ANALITIKA VITAMINA

Metode određivanja:

a) Direktneb) Indirektne

Direktne metode-------koncentracije vitamina, prekurzora, metabolitau tečnostima i tkivima

Indirektne metode-evaluacija fiziološkog odgovora na biohmijskoDejstvoEnzimatski ili pak metabolički tetsovi

Uzorci :krv, plazma, serum ili homogenatiAntikoagulans:litij heparinat(tiamin,riboflavin,vit A,E,D i beta karoten

Liposolubilni vitamini:

VIT A(nehemoliziran uzorak)VIT A(nehemoliziran uzorak)

1.Kolorimetrijske metode

Retinol(serum)---dehidratacija u prisustvu Lewis kiseline-----plavi kompleksa)Reakcija sa trifluoroctenom kiselinom (Neald Pearson) 620 nm

b)Klasična Carr Price metoda (koristi antimon hlorid u hloroformu)2.Fluorimetrijske metode

3.HPLC---određuje retinol,njegove estre, terapeutke retinoide kao i beta karoten

VIT D

1.Određivanje 25 hidroksi vitamina D u serumuOdređuje se kalcidiol (cirkulirajući nivo)Metode kompetitivog vezivanja proteina

2.Metaboliti-detekcija teška jer su prisutni u manjim koncentracijamaHPLC ili eseji radioligand vezivanja

Faze u eseju:

EkstrakcijaHromatografsko pročišćavanjeKvantifikacija sa radioligandima

ViT EViT E

1.Određivanje vit E u serumu ili plazmiFaze: Saponifikacija uzoraka Molekularna destilacijaGasna hromatografija ili HPLC

2.Hemijske metode –princip oksidoredukcijeOksidacija tokoferola u tokoferil kinon u prisustvu FeCl3

Fe+2 kompleksiranje sa alfa, alfa dipiridilom----crvena boja

3.Test hemolize eritrocitaVeća od 20%nakon ispiranja u soluciji vodik peroksida(može i fiziološka) u trajanju od 3 sata predstavlja deficit.

3Spektrofotometrija, fluorimetrija4.HPLC-reverzna faza (uv ili elektrohemijska detekcija)

Vit KVit K

1.Direktno određivanje(spektrofotometrija1.Direktno određivanje(spektrofotometrija))Kinoidni nukleus+ kiselili fenil hidrazinKinoidni nukleus+ kiselili fenil hidrazin 2,6dihlorindofenol2,6dihlorindofenol piperidinpiperidin nakon hemijske redukcijenakon hemijske redukcije

2.Protrombinsko vrijeme

Tkivni tromboplastin se doda na rekalcificiranu plazmuKada protrombin opada za više od 30%, PT vrijeme raste iznad 30 sec.Prolongiranje od više od 2 minute-hipovitaminoza

3.Reverzna HPLC-fluorimetrijska detekcija

4.Imunohemijske metode

TIAMIN1.Hemijske metodeTiamin + fericijanid u alkalnom rastvoru--------------Tiohrom

Modifikacije ove metode------elektroforeza, jonoizmjenjivačka ili HPLC

2.Određivanje funkcionalnog nivoa TPP-a Mjerenje odnosa laktat/piruvat nakon administriranja glukoze Nivo u krvi i urinu raste kod nedostatka Pad aktivnosti piruvat dehidrogenaze Akumuliraju se još 2-oksoglutarat, glioksilat te urinarni metil glioksal.3.Određivanje transketolaze (eritrocit)X5P+R-5-P------------->sedoheptulozo-7-P+ GA3PX5P+E-4-P------------- > F6P+GA3PPraćenje brzine nestanka D-R-5P sa orcinolom (580 nm)Ili nastanka sedoheptulozo-7-P na 670 nmStvaranje F6P uz antron reagensEnzim se određuje u prisustvu i odsustvu TPP-a.

Određivanje transketolaze eritrocita

Stvaranje GA3P –višak triozofosfat izomeraze.GDH i NADHOptički test

RIBOFLAVIN

1.Tehnike zasnovane na specifičnom vezivanju (riboflavin sa riboflavin vezujućim proteinom iz bjelanceta jajeta)FMN sa apoflavodoksinomFAD sa apoproteinima za D amino oksidazui AK ili glukozo oksidazu.Određivanje urinarne ekskrecije vitamina na tašte, u eritocitu

Urin :fluorimetrijska detekcija(HPLC), mikrobiološke tehnike

Eritrociti:fluorimetrija ili mikrobiološki test2.Određivanje FAD ovisne glutation reduktaze u liziranim eritrocitima (referentna metoda)Apoenzim + FAD---------HaloenzimGSSH+NADPH+H+----------2G-SH+NADP+

B61.Direktno određivanje formi vitamina B6 u urinu i krvi-mikrobiološki(S.uvarum) za sva tri prirodna strainaStreptoccocus fecium za piridoksla i piridoksaminLactobacillus casei za piridoksal

2.Fluorimetrijski eseji 4 piridoksinske kisleine u urinu i PLP-a u krviNakon konverzije u cijanidni kompleks

4 piridoksinska kiselina------HPLC

3.Određivanje aktivnosti transaminaza( eritrocit)

4.Metaboliti triptofana u urinu-ksanturenska kiselina nakon testa opterećenja triptofanomU deficitu-- ksanturenska visokaTest opterećenja metioninom-odnos cistationin/cistin

NIACIN

Ekskrecija metabolita niacina i triptofana je niska., ne mjere se

1.Ekskrecija N(1)metilnikotinamid i N(1) metil-3-karboksamid-6-piridonNormalna ekskrecija 20-30% u formi metil oblika, 40-60% u formi piridonaOdnos piridon/metilnikotinamid –HPLC

FOLNA KISELINA I VITAMIN B12

1.Mikrobiološki2.Esej kompetitivnog vezivanja proteina3.Imunometrijski eseji

Drugi testovi:

Metilmalonska kiselina u serumu ili urinu,plazma homocistein(GC-MS)

MMA+vit B12-------sukcinat., homocistein se akumulira, ne prevodi se u metionin (arterijski i venski tromboembolizam primarni test)

VITAMIN C

1.Određivanje sa 2,4 DNPH-------bis hidrazon(crven)2.Određivanje sa 2,4 dihlorfenol indofenol------redukcija u bezbojan Oblik3.Fluorimetrija4.HPLC

Nivo u serumu ili leukocitima, urin rijetko

Faze u reakcijama 1 i 2:

1.Vit C+ Cu(II)-----oksidacija dehidroaskorbat2.Dehidroaskorbat+2,4 DNPH------------------bis hidrazon(A 520 nm)