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“Año de la Integración Nacional y el Reconocimiento de Nuestra Diversidad”
Instituto de Educación Superior Tecnológico Privado
“Sergio Bernales García”
Curso :
Tema :
Alumno :
Especialidad :
Ciclo :
Docente :
San Vicente - Cañete
2012
DEDICATORIA
A todos los que creen en el futuro y hacen
de sus vidas una realidad permanente, y en
especial a nuestros seres queridos que
hicieron posible la realización de este
trabajo.
INTRODUCCION
Las moléculas de histocompatibilidad fueron inicialmente descubiertas por ser las
principales responsables de las reacciones de rechazo de tejidos trasplantados entre
individuos de la misma especie. Los loci genéticos reguladores de la síntesis de estos
antígenos se agrupan en una región denominada Complejo Mayor de
Histocompatibilidad (MHC) y se heredan de acuerdo con las leyes de Mendel.
Una de las principales características de estas moléculas es su extraordinario
polimorfismo. Hoy día se considera que las moléculas de histocompatibilidad tienen
como función principal recoger péptidos del interior de la célula, transportarlos a la
superficie celular y allí presentarlos a las células T.
Las moléculas de histocompatibilidad se localizan en la superficie de las células de las
distintas especies animales. En el ratón se denominan antígenos H-2 y los genes que las
codifican se localizan en el cromosoma 17. En el humano se denominan antígenos HLA
(Human Leucocyte Antigens) y están codificadas por genes ubicados en el brazo corto
del cromosoma 6. Los primeros trabajos sobre los antígenos H-2 fueron realizados por
Gorer (1936) en cepas murinas endogámicas (inbred), obtenidas por el cruce entre
animales hermanos de forma continuada durante al menos 20 generaciones. El rechazo
de trasplantes entre animales de distintas cepas endogámicas y la obtención de
aloantisueros mediante inmunización de animales de una cepa con células de otra,
permitieron una primera definición de este sistema genético.
En el caso humano, el primer antígeno de histocompatibilidad descrito fue Mac (en la
actualidad definido como HLA-A2), descubierto por Jean Dausset en 1958. Pronto se
vio que existía una relación entre estos antígenos y la supervivencia de riñones
trasplantados.
En este trabajo estudiaremos la estructura de estas moléculas y la organización de los
genes que las codifican. Su función en el procesamiento y presentación de péptidos se
estudiará en el capítulo siguiente.
ÍNDICE
PORTADA ……………………………………………………………….. 1
DEDICATORIA ………………………………………………………….. 2
INTRODUCCION ………………………………………………………... 3
ÍNDICE …………………………………………………………………… 4
Estructura y función de las moléculas de histocompatibilidad …………… 5
Estructura de las moléculas HLA de clase I ……………………………… 5
Estructura de las moléculas HLA clase II ………………………………… 6
Estructura tridimensional …………………………………………………. 6
Distribución tisular de las moléculas clase I y II …………………………. 7
Moléculas de histocompatibilidad no clásicas ……………………………. 8
Función de las moléculas de histocompatibilidad ………………………… 9
Polimorfismo HLA ……………………………………………………….. 9
Desequilibrio de ligamento ……………………………………………….. 10
¿Cómo se genera la diversidad de las moléculas HLA? ………………….. 10
Factores inductores de la generación de polimorfismo …………………... 11
Mecanismo de generación de polimorfismo ……………………………… 12
Ventajas y desventajas aportadas por el polimorfismo HLA …………..... 13
Asociación entre HLA y enfermedad …………………………………… 14
Tipaje HLA ……………………………………………………………….. 15
Método Serológico ………………………………………………………... 16
Métodos basados en técnicas de Biología Molecular …………………….. 17
Genética del Complejo Mayor de Histocompatibilidad ………………….. 17
Loci HLA-A, B, C ……………………………………………………….. 20
Región HLA-D …………………………………………………………… 20
Procesamiento y presentación de antígenos ………………………………. 21
Captación y procesamiento de antígenos por células APC ……………….. 22
Síntesis de HLA-I y procesamiento de antígenos en células diana ………. 24
Las moléculas HLA como receptores de péptidos ……………………….. 25
BIBLIOGRAFIA …………………………………………………………. 26
Estructura y función de las moléculas de histocompatibilidad
Según su estructura, las moléculas de histocompatibilidad se dividen en dos grandes
grupos: moléculas de histocompatibilidad clase I
y clase II, que presentan estructura y funciones
diferentes.
Entre las primeras se encuentran las moléculas
clásicas de clase I que se corresponden con los
antígenos HLA-A, B y Cw y las moléculas no
clásicas entre las que se encuentran HLA-E, F, G y CD1. Las moléculas HLA clase II
pueden ser HLA-DR, DQ y DP. (Tabla: Clases y formas de HLA).
Estructura de las moléculas HLA de clase I
Las moléculas HLA clase I se encuentran constituidas por 2 cadenas polipeptídicas: una
cadena pesada, glicosilada, de mayor tamaño, que se encuentra asociada, mediante
interacciones no covalentes a una cadena más pequeña, cadena ligera, la
β-2-microglobulina. (Figura: HLA I y II).
La cadena pesada es altamente variable entre individuos de la misma especie, siendo la
responsable del polimorfismo antigénico de las moléculas de histocompatibilidad clase
I, mientras que la cadena ligera es igual en todos los individuos (Figura: Variabilidad
HLA).
En la cadena pesada se distinguen tres zonas: una zona extracelular de mayor tamaño y
otras dos más pequeñas que corresponden a la región transmembrana e
intracitoplasmática respectivamente. La zona extracelular se halla organizada en tres
dominios de aproximadamente unos 90 residuos cada uno, denominados α-1, α-2 y α-3,
mantenidos por la existencia de puentes intracatenarios.
Los dominios α-1 y α-2 constituyen regiones de contenido variable en aminoácidos
mientras que el dominio α-3 es bastante constante. Estas moléculas pertenecen a la
superfamilia de las inmunoglobulinas por mostrar una notable homología con la región
constante de las
inmunoglobulinas.
La cadena
β-2-microglobulina
pertenece también a la
familia de las
inmunoglobulinas y en
todos los individuos es un
polipéptido idéntico.
(Figura Estructura HLA-I)
Estructura de las moléculas HLA clase II
Las moléculas de clase II son glicoproteínas que se encuentran en la superficie celular
y están formadas por dos cadenas, α y β de tamaños similares y unidas entre sí
mediante interacciones de naturaleza no covalente. Están constituidas por dos dominios
extracelulares, α-1 y α-2 y β -1 y β -2 en cada una de ellas, un dominio transmembrana
y otro intracitoplasmático.
Estructura tridimensional
El análisis de la estructura tridimensional de los antígenos de histocompatibilidad de
clase I y clase II, determinada mediante cristalografía, demuestra que el dominio α-3 y
la β-2-microglobulina están organizados en estructura de hoja plegada β. Por el
contrario los dominios a1 y a2 constan cada uno de ellos de una sola zona formada por
cuatro fragmentos en estructura de hoja plegada β seguido de otro segmento organizado
en forma de a-hélice.
Esta organización delimita una hendidura denominada sitio de unión al péptido (peptide
binding groove) en el que los residuos más polimórficos se encuentran en el suelo y las
paredes de la hendidura. En esa hendidura se localiza un péptido que no pertenece a la
molécula y de aproximadamente 8-10 aminoácidos. Ese péptido procede de proteínas
endógenas, como veremos después, e interacciona con las moléculas de
histocompatibilidad mediante fuerzas no covalentes entre sitios concretos de ambas
estructuras. Un determinado antígeno de histocompatibilidad puede unirse a numerosos
péptidos diferentes siempre que éstos posean uno o varios motivos que interaccionen
con zonas de la molécula cuya estructura suele estar condicionada por residuos
polimórficos.
La estructura tridimensional de los antígenos de clase II es semejante a la de los
antígenos de clase I. Los dos dominios proximales (α2 y β2) son los equivalentes al
dominio α-3 y a la β-2-microglobulina de los antígenos clase I, mientras que los dos
dominios distales (α-1 y β-1) de los antígenos clase II se corresponden con los dominios
α-1 y α-2 de la molécula clase I. La hendidura donde se ubica el péptido se forma entre
los dominios α-1 y β-1 de las moléculas clase II.
Distribución tisular de las moléculas clase I y II
Las moléculas de clase I se encuentran presentes en
la mayoría de las células nucleares del organismo
pero no en todas, dado que, en algunas
localizaciones, su expresión es mínima o incluso
nula. Esto sucede con los hematíes en el endotelio,
glándulas de Brunner duodenales, trofoblasto
velloso o neuronas del sistema nervioso central. La
expresión de las moléculas de clase II se encuentra
fundamentalmente restringida a macrófagos en sus
diversas localizaciones, monocitos, linfocitos B y cuando están activados también en
linfocitos T y NK. Igualmente se encuentran expresados en alta densidad en otras
células que actúan como presentadoras de antígenos, tales como células dendríticas.
Esta distribución diferencial de las moléculas de histocompatibilidad de clase I y II se
encuentra directamente relacionada con la diferente función de cada una de ellas.
En suma las moléculas de histocompatibilidad clase I están presentes en la mayoría
de células del organismo actuando así para las células del sistema inmunitario como
"marcadores de lo propio" (el yo inmunológico).
Moléculas de histocompatibilidad no clásicas
Entre este grupo destacan de manera más significativa, las moléculas de
histocompatibilidad HLA-G, HLA-E y HLA-F, que presentan una gran homología con
las moléculas clásicas clase I (HLA-A, -B y -C), aunque poseen una función, exposición
y polimorfismo diferencial.
Molécula HLA-E: Esta molécula se encuentra en la mayoría de las células del
organismo y su importancia radica en que cuando es reconocida por los receptores
CD94/NKG2A, presentes en la mayoría de las células NK, y ciertos linfocitos T, los
inhiben. De esta manera parece que se protegen las células del organismo frente a su
destrucción, sobre todo de células NK.
Molécula HLA-F: Se sabe que esta molécula se expresa principalmente en células
de amígdalas, bazo y timo. La localización de la proteína es intracelular y está
descrito que los tetrámeros de HLA-F se unen a receptores inhibidores presentes en
NK y otros leucocitos.
Molécula HLA-G: Esta molécula se caracteriza por su distribución celular
restringida al trofoblasto fetal y células del epitelio tímico. Puede presentarse en
siete isoformas distintas: cuatro de ellas son proteínas unidas a membrana (HLA-
G1, G2, G3 Y G4), y otras tres isoformas que son proteínas solubles (HLA-G5, G6
Y G7). Parece que juega un papel muy importante inhibiendo el sistema inmune de
la madre para proteger al feto, que en definitiva es un trasplante, debido al contenido
paterno presente en el mismo. Recientemente se ha demostrado también su efecto
protector en células infectadas por el virus HIV y en trasplante de corazón.
Familia de moléculas CD1. Se ha definido como una molécula presentadora de
antígeno presente tanto en las células dendríticas como en timocitos. En humanos
CD1 presenta antígenos no peptídicos de origen microbiano, generalmente a un
subtipo de células T.
Función de las moléculas de histocompatibilidad
Las moléculas de histocompatibilidad están presentes en la mayoría de las células del
organismo, actuando así para las
células del sistema inmunitario
como "marcadores de lo propio" (el
yo inmunológico) en tanto que han
intervenido en el proceso de
selección de los linfocitos T en el
timo y eliminándose todos aquellos
clonos potencialmente
autorreactivos, permaneciendo
aquellos que reconocen a las
moléculas de histocompatibilidad propias.
Complementariamente a lo indicado anteriormente, la función biológica más relevante
de las moléculas de histocompatibilidad propias presentes en las células del organismo,
es la de presentar péptidos antigénicos para la activación de los linfocitos T. Los
linfocitos T que reconocen moléculas HLA clase I y su péptido pertenecen a la
subpoblación de linfocitos T citotóxicos, mientras que las células T que reconocen
moléculas HLA clase II en su mayoría son T colaboradores y tienen la función de
producir citocinas (Tabla: Funciones HLA).
Polimorfismo HLA
El complejo mayor de histocompatibilidad posee diferentes
locus y un número extraordinariamente grande de alelos
diferentes en cada uno de los mismos. Es por tanto, el
complejo más poligénico y polimórfico que se conoce en
vertebrados superiores.
Se han descrito más de mil alelos para HLA clase I y más de
500 para clase II. Este enorme polimorfismo da como
resultado una gran diversidad de moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad
dentro de una especie. (tabla polimorfismo HLA).
Esto es así porque nuestras moléculas HLA no pueden presentar todos los péptidos, sino
que cada HLA podría presentar sólo una selección de los mismos y por tanto a mayor
variabilidad más posibilidad de presentar péptidos diferentes.
Desequilibrio de ligamento
El polimorfismo no se explica sólo como resultado de una combinación al azar, sino que
algunos haplotipos se encuentran en mayor frecuencia a la esperada. Este fenómeno se
conoce como desequilibrio de ligamento y se corresponde, pues, a la mayor frecuencia
observada para una combinación particular de alelos en un haplotipo que la esperada
con base a las frecuencias de los mismos considerado individualmente.
Para explicar este fenómeno, se ha propuesto la intervención de varios procesos que no
son excluyentes entre sí:
Que los haplotipos con representación mayor en la población actual reflejarían las
combinaciones de alelos presentes en los fundadores (esto es por ejemplo lo que
ocurriría en la población india de americana).
Que se presente como consecuencia de los efectos del proceso evolutivo; por
ejemplo, algunas combinaciones de alelos proporcionarían resistencia a ciertas
enfermedades y harían que se seleccionaran y estuvieran representadas en mayor
frecuencia mientras que otros que podrían generar efectos perjudiciales, como
mayor susceptibilidad enfermedades, y se expresasen con menor frecuencia debido
a un proceso de selección negativo.
¿Cómo se genera la diversidad
de las moléculas HLA?
Las moléculas HLA que una
persona expresa están fijadas en
los genes y no cambian con el
tiempo como ocurre con las
inmunoglobulinas, que pueden ir
adoptándose al patógeno.
La diversidad de las moléculas HLA de un individuo se deben a la presencia de
diferentes genes y diferentes alelos que cada uno de ellos puede presentar.
Todo hace indicar que el polimorfismo del CMH evolucionó con el objeto de
contrarrestar la evolución de los microorganismos hacia variantes cuyos péptidos no son
presentados por las moléculas del CMH y evitar de esa manera su patogenicidad una
vez que infectan al individuo. La lucha entre el individuo y microorganismos es
evidente desde el origen de la vida, dado que los microorganismo existen desde antes
que el propio individuo. Obviamente, si se evade la presentación antigénica de los
microorganismos, éstos adquieren la capacidad de establecer una infección sin ser
detectados por el sistema inmune.
Por lo tanto, el sistema inmune ha ido mutando los genes del CMH para generar una alta
variabilidad en el sitio de unión al péptido, de manera que se anula la posibilidad de que
los microorganismos generen variantes cuyos péptidos no son presentados por las
moléculas del CMH. Esta presión de selección hace que la frecuencia de modificaciones
de secuencias en diferentes alelos del CMH sea muy superior a lo esperado si el proceso
fuera una simple introducción de mutaciones al azar.
Factores inductores de la generación de polimorfismo
La diversidad en las moléculas HLA se va generando de manera permanente aunque
lenta. En este hecho han influido
múltiples factores y circunstancias.
Entre ellas destacan el efecto de
gérmenes frente a los cuales tiene
que defenderse el individuo y
también parecen ser decisivas otras
fuerzas naturales, como son el hecho
de una mayor atracción hacia una
pareja más distante HLA, que la
implantación embrionaria en el útero
es más factibles en embriones más heterocigóticos así como el hecho que la progresión
del embarazo presenta menos complicaciones en fetos heterocigóticos que
homocigóticos.
Efectivamente, a mayor cantidad de alelos, mayor será la variabilidad y posibilidades de
unión de los distintos péptidos a las moléculas HLA. Esto trae como consecuencia que
la respuesta inmune mediada por linfocitos T contra cualquier agente patógeno será más
amplia y eficiente. En consecuencia a mayor polimorfismo, más posibilidades de
sobrevivir ante plagas o infecciones concretas.
Todo ello justifica que con el paso del tiempo desaparecen las poblaciones con menos
capacidad de defensa (por ejemplo en una plaga en la antigüedad) y sólo sobreviven los
más aptos. Por ejemplo al paludismo, sobre todo a la forma grave o el mayor grado de
progresión a SIDA de las personas infectadas por el virus HIV que son homocigóticas
en relación a las heterocigóticas.
Mecanismo de generación de polimorfismo
El polimorfismo del MHC es el resultado de un largo proceso de evolución a lo largo de
miles de millones de años como consecuencia de la presión evolutiva ejercida por los
agentes infecciosos. Para la
generación de este elevado
polimorfismo el MHC ha
utilizado diferentes
mecanismos que han
contribuido de diferente forma
a la creación de nuevos alelos.
Así, algunos son el resultado de
mutaciones puntuales mientras
que otros proceden de la combinación de secuencias completas entre diferentes alelos,
bien mediante un proceso de recombinación génica o bien mediante el proceso
denominado conversión génica, según el cual una secuencia es reemplazada por otra
semejante de un gen homólogo.
La recombinación entre alelos del mismo locus parece ser el mecanismo más
frecuentemente utilizado para la creación del polimorfismo y así muchos alelos
diferentes pueden proceder de procesos de recombinación repetidos a partir de un
pequeño número de genes ancestrales. La existencia de este proceso evolutivo apoya
que el polimorfismo es esencial para la función de los antígenos de histocompatibilidad.
Ventajas y desventajas aportadas por el polimorfismo HLA
Para un individuo, la ventaja de tener múltiples genes del CMH de clase I y de clase II
es que estos genes aportan diferentes especificidades de unión a los péptidos, lo que
permite que se pueda presentar un mayor número de péptidos derivados del patógeno
durante cualquier infección determinada. Esto mejora la potencia de la respuesta
inmunitaria contra el patógeno al aumentar el número de linfocitos T específicos del
patógeno activados.
El mismo argumento es válido para el polimorfismo de cualquier locus determinado del
CMH; la ventaja de ser heterocigoto es que pueden ponerse en juego dos
especificidades diferentes de HLA, en comparación con una sola en el caso del
homocigoto. Además, el alto grado de polimorfismo de los isotipos presentadores de
antígeno del HLA asegura que la mayoría de los miembros de la población sean
heterocigotos. Sin embargo, la magnitud de la ventaja de ser heterocigoto variará de
acuerdo con la diferencia de especificidades de unión a los péptidos de los dos alotipos.
Puede suponerse que este tipo de ventaja surge de una selección compensadora porque
actúa para mantener una variedad de isoformas del CMH en la población al tener más
posibilidades de sobrevivir.
Ejemplos de este fenómeno de
distribución selectiva de un
determinado alelo que confiere
ventajas evolutivas al antígeno en
una población son frecuentes.
Veamos por ejemplo, lo que
ocurre en oeste de África donde el paludismo es endémico y mortal en algunos casos.
Pues bien se ha visto que los individuos de dichas zonas suelen enfermarse
desarrollando un cuadro leve de la enfermedad, lo que no ocurre con los individuos de
otras zonas o endémicas para el paludismo de África. Hoy sabemos cómo esta
resistencia está ligada al antígeno, a la presencia de una molécula HLA clase I, HLA-
Bw52, que se encuentra en muy alta proporción en las regiones arriba indicadas y por el
contrario en muy baja proporción en otras regiones, donde el paludismo no es
endémico. (Tabla: Ventajas y desventajas del polimorfismo).
Así, los individuos que no tiene este antígeno morirían más fácilmente antes de
procrear, con lo que al pasar el tiempo solo sobrevivirían los más aptos, que son los que
posen la molécula HLA-Bw53 que como decimos confiere la capacidad de defensa
frente al paludismo. En suma se ha efectuado una selección positiva del antígeno
HLQA-Bw53 que ha hecho que se mantengan en la población dicho antígeno que
proporciona una clara ventaja evolutiva en las regiones donde el paludismo es
endémico. Una cuestión interesante es lo que ocurre con las enfermedades reumáticas
tan ampliamente ligadas a genes del CMH y es que no están influyendo en un proceso
de selección negativa de la población que los porta.
Una explicación a ello deriva del hecho de que la manifestación de estas enfermedades
es tardía (habitualmente pasados los 35-40 años) fecha ya en donde se ha realizado la
selección de pareja y ésta ha procreado. En este mismo sentido, es de destacar que
incluso se observa una selección favorecedora de procesos autoinmunes (reumáticos
sobre todo) y ello tiene su explicación en el hecho de que el haplotipo más
autoinmuntiario es a la vez el haplotipo con mayores potencialidades defensivas frente a
la infección como es en la actualidad la epidemia de infección por VIH, que pro-
porciona una oportunidad única para estudiar los efectos del polimorfismo del HLA
sobre una enfermedad infecciosa.
Así, se sabe que el carácter de heterocigoto para el HLA proporciona grandes ventajas
(Figura: Sida y HLA). Como desventajas del polimorfismo HLA cabe destacar el mayor
número de enfermedades autoinmunes presentadas en estos individuos, los
inconvenientes de la realización de trasplantes por incompatibilidad entre donante y
receptor y la dificultad en el generación de vacunas de tipo celular (Tabla: ventajas y
desventajas polimorfismos HLA).
Asociación entre HLA y enfermedad
Desde hace varias décadas se sabe que el padecimiento de ciertas enfermedades se
asocia con el incremento en la frecuencia de un determinado alelo HLA. Esta asociación
cuando tiene un valor estadísticamente significativo, se viene considerando como un
factor de susceptibilidad o un marcador de riesgo a padecer una
determinada enfermedad. Esto puede cifrarse estadísticamente como “riesgo relativo”
(RR) y da una idea de la mayor o menor probabilidad que tiene un sujeto a padecer una
determinada enfermedad si presenta dicho marcador o alelo HLA con respecto a
aquellos individuos que no lo tienen.
Efectivamente, a pesar del alto polimorfismo de las
moléculas HLA y de la ampliación del número de
subtipos alélicos de clase I y de clase II, hoy se
conocen diversas enfermedades que están asociadas a
clase I y otras a clase II. El número de enfermedades
asociadas a alelos de clase I es menor que el de las
asociadas a clase II (Tabla Enfermedades asociadas)
Las causas de esta asociación HLA y enfermedad no son conocidas completamente. Por
ejemplo en espondilitis anquilopoyética (EA), enfermedad invalidante y que afecta a
las articulaciones de la columna principalmente, y en la que se ha descrito una fuerte
asociación con HLA-B27, se ha podido observar que ciertos péptidos antigénicos de
origen articular serian capaces de formar un complejo con HLA-B27 que induciría
fenómenos de autoinmunidad, bien por generar en la molécula B-27 modificaciones
conformacionales que la harían no ser reconocida como propia, bien por generar
complejos HLA-péptido con cierta similitud con antígenos bacterianos que provocarían
reacciones cruzadas autoagresivas en individuos HLA-B27, previamente sensibilizados
a tales antígenos bacterianos.
En el caso de la diabetes mellitus insulino dependiente (DMID), enfermedad que cursa
con una destrucción selectiva de los islotes de Langerhans del páncreas, con infiltración
linfocitaria, se considera que es el resultado
de una respuesta autoagresiva frente a
antígenos presentes en la membrana celular
mediada por linfocitos T.
Tipaje HLA
Se denomina tipaje HLA al análisis que se realiza en el laboratorio para conocer las
moléculas de histocompatibilidad o los alelos HLA de un determinado individuo
mediante métodos serológicos o de biología molecular (Figura Tipaje HLA). El tipaje
HLA tiene especial interés en las siguientes situaciones:
Estudio de la asociación con distintas enfermedades. Por ejemplo las
espondiloartropatias están asociadas a B27.
En trasplantes de órganos sólidos y medula ósea.
Estudios de filiación familiar: ya hemos comentado que es el sistema más
polimórfico en humanos y por tanto representa una alternativa ideal para estos
estudios.
Método Serológico
El método serológico más utilizado es el test de microlinfocitotoxicidad dependiente de
complemento. Éste se realiza enfrentando una población de linfocitos a una batería de
anticuerpos monoclonales específicos para cada uno de los antígenos posibles.
Posteriormente se añade
complemento de tal manera
que en los pocillos en los que
se encuentre el anticuerpo
específico para los antígenos
de un individuo determinado,
se producirá la lisis celular que
podrá ser visualizada al
microscopio.
Para visualizar la lisis, actualmente se usa una técnica fluorescente con una mezcla de
anaranjado de acridina y bromuro de etídio. El bromuro de etídio se fija al ADN de las
células muertas (que aparecen de color rojo) y desplaza al anaranjado de acridina que
tiñe a las células vivas de color verde brillante. (Figura Tipaje serológico).
Para llevar a cabo la tipificación de los antígenos de clase II no se suelen utilizar
métodos serológicos porque nos obligan a purificar la población de linfocitos B y puede
suponer un proceso lento y complejo. Es preferible utilizar métodos de biología
molecular.
Métodos basados en técnicas de Biología Molecular
Las técnicas de biología molecular más usadas requieren un paso previo de
amplificación del
ADN por la reacción
en cadena de la ADN
polimerasa (PCR,
polymerase chain
reaction).
Según el método
utilizado para
discriminar el
material amplificado tenemos 3 métodos principales de tipaje: PCR-SSO, PCR-SSP y
PCR-SBT. La PCR-SSO (Figura Tipaje por biología molecular) se basa en la
hibridación con oligonucleótidos específicos de secuencia (SSO) fijados a membranas
de nylon del material amplificado por PCR. Con la técnica de PCR-SSP (Primers
específicos de secuencia) detectamos en qué reacciones ha habido productos de
amplificación de ADN mediante una electroforesis en gel de agarosa y en la técnica de
PCR-SBT se hace una secuenciación, pero sólo del producto amplificado por PCR y se
compara la secuencia con diferentes patrones conocidos.
Genética del Complejo
Mayor de
Histocompatibilidad
Como ya se ha dicho, los
genes que codifican las
moléculas de
histocompatibilidad se
encuentran agrupados en
el genoma formando el Complejo Mayor de Histocompatibilidad (CMH) que en el
humano está situado en el brazo corto del cromosoma 6. (Figura: Complejo Mayor de
Histocompatibilidad)
Entre los de clase I se encuentran los genes que codifican las cadenas alfa de los
antígenos HLA-A, HLA-B y HLA-C y entre los de clase II se encuentran los pares de
genes que codifican las cadenas alfa y beta de los antígenos HLA-DR, HLA-DQ y
HLA-DP. Los genes que codifican la beta-2-microglobulina sin embargo no se
encuentran en el CMH. Este grupo de genes se heredan de acuerdo con las leyes de
Mendel, como caracteres codominantes simples.
La región genética de un cromosoma que contiene todos los genes HLA (a excepción de
los que codifican la beta-2-microglobulina) se denomina haplotipo HLA
(Figura Haplotipo HLA).
Así pues un haplotipo HLA incluye los genes clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C y los
genes clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP y otros loci situados también en esta
región.
Gracias a las técnicas de biología molecular
se ha descubierto la existencia en esta
región de numerosos genes y pseudogenes
relacionados estructuralmente con las
moléculas HLA y otros no relacionados con
las mismas.
Cada célula del organismo, (excepto las
células germinales), poseen un haplotipo
procedente del padre y otro de la madre.
La
mayoría de los
genes del MHC son altamente polimórficos, es decir pueden ser estructuralmente
diferentes entre individuos de la misma especie.
Dado que cada individuo posee dos de cada uno de estos alelos por loci, el número de
combinaciones teóricas posibles en la población considerada en su conjunto es muy
alto. A menudo se describen nuevas especificidades asociadas a otras previamente
establecidas. Estas nuevas especificidades se suelen denominar especificidades
subtípicas, que aparecen por división de otras anteriores y a las antiguas especificidades
supertípicas. Así por ejemplo, las especificidades HLA-B51 y HLA-B52 se consideran
como productos de la división del antígeno HLA-B5.
La secuenciación de los genes HLA ha demostrado que el polimorfismo a nivel
genómico es mayor que el detectado a nivel serológico. Así por ejemplo existen
numerosos subtipos de HLA-A2 y numerosos subtipos de HLA-B27. Para incluir estos
suptipos se ha establecido un nuevo sistema de nomenclatura para los diferentes alelos
HLA, añadiendo 2 dígitos más a la denominación de 2 dígitos iniciales. Los dos
primeros dígitos serían los de la especificidad serológica o genómica de baja resolución
y los otros dos indicarían el subtipo de los
anteriores y, como sólo se detecta a nivel
genómico, se denomina genómico de alta
resolución.
Los haplotipos heredados de cada padre van a
determinar el genotipo del hijo, es decir, el
genotipo de éste será la suma de un haplotipo procedente de padre y otro procedente de
la madre (Figura: Herencia haplotipos). Se ilustra gráficamente todo lo anteriormente
expuesto. Como la herencia de los haplotipos se haceen bloque de generación, en una
familia determinada en la que el padre tiene los haplotipos (a) = A2, B8, Cw1, DR1 y
(b) = A3, B7, Cw3, DR4 y la madre los haplotipos (c) = A2, B7, sólo Cw2, DR12 y (d)
= A11, B13, Cw3, DR15 los hijos podrán heredar cuatro combinaciones distintas de
estos haplotipos, siendo (a, b), (a, d), (b, c) y (b, d) los posibles genotipos resultantes.
Probablemente el estudio del polimorfismo de esta región ayudará a comprender por
qué unas personas desarrollan unas enfermedades y otras no, en todo caso este avance
será una importante herramienta para el estudio filogenético, la biología y la evolución
de las familias de multigenes, las poblaciones y la enfermedad.
Loci HLA-A, B, C
La región que codifica las moléculas de clase I está dividida en tres loci, conocidos
como A (Tabla I) , B (Tabla II-III) y C, (Tabla IV) que codifican tres tipos de cadenas
pesadas para las distintas moléculas de clase I. Cada una de estas cadenas debe unirse a
la beta-2-microglobulina para conformar la molécula HLA.
Región HLA-D
En la región D se localizan los genes A y B que codifican las moléculas HLA de clase II
HLA-DR (Tabla V-VI ), HLA-DQ (Tabla V ) y HLA-DP.
Los genes que codifican HLA-DR comprenden un gen DRA que codifica la cadena
DRalfa y posee escaso polimorfismo y al menos cuatro genes DRB (DRB1, 3, 4, 5) que
codifican cadenas DRbeta que contienen gran polimorfismo.
Se han descrito otra serie de pseudogenes DRB (DRB2, 6, 8) sin conocerse aún su
función y expresión. La cadena proteica DRα puede combinarse (Figura Recombinación
genes clase II) Con las diferentes cadenas β codificadas por los genes DRB dando
origen a HLA-DR (la unión de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-DRB1) y
HLA-DRw51, 52 y 53 (la unión de los productos de los genes HLA-DRA y HLA-
DRB5, DRB3 o DRB4, respectivamente). La presencia de genes DRB3, DRB4 y DRB5
depende de la especificidad del gen DRB1 de cada persona.
Tanto las familias DQ como DP contienen diferentes genes, próximos entre sí. Sólo uno
de estos pares, DQA1 y DQB1 y DPA1 y DPB1, codifican las cadenas alfa y beta de las
moléculas de clase II HLA-DQ y HLA-DP respectivamente. Los otros pares de genes
DQA2, DQB2 y DQB3 (pseudogen) y DPA2 y DPB2 poseen un limitado polimorfismo
y no se encuentran expresados en la superficie celular. Además existe otra subregión
que contiene un gen A, denominado DNA, y un gen B, DOB, que podrían codificar una
proteína. Por otra parte también se encuentra una pareja de genes, HLA-DM, no
polimórficos, implicados en el procesamiento y presentación de antígeno como se
expondrá a continuación.
Procesamiento y presentación de
antígenos
El receptor de los linfocitos T
(TCR) reconoce el complejo
molecular formados por las
moléculas HLA clase I o clase II, a
las que se han unidas péptidos resultantes de la degradación intracelular de antígenos.
El TCR interacciona de forma específica con el péptido y las propias moléculas HLA
(Figura 1). El fenómeno de reconocimiento del TCR fue originalmente descrito por
Zinkernagel y Doherty (1974). Estos autores demostraron que los péptidos solo son
reconocidos por el TCR cuando éstos son presentados por moléculas de
histocompatibilidad propias del individuo y no de otras personas.
Las células que exponen los péptidos unidos a moléculas HLA- II, se conocen como
“células presentadoras de antígenos” (APC), mientras que aquellas que lo hacen unidos
moléculas de HLA-I, se conocen como “células diana”
o “célula blanco”.
Las células APC, que como decimos utilizan las
moléculas HLA clase II, tienen que capturar del medio
exterior los antígenos y además deben de
fraccionarlos hasta su degradación en péptidos capaces
de ser presentados por las moléculas de HLA-II. Los tres tipos celulares que cumplen
estos requisitos son las células dendríticas, los macrófagos y los linfocitos B.
Por otra parte las células, que utilizan las moléculas HLA clase I, se caracterizan por
presentar péptidos procedentes del procesamiento de proteínas ya presentes dentro de la
célula. Estos péptidos pueden provenir de proteínas virales o de proteínas tumorales
entre otros. Veamos estos procesos con detalle.
Captación y procesamiento de antígenos por células APC
Las células APC incorporan en su citoplasma los antígenos del medio externo
mediante procesos de pinocitosis o bien de fagocitosis según el tipo celular. Una vez
en el interior, los antígenos, forman fagosomas, que tras fusionarse con elementos de la
vía endocítica culminan en la formación de lisosomas.
En los lisosomas se realiza el procesamiento de antígenos exógenos consiste en la
desnaturalización y proteólisis de las proteínas captadas en las vesículas acídicas gracias
al pH bajo y presencia de proteasas en los lisosomas en donde las proteínas endógenas
son degradadas por un complejo catalítico denominado proteosoma
La biosíntesis de las moléculas HLA-
II se produce en el retículo
endoplasmático y a este complejo se
une posteriormente a una cadena
llamada invariable (Ii).
Posteriormente los complejos
formados por HLA y la cadena
invariante se trasladan al aparato de
Golgi desde donde se desvían a un compartimento de la vía endocítica denominado
MIIC (Compartimento para las moléculas HLA de Clase II).
En este compartimento (MIIC), (Figura 4), se inicia la proteolisis parcial de la cadena Ii,
quedándose sólo unido a la molécula HLA-I la porción de Ii que ocupa la hendidura de
unión a péptidos, llamada CLIP (class II-associated invariant chain peptide). El CLIP se
separa posteriormente, pero el dímero se mantiene estable gracias a la intervención de
una nueva chaperona de tipo HAL, el HLA-DM, presente en el del MIIC.
Las moléculas HLA-I se separa de HLA-DM si se asocia a un péptido capaz de
conferirle suficiente estabilidad. Por último, el complejo estable HLA-II/péptido viaja a
la superficie celular de la APC por vía vesicular (Figura Procesamiento APC).
Las moléculas HLA-DM, a
diferencia de las moléculas de
clase II, no se expresan en la
superficie celular, sino que
interviene en la ruta endocítica
de procesamiento para que se
pueda generar el complejo
HLA-II/péptido, sugiriendo un
papel esencial en el intercambio
entre CLIP y los péptidos ubicados en la vía endocítica.
También el HLA-DM ejercen función de chaperona, mediando la retención en el HLA-
Ivacíos o asociados a CLIP, hasta que se asocien con un péptido capaz de conferirles
alta estabilidad.
Síntesis de HLA-I y procesamiento de antígenos en células diana
La biosíntesis de moléculas HLA clase I, se realiza en el retículo endoplamático (RE)
en donde una vez formada la cadena pesadas y la beta-2-microglobulina (beta-2-m), se
unen con la ayuda de diversas chaperonas. Después las moléculas HLA-I generadas en
el RE se desplazan al aparato de Golgi, desde donde pasan a través del tras-Golgi y por
vía vesicular, llegan a la membrana celular (Figura Procesamiento célula diana).
En concreto el proceso es como sigue: el heterodímero formado por la cadena pesada y
la beta-2-m formado en el RE es inestable en condiciones fisiológicas y requiere de la
unión a un péptido para alcanzar una conformación estable que le permita la salida del
retículo endoplásmico. La cadena pesada se une a una molécula llamada calnexina,
chaperona de HLA-I por excelencia, que funciona uniéndose a proteínas de nueva
síntesis que aún no se han plegado o ensamblado correctamente, reteniéndolas en el RE.
Cuando la beta-2-m se une a la cadena pesada, la calnexina se desplaza para que HLA-I
se una a otras chaperonas, entre ellas la calreticulina, cuya función es parecida a la
calnexina. El complejo calreticulina/beta-2-m se une a una tercera chaperona llamada
tapasina (Figura Procesamiento célula diana).
Las proteínas endógenas son degradas en los proteosomas que son complejos catalíticos
multienzimático en donde las proteínas son degradas hasta péptidos que
posteriormente serán trasladados al interior del RE con ayuda del trasportador de
péptidos TAP (Transporter Associated with antigen Processing). Para ello, el péptido
interacciona con la parte citoplasmática de TAP provocando la hidrólisis del ATP, que
induce un cambio conformacional del transportador permitiendo el paso del sustrato al
lumen del RE.
Posteriormente las moléculas HLA-I estabilizadas por los pepidos unidos a ellas son
trasportadas a la membrana celular donde quedan ancladas exponiéndose a los
receptroes de los linfocitos T.
Las moléculas HLA como receptores
de péptidos
Las moléculas HLA necesitan formar
complejo con un péptido para
convertirse en moléculas estables y
maduras. En estado de reposo celular,
las moléculas del HLA están ocupadas
por péptidos propias, endógenas o
exógenas. Cuando el organismo es
atacado por un agente extraño, como
por ejemplo un virus, estos péptidos naturales son desplazados por los péptidos víricos
que, durante la infección, serán mayoritarios en el interior de las células presentadoras.
Debido al polimorfismo de las moléculas del HLA, cada molécula de
histocompatibilidad presenta una
secuencia distinta en el lugar de unión
al péptido, lo cual implica que existan
preferencias en cuanto al patrón de
péptidos que se unirán a cada
molécula de HLA. Por otra parte, los péptidos que se unen a las moléculas de HLA-I y
HLA-II presentan características especiales que describen a continuación (Figura 7).
Las moléculas de clase I unen péptidos cortos, de 8-10 aa y en general, cada molécula
de clase I puede unir de 2.000 a 10.000 péptidos distintos. En la unión tienen especial
importancia a los aminoácidos en posición 2 y 9 del péptido que son los "puntos de
anclaje" a la molécula de clase I.
Las moléculas de clase II, unen péptidos de mayor tamaño que las de clase I. Estos
péptidos oscilan entre 12 y 20 aa y sus puntos de anclaje a la cavidad del HLA se hace
por aminoácidos situados en las posiciones extremas, generalmente, 2 o 4 y 9. El tipo
de péptido se halla sujetos a un proceso selectivo de unión que depende del alelo del
HLA-II.
BIBLIOGRAFIA
http://es.wikipedia.org/wiki/Complejo_mayor_de_histocompatibilidad
http://www.inmunologiaenlinea.es/index.php?
option=com_content&view=article&catid=40%3Ahistocompatibilidad&id=67%3A
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http://www.uco.es/grupos/inmunologia-molecular/inmunologia/
tema05/etexto05.htm