Samira Nogarol Yunes

AVALIAO DA FREQNCIA DE ABERRAES CROMOSSMICAS

INSTVEIS EM GRUPOS DE INDIVDUOS RESIDENTES NO MUNICPIO DE

MONTE ALEGRE PA EXPOSTOS DIFERENCIALMENTE AO RADNIO.

Dissertao aprovada para obteno

do Grau de Mestre pelo Programa de Ps-

Graduao em Radioproteo e Dosimetria

do Instituto de Radioproteo e Dosimetria

da Comisso Nacional de Energia Nuclear na

rea de Biofsica das Radiaes.

Orientador: Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida - IRD/CNEN Co-orientadora: Dra. Lene Holanda Sadler Veiga IRD/CNEN

Rio de Janeiro Brasil

Instituto de Radioproteo e Dosimetria Comisso Nacional de Energia Nuclear

Coordenao de Ps-Graduao

2010

ii

Yunes, Samira Nogarol

Avaliao da Freqncia de Aberraes Cromossmicas Instveis em

grupos de indivduos residentes no municpio de Monte Alegre PA

expostos ao radnio.

Samira Nogarol Yunes [Rio de Janeiro] 2010

Xiv, 68 p. 29,7 cm: fig., tab.

Dissertao (mestrado) - Instituto de Radioproteo e Dosimetria

Rio de Janeiro, 2010.

1. Radiao Ionizante; 2. Aberrao Cromossmica; 3. Monte

Alegre;

I. Instituto de Radioproteo e Dosimetria II. Ttulo

iii

Samira Nogarol Yunes

AVALIAO DA FREQNCIA DE ABERRAES CROMOSSMICAS INSTVEIS EM GRUPOS DE INDIVDUOS RESIDENTES NO MUNICPIO DE

MONTE ALEGRE PA EXPOSTOS DIFERENCIALMENTE AO RADNIO.

Rio de Janeiro, 17 de dezembro de 2010.

_________________________________________________________

Dr. IRD/CNEN

_________________________________________________________ Dr. IRD/CNEN

________________________________________________________ Dr. IRD/CNEN

_________________________________________________________ Dr. - UFRJ

iv

O presente trabalho foi desenvolvido no Instituto de Radioproteo e Dosimetria da Comisso Nacional de Energia Nuclear, sob orientao do Prof. Dr. Carlos Eduardo Bonacossa de Almeida e Coorientadora Dra. Lene Holanda Sadler Veiga no Laboratrio de Radiobiologia.

v

Este trabalho dedico a meus pais, Jorge e Regina,

que sempre acreditaram em mim, investiram nos meus sonhos.

vi

Agradecimentos

A Deus, acima de tudo, por ser a fonte de todo amor, paz, justia e alegria da minha

vida.

A meus pais, quem devo honrar para sempre por abdicarem de suas vidas por mim.

Obrigada pelo grande amor, carinho e cuidado com o meu crescimento.

A minha grande e eterna famlia (Igreja Mananciais), que provam e manifestam de

maneira pratica a cada dia o seu amor incondicional.

A meu orientador, Carlos, que me ensinou a correr atrs daquilo que acredito e enxergar

alem do tubo aparentemente vazio, um exemplo de coragem e determinao.

amiga Monica, por sua pacincia e dedicao em passar suas experincias

profissionais e pessoais, que foram fundamentais para o inicio, meio e fim deste

trabalho.

As minhas amigas eternas, Cristiny e Isabelle, que fizeram do meu trabalho um lugar

inesquecvel.

Aos amigos Amanda, Leonardo, Hugo, que sempre me incentivaram e ajudaram a

chegar aqui.

As amigas Claudia e Cris, pelo carinho, amor e amizade, e a todos do DEMIN.

Aos rgos de apoio financeiro deste trabalho: IRD-CNEN e Fiocruz.

vii

Resumo

O municpio de Monte Alegre uma regio que apresenta radiao natural elevada devido presena do radionucldeo Urnio (238U) em seu solo, que atravs de seu decaimento d origem ao elemento Radnio (226Ra), um gs radioativo (. A radioatividade das rochas passou a constituir um problema para a populao de Monte Alegre, a partir do momento em que o material radioativo comeou a ser utilizado na construo de casas e pavimentao de ruas. Entre todos os biomarcadores relacionados a exposies ambientais e seus efeitos biolgicos, as aberraes cromossmicas so considerados bons biomarcadores como preditores do risco de cncer. Estudos sugerem que a freqncia de aberraes cromossmicas pode estar relacionada com a instabilidade gentica individual e/ou exposio radiao ionizante.Com isto nosso trabalho visou avaliar a freqncia de aberraes cromossmicas em indivduos na regio de alta radioatividade natural em Monte Alegre-PA. Como tambm correlacionarmos a anlise citogentica feita no presente estudo com os resultados da analise da freqncia de polimorfismos de genes de reparo do DNA realizada em outro estudo que resultou em outra dissertao. De acordo com a distribuio dos dados obtidos na caracterizao radiolgica ambiental e no clculo de dose, foram escolhidos residentes de domiclios com maior e menor exposio radiao. As amostras do sangue perifrico de 85 indivduos da populao residente da regio de Monte Alegre PA foram coletadas e uma analise previa de duas laminas por individuo foi realizada para verificao da qualidade da amostra. Atravs dessa avaliao determinamos que 33% do material coletado, ou seja, amostras de 28 indivduos estavam em condies adequadas para anlise quanto a freqncia de aberraes cromossmicas. Aps as coletas os linfcitos presentes na amostra foram cultivados de acordo com a metodologia proposta para obteno de clulas em metfase. Foram analisadas 6.177 metfases dos 28 indivduos dentre as quais foram encontrados 4 cromossomas dicntricos e 19 fragmentos. O numero de aberraes cromossmicas no ultrapassou o intervalo dos valores de referencia para a freqncia de dicntrico basal. Sendo assim a exposio a radiao, produzida pelo decaimento do Urnio (238U) , nas residncias de Monte Alegre no suficiente para aumentar a freqncia de aberraes tipo-cromossmicas instveis para o grupo de estudo. No podemos afirmar que a combinao de variaes polimrficas encontradas nos indivduos tiveram influencia no surgimento das aberraes, j que diversos fatores podem estar envolvidos para o aparecimento de aberraes cromossmicas espontneas. Palavras Chave: Radiao Ionizante, Aberrao Cromossmica, Monte Alegre

viii

Abstract

The municipality of Monte Alegre is a region that presents natural radiation high due to the presence of the radionuclide uranium (238U) in its soil, which through its decay gives rise to element Rn, a gas. The radioactivity of the rocks has become a problem for the population of Monte Alegre, from the moment when the radioactive material began to be used in the construction of houses and paving of streets. Among all biomarkers related to environmental exposures and its biological effects, the chromosomal aberrations are considered good biomarkers as predictors of the risk of cancer. Studies suggest that the frequency of chromosomal aberrations may be related to the genetic instability individual and/or exposure to ionizing radiation. Our work aimed to evaluate the frequency of chromosomal aberrations in individuals in the region of high natural radioactivity in Monte Alegre-PA. As well as to correlate the cytogenetic analysis made in this study with the results of analysis of frequency of polymorphisms of genes of DNA repair carried out in another study that resulted in other dissertation. In accordance with the distribution of the data obtained in characterizing environmental radiological and in the calculation of dose, were chosen residents of homes with more and less exposure to radiation. The samples of peripheral blood of 85 individuals of the resident population of the region of Monte Alegre PA were collected and examine provided two slides for individual was performed to verify the quality of the sample. Through this evaluation we decide that 33% of the material collected, or is, samples of 28 individuals were in suitable conditions for analysis of the frequency of chromosomal aberrations. After the collections lymphocytes present in the sample were cultivated in accordance with the methodology proposed for obtaining of cells in metaphase. were analyzed 6,177 metaphases of 28 individuals among which were found dicentric chromosomes 4 and 19 fragments. The number of chromosomal aberrations exceeded the interval of the values of reference for the frequency of dicntrico basal. Thus the exposure to radiation, produced by decay of uranium, in the residences of Monte Alegre is not sufficient to increase the frequency of chromosomal aberrations-type unstable for the study group. We cannot say that the combination of variations polymorphic found in individuals had influences the emergence of aberrations, given that several factors may be involved to the emergence of spontaneous chromosomal aberrations. Key Words: Ionizing Radiation, Chromosomal aberration , Monte Alegre

ix

ndice

1. INTRODUO ......................................................................................... 1

1.1. Fontes de exposio a radiao natural ........................................................... 1

1.2. Estudos em reas de radioatividade natural elevada no Brasil ........................ 4

1.3. O municpio de Monte Alegre, PA ................................................................. 6

1.4. Efeitos sade decorrentes da exposio `a radiao ionizante ...................... 8

1.5. Aberraes cromossmicas como eventos preditores do risco de cncer ........ 9

2. OBJETIVO GERAL ......................................................................................... 13

2.1. Objetivo Especifico ......................................................................................... 13

3. FUNDAMENTOS TERICOS ......................................................................... 14

3.1. Linfcitos Humanos ......................................................................................... 14

3.2. Estrutura Cromossmica ................................................................................. 15

3.2.1. Compactao da Cromatina .......................................................................... 15

3.2.2. Caritipo Humano ........................................................................................ 16

3.2.3. Ciclo Celular ........................................................................................ 19

3.3. Alteraes Cromossmicas induzidas por radiao ......................................... 20

3.4. Aberraes Tipo cromossmicas ..................................................................... 22

3.4.1. Aberraes instveis ................................................................................. 23

3.5. Vias de reparo de DNA de interesse ............................................................ 26

3.5.1. Reparo por exciso de bases (BER) ............................................................ 27

3.5.2. Reparo por exciso de nucleotdeos (NER) ............................................... 29

3.5.3. Recombinao Homologa ............................................... 31

4. METODOLOGIA ......................................................................................... 32

x

4.1. rea de Estudo: Monte Alegre ........................................................................ 32

4.2. Escolha dos indivduos ........................................................................ 34

4.3. Coleta das amostras ........................................................................ 35

4.4. Cultivo das clulas ........................................................................ 35

4.4.1 Colheita e fixao das clulas ........................................................................ 36

4.4.2. Preparo das laminas ........................................................................ 37

4.4.3 Colorao das laminas ........................................................................ 37

4.5. Anlise Microscpica ........................................................................ 38

4.6. Purificao do DNA ........................................................................ 38

4.7. Quantificao do DNA ........................................................................ 39

4.8. Amplificao pelo mtodo PCR (Polymerase Chain Reaction) ............... 40

4.9. Polimorfismo no comprimento de fragmentos de Restrio - RFLP ............... 42

5. RESULTADOS ......................................................................................... 44

6. DISCUSSO ......................................................................................... 50

7. CONCLUSO ......................................................................................... 55

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICA .............................................................. 56

xi

Lista de Figuras

Figura 1 Modelo de Compactao da Cromatina ................................................. 17

Figura 2 Ilustrao Esquemtica do Caritipo Humano .................................... 18

Figura 3 Imagem de dois cromossomos dicntricos e um anel cntrico com seus

fragmentos acntricos associados (colorao Giemsa) .............................................. 25

Figura 4. Mapa da Regio norte abrangendo Monte Alegre e cidades prximas ... 33

Figura 5. Rogue cell -Metfase com trs dicentricos e dez fragmentos (colorao

Giemsa). .................................................................................................................... 48

xii

Lista de tabelas e quadros

Tabela 1 - Condies fsicas dos genes no processo de amplificao das amostras. 41

Tabela 2 - Primers especficos de cada gene para a realizao do PCR ............... 41

Tabela 3 - Genes e suas enzimas de restries correspondentes ............................. 43

Tabela 4 - Tamanho dos fragmentos de interesse aps o corte com cada enzima de

restrio .................................................................................................................... 43

Tabela 5 Freqncia de Aberrao Cromossmica em linfcitos dos indivduos

de Monte Alegre ..................................................................................................... 45

Tabela 6 - Correlao entre os dados obtidos da analise citogentica e analise

molecular dos indivduos de Monte Alegre. .............................................................. 49

xiii

Lista de Abreviaturas e Siglas

ARNE rea de radioatividade Natural Elevada

CNEN Comisso Nacional de Energia Nuclear

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento

Cientifico e Tecnolgico

CPRM Companhia de Pesquisas de Recursos Naturais

CPS Contagem por segundo

DNA cido desoxirribonuclico

ICRP Comisso Internacional de Proteo Radiolgica

INB Indstrias Nucleares Brasileiras

IR Radiao Ionizante

LPH Linfcito Perifrico Humano

PCR Reao de polimerase cadeia

RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism

RNF Radiao Natural de Fundo

SMR Razo de Mortalidade Padronizada

UFPA Universidade Federal do Par

UNSCEAR Comit Cientifico das Naes Unidas sobre

Efeitos da Radiao Atmica

UV Ultravioleta

xiv

Lista de Smbolo

% Porcentagem

g Gravidade

L Microlitro

Bq Bequerel

mSv Milisievert

1

1. INTRODUO

1.1. Fontes de exposio radiao natural

A radiao natural de fundo (RNF) que tem origem no ambiente terrestre varia

grandemente em todo mundo e tambm dentro dos pases. Os elementos radioativos

primrios da crosta terrestre que leva exposio humana so Potssio (40K), Urnio

(238U), Trio (232Th)e seus produtos radioativos de decaimento (Radio, Radnio, etc)

(EISENBUD, 1997).

Uma rea com RNF alta definida como rea ou um complexo de residncias

onde a soma de radiao csmica e a radioatividade natural do solo, gua, alimento, etc

levam a situao de exposio crnica por exposies interna ou externa que resulta em

uma dose efetiva anual ao publico acima de um nvel definido (CARDIS, 2005). A taxa

da dose efetiva anual est classificada em quatro nveis: baixo, que significa = 5

mSv/ano (ou aproximadamente o dobro da media global de 2,4 mSv/ano); mdio (5 - 20

mSv/ano); alto (20 50 mSv/ano); e muito alto (> 50 mSv/ano). As reas mais

estudadas com altos nveis de radiao terrestres esto no Brasil, China, ndia, Iran

(SOHRABI, 1998, UNSCEAR, 1994).

2

A maior parte da radioatividade da atmosfera ao nvel do mar se atribui dois

istopos de Radnio (222Rn e 220Rn) e os seus filhos. O 222Rn faz parte da serie de

decaimento de Urnio (U238). O 222Rn um gs nobre emissor alfa que prontamente

difunde atravs de rochas e emana continuamente pelas paredes, o cho e teto de minas

(KATHREN, 1998). As doses decorrentes da inalao de radnio e da exposio

radiao gama terrestre contribuem com a maior frao de exposio radiao natural em

seres humanos, sendo juntas cerca de 70% da dose total recebida anualmente pelo

homem devido a fontes naturais. Geralmente, um aumento da exposio

radioatividade natural est relacionado a uma maior exposio ao radnio e exposio

radiao gama terrestre (NRC, 1988, GREENLEE, 2001).

A exposio radiao natural pode ser fortemente influenciada por atividades

humanas e hbitos de vida. Isto particularmente importante para a exposio ao

radnio e seus filhos de meia-vida reduzida, onde ela fortemente dependente do local

onde um determinado grupo populacional est situado, do tipo de construo que

caracteriza sua moradia, o tipo de material utilizado na construo e da ventilao destas

construes (NRC, 1988).

Os principais efeitos na sade humana causadas pela intoxicao aguda por

Urnio (238U) so falncia renal, problemas de desenvolvimento, crescimento retardado

dos ossos, e danos no DNA (BRUGGE, 2005). O Radnio e seus produtos de

decaimento j foram reconhecidos como carcingenos pulmonares. Porem, as doses

para outros rgos e tecidos provenientes da inalao do radnio e seus produtos de

3

decaimento so baixas, pelo menos so de uma ordem de magnitude inferior s do

pulmo. Estudos epidemiolgicos disponveis at o momento apontam risco de

mortalidade por cncer de pulmo maior do que por quaisquer outras causas

(UNSCEAR, 2008). A energia das partculas alfa liberada pelos produtos de decaimento

do Po218 e do Po214 so depositadas nas clulas do epitlio respiratrio, sendo

consideradas as causadoras do cncer de pulmo associado exposio ao radnio.

(KREWSKI, 2005)

Vrios estudos em trabalhadores de minas subterrneas expostos a radnio e

seus produtos de decaimento tm demonstrado um aumento no risco de cncer de

pulmo, quando comparado com um grupo no exposto (NRC, 1988). A exposio ao

radnio universalmente reconhecida como a segunda causa de cncer de pulmo

depois do fumo. No entanto, o risco deste tipo de cncer para o pblico em geral ainda

era obtido atravs da extrapolao dos dados obtidos nos estudos em trabalhadores

mineiros, uma vez que os estudos epidemiolgicos de radnio em residncias no foram

capazes de demonstrar este risco. Somente recentemente, obtiveram-se evidncias

diretas deste risco atravs da anlise combinada de diversos estudos conduzidos na

Europa, Amrica do Norte e China (DARBY, 2005, KREWSKI, 2005, LUBIN, 2004)

4

1.2. Estudos em reas de radiatividade natural elevada no Brasil

Diversos trabalhos foram realizados no Brasil em reas ditas como de

radioatividade natural elevada, devido ocorrncia de Urnio (238U) e trio em

depsitos geolgicos, como areias monazticas e intruses vulcnicas alcalinas. Como

exemplo de algumas destas reas temos o planalto de Poos de Caldas, a cidade de

Guarapari, Meape, e Arax. (CULLEN, 1997, PENNA FRANCA, 1965, AMARAL,

1992)

VEIGA & KOIFMAN (2005), aps trs dcadas, avaliaram o padro de

mortalidade por cncer de algumas regies brasileiras ditas de radioatividade natural

elevada, como Poos de Caldas, Arax e Guarapari. Os resultados mostram que, para

Poos de Caldas e Guarapari, a mortalidade por cncer maior do que esperada, tendo

como base uma populao de referncia. Para Poos de Caldas, observou-se um

aumento significativo na mortalidade por cncer de estmago, pulmo, mama e

leucemia. Em relao a Guarapari, um aumento significativo na mortalidade foi

observado para cncer de esfago, estmago, pulmo e prstata, enquanto que para

Arax, nenhum excesso de bito por cncer foi observado. Os autores ressaltam que

estes resultados so importantes, uma vez que se desconhecia at ento o padro de

mortalidade por cncer destas regies. Com estes dados, no se pode negar a existncia

de um aumento na mortalidade por cncer em Poos de Caldas. No entanto, no se pode

associar este aumento com a exposio a radioatividade natural, uma vez que deve-se

levar em considerao os vrios fatores de risco associados ao cncer. Arax, que

5

reconhecidamente uma rea de radiatividade natural elevada, no apresentou excesso de

bitos.

O principal objetivo destes estudos foi caracterizar a regio do ponto de vista da

estimativa da exposio externa e contaminao interna, atravs da ingesto de

alimentos cultivados no local, e inalao de radnio, tornio e seus filhos. O nico

estudo que teve como objetivo avaliar possveis efeitos sade decorrentes da

exposio crnica radiao ionizante foi um estudo realizado na dcada de 70, que

realizou uma avaliao citogentica na populao residente em Guarapari. Este estudo

revelou que a freqncia de aberraes tipo cromossmicas (0.11) (dicntricos e anis

acntricos) na populao investigada aumentou significativamente quando comparada a

um grupo controle (0.06) (BRANDOM et al., 1978, BARCINSKI et al., 1975).

Embora a radiatividade natural em algumas destas regies apresentasse valores

mais elevados, as exposies a verificadas no eram representativas da exposio

mdia de toda a populao que vive nestes locais, uma vez que os nveis de

radiatividade mais elevados, geralmente, restringem-se s reas prximas s anomalias

geolgicas. Estudos questionam a classificao das reas Brasileiras de Radioatividade

Natural Elevada, tendo em vista que este tipo equivocado de classificao pode levar a

um sentimento de radiofobia na populao e a uma associao equivocada com casos de

cncer, m-formao congnita e outros agravos sade (VEIGA, 2007)

6

1.3. O municpio de Monte Alegre, PA

O municpio de Monte Alegre, localizado no Estado do Par, um dos mais

antigos povoamentos da Amaznia. Possui uma populao estimada de cerca de 68.000

pessoas numa rea de aproximadamente 21.703 km2.

Desde 1977, levantamentos radiomtricos e caracterizaes geolgicas

realizadas pela Companhia de Pesquisas de Recursos Naturais (CPRM), rgo do

Ministrio das Minas e Energia, revelaram ocorrncias de Urnio (238U) na rea do

Domo de Monte Alegre (PASTANA, 1999).

Trabalhos desenvolvidos pela extinta Nuclebrs, atual Indstrias Nucleares

Brasileiras (INB), em Monte Alegre revelaram anomalias de Urnio (U3O8) no membro

Barreirinha e em sedimentos de corrente na rea do Domo. A presena dessa ocorrncia

uranfera foi investigada pela INB com o objetivo de avaliar a viabilidade econmica

para explorao desse depsito. No entanto, a radioatividade das rochas passou a

constituir um problema para a populao de Monte Alegre, principalmente na vila

Ingls de Souza, a partir do momento em que o material radiativo comeou a ser

utilizado, indevidamente, na construo civil, no revestimento interno de residncias,

pavimentao de caladas e ruas.

7

Em 1995, equipes de gelogos e geofsicos da Universidade Federal do Par

(UFPA) iniciaram um projeto para investigar os nveis de radioatividade natural na

cidade. Medidas cintilomtricas (medies da radioatividade com aparelho denominado

cintilmetro) foram realizadas em cerca de 1.600 residncias e instituies pblicas da

cidade de Monte Alegre. Os valores reportados (300 a 2.000 cps) superaram o valor

mdio de background (100 a 200 cps).

No mesmo ano da realizao destas medidas, a equipe da UFPA solicitou a

colaborao da CNEN para investigar um possvel aumento da exposio

radioatividade natural da populao de Monte Alegre. Um grupo de tcnicos da CNEN

realizou amplo levantamento dos nveis de exposio ao radnio, nas residncias de

Monte Alegre e de Ingls de Souza. Os resultados deste estudo mostraram que das 33

residncias monitoradas na cidade de Monte Alegre, a concentrao mdia de radnio

no ar foi de 75 Bq/m3, variando de 22 a 188 Bq/m3. Na regio de Ingls de Souza, a

mdia de concentrao de atividade de radnio nas 19 residncias monitoradas foi de

116 Bq/m3, variando de 40 a 338 Bq/m3 (MELO, 1992).

Embora a radioatividade natural em Monte Alegre (mdia de 227 Bq/m3 nas

residncias) seja compatvel com os nveis encontrados em outras cidades do Brasil e do

mundo, no havia nenhum estudo que tivesse avaliado a incidncia de cncer na regio,

apenas rumores que refletiam o sentimento da populao, mantendo a idia de que os

habitantes vm sendo vtimas fatais da radiao.

8

1.4. Efeitos sade decorrentes da exposio radiao ionizante

O cncer um efeito importante associado exposio radiao, tendo em

vista os resultados dos estudos provenientes dos sobreviventes da bomba atmica,

exposies mdicas e exposies resultantes de acidentes e testes nucleares. Estes

estudos tm demonstrado claramente uma forte associao da exposio radiao

ionizante em altas doses bem como altas taxas de dose com o desenvolvimento de

vrios tipos de cncer. RON (1999) classificou os diferentes tipos de cncer, de acordo

com o nvel de associao com a exposio radiao, em definitivo, provvel, possvel

e apresentando poucas evidncias.

Os tipos de cncer que apresentam um nvel de associao definitivo com a

radiao so: cncer de tiride, pulmo, mama feminina e leucemias mielocticas. Os

que apresentam provveis evidncias so: glndulas salivares, estmago, clon, bexiga,

ovrio, pele; aqueles com possvel nvel de associao: cncer de fgado esfago,

mieloma mltiplo, linfoma no-Hodgkin; e finalmente, aqueles que possuem poucas

evidncias de associao com a radiao so: leucemia linfoctica crnica, pncreas,

doena de Hodgkin, cncer de prstrata, testculo e colo uterino.

9

1.5. Aberraes cromossmicas como eventos preditores do risco de cncer

Entre todos os biomarcadores relacionados a exposies ambientais e seus

efeitos biolgicos, as aberraes cromossmicas so considerados bons biomarcadores

como preditores do risco de cncer (PERERA, 2000, BONASSI, 2008). A anlise

combinada dos dados de duas coortes prospectivas (nrdica e italiana), envolvendo

3541 pessoas encontrou uma associao significativa entre a freqncia de aberraes

cromossmicas e o risco de cncer. Na coorte Nrdica, a razo de mortalidade

padronizada por idade (SMR) para cncer entre os membros da coorte com maior

freqncia de aberraes cromossmicas, foi de 1,53 (95% CI=1,13-2,05), comparado

com um valor de SMR de 2,01 (95% CI=1,35-2,89) na coorte italiana (HAGMAR

1998).

Na coorte italiana, o risco de cncer dos sujeitos com alta freqncia de

aberraes cromossmicas foi maior para os cnceres hematolgicos do que para todos

os outros cnceres: um valor de SMR de 5.49 (95% CI=1,49-140,5) foi calculado para

cnceres linfticos e hematolgicos.

A contagem do nmero de aberraes cromossmicas instveis (dicntricos,

anis, acntricos) utilizada para a reconstruo da dose em indivduos expostos a uma

dose aguda de radiao ionizante de baixa transferncia linear de energia

(BAUCHINGER 1998) . Entretanto, a utilizao da anlise citogentica para estimativa

da dose no vista como um mtodo confivel para casos de doses fracionadas,

10

principalmente em situaes de exposio de corpo no-uniforme que o caso da

exposio radnio. Por outro lado, fato estabelecido que populaes

ocupacionalmente expostas ao radnio apresentam uma alta freqncia de aberraes

cromossmica instveis que grupos controle (POHL-RULING & FISCHER 1979;

BRANDOM 1978, BILBAN 1998, SRAM 1993, BRANDOM 1972). Dados sobre

efeitos a longo prazo do aumento de aberraes cromossmicas em indivduos expostos

ao radnio so escassos. BRANDON et al, (1978) e POPP et al, (2000), mencionam

que em grupos de mineiros com uma alta freqncia de aberraes cromossmicas,

alguns biomarcadores de efeito precoce para cncer de pulmo tendem a estar

aumentados. SMERHOVSKY et al, (2002) testaram a associao entre freqncia de

aberraes cromossmicas e subseqente risco de cncer em uma coorte retrospectiva

de mineiros com conhecida exposio ao radnio e conhecido resultado de anlise

citogentica. Os resultados do estudo apontaram, atravs do modelo de regresso de

Cox que levou em considerao a idade na poca da anlise citogentica, a exposio ao

radnio e o fumo, para uma forte associao estatisticamente significativa entre a

incidncia de cncer e a freqncia de aberraes cromossmicas.

Os resultados dos estudos citogenticos nas reas de radioatividade natural

elevada so contraditrios. HAYATA et al (2004) analisaram a freqncia de

aberraes cromossmicas de residentes de uma rea de radioatividade natural elevada

(ARNE) em Guangdong, China e comparou com os resultados obtidos em residentes de

uma rea controle. Uma mdia de 2600 clulas por individuo foram analisadas. 27

adultos e 6 crianas na ARNE e 25 adultos e 8 crianas na rea controle. Os autores

relataram um aumento na freqncia de dicntricos e anis em residentes da ARNE,

onde o nvel de radiao natural 3 a 5 vezes maior que na rea controle, mas no

11

encontraram um aumento na freqncia de translocaes na ARNE, estando dentro da

faixa de variao individual dos controles.

Por outro lado, estudos citogenticos realizados em Ramsar no Ir, conhecida

como uma rea de radiao natural elevada onde se observa a maior dose de radiao

natural (maior que 100 mSv ano-1), no mostraram diferenas significativas entre

residentes da ARNE comparado com residentes de reas normais. Ensaios in vitro onde

uma dose aguda de 1,5 Gy de radiao gama foi realizada nos linfcitos dos residentes

das ARNE e da rea controle. A freqncia de aberraes cromossmicas induzida foi

significativamente menor nos residentes da ARNE quando comparada com a rea

controle. Especificamente, os habitantes da ARNE tiveram cerca de 56% do nmero

mdio de aberraes cromossmicas induzidas dos habitantes da rea de radiao

normal aps e exposio dose aguda. Os autores sugerem que a menor freqncia de

aberraes induzidas pela dose aguda de radiao nos residentes de ARNE possa ser

uma resposta adaptativa provocada pela exposio crnica a radiao ionizante

(GHIASSE-NEJAD 2002).

Devido aos problemas econmicos e sociais causados ao municpio de Monte

Alegre, a respeito dos riscos da exposio `a radiao ionizante, amplamente explorados

pela imprensa local e nacional, o Ministrio da Sade atravs do Conselho Nacional de

Desenvolvimento Cientfico e Tecnolgico (CNPQ) fomentou o desenvolvimento de

investigaes na regio. Os objetivos de tais investigaes contemplam realizar uma

ampla caracterizao radiolgica nas reas urbanas e rurais, assim como uma avaliao

12

epidemiolgica, incluindo o estudo de biomarcadores genticos em residentes do

Municpio de Monte Alegre.

Com isso o presente estudo contribuir para traar um perfil epidemiolgico da

regio de Monte Alegre e responder de forma emprica, questionamentos que so

apenas sugestivos aos possveis efeitos `a sade decorrentes desta exposio.

13

2. OBJETIVO GERAL

Caracterizao genotpica e avaliao da freqncia dos indivduos da populao

de Monte Alegre quanto a instabilidade cromossmica.

2.1. Objetivo especfico

Avaliar a freqncia de aberrao cromossmica de um grupo populacional com

maior exposio ao Radnio em relao a um grupo controle com menor exposio,

residentes em Monte Alegre PA.

Avaliar a relao entre a freqncia de aberraes tipo cromossmicas e a

presena de polimorfismos em genes de reparo de DNA no mesmo grupo de estudo.

14

3. FUNDAMENTOS TERICOS

3.1. Linfcitos Humanos

As clulas mais prontamente e acessveis para fazer uma anlise cromossmica

em grande escala, que so capazes de crescer e se dividir rapidamente em cultura, so os

linfcitos perifricos humanos (LPHs), especificamente os linfcitos T.

Os LPHs representam uma populao de clulas que esto predominantemente

na fase pr-sinttica do DNA do ciclo celular (fase Go). Somente 0.2% ou menos dos

LPHs esto inseridos no ciclo celular, estes provavelmente provem do grupo de clulas

linfides grandes que representam linfcitos estimulados ou clulas plasmas maduras.

As clulas deste grupo podem resultar numa mitose rara ocasionalmente encontrada no

sangue perifrico.

A estimativa do numero total de linfcitos em jovens de aproximadamente 500

x 109 . Somente 2% ( 10 x109 ) destes esto presentes no sangue perifrico e os outros

geralmente esto distribudos nos outros tecidos, com concentraes particulares no

timu, linfonodos, tonsinas, tecido linftico do intestino, bao e na medula ssea. O

tempo de vida dos linfcitos varia e a definio deste tempo pode significar que a clula

morre ou se divide (AIRES, 1999).

15

Para interpretar as aberraes cromossmicas induzidas in vivo em humanos,

de extrema importncia que a maior parte dos linfcitos perifricos pertenam ao

grupo de redistribuio. Ou seja, os linfcitos devem ter deixado o sangue perifrico,

passado pelo bao, os linfonodos e outros tecidos, e voltar para circulao. A media de

tempo que um linfcito do grupo de redistribuio fica no sangue perifrico mais ou

menos 30 minutos. estimado que aproximadamente 80%, ou seja, 400 x 109 linfcitos,

pertencem ao grupo de redistribuio e que o tempo geral de circulao de 12 horas.

Isto significa que os linfcitos com aberraes cromossmicas que foram induzidos a

qualquer parte do corpo esto presentes no sangue perifrico. Assim, com a anlise de

linfcitos, no s as aberraes cromossmicas que foram induzidas nos linfcitos do

sangue perifrico podem ser detectadas, como tambm aquelas que foram induzidas nos

linfcitos distribudos pelo corpo em rgos diferentes (BOGEN, 1993).

3.2. Estrutura cromossmica

3.2.1. Compactao da Cromatina

Todos os organismos eucariticos apresentam formas elaboradas de compactar

seu DNA em cromossomos. Este feito notvel de compactao realizado por protenas

que enrolam e dobram o DNA em nveis cada vez mais altos de organizao. Estas

protenas so divididas em duas classes gerais: as histonas e as protenas cromossmicas

no-histonas que no so to bem caracterizadas, mas que parecem ser cruciais para o

estabelecimento de um ambiente apropriado para garantir o comportamento normal dos

16

cromossomos e a expresso apropriada dos genes. O envolvimento de tais estruturas

internas na formao das aberraes cromossmicas ainda no foram elucidadas.O

complexo das duas classes de protenas com o DNA nuclear chamado de um

nucleossomo, que a unidade estrutural bsica da cromatina. A associao do DNA e

histonas formando o nucleossomo j foi demonstrada com detalhes significativos,

embora a associao das protenas no-histonicas com o nucleossomo ainda no tenha

sido compreendida completamente. As estruturas internas tambm podem ser

identificadas, como regies coradas pela prata, sob luz do microscpio, quando o

cromossomo est em diferentes estgios mitticos (PAULSON 1977, CREMER 1996).

Um modelo simples da organizao do cromossomo em metfase est representado na

figura 1 .

3.2.2. Caritipo Humano

Com exceo das clulas da linhagem germinativa, todas as clulas que

contribuem para o nosso corpo so chamadas de clulas somticas. Os 46 cromossomos

das clulas somticas humanas constituem 23 pares. Destes 23 pares, 22 so similares

em homens e mulheres e so chamados de autossomos, numerados em ordem

decrescente do maior (cromossomo 1) at o menor (cromossomo 21 e 22). O par

restante constitui os cromossomos sexuais (NUSSBAUM 2002). O Caritipo do homem

est ilustrado na figura 2.

17

Figura 1. Modelo de compactao da cromatina. Esta ilustrao esquemtica mostra algumas das muitas ordens de compactao da cromatina, postuladas para explicar a estrutura altamente condensada do cromossomo mittico.

18

.

Figura 2. Ilustrao esquemtica do caritipo humano.

19

3.2.3. Ciclo Celular

As informaes importantes sobre os efeitos clastogenicos dos agentes qumicos

e fsicos nas clulas interfsicas podem ser obtidos atravs da anlise de cromossomos

no momento da diviso celular (chamada mitose para clulas somticas). As clulas

somticas de interesse para a dosimetria Biolgica so os linfcitos perifricos. Essa

diviso possui fases que podem ser identificadas pela aparncia e funo. Durante a

mitose, fases como prfase, metfase, anfase e telfase so distinguidas. Na interfase,

o material cromossmico duplica (isto , DNA e protena associada). Isto chamado a

fase `S` (sntese) e precedida pela fase G1 (intervalo pr-sinttico) e seguida pela G2

(intervalo ps-sintetico) inserida na interfase. Nas clulas que no esto participando do

ciclo, por exemplo linfcitos perifricos, a clula permanece Go (fase estacionria)

(NUSSBAUM 2002).

A interfase metabolicamente a fase mais ativa do ciclo celular, e a maioria das

reaes no ncleo que requerem energia acontecem nesta fase. A durao de cada fase

da clula varia de acordo com tipo celular e as condies de crescimento. Nos linfcitos,

o primeiro ciclo celular depois da estimulao quase sincronizado e estas clulas so

convenientes principalmente nos estudos radiobiolgicos. Clulas em cultura de

mamferos, no so sincronizadas, porem podem ser levadas a sincronia por tcnicas

variadas. A sensibilidade das diferentes fases do ciclo celular variam na resposta `a ao

de agentes qumicos ou radiolgicos, e os tipos de aberraes cromossmicas

produzidas variam dependendo da fase em que foram tratadas. Assim, em estudos como

20

estes importante analisar uma populao de clulas sincronizada (no mesmo estagio,

ex. metfase), ou no mnimo ter uma estimativa das propores das clulas nas

diferentes fases presentes no tempo de tratamento (CARRANO 1975).

3.3. Alteraes cromossmicas induzidas pela radiao

Nos anos 30, quando a organizao cromossmica asssim como a importncia

do DNA na estrutura cromossmica ainda no era compreendida, Sax em 1940, props

a teoria geral para produo de aberrao cromossmica pela radiao ionizante, que

foi nomeada a teoria `breakage first`. Esta indicou que a radiao ionizante induz

quebras nos cromossomos das quais a maioria so restitudas (reparadas), porem

algumas permanecem abertas (no reparadas) e algumas voltam a juntar-se com outra

quebra (erro de reparo). Essa teoria amplamente aceita at hoje, sendo que a

frequncia desses eventos pode variar de acordo com outros fatores, como pr-

disposio gentica, hbitos de vida e fatores ambientais. Uma teoria alternativa ,

chamada teoria `contact first` presume que as trocas das cromtides ocorrem em

regies pr determinadas que esto prximas no tempo de radiao, e uma falha na

formao da troca aumenta os fragmentos (SAX 1941, REVELL 1955). Em 1960 foi

demonstrado que os cromossomos se duplicam durante a interfase e o ciclo celular

pode ser dividido em G1, S, G2 e M. A radiao ionizante induz aberraes tipo

cromossmicas em G1, as aberraes tipo cromatidicas em G2 e uma mistura destes

dois tipos na fase S. A maioria dos mutagnicos qumicos e UVC induzem aberraes

21

tipo cromatidicas em todos os estgios do ciclo celular (inclusive na prxima diviso)

indicando que as leses induzidas por estes agentes requerem a interveno da fase S

para gerar aberraes (EVANS 1963). Baseado nessas informaes, os agentes de

quebra cromossmicas (clastogenicos) podem ser amplamente classificados como S

independente (radiao ionizante) e S dependente (UVC, agentes oxidantes) (

referencia). BENDER et al. 1974, props um modelo geral para explicar a formao de

aberrao cromossmica por todos os tipos de agentes, que sugere que toda aberrao

cromossmica surge pelo erro de reparo da quebra de fita dupla, e que esta quebra

induzida direta (radiao ionizante) ou indiretamente (UVC, agentes oxidantes) pelo

processo de reparo enzimtico (que pode converter leses de fita simples por quebra de

fita dupla). NATARAJAN et al. 2008 , produziram evidencias experimentais para

converso das leses de fita simples para quebra de fita dupla levando `as aberraes

cromossmicas.

A quebra de fita dupla uma leso no DNA potencialmente perigosa, pois no

h uma fita molde intacta para o reparo. Se essas leses no forem corrigidas ou tiver

um erro de reparo, rapidamente resultam em degradao dos cromossomos em

fragmentos menores, que poder resultar num rearranjo estrutural, formando uma

aberrao cromossmica (NATARAJAN, 2008). Estudos comprovam que a radiao

ionizante aumenta a instabilidade genomica em humanos, potencializando o

desenvolvimento de cncer (STREFFER, 2010).

22

3.4. Aberraes tipo cromossmicas

Como foi visto anteriormente, os rearranjos estruturais resultam de quebra

cromossmica, seguida de reconstituio em uma combinao anormal. A troca

cromossmica ocorre espontaneamente em uma frequncia baixa e tambm pode ser

induzida por agentes quebradores (clastognicos), tais como radiao ionizante,

algumas infeces virais e muitos agentes qumicos (AWA, 1986). A populao de

linfocito perifrico (clula utilizada no presente estudo) que estimulado

mitogenicamente normalmente se encontra na fase Go (fase estacionria em G1) do

ciclo celular. Consequentemente as aberraes cromossomicas induzidas pela radiao

sero do tipo cromossomico, ou seja, envolvem ambas cromatides do cromossomo. J

se sabe que a radiao ionizante um clastgeno S independente, diferente da radiao

UV e agentes qumicos que so S dependentes. Ento, com a radiao ionizante, as

aberraes tipo cromossomicas e cromatidicas so induzidas nas clulas Go/G1 e G2/S

respectivamente. No entanto, UV e agentes qumicos induzem somente as aberraes

tipo cromatidicas em todas as fases do ciclo celular. Se as aberraes tipo cromatidicas

forem observadas em clulas G0/g1 que foram expostas a radiao ionizante, pode se

presumir que estas no foram induzidas pela radiao ou j passaram por um segundo

ciclo celular in vitro. Algumas aberraes cromossomicas so estveis, capazes de

passar inalteradas por divises celulares mitticas e meiticas, enquanto outros so

instveis. Para ser estvel, um cromossomo rearranjado deve ter elementos estruturais

normais, incluindo um centrmero funcional e dois telmeros. (NATARAJAN, 2002;

ROMM, 2009)

23

3.4.1. Aberraes instveis

Dicntrico

O Dicntrico (figura 3) a aberrao principal usada para biodosimetria. uma

troca entre as peas centromricas de dois cromossomos quebrados, a qual em sua

forma completa acompanhada por um fragmento composto das peas acntricas destes

cromossomos. Particularmente aps doses altas, configuraes multicentricas podem

formar-se. Tricentricos so acompanhados por dois fragamentos, quadricentricos por

trs fragmentos, etc. Existem algumas vantagens para utilizar a anlise de dicentrico

como indicador de radiao ionizante, estas so: baixo nvel background; especifico

para radiao ionizante; rpida avaliao para dose estimada; boa reprodutibilidade e etc

(ROMM 2009).

Anis cntricos

Em linfcitos humanos, os anis cntricos so muito mais raros que os

dicntricos. Alguns pesquisadores os combinam com os dicntricos enquanto outros

escolhem por ignora-los para estimativa de dose. O anel cromossmico uma troca

24

entre duas quebras em braos separados do mesmo cromossomo tambm

acompanhado de um fragmento acntrico (figura 3).

Acntricos

Aberraes acntricas podem ser formadas independentemente das trocas

descritas acima e normalmente se refere a elas acntricos excesso. Elas podem ser

terminais, ou delees intersticial de vrios tamanhos mas no sempre possvel

determinar sua origem e, ento, so combinadas (figura 3) (NUSSBAUM, 2002).

25

Figura 3. Dois cromossomos dicntricos e um anel cntrico com seus fragmentos acntricos associados (colorao Giemsa).

26

3.5.Vias de reparo de DNA de interesse

As vias de reparo de DNA so necessrias para manter a estabilidade genmica e

garantir a sobrevivncia do organismo, frente aos efeitos deletrios causados por fatores

endgenos e exgenos (LIMA, et al 2001). As quebras duplas e simples das fitas

podem ser formadas direta e/ou indiretamente em resposta ao de agentes endgenos

e exgenos, tais como radiao ionizante (DRISCOLL e JEGGO, 2006). Uma vez que o

dano seja localizado, molculas especficas de reparo de DNA so enviadas ao local e se

ligam regio ou nas proximidades do local do dano, incluindo outras molculas para

ligar e formar um complexo que habilita o reparo a agir no local. Se a taxa de danos no

DNA exceder a capacidade da clula em repar-los, o acmulo de erros pode subjugar a

clula e resultar em senescncia, apoptose ou cncer (VODICKA et al, 2004).

A presena de polimorfismos genticos em genes relacionados a manuteno da

estabilidade do genoma pode influenciar na variao individual da capacidade de reparo

do material gentico. Desta forma, a presena de polimorfismos pode estar associado a

um maior risco de desenvolver o cncer (BERWICK, 2000, MOCELLIN, 2009,

ZIENOLDINNY, 2006).

Os principais mecanismos de reparo podem ser divididos em : MMR (MisMatch

Repair), BER (Base excision repair), NER (Nucleotide excision repair), Reparo por

Recombinao Homloga alm do NHEJ (Non-Homologous End-Joining ) que so

geralmente conhecidos como unio terminal no-homloga (HOEIJIMAKERS, 2001).

27

3.5.1. Reparo por exciso de bases (BER)

O reparo BER (Base Excision Repair ou reparo de exciso de bases) lida com

danos em bases individuais realizando o reparo de leses geralmente ocasionadas por

processos oxidativos. Esse tipo de reparo tem incio com a ao de DNA glicosilases

que reconhecem e removem bases lesadas da cadeia do DNA pela quebra da ligao N-

glicosil, a qual mantm a base nitrogenada associada com o esqueleto de acar-fosfato

(FRIEDBERG et al., 1995). A maioria das DNA glicosilases reconhecem leses

especficas como a adenina metilada na posio 3 (STEINUM & SEEBERG, 1986) ou a

8-hidroxiguanina (BOITEAUX et al.,1992).

.

Aps a retirada da base lesada gera-se no DNA um stio apurnico ou

apirimidnico (AP) que ser reparado por AP endonucleases (DOETSCH &

CUNNINGHAM, 1990). Os stios AP tambm podem ser gerados por hidrlise natural

do DNA. As AP endonucleases geralmente so conhecidas por realizarem a quebra do

esqueleto acar-fosfato na regio 5 deste. O resultado dessa quebra gera duas

terminaes: uma 3-OH e outra 5-fosfato-desoxirribose. Essa etapa realizada pela

enzima DNA desoxirribo-fosfodiesterase (dRpase), para que uma DNA polimerase

possa reconhecer e complementar a lacuna gerada pela retirada do nucleotdeo

(FRIEDBERGE et al.,1995).

O gene hOGG1 chamado de 8-oxoguanine DNA glycosylase (Homo sapiens).

Seu produto (DNA glicosilase/AP liase) catalisa a exciso da base modificada do DNA,

28

8-hidroxiguanina (8-oxoG), durante o processo de reparao por exciso de bases

(BOITEUX e RADICELLA, 2000). Essa leso surge como resultado da exposio do

DNA a espcies reativas de oxignio (ERO) e radiao ionizante. Trata-se de uma

leso extremamente mutagnica levando a transverses GC--TA (SHINMURA e

YOKODA, 2001).

A enzima hOGG1 relacionada ao reparo por exciso de uma base, uma pea

fundamental no sistema de preveno de danos oxidativos e o gene hOGG1 tem sido

alvo de estudos j que possvel admitir que clulas sem o alelo funcional desse gene

mostraram um fentipo distinto, podendo, a partir desse, iniciar ou acelerar o processo

carcinognico (SHINMURA e YOKODA, 2001).

O gene XRCC1 (X-ray repair cross complementing group 1) um dos mais de

20 genes que participam da via de reparo por exciso de bases (BER). Ele codifica uma

protena cuja funo auxiliar na reparao de quebras de fita dupla, que so as leses

de DNA mais comuns (THOMPSON,2000). Evidncias biolgicas e bioqumicas

indicam que XRCC1 interage com um complexo de protenas de reparo de DNA,

incluindo a poli(ADP-ribose) polimerase (Parp), a DNA ligase-3 e a DNA polimerase-

(CALDENOTT, 1995). H aproximadamente oito diferentes Polimorfismos de

Nucleotdeo nico (em ingls, SNP) em XRCC1, trs dos quais so comuns e levam

substituio de aminocidos nos cdons 194 (exon 6, base C para T, aminocido Arg

para Trp), 280 (exon 9, base G para A, aminocido Arg para His) e 399 (exon 10, base

G para A, aminocido Arg para Gln) (http://egp.gs.washington.edu). Por ser localizado

em uma regio dentro do domnio de interao com a poli (ADP-ribose) polimerase, o

29

polimorfismo Arg399Gln tem sido intensamente investigado, tanto por sua funo como

por sua associao com o risco de cncer. A presena do alelo variante Gln399 mostrou

estar associado a uma reduzida capacidade de reparo de DNA, sendo avaliada pela

persistncia de adutos no DNA, elevados nveis de troca de cromtides irms, mutaes

em p53 e atraso prolongado do ciclo celular (SHEN, 1998).

3.5.2. Reparo por exciso de nucleotdeos (NER)

Muitas vezes, o reparo por exciso de bases (BER) insuficiente para lidar com

certos tipos de danos de DNA, dessa forma, o reparo por exciso de nucleotdeos (NER)

age como uma via alternativa para o reparo. NER tem sido um dos sistemas de reparo

mais estudados em humanos, o qual reconhece os danos baseando-se na estrutura

anormal da dupla hlice, assim como da estrutura qumica (LIEBERLING, 2006).

Este reparo consiste em um mltiplo processo, no qual as leses de DNA so

reconhecidas e demarcadas atravs do desenovelamento da dupla hlice. Em seguida,

um trecho de aproximadamente 28 pares de base (pb) de DNA contendo o

oligonucleotdeo danificado retirado. A lacuna formada preenchida usando-se como

molde o DNA no danificado da outra fita (HASHIMOTO, 2009). As consequncias de

um NER defeituoso so demonstradas por trs sndromes recessivas e autossmicas:

xeroderma pigmentosum D (XPD), Sndrome de Cockayne (SC) e tricotiodistrofia

(TTD). Os pacientes com XPD demonstram uma severa sensibilidade ao sol,

30

apresentando sardas e cncer de pele ainda durante a infncia. Pacientes com SC

tambm apresentam sensibilidade ao sol, severas anormalidades neurolgicas e

nanismo. Indivduos com TTD apresentam deficincia de enxofre nos cabelos e nas

unhas, o que resulta em seu estado quebradio. Alm disso, esses pacientes apresentam

atraso no crescimento e retardo mental, assim como fotossensibilidade cutnea, embora

sem predisposio ao cncer (STARY, 2002).

A protena XPD, tambm chamada ERCC2 (Excision Repair Cross-

complementing Group 2), um componente chave da maquinaria responsvel por NER

e pelo reparo acoplado transcrio (RAT) de DNAs danificados (BECK, 2008). XPD

uma helicase que funciona como uma subunidade do complexo de transcrio TFIH.

Ela promove a formao de uma bolha no sitio de DNA onde se encontra o dano,

gerando o desnovelamento do DNA como preparao para os passos subseqentes

(WU, 2009). Para isto, XPD assume uma conformao apropriada para interagir com o

DNA e com outros componentes do complexo TFIH. O domnio C-terminal de XPD o

stio de interao com a protena ativadora do complexo TFIH (LEHMANN, 2008).

neste domnio onde ocorre um dos mais comuns SNPs, o qual resulta na substituio do

aminocido Glutamina (Gln) pela Lisina (Lys) no resduo 751(BENHAMOU, 2005).

Embora os dados ainda sejam inconsistentes, evidncias epidemiolgicas e

experimentais sugerem que o polimorfismo em XPD pode alterar a capacidade de

reparo de DNA e o risco de cncer. Dessa forma, teoricamente possvel que esse

polimorfismo seja responsvel por alterar a estrutura do domnio C-terminal e

31

conseqentemente a funo da protena XPD, perturbando a interaes protena-

protena e seu papel no reparo de DNA.

3.5.3. Recombinao Homloga

Esse tipo de reparo consiste em um processo de rearranjo fsico que ocorre entre

duas cadeias de DNA. considerada como um tipo de recombinao gentica que

envolve o alinhamento de sequncias similares, formao de uma juno de Holliday

(juno mvel de quatro cadeias de DNA) alm de quebra e reparo, conhecido como

resposta do DNA para produzir troca de material entre cadeias. A recombinao

homloga constitui uma das vias de reparo de fitas de quebra dupla causadas pela RI,

assim como por inibidores de topoizomerase II, na qual so utilizadas como molde as

sequncias homlogas das cromtides irms (OLIVEIRA, 2006).

O gene X-Ray Repair Cross Complementing 3 (XRCC3) codifica uma protena

que est relacionada via de reparo por recombinao homologa. A protena XRCC3

interage com RAD-51 formando um filamento de nucleoprotena que permitir o

alinhamento de regies homlogas de DNA para o reparo (HOEIJMAKERS, 2001;

CHRISTMANN et al., 2003).

32

4. METODOLOGIA

O projeto da pesquisa foi elaborado segundo as normas dispostas na Resoluo

196/96 do Conselho Nacional de tica em Pesquisa, tendo sido submetido e aprovado

pelo Comit de tica em Pesquisa da Escola Nacional de Sade Pblica, Fiocruz. Este

projeto teve suporte financeiro do Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientfico e

Tecnolgico CNPq atravs do edital MCT-CNPq/MS-SCTIE-DECIT/CT-Sade N

24/2006 e da Comisso Nacional de Energia Nuclear - CNEN atravs da concesso de

bolsa de Mestrado.

4.1. rea de Estudo: Monte Alegre

O municpio de Monte Alegre apresenta as seguintes coordenadas geogrficas:

02 00' 15"S e 54 04' 45"W Gr (figura 4). Possui uma populao de 63.543 pessoas

numa rea de aproximadamente 21.703 km2 (IBGE, 2008).

33

Figura 4. Mapa da Regio norte abrangendo Monte Alegre e cidades prximas

34

4.2. Escolha dos indivduos

De acordo com a distribuio dos dados obtidos na caracterizao radiolgica

ambiental e no clculo de dose, foram utilizados os valores dos tercis desta distribuio

para comparar os residentes de domiclios com maior (3o tercil) e menor (1o tercil)

exposio radiao.

De acordo com o numero de domiclios em cada tercil, foi selecionado o maior

nmero possvel de residentes para a avaliao de freqncias de aberraes

cromossmicas. Os critrios de incluso no estudo citogentico sero: a) ter mais de 14

anos; b) no ter diagnstico de cncer; c) estar residindo no mesmo local por pelo

menos 5 anos; d) No ter sido exposto exames radiolgicos nos ltimos 3 meses. Cada

participante elegvel assinar um termo de consentimento para a pesquisa e responder

a um questionrio onde sero obtidas informaes pessoais, tempo de residncia,

hbitos de fumo e, consumo de lcool, uso de medicamentos).

35

4.3. Coleta das amostras

Para o presente estudo, foram coletados 10 ml de sangue venoso, em tubo

vacutainer estril contendo o anticoagulante heparina, de 85 indivduos distribudos

pela populao de Monte Alegre. As coletas foram realizadas em agosto de 2008, sendo

39 amostras de homens entre 15 e 78 anos e 46 amostras de mulheres entre 15 e 72 anos

de idade no domicilio de cada individuo.

4.4. Cultivo das clulas

A amostra de sangue de cada individuo foi cultivada em garrafas de cultura de 75

ml (previamente identificada com o cdigo da amostra), onde foram adicionados 2 ml

de sangue perifrico em 20 ml de meio para caritipo (RPMI 1640, HEPES, Soro fetal

bovino e Fitohemaglutinina) (Cultilab). A cultura foi incubada por 47 horas a 37C em

estufa umidificada e atmosfera de 5% de CO2.

36

4.5. Colheita e fixao das clulas

As clulas foram interrompidas na mitose na fase de metfase com a adio de

400 l da soluo de colchicina (0,16mg/ml) em seguida a cultura foi incubada a 370C

por mais 3 horas. Posteriormente a cultura foi transferida para um tubo de centrifuga de

50 ml (identificado com o cdigo da amostra) e centrifugada a 200 xg por 10 minutos `a

temperatura ambiente. Descartado o sobrenadante, foi adicionado a soluo hipotnica

(KCl 0,075M) previamente aquecida a 37C, at o volume de 32 ml, sob agitao

mecnica. Em seguida o tubo foi incubado a 37C por 20 minutos em banho Maria e

centrifugado a 200 xg por 10 minutos `a temperatura ambiente. Aps ter descartado o

sobrenadante, foi adicionado o fixador (3:1-metanol/cido actico) gelado, sob agitao

mecnica, gota a gota at completar 8 ml e depois completar rapidamente at o volume

de 32 ml. Os tubos foram mantidos em refrigerao a 4 C por 24 horas e centrifugados

a 600 xg por 3 minutos. Descartado o sobrenadante, foi adicionado o fixador at o

volume de 20 ml e os tubos foram centrifugados novamente a 600 xg por 3 minutos.

Aps repetir a lavagem, foi adicionado o fixador at o volume de 8 ml e os tubos

centifugados a 600 xg por 3 minutos. Em seguida foi descartado o sobrenadante e o

volume foi completado at 2 ml de fixador. Os tubos foram guardados a 20 C por 48

horas.

37

4.6. Preparo das laminas

As laminas foram previamente lavadas com extran 5% e mergulhadas no coplin

contendo uma soluo de etanol absoluto/acido clordrico (4:1). Aps 1 h, as laminas

foram lavadas e colocadas a 20 C por 10 minutos. Durante esse perodo, a suspenso

de clulas foram descongeladas e concentradas para 1 ml de soluo em um tubo de

centrifuga de 2 ml. Em seguida com auxilio da pipeta Pasteur foram pingadas de 2 a 3

gotas da amostra em cada lamina previamente mantida a 4 C. Aps secarem, as laminas

foram identificadas com o cdigo da amostra e guardadas na geladeira para anlise

posterior.

4.7. Colorao das laminas

As laminas escolhidas para anlise microscpica foram mergulhadas em coplin

pequeno contendo 50 ml de tampo fosfato (8,9 g de Na2HPO4.2H2O em 500 ml de

gua destilada + 6,9 g de NaH2PO4.H2O em 500 ml de gua destilada) e 1,5 ml de

soluo Giemsa, por 5 minutos. Em seguida, as laminas foram lavadas com gua

corrente.

38

4.8. Anlise microscpica

A varredura das laminas foi realizada pelo Microscpio semi automatizado

Zeiss Axioplan 2 e com auxilio do programa Zeiss Metafer, as imagens das metfases

foram capturadas com localizador automtico. Uma vez que as metfases foram

encontradas, cada uma foi analisada individualmente e manualmente. Para cada

indivduo 200 metfases foram contadas a fim de verificar a presena de aberraes

instveis tipo-cromossmicas (i.e. dicntricos, anis cntricos, e fragmentos acntricos)(

LLOYD 1981).

4.9. Purificao do DNA para RFLP

Foi coletada saliva dos mesmos indivduos estudados na analise citogenetica

para analise molecular. A coleta foi realizada atravs do Kit Oragene DNA Self-

Collection Kit da DNAGenotek. Foi realizada a coleta, preservao, transporte e

purificao do DNA.

Cada amostra de saliva contendo o material gentico foi incubada por 1 hora a

50C, para a desnaturao das protenas. Subsequentemente foram adicionados 20L do

39

purificador Oragene a 500L da amostra de saliva em um tubo Eppendorf utilizou-se o

vortex por cerca de 10 segundos para garantir a mistura da amostra com o purificador.

Em seguida essa mistura foi incubada no gelo por 10 min, para melhor eliminao das

impurezas. Aps o esfriamento, centrifugou-se 5 minutos a 13.000 rpm x g, onde o

sobrenadante foi usado enquanto que o pellet contendo impurezas foi descartado.

Adicionou-se 500L de etanol a 95% ao tubo para a precipitao do DNA, com durao

de 10 minutos para a visualizao da nuvem de DNA. Para a finalizao do processo,

as amostras foram centrifugadas por 2 min a 13.000 rpm e logo aps foi removido o

sobrenadante de cada amostra e adicionados 100L de gua milli-Q em cada tubo de

eppendorf ao pellet contendo o material de interesse para anlise molecular.

4.9.1. Quantificao de DNA

Neste processo foi determinada a quantidade de DNA baseada na absoro de

energia radiante (luz) utilizando-se o espectrofotmetro ThermoSpectronic Genesys 10

UV. As medies foram realizadas em 260nm, 280nm, pois no comprimento de onda de

260nm o DNA absorve luz e no de 280nm as protenas absorvem. Para cada amostra

analisada foram diludos 10L de DNA purificado para 90L de gua milli-Q em uma

cubeta. A concentrao de DNA em g /L foi determinada atravs do clculo A260 x 10

(fator de diluio) x 50 (fator de converso). Nesse sentido, a relao absorbncia de

260nm/280nm fornece um parmetro de qualidade do DNA, chamado de pureza. A

razo entre 1,8 e 2,2 considerada ideal. Valores inferiores a 1,8 indicam excesso de

40

protenas e valores superiores, excesso de solventes orgnicos. As amostras

apresentaram uma mdia de 1,7 para a razo de pureza, estando este valor prximo do

ideal para a anlise e uma mdia de DNA igual a 120g/L, tambm considerada

adequada, j que a quantidade ideal em torno de 100g/L (QUIAGEN, 2008).

4.9.2. Amplificao PCR

As reaes para a amplificao foram preparadas atravs do kit PCR Mastermix

da Promega contendo 50 unidades por mL de Taq Dna polimerase, 400M de: dATP,

dGTP, dCTP, dTTP e 3mM de MgCl2,. Adicionou-se a 12,5L (1X) do Kit, 2,5L de

primer R a concentrao de 10M e 2,5 de primer F tambm a 10M, mais a

quantidade de DNA e H2O de acordo com a quantidade encontrada de DNA em cada

amostra, totalizando, 25L de reao para a amplificao. Aps esse processo, cada

amostra foi colocada em condies fsicas especficas no total de 25 e 35 ciclos de

acordo com cada gene (Tabela 1). Os primers correspondentes a cada gene foram

selecionados de acordo com a regio de interesse onde ocorrem os polimorfismos

(Tabela 2).

41

Tabela 1 - Condies fsicas dos genes no processo de amplificao das amostras

Genes

Desnaturao

Inicial

Desnaturao

Anelamento

Extenso

Extenso

Final

Ciclos

XRCC1 94 oC / 4 94 oC/ 1 58oC/ 50 72oC/45 72oC/5 35

XPD 94 oC / 4 94 oC/ 1 65 oC/30 72oC/45 72oC/5 35

hOGG1 94 oC / 4 94 oC/ 30 60 oC/30 72oC/130 72 oC/5 25

P53 95 oC/ 5 95 oC/30 65 oC/1 72 oC/1 72 oC/5 35

XRCC3 94 oC / 4 94 oC/ 30 60 oC/30 72 oC/ 30 72 oC/5 25

Tabela 2 - Primers especficos de cada gene para a realizao do PCR

Locus Forward Primer Reverse Primer

XRCC1

5-TTGTGCTTTCTCTGTGTCCA-3

5-TCCTCCAGCCTTTTCTGATA-3

XPD

5-CCCCTCTCCCTTTCCCTCTGTT-3

5-GCTGCCTTCTCCTGCGATTA-3

p53

5`TTGCCGTCCCAAGCAATGGATGA

5`TCTGGGAAGGGACAGAAGATGAC 3

XRCC3 5`GCTCGCCTGGTGGTCATCGACTCG 5`AAGAGCACAGTCCAGGTCAGCTG-3

hOGG1 5`CCCAACCCCAGTGGATTCTCATTGC 5`GGTGCCCCATCTAGCCTTGCGGCCCTT-3

42

4.9.3. Polimorfismo no comprimento de fragmentos de Restrio - RFLP

O RFLP entendido por polimorfismo no comprimento de fragmentos obtidos

por corte da fita dupla de DNA, que evidenciado pela fragmentao do DNA atravs

do uso de enzimas de restrio. Para que o polimorfismo seja detectado, necessrio

que as sequncias de nucleotdeos nas fitas de DNA de dois ou mais indivduos

comparados sejam distintas. A tcnica baseia-se na hidrlise do DNA com enzimas de

restrio e posterior separao, por eletroforese, dos fragmentos gerados, que

correspondem a padres de restrio especficos. Alm disso, a tcnica de RFLP vem

sendo utilizada para rastreamento epidemiolgico (NAVEDA, 2001).

Os genes de interesse foram escolhidos segundo sua importncia para reparo de

danos no DNA (bases oxidadas, quebras simples e duplas de DNA) resultantes da

exposio s radiaes ionizantes. Os fragmentos dos genes amplificados foram

digeridos com as enzimas de restrio especificas de cada gene. Para o gene hOGG1

utilizamos a enzima SatI (Fnu4HI Fermentas-Brasil), que tem como regio de corte a

seguinte sequncia: 5'-GC NGC-3'. Para o gene p53 a enzima Bsh1236I (BstUI-

Fermentas-Brasil) com a sequncia para corte 5'-CGC G-3' e a enzima Hin1I(Hsp92II

Fermentas-Brasil) para o gene XRCC3 cortando em 5CATG 3. Cada enzima de

restrio especfica para cada regio de corte dos genes estudados (Tabela 3). Os

tamanhos diferentes dos fragmentos determinam o gentipo do indivduo (Tabela 4).

43

Tabela 3 - Genes e suas enzimas de restries correspondentes

Gene alvo Tipo de polimorfismo Enzima utilizada

XRCC1 Arg399Gln PCR-RFLP (MspI)

XPD Lys751Gln PCR-RFLP (PstI)

p53 Arg72Pro PCR-RFLP(BstUI)

XRCC3 Thr241Met PCR-RFLP(Hsp92II)

hOGG1 Ser326Cys PCR-RFLP(Fnu4HI)

Tabela 4 - Tamanho dos fragmentos de interesse aps o corte com cada enzima de

restrio

Genes alvos

RFLP Gentipo

XRCC1 615pb Gln-Gln

fdsf

221 e 374pb Arg-Arg

221,374 e 615pb Gln-Arg

XPD 272pb Lys-Lys

86 e 186pb Gln-Gln

86, 186 e 272pb Lys-Gln

p53 199bp Pro-Pro

113bp, 86bp Arg-Arg

199, 113 e 86bp Arg-Pro

XRCC3 335bp Thr-Thr

233, 102bp Met-Met

335, 233 e 102bp Thr-Met

hOGG1 213bp Ser-Ser

164 e 49bp Cys-Cys

213, 164 e 49bp Ser-Cys

44

5. RESULTADOS

As amostras foram classificadas de acordo com a mdia da dose (mSv/ano)

encontrada. O tercil com menor mdia foi classificado como tercil 1 e a maior mdia de

dose como tercil 3. As mdias das doses foram de 2,0151 e 4,1827 (mSv.year-1)

calculadas pela equipe da Fiocruz e IRD.

Uma anlise prvia de 2 lminas por individuo foi feita para os 85 indivduos,

para verificao a qualidade da amostra. Atravs dessa avaliao determinamos que

33% do material coletado, ou seja, amostras de 28 indivduos estavam em condies

adequadas para anlise quanto a freqncia de aberraes cromossmicas. Podemos

sugerir que essa deficincia nas amostras est associada ao processamento das mesmas,

a coleta, ao transporte, devido ao difcil acesso ao local das residncias e as causas

inerentes dos indivduos (ex. leucopenia).

Foram analisadas 6.177 metfases dos 28 indivduos dentre as quais foram

encontrados 4 cromossomos dicntricos e 19 fragmentos acntricos.

A tabela 5 apresenta os dados por indivduo com o nmero de metfases

analisadas e de aberraes cromossmicas instveis encontradas no grupo mais exposto

radiao (tercil 3) e no grupo menos exposto (tercil 1).

45

Tabela 5 . Metfases numero de clulas analisadas por individuo; Dic dicntrico; AC anel cntrico; A fragmento acntrico; Tercil 1- rea de exposio `a menor dose de radiao na regio; 2- rea de exposio `a maior dose de radiao na regio.

46

A freqncia de aberrao cromossmica encontrada por individuo e do grupo

estudado est dentro do intervalo dos valores de referencia para o background da

freqncia de dicentrico reportados, variando estes entre 0.09 e 2.99 por 1000 clulas

(ROMM 2009). Apesar do individuo 55 ter apresentado 3 dicntricos e 10 fragmentos

acntricos em uma clula (figura 5), nomeada pela literatura rogue cells, estudos

afirmam que esta ocorrncia no esta relacionada com radiao ionizante e ocorre

esporadicamente em humanos por diferentes fatores como uma infeco viral (AWA

1986). Embora outros trabalhos com rogue cells sugiram que a exposio crnica a

baixo nvel de radiao pode aumentar a susceptibilidade gentica para efeito

clastognico de algumas viroses (NEL,1998; ROZGAJ et al.,2002). No individuo 83

foi encontrado um dicntrico porem no podemos correlacionar esse evento somente

com a exposio a radiao, j que sabido na literatura que o valor mnimo de dose

equivalente, para ser detectado por aberraes tipo cromossmicas 0,1 Sv (LLOYD

1981). No podemos determinar a origem dos fragmentos acntricos quando isolados,

ou seja, no combinados a outra aberraes, como observado no individuo 38.

Podemos observar tambm que no houve correlao entre os indivduos

fumantes (87 e 93) com o aumento da freqncia de aberraes cromossmicas.

A tabela 6 apresenta os dados obtidos por indivduo com numero de aberrao

cromossmica e a presena ou no de polimorfismos nos alelos dos genes estudados.

Ao ser encontrado polimorfismo em um alelo, classificou-se esse grupo de pessoas

como sendo heterozigotos (Hetero). Quando h polimorfismo nos dois alelos, nomeou-

se homozigotos variantes (Homo var). No caso em que os dois alelos so normais (no

47

polimorficos), os indivduos foram classificados como Homo wt (homozigotos tipo

selvagem -wild type). O x representa amostras que no amplificaram pelo mtodo

PCR.

48

Figura 5. Rogue cell - Metfase com trs dicentricos e dez fragmentos (colorao Giemsa).

49

No. coleta Tercil

Ab. Cromo. XRCC1 HOGG1 XRCC3 P53 XPD

1 1 - hetero x x x homo wt 11 1 - hetero homo wt homo wt hetero hetero 12 1 - hetero homo wt homo wt hetero homo wt 14 1 - homo wt homo wt hetero homo wt homo wt 16 1 - homo wt homo wt homo wt homo wt hetero 20 1 - homo wt x x x homo wt 22 1 - homo var homo wt homo wt hetero hetero 35 1 - hetero x x x homo wt 36 1 - homo var homo wt homo wt hetero hetero 38 3 9 frag. homo var homo wt hetero homo wt homo wt 47 3 - hetero homo wt homo wt hetero hetero 48 3 - homo var homo wt homo wt homo wt hetero 49 1 - hetero homo wt homo wt homo wt homo wt 50 1 - homo var homo wt homo wt homo var hetero 51 1 - homo var homo wt homo wt homo var hetero 54 1 - homo var homo wt homo wt homo var hetero

55 1 3 dic.+ 10 frag. hetero homo var homo wt homo wt hetero

58 1 - hetero homo wt homo wt homo var hetero 75 3 - homo wt homo wt homo wt homo wt homo var 77 3 - hetero homo wt homo wt homo wt homo wt 82 3 - hetero homo wt homo wt homo var homo wt 83 3 1 dic. homo var homo wt homo wt hetero homo wt 84 3 - hetero x x x homo wt 85 3 - hetero x x x homo wt 87 3 - x hetero homo wt homo wt x 88 3 - x homo wt homo wt hetero homo wt 93 3 - homo wt hetero homo wt homo wt hetero 95 3 - homo wt homo wt homo wt homo var hetero

Tabela 6. Correlao entre os dados obtidos da analise citogentica e analise molecular dos indivduos de Monte Alegre (HOZUMI 2009, DUARTE 2010). Dic representa o numero de dicentrico e frag. o numero de fragmento encontrado por individuo.

50

6. DISCUSSO

O Radnio (222Rn) um gs radioativo da srie de decaimento do urnio, o qual

encontrado difuso em rochas. Em Monte Alegre, a maioria das casas so construdas por

rochas removidas da crosta terrestre nas florestas onde h reservas de urnio. A

concentrao do 222Rn dentro dessas casas varia entre 88 80 a 338 19 Bq m-3

(concentrao mdia 116 84 Bq m-3). Em outras reas na Amaznia a concentrao de

radnio encontrada dentro das casas foi consideravelmente mais baixa (28 3 Bq m-3;

MELO 1999).

A exposio domstica ao urnio e aos seus produtos de decaimento uma via

importante de contaminao humana. Estudos anteriores indicaram a possvel

associao entre casos de leucemia linfoctica aguda e exposio radiao gama em

indivduos que residiam em casas construdas com concreto contendo urnio na Sucia

(AXELSON 2002). Anlise de aberraes cromossmicas instveis em linfcitos

perifricos de moradores das casas com elevadas concentraes de 222Rn (>200 Bq m-3),

revelou um aumento estatisticamente significativo de aberraes tipo cromossmicas

(dicntricos) quando comparado aos indivduos controle (no expostos)

(BAUCHINGER et al. 1994; OESTREICHER et al. 2004). Estudos revelam que a

freqncia de aberraes cromossmicas instveis em linfcitos perifricos tem sido

aplicada como biomarcadores preditores da carcinogenese (NORPPA et al. 2004).

51

A ICRP 65 sugere que o nvel de interveno para reduzir os nveis de radnio nas

residncias s se justificar com concentraes superiores a 600 Bq.m-3 ou doses anuais

de 10 mSv. As doses encontradas em Monte Alegre variaram entre a menor dose de 3

mSv a maior dose de 8 mSv, sendo assim os valores medidos em Monte Alegre no

apresentariam riscos `a sade da populao pelo ponto de vista da proteo radiolgica,

segundo a ICRP. Porm, os efeitos citogenticos da exposio crnica `a baixos nveis

de radiao at hoje no esto claros (CHANG 1999, MILLER 2005). A exposio `a

dose de baixo nvel de radiao no influencia a sade humana diretamente; porm a

predisposio gentica encontrada em alguns indivduos contribui para o aumento da

radiossensiblidade dos mesmos, conseqentemente colabora com a instabilidade

gentica, e assim contribuindo para o desenvolvimento do cncer (MILACIC, 2004,

STREFFER, 2010).

Uma vez que reas com radiao natural de fundo alta, como apresentou

algumas residncias em Monte Alegre PA, tem a probabilidade da incidncia de

cncer, a utilizao de biomarcadores de efeitos assim como de exposio (aberraes

cromossmicas instveis) se torna uma importante ferramenta para avaliao

epidemiolgica.

Apesar de no encontrarmos um aumento na freqncia de aberraes

cromossmicas instveis no grupo estudado, os resultados dos estudos citogenticos

nas reas de radioatividade natural elevada so contraditrios. Estudos afirmam que

populaes ocupacionalmente expostas ao radnio apresentam uma freqncia de

aberraes cromossmicas instveis significativamente maior que em grupos controle

52

(POHL-RULING & FISCHER, 1979, BRANDOM et al, 1978, BILBAN et al, 1998,

SRAM et al, 1993, BRANDOM et al, 1972). Por outro lado, estudos relataram que a

freqncia de aberraes cromossmicas induzidas pela radiao foi menor do que `as

encontradas nas reas de controle (GHIASSE-NEJAD et at, 2002).

Com isso precisamos levar em considerao outros fatores que influenciam o

aumento da freqncia de aberrao cromossmica instveis como a variabilidade

gentica individual, como tambm a correlao da mesma com a exposio s radiaes

ionizantes. Estudos afirmam que a predisposio gentica para efeitos clastognicos

aumenta a suscetibilidade individual do desenvolvimento do cncer (GOODE et al,

2002). No caso especifico de Monte Alegre, por exemplo, a combinao entre variantes

polimrficas ocorridas em genes relacionados com a manuteno da estabilidade do

genoma poderia conferir maior risco ao cncer de pulmo em pessoas expostas a altos

nveis de radnio.

Em nosso laboratrio tambm foi determinada a presena de polimorfismos para

os mesmos indivduos em estudo (HOZUMI 2009, DUARTE 2010). O polimorfismo

gentico uma variao natural no gene e est presente num valor superior a 1 % da

populao e essa mutao pode influenciar no fentipo de algumas clulas interferindo

no seu funcionamento normal (GENE TESTS, 2009). Quando este polimorfismo est

presente em genes responsveis pelo reparo do DNA a clula est mais vulnervel aos

efeitos clastogenicos sejam estes endgenos ou exgenos como a radiao ionizante

(MOCELLIN, 2009). O reparo errneo do DNA pode causar o aumento da freqncia

de aberrao cromossmica e esse efeito deve ser avaliado como um aumento do risco

53

de cncer (NATARAJAN 2008). KIURU et al. (2005) revelou em seu estudo com

polimorfismos de genes de reparo em residentes expostos ao radnio na Finlndia, o

aumento significativo em duas vezes a taxa de dicentricos em indivduos portadores do

gene polimrfico XRCC1. Muito embora no haja descrio do aumento de dicntricos

em indivduos polimrficos para os outros quatro genes, eles participam de vias

metablicas relacionadas a reparo de leses induzidas pelas radiaes ionizantes. Logo

de grande importncia correlacionarmos os resultados dos trabalhos feitos em nosso

laboratrio no grupo de indivduos de Monte Alegre exposto e no exposto a radiao.

Os genes polimrficos envolvidos nesse estudo esto relacionados em regular a

progresso do ciclo celular (p53) e em reparar o DNA. Os genes XRCC1 e HOGG1 so

responsveis pelo processo de reparao por exciso de bases. Onde o produto do

hOGG1 responsvel por remover o dano no DNA, e o produto do gene XRCC1

participa do complexo de protenas de reparo. O gene XPD est relacionado ao reparo

por exciso de nucleotdeos. O gene XRCC3 est relacionado ao reparo por

Recombinao homologa. Como cada um tem um papel especifico no sistema de

reparo, a associao desses genes polimrficos em um individuo e exposio a agentes

genotxicos pode potencializar o comprometimento do mecanismo celular de responder

s leses no DNA. Assim de grande valia avaliarmos separadamente a resposta

individual do grupo do presente estudo.

O individuo 55 apresentou trs variaes polimrficas, incluindo XRCC1 e

hOGG1, e a presena de aberraes cromossmicas. O individuo 38 apresentou duas

54

variaes polimrficas, XRCC1 e XRCC3, e a presena de aberrao cromossmica.

Estudo com trabalhadores expostos a agentes genotoxicos que apresentavam variantes

de XRCC3 apresentaram um aumento significativo de fragmentos acntricos

(MATEUCA et al., 2005). O individuo 83 apresentou duas variaes polimrficas,

XRCC1 e p53, e a presena de aberrao cromossmica. Podemos observar que a

variao polimrfica do gene XRCC1 est presente nos trs indivduos que

apresentaram aberrao cromossmica, porem no podemos afirmar esta correlao, j

que existem outros fatores como infeco viral, alimentao e at a tcnica utilizada que

interferem na produo espontnea de aberraes cromossmicas instveis.

55

7. CONCLUSO

Nossos estudos sugerem que a exposio a radiao, produzida pelo decaimento

do Urnio, nas residncias de Monte Alegre no suficiente para aumentar a freqncia

de aberraes tipo-cromossmicas instveis para o grupo de estudo.

A combinao dos alelos polimrficos dos genes estudados no influenciou na

produo de dicntricos nos indivduos analisados.

Os dados obtidos no presente estudo colaboram para o acervo de estudos

epidemiolgicos em reas de radioatividade natural elevadas e para uma resposta a

populao de Monte Alegre, aos questionamentos levantados em relao `a

radioatividade natural, reiterando que a mesma no est ocorrendo um aumento da

freqncia de aberraes tipo-cromossmicas instveis na sua populao.

56

8. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

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