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Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie der Universität Würzburg Lehrstuhl für Anatomie II Vorstand: Professor Dr. med. D. Drenckhahn Reaktive Veränderungen von Rückenmark und Nervenwurzeln nach dorsaler Rhizotomie sowie Ausriss und Replantation der Vorderwurzel im Segment C7 mit Applikation neurotropher Faktoren CNTF und BDNF Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Bayerischen Julius-Maximilians-Universität zu Würzburg vorgelegt von Nicolas Schlegel aus Donaueschingen Würzburg, Oktober 2006

Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie Lehrstuhl ... · Klinik und Diagnostik von Verletzungen des Plexus brachialis ... Nervus radialis bildet, ... Im entsprechenden Dermatom

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  • Aus dem Institut fr Anatomie und Zellbiologie

    der Universitt Wrzburg

    Lehrstuhl fr Anatomie II

    Vorstand: Professor Dr. med. D. Drenckhahn

    Reaktive Vernderungen von Rckenmark und Nervenwurzeln nach dorsaler

    Rhizotomie sowie Ausriss und Replantation der Vorderwurzel im Segment C7 mit

    Applikation neurotropher Faktoren CNTF und BDNF

    Inaugural-Dissertation

    zur Erlangung der Doktorwrde

    der Medizinischen Fakultt

    der

    Bayerischen Julius-Maximilians-Universitt zu Wrzburg

    vorgelegt von

    Nicolas Schlegel

    aus

    Donaueschingen

    Wrzburg, Oktober 2006

  • Referent: Prof. Dr. med. Esther Asan

    Koreferent: Prof. Dr. med. Cordula Matthies

    Dekan: Prof. Dr. med. Georg Ertl

    Tag der mndlichen Prfung: 11.12.2007

    Der Promovend ist Arzt

  • V

    Inhaltsverzeichnis

    Einleitung ..................................................................................................... 1

    Einfhrung zum Thema; allgemeine Problematik........................................................ 1

    Klinik und Diagnostik von Verletzungen des Plexus brachialis .................................. 2

    Definitionen.............................................................................................................. 2

    Unfallmechanismus und Folgen ............................................................................... 2

    Diagnostik von Nervenwurzelverletzungen des Plexus brachialis........................... 4

    berblick ber die Anatomie des Nervensystems........................................................ 6

    Bedeutung der Myelinscheide .................................................................................. 7

    Anatomie des peripheren Nerven ............................................................................. 8

    Anatomie des Rckenmarks ..................................................................................... 9

    Schichtenbau und Zytoarchitektonik des Rckenmarks und des Vorderhorns ...... 11

    Pathophysiologie von Nervenlsionen ................................................................... 12

    Degeneration und Regeneration von Nerven nach Verletzung .................................. 13

    Peripheres Nervensystem und Waller-Degeneration.............................................. 13

    Reaktion im distalen Stumpf nach Axotomie..................................................... 13

    Reaktion im proximalen Anteil der Nervenzelle................................................ 15

    Prozesse der Myelinisierung............................................................................... 16

    Regeneration im zentralen Nervensystem .............................................................. 18

    Therapieanstze zur Behandlung von Nervenwurzelausrissen .................................. 21

    Allgemeine Therapieanstze fr Nervenverletzungen ........................................... 21

    Therapieanstze fr Nervenwurzelausrisse ............................................................ 21

  • VI

    Historische Entwicklung .................................................................................... 21

    Technik des Nerventransfers .............................................................................. 22

    Replantationstechnik von Nervenwurzeln.......................................................... 22

    Operationtechnik nach Thomas Carlstedt........................................................... 23

    Voraussetzungen fr eine Verbesserung der Therapieanstze der Vorderwurzel .. 24

    Voruntersuchungen zur vorliegenden Arbeit ............................................................. 25

    Neurotrophe Faktoren................................................................................................. 25

    Neurotrophine der NGF- Familie ........................................................................... 26

    BDNF (brain derived neurotrophic factor)......................................................... 28

    Familie der Neurokine ............................................................................................ 29

    CNTF (ciliary neurotrophic factor) .................................................................... 29

    Familie der Transforming Growth Factors............................................................. 31

    Fragestellung der Untersuchungen ............................................................................. 31

    Material und Methoden............................................................................32

    Untersuchungsmaterial ............................................................................................... 32

    Operatives Vorgehen .............................................................................................. 32

    Bildung verschiedener Versuchsgruppen ............................................................... 34

    Postoperative Beobachtung der Tiere..................................................................... 34

    Perfusion und berlebenszeitrume....................................................................... 34

    Behandlung der proximalen Gewebeanteile............................................................... 35

    Behandlung der distalen Gewebeanteile..................................................................... 37

    Markscheidenfrbung ................................................................................................. 39

  • VII

    Modifizierte Frbung nach Klver-Barrera (Luxol-Fast Blue Frbung).................... 39

    Morphologische und quantitative Auswertung der Gewebeschnitte.......................... 40

    Zhlung der Vorderhornneurone ............................................................................ 41

    Bestimmung der Axondurchmesser ....................................................................... 42

    Auswertung der Semidnnschnitte......................................................................... 42

    Bestimmung der Myelinisierung ............................................................................ 44

    Analyse von Anzahl und Flchen myelinisierter Axone innerhalb des Spinalganglions ...................................................................................................... 45

    Messung von Flchen sensorischer Neurone in den Semidnnschnitten ............... 46

    Messung der Dichte sensorischer Neurone ............................................................ 46

    Ergebnisse ..................................................................................................47

    Morphologie des Rckenmarks und der Axonverlufe.............................................. 47

    Morphologie des Rckenmarks der unverletzten Seiten ........................................ 47

    Morphologie der replantierten Seiten ..................................................................... 49

    Replantationstelle und Verletzungsausma am Rckenmark ............................ 49

    Allgemeine morphologische Beobachtungen an der grauen Substanz............... 52

    Intraspinale Narbenausdehnung um die Replantationsstelle im Segment C7 .... 53

    Anzahl berlebender Motoneurone nach 6 Monaten ............................................. 53

    Allgemeine morphologische Beobachtungen an den Regenerationswegen auswachsender Axone ........................................................................................ 54

    Morphologische Unterschiede zwischen ventral und lateral austretenden Axonen............................................................................................................................ 59

    Morphologie der Vorderwurzel C7 ............................................................................ 60

  • VIII

    Gesunde, nicht replantierte Seiten .......................................................................... 60

    Vergleich zwischen den Gruppen; Besonderheiten............................................ 60

    Replantierte Seiten.................................................................................................. 62

    Quantitative Analysen ................................................................................................ 62

    Gesamtflchen der Vorderwurzeln......................................................................... 62

    Axonzahlen der Vorderwurzeln.............................................................................. 63

    Analyse von Axonflchen der Vorderwurzel ......................................................... 64

    Axon-Myelinverhltnis........................................................................................... 65

    Vernderungen in der rhizotomierten Hinterwurzel und im Spinalganglion ............. 69

    Vernderungen im zentralen Rest der C7 Hinterwurzel......................................... 69

    Morphologie des C7 Spinalganglions ........................................................................ 72

    Axone in den Spinalganglien.............................................................................. 74

    Verlauf der zentralen sensorischen Fortstze ..................................................... 77

    Morphologie des Nervus radialis................................................................................ 80

    Gesunde, nicht replantierte Seiten .......................................................................... 80

    Replantierte Seiten.................................................................................................. 81

    Diskussion ..................................................................................................83

    Das verwendete Tiermodell ist der klinischen Situation eher vergleichbar als frhere Modelle....................................................................................................................... 84

    Interindividuelle Abweichungen des Verletzungsausmaes: mgliche Ursachen ..... 84

    Kein deutlicher Einflu auf Motoneuronberleben nach einmaliger Applikation neurotropher Faktoren ................................................................................................ 86

    Regenerierende Axone wachsen lateral und ventral aus ............................................ 87

  • IX

    Ventrale Replantation knnte gnstige Effekte haben ............................................... 88

    Deutliche Regeneration von myelinisierten Axonen in der Vorderwurzel auf Hhe des Spinalganglions .................................................................................................... 90

    Regenerierte Vorderwurzelaxone sind kleinflchig ................................................... 92

    Neurotrophe Faktoren wirken positiv auf die Remyelinisierung ............................... 93

    Morphologie des Nervus radialis zeigt regenerative Prozesse ................................... 95

    Verletzungsauswirkungen auch auf den unverletzten Seiten? ................................... 96

    Beobachtungen zur durchtrennten Hinterwurzel vervollstndigen das Bild der komplexen Vernderungen im Segment C7............................................................... 96

    Reaktion der Spinalganglienneurone auf Axotomie des zentralen Fortsatzes ist minimal....................................................................................................................... 99

    Wege der regenerierten Hinterwurzelaxone zeigen mglicherweise Einfluss auf die regenerierende Vorderwurzel ................................................................................... 102

    Zusammenfassung...................................................................................104

    Literatur ...................................................................................................106

    Danksagung..............................................................................................120

    Lebenslauf ................................................................................................121

  • 1

    Einleitung

    Einfhrung zum Thema; allgemeine Problematik

    Gegenstand der vorliegenden Arbeit sind Untersuchungen zu

    Regenerationsphnomenen in Rckenmark und Nervenwurzeln sowie zum Einfluss

    neurotropher Faktoren CNTF (ciliary neurotrophic factor) und BDNF (brain derived

    neurotrophic factor) auf diese Phnomene in einem Plexus brachialis-Lsions- und

    Therapiemodell (dorsale Rhizotomie, Ausriss und Replantation der Vorderwurzel im

    Segment C7) nach einer Regenerationszeit von sechs Monaten.

    Durch extreme Zugbelastung an Nervenfasern des Plexus brachialis kann es zu

    vielfltigen Verletzungsmustern kommen. Fr die meisten dieser Verletzungen

    existieren chirurgische Therapieverfahren, die seit einiger Zeit zu wachsenden Erfolgen

    in der Wiederherstellung der Funktion der verletzten peripheren Nervenstrnge fhren.

    Eine der gravierendsten Verletzungen des Plexus brachialis ist der Ausriss von

    Nervenwurzeln aus dem Rckenmark, da an diesen Verletzungen nicht nur das

    periphere Nervensystem, sondern durch die Beschdigung des Rckenmarks auch das

    zentrale Nervensystem mitbeteiligt ist. Nervenwurzelausrisse sind Folge extremer

    Zugbelastungen und daher immer traumatisch bedingt. Bis vor wenigen Jahren wurden

    solche Verletzungen als nicht therapierbar angesehen und die chirurgische Intervention

    war auf Manahmen begrenzt, die mit einem Nerventransfer zumindest eine partielle

    Wiederherstellung der verlorengegangenen Funktionen erlaubte.

    Die bisher unbefriedigenden Therapieergebnisse und die relativ geringen Kenntnisse

    ber die komplexen Schdigungsfolgen auf zellulrer Ebene lassen einen weiten Raum

    fr die experimentelle Erforschung neuer Therapieanstze. Um diese Herausforderung

    erfolgreich angehen zu knnen, ist es sinnvoll, dass verschiedene Disziplinen der

    Medizin eng zusammenarbeiten. Grundlage der vorliegenden Arbeit ist daher eine enge

    Verknpfung zwischen chirurgisch-experimenteller Arbeit und histologisch-

    morphologischer Analyse der Ergebnisse. Die Zusammenarbeit erfolgte zwischen Frau

    Dr. Eva Lang, Oberrztin fr Plastische- und Handchirurgie des Universittsklinikums

    in Freiburg im Breisgau und dem Institut fr Anatomie und Zellbiologie der Universitt

    Wrzburg.

  • 2

    Klinik und Diagnostik von Verletzungen des Plexus brachialis

    Definitionen

    Verletzungen des Plexus brachialis knnen in Penetrationsverletzungen,

    Kompressionsverletzungen und Zug- bzw. Traktionsverletzungen eingeteilt werden. Die

    bei weitestem hufigste Verletzung des Plexus brachialis ist dabei die

    Traktionsverletzung. Fr die Behandlungsweise und Prognose ist die weitere

    Unterscheidung zwischen zwischen pr- und postganglionrer Verletzung wichtig.

    Postganglionre Verletzungen sind definiert als Verletzungen, die distal des

    Spinalganglions liegen. Entsprechend befindet sich eine prganglionre Lsion

    proximal des Spinalganglion. Bei den bereits intradural liegenden prganglionren

    Lsionen ist entscheidend, ob sie sich zentral oder peripher der Transitionszone

    zwischen zentralem und peripherem Nervensystem befinden. Im Falle, dass sich die

    Lsion peripher dieser bergangszone befindet, kann man bei der operativen

    Exploration Nervenstmpfe unterschiedlicher Lnge erkennen. Daher hat man diese

    diese Art der Verletzung als periphere intradurale Ruptur bezeichnet. Im anderen Fall

    der zentralen intraduralen Ruptur findet sich der Ausriss der Nervenwurzel

    einhergehend mit einer oberflchlichen Verletzung des Rckenmarks. Wird in der

    vorliegenden Arbeit von Nervenwurzelausrissen gesprochen, ist damit die zentrale

    intradurale Ruptur gemeint (Tavakkolizadeh et al., 2001; Birch, 1998; Schenker and

    Birch, 2000).

    Unfallmechanismus und Folgen

    Nervenwurzelausrisse kommen am hufigsten bei Motorradunfllen, Verkehrsunfllen

    und komplizierten Geburten vor. Es handelt sich dabei um Schdigungen, die durch

    extreme Zugbelastung auf die Nervenwurzeln ausgelst werden (Bae et al., 2003;

    Dunham, 2003; El Gammal and Fathi, 2002; Kim et al., 2003; Terzis et al., 1999). In

    Abbildung 1 sind typische Positionen dargestellt, die zu Ausrissen von Nervenwurzeln

    fhren.

  • 3

    Oft betreffen diese Verletzungen nicht nur ein Segment, sondern mehrere

    Nervenwurzeln, die an der Bildung des Plexus brachialis beteiligt sind. Dies fhrt meist

    zum kompletten Ausfall der motorischen und sensorischen Qualitten, was funktionell

    einer Amputation des betroffenen Armes gleichkommt. Da es sich berwiegend um

    Folgen von Motorradunfllen handelt, sind vorwiegend jngere Menschen von solchen

    Verletzungen betroffen. Der obere Teil des Plexus brachialis ist hufiger betroffen als

    der untere. Hufigste Lokalisation von Nervenwurzelausrissen aus dem Rckenmark ist

    das Segment C7. Eine Erklrung fr diese Lokalisation ist wohl die strkere Fixierung

    an den ueren Rand der Foramina intervertebralia der Spinalnerven C5-C7 und die

    vergleichsweise ungeschtzte Lage im Halsbereich (Drenckhahn D., 2004b).

    Fast immer werden beide Nervenwurzeln, also sowohl Vorder- als auch Hinterwurzel,

    ausgerissen bzw. verletzt. Ein isolierter Vorderwurzel- bzw. Hinterwurzelausriss kommt

    sehr selten vor. Hufig sind Patienten mit einer solchen Verletzung polytraumatisiert, so

    dass sich der Nervenwurzelausriss erst spter diagnostiziert wird oder aufgrund vitaler

    Bedrohung durch andere Verletzungen als nachrangig eingestuft wird. Dies hat

    ungnstige Auswirkungen auf die Prognose. Die Grnde werden unten nher erlutert.

    Abbildung 1: Typische Positionen nach Unfall mit Motorrdern, die durch starke mechanische Zugbelastung zum Ausriss von Nerven-wurzeln aus dem Rckenmark fhren (zur Verfgung gestellt von Frau Dr. Eva Lang).

  • 4

    Diagnostik von Nervenwurzelverletzungen des Plexus brachialis

    Das Ergebnis der klinischen Untersuchung des Patienten wird blicherweise nach der

    Narakas-Klassifikation dokumentiert (Verfahren am Royal National Orthopaedic

    Hospital, Stanmore, England):

    - Grad I: Ausfall von C5, C6 und C7

    - Grad II: Ausfall von C5, C6, C7 und C8

    - Grad III: Ausfall von C5-Th1; also gesamter Plexus brachialis

    - Grad IV: Ausfall von C5-Th1 mit Hornersyndrom (Ptosis, Miosis, Enophtalmus)

    Im klinisch unrealistischen Falle eines isolierten Nervenwurzelausrisses (wie im

    Tiermodell der vorliegenden Arbeit; siehe unten) wrde sich dem Untersucher beim

    Menschen folgendes Bild bieten: Da die Nervenwurzel C7 einen starken Anteil des

    Nervus radialis bildet, sind Streckdefizite in Ober- und Unterarm und somit eine

    Fallhand zu erwarten. Kennmuskel fr dieses Segment ist der M. triceps brachii. In

    der Regel ist sptestens nach acht Wochen eine deutliche Atrophie der betroffenen

    Muskelpartien zu sehen. Im entsprechenden Dermatom findet sich entsprechend einer

    gleichzeitigen Verletzung der Hinterwurzel auch ein Sensibilittsverlust.

    Durch die klinische Untersuchung ist es normalerweise nicht mglich zwischen prg-

    und postganglionren Lsionen zu unterscheiden. Auch elekrophysiologische Verfahren

    bringen blicherweise nicht die ntige Sicherheit fr eine Diagnose, so dass der

    behandelte Arzt zur optimalen Diagnostik auf bildgebende Verfahren angewiesen ist.

    Hierfr stehen verschiedene Mglichkeiten zur Verfgung.

    Ein Verfahren stellt die Bildgebung mit dem MRT dar (Abbildung 2). Den

    limitierenden Faktor bei der Bildgebung durch das MRT stellt die Schichtdicke von 4-5

    mm fr axiale Sequenzen dar. Menschliche Nervenwurzeln haben einen Durchmesser

    von 1-3 mm. In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass das MRT nur in

    Ausnahmefllen eine klare Diagnostik der Nervenwurzelausrisse erlaubt. Einen

    einigermassen sicheren Hinweis auf den zentralen Ausriss der Nervenwurzel gibt das

    durch die Verletzung entstehende dem (Tavakkolizadeh et al., 2001).

  • 5

    Abbildung 2: MRT- Bild in T1-Wichtung eines Patienten mit Nervenwurzelausriss rechts (A) und ein Bild eines unverletzten Rckenmarkssegments im Vergleich (B). Man sieht, wie die Kontinuitt zwischen Rckenmark und Vorderwurzel bzw. Rckenmark und Hinterwurzel aufgehoben ist (A). Abbildung 2 und 3 modifiziert nach Preoperative Assessment of Stretch/ Contusive Injuries to the Brachial Plexus der Homepage Aruna Ganju, MD und David G. Kline, MD.

    Das hochauflsende CTM (Computerised Tomographic Myelography) ist derzeit am

    ehesten in der Lage zwischen zentraler und peripherer Ruptur zu unterscheiden. Die

    Myelographie bzw. die CTM stellt daher das Verfahren der Wahl zur Darstellung von

    Nervenwurzelausrissen dar. Bei dieser Untersuchung wird der Dura mater-Sack mit

    einem Kontrastmittel gefllt. Im Rntgenbild zeigt sich ein Nervenwurzelausriss dann

    als Aussackung des Dura mater-Sackes. Auch im CT-Bild ist die Aussackung der Dura

    Mater gut zu erkennen und gilt als eindeutiges diagnostisches Merkmal

    (Tavakkolizadeh et al., 2001);(Abbildung 3).

    Abbildung 3: (folgende Seite) Myelographische Darstellung von Nervenwurzelausrissen: links ein Rntgenbild nach Kontrastmittelapplikation in den Dura mater Sack a.p; die Pfeile zeigen die Aussackung des Dura Mater Sackes welche als diagnostisches Merkmal eines Nervenwurzelausriss gilt; A-D CTM Bilder eines Patienten nach Kontrastmittelapplikation in den Dura Matersack (Quelle siehe oben).

  • 6

    berblick ber die Anatomie des Nervensystems

    Im Folgenden soll ein berblick gegeben werden, welcher auch Laien bzw. Betroffenen

    das Verstndnis der vorliegenden Arbeit ermglichen soll. Es handelt sich dabei um die

    Darstellung von zusammengefasstem Lehrbuchwissen:

    Das Nervengewebe ist strukturelle Grundlage des Nervensystems. Es stellt eine

    funktionelle Einheit dar, die zur Reizaufnahme, Erregungsbildung,

    Erregungsweiterleitung, Verarbeitung und Beantwortung von Reizen aus der Umwelt

    und dem Krperinneren dient. Das Nervensystem setzt sich aus dem zentralen

    Nervensystem (ZNS) und dem peripheren Nervensystem (PNS) zusammen.

    Das Neuron ist die spezifische Zelle des Nervengewebes, die hochspezialisiert und nicht

    mehr teilungsfhig ist. Die Nervenzelle besteht aus dem Zellkrper (Soma) und seinen

    Fortstzen, den Dendriten und Axonen. Es existieren mehrere Typen von Neuronen, die

    nach Anzahl ihrer Fortstze unterschieden werden: Man unterscheidet multipolare,

    unipolare, pseudounipolare und bipolare Neuronen, deren Lokalisation fr verschiedene

    Regionen des Nervensystems typisch ist. So sind die Motoneurone in den

    Vorderhrnern des Rckenmarks, Krnerzellen, Sternzellen, Korbzellen des Kleinhirns

    und Pyramidenzellen des Neocortex multipolare Nervenzellen, die Zellen in den Spinal-

    und Hirnnervenganglien sowie im mesenzephalen Trigeminuskern sind pseudounipolar;

  • 7

    bipolare Nervenzellen findet man typischerweise in der Retina, im Ganglion spirale, im

    Ganglion vestibulare und im olfaktorischen System.

    Der Zellkrper (Soma) enthlt den Zellkern und dessen zytoplasmatische Umgebung,

    das Perikaryon. Die Gre des Zellkrpers variiert zwischen 6 und 100 m im

    Durchmesser und ist mit seiner Vielzahl von Mitochondrien, dem endoplasmatischem

    Retikulum (ER) und Golgi-Apparat Ort der Proteinsynthese. Der Proteingehalt einer

    Nervenzelle wird in 14 Tagen durchschnittlich einmal umgesetzt. Fr den Umsatz

    und Nachschub von Proteinen in die Fortstze der Zellen existieren verschiedene

    Transportmechanismen, die z.B. durch ATP-abhngige Transportmolekle entlang der

    Mikrotubuli vermittelt werden.

    Das endoplasmatische Retikulum wird in der Nervenzelle auch als Nissl-Substanz

    bezeichnet. Ihre biochemischen Eigenschaften macht man sich in der Nissl-Frbung zur

    Anfrbung von Neuronen in histologischen Schnitten zu Nutze. Feine Verstelungen,

    die vom Zellkrper ausgehen, werden Dendriten genannt. Sie unterscheiden sich,

    abhngig vom Typ der Nervenzelle, in Lnge und Grad der Verzweigung. Sie sind

    anhand ihrer Morphologie und ber Oberflchenantigene immunhistochemisch von

    Axonen zu unterscheiden. Das Axon einer Nervenzelle entspringt aus dem Soma.

    Gelegentlich knnen Axone ihren Ursprung auch aus groen Dendriten haben

    (Drenckhahn D, 2004a; Drenckhahn D., 2004b).

    Bedeutung der Myelinscheide

    Neuronale Fortstze werden von Zellen umhllt, welche die sogenannte Markscheide

    bzw. Myelinscheide bilden. Die Myelinscheide von markhaltigen Axonen erhht den

    Membranwiderstand erheblich und wird im ZNS von Oligodendrozyten, im PNS von

    Schwann-Zellen gebildet. Die durch die Umhllung entstandene Isolierschicht um die

    Nervenfortstze ist in ihrem Verlauf nicht kontinuierlich, sondern durch regulre

    Intervalle unterbrochen, die kein Myelin enthalten und als Ranvier`sche Schnrringe

    bezeichnet werden. Sie ermglichen eine sprunghafte (saltatorische) Weiterleitung von

    Aktionspotentialen von einem Schnrring zum nchsten. Auf diese Weise kann die

    Geschwindigkeit der Reizleitung gegenber unmyelinisierten Axonen um einen

    erheblichen Faktor gesteigert, metabolische Energie fr die Entstehung von

    Aktionspotentialen gemindert und durch Reduktion des Axondurchmessers Platz im

    Nervensystem eingespart werden. Die Leitungsgeschwindigkeit myelinisierter

  • 8

    Nervenfasern betrgt 5-120 m/s. Es werden nach Durchmesser und

    Leitungsgeschwindigkeit verschiedene Gruppen von Nervenfasern unterschieden, die in

    Tabelle 1 kurz charakterisiert sind.

    Es besteht eine proportionale Beziehung zwischen der Dicke der Myelinscheide und der

    Dicke des Axons, die als g-ratio bezeichnet wird (Adhami et al., 1976; Orgel, 1982;

    Fraher and O`Sullivan 2000; Nave and Salzer, 2006). Diese Beziehung beeinflusst

    wesentlich die Funktion des Axons und damit der gesamten Nervenzelle. Die

    Geschwindigkeit der Erregungsleitung ist von diesen beiden kritischen Gren der

    Nervenfaser abhngig. Bei Vergrerung des Durchmessers eines Axons und

    entsprechend dickerer Myelinscheide wird die Reizleitung als Folge greren

    Stromflusses erhht.

    Anatomie des peripheren Nerven

    Periphere Nerven enthalten somato und viszeromotorische, und -sensorische Fasern.

    Die Zellkrper der motorischen Fasern sind Vorderhornzellen im Rckenmark, die

    Zellkrper der sensorischen Fasern sind die pseudounipolaren Zellen im

    Spinalganglion. Das Nervenfaserbndel wird von drei Schutzschichten umgeben:

    Tabelle 1: Schematische bersicht ber Fasertypen, Durchmesser, Leitgeschwindigkeit und Funktion der verschiedenen Nervenfasern; modifiziert nach Silbernagl/Despopoulos (Taschenatlas der Physiologie).

  • 9

    - Epineurium: Umhllt den peripheren Nerven als Ganzes und besteht aus dichtem

    Bindegewebe. Netzwerke von Lymph- und Blutgefen sind im Epineurium enthalten.

    - Perineurium: Epithelartig, mehrschichtig angeordnete Zellen, die untereinander mit

    Tight Junctions verbunden sind und damit fr die meisten Makromolekle eine

    Diffusionsbarriere bilden und den intrafunikulren Druck erzeugen.

    - Endoneurium: Lockeres Bindegewebe, das sich an die Basallamina der Schwann-

    Zellen anschliet und jede Nervenfaser als schmalen Saum aus kollagenen Fibrillen

    umhllt. Im Endoneurium kommen freie Zellen und Kapillaren vor. Innerhalb des

    Endoneuriums bedindet sich eine liquorhnliche Flssigkeit.

    Anatomie des Rckenmarks

    Das Rckenmark ist ein Teil des zentralen Nervensystems. Es befindet sich im

    Wirbelkanal, der durch die Wirbelkrper und deren Wirbelbgen gebildet wird. Das

    Rckenmark ist ein weilicher, zylindrischer Strang, der einen kreisrunden bis ovalen

    Querschnitt zeigt. Sein Gewicht betrgt beim erwachsenen Menschen etwa 36g und ist -

    abhngig von der individuellen Rumpflnge des erwachsenen mitteleuropischen

    Menschen - durchschnittlich 40-45 cm lang. Der kraniale Beginn des Rckenmark ist

    auf Hhe der Kreuzung der Pyramidenbahn im unteren Bereich der Medulla oblongata

    etwa auf Hhe des Foramen magnum des Os occipitale und es erstreckt etwa bis auf die

    Hhe des zweiten Lendenwirbels. Nach kaudal verjngt sich das Rckenmark zum

    Conus medullaris. Das Rckenmark gibt insgesamt 31-33 Spinalnerven ab, deren

    genaue Zusammensetzung unten genauer beschrieben wird. Entsprechend seiner

    Projektion auf die Krperabschnitte wird das Rckenmark in folgende Abschnitte

    unterteilt:

    - Pars cervicalis mit den Nervenwurzeln fr 8 Zervikalnerven

    - Pars thoracalis mit den Nervenwurzeln fr 12 Thorakalnerven

    - Pars lumbalis mit den Nervenwurzeln fr 5 Lumbalnerven

    - Pars sacralis mit den Nervenwurzeln fr 5 Sakralnerven

    - Pars coccygea mit den Nervenwurzeln fr 1-3 Kokzygealnerven.

    Die Dicke des Rckenmarks ist in verschiedenen Abschnitten unterschiedlich.

    Diejenigen Abschnitte, welche fr die neuronale Versorgung der Extremitten zustndig

    sind, sind wesentlich dicker und werden daher als Intumescentia cervicalis im Bereich

    zwischen viertem Halswirbel und zweitem Thorakalsegment und als Intumescentia

  • 10

    lumbosacralis im Bereich zwischen erstem Lumbalsegment und drittem Sakralsegment

    bezeichnet.

    Die Oberflche des Rckenmarks ist durch mehrere Lngsfurchen in einzelne

    Abschnitte unterteilt. In der Mitte ventral schneidet die tiefe Fissura mediana anterior

    ein, dorsal der seichte Sulcus medianus posterior. Beiderseits des Sulcus medianus

    posterior befindet sich je ein Sulcus posterolateralis, in dem die Hinterwurzeln in das

    Rckenmark eintreten. Zwischen diesen beiden Sulci liegt der Hinterstrang, der im

    Halsbereich durch den Sulcus intermedius posterior in den medialen Fasciculus gracilis

    und den lateralen Fasciculus cuneatus unterteilt wird. Die Vorderwurzeln verlassen das

    Rckenmark in einem beidseits der Fissura mediana gelegenen Lngsstreifen, dem

    Sulcus anterolateralis.

    Im mikroskopischen Querschnitt kann man erkennen, dass das Rckenmark

    grundstzlich aus zwei verschiedenen Substanzen besteht. In der Mitte kann man eine

    graue, nervenzellreiche schmetterlingsfrmige Struktur erkennen, die als Substantia

    grisea bezeichnet wird. Umgeben wird diese von einer fetthaltigen, weilichen

    Substanz, die als Substantia alba bezeichnet wird.

    Die graue Substanz kann grob in ein Vorderhorn und ein Hinterhorn untergliedert

    werden. Whrend das Hinterhorn Neurone beinhaltet, welche die Verarbeitung der

    sensorischen Impulse aus der Peripherie ermglichen, sind im Vorderhorn

    unterschiedlich groe Neuronenpopulationen zu sehen, die in ihrer Gesamtheit auch als

    Wurzelzellen bezeichnet werden. Die grten Zellen des Rckenmarks sind die -

    Motoneurone. Sie haben beim Menschen einen Durchmesser von 30-80m. Die Axone

    der Motoneurone geben noch in der grauen Substanz 1-5 Kollateralen ab, die sich zum

    Teil mit Interneuronen verbinden. Extramedullr haben die menschlichen

    Motoneuronaxone einen Durchmesser zwischen 12 und 20 m und ziehen zu

    bestimmten Muskelgruppen des Bewegungsapparates, um dann dort in den motorischen

    Endplatten zu enden. Die -Motoneurone sind mit einem Durchmesser von 15-20 m

    kleiner als die -Motoneurone, versorgen die intrafusalen Muskelfasern und regulieren

    deren Spannung. -Motoneuronaxone haben extramedullr einen Durchmesser von 2-15

    m. Im thorakalen und lumbalen Bereich (C8-L2) liegen im Seitenhorn multipolare

    sympathische Neurone, die Axone zu vegetativen Ganglien senden und

    viszeromotorische Funktionen erfllen. Im Sakralbereich befinden sich im Bereich des

  • 11

    Seitenhorns multipolare Nervenzellen mittlerer Gre, die dem Parasympathikus

    angehren. Auch diese Zellen entsenden Axone zu vegetativen Ganglien. In der grauen

    Substanz finden sich diffus verteilte Interneurone, die auch als Binnenzellen bezeichnet

    werden. Innerhalb der grauen Substanz sind auerdem Strangneurone zu sehen, die sich

    hauptschlich in den dorsalen Anteilen der Zona intermedia oder im Hinterhorn

    befinden. Ihre Neuriten verlaufen in der Regel in der weien Substanz und ber weite

    Strecken (Drenckhahn D, 2004a; Drenckhahn D., 2004b; Schiebler T et al., 1996).

    Schichtenbau und Zytoarchitektonik des Rckenmarks und des Vorderhorns

    Die graue Substanz gliedert sich in 9 Laminae die von dorsal nach ventral

    durchnummeriert werden (Lamina I-IX). Hinzu kommt noch die Lamina X, das Gebiet

    um den Zentralkanal. Die Laminae VIII IX bilden das Vorderhorn. Dabei berwiegen

    in der Lamina VIII die Interneurone fr die motorischen Systeme. Die Lamina IX

    enthlt dagegen die Motoneurone, die somatotopisch gegliederte Zellgruppen bilden.

    Das Vorderhorn enthlt zwei Arten von Nervenzellen, nmlich die Wurzelzellen, deren

    Axone ber die Vorderwurzel das Rckenmark verlassen und die Strangzellen, deren

    Axone komplett im Zentralorgan liegen. Alle im Vorderhorn entsprungenen

    markhaltigen bzw. myelinisierten Axone der Vorderwurzeln enden auf typische Weise

    im quergestreiften Muskelgewebe. Um die Funktion der Innervation des quergestreiften

    Muskelgewebes prziser zu beschreiben, wurden diese Zellen von Massaza 1924 auch

    myorhabdotische Zellen genannt. Die myorhabdotischen Zellen liegen nicht

    gleichmig verteilt im Vorderhorn, sondern sind in mehr oder weniger abgrenzbaren

    Untergruppen angeordnet, deren Anzahl und Form in den verschiedenen Segmenten und

    sogar oft in den verschiedenen Niveaus der Segmente variieren. Erkenntnisse aus vielen

    Untersuchungen machen es wahrscheinlich, dass ein Zusammenhang zwischen dieser

    variierten Gruppierung der myorhabdotischen Zellen und dem Formenreichtum des von

    ihnen innervierten quergestreiften Muskelgewebes besteht. Diese Untersuchungen

    zeigen, dass jeder bestimmte quergestreifte Muskel seine Innervation aus Zellen

    empfngt, die nebeneinander und niemals diffus verstreut zwischen anderen

    myorhabdotischen Zellen der brigen Muskeln liegen. Die Peripherie ist also streng im

    Vorderhorn reprsentiert und erstaunlicherweise ist die Lokalisation recht konstant, so

    dass einzelne Neuronengruppen in verwandten Tieren an hnlichen Stellen im

    Vorderhorn wieder gefunden werden knnen. Jede myorhabdotische Zelle liegt im

  • 12

    selben Segment und in derselben Krperhlfte, in welchem ihr Axon durch eine

    Vorderwurzel austritt. Alle Zellen liegen also in denjenigen Segmenten, deren

    Vorderwurzeln motorische Fasern fr jenen Muskel enthalten. Da die meisten Muskeln

    polysegmental innerviert werden, haben ihre Zellfelder die Form einer longitudinal

    gelegenen Zellsule.

    Aus dem Rckenmark entspringen insgesamt 31-33 Spinalnervenpaare, die sich jeweils

    aus der Vorder- und Hinterwurzel zusammensetzen. Die Zusammensetzung der

    Vorderwurzeln aus Axonen, welche dem Vorderhorn und ggf. dem Seitenhorn

    entstammen ergibt sich aus den oben erwhnten Erklrungen ber den zellulren Inhalt

    der grauen Substanz. Das Gesetz von Magendie besagt, dass in Vorderwurzeln

    ausschlielich motorische Fasern verlaufen bzw. in Hinterwurzeln nur sensible Fasern

    zu finden sind.

    Dieses neuroanatomische Dogma hat bis heute Gltigkeit, obwohl es seit seiner

    Postulierung im Jahre 1822 in Frage gestellt wird. Zahlreiche Studien zeigten nmlich,

    dass Vorderwurzeln auer den Motoneuronaxonen noch Populationen dnner

    myelinisierter und unmyelinisierter Axone enthalten, deren Somata in sensorischen oder

    sympathischen Ganglien liegen (z.B. Hildebrand et al., 1997; Schenker and Birch,

    2000; Coggeshall et al., 1973; Coggeshall et al., 1974; Coggeshall et al., 1977). Die

    Anzahl solcher Axone in der Vorderwurzel wurde auf 3,9% angegeben (Loeb, 1976).

    Ursprung und Ziel dieser Fasern sind noch umstritten (Hildebrand et al., 1997). Es gibt

    Hinweise dafr, dass diese Fasern nicht ber die Vorderwurzel in das ZNS einwachsen,

    sondern dort blind enden, die Pia mater erreichen, dort drehen und anschlieend zurck

    in die Peripherie laufen bzw. das ZNS ber die Hinterwurzel erreichen (Hildebrand et

    al., 1997). Andere Arbeiten zeigten, dass wenige primre senorische Neurone Axone

    haben, die direkt ber die Vorderwurzeln zum ZNS gelangen (Maynard et al., 1977;

    Yamamoto et al., 1977). Die Hinterwurzel besteht im Wesentlichen aus den axonalen

    Fortstzen der pseudounipolaren Nervenzellen des Spinalganglion und leitet, wie bereits

    erwhnt, dem Rckenmark somatosensorische und viszerosensorische Informationen zu

    (Scharf JH, 1958)

    Pathophysiologie von Nervenlsionen

    Die Prognose einer funktionellen Nervenregeneration hngt vom Grad der

    Nervenverletzung ab. Sunderland (Sunderland S, 1951) definierte anhand von

  • 13

    histologischen Vernderungen 5 Stadien der Nervenschdigung. Drei Schweregrade der

    Nervenunterbrechung wurden von Seddon vorgeschlagen und sind heute im

    allgemeinen klinischen Gebrauch (Seddon HJ, 1943):

    1. Neurapraxia: Es handelt sich dabei um die leichteste Form der, mit Funktionsverlust

    einhergehenden, traumatischen Nervenschdigung, bei welcher die Myelinscheide

    beschdigt ist. Die Wiederherstellung des vollstndig reversiblen Funktionsausfalls ist

    sptestens nach zwei Monaten abgeschlossen.

    2. Axonotmesis: Die Kontinuittsunterbrechung endoneuraler Strukturen und Axone

    bei erhaltener Hlle. Distal tritt eine Wallersche Degeneration (s.u.) auf. Dabei sind die

    erhaltenen Hllstrukturen fr eine Regeneration sehr gnstig.

    3. Neurotmesis: Nervenschdigung mit kompletter Durchtrennung der Fasern und der

    Hlle. Eine spontane Reinnervation ist in diesem Stadium nicht mglich. Die

    Ausrissverletzung, welche in der vorliegenden Arbeit untersucht wird entspricht diesem

    Ausma der Verletzung.

    Degeneration und Regeneration von Nerven nach Verletzung

    Eine Nervenzelle geht blicherweise zugrunde, wenn die Verletzung ihren Zellkrper

    oder den proximalen Teil des Axons betrifft. Wenn die Verletzung im distalen Teil des

    Axons stattfindet, kann die Nervenzelle berleben und es treten zunchst verschiedene

    degenerative Vernderungen auf, die im peripheren Nervensystem letztendlich zu einer

    Regeneration der durchtrennten Nerven fhren knnen.

    Peripheres Nervensystem und Waller-Degeneration

    Reaktion im distalen Stumpf nach Axotomie

    Unmittelbar nach Unterbrechung des Nervs folgt die anterograde Degeneration der

    Nervenfasern distal der Lsion, die nach ihrem Entdecker August Waller (Waller A.,

    1850), Wallersche Degeneration genannt wird. Die Wallersche Degeneration umfasst

    den Untergang des Axons und die Entfernung der Myelinscheide vom distalen Stumpf

    durchtrennter Nervenfasern. Die Fragmentierung der Axone beginnt am Ort der

    Faserdurchtrennung und setzt sich nach distal mit einer Geschwindigkeit fort, die der

    Dicke und der Internodallnge der betroffenen Fasern proportional ist. Die Latenzzeit

    bis zum Beginn der Wallerschen Degeneration ist abhngig vom Fasertyp, sie betrgt

  • 14

    bei dnnen Markfasern 25 Stunden, bei dicken Markfasern 45 Stunden. Beim Menschen

    wurde als Geschwindigkeit des distalen Fortschreitens fr dnne Axone 2,5 mm pro

    Tag und fr dicke Fasern 4,6 mm pro Tag ermittelt. Bereits 10 bis 21 Tage nach der

    Durchtrennung erstreckt sich die Wallersche Degeneration bis zum Endorgan, z.B. der

    motorischen Endplatte, und die Muskelfasern im Zielgebiet atrophieren infolge der

    Denervierung (Mumenthaler M, 1998). Ein entscheidender Prozess in der Wallerschen

    Degeneration ist die granulre Desintegration des Zytoskeletts. Hierbei werden die

    Elemente des axonalen Zytoskeletts, Neurofilamente und Mikrotubuli zu Granula und

    Trmmern abgebaut. Die granulre Desintegration ist die Folge der Aktivierung

    ionensensitiver Proteasen im distalen Nervenstumpf. Der Anstieg von intraaxonalem

    Kalzium auf ein kritisches Niveau initiiert die Proteolyse des Axoplasmas. Assoziiert ist

    die granulre Desintegration des Zytoskeletts mit dem Verlust des Axolemms und des

    Axoplasmas, so dass die Myelinscheide einen leeren Zylinder umhllt, der zuvor vom

    Axon ausgefllt war. Anschlieend kommt es zum Zerfall der Myelinscheide in kurze

    Fragmente, die so genannten Ovoide. Das Myelin fllt in sich zusammen und verliert

    seine Periodizitt (Griffin JW, 1992). Innerhalb von zwei Tagen hat sich die

    Ovoidbildung vollzogen. Die Schwann-Zellen phagozytieren die Myelintrmmer und

    bilden Lipidtrpfchen noch bevor Makrophagen einwandern. Bereits zwei bis vier Tage

    nach Faserdurchtrennung findet man Schwann-Zell-Mitosen. Die Schwann-Zellen teilen

    sich am strksten am dritten Tag nach der Durchtrennung und bilden mit ihrer

    Basallamina Rhren, die Bngner-Bnder, welche spter als Fhrung fr regenerierende

    Nervenfasern dienen. Neben den vorhandenen ortstndigen Makrophagen treten ab dem

    zweiten Tag, mit einem Maximum zwischen dem vierten und dem siebten Tag,

    hmatogene Makrophagen in den distalen Stumpf ein und migrieren zu den Ovoiden

    (Stoll and Mller, 1999). Die Myelindegeneration stellt fr die Makrophageninvasion

    einen strkeren Stimulus dar, als die Axoplasmadegeneration. Die rekrutierten

    Makrophagen wandern zu den degenerierenden Fasern, in die sie nach Passage der

    Basalmembran eintreten. In den degenerierenden Nervenfasern werden die

    hmatogenen Makrophagen zu intratubalen Phagozyten. Mit steigender

    Phagozytoseaktivitt werden die Phagozyten zu Schaumzellen, die Fetttropfen

    enthalten. Der grte Teil der Myelintrmmer wird von Makrophagen beseitigt.

    Innerhalb von zwei Wochen verschwinden die Myelintrmmer und zurck bleiben die

  • 15

    Schaumzellen, die nicht nur von Makrophagen, sondern auch von Schwann-Zellen,

    Endothelzellen, Fibroblasten und perineuralen Zellen abstammen.

    Eine T-Zell Antwort fehlt whrend der Wallerschen Degeneration, d.h. es kommt nicht

    zu einer Entzndung (Griffin JW, 1992; Mumenthaler M, 1998; Stoll and Mller,

    1999). Auf die nach distal fortschreitende Wallersche Degeneration folgt mit der Zeit

    die Verdung der intramuskulren Nervenscheiden im denervierten Zielgebiet, was

    dazu fhrt, dass regenerierende Axone nur schwer Anschluss an die Muskulatur finden.

    Auerdem nimmt die Anzahl reinnervations-bereiter Muskelfasern durch degenerative

    Prozesse ab (Fu and Gordon, 1995).

    Die Axotomie eines peripheren Nervs fhrt auch zu molekularen Vernderungen. Es

    entsteht ein Milieu, das die axonale Regeneration im peripheren Nervensystem

    erheblich frdert. Zuvor myelinisierende Schwann-Zellen dedifferenzieren und werden

    phnotypisch zu Zellen vor der Myelinisierung. Als Antwort auf den Axonverlust

    kommt es zur Schwann-Zellteilung und Hypertrophie. Die Lsion eines peripheren

    Nervs fhrt zu einer vermehrten Produktion neurotropher Faktoren in den

    degenerierenden Nervensegmenten. Nerve Growth Factor (NGF) und Brain Derived

    Neurotrophic Factor (BDNF) sind bereits in den ersten Tagen nach der Verletzung

    vermehrt vorhanden. Ferner kommt es zu einer Hochregulation von pro- und

    antiinflammatorischen Zytokinen, die eine T-Zell-Entzndungsreaktion verhindern

    (Stoll and Mller, 1999).

    Reaktion im proximalen Anteil der Nervenzelle

    Innerhalb weniger Tage nach der Lsion stirbt das uerste Ende des proximalen Teils

    des Axons ab. Durch Anstau von Zellmaterial, dass mit dem axoplasmatischen Flu

    antransportiert wird, schwillt das Axon an und es bildet sich aus dieser Anschwellung

    ein Wachstumskolben. Zunchst findet durch Phagozytose von Makrophagen eine

    Abrumreaktion von Zelltrmmern und Schwannzellen statt. Es knnen zystische

    Defekte, Bindewebsnarben oder Glianarben entstehen.

    Aus dem Wachstumskolben wachsen in der Folgezeit viele feine Sprossen aus

    (Abbildung 4), die eine Verbindung mit den Resten des ehemaligen distalen Axonende

    bekommen sollen. Im distalen Stumpf wird eine Reihe von Moleklen vermehrt

    gebildet, die das Auswachsen von Neuriten nach distal frdern sollen. So untersttzt

  • 16

    eine Chemotaxis durch im distalen Stumpf freigesetzte Zytokine, wie Tumor Necrosis

    Factor Alpha (TNF-), verschiedene Interferone und Neurotrophe Faktoren, wie Ciliary

    Neurotrophic Factor (CNTF) und NGF, das Auswachsen der Axone nach distal.

    Zustzlich verhindern die genannten Stoffe das Absterben der axotomierten Perikarya

    im proximalen Nerven. Die Geschwindigkeit des Auswachsens neuer Axone liegt, je

    nach Literaturangabe, zwischen 1-3mm pro Tag. Bei Ausbleiben von

    Wachstumsfaktoren, findet keine Axonaussprossung statt. Man nimmt daher an, dass

    durch eine zustzliche externe Applikation von neurotrophen Faktoren das

    Axonwachstum und die Regeneration gefrdert und beschleunigt werden knnen (siehe

    unten).

    Bei vollstndiger Axotomie und fehlender Reanastomosierung, knnen die von

    proximal auswachsenden Axone den distalen Stumpf nicht erreichen. Durch die Bildung

    von Narbengewebe durch Schwann-Zell- und Fibroblastenwucherung kann es ebenfalls

    zum Fehlen einer Anschlussmglichkeit des proximalen und des distalen Stumpfes

    kommen. Fehlt der Kontakt zu den leitenden Bngner-Bndern verlieren die

    nachwachsenden Axone bald ihre proximodistale Ausrichtung und wachsen aberrierend

    und knuelartig durcheinander. Zusammen mit einem Narbenbindegewebe bildet sich in

    diesem Fall in Narbenneurom. Histologisch liegen in Neuromen zahlreiche, in

    verschiedenen Richtungen wachsende, kleine Nervenfaserbndel. Diese Bndel

    besitzen nur wenige Nervenfasern und sind von einer mehrschichtigen perineuralen

    Hlle umgeben. Die Nervenfaserbndel liegen in einem zunehmend derber werdenden,

    kollagenen Bindegewebe, welches eine unterschiedlich starke Vaskularisierung aufweist

    (Schiebler T et al., 1996).

    Prozesse der Myelinisierung

    Untersuchungen zur Entwicklung von Myelinscheiden deuten daraufhin, dass es einen

    initialen Ansto zur Myelinisierung geben knnte. Dieses Signal bestimmt auch die

    Dicke der Myelinscheide, die dann gleichmig aufrechterhalten wird, ohne dass dafr

    zustzliche Informationen notwendig sind (Fraher and Dockery, 1998). Vor kurzem

    wurde entdeckt, ein einzelner Wachstumsfaktor, das Neuregulin-1 ein solch ein Signal

    fr Schwann-Zell Proliferation und Myelinisierung ist (Review: Nave and Salzer,

    2006). Die Neuregulin-1 Familie beinhaltet mehr als 15 membranassoziierte und freie

  • 17

    Proteine, deren Expression nicht spezifisch fr das Nervensystem ist (Esper et al.,

    2006). Innerhalb des Nervensystems werden hufig NRG-1 Typ I und III insbesondere

    durch Motoneuronen und Spinalganglienneuronen exprimiert. NRG-1 Proteine

    vermitteln ihre Effekte durch die Interaktion mit ErbB-Rezeptoren, welche zur EGF-

    Rezeptor Superfamilie gehren (Citri et al., 2003). Whrend der Entwicklung des

    Nervensystems initiiert das Signal durch NRG-1 Typ III der Neurone auf den Erb-

    Rezeptorkomplex der Schwann-Zellen die Myelinisierung. Es ist jedoch nicht nur der

    Beginn der Myelinisierung, sondern auch deren Ausma fr die entsprechende Funktion

    des myelinisierten Axons von mageblicher Bedeutung. Michailov et al. zeigten, dass

    dieses zumindest teilweise durch die Menge von Membran-assoziiertem NRG-1 Typ III

    auf der Axonoberflche abhngig ist. Eine Vernderung dieser Menge bedeutet eine

    Vernderung der g-ratio. Das Ausma der Expression des ErbB2/ErbB3-Rezeptors auf

    der Schwann Zelle spielt nicht die gleiche entscheidende Rolle, weil dieser

    Rezeptorkomplex normalerweise in groen Mengen vorhanden ist . Zusammenfassend

    ist die frhere Meinung, dass Myelinisierung von der Axongre abhngig ist nicht

    falsch, sondern stimmt mit der Beobachtung berein, dass grere Axone auf ihrer

    Oberflche den Schwann-Zellen quantitativ mehr NRG-1 Typ III zur Interaktion zur

    Verfgung stellen, was zur besseren Myelinisierung fhrt.

    Dieser Mechanismus spielt auch in der Regeneration peripherer Nerven eine Rolle. Es

    wurde gezeigt, dass NRG-1 whrend der Waller-Degeneration die Proliferation von

    Schwann-Zellen stimuliert. Dazu kommt, dass ErbB2 innerhalb Minuten nach einer

    Nervenverletzung durch Phosphorylierung aktiviert wird, gefolgt von einer

    Hochregulation der ErbB2-Rezeptoren.

    Interessanterweise wurde in weiteren Arbeiten gezeigt, dass neurotrophe Faktoren

    (NGF, GDNF) zu einer raschen Freisetzung von NRG-1 durch kultivierte Motoneurone

    und Spinalganglienneurone fhrte. Diese Freisetzung ist dosisabhngig und geschieht

    innerhalb von Minuten. Gemeinsam mit der Tatsache betrachtet, dass NRG-1 die

    GDNF-Expression von Schwann-Zellen frdert, scheint es eine Regulationsschleife

    zwischen glia-axo-glialen Signalen durch Wachstumsfaktoren zu geben, welche das

    berleben von Nervenzellen und die Proliferation bzw. die Differenzierung von

    Schwann-Zellen bedingen (Nave and Salzer, 2006).

  • 18

    Regeneration im zentralen Nervensystem

    Es ist bekannt, dass das zentrale Nervensystem eine viel schlechtere

    Regenerationskapazitt als das periphere Nervensystem hat. Es existieren vier

    anerkannte Theorien, die versuchen diese geringe Regenerationskapazitt des zentralen

    Abbildung 4: Schematische Darstellung der wichtigsten Vernderungen nach Axotomie.A: Normal myelinisierte Nervenfaser mit Neuron und intakter Verbindung zum Skelettmuskel;B: Nach Axotomie verlagert sich der Nucleus in die Peripherie des vergrerten Neurons. Im distalem Abschnitt kommt es zur Wallerschen Degeneration. Die endogene Produktion der Wachstumsfaktoren gesteigert, Abumraktionen von Zelltrmmern und Schwann-Zellen findet statt; C: Proliferierende Schwann-Zellen bilden im distalen Abschnitt das Bngnersche Band, das dem auswachsenden Axon als Leitschiene dient. Der Muskel ist atrophisch; D: Nach erfolgreicher Regeneration wird der Skelettmuskel reinnerviert. Die Remyelinisierung findet anschlieend statt (Abbildung nach Schiebler, Histologie)

  • 19

    Nervensystems zu erklren. Diese vier Modelle wurden jeweils entwickelt, um daraus

    entsprechend therapeutische Anstze zur Behandlung von zentralen Nervenlsionen zu

    entwickeln:

    Periphere Nerven scheinen eine gnstigere Mikroumgebung als zentrale Axone zu

    haben. Das liegt daran, dass Schwann-Zellen in der Lage sind, wachstumsfdernde

    Faktoren an der Lsionsstelle zu produzieren, die normalerweise im ZNS nicht

    vorkommen. Zahlreiche Studien des letzten Jahrhunderts haben gezeigt, dass einige

    Bestandteile des peripheren Nerven und der Schwann-Zellen potente Frderer fr

    axonales Wachstum sind. Dazu gehren Komponenten der Schwann-Zell Basallamina,

    wie Laminin, Zelladhsionsmolekle der Immunglobulinsuperfamilie wie NgCAM/L1.

    Dazu kommt, dass denervierte distale Axonstmpfe die Produktion von Neurotrophinen

    oder anderen trophischen Moleklen erhhen. Zentrale Gliazellen sind dagegen kaum

    Quelle fr derartige Molekle. Sie enthalten beispielsweise wenig Laminin und

    produzieren typischerweise nur kleine Mengen trophischer Molekle. In der

    Embyonalentwicklung findet sich dagegen sowohl im peripheren als auch im zentralen

    Nervensystem eine wachstumspermissive Umgebung. Wahrscheinlich ist es so, dass

    lediglich das periphere Nervensystem in der Lage ist nach einer Verletzung diese

    Umgebung wieder zu entwickeln.

    Die Umsetzung dieser Theorie ist der Versuch mit der Applikation neurotropher

    Faktoren oder anderer Molekle wie Laminin eine erhhte Regenerationskapazitt im

    ZNS zu erreichen. In anderen Fllen wurden Schwann-Zellen selbst in das ZNS

    eingebracht, um eine Umgebung zu erreichen, die der wachstumspermissiven des PNS

    gleicht.

    In den 1980er Jahren wurde eine vollkommen andere Theorie entwickelt: Nach dieser

    haben beide Teile des Nervensystems eine ausreichende Regenerationskapazitt. Der

    zentrale Teil des Nervensystems enthlt jedoch auch Elemente, die hemmend auf die

    Regeneration wirken. Tatschlich ist die zentrale Myelinscheide, bestehend aus

    Oligodendrozyten ein potenter Inhibitor des axonalen Wachstums. Dies erklrt

    vielleicht warum die Myelinisierung in der Entwicklung sehr spt stattfindet - nmlich

    nachdem die Nervenbahnen bereits gebildet sind. Es wurden zwei Elemente entdeckt,

    die fr diese inhibitorische Funktion der Oligodendrozyten verantwortlich sind: Eines

    ist das Myelin-Associated-Glykoprotein (MAG), ein struktureller Bestandteil des

  • 20

    Myelin, der in der Lage ist das Auswachsen von Axonen bei bestimmten Neuronen zu

    frdern oder aber im Gegenteil das Auswachsen anderer Neurone zu hemmen. Das

    zweite Element ist ein Protein, das Neurite inhibitor of 35 kDa (NI-35) genannt wird.

    In Zellkulturen konnte gezeigt werden, dass mit einer Ausschaltung dieser Proteine

    durch Antikrper ein Auswachsen von Axonen zentraler Neurone auf einem Rasen von

    Oligodendrozyten stattfindet, ohne deren Hemmung jedoch nicht. Eine andere

    Mglichkeit ist, die inhibitorische Signalkaskade, die durch Proteine ausgelst wird,

    durch die Blockade von second-messenger Systemen zu unterbrechen.

    Ein drittes Modell betont nicht die Unterschiede der Umgebung des Nervs, sondern die

    Unterschiede zwischen peripheren und zentralen Neuronen. Einige Experimente haben

    gezeigt, dass die Regenerationsfhigkeit eines zentralen Neurons mit fortschreitendem

    Alter sinkt, wohingegen die Regenerationsfhigkeit eines peripheren Neurons bei

    geeigneter Umgebung erhalten bleibt. Eine Erklrung fr diesen Unterschied liegt in der

    Expression eines Proteins, von dem man annimmt, dass es fr das Auswachsen von

    Axonen von entscheidender Bedeutung sei. Es handelt sich dabei um das Growth-

    associated-Protein-43 (GAP 43), das whrend der embryonalen Phase der Entwicklung

    in beiden Teilen des Nervensystems in hohen Konzentrationen exprimiert wird. Im

    peripheren Nervensystem bleibt die Konzentration des GAP 43 auch im

    Erwachsenenalter hoch und wird nach Axotomie erhht, whrend es im zentralen

    Nervensystem nach Abschlu der Entwicklung kaum zu finden ist und auch nach

    Axotomie nicht nennenswert vermehrt exprimiert wird. Zur Umsetzung dieses Ansatzes

    wurden fetale Neurone in das ZNS eingebracht.

    Das vierte Modell schlielich konzentriert sich auf die sekundren Vernderungen, die

    nach Axotomie stattfinden: Durch die Verletzung von Gewebe des zentralen

    Nervensystems kommt es zur Astrozytenproliferation, Aktivierung von Mikroglia,

    Narbenbildung und Invasion von Zellen des Immunsystems. Diese Vorgnge wirken

    sich inhibierend auf ein mgliches Axonwachstum aus. Es konnte gezeigt werden, dass

    durch Vermeidung eines groen Verletzungsausmaes und der darauf folgenden

    Narbenbildung weit mehr Regeneration im ZNS stattfindet, als bei riesigem

    Verletzungsausma.

  • 21

    Um die Narbenbildung und Immunreaktion zu verhindern wurden Immunsupressiva,

    antiinflammatorische Substanzen und Enzyme appliziert. Tatschlich wird

    Methylprednisolon heute routinemig bei Rckenmarkverletzungen appliziert. Ein

    positiver Effekt dieser therapeutischen Intervention ist mehrfach nachgewiesen worden

    (Kandel E et al., 2000).

    Therapieanstze zur Behandlung von Nervenwurzelausrissen

    Allgemeine Therapieanstze fr Nervenverletzungen

    Seit Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts gibt es in der Humanmedizin zahlreiche

    Anstze, um Nerven- und Muskelfunktion nach unterschiedlichsten Verletzungen des

    peripheren Nervensystems wiederherzustellen. Hierzu zhlen der Einsatz von

    Nerveninterponaten, die autolog (z.B. N. suralis) oder auch artifiziell (z.B.

    schwammhnliche Materialien oder Rhren) sein knnen. Hinzu kommt der Versuch,

    artifizielle Nerveninterponate mit helfenden Zellen (z.B. Schwann-Zellen) zu versehen

    oder aber auch exogene, lsliche neurotrophe Faktoren in die Regenerationszone

    einzubringen. Nach einer Nervendurchtrennung weist die primre, mikrochirurgische

    Nervennaht unter Bercksichtigung der intraneuralen Topographie die besten

    Regenerationsergebnisse auf (Schmidt and Leach, 2003; Frostick et al., 1998).

    Therapieanstze fr Nervenwurzelausrisse

    Historische Entwicklung

    Die erste Beschreibung einer Nervenwurzelverletzung mit Beteiligung des Plexus

    brachialis stammt aus einem Case report, der zu Beginn des 19. Jahrhunderts

    verffentlicht wurde (Flaubert G., 1827). 1911 wurde die erste intradurale Exploration

    einer solchen Plexus brachialis Verletzung vorgenommen. Bereits in dieser Arbeit

    wurde eine frhestmgliche chirurgische Behandlung der Verletzung empfohlen

    (Frazier CH and Skillern PG, 1911). Die erste chirurgische Behandlung einer

    intraspinalen Plexusverletzung erfolgte erst 1979 (Bonney G and Jamieson A, 1979;

    Carlstedt et al., 2000).

  • 22

    Technik des Nerventransfers

    Ein chirurgischer Therapieansatz zur Wiederherstellung der ausgefallenen Funktionen

    bei Nervenwurzelausrissen ist der Transfer der geschdigten Nervenfasern des Plexus

    auf intakte Nerven (Terzis J.K., 1999; Fantis and Slezk, 1967). Ein hufig angewandtes

    Verfahren ist der Nerventransfer des N. accessorius auf den N. suprascapularis bei

    Schdigung C5 und C6. Das funktionelle Ergebnis solcher Nerventransfers erlaubt eine

    Wiederherstellung der Funktion - zumindest der wirbelsulennahen und der

    Oberarmmuskulatur. Die Reinnervation von Unterarm oder Handmuskulatur kann nicht

    stattfinden.

    Replantationstechnik von Nervenwurzeln

    In den letzten Jahren ist durch Thomas Carlstedt und seine Mitarbeiter ein neuer

    chirurgischer Therapieansatz entwickelt worden (Carlstedt et al., 1993a; Carlstedt et al.,

    2000; Carlstedt et al., 1995; Carlstedt, 2000; Carlstedt et al., 1988; Carlstedt, 1991;

    Carlstedt, 1983; Carlstedt et al., 1993b; Cullheim et al., 1989). Grundlage ist die

    Wiederherstellung der Kontinuitt zwischen ausgerissenen Nervenwurzeln und

    Rckenmark durch Replantation direkt im Bereich des verletzten

    Rckenmarkssegments. Mit dieser Technik konnte gezeigt werden, dass ein

    Auswachsen von Vorderwurzelaxonen in die replantierte Vorderwurzel mglich ist

    (Carlstedt et al., 1995; Cullheim et al., 1989; Hallin et al., 1999).

    Im Gegensatz dazu zeigte sich, dass die Axone der Hinterwurzel nicht in der Lage sind,

    nach einer chirurgischen Replantation spontan in das Rckenmark einzuwachsen. Die

    beiden vermuteten Hauptursachen dafr sind erstens die Narbenbildung durch

    Astrozyten an der bergangszone zwischen dem peripheren und zentralen

    Nervensystem (Fernaud-Espinosa et al., 1993; Tang et al., 2004) und zweitens das

    wachstumsrestriktive Milieu des zentralen Nervensystems (Bandtlow et al., 1990;

    Pesheva et al., 1989; Schnell and Schwab, 1990). Zahlreiche Studien der vergangenen

    Jahre versuchten diese Bedingungen zu verndern. Vielversprechende erste Ergebnisse

    zeigte die Applikation neurotropher Faktoren oder die Neurotrophin Gentherapie

    (Oudega and Hagg, 1996; Ramer et al., 2000; Ramer et al., 2001; Romero et al., 2001;

    Deng et al., 2000). Ein weiterer experimenteller Ansatz zur Verbesserung der

    Regeneration der Hinterwurzel ist das Einbringen von olfaktorischen Hllzellen

  • 23

    (OECs=olfactory ensheathing cells) (Ramn-Cueto and Nieto-Sampedro, 1994) oder

    neuronalen Stammzellen (Ohta et al., 2004) direkt an die bergangszone zwischen

    peripherem und zentralen Nervensystem.

    Unter klinischen Bedingungen ist es derzeit jedoch nicht mglich, eine funktionelle

    Verbindung zwischen Hinterwurzelaxonen und Rckenmark herzustellen. Aus diesem

    Grund werden die verletzten Hinterwurzeln nicht behandelt, wohingegen die

    Vorderwurzeln chirurgisch replantiert werden. Erstaunlicherweise wurde bei Patienten,

    bei denen eine Replantation der Vorderwurzel durchgefhrt worden war, festgestellt,

    dass sie neben der Wiederherstellung einiger motorischer Funktionen auch sensorische

    Qualitten wie z.B. Propriozeption, Temperatur- und Schmerzempfindung

    wiedererlangten (Carlstedt, 2000). Eine Erklrung fr dieses Phnomen gibt es derzeit

    nicht. Es wurde spekuliert, dass dies durch intraspinale Sprossung zuvor stummer

    Fasern ber angrenzende Nervenwurzeln (Darian-Smith, 2004), oder durch Sprossung

    aus Hinterhornneuronen entlang der replantierten Vorderwurzel zustande gekommen

    sein knnte (Carlstedt, 2000). Vorderwurzeln enthalten eine Population dnner

    myelinisierter und unmyelinisierter Axone aus dem Spinalganglion, die ebenfalls fr

    derartige Phnomene verantwortlich sein knnten (s.o.) (Hildebrand et al., 1997;

    Schenker and Birch, 2000) .

    Operationtechnik nach Thomas Carlstedt

    Die ausgerissene Vorderwurzel wird in diesem neuen chirurgischen Verfahren in einem

    Areal zwischen den physiologischen Austrittsstellen von Vorder- und Hinterwurzel

    ventrolateral replantiert (Abbildung 5). Durch eine kleine Inzision in die Pia mater wird

    erreicht, dass die ausgerissene Vorderwurzel in direkten Kontakt mit dem Rckenmark

    kommt. Durch die Narbe, die dabei entsteht, werden neurotrophe Faktoren gebildet, die

    das berleben von Neuronen begnstigen sollen (Carlstedt et al., 1993a; Hallin et al.,

    1999). Somit soll durch eine ausreichende Anzahl an berlebenden Motoneuronen die

    Grundlage fr eine Regeneration geschaffen werden.

    Zahlreiche Studien konnten zeigen, dass einige Zeit nach Replantation Axone von

    berlebenden Motoneuronen ausgewachsen sind und Anschluss an die replantierte

    Vorderwurzel gefunden haben. Funktionell konnte eine Wiederherstellung der

    paravertebralen und der proximalen Schultermuskulatur und gelegentlich auch der

  • 24

    Oberarmmuskulatur erreicht werden (Carlstedt et al., 1993a; Carlstedt et al., 2000;

    Carlstedt et al., 1995). Mit diesem Ergebnis hat sich dieses neue Verfahren im

    Vergleich zu frheren Therapieanstzen wie dem Nerventransfer als nicht berlegen

    erwiesen. Eine adquate Therapie mit einem befriedigenden funktionellen Ergebnis fr

    Nervenwurzelausrisse existiert daher bis heute nicht (Holtzer et al., 2002; Lang et al.,

    2005a).

    Abbildung 5: Schematische Darstellung der Technik der Vorderwurzelreplantation nach Thomas Carlstedt. Links: Rckenmarkssegment mit ausgerissener Vorderwurzel; Rechts: Ventrolaterale Replantation der Vorderwurzel; Modifizierte Abbildung nach Carlstedt et al., 1993b; Carlstedt et al., 1993a.

    Voraussetzungen fr eine Verbesserung der Therapieanstze der Vorderwurzel

    Die Suche nach einer Verbesserung der bisherigen Therapieanstze zur funktionellen

    Wiederherstellung der zunchst der motorischen Innervation wirft die Frage auf, welche

    grundstzlichen Vorraussetzungen zu erfllen sind. Zunchst erscheint es sinnvoll eine

    Replantation der Voderwurzel dem Nerventransfer vorzuziehen, da der Nerventransfer

    immer den Ausfall anderer Innervationsgebiete zur Folge hat. Zur Verbesserung der

    Replantationstechnik der Vorderwurzel sind vor allen anderen Gesichtspunkten

    insgesamt drei wesentliche Punkte zu erfllen (Lang et al., 2005b):

    1. Eine ausreichende Anzahl an Motoneuronen muss das Trauma berleben und die

    Fhigkeit haben, neue Axone in die Peripherie auswachsen zu lassen.

    2. Die Verbindung zwischen Rckenmark und ausgerissener Vorderwurzel muss

    wiederhergestellt werden.

  • 25

    3. Die regenerierenden Axone mssen qualitativ hochwertig sein.

    Voruntersuchungen zur vorliegenden Arbeit

    In einigen Studien konnte gezeigt werden, dass es bereits in der ersten Woche bzw.

    innerhalb von drei Wochen nach einem Vorderwurzelausriss zu einem Verlust von bis

    zu 80% der Motoneuronen im betroffenen Segment kommt (Carlstedt, 1997; Carlstedt

    T., 1997b; Cullheim et al., 1989; Koliatsos et al., 1994). Voruntersuchungen zur

    vorliegenden Arbeit zeigten, dass allein durch Replantation der Vorderwurzel mehr

    Motoneurone die Verletzung berleben (Verlust von 33,5 7,1%). Es wurde weiter

    gezeigt, dass mit Applikation neurotropher Faktoren (ohne Replantation) ein erheblicher

    Anteil von Motoneuronen vor dem Zelluntergang bewahrt werden kann. In einem

    Plexus brachialis Lsionsmodell, wurden nach Ausriss der Vorderwurzeln, neurotrophe

    Faktoren auf die Ausrisstelle appliziert. Es wurden in verschiedenen Versuchsgruppen

    CNTF (ciliary neurotrophic factor), BDNF (brain derived neurotrophic factor) und eine

    Kombination aus beiden Faktoren verwendet. Nach einer berlebenszeit von einer

    Woche konnte gezeigt werden, dass diejenigen Tiere, die neurotrophe Faktoren erhalten

    hatten, einen deutlich niedrigeren Verlust von 16,9 14.3 % (CNTF-Gruppe ) bzw. 28,0

    11.4 % (BDNF-Gruppe) Motoneuronen zeigten als die Kontrollen mit 54,4 12.1 %,

    die keine Faktoren erhalten hatten. Dieser positive Effekt neurotropher Faktoren konnte

    auch nach drei Wochen nach gleicher Behandlung gezeigt werden (Lang et al., 2005a).

    Auch andere Arbeiten zeigten in verschiedenen Modellen vergleichbare Effekte

    neurotropher Faktoren auf das berleben von Motoneuronen z.B (Ma J., 2001; Novikov

    et al., 2000; Novikov et al., 1995; Novikov et al., 1997).

    Neurotrophe Faktoren

    Neurotrophe (trophisch, griechisch: frdernd, ernhrend) Faktoren sind eine Guppe von

    Polypeptiden, die das berleben von neuronalen Populationen frdern und eine Rolle

    bei der Entwicklung und Differenzierung von Neuronen spielen. Die Entdeckung des

    ersten neurotrophen Faktors Nerve Growth Factor (NGF) durch Cohen und Levi-

    Montalcini (1951) gilt als Meilenstein in der Untersuchung von Wachstumsfaktoren und

    lste die Suche nach weiteren Faktoren aus. Heutzutage wei man, dass NGF nur einer

  • 26

    unter vielen neurotrophen Faktoren ist, der fr die oben genannten Effekte

    verantwortlich sein kann.

    Ursprnglich hatte man angenommen, dass neurotrophe Faktoren das berleben von

    Neuronen frdert, indem die Faktoren den Metabolismus der Zellen in einer positiven

    Weise beeinflussen. Heute nimmt man an, dass die Faktoren u.a. das

    Apoptoseprogramm der Zellen unterdrcken.

    Neurotrophe Faktoren werden nach ihren Eigenschaften und Rezeptoren in drei

    verschiedene Hauptfamilien eingeteilt (Drenckhahn D, 2004a):

    Die Neurotrophine der NGF Familie; dazu gehren:

    NGF (Nerve growth factor)

    BDNF (Brain derived neurotrophic factor)

    NT-3 (Neurotrophin-3)

    NT-4/5 (Neurotrhophin 3/4)

    Die Familie der Neurokine (Interleukin-6-Familie); dazu gehren

    CNTF (Ciliary neurotrophic Factor)

    LIF (Leukaemia inhibitory factor)

    Cardiotrophin

    Die Familie der Transforming growth factors

    TGF-1 (Transforming growth factors)

    TGF-2 (Transforming growth factors)

    TGF-3 (Transforming growth factors)

    GDNF (Glial derived neurotrophic factor)

    FGF (Fibroblast growth factor)

    Persephin

    Neurturin

    Artemin

    Andere Quellen (Kandel E et al., 2000) ordnen den FGF in eine eigene Familie ein.

    Neurotrophine der NGF- Familie

    Die Familie der Neurotrophine gilt als die am besten untersuchte Gruppe der

    neurotrophen Faktoren. Die Mitglieder dieser Familie BDNF (Brain derived

  • 27

    neurotrophic factor), NT-3 (Neurotrophin-3), NT-4/5 (Neurotrophin 4/5) zeigen eine

    hohe strukturelle hnlichkeit zu NGF (Nerve growth factor).

    Neurotrophine interagieren mit zwei Rezeptorhauptklassen: Die transmembransen, als

    Dimer vorliegenden Tyrosinkinaserezeptoren mit dem Namen trk-A, trk-B, trk-C.

    Dabei interagiert NGF hauptschlich mit trk-A, BDNF und Neurotrophin 4/5 mit trk-B

    und Neurotrophin-3 mit trk-C, aber ferner auch mit trk-B. Die Aktivierung der trk-

    Rezeptoren durch Bindung des Liganden fhrt zunchst zur Dimerisierung. Die

    anschlieende Phosphorylierung der zytoplasmatischen Domne fhrt zur Aktivierung

    spezifischer intraneuronaler Signalmolekle, von denen viele auch durch andere

    Tyrosinkinaserezeptoren aktiviert werden knnen.

    Neurotrophine binden auch an den p75NTR (NTR=Neurotrophinrezeptor). Im Gegensatz

    zu den trk-Rezeptoren bindet jedes Neurotrophin mit gleicher Affinitt an den p75NTR.

    Dem p75NTR werden verschiedene Funktionen zugeschrieben: Eine Rolle ist, dem trk-A-

    Abbildung 6: Schematische Darstellung derNeurotrophinrezeptoren, ihrer Liganden und der intrazellulren Wirkung (modifizierte Abbildung nach Principles of Neural Science)

  • 28

    Rezeptor NGF zu prsentieren. Die zweite Rolle ist die bertragung intrazellulrer

    Signale direkt durch Aktivierung von Transduktionswegen, die durch Signale ausgelst

    wurden, die von Membranlipiden getriggert werden. An Zellen, denen trk-Rezeptoren

    fehlen konnte gezeigt werden, dass die Aktivierung von p75NTR den Tod dieser Zellen

    frdert, statt das Absterben zu verhindern.

    BDNF (brain derived neurotrophic factor)

    BDNF gehrt zur Familie der Neurotrophine. Nach Verletzung der Nervenzelle

    unterliegt BDNF unter anderem einem retrograden Transport. Es konnte in vitro und in

    vivo gezeigt werden, dass das berleben und die Differenzierung von Motoneuronen

    durch BDNF gefrdert wird (Novikov et al., 1997). Auch wird die Regulation der

    entwickelnden neuromuskulren Synapse u.a. durch BDNF beeinflut. Dieser

    Sachverhalt erhht die Wahrscheinlichkeit, da BDNF zur Verbesserung der

    Nervenregeneration erfolgreich genutzt werden knnte. In einer Studie von Utley et al.

    wurde gezeigt, da Tiere, die nach einer peripheren Nervenverletzung mit BDNF

    gemeinsam mit Collagen Tubulisation behandelt wurden, die grte

    Wiederherstellung der Funktion und durchschnittlich den grten Axondurchmesser

    aufweisen (Utley et al., 1996). Jngere Studien fanden dagegen keinen Hinweis darauf,

    da BDNF einen frdernden Effekt auf die axonale Regeneration hat. Die

    unterschiedlichen Ergebnisse knnten durch eine unterschiedliche Dosierung und

    andere Art der Bewertung zustande gekommen sein.

    Vor kurzem wurde gezeigt, dass die Bindung von BNDF an den p75NTR in frhen

    Abschnitten der postnatalen Entwicklung unter anderem fr die Myelinisierung von

    Axonen durch Schwann-Zellen verantwortlich ist (Cosgaya et al., 2002) (Abbildung 6).

    Es konnte weiter gezeigt werden, dass die Applikation von exogenem BDNF die

    Myelinisierung von Axonen frdert. Die BDNF Applikation hatte neben der erhhten

    Produktion von Myelin durch Schwann Zellen direkten Einfluss auf die Dicke der

    Myelinscheide. Cosgaya et al. konnten durch Versuche beweisen, dass die Bindung von

    BDNF an den p75NTR Rezeptor der Schlsselprozess fr die Produktion von Myelin

    durch Schwann Zellen war.

    Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde ein Modell fr die Aktivitt von

    Neurotrophinen und deren Wechselwirkungen mit ihren Rezeptoren im peripheren

  • 29

    Nervensystem in Bezug auf die Myelinisierung vorgeschlagen. Danach spielt sich die

    Myelinisierung in verschiedenen Stadien ab, die sich aus Proliferation und

    Einwanderung von Schwann-Zellen gefolgt von Verlngerung und Einhllung der

    Axone und schlielich aus der Formation des Internodiums zusammensetzen. Whrend

    dieser Stadien spielt die Verfgbarkeit von Neurotrophinen und deren Rezeptoren eine

    entscheidende Rolle. Wichtig sind NT-3 und sein Rezeptor trk-C sowie BDNF und sein

    Rezeptor p75NTR, die alle im prmyelinisierten Nerven exprimiert werden. Trk-C und

    NT-3 verhindern zunchst die Myelinisierung und halten die Schwann-Zellen im

    Proliferationsstadium. Wenn die Schwann- Zellen Verbindung mit dem Axon

    aufgenommen haben, erfolgt eine Herunterregulation von trk-C und NT-3, whrend

    p75NTR und BDNF vermehrt exprimiert werden. Ist die Myelinscheide gebildet, werden

    beide Neurotrophine und deren Rezeptoren herunterreguliert (Notterpek, 2003;

    Hempstead and Salzer, 2002).

    Familie der Neurokine

    Zur Familie der Neurokine gehren CNTF (ciliary neurotrophic factor) und LIF

    (leukemia inhibitory factor). Ferner werden auch Cardiotrophin-1 und andere IL-6

    hnliche Faktoren zu dieser Familie gerechnet.

    Neurokine entfalten ihre Wirkung ber einen heterodimeren Rezeptor, bestehend aus

    den Untereinheiten gp130 und LIFR-. Die Wirkung von CNTF wird ermglicht durch

    eine weitere hochaffine Untereinheit, genannt CNTFR-, die nur im ZNS exprimiert

    wird und mit einem Lipidanker in der Zellmembran verankert ist.

    CNTF (ciliary neurotrophic factor)

    Der ciliary neurotrophic factor (CNTF) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von

    22-24 kDa. Es wurde erstmals in embryonalem Hhneraugengewebe entdeckt. In

    anschlieenden Untersuchungen wurde CNTF im Nervus ischiadicus von erwachsenen

    Kaninchen und Ratten nachgewiesen. CNTF besitzt eine hnliche Struktur wie andere

    hmatopoetische Zytokine, insbesondere bestehen groe hnlichkeiten mit Leukemia

    inhibitory Factor (LIF). Sie teilen die Eigenschaft in vitro noradrenerge Neurone im

    Phnotyp in cholinerge Neurone umzuwandeln (Terenghi, 1999).

    CNTF war der erste neurotrophe Faktor, bei dem nachgewiesen wurde, dass er das

    berleben von -Motoneuronen sowohl in vivo als auch in vitro frdert (Masu et al.,

  • 30

    1993). Der Faktor wird im PNS von Schwann- Zellen exprimiert und im ZNS von

    Astrozyten.

    Nach Axotomie fllt der Anteil an CNTF m-RNA dramatisch im distalen Stumpf und

    erhht sich erst nach der axonalen Regeneration wieder. Man nimmt an, dass exogenes

    CNTF die periphere Nervenregeneration verbessern knnte.

    Funktionell frdert CNTF das Auswachsen von Axonen sensibler und sympathischer

    Neurone, frdert das berleben von Motoneuronen, verhindert ber bereits erluterte

    Mechanismen die Apoptose, rettet entwickelnde Rattenmotoneurone vor dem Zelltod

    nach Axotomie und verhindert die Degeneration von Axonen und Somata der

    Motoneuronen (Sendtner, 1995; Sendtner et al., 1994). Auch fr Prozesse der

    Myelinisierung ist der Einflu von CNTF von Bedeutung. Einige Arbeiten konnten in

    der Vergangenheit zeigen, dass CNTF einen Einflu auf Oligodendrozyten und damit

    auf die Myelinisierung im ZNS nimmt, was von groem Interesse fr Therapieanstze

    zentral demyelinisierender Erkrankungen ist (Stankoff B., 2002; Barres et al., 1996;

    Mayer M., 1994). Ein erster Hinweis, dass CNTF auch Einflu auf Schwann-Zellen und

    Myelinisierung im PNS nimmt existiert seit kurzem. Allerdings fehlt ein quantitativer

    Nachweis dieser Beobachtung (Zhang et al 2004).

    Abbildung 7: Schematische Darstellung des CNTF-Rezeptors und seines intrazellulren Wirkmechanismus. Nach Bindung von CNTF an seinen heterodimeren Rezeptor und der Untereinheit CNTF- erfolgt intrazellulr eine Autophosphorylierung ber Januskinasen mit anschlieender Aktivierung von Statinen. Dieser Mechanismus fhrt letztendlich zur Verhinderung von Zelltod und begnstigt Auswachsen neuer Axone (modifizierte Abbildung nach Principles of Neural Science

  • 31

    Familie der Transforming Growth Factors

    Die Familie der Transforming growth factors ist sehr gro. Zahlreiche sehr bekannte

    und wichtige Faktoren gehren ihr an. Dazu gehren TGF-1, TGF-2, TGF-, GDNF

    (Glial cell-line Derived Neurotrophic Factor), das in der Entwicklung sehr wichtige

    Bone morphogenetic protein, sowie Neuturin, Persephin, Artemin.

    Die Signaltransduktion dieser Faktoren findet ber die Rezeptoruntereinheit c-ret statt.

    Jeder Ligand bindet an eine spezifische Rezeptoruntereinheit, die als Lipidanker in der

    Membran befestigt ist (Kandel E et al., 2000; Drenckhahn D, 2004a; Drenckhahn D.,

    2004b).

    Fragestellung der Untersuchungen

    Aus den bisherigen Erkenntnissen aus den Voruntersuchungen gehen folgende

    Fragestellungen hervor:

    1. Kann in einem Tiermodell fr Plexus brachialislsion und therapie durch

    Kombination aus Replantation ausgerissener Vorderwurzeln und Applikation

    neurotropher Faktoren auf die Replantationsstelle das berleben der Motoneuronen

    nach einem Vorderwurzelausriss langfristig erhht werden, so dass eine ausreichende

    Anzahl Motoneuronen fr eine hochwertige Regeneration zur Verfgung stehen?

    2. In welchem Ausmass und ber welche Wege findet ein Auswachsen regenerierender

    Axone in die ventrolateral replantierte Vorderwurzel statt?

    3. Hat die Applikation neurotropher Faktoren Einfluss auf Quantitt (Anzahl) und

    Qualitt (Dicke und Myelinisierung ) der regenerierten Axone?

    4. Welche Vernderungen ergeben sich im Spinalganglion und den Hinterwurzelresten

    durch die Durchtrennung der Hinterwurzel und reicht der Einflu neurotropher Faktoren

    bis dorthin?

    5. Welche morphologischen Vernderungen sind im peripheren Nerven sichtbar?

    Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine detaillierte morphologische und

    morphometrische Analyse von Rckenmark, Nervenwurzeln, Spinalganglien und

    peripherem Nerven nach einer berlebenszeit der Versuchstiere von 3 Wochen bzw. 6

    Monaten durchgefhrt.

  • 32

    Material und Methoden

    Untersuchungsmaterial

    Die Untersuchungen wurden an C7 Segmenten des Rckenmarks adulter New Zealand

    Kaninchen durchgefhrt. Die operative Behandlung, die postoperative Versorgung und

    Beobachtung der Tiere, die anschlieende Perfusion und Prparation des Rckenmarks

    (s.u.) wurden von Frau Dr. med. Eva Lang (Plastische- und Handchirurgie)

    durchgefhrt. Herstellung und Analyse der Schnittprparate waren Gegenstand der

    vorliegenden Dissertation.

    Operatives Vorgehen

    Nach Einleitung der Narkose erfolgte zunchst eine Tracheotomie zum Einlegen eines

    Beatmungstubus. Die anschlieende Operation der Versuchstiere wurde ber einen

    dorsalen operativen Zugangsweg durchgefhrt. Dieser Zugangsweg hat sich in der

    Vergangenheit fr die Durchfhrung von ventrolateraler Replantation ausgerissener

    Vorderwurzeln bewhrt, da die Komplikationsraten whrend der Operation im

    Vergleich zum ventralen Zugang deutlich niedriger sind.

    Nach Hautschnitt und Prparation der paravertebralen Muskulatur erfolgte zunchst

    eine Hemilaminektomie des Wirbels C6 und anschlieend die Darstellung des

    Rckenmarksegments C7. Nach Inzision und Auftrennung der Dura mater wurde die

    Hinterwurzel dargestellt und durchtrennt. Damit wurde die Sicht auf die Vorderwurzel

    mglich. Diese wurde nun mit einem Haken aus dem Rckenmark herausgerissen und

    anschlieend ventrolateral replantiert. Dabei wurde darauf geachtet, dass die zur

    Vorderwurzel gehrigen gebndelten Fila radicularia vollstndig ausgerissen und

    replantiert wurden (Carlstedt et al., 1993a; Carlstedt et al., 2000). Nach Inzision der Pia

    mater an der geplanten Replantationsstelle erfolgte die Replantation der Vorderwurzel

    an dieser Stelle. Die primre Fixation der Vorderwurzel wurde mit 0,2 ml Fibrinkleber

    bei allen Tieren erreicht (Abbildung 8).

  • 33

    Abbildung 8: Dokumentation des operativen Vorgehens. Zunchst erfolgte die Hemilaminektomie ber dem Wirbelkrper C6 (siehe Text). Nach Erffnung der Dura mater konnte die Hinterwurzel dargestellt werden (a).Zur Darstellung der Vorderwurzel wurde die Hinterwurzel durchtrennt (b). Die Vorderwurzel wurde mit einem Haken entsprechend eines hiermit simulierten Ausrisstraumas herausgerissen (c); (d) zeigt die herausgerissene Vorderwurzel. Anschlieend erfolgte die ventrolaterale Replantation der Vorderwurzel nach dem Prinzip von Thomas Carlstedt im Bereich zwischen Ausrissstelle der Vorderwurzel und Eintrittsstelle der Hinterwurzel (e). Die primre Fixation erfolgte mit Fibrinklebe (siehe Text) (f). Die Bilder wurden zur Illustration von Frau Dr. Eva Lang zur Verfgung gestellt.

  • 34

    Bildung verschiedener Versuchsgruppen

    Bei insgesamt 10 Tieren, nachfolgend als Kontrollgruppe bezeichnet, wurde die

    Vorderwurzel wie oben beschrieben mit 0,2 ml Fibrinkleber (Tissuecol Duo S ,

    Baxter, Stadt, sterreich) fixiert. Bei den anderen Gruppen, jeweils bestehend aus 7

    Tieren wurden 10 l rekombinantes Ratten-CNTF (0.78 bzw. 1 mg/ml in PBS) oder 10

    l rekombinantes Menschen-BDNF (1mg/ml) in den Fibrinkleber gemischt und die

    Vorderwurzel auf gleiche Weise ventrolateral replantiert und fixiert. Bei der vierten

    Versuchsgruppe, ebenfalls bestehend aus 7 Tieren wurden je 10 l beider neurotropher

    Faktoren CNTF und BDNF in den Fibrinkleber gemischt.

    Diese Gruppen sind nachfolgend entsprechend der Beigabe neurotropher Faktoren in

    den Fibrinkleber als CNTF-Gruppe, BDNF-Gruppe oder CNTF+BDNF-Gruppe

    bezeichnet.

    Postoperative Beobachtung der Tiere

    Zwei Tiere mussten gettet werden, weil sie anhaltend an Gleichgewichtsproblemen

    litten, die wahrscheinlich auf einer Verletzung der Tractus spinocerebellares anterior

    und posterior beruhte. Alle weiteren Tiere, auer einem Tier der BDNF-Gruppe, das

    eine Woche nach der Operation starb, berstanden die Operation komplikationslos. Sie

    zeigten einen partiellen Verlust der Funktionen der Extensoren des Vorderlaufs, was

    durch Hinken deutlich wurde. Diese Symptomatik war fr einige Wochen

    offensichtlich, wurde im Laufe der Zeit geringer, war aber nach sechs Monaten immer

    noch vorhanden. Offensichtliche Unterschiede in der Wiederherstellung der

    Muskelfunktionen in den einzelnen Gruppen wurden nicht beobachtet.

    Perfusion und berlebenszeitrume

    Nach einer berlebenszeit von 3 Wochen (n=3 Tiere der Kontrollgruppe) bzw. einer

    berlebenszeit von 6 Monaten (n=25 Tiere aller Versuchsgruppen) erhielten die Tiere

    erneut eine Narkose mit Beatmung ber Tracheotomie und wurden transcardial

    perfundiert. Die verwendete Fixationslsung bestand aus 4% Paraformaldehyd und

    0,2% Glutaraldehyd in 0,1M Phosphat Puffer bei PH 7,4.

    Die Segmente C6-C8 wurden nach der Perfusion aus dem Wirbelkanal zusammen mit

    Hinterwurzel, Spinalganglien, Vorderwurzeln und dem proximalen Spinalnervenanteil

  • 35

    herausprpariert. Das Spinalganglion und die Vorderwurzeln wurden auf beiden Seiten

    durch einen Transversalschnitt in einen proximalen und distalen Abschnitt geteilt

    (Abbildung 9). Auf die proximale Schnittflche von Spinalganglion und Vorderwurzel

    wurde der Fluroeszenfarbstoff DiI (1,1dioctadecyl-3,3,33-tetramethylindo-

    carbocyaninperchlorat) in einer 2%igen Agar Lsung in Form von Kristallen appliziert

    und bei 37C fr die Dauer mindestens eines Jahres in Fixans inkubiert. Bei DiI handelt

    es sich um einen fluoreszierenden Farbstoff, der durch seine lipophilen Eigenschaften in

    der Lage ist, retrograd entlang von neuronalen Membranen zu wandern. Bei einer

    Inkubationszeit von 12-15 Wochen und einer Inkubationstemperatur von 37C wandert

    DiI nach Literaturangaben 28,9 2,2 mm (Lukas et al., 1998).

    Behandlung der proximalen Gewebeanteile

    Nach der Inkubationszeit wurde das Segment C7 in PBS gewaschen in 10% und 20%

    Saccharoselsung in PBS gebracht, ber Isopentan in Stickstoff eingefroren und mit

    Tissue Tek auf Korken geklebt. Die so behandelten Gewebe wurden bei -80C gelagert.

    Durch das gesamte Segment C7 wurden im Cryostat Transversalserienschnitte

    angefertigt, die eine Dicke von 30m haben. Diese Schnitte wurden auf Objektrger

    SuperfrostTM (Menzel, Braunschweig) aufgezogen, um eine anschlieende

    mikroskopische Beobachtung der Schnitte durchfhren zu knnen. Es wurden jeweils

    Abbildung 9: Methodenschema; durch Transversalschnitte auf der Hhe, an der die Vorderwurzel dem Spinalganglion anliegt erfolgte die Aufteilung des Gewebeblocks bestehend aus Segment C7 in zwei distale und einen proximalen Gewebeanteil (siehe Text). Diese beiden Gewebeanteile wurden zur Beurteilung verschiedener Aspekte unterschiedlich histologisch aufbereitet.

  • 36

    Serien aus vier Objekttrgern gebildet, auf die jeweils sechs Rckenmarkschnitte

    aufgezogen wurden. Die Reihenfolge der Schnitte ist aus folgendem Schema ersichtlich

    (Abbildung 10).

    Abbildung 10: Die Transversalserienschnitte wurden in Serien je vier Objekttrgern aufgezogen. Die Nummerierung der Schnitte im Schema zeigt die Reihenfolge, in der die Schnitte aufgezogen wurden. Bei einer Schnittdicke von 30 m ist der Abstand dieser Schnitte auf einem der Objektrger 120 m bis zum nchsten Schnitt auf dem gleichen Objekttrger. Der jeweils erste Schnitt einer solchen Serie wurde mit einer Klver-Barrera Frbung (KBF; siehe unten im Text) die drei anderen mit einer Markscheidenfrbung MSF (siehe unten im Text) gefrbt.

    Die anschlieende fluoreszenzmikroskopische Beobachtung der

    Transversalserienschnitte erfolgte mit einem Olympus Mikroskop (Olympus GmbH,

    Deutschland). Fotografien von wichtigen Schnitten wurden mit einer Olympus Kamera

    und Kodak TMAX- 400 Schwarzweifilmen (Kodak GmbH, Stuttgart) angefertigt.

    Zwei Fragestellungen sollte die anschlieende lichtmikroskopische Analyse der

    Transversalserienschnitte beantworten:

    1. Ist eine ausreichende Anzahl von Motoneuronen vorhanden und gibt es Unterschiede

    in der Anzahl der berlebenden Motoneurone in den verschiedenen Gruppen?

    2. Welche Wege nehmen regenierende Axone beim Wiederauswachsen aus den

    Neuronen durch das Rckenmark in die replantierte Vorderwurzel?

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    Diese Fragestellungen machten die Auswahl geeigneter Gewebefrbungstechniken

    notwendig. Zur Darstellung neuronaler Strukturen insbesondere des Perikaryons eignet

    sich die Kresylviolettfrbung nach Nissl, die die basophilen Strukturen der Zellen (Nissl

    Schollen) selektiv darstellt. Mit einer modifizierten Frbung nach Klver Barrera, die

    eine Kresylviolettfrbung einschliet und gleichzeitig Markscheiden schwach darstellt

    wurde jeder erste Objektrger einer Viererserie gefrbt. Dies sollte spter bei der

    Zhlung der Neurone ermglichen, d