o C

B

















4 Apparatur




o C



46 Centrifuge



B





o C

5 Fremgangsmaringde










o C





B























B













o C







o C

54 Kromatografi



B
















B





10 ml Uuml V 10








694 n = 15

301 n = 17

327 n = 17

955 n = 13


931 n = 16

392 n = 18

508 n = 18

1393 n = 16


2232 n = 16

506 n = 17

1201 n = 17

4774 n = 15


mdash 9021 n = 16

9803 n = 16


71 Repeterbarhed






013 n = 15

010 n = 17

011 n = 17

026 n = 13


020 n = 16

011 n = 18

016 n = 18

028 n = 16


048 n = 16

013 n = 17

027 n = 17

099 n = 15


mdash 219 n = 16

206 n = 16


B






19 n = 15

33 n = 17

34 n = 17

28 n = 13


21 n = 16

28 n = 18

31 n = 18

21 n = 16


27 n = 16

26 n = 17

22 n = 17

24 n = 15


mdash 24 n = 16

21 n = 16


72 Reproducerbarhed






028 n = 15

030 n = 17

023 n = 17

030 n = 13


048 n = 16

034 n = 18

055 n = 18

075 n = 16


085 n = 16

062 n = 17

157 n = 17

124 n = 15


mdash 620 n = 16

662 n = 16






41 n = 15

99 n = 17

70 n = 17

32 n = 13


52 n = 16

88 n = 18

109 n = 18

54 n = 16


38 n = 16

123 n = 17

130 n = 17

30 n = 15


mdash 69 n = 16

67 n = 16


B




9 Bemaeligrkninger









2 Princip





3 Reagenser





35 Natriumhydroxid





B





















318 Eddikesyre





4 Apparatur



43 pH-meter


B





48 Vortex-blander

5 Fremgangsmaringde











o C i 20 timer




B





54 HPLC-bestemmelse





Flow 1 mlminuttet














7 Repeterbarhed


B








svin

L 12 12 12

n 50 55 50


242 340 422

s r [gkg] 005 005 008

r [gkg] 014 014 022

CV r [] 19 16 19

S R [gkg] 015 020 009

R [gkg] 042 056 025

CV R [] 63 60 22





hvede



(0457 gkg)

L 12 12

n 55 60


s r [gkg] 0005 0012

r [gkg] 0014 0034

CV r [] 134 134

S R [gkg] 0018 0048

R [gkg] 0050 0134

CV R [] 471 511



B




blanding (CRM 117)




(CRM 119)



L 7 7 7 7

n 25 30 30 30


2064 8801 6882 5236

S r [gkg] 0021 0101 0089 0040

r [gkg] 0059 0283 0249 0112

CV r [] 104 115 130 076

S R [gkg] 0031 0413 0283 0221

R [gkg] 0087 1156 0792 0619

CV R [] 148 469 411 422



9 Bemaeligrkninger









Flow 12 mlminuttet



B




93 Bariumhydroxid












2 Princip

21 Metode A


22 Metode B


B


3 Reagenser






4 Apparatur





o C plusmn 3 o C

5 Fremgangsmaringde





52 Metode B





B






7 Repeterbarhed





8 Bemaeligrkninger





(10m 1 + m 2 ) times 5

hvor







B






2 Princip



3 Reagenser




timer (86)

34 Acetone




4 Apparatur









5 Fremgangsmaringde


B















hvor


7 Repeterbarhed




8 Bemaeligrkninger


B












2 Princip


3 Reagenser








B















4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde







B














8 Bemaeligrkninger


B







Eksempel





4 Uuml 166 10 frac14 664



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B





2 Princip


3 Reagenser














4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde




o C


B









7 Bemaeligrkning




Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B






2 Princip




3 Reagenser







4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde





B


( 1 ) EFT L 125 af 2351996 s 35


o C






o C






D




+1859 o risstivelse




+1815 o bygstivelse



blandinger






B






63 Repeterbarhed


7 Bemaeligrkninger






mdash citruskvas





mdash kartoffelkvas



mdash grever




B


2 Princip


3 Reagenser


4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde










7 Bemaeligrkninger




B







2 Princip



3 Reagenser




4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde







B






7 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser


32 Calciumcarbonat


4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde









B





hvor


7 Bemaeligrkninger



B



FOTOMETRISK METODE



2 Princip


3 Reagenser

31 Calciumcarbonat









4 Apparatur





45 Spektrofotometer


5 Fremgangsmaringde





B















Repeterbarhed




B





2 Princip


3 Reagenser





35 Diethylether

36 Acetone




4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde










B




52 Titrering





m

hvor



7 Bemaeligrkninger




B


BILAG IV






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol




6 IUg



6 IUg

B




4 Apparatur

















5 Fremgangsmaringde




B


52 Forsaeligbning


53 Ekstraktion











B



55 HPLC-bestemmelse









56 Kalibrering







B




















B




V 1 Uuml m [UIkg]

hvor


7 Bemaeligrkninger













8 Repeterbarhed


B





smaringgrise

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49


1702 times 10 6 121 times 10

6 537 100 151 800 18 070


6 22 080 12 280 682


6 61 824 34 384 1 910

CVr [ ] 30 35 41 81 38


6 46 300 23 060 3 614


6 129 640 64 568 10 119

CVR [ ] 80 62 86 15 20


B



B






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Apparatur


B

















5 Fremgangsmaringde




52 Forsaeligbning


B


53 Ekstraktion











55 HPLC-bestemmelse


B





















B
















V 1 Uuml m [mgkg]

hvor



7 Bemaeligrkninger




B








8 Repeterbarhed





smaringgrise

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48


17 380 1 187 926 315 613

s r [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

sR mgkg] 830 650 555 189 78

S R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127


B



B









2 Princip


3 Reagenser

Indledning















B









4 Apparatur










B








Bemaeligrkninger










B


Jern

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kobber

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

B


Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfoder




7 Repeterbarhed






8 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat

35 Iseddike

B









38 Methanol

39 Soslashlvnitrat

310 Natriumascorbat

311 Natriumcarbonat

312 Natriumchlorid
















B


4 Apparatur

41 Ultralydsbad


43 Centrifuge







5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion




B




o C

53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (441)








B







w frac14 c Uuml 10

m

hvor



71 Identitet










B



72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Resultater


ved modtagelse


ved modtagelse

efter 2 maringneder

ved modtagelse

efter 2 maringneder


S R [mgkg] mdash 045 043 040 042

CV R [ ] mdash 16 18 14 17

Genf [ ] 86 74 88 75






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol

32 Sur methanol


B


( 1 ) The Analyst 108 1983 s 1252-1256


34 Molekylsi















39 Standardstof









B


4 Apparatur

41 Glaskolonne









5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion


53 Oprensning



B





54 HPLC-bestemmelse










w frac14 c Uuml 200

m

hvor


B



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding




B


Fjerkraelig Kaniner



S R [mgkg] 436 336 461 391 CV R [] 161 120 106 97

Genfinding [] 900 933 872 802






2 Princip


3 Reagenser


32 Ammoniumacetat









o C

B




o C




o C



o C




o C




sorbentmasse 100 mg








B


4 Apparatur







45 Vakuummanifold

46 Ultralydsbad

5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r





B




53 HPLC-bestemmelse

















61 Foder



Uuml c dc Uuml 10 V

m [mgkg]

B


hvor




62 Forblandinger




m [mgkg]

hvor





71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding




Proslashve 1 A 100

Proslashve 2 O 100

Proslashve 3 L1

Proslashve 4 Z1

Proslashve 5 K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12


S r (mgkg) 588 764 015 002 003

CV r ( ) 583 738 1732 192 334

S R (mgkg) 759 764 017 011 012

CV R ( ) 753 738 1861 967 1365



B




9 Bemaeligrkninger






2 Princip


3 Reagenser










38 Sur methanol







B







4 Apparatur






5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r


B







53 HPLC-bestemmelse





Flow 12 mlminuttet


Excitation 310 nm

Emission 419 nm









B


61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor


62 Forblandinger



m [mgkg]

hvor




71 Identitet




72 Repeterbarhed





73 Genfinding


B





ding (kylshylinger)





foder



L 12 12 12 12 12 12 12 n 23 23 23 23 23 23 23


5 050 16 200 765 784 929 483 326

S r [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CV r [ ] 212 252 224 284 244 400 537 S R [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CV R [ ] 566 545 503 934 569 718 1070


5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()



B


() Analyst 1995 120 s 2175ndash2180

BILAG V





2 Princip


3 Reagenser








4 Apparatur


B


42 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde













B















hvor






B









63 Repeterbarhed





B



KAPITEL I








(raquoPCDFerlaquo)


2378-TCDD 1


123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003


2378-TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



M6









M6
















M6







KAPITEL II


i foder








M6







2 Baggrund






M6














M6













ndash 9 g)






M6











56 Analysekriterier


M6





lt 5




lt 25 lt 15












M6
















M6



















M6












M6














M6













M6








hvor








Q xx frac14 X m




hvor


M6






Figur 1





M6














M6

















M6








KAPITEL III












M6













6 Kvalitetskontrol












M6













le 15 le 20


le 20 le 20


standarder







M6



BILAG VI


FODER







2 METODER

21 Lysmikroskopi

211 Princip



2121 Reagenser







M2













21216 Blegemiddel


2122 Udstyr





Skilletragt

M2









2132 Forholdsregler








M2



















M2















M2


Diagram 1


M2


Diagram 2


M2















M2










22 PCR

221 Princip




2221 Reagenser




M2




222122 Mastermix







2222 Udstyr















224 Dna-ekstraktion





M2




















M2


BILAG VII














B


BILAG VIII


TILLADT

Vigtigt







2 Princip


3 Reagenser

31 Dichlormethan












B








4 Apparatur








5 Fremgangsmaringde

51 Generelt




52 Ekstraktion




B













56 HPLC-bestemmelse








B










w frac14 c Uuml 40

m

hvor



71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding






S r [mgkg] mdash 030 020 060 050

CV r [ ] mdash 670 440 670 570

S R [mgkg] mdash 040 050 090 100

CV R [ ] mdash 890 1110 1010 1150





4 -dioxid



2 Princip


B


3 Reagenser

31 Methanol






1 N 4 -dioxid E 851







Fremstilles dagligt

4 Apparatur

41 Ultralydsbad





5 Fremgangsmaringde


51 Generelt



B




52 Ekstraktion


53 HPLC-bestemmelse

















m

B


hvor



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding


B





L 13 10 11 11 n 40 40 44 44



CV R [ ] mdash 111 89 88




9 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol







B







o C



o C





4 Apparatur






44 Ultralydsbad


5 Fremgangsmaringde

51 Generelt



B





52 Ekstraktion





53 HPLC-bestemmelse








B











m [mgkg]

hvor




71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding





L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


S r [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [ ] mdash 495 190 346 220

S R [mgkg] mdash 295 118 266 760

CV R [ ] mdash 647 627 519 300



B


9 Bemaeligrkninger






4 -dioxid



2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol








37 Natriumacetat







B


311 Standardstof


4 - dioxid E 850



o C







4 Apparatur










47 Ultralydsbad

B


5 Fremgangsmaringde


51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r








B





53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse













B




61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor





m [mgkg]

hvor






71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Skema 1



L 8 8 8 8 8 8 n 15 14 15 15 15 15


CVr ( ) 58 56 29 31 32 43 SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244 CVR ( ) 78 87 46 52 48 49


Skema 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8 n 14 14 14 14 16 16 16


CVr ( ) 42 30 30 50 43 52 74 SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

B



A B C D A B C

CVR ( ) 42 30 43 63 57 65 74


100 100 100 100 100 100 100


B


BILAG IX














B






















Artikel 1 Artikel 3


B


12 Direktiv 93117EF




13 Direktiv 9864EF





















B








B


Artikel 6



Artikel 7




B


BILAG I







2 DEFINITIONER









M3







4 APPARATUR










423 Proslashvedeler


M3











le 25 tons 7



M3























le 5 tons 5




M3









ge 80 tons 100








M3





4 liter










Slutproslashver







M3














M3















M3





91 Generelt















M3

















M3












M3


BILAG II



1 Formaringl



2 Forholdsregler






3 Fremgangsmaringde







M3
















M3















M3


( 1 ) EUT L 229 af 192009 s 1







M3


BILAG III






2 Princip


3 Apparatur




2





4 Fremgangsmaringde


B




41 Klargoslashring







42 Toslashrring















B





43 Fortoslashrring





432 K o r n








hvor






Icirc

hvor


B


53 Repeterbarhed


6 Bemaeligrkning





2 Princip


3 Apparatur





35 Analysevaeliggt

4 Fremgangsmaringde








B


hvor



Repeterbarhed





2 Princip



3 Reagenser

31 Kaliumsulfat


33 Granuleret zink














B









4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde

51 Destruktion




52 Destillation




B







53 Titrering




532 B o r s y r e






B





54 Blindproslashve







hvor







hvor





B


hvor



71 Repeterbarhed





72 Noslashjagtighed


8 Bemaeligrkninger








B


2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur



43 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde




o C (+- 4







7 Bemaeligrkninger


B








2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur




5 Fremgangsmaringde



o C



B





Repeterbarhed




7 Bemaeligrkning


B





2 Princip


3 Reagenser


32 Magnesiumoxid





4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde







Repeterbarhed





B




2 Princip

21 Frie aminosyrer






3 Reagenser




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin



B



315 1-Octanol

316 Aminosyrer


3162 Cysteinsyre






















o C

B

















4 Apparatur




o C



46 Centrifuge



B





o C

5 Fremgangsmaringde










o C





B























B













o C







o C

54 Kromatografi



B
















B





10 ml Uuml V 10








694 n = 15

301 n = 17

327 n = 17

955 n = 13


931 n = 16

392 n = 18

508 n = 18

1393 n = 16


2232 n = 16

506 n = 17

1201 n = 17

4774 n = 15


mdash 9021 n = 16

9803 n = 16


71 Repeterbarhed






013 n = 15

010 n = 17

011 n = 17

026 n = 13


020 n = 16

011 n = 18

016 n = 18

028 n = 16


048 n = 16

013 n = 17

027 n = 17

099 n = 15


mdash 219 n = 16

206 n = 16


B






19 n = 15

33 n = 17

34 n = 17

28 n = 13


21 n = 16

28 n = 18

31 n = 18

21 n = 16


27 n = 16

26 n = 17

22 n = 17

24 n = 15


mdash 24 n = 16

21 n = 16


72 Reproducerbarhed






028 n = 15

030 n = 17

023 n = 17

030 n = 13


048 n = 16

034 n = 18

055 n = 18

075 n = 16


085 n = 16

062 n = 17

157 n = 17

124 n = 15


mdash 620 n = 16

662 n = 16






41 n = 15

99 n = 17

70 n = 17

32 n = 13


52 n = 16

88 n = 18

109 n = 18

54 n = 16


38 n = 16

123 n = 17

130 n = 17

30 n = 15


mdash 69 n = 16

67 n = 16


B




9 Bemaeligrkninger









2 Princip





3 Reagenser





35 Natriumhydroxid





B





















318 Eddikesyre





4 Apparatur



43 pH-meter


B





48 Vortex-blander

5 Fremgangsmaringde











o C i 20 timer




B





54 HPLC-bestemmelse





Flow 1 mlminuttet














7 Repeterbarhed


B








svin

L 12 12 12

n 50 55 50


242 340 422

s r [gkg] 005 005 008

r [gkg] 014 014 022

CV r [] 19 16 19

S R [gkg] 015 020 009

R [gkg] 042 056 025

CV R [] 63 60 22





hvede



(0457 gkg)

L 12 12

n 55 60


s r [gkg] 0005 0012

r [gkg] 0014 0034

CV r [] 134 134

S R [gkg] 0018 0048

R [gkg] 0050 0134

CV R [] 471 511



B




blanding (CRM 117)




(CRM 119)



L 7 7 7 7

n 25 30 30 30


2064 8801 6882 5236

S r [gkg] 0021 0101 0089 0040

r [gkg] 0059 0283 0249 0112

CV r [] 104 115 130 076

S R [gkg] 0031 0413 0283 0221

R [gkg] 0087 1156 0792 0619

CV R [] 148 469 411 422



9 Bemaeligrkninger









Flow 12 mlminuttet



B




93 Bariumhydroxid












2 Princip

21 Metode A


22 Metode B


B


3 Reagenser






4 Apparatur





o C plusmn 3 o C

5 Fremgangsmaringde





52 Metode B





B






7 Repeterbarhed





8 Bemaeligrkninger





(10m 1 + m 2 ) times 5

hvor







B






2 Princip



3 Reagenser




timer (86)

34 Acetone




4 Apparatur









5 Fremgangsmaringde


B















hvor


7 Repeterbarhed




8 Bemaeligrkninger


B












2 Princip


3 Reagenser








B















4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde







B














8 Bemaeligrkninger


B







Eksempel





4 Uuml 166 10 frac14 664



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B





2 Princip


3 Reagenser














4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde




o C


B









7 Bemaeligrkning




Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B






2 Princip




3 Reagenser







4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde





B


( 1 ) EFT L 125 af 2351996 s 35


o C






o C






D




+1859 o risstivelse




+1815 o bygstivelse



blandinger






B






63 Repeterbarhed


7 Bemaeligrkninger






mdash citruskvas





mdash kartoffelkvas



mdash grever




B


2 Princip


3 Reagenser


4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde










7 Bemaeligrkninger




B







2 Princip



3 Reagenser




4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde







B






7 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser


32 Calciumcarbonat


4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde









B





hvor


7 Bemaeligrkninger



B



FOTOMETRISK METODE



2 Princip


3 Reagenser

31 Calciumcarbonat









4 Apparatur





45 Spektrofotometer


5 Fremgangsmaringde





B















Repeterbarhed




B





2 Princip


3 Reagenser





35 Diethylether

36 Acetone




4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde










B




52 Titrering





m

hvor



7 Bemaeligrkninger




B


BILAG IV






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol




6 IUg



6 IUg

B




4 Apparatur

















5 Fremgangsmaringde




B


52 Forsaeligbning


53 Ekstraktion











B



55 HPLC-bestemmelse









56 Kalibrering







B




















B




V 1 Uuml m [UIkg]

hvor


7 Bemaeligrkninger













8 Repeterbarhed


B





smaringgrise

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49


1702 times 10 6 121 times 10

6 537 100 151 800 18 070


6 22 080 12 280 682


6 61 824 34 384 1 910

CVr [ ] 30 35 41 81 38


6 46 300 23 060 3 614


6 129 640 64 568 10 119

CVR [ ] 80 62 86 15 20


B



B






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Apparatur


B

















5 Fremgangsmaringde




52 Forsaeligbning


B


53 Ekstraktion











55 HPLC-bestemmelse


B





















B
















V 1 Uuml m [mgkg]

hvor



7 Bemaeligrkninger




B








8 Repeterbarhed





smaringgrise

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48


17 380 1 187 926 315 613

s r [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

sR mgkg] 830 650 555 189 78

S R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127


B



B









2 Princip


3 Reagenser

Indledning















B









4 Apparatur










B








Bemaeligrkninger










B


Jern

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kobber

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

B


Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfoder




7 Repeterbarhed






8 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat

35 Iseddike

B









38 Methanol

39 Soslashlvnitrat

310 Natriumascorbat

311 Natriumcarbonat

312 Natriumchlorid
















B


4 Apparatur

41 Ultralydsbad


43 Centrifuge







5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion




B




o C

53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (441)








B







w frac14 c Uuml 10

m

hvor



71 Identitet










B



72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Resultater


ved modtagelse


ved modtagelse

efter 2 maringneder

ved modtagelse

efter 2 maringneder


S R [mgkg] mdash 045 043 040 042

CV R [ ] mdash 16 18 14 17

Genf [ ] 86 74 88 75






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol

32 Sur methanol


B


( 1 ) The Analyst 108 1983 s 1252-1256


34 Molekylsi















39 Standardstof









B


4 Apparatur

41 Glaskolonne









5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion


53 Oprensning



B





54 HPLC-bestemmelse










w frac14 c Uuml 200

m

hvor


B



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding




B


Fjerkraelig Kaniner



S R [mgkg] 436 336 461 391 CV R [] 161 120 106 97

Genfinding [] 900 933 872 802






2 Princip


3 Reagenser


32 Ammoniumacetat









o C

B




o C




o C



o C




o C




sorbentmasse 100 mg








B


4 Apparatur







45 Vakuummanifold

46 Ultralydsbad

5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r





B




53 HPLC-bestemmelse

















61 Foder



Uuml c dc Uuml 10 V

m [mgkg]

B


hvor




62 Forblandinger




m [mgkg]

hvor





71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding




Proslashve 1 A 100

Proslashve 2 O 100

Proslashve 3 L1

Proslashve 4 Z1

Proslashve 5 K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12


S r (mgkg) 588 764 015 002 003

CV r ( ) 583 738 1732 192 334

S R (mgkg) 759 764 017 011 012

CV R ( ) 753 738 1861 967 1365



B




9 Bemaeligrkninger






2 Princip


3 Reagenser










38 Sur methanol







B







4 Apparatur






5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r


B







53 HPLC-bestemmelse





Flow 12 mlminuttet


Excitation 310 nm

Emission 419 nm









B


61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor


62 Forblandinger



m [mgkg]

hvor




71 Identitet




72 Repeterbarhed





73 Genfinding


B





ding (kylshylinger)





foder



L 12 12 12 12 12 12 12 n 23 23 23 23 23 23 23


5 050 16 200 765 784 929 483 326

S r [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CV r [ ] 212 252 224 284 244 400 537 S R [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CV R [ ] 566 545 503 934 569 718 1070


5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()



B


() Analyst 1995 120 s 2175ndash2180

BILAG V





2 Princip


3 Reagenser








4 Apparatur


B


42 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde













B















hvor






B









63 Repeterbarhed





B



KAPITEL I








(raquoPCDFerlaquo)


2378-TCDD 1


123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003


2378-TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



M6









M6
















M6







KAPITEL II


i foder








M6







2 Baggrund






M6














M6













ndash 9 g)






M6











56 Analysekriterier


M6





lt 5




lt 25 lt 15












M6
















M6



















M6












M6














M6













M6








hvor








Q xx frac14 X m




hvor


M6






Figur 1





M6














M6

















M6








KAPITEL III












M6













6 Kvalitetskontrol












M6













le 15 le 20


le 20 le 20


standarder







M6



BILAG VI


FODER







2 METODER

21 Lysmikroskopi

211 Princip



2121 Reagenser







M2













21216 Blegemiddel


2122 Udstyr





Skilletragt

M2









2132 Forholdsregler








M2



















M2















M2


Diagram 1


M2


Diagram 2


M2















M2










22 PCR

221 Princip




2221 Reagenser




M2




222122 Mastermix







2222 Udstyr















224 Dna-ekstraktion





M2




















M2


BILAG VII














B


BILAG VIII


TILLADT

Vigtigt







2 Princip


3 Reagenser

31 Dichlormethan












B








4 Apparatur








5 Fremgangsmaringde

51 Generelt




52 Ekstraktion




B













56 HPLC-bestemmelse








B










w frac14 c Uuml 40

m

hvor



71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding






S r [mgkg] mdash 030 020 060 050

CV r [ ] mdash 670 440 670 570

S R [mgkg] mdash 040 050 090 100

CV R [ ] mdash 890 1110 1010 1150





4 -dioxid



2 Princip


B


3 Reagenser

31 Methanol






1 N 4 -dioxid E 851







Fremstilles dagligt

4 Apparatur

41 Ultralydsbad





5 Fremgangsmaringde


51 Generelt



B




52 Ekstraktion


53 HPLC-bestemmelse

















m

B


hvor



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding


B





L 13 10 11 11 n 40 40 44 44



CV R [ ] mdash 111 89 88




9 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol







B







o C



o C





4 Apparatur






44 Ultralydsbad


5 Fremgangsmaringde

51 Generelt



B





52 Ekstraktion





53 HPLC-bestemmelse








B











m [mgkg]

hvor




71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding





L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


S r [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [ ] mdash 495 190 346 220

S R [mgkg] mdash 295 118 266 760

CV R [ ] mdash 647 627 519 300



B


9 Bemaeligrkninger






4 -dioxid



2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol








37 Natriumacetat







B


311 Standardstof


4 - dioxid E 850



o C







4 Apparatur










47 Ultralydsbad

B


5 Fremgangsmaringde


51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r








B





53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse













B




61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor





m [mgkg]

hvor






71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Skema 1



L 8 8 8 8 8 8 n 15 14 15 15 15 15


CVr ( ) 58 56 29 31 32 43 SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244 CVR ( ) 78 87 46 52 48 49


Skema 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8 n 14 14 14 14 16 16 16


CVr ( ) 42 30 30 50 43 52 74 SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

B



A B C D A B C

CVR ( ) 42 30 43 63 57 65 74


100 100 100 100 100 100 100


B


BILAG IX














B






















Artikel 1 Artikel 3


B


12 Direktiv 93117EF




13 Direktiv 9864EF





















B








B


BILAG I







2 DEFINITIONER









M3







4 APPARATUR










423 Proslashvedeler


M3











le 25 tons 7



M3























le 5 tons 5




M3









ge 80 tons 100








M3





4 liter










Slutproslashver







M3














M3















M3





91 Generelt















M3

















M3












M3


BILAG II



1 Formaringl



2 Forholdsregler






3 Fremgangsmaringde







M3
















M3















M3


( 1 ) EUT L 229 af 192009 s 1







M3


BILAG III






2 Princip


3 Apparatur




2





4 Fremgangsmaringde


B




41 Klargoslashring







42 Toslashrring















B





43 Fortoslashrring





432 K o r n








hvor






Icirc

hvor


B


53 Repeterbarhed


6 Bemaeligrkning





2 Princip


3 Apparatur





35 Analysevaeliggt

4 Fremgangsmaringde








B


hvor



Repeterbarhed





2 Princip



3 Reagenser

31 Kaliumsulfat


33 Granuleret zink














B









4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde

51 Destruktion




52 Destillation




B







53 Titrering




532 B o r s y r e






B





54 Blindproslashve







hvor







hvor





B


hvor



71 Repeterbarhed





72 Noslashjagtighed


8 Bemaeligrkninger








B


2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur



43 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde




o C (+- 4







7 Bemaeligrkninger


B








2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur




5 Fremgangsmaringde



o C



B





Repeterbarhed




7 Bemaeligrkning


B





2 Princip


3 Reagenser


32 Magnesiumoxid





4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde







Repeterbarhed





B




2 Princip

21 Frie aminosyrer






3 Reagenser




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin



B



315 1-Octanol

316 Aminosyrer


3162 Cysteinsyre






















o C

B

















4 Apparatur




o C



46 Centrifuge



B





o C

5 Fremgangsmaringde










o C





B























B













o C







o C

54 Kromatografi



B
















B





10 ml Uuml V 10








694 n = 15

301 n = 17

327 n = 17

955 n = 13


931 n = 16

392 n = 18

508 n = 18

1393 n = 16


2232 n = 16

506 n = 17

1201 n = 17

4774 n = 15


mdash 9021 n = 16

9803 n = 16


71 Repeterbarhed






013 n = 15

010 n = 17

011 n = 17

026 n = 13


020 n = 16

011 n = 18

016 n = 18

028 n = 16


048 n = 16

013 n = 17

027 n = 17

099 n = 15


mdash 219 n = 16

206 n = 16


B






19 n = 15

33 n = 17

34 n = 17

28 n = 13


21 n = 16

28 n = 18

31 n = 18

21 n = 16


27 n = 16

26 n = 17

22 n = 17

24 n = 15


mdash 24 n = 16

21 n = 16


72 Reproducerbarhed






028 n = 15

030 n = 17

023 n = 17

030 n = 13


048 n = 16

034 n = 18

055 n = 18

075 n = 16


085 n = 16

062 n = 17

157 n = 17

124 n = 15


mdash 620 n = 16

662 n = 16






41 n = 15

99 n = 17

70 n = 17

32 n = 13


52 n = 16

88 n = 18

109 n = 18

54 n = 16


38 n = 16

123 n = 17

130 n = 17

30 n = 15


mdash 69 n = 16

67 n = 16


B




9 Bemaeligrkninger









2 Princip





3 Reagenser





35 Natriumhydroxid





B





















318 Eddikesyre





4 Apparatur



43 pH-meter


B





48 Vortex-blander

5 Fremgangsmaringde











o C i 20 timer




B





54 HPLC-bestemmelse





Flow 1 mlminuttet














7 Repeterbarhed


B








svin

L 12 12 12

n 50 55 50


242 340 422

s r [gkg] 005 005 008

r [gkg] 014 014 022

CV r [] 19 16 19

S R [gkg] 015 020 009

R [gkg] 042 056 025

CV R [] 63 60 22





hvede



(0457 gkg)

L 12 12

n 55 60


s r [gkg] 0005 0012

r [gkg] 0014 0034

CV r [] 134 134

S R [gkg] 0018 0048

R [gkg] 0050 0134

CV R [] 471 511



B




blanding (CRM 117)




(CRM 119)



L 7 7 7 7

n 25 30 30 30


2064 8801 6882 5236

S r [gkg] 0021 0101 0089 0040

r [gkg] 0059 0283 0249 0112

CV r [] 104 115 130 076

S R [gkg] 0031 0413 0283 0221

R [gkg] 0087 1156 0792 0619

CV R [] 148 469 411 422



9 Bemaeligrkninger









Flow 12 mlminuttet



B




93 Bariumhydroxid












2 Princip

21 Metode A


22 Metode B


B


3 Reagenser






4 Apparatur





o C plusmn 3 o C

5 Fremgangsmaringde





52 Metode B





B






7 Repeterbarhed





8 Bemaeligrkninger





(10m 1 + m 2 ) times 5

hvor







B






2 Princip



3 Reagenser




timer (86)

34 Acetone




4 Apparatur









5 Fremgangsmaringde


B















hvor


7 Repeterbarhed




8 Bemaeligrkninger


B












2 Princip


3 Reagenser








B















4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde







B














8 Bemaeligrkninger


B







Eksempel





4 Uuml 166 10 frac14 664



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B





2 Princip


3 Reagenser














4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde




o C


B









7 Bemaeligrkning




Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B






2 Princip




3 Reagenser







4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde





B


( 1 ) EFT L 125 af 2351996 s 35


o C






o C






D




+1859 o risstivelse




+1815 o bygstivelse



blandinger






B






63 Repeterbarhed


7 Bemaeligrkninger






mdash citruskvas





mdash kartoffelkvas



mdash grever




B


2 Princip


3 Reagenser


4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde










7 Bemaeligrkninger




B







2 Princip



3 Reagenser




4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde







B






7 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser


32 Calciumcarbonat


4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde









B





hvor


7 Bemaeligrkninger



B



FOTOMETRISK METODE



2 Princip


3 Reagenser

31 Calciumcarbonat









4 Apparatur





45 Spektrofotometer


5 Fremgangsmaringde





B















Repeterbarhed




B





2 Princip


3 Reagenser





35 Diethylether

36 Acetone




4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde










B




52 Titrering





m

hvor



7 Bemaeligrkninger




B


BILAG IV






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol




6 IUg



6 IUg

B




4 Apparatur

















5 Fremgangsmaringde




B


52 Forsaeligbning


53 Ekstraktion











B



55 HPLC-bestemmelse









56 Kalibrering







B




















B




V 1 Uuml m [UIkg]

hvor


7 Bemaeligrkninger













8 Repeterbarhed


B





smaringgrise

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49


1702 times 10 6 121 times 10

6 537 100 151 800 18 070


6 22 080 12 280 682


6 61 824 34 384 1 910

CVr [ ] 30 35 41 81 38


6 46 300 23 060 3 614


6 129 640 64 568 10 119

CVR [ ] 80 62 86 15 20


B



B






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Apparatur


B

















5 Fremgangsmaringde




52 Forsaeligbning


B


53 Ekstraktion











55 HPLC-bestemmelse


B





















B
















V 1 Uuml m [mgkg]

hvor



7 Bemaeligrkninger




B








8 Repeterbarhed





smaringgrise

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48


17 380 1 187 926 315 613

s r [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

sR mgkg] 830 650 555 189 78

S R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127


B



B









2 Princip


3 Reagenser

Indledning















B









4 Apparatur










B








Bemaeligrkninger










B


Jern

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kobber

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

B


Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfoder




7 Repeterbarhed






8 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat

35 Iseddike

B









38 Methanol

39 Soslashlvnitrat

310 Natriumascorbat

311 Natriumcarbonat

312 Natriumchlorid
















B


4 Apparatur

41 Ultralydsbad


43 Centrifuge







5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion




B




o C

53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (441)








B







w frac14 c Uuml 10

m

hvor



71 Identitet










B



72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Resultater


ved modtagelse


ved modtagelse

efter 2 maringneder

ved modtagelse

efter 2 maringneder


S R [mgkg] mdash 045 043 040 042

CV R [ ] mdash 16 18 14 17

Genf [ ] 86 74 88 75






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol

32 Sur methanol


B


( 1 ) The Analyst 108 1983 s 1252-1256


34 Molekylsi















39 Standardstof









B


4 Apparatur

41 Glaskolonne









5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion


53 Oprensning



B





54 HPLC-bestemmelse










w frac14 c Uuml 200

m

hvor


B



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding




B


Fjerkraelig Kaniner



S R [mgkg] 436 336 461 391 CV R [] 161 120 106 97

Genfinding [] 900 933 872 802






2 Princip


3 Reagenser


32 Ammoniumacetat









o C

B




o C




o C



o C




o C




sorbentmasse 100 mg








B


4 Apparatur







45 Vakuummanifold

46 Ultralydsbad

5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r





B




53 HPLC-bestemmelse

















61 Foder



Uuml c dc Uuml 10 V

m [mgkg]

B


hvor




62 Forblandinger




m [mgkg]

hvor





71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding




Proslashve 1 A 100

Proslashve 2 O 100

Proslashve 3 L1

Proslashve 4 Z1

Proslashve 5 K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12


S r (mgkg) 588 764 015 002 003

CV r ( ) 583 738 1732 192 334

S R (mgkg) 759 764 017 011 012

CV R ( ) 753 738 1861 967 1365



B




9 Bemaeligrkninger






2 Princip


3 Reagenser










38 Sur methanol







B







4 Apparatur






5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r


B







53 HPLC-bestemmelse





Flow 12 mlminuttet


Excitation 310 nm

Emission 419 nm









B


61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor


62 Forblandinger



m [mgkg]

hvor




71 Identitet




72 Repeterbarhed





73 Genfinding


B





ding (kylshylinger)





foder



L 12 12 12 12 12 12 12 n 23 23 23 23 23 23 23


5 050 16 200 765 784 929 483 326

S r [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CV r [ ] 212 252 224 284 244 400 537 S R [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CV R [ ] 566 545 503 934 569 718 1070


5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()



B


() Analyst 1995 120 s 2175ndash2180

BILAG V





2 Princip


3 Reagenser








4 Apparatur


B


42 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde













B















hvor






B









63 Repeterbarhed





B



KAPITEL I








(raquoPCDFerlaquo)


2378-TCDD 1


123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003


2378-TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



M6









M6
















M6







KAPITEL II


i foder








M6







2 Baggrund






M6














M6













ndash 9 g)






M6











56 Analysekriterier


M6





lt 5




lt 25 lt 15












M6
















M6



















M6












M6














M6













M6








hvor








Q xx frac14 X m




hvor


M6






Figur 1





M6














M6

















M6








KAPITEL III












M6













6 Kvalitetskontrol












M6













le 15 le 20


le 20 le 20


standarder







M6



BILAG VI


FODER







2 METODER

21 Lysmikroskopi

211 Princip



2121 Reagenser







M2













21216 Blegemiddel


2122 Udstyr





Skilletragt

M2









2132 Forholdsregler








M2



















M2















M2


Diagram 1


M2


Diagram 2


M2















M2










22 PCR

221 Princip




2221 Reagenser




M2




222122 Mastermix







2222 Udstyr















224 Dna-ekstraktion





M2




















M2


BILAG VII














B


BILAG VIII


TILLADT

Vigtigt







2 Princip


3 Reagenser

31 Dichlormethan












B








4 Apparatur








5 Fremgangsmaringde

51 Generelt




52 Ekstraktion




B













56 HPLC-bestemmelse








B










w frac14 c Uuml 40

m

hvor



71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding






S r [mgkg] mdash 030 020 060 050

CV r [ ] mdash 670 440 670 570

S R [mgkg] mdash 040 050 090 100

CV R [ ] mdash 890 1110 1010 1150





4 -dioxid



2 Princip


B


3 Reagenser

31 Methanol






1 N 4 -dioxid E 851







Fremstilles dagligt

4 Apparatur

41 Ultralydsbad





5 Fremgangsmaringde


51 Generelt



B




52 Ekstraktion


53 HPLC-bestemmelse

















m

B


hvor



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding


B





L 13 10 11 11 n 40 40 44 44



CV R [ ] mdash 111 89 88




9 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol







B







o C



o C





4 Apparatur






44 Ultralydsbad


5 Fremgangsmaringde

51 Generelt



B





52 Ekstraktion





53 HPLC-bestemmelse








B











m [mgkg]

hvor




71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding





L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


S r [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [ ] mdash 495 190 346 220

S R [mgkg] mdash 295 118 266 760

CV R [ ] mdash 647 627 519 300



B


9 Bemaeligrkninger






4 -dioxid



2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol








37 Natriumacetat







B


311 Standardstof


4 - dioxid E 850



o C







4 Apparatur










47 Ultralydsbad

B


5 Fremgangsmaringde


51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r








B





53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse













B




61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor





m [mgkg]

hvor






71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Skema 1



L 8 8 8 8 8 8 n 15 14 15 15 15 15


CVr ( ) 58 56 29 31 32 43 SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244 CVR ( ) 78 87 46 52 48 49


Skema 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8 n 14 14 14 14 16 16 16


CVr ( ) 42 30 30 50 43 52 74 SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

B



A B C D A B C

CVR ( ) 42 30 43 63 57 65 74


100 100 100 100 100 100 100


B


BILAG IX














B






















Artikel 1 Artikel 3


B


12 Direktiv 93117EF




13 Direktiv 9864EF





















B








B







4 APPARATUR










423 Proslashvedeler


M3











le 25 tons 7



M3























le 5 tons 5




M3









ge 80 tons 100








M3





4 liter










Slutproslashver







M3














M3















M3





91 Generelt















M3

















M3












M3


BILAG II



1 Formaringl



2 Forholdsregler






3 Fremgangsmaringde







M3
















M3















M3


( 1 ) EUT L 229 af 192009 s 1







M3


BILAG III






2 Princip


3 Apparatur




2





4 Fremgangsmaringde


B




41 Klargoslashring







42 Toslashrring















B





43 Fortoslashrring





432 K o r n








hvor






Icirc

hvor


B


53 Repeterbarhed


6 Bemaeligrkning





2 Princip


3 Apparatur





35 Analysevaeliggt

4 Fremgangsmaringde








B


hvor



Repeterbarhed





2 Princip



3 Reagenser

31 Kaliumsulfat


33 Granuleret zink














B









4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde

51 Destruktion




52 Destillation




B







53 Titrering




532 B o r s y r e






B





54 Blindproslashve







hvor







hvor





B


hvor



71 Repeterbarhed





72 Noslashjagtighed


8 Bemaeligrkninger








B


2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur



43 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde




o C (+- 4







7 Bemaeligrkninger


B








2 Princip


3 Reagenser






4 Apparatur




5 Fremgangsmaringde



o C



B





Repeterbarhed




7 Bemaeligrkning


B





2 Princip


3 Reagenser


32 Magnesiumoxid





4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde







Repeterbarhed





B




2 Princip

21 Frie aminosyrer






3 Reagenser




33 Phenol

34 Natriumdisulfit

35 Natriumhydroxid





310 Natriumchlorid

311 Ninhydrin



B



315 1-Octanol

316 Aminosyrer


3162 Cysteinsyre






















o C

B

















4 Apparatur




o C



46 Centrifuge



B





o C

5 Fremgangsmaringde










o C





B























B













o C







o C

54 Kromatografi



B
















B





10 ml Uuml V 10








694 n = 15

301 n = 17

327 n = 17

955 n = 13


931 n = 16

392 n = 18

508 n = 18

1393 n = 16


2232 n = 16

506 n = 17

1201 n = 17

4774 n = 15


mdash 9021 n = 16

9803 n = 16


71 Repeterbarhed






013 n = 15

010 n = 17

011 n = 17

026 n = 13


020 n = 16

011 n = 18

016 n = 18

028 n = 16


048 n = 16

013 n = 17

027 n = 17

099 n = 15


mdash 219 n = 16

206 n = 16


B






19 n = 15

33 n = 17

34 n = 17

28 n = 13


21 n = 16

28 n = 18

31 n = 18

21 n = 16


27 n = 16

26 n = 17

22 n = 17

24 n = 15


mdash 24 n = 16

21 n = 16


72 Reproducerbarhed






028 n = 15

030 n = 17

023 n = 17

030 n = 13


048 n = 16

034 n = 18

055 n = 18

075 n = 16


085 n = 16

062 n = 17

157 n = 17

124 n = 15


mdash 620 n = 16

662 n = 16






41 n = 15

99 n = 17

70 n = 17

32 n = 13


52 n = 16

88 n = 18

109 n = 18

54 n = 16


38 n = 16

123 n = 17

130 n = 17

30 n = 15


mdash 69 n = 16

67 n = 16


B




9 Bemaeligrkninger









2 Princip





3 Reagenser





35 Natriumhydroxid





B





















318 Eddikesyre





4 Apparatur



43 pH-meter


B





48 Vortex-blander

5 Fremgangsmaringde











o C i 20 timer




B





54 HPLC-bestemmelse





Flow 1 mlminuttet














7 Repeterbarhed


B








svin

L 12 12 12

n 50 55 50


242 340 422

s r [gkg] 005 005 008

r [gkg] 014 014 022

CV r [] 19 16 19

S R [gkg] 015 020 009

R [gkg] 042 056 025

CV R [] 63 60 22





hvede



(0457 gkg)

L 12 12

n 55 60


s r [gkg] 0005 0012

r [gkg] 0014 0034

CV r [] 134 134

S R [gkg] 0018 0048

R [gkg] 0050 0134

CV R [] 471 511



B




blanding (CRM 117)




(CRM 119)



L 7 7 7 7

n 25 30 30 30


2064 8801 6882 5236

S r [gkg] 0021 0101 0089 0040

r [gkg] 0059 0283 0249 0112

CV r [] 104 115 130 076

S R [gkg] 0031 0413 0283 0221

R [gkg] 0087 1156 0792 0619

CV R [] 148 469 411 422



9 Bemaeligrkninger









Flow 12 mlminuttet



B




93 Bariumhydroxid












2 Princip

21 Metode A


22 Metode B


B


3 Reagenser






4 Apparatur





o C plusmn 3 o C

5 Fremgangsmaringde





52 Metode B





B






7 Repeterbarhed





8 Bemaeligrkninger





(10m 1 + m 2 ) times 5

hvor







B






2 Princip



3 Reagenser




timer (86)

34 Acetone




4 Apparatur









5 Fremgangsmaringde


B















hvor


7 Repeterbarhed




8 Bemaeligrkninger


B












2 Princip


3 Reagenser








B















4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde







B














8 Bemaeligrkninger


B







Eksempel





4 Uuml 166 10 frac14 664



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B





2 Princip


3 Reagenser














4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde




o C


B









7 Bemaeligrkning




Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


C 6 H 12 O 6



Na 2 S 2 O 3 01 mol

liter


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

24 48 72 97

122 147 172 198 224 250 276 303 330 357 385 413 442 471 500 530 560 591 622

24 24 25 25 25 25 26 26 26 26 27 27 27 28 28 29 29 29 30 30 31 31

36 73

110 147 184 221 258 295 332 370 408 446 484 522 560 599 638 677 717 757 798 839 880

37 37 37 37 37 37 37 37 38 38 38 38 38 38 39 39 39 40 40 41 41 41

39 78 117 156 196 235 275 315 355 395 435 475 516 557 598 639 680 722 765 809 854 900 946

39 39 39 40 39 40 40 40 40 40 40 41 41 41 41 41 42 43 44 45 46 46

1 2 3 4 5 6 7 8 9

10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

B






2 Princip




3 Reagenser







4 Apparatur



5 Fremgangsmaringde





B


( 1 ) EFT L 125 af 2351996 s 35


o C






o C






D




+1859 o risstivelse




+1815 o bygstivelse



blandinger






B






63 Repeterbarhed


7 Bemaeligrkninger






mdash citruskvas





mdash kartoffelkvas



mdash grever




B


2 Princip


3 Reagenser


4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde










7 Bemaeligrkninger




B







2 Princip



3 Reagenser




4 Apparatur

41 Varmeplade



5 Fremgangsmaringde







B






7 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser


32 Calciumcarbonat


4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde









B





hvor


7 Bemaeligrkninger



B



FOTOMETRISK METODE



2 Princip


3 Reagenser

31 Calciumcarbonat









4 Apparatur





45 Spektrofotometer


5 Fremgangsmaringde





B















Repeterbarhed




B





2 Princip


3 Reagenser





35 Diethylether

36 Acetone




4 Apparatur


5 Fremgangsmaringde










B




52 Titrering





m

hvor



7 Bemaeligrkninger




B


BILAG IV






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol






38 2-Propanol




6 IUg



6 IUg

B




4 Apparatur

















5 Fremgangsmaringde




B


52 Forsaeligbning


53 Ekstraktion











B



55 HPLC-bestemmelse









56 Kalibrering







B




















B




V 1 Uuml m [UIkg]

hvor


7 Bemaeligrkninger













8 Repeterbarhed


B





smaringgrise

L 13 12 13 12 13

n 48 45 47 46 49


1702 times 10 6 121 times 10

6 537 100 151 800 18 070


6 22 080 12 280 682


6 61 824 34 384 1 910

CVr [ ] 30 35 41 81 38


6 46 300 23 060 3 614


6 129 640 64 568 10 119

CVR [ ] 80 62 86 15 20


B



B






2 Princip


3 Reagenser

31 Ethanol σ = 96


33 Methanol













4 Apparatur


B

















5 Fremgangsmaringde




52 Forsaeligbning


B


53 Ekstraktion











55 HPLC-bestemmelse


B





















B
















V 1 Uuml m [mgkg]

hvor



7 Bemaeligrkninger




B








8 Repeterbarhed





smaringgrise

L 12 12 12 12 12

n 48 48 48 48 48


17 380 1 187 926 315 613

s r [mgkg] 384 453 252 130 23

r [mgkg] 1 075 1268 706 364 64

CVr [] 22 38 27 41 38

sR mgkg] 830 650 555 189 78

S R [mgkg] 2 324 1820 1554 529 218

CVR [] 48 55 60 60 127


B



B









2 Princip


3 Reagenser

Indledning















B









4 Apparatur










B








Bemaeligrkninger










B


Jern

μg Feml 0 05 1 2 3 4 5


0 05 1 2 3 4 5

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Kobber

μg Cuml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 8 8 8 8 8 8 8

Mangan

μg Mnml 0 01 02 04 06 08 10


0 1 2 4 6 8 10

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7


Zink

μg Znml 0 005 01 02 04 06 08


0 05 1 2 4 6 8

ml HCl (32) 7 7 7 7 7 7 7









Fe 2483 nm

Cu 3248 nm

B


Mn 2795 nm

Zn 2138 nm


52 Mineralfoder




7 Repeterbarhed






8 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser



33 Ammoniumacetat

34 Ethylacetat

35 Iseddike

B









38 Methanol

39 Soslashlvnitrat

310 Natriumascorbat

311 Natriumcarbonat

312 Natriumchlorid
















B


4 Apparatur

41 Ultralydsbad


43 Centrifuge







5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion




B




o C

53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse



HPLC-kolonne (441)








B







w frac14 c Uuml 10

m

hvor



71 Identitet










B



72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Resultater


ved modtagelse


ved modtagelse

efter 2 maringneder

ved modtagelse

efter 2 maringneder


S R [mgkg] mdash 045 043 040 042

CV R [ ] mdash 16 18 14 17

Genf [ ] 86 74 88 75






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol

32 Sur methanol


B


( 1 ) The Analyst 108 1983 s 1252-1256


34 Molekylsi















39 Standardstof









B


4 Apparatur

41 Glaskolonne









5 Fremgangsmaringde


51 Generelt




52 Ekstraktion


53 Oprensning



B





54 HPLC-bestemmelse










w frac14 c Uuml 200

m

hvor


B



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding




B


Fjerkraelig Kaniner



S R [mgkg] 436 336 461 391 CV R [] 161 120 106 97

Genfinding [] 900 933 872 802






2 Princip


3 Reagenser


32 Ammoniumacetat









o C

B




o C




o C



o C




o C




sorbentmasse 100 mg








B


4 Apparatur







45 Vakuummanifold

46 Ultralydsbad

5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r





B




53 HPLC-bestemmelse

















61 Foder



Uuml c dc Uuml 10 V

m [mgkg]

B


hvor




62 Forblandinger




m [mgkg]

hvor





71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding




Proslashve 1 A 100

Proslashve 2 O 100

Proslashve 3 L1

Proslashve 4 Z1

Proslashve 5 K1

L 11 11 11 11 6

n 19 18 19 19 12


S r (mgkg) 588 764 015 002 003

CV r ( ) 583 738 1732 192 334

S R (mgkg) 759 764 017 011 012

CV R ( ) 753 738 1861 967 1365



B




9 Bemaeligrkninger






2 Princip


3 Reagenser










38 Sur methanol







B







4 Apparatur






5 Fremgangsmaringde

51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r


B







53 HPLC-bestemmelse





Flow 12 mlminuttet


Excitation 310 nm

Emission 419 nm









B


61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor


62 Forblandinger



m [mgkg]

hvor




71 Identitet




72 Repeterbarhed





73 Genfinding


B





ding (kylshylinger)





foder



L 12 12 12 12 12 12 12 n 23 23 23 23 23 23 23


5 050 16 200 765 784 929 483 326

S r [mgkg] 107 408 171 223 227 193 175

CV r [ ] 212 252 224 284 244 400 537 S R [mgkg] 286 883 385 732 529 347 349

CV R [ ] 566 545 503 934 569 718 1070


5 000 () 16 000 () 80 () 105 () 120 () 50 () 35 ()



B


() Analyst 1995 120 s 2175ndash2180

BILAG V





2 Princip


3 Reagenser








4 Apparatur


B


42 Spektrofotometer

5 Fremgangsmaringde













B















hvor






B









63 Repeterbarhed





B



KAPITEL I








(raquoPCDFerlaquo)


2378-TCDD 1


123478-HxCDD 01 PCB 77 00001

123678-HxCDD 01 PCB 81 00003

123789-HxCDD 01 PCB 126 01

1234678-HpCDD 001 PCB 169 003


2378-TCDF 01 PCB 105 000003

12378-PeCDF 003 PCB 114 000003

23478-PeCDF 03 PCB 118 000003

123478-HxCDF 01 PCB 123 000003

123678-HxCDF 01 PCB 156 000003

123789-HxCDF 01 PCB 157 000003

234678-HxCDF 01 PCB 167 000003

1234678-HpCDF 001 PCB 189 000003

1234789-HpCDF 001

OCDF 00003



M6









M6
















M6







KAPITEL II


i foder








M6







2 Baggrund






M6














M6













ndash 9 g)






M6











56 Analysekriterier


M6





lt 5




lt 25 lt 15












M6
















M6



















M6












M6














M6













M6








hvor








Q xx frac14 X m




hvor


M6






Figur 1





M6














M6

















M6








KAPITEL III












M6













6 Kvalitetskontrol












M6













le 15 le 20


le 20 le 20


standarder







M6



BILAG VI


FODER







2 METODER

21 Lysmikroskopi

211 Princip



2121 Reagenser







M2













21216 Blegemiddel


2122 Udstyr





Skilletragt

M2









2132 Forholdsregler








M2



















M2















M2


Diagram 1


M2


Diagram 2


M2















M2










22 PCR

221 Princip




2221 Reagenser




M2




222122 Mastermix







2222 Udstyr















224 Dna-ekstraktion





M2




















M2


BILAG VII














B


BILAG VIII


TILLADT

Vigtigt







2 Princip


3 Reagenser

31 Dichlormethan












B








4 Apparatur








5 Fremgangsmaringde

51 Generelt




52 Ekstraktion




B













56 HPLC-bestemmelse








B










w frac14 c Uuml 40

m

hvor



71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding






S r [mgkg] mdash 030 020 060 050

CV r [ ] mdash 670 440 670 570

S R [mgkg] mdash 040 050 090 100

CV R [ ] mdash 890 1110 1010 1150





4 -dioxid



2 Princip


B


3 Reagenser

31 Methanol






1 N 4 -dioxid E 851







Fremstilles dagligt

4 Apparatur

41 Ultralydsbad





5 Fremgangsmaringde


51 Generelt



B




52 Ekstraktion


53 HPLC-bestemmelse

















m

B


hvor



71 Identitet











72 Repeterbarhed


73 Genfinding


B





L 13 10 11 11 n 40 40 44 44



CV R [ ] mdash 111 89 88




9 Bemaeligrkning






2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol







B







o C



o C





4 Apparatur






44 Ultralydsbad


5 Fremgangsmaringde

51 Generelt



B





52 Ekstraktion





53 HPLC-bestemmelse








B











m [mgkg]

hvor




71 Identitet








B





72 Repeterbarhed





73 Genfinding





L 14 14 14 14 15

n 56 56 56 56 60


S r [mgkg] mdash 226 357 178 550

CVr [ ] mdash 495 190 346 220

S R [mgkg] mdash 295 118 266 760

CV R [ ] mdash 647 627 519 300



B


9 Bemaeligrkninger






4 -dioxid



2 Princip


3 Reagenser

31 Methanol








37 Natriumacetat







B


311 Standardstof


4 - dioxid E 850



o C







4 Apparatur










47 Ultralydsbad

B


5 Fremgangsmaringde


51 Generelt






52 Ekstraktion

521 F o d e r








B





53 Oprensning






54 HPLC-bestemmelse













B




61 Foder


w frac14 c Uuml V 1

m [mgkg]

hvor





m [mgkg]

hvor






71 Identitet








B





72 Repeterbarhed


73 Genfinding




Skema 1



L 8 8 8 8 8 8 n 15 14 15 15 15 15


CVr ( ) 58 56 29 31 32 43 SR (mgkg) 392 413 223 258 226 244 CVR ( ) 78 87 46 52 48 49


Skema 2



A B C D A B C

L 7 7 7 7 8 8 8 n 14 14 14 14 16 16 16


CVr ( ) 42 30 30 50 43 52 74 SR (gkg) 037 028 040 055 54 64 77

B



A B C D A B C

CVR ( ) 42 30 43 63 57 65 74


100 100 100 100 100 100 100


B


BILAG IX














B






















Artikel 1 Artikel 3


B


12 Direktiv 93117EF




13 Direktiv 9864EF





















B








B


Documents

B KOMMISSIONENS FORORDNING (EF) NR152/2009 af 27. …