““Algoritmos Moleculares en Hemofilia A y B. Algoritmos Moleculares en Hemofilia A y B. ""

Liliana RossettiLiliana Rossetti

Laboratorio de GenLaboratorio de Genéética Molecular de la Hemofilia.tica Molecular de la Hemofilia.Instituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICETInstituto de Medicina Experimental (IMEX), CONICET

Academia Nacional de MedicinaAcademia Nacional de Medicina

CCáátedra de Gentedra de Genéética y Biologtica y Biologíía Molecular. Facultad de Farmacia y Bioqua Molecular. Facultad de Farmacia y Bioquíímica. mica. UBAUBA

Hemofilia A y B Hemofilia A y B

-- La hemofilia es una La hemofilia es una coagulopatcoagulopatííaa ligada al cromosoma X que afecta 1:5000 ligada al cromosoma X que afecta 1:5000 varones en todas las poblaciones humanas sin distinciones varones en todas las poblaciones humanas sin distinciones éétnicas ni tnicas ni geogrgeográáficas. ficas.

-- La hemofilia A (HA), causada por mutaciones en el gen del FVIIILa hemofilia A (HA), causada por mutaciones en el gen del FVIII ((F8F8), es 4 o ), es 4 o 5 veces m5 veces máás frecuente que la hemofilia B (HB), causada por defectos gens frecuente que la hemofilia B (HB), causada por defectos genééticos ticos en el FIX (en el FIX (F9F9).).

-- La HA y la HB pueden clasificarse segLa HA y la HB pueden clasificarse segúún su severidad cln su severidad clíínicanica--bioqubioquíímica de mica de acuerdo a los valores de actividad especacuerdo a los valores de actividad especíífica del fica del FVIII:CFVIII:C o o FIX:CFIX:C en en comparacicomparacióón con la actividad del plasma promedio de la poblacin con la actividad del plasma promedio de la poblacióón general.n general.

ActividadActividad (IU/(IU/dldl))-- SeveraSevera <1%<1%-- ModeradaModerada 11--5%5%-- Leve Leve 55--25%25%

PatrPatróón de herencia de la Hemofilia: recesivon de herencia de la Hemofilia: recesivo--ligado al Xligado al X

Madre Portadora

PatrPatróón de herencia de la Hemofilia: recesivon de herencia de la Hemofilia: recesivo--ligado al Xligado al X

Padre con HemofiliaPadre con Hemofilia

X chromosome

Catalityc domain

LocalizaciLocalizacióónn cromoscromosóómicamica y y estructuraestructura del gen del factor del gen del factor VIII y factor IX de VIII y factor IX de coagulacicoagulacióónn humanohumano

FVIII FIX

HemofilaHemofila A y Mutaciones en el A y Mutaciones en el F8F8

Tipo de mutación Severa FVIII<1% Moderada FVIII:1-5% Leve FVIII:5-20%

Inversiones tipo 1 35%Inv22 tipo 2 7%

Total 42%

Inv1 <5%

Mutaciones falso sentido 14% falso sentido >95% falso sentido >98%Puntuales no-sentido 7%

sitio splicing 4% sitio splicingTotal 25%

Deleciones >0,2kb 15% >0,2kb<0,2kb 6%Total 21%

Inserciones <20 bp 4%LINELINE--1 <1%1 <1%Total 5%Total 5%

Datos de la literatura y de la Base de DatosDatos de la literatura y de la Base de Datos www.factorviii-db.org.

Datos de la Literatura y de la Base de Datos www.factorix.org/

6Grandes deleciones (> 50 bp)

11,6Pequeñas deleciones e inserciones

(< 50 bp)

27,7No-sentido (nonsense)

54,6Falso sentido (missense)

Porcentaje observadoTipo de Mutación

HemofilaHemofila B y Mutaciones en el B y Mutaciones en el F9F9

X X cencenXqXq teltel

int22hint22h--3 3 int22hint22h--2 2 F8F8 int22hint22h--11

1 22 23 1 22 23 2626

LakichLakich et al, Nat et al, Nat GenetGenet 1993; 1993; NaylorNaylor et al, et al, HumHum MolecMolec GenetGenet 1993. 1993.

X X cencenXqXq teltel

int22hint22h--3/3/--1 1 int22hint22h--2 2 int22hint22h--1/31/3

23 2623 26

1 22 1 22

InversiInversióón molecularn molecular

CrossoverCrossover

InversiInversióón n intrintróónn 22 del 22 del F8F8

AnAnáálisislisis de Southern blot de la Inv22de Southern blot de la Inv22

LakichLakich et al, Nat et al, Nat GenetGenet 1993.1993.

Normal Allele

21.6 kb 14 kb

int22h-1 int22h-2

16.0 kb

int22h-3

Inv22-1 ~ 80%type 1

17.5 kb 14 kb 20 kb

int22h-2int22h-1/-3 Int22h-3/-1

15.5 kb

int22h-1/-2

20 kb

Int22h-2/-1Inv22-2 ~ 20%type 2

kb

21,520

17,516

15,514

kb

23,1

9,4

Inv22 N 1 1 N 2 2 N

1 2 3 4 5 M1 2 3 4 5 M

RestricciRestriccióón: n: BclBcl II

Sonda: F8A (1 Sonda: F8A (1 kbkb))

16.0 kb

int22h-3

AnAnáálisis de la Inv22 por long lisis de la Inv22 por long distancedistance PCRPCR

Liu et al, Liu et al, BloodBlood 1998.1998.

1010--16 16 hshs

genomic DNAgenomic DNA

BclBcl I restrictionI restriction

selfself--endend--ligationligation

standard PCRstandard PCR

Rossetti et al, Clin Chem 2005.

27 460

B

ID 487 bp IU

Normal DNA-rings21.6 kb

int22h-1

B

int22h-1/-3:2

460 99

IU 559 bp ED

B

Inv22 DNA-rings20 kb

Normal Allele21.6 kb

int22h-1

B BID IU

Inv22-1/-220 kb

Int22h-1/-3:2

B BIU ED

IU intra-F8 UPST

ID intra-F8 DWST

ED extra-F8 DWST

Ochman et al, Genetics 1988.Collins et al, PNAS 1984.

AnAnáálisis de la Inv22 por lisis de la Inv22 por InverseInverse ShiftingShifting –– PCRPCR

Patrones de SePatrones de Seññal ISal IS--PCR y DiagnPCR y Diagnóóstico de la Inv22 no stico de la Inv22 no discriminante de patrones tipo 1 y 2discriminante de patrones tipo 1 y 2

Mar

ker

bp

600500400350

bp

559487

Inv22 + – + +/–

Rossetti et al, Rossetti et al, ClinClin ChemChem 2005.2005.

Mar

ker

Nor

mal

Inv2

2/N

Inv2

2

bp

600500400350

bp

559487

Inv22 – +/– +

100

bpla

dder

Ex.

1E

x.2

Ex.

3E

x.4

Ex.

5E

x.6

Ex.

710

0 bp

ladd

erE

x.8

Ex.

9E

x.10

Ex.

11E

x.12

Ex.

13E

x.14

ab10

0 bp

ladd

er

100

bpla

dder

Ex.1

4cd

Ex.

14ef

Ex.

14gh

Ex.

14jk

Ex.

15E

x.16

Ex.1

7-18

100

bpla

dder

Ex.

19E

x.20

Ex.

21E

x.22

Ex.

23E

x.24

Ex.

25E

x.26

100

bpla

dder

ANANÁÁLISIS PRIMARIOLISIS PRIMARIO

IdentificaciIdentificacióón de grandes n de grandes delecionesdeleciones en el en el F8F8

10 11 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 12 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 25 26

10 kb

ExExóón #n #

38 38 amplamplíímerosmeros

Rossetti et al, Rossetti et al, HaematologicaHaematologica 2007.2007.

ReuniReunióón de extremos, n de extremos, ligado covalente ligado covalente

de las secuencias del de las secuencias del intrintróónn 1 y 21 y 2

Rupturas de Doble CadenaRupturas de Doble Cadenaen el DNAen el DNA

En En intrintróónn 1 e 1 e intrintróónn 2 2

Gran deleciGran delecióón n del del F8F8 o o F9F9

11°° Variante Estructural.Variante Estructural.22°° DuplicaciDuplicacióón n

33°° InversiInversióónn

Gran Deleción del F8 o F9: ejemplo-esquema

NotaciNotacióón HGVSn HGVS c.1520+340_1796c.1520+340_1796--955del955del

ExExóón 1n 1 ExExóón 2n 2 ExExóón 3n 3IntrIntróónn 11 IntrIntróónn 22 IntrIntróónn 33

IntrIntróónn 1::21::2 ExExóón 3n 3 IntrIntróónn 33ExExóón 1n 1

gtgt agag gtgt agag

gtgt agag

15201520

17961796+340+340 --955955

11

bp

725

441

M2

Pr Pr.M

o

Co

i3f-i10r-4bPCR

E3 E4 E11

3a i3f 4b

i10r 11b

5.7 kb

441 bp

725 bp

Xq tel

X cen

Alu

4.3 kb

kb

5.74.3

M1

Pr Pr.M

oC

oC

oP

r.Mo

3a-11b 3a-4bLD-PCRs

DetecciDeteccióónn de de portadorasportadoras mediantemediante PCR de PCR de LargaLarga DistanciaDistancia & Standard& Standard((ejemploejemplo casocaso ííndicendice, CHE EX4_EX10del), CHE EX4_EX10del)

AnAnáálisis lisis de de Mapas de Mapas de restriccirestriccióónn del del productoproductoLDLD--PCR [3APCR [3A--11B]11B]

M H1 M N M H1 M N

LDLD--PCRPCR [3A[3A--11B]11B]

kb

5.7

M

M

Und

Und Eco

RI

Eco

RI

Msp

IM

spI

Hin

dIII

Hin

dIII

Eco

RI

Eco

RI ++

Msp

IM

spI

Hin

dIII

Hin

dIII ++

Msp

IM

spI

MM

BioinformBioinformááticaticaAlineamientoAlineamiento e e identificaciidentificacióón de las n de las secuencias involucradas secuencias involucradas MegalignMegalign DNA DNA LasergeneLasergene

CaracterizaciCaracterizacióón final n final y completa de los puntos de ruptura, por y completa de los puntos de ruptura, por secuenciacisecuenciacióón de DNAn de DNA directa y nuevo andirecta y nuevo anáálisis lisis

bioinformbioinformááticotico (BLASTN) para recabar datos acerca del mecanismo que origin(BLASTN) para recabar datos acerca del mecanismo que originóó la delecila delecióón n (por ejemplo recombinaci(por ejemplo recombinacióón homn homóóloga loga AluAlu--AluAlu).).

DetecciDeteccióónn de de portadorasportadoras mediantemediante PCR de PCR de LargaLarga DistanciaDistancia & Standard& Standard((ejemploejemplo casocaso ííndicendice, CHE EX4_EX10del), CHE EX4_EX10del)

XX

Curvas de probabilidad de simple y doble dosis del cromosoma X (Curvas de probabilidad de simple y doble dosis del cromosoma X (TargetTarget)/ )/ AutosomaAutosoma ((ReferenceReference); e ); e interpolaciinterpolacióón de valores T/R de las mujeres en riesgo de ser portadoras de gn de valores T/R de las mujeres en riesgo de ser portadoras de grandes randes delecionesdeleciones en distintas en distintas regiones del regiones del F8F8. Las curvas (Normal . Las curvas (Normal --GaussianaGaussiana) rayadas y abiertas caracterizan los valores T/R de la poblaci) rayadas y abiertas caracterizan los valores T/R de la poblacióón n general de varones (46, XY) (n = 15) y mujeres (46, XX) (n = 15)general de varones (46, XY) (n = 15) y mujeres (46, XX) (n = 15), respectivamente. Se muestra el an, respectivamente. Se muestra el anáálisis de lisis de F8 F8 Ex6, 26, F9 Ex8 y F8 Ex6, 26, F9 Ex8 y F8 PromProm en siete familias. Se muestran gren siete familias. Se muestran grááficamente los valores T/R de las catorce mujeres en ficamente los valores T/R de las catorce mujeres en riesgo. Los valores de nueve de ellas interpolan claramente la criesgo. Los valores de nueve de ellas interpolan claramente la curva de varones (resultando portadoras con urva de varones (resultando portadoras con PcPc=100%) y cinco de ellas interpol=100%) y cinco de ellas interpolóó en la curva de mujeres (resultando no portadoras con en la curva de mujeres (resultando no portadoras con PcPc=0%).=0%).

DetecciDeteccióónn de de portadorasportadoras mediantemediante Real Time Real Time qPCRqPCRMediciMedicióónn relativarelativa de de dosisdosis ggéénicanica

XXXX

Abelleyro et al, Haemophilia 2015.

MMéétodos de todos de screeningscreening para la deteccipara la deteccióón de mutacionesn de mutaciones

Existen una variedad de mExisten una variedad de méétodos de todos de screeningscreening que permiten localizar mutaciones:que permiten localizar mutaciones:

-- SSCPSSCP ((Single Single StrandStrand ConformationConformation PolymorphismPolymorphism))

-- DGGEDGGE ((DenaturingDenaturing GradientGradient Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis))

-- TGGETGGE ((TemperatureTemperature GradientGradient Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis))

-- CMCCMC ((ChemicalChemical MismatchMismatch CleavageCleavage))

-- CSGECSGE ((ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis))

-- Eficiencia Eficiencia ~~80%.80%.-- Productos PCR 200Productos PCR 200--800 800 bpbp (rango ideal 300(rango ideal 300--500 500 bpbp, eficiencia ~95%. )., eficiencia ~95%. ).-- ÚÚnica condicinica condicióón de electroforesis.n de electroforesis.-- Revelado por tinciRevelado por tincióón con n con EtBrEtBr/UV o con Plata/Luz blanca./UV o con Plata/Luz blanca.-- Los resultados son fLos resultados son fááciles de interpretar.ciles de interpretar.-- No detecta mutaciones en los bordes de las secuencias analizadaNo detecta mutaciones en los bordes de las secuencias analizadas (40 s (40 bpbp), ni), nien dominios ricos en GC.en dominios ricos en GC.

MMéétodo de todo de screeningscreening de mutacionesde mutaciones

HeterodHeterodúúplexplex

C S G E C S G E

ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis

DesnaturalizaciDesnaturalizacióón crecienten creciente(Por (Por ej.ej. % % FormamidaFormamida, , EtilenEtilen Glicol)Glicol)

ConformaciConformacióón Hipotn Hipotééticatica

Electroforesis en Gel (45 Electroforesis en Gel (45 cm) de Poliacrilamida (10cm) de Poliacrilamida (10--15%, Bajo CL 99:1), tinci15%, Bajo CL 99:1), tincióón n con Et Br. con Et Br.

BubbleBubble BendBend BulgeBulge

100

bpla

dder

Ex.

1E

x.2

Ex.

3E

x.4

Ex.

5E

x.6

Ex.

710

0 bp

ladd

erE

x.8

Ex.

9E

x.10

Ex.

11E

x.12

Ex.

13E

x.14

ab10

0 bp

ladd

er

100

bpla

dder

Ex.1

4cd

Ex.

14ef

Ex.

14gh

Ex.

14jk

Ex.

15E

x.16

Ex.1

7-18

100

bpla

dder

Ex.

19E

x.20

Ex.

21E

x.22

Ex.

23E

x.24

Ex.

25E

x.26

100

bpla

dder

10 11 17 181 2 3 4 5 6 7 8 9 12 13 14 15 16 19 20 21 22 23 24 25 26

10 kb

Exón #

ProductosProductos PCR de los PCR de los exonesexones y y sussus secuenciassecuencias de splicing de de splicing de F8F8

WildWild--typetypeDNADNA

HeteroduplexHeteroduplex DNADNA

GC AT+

G T A C GC AT

Mutante Mutante DNADNA

DesnaturalizaciDesnaturalizacióón a 98 n a 98 °°C 5 C 5 minmin

RenaturalizaciRenaturalizacióónn a 65 a 65 °°C 30 C 30 minmin

HomoduplexHomoduplex DNADNA

FormaciFormacióón de n de heterodheterodúúplexplex

TTéécnica para el monitoreo de Mutacionescnica para el monitoreo de MutacionesConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis (CSGE)(CSGE)

ScreeningScreening para identificacipara identificacióón de Mutaciones pequen de Mutaciones pequeññas:as:HighHigh resolutionresolution ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel

ElectrophoresisElectrophoresis (CSGE)(CSGE)

Ejemplo Ejemplo correspondiente al correspondiente al exexóón 26 (primers n 26 (primers 26a y 26a2)26a y 26a2)

Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 11

Electroforesis en Electroforesis en gelesgeles de poliacrilamida (12%) de gran tamade poliacrilamida (12%) de gran tamañño (40 cm) o (40 cm) medianamente medianamente desnaturalizantesdesnaturalizantes (15% (15% formamidaformamida, y 10% , y 10% etilenetilen--glicol).glicol).Se siembran mezclas (Se siembran mezclas (heterodheterodúúplexplex) de productos de amplificaci) de productos de amplificacióón de n de muestras de DNA controlmuestras de DNA control--normal con los pacientes hemofnormal con los pacientes hemofíílicos.licos.

SecuenciaciSecuenciacióón: n:

Ejemplo Ejemplo correspondiente correspondiente a los exones: a los exones: 11, 14H, 2211, 14H, 22

Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 Caso: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 9 10

SecuenciaciSecuenciacióónn: :

ConformationConformation SensitiveSensitive Gel Gel ElectrophoresisElectrophoresis (CSGE) (CSGE) MULTIPLEXMULTIPLEX

pb

445

364

280

Algoritmo de análisis molecular del F8 Hemofilia A

Rossetti et al, Clin Chem 2005.Rossetti-Radic et al, J Thromb Haemost 2008.Abelleyro et al, Thromb Haemost 2016.

Screeningmutaciones pequeñas

Amplificación PCR del gen

38 productos PCR

F8

Caracterización

Inverse shift-PCR

Inversión del Intrón 1

Inverse shift-PCR

Gap-PCRCaso específica

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

Diagnóstico de portadoras

Rossetti et al, Haematologica 2007.Rossetti et al, Haemophilia 2013.Marchione et al, Haemophilia 2017.

Rossetti et al, Hum Mutat 2004.

Abelleyro et al, Haemophilia 2015.

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

Inversión del Intrón 22

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

CSGE38 / F8

Secuenciación de Sanger

Moderate/Mild HASevere HA

qPCR

Screeningmutaciones pequeñas

Amplificación PCR del gen

12 productos PCR

F9

Caracterización

Gap-PCRCaso específica

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

Diagnóstico de portadoras

qPCR

Radic-Abelleyro et al, unpublished.

Abelleyro et al, Haemophilia 2015.

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

Secuenciación de Sanger

Detección y confirmación de

grandes Deleciones

CSGE12 / F9Radic et al, Thromb Haemost 2013.

Severe/Moderate/Mild HB

Algoritmo de análisis molecular del F9 Hemofilia B

AsignaciAsignacióónn del del GenotipoGenotipo al al FenotipoFenotipo en en HemofiliaHemofilia

1. Estudio de los reportes previos en la literatura y/o en las bases de datos de HA o HB. Los características bioquímicas y clínicas asociadas deben ser concordantes. HADB: http://www.factorviii-db.org/ y HBDB: http://www.factorix.org/.

2. Experiencia en otras enfermedades y otros genes (e.g., cambios del marco de lectura, mutaciones nonsense, etc).

3. Descartar que el defecto observado no sea una variante polimórfica en al menos, 300 cromosomas X de varones no afectados de la misma población a la quepertenece el paciente.

4. En defectos missense, la proteína es alineada por identidad de residuos con susortólogos (e.g., FVIII humano, porcino, murino y canino). Cambios missense en residuos conservados son más severos que en los no-conservados.

5. Análisis teóricos in silico. E.g., análisis de consenso de splicing, modeladoestructural 3D de defectos missense (cambios de la estructura 2aria y 3ria) de la proteína, etc.

6. Estudios funcionales in vitro para investigar mutaciones de splicing del RNA (sistema de miniexones) o ensayos de unión para proteínas para missense, etc.

De De BrasiBrasi et al, et al, HaemophiliaHaemophilia 2014. 2014.

DiagnDiagnóóstico Genstico Genéético en hemofilia en Argentina tico en hemofilia en Argentina –– 1995 2016 1995 2016 ––

1199 muestras de ADN genómico: 1109 individuos indexados (probandos y familiares).480 familias con Hemofilia A: 378 severas HA, 36 moderadas HA y 58 leves HA.96 familias con Hemofilia B: 68 severas HB, 16 moderadas HB y 12 leves HB.

Mutaciones en F9 : Hemofilia BMutaciones en F8 : Hemofilia A

HB.M.DB: http://HB.M.DB: http://www.factorix.orgwww.factorix.org//HA.M.DB: HA.M.DB: http://http://www.factorviiiwww.factorviii--db.orgdb.org//

Promoter2%

Nonsense15%

Splicing defect8%

Missense60%

Large deletions8%

Indels7%

Splicing defect5% Indels

15%

Intron 22 inversions type 1

35%Intron 22

inversions type 27%

Large deletions5%

Intron 1 inversions

1%

Missense24%

Nonsense8%

MATERIAL: Muestra de sangre periférica

ESTUDIO MOLECULAR:Se efectuó el análisis molecular de la inversión del intrón 22 (Inv22) y del

intrón 1 (Inv1) del F8 por la técnica de inverse shifting-PCR (Rossetti et al, J Thromb Haemost 2008, 6: 830-6) resultando no informativa, y el screening molecular de pequeñas mutaciones por la técnica de PCR-CSGE (45cm) (Rossetti et al, 2007, Haematologica 92:842-5) y secuenciación automática de DNA. La familia resultó informativa sobre el amplímero del exón 13 (primers 13A y 13B) mostrando un cambio de base (notación HGSV) NM_000132.3:c.2048A>G condicionando una mutación de falso sentido o missense (notación Legacy) NP_000123.1:p.Tyr664Cys reportada en la base de datos de HA (URL: factorfviii-db.org) asociada a HA severa.

1-NNH (Probando con HA severa): Mostró la mutación missensep.Tyr664Cys en hemicigosis como causa de HA severa en la familia.

2-NNM (Madre del Probando con HA severa): Mostró la mutación missensep.Tyr664Cys en heterocigosis indicando su condición de Portadora de HA severa.

Mutación missense

Probando familiar y Portadora

Informe Molecular

HA severa

INHIBIDORESINHIBIDORESAmbientalesAmbientales

pacientepacienteTerapiaTerapia

antihemofantihemofíílicalica

GenGenééticaticadeldel

pacientepaciente

MutaciMutacióón causal (n causal (F8F8, , F9F9).).Historia familiarHistoria familiarFenotipo MHC Clase I/II.Fenotipo MHC Clase I/II.Etnia no caucEtnia no caucáásicasica

Repertorio del receptor T.Repertorio del receptor T.Polimorfismos de Polimorfismos de citoquinascitoquinas y y molmolééculas culas inmunoreguladorasinmunoreguladoras..

-- IL10IL10 , , TNFTNF S, CTLA4.S, CTLA4.

Tipo de factor concentrado.Tipo de factor concentrado.

Modo de administraciModo de administracióón.n.

Factores que influencian el riesgo de formaciFactores que influencian el riesgo de formacióón de inhibidor n de inhibidor en pacientes con hemofiliaen pacientes con hemofilia

Edad de la 1ra infusiEdad de la 1ra infusióón de n de FVIII o FIX.FVIII o FIX.

DesafDesafííos al sistema inmune:os al sistema inmune:-- Inmunizaciones.Inmunizaciones.-- Inflamaciones.Inflamaciones.-- Traumas/cirugTraumas/cirugíías.as.

RASGORASGOMULTIFACTORIALMULTIFACTORIAL

AdaptadoAdaptado de de AstermarkAstermark, , HaemophiliaHaemophilia 2006.2006.

Factor VIII genotype characterisation of haemophilia A affected Factor VIII genotype characterisation of haemophilia A affected patients with transient and patients with transient and permanent inhibitors: a comprehensive Argentine study of inhibitpermanent inhibitors: a comprehensive Argentine study of inhibitor risks.or risks.

5’ 3’

COOH

9

40

TransientTransient InhibitorsInhibitorsPermanentPermanent Low Low RespondersRespondersPermanentPermanent HighHigh RespondersResponders

MissenseIns/Del frameshift (An: within an A-run) NonsenseSplicing defectInversionLarge deletion

10

2

22

8765421 9 10 11 12 13 14 20 22 233 19181715 16 2524 2621

SP a1 a2 a3B A3 C1 C2A1 A2

Light ChainHeavy Chain

An An An An An

22

22

An

Rossetti et al, Rossetti et al, HaemophiliaHaemophilia 2013.2013.

Table 1. FVIII inhibitor development vs F8 mutation type/location in Argentine patients with severe HA.

Mutation Type

SHA1

[%] Cases2 N= 84

Controls3 N= 143

OR4(CI 95) IP5(CI 95) [%] P value6

INV22 44.0 48 60 1.84(1.07-3.18) 24(18-29) 0.0287*

INV1 1.9 0 2 0.33(0.02-7.07) 5.9(0.3-100) 0.5317

MED 6.5 8 4 3.66(1.07-12.55) 55(19-100) 0.0604

SED 3.7 3 5 1.02(0.24-4.39) 18(4-69) 1.0000

NS.LCH 6.5 5 7 1.23(0.38-4.01) 21(7-59) 0.7642

NS.HCH 3.7 4 9 0.74(0.22-2.50) 13(4-41) 0.7719

FS.I/D 15.9 13 27 0.79(0.38-1.62) 14(7-26) 0.5905

IF.I/D 1.9 0 2 0.33(0.02-7.07) 5.9(0.3-100) 0.5317

MS 12.2 2 21 0.14(0.03-0.62) 3(0.6-11) 0.0025**

SPD 3.7 1 6 0.27(0.03-2.33) 5(0.6-39) 0.2641 1 SHA [%]: Natural (unbiased) Mutational Prevalence in Severe HA showing an absolute inhibitor prevalence estimation of 17.6% (N=107), similar to those previously reported in the same population [11]. 2 Cases: Permanent Inhibitor Positive cases (high and low responders). 3 Controls: Inhibitor Negative or Transient. 4 OR: Inhibitor Likelihood Odds Ratio (Mutation positive/Mutation negative); (CI95): Confidence interval of 95%. 5 IP [%]: Absolute Inhibitor Prevalence; (CI95). 6 P value: Fisher Exact Test P value; *P<0.05 significant; **P<0.01 highly significant. MED: Multi Exon Deletion; SED: Single Exon Deletion; NS.LCH: Nonsense Light Chain; NS.HCH: Nonsense Heavy Chain; FS.I/D: Frameshift Indel; IF.I/D: In-Frame Indel; MS: Missense; SPD: Splicing Defect.

Rossetti et al, Rossetti et al, HaemophiliaHaemophilia 2013.2013.

Table 2. FVIII inhibitor status concordance/discordance vs related/expected-if-unrelated in patients with severe HA. Patient Group (Consanguinity1)

Concordant2 Discordant3 OR4(CI95) P value5

All Mutations6 Related (≥ 1/8) Obs. 36 10 2.8(1.1-6.9) 0.0261* Expected-if-Ho 26 20

F8 Intron 22 Inversions Related (≥ 1/8) Obs. 20 6 3.3(1.0-11.0) 0.0438* Expected-if-Ho 13 13 1 Consanguinity coefficients ≥ 1/8 included: monozygotic twins (1); full brothers (1/2); uncle-nephew, half brothers and Grandfather-grandson (1/4); and 1st degree cousins (1/8). 2 Concordant: In related patients, cases with a concordant inhibitor status matching pair; in expected if Ho (null hypothesis: concordant/discordant matching pairs expected by chance in the same population, or “apart from the causative mutation, no additional genetic factors influence the development of inhibitors”), the expected matching pair was calculated using the Binomial distribution and the frequency of patients with inhibitors (p) and without inhibitors (q) (i.e., ExpConcHo=(2pq)N) (N=46 for the all mutations group and N=26 for Inv22 patients). 3 Discordant: In related patients, same as concordant inhibitor status matching pair; in expected if Ho, the discordant expected matching pair was calculated using the formula ExpDiscHo=N-ExpConcHo (i.e., ExpDiscHo=N-(2pq)N).. 4 OR: Inhibitor Concordance Odds Ratio (Related-Obs/Expected-if-Ho); (CI95): Confidence interval of 95%. 5 P value: Chi square test. P value; * P<0.05, significant differences. 6 All mutation group included 46 cases: 26 Inv22, 10 ins/del frameshifts, 6 large deletions and 4 nonsense mutations.

Riesgo de Inhibidor en HAHoHoSHASHA: 17.6% N: 107 (1995: 17.6% N: 107 (1995--2008)2008)

N: 227 N: 227 pacientespacientes

ConclusiConclusióónn::

ExistenExisten factoresfactoresgengenééticosticos adicionalesadicionalesademademááss del del genotipogenotipodel del F8F8

RiesgoRiesgo de de InhibidorInhibidor en HBen HB

RadicRadic et al, TH 2013.et al, TH 2013.

HoSHB: 3% N: 55 pacientes

34

Ho: 17.6%

**

*

***

Severe HA

n=107(unbiased cohort)

n=352

* P<0.05** P<0.01*** P<0.001

High-risk groupIntermediate-risk groupLow-risk group

RiesgoRiesgo relativorelativo de de desarrollodesarrollo de de inhibidorinhibidor vsvs tipotipo de de mutacimutacióónn causal en HA causal en HA severasevera

20162016

Estudios moleculares en hemofiliaEstudios moleculares en hemofilia

¿¿para qupara quéé??

La determinaciLa determinacióón de la mutacin de la mutacióón causal de hemofilia permite la n causal de hemofilia permite la provisiprovisióón de informacin de informacióón directa y segura para el asesoramiento n directa y segura para el asesoramiento gengenéético de lastico de las familias afectadasfamilias afectadas. . En particular para elEn particular para elDiagnDiagnóóstico de Portadorasstico de Portadoras..

TambiTambiéén saber la mutacin saber la mutacióón causal de la hemofilia en cada caso n causal de la hemofilia en cada caso particular ayuda alparticular ayuda al mméédico hematdico hematóólogo tratante de la hemofilialogo tratante de la hemofilia aatener un conocimiento mtener un conocimiento máás amplio y especs amplio y especíífico del paciente. fico del paciente. Puede estimarse elPuede estimarse el riesgo a desarrollar inhibidorriesgo a desarrollar inhibidor. .

Laboratorio de Genética Molecular de la Hemofilia

EmilceEmilceMoraMora

MartMartíínnAbelleyroAbelleyro

Vanina Vanina MarchioneMarchione

PamelaPamelaRadicRadic

LiliLiliRossettiRossetti

CarlosCarlosDe De BrasiBrasi

Irene Irene LarripaLarripa

PamelaPamelaRadicRadic

LiliLiliRossettiRossetti

CarlosCarlosDe De BrasiBrasi

Irene Irene LarripaLarripa

20142004

2017

AgradecimientosAgradecimientos

•• AgradecemosAgradecemos a la a la comunidadcomunidad formadaformada porpor los los pacientespacientes hemofhemofíílicoslicos, , sussusfamiliaresfamiliares y el personal y el personal ttéécnicocnico y y profesionalprofesional abocadoabocado al al tratamientotratamiento de la de la HemofiliaHemofilia en Argentina, en particular a los en Argentina, en particular a los DresDres Daniela Daniela NemeNeme, Laura , Laura PPrimianirimiani, , Miguel Candela y Miguel de Miguel Candela y Miguel de TezanosTezanos PintoPinto..

•• AgradecemosAgradecemos a los a los investigadoresinvestigadores Eduardo Eduardo TizzanoTizzano (Barcelona, (Barcelona, EspaEspaññaa), Carol ), Carol Kasper (Los Angeles, Kasper (Los Angeles, EstadosEstados UnidosUnidos), Amy ), Amy CurtoCurto, , HHééctorctor TargovnikTargovnik y y VivianaVivianaVarela (Buenos Aires, Argentina), Peter Collins, Derrick Bowen, Varela (Buenos Aires, Argentina), Peter Collins, Derrick Bowen, Michael Michael MakrisMakris, , Anne Anne GoodeveGoodeve (Cardiff y Sheffield, (Cardiff y Sheffield, ReinoReino UnidoUnido), Enrique Medina), Enrique Medina--Acosta (Acosta (BrasilBrasil) ) y Ana y Ana RebecaRebeca JalomaJaloma--Cruz (Guadalajara, Cruz (Guadalajara, MMééjicojico) ) porpor susu valiosavaliosa ayudaayuda..

•• PorPor el el apoyoapoyo econeconóómicomico, , agradecemosagradecemos a la a la FundaciFundacióónn RenRenéé BarBaróónn, a la , a la FundaciFundacióónn Florencio Florencio FioriniFiorini, a la , a la FundaciFundacióónn Alberto J Alberto J RoemmersRoemmers, a la , a la FundaciFundacióónnAdolfo H Adolfo H AztiriaAztiria, a la , a la FederaciFederacióónn Mundial de la Mundial de la HemofiliaHemofilia, al CONICET, a la , al CONICET, a la ANPCyTANPCyT y a la Academia y a la Academia NacionalNacional de de MedicinaMedicina..