Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik

8/10/2019 Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik

1/34

ANALISIS TOKSIKOLOGI

FORENSIK DAN KLINIK

Determination of Chronic Abuse of The Anaesthetic Agents

Midazolam and Propofol as Demonstrated by Hair Analysis


2/34

Kelompok 3

Putu Wida Kawistari 1008505006

Putu Hediarta Widiana Putra 1008505080Putu Yudha Ugrasena 1008505082


3/34

Kasus

Seorang perawat wanita di departemen anestesiologi berumur 44

tahun ditemukan tewas di rumahnya. Pada kasus ini, ditemukan sebuah

botol kosong Hypnovel (midazolam 5 mg/5 mL) dan jarum suntik di

dekat mayat. Pada tubuh korban tidak menunjukkan adanya tanda-

tanda kekerasan, tetapi terdapat beberapa bekas jarum pada lengandan kongesti paru pada saat otopsi. Darah femoral dan berbagai jenis

rambut dikumpulkan untuk investigasi toksikologi. Helaian rambut di

kepala (panjang 6 cm) dipotong sedekat mungkin dengan kulit

menggunakan gunting kecil pada bagian posterior vertex dan disimpan

dalam tabung plastik kering pada suhu kamar. Tidak ada penggunaankosmetik yang diaplikasikan ke rambut (misalnya pengeritingan,bleaching, dying hair, dll). Sampel rambut ketiak dan kemaluan juga

dipotong sedekat mungkin dengan kulit menggunakan gunting kecil dan

disimpan dalam tabung kering pada suhu kamar. Warna untuk semua

spesimen rambut adalah coklat (Cirimeleet al., 2002).


4/34

Tujuan

Tujuan Analisis

Untuk analisis agen anestesi dalam sampel rambut yaitu

midazolam dengan metode GC-MS mode ionisasi kimia negatif

(NCI) dan propofol dengan metode HS-GC/MS yang sensitifdan spesifik dalam menyelesaikan kasus forensik.

Tujuan Aspek Forensik

Untuk membuktikan adanya penyalahgunaan senyawamidazolam dan propofol yang terdapat pada sampel rambut

perawat wanita yang tewas di rumahnya.


5/34

Aspek Forensik

Dalam kasus ini, peran ilmu forensik digunakan untuk mengetahui

apakah kasus ini termasuk tindak kriminal sebagai masalah hukum

atau termasuk tindak kriminal masalah teknis.

Konsentrasi senyawa midazolam dan propofol dalam darah

korban tidak memenuhi untuk menimbulkan efek toksisitas.

Sehingga dicurigai bahwa korban telah menyalahgunakan agen

anestesi tersebut dalam jangka panjang. Untuk mengetahui

riwayat penggunaan obat yang kronis, sampel biologi yang

dapat digunakan adalah rambut. Dengan bantuan ilmu forensik, dapat disimpulkan penyebabnya

adalah bunuh diri. Oleh sebab itu penyidik tidak perlu melakukan

penyidikan selanjutnya guna mencari siapa pelaku dari peristiwa

tersebut, karena kematian diakibatkan oleh perbuatannya sendiri.


6/34

Uraian Masalah

Masalah Analisis

Sampel biologis yang paling banyak digunakan dalam analisis

toksikologi adalah berupa urin dan plasma. Namun, eliminasi

obat dalam sampel tersebut terjadi dalam beberapa hari saja,sehingga untuk mengetahui tepatnya tingkat toksisitas pasien,

biasanya diperlukan analisis toksikan yang berulang baik dari

darah maupun urin, sehingga dalam kasus ini digunakan sampel

rambut.

Diperlukan suatu metode analisis yang cepat, sensitif, dan

spesifik dalam penentuan midazolam dan propofol pada

sampel rambut.


7/34

Uraian Masalah

Masalah Forensik

Ditemukan sebuah botol kosong Hypnovel (midazolam 5 mg/5

mL) dan jarum suntik di dekat mayat, serta tidak ditemukannya

tanda-tanda kekerasan pada tubuh korban, sehingga didugaperawat tersebut meninggal akibat penyalahgunaan

midazolam dan propofol.

Apakah kasus tersebut termasuk tindak kriminal sebagai

masalah hukum atau tindak kriminal sebagai masalah teknis?


8/34

Tinjauan Pustaka

Midazolam

Midazolam, yang juga dikenal sebagai Hypnovel, merupakan

water soluble benzodiazepine yang terikat dalam albumin

plasma. Midazolam termasuk psikotropika golongan IV yang pertama

kali dibuat tahun 1976 oleh Fryer dan Walser. Tujuan

pemberian utamanya adalah sebagai obat penenang atau

hipnotis serta digunakan dalam prosedur medis dan bedah. Paparan midazolam terhadap pH darah juga mengubah

strukturnya dariwater-solublemenjadilipid-solubleyang mampu

melewati sawar darah otak untuk meningkatkan akses menuju

sistem saraf pusat.


9/34

Tinjauan Pustaka

Midazolam

Rumus molekul : C18H13ClFN3

Berat molekul : 325,8 g/mol

Pemerian : Kristal tidak berwarna Kelarutan : Larut dalam air

Titik leleh : 158-1600C

pKa : 6,2

Koefisien partisi : Log P (oktanol/air) 4,3


10/34

Tinjauan Pustaka

Propofol

Propofol merupakan derivat fenol yang banyak digunakan

sebagai anastesia intravena dan lebih dikenal dengan nama

dagang Diprivan. Propofol digunakan untuk induksi dan pemeliharaan dalam

anastesia umum dengan pemakaian propofol, maka

didapatkan kesadaran yang lebih cepat kembali dengan

efek residul yang minimum pada sistem saraf pusat jikadibandingkan dengan obat induksi lainnya.


11/34

Tinjauan Pustaka

Propofol

Rumus molekul : C12H18O

Berat molekul : 178,3 g/mol

Kelarutan : Sangat sukar larut dalam air Titik leleh : 190C

pKa : 11,1

Koefisien partisi : Log P (oktanol/air) 3,79


12/34

Tinjauan Pustaka

Preparasi Sampel Biologis (Rambut)

Keuntungan tes rambut dibandingkan dengan urine atau darah

adalah mempunyai jendela pengamatan yang besar (mingguke bulan, tergantung dari panjang batang rambut, 2-4 hari

untuk obat dalam urine dan darah) serta mampu membedakan

antara chronic use atau single exposure. Biasanya analisis

rambut disertai juga dengan analisis urin atau darah. Analisisrambut digunakan untuk mengetahui data jangka panjang

sedangkan analisis urin atau darah untuk informasi jangka

pendek.

Prosedur pengambilan rambut untuk analisis belum terstandarisasi.


13/34

Tinjauan Pustaka

GC-MS

Pemisahan pada kromatografi gas didasarkan pada titik didih suatu

senyawa dikurangi dengan semua interaksi yang mungkin terjadi

antara solut dengan fase diam. Fase gerak yang berupa gas

akan mengelusi solut dari ujung kolom lalu menghantarkannya ke

detektor. Spektrometri massa didasarkan pada pergerakan

partikel yang bermuatan (ion) dalam bidang listrik atau magnetik

berdasarkan rasiom/zdari ion tersebut

Pengoperasian GC/MS dalam mode SIM memungkinkan untukmendeteksi analit tertentu dengan meningkatnya kepekaan relatif

terhadap mode full scan. Dalam mode SIM, MS mengumpulkan

data massa lebihinterestdaripada mencari semua massa dalam

semua rentang.


14/34

Metode Analisis

GC/MS denganNCI deteksi

chromatograph (LC sistem

Alliance)

Tabung kaca head space

Kolom kapiler HP wax (30 m

0.25 mm I. D. 0.25 mm tebal

film)

Detektor selected ion monitoringDan beberapa peralatan lain

sesuai keperluan analisis.

Methylene klorida

Tetrahydofuran (THF)

Soerensen buffer pH 7,6 Diazepam deuerated

Diethyl eter / kloroform

N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide

1% trimethylchlorosilane. Rambut Perawat (dari ketiak,

kepala, pubis) dengan panjangberbeda

Rambut selain perawat (Blank)

Alat Bahan


15/34

A. Preparasi Larutan Stok Standar

Larutan Stok Midazolam, 1-OH-midazolam, dan Propofol

Larutan stok disiapkan dalam metanol pada konsentrasi 400 g/ml dan

disimpan pada suhu -20OC. Dibuat larutan kerja 400 ng/mL

Larutan Internal Standar (Diazepam terdeuterasi) untuk Midazolam dan 1-

OH-midazolam Larutan stok Diazepam dibuat pada konsentrasi 100 g/mL. Dibuat

Larutan baku kerja internal sebesar 5 ng/mL

Larutan Internal Standar (THF) untuk Propofol

Disiapkan stok tetrahidrofuran (THF) pada konsentrasi 100 g/mL. Dibuatlarutan kerja baku internal sebesar 5 ng/mL

Pembuatan Buffer

KH2PO4(38,8 mL) (9,07 g/ml) dicampur dengan 61,2 ml (11.87 g/ml)

Na2HPO4dan diatur pH nya menjadi 7,6 dengan 1M NaOH. Bufferdisimpan selama 1 bulan pada temperatur hangat dalam termos gelap.


16/34

C. Penanganan Sampel Rambut (Prosedur Ekstraksi)

untuk Analisis Midazolam, 1-OH-midazolam

Untuk melakukan validasi metode, rambut kepala tanpa obat digunakan sebagaispesimen kosong (blanko). Rambut perawat yang telah dilakukan pencucian

berturut-turut dalam metilen klorida dipotong-potong menjadi 3 bagian.

Dari akar 2 cm, 2-4 cm, dan 4-6 cm. Rambut dari ketiak dan pubis jugadikumpulkan dan dicuci dengan metilen klorida.

Rambut kemudian dihaluskan dalam ball mill dan 50 mg bubuk rambut

diinkubasi dalam 1 ml larutan penyangga pH 7,6 semalaman pada suhu 40Cdengan diazepam deuterateddigunakan sebagai standar internal sebesar 50 ng.

Setelah ekstraksi dengan 5 ml dietileter : kloroform (80:20 v/v), fase organik

diuapkan dan ekstrak kering diderivatisasi dengan 35 ml N,O-bis (trimetilsilil)

trifluoroacetamide dan 1 % trimetilklorosilan.


17/34

D. Penanganan Sampel Rambut (Prosedur Ekstraksi)

untuk Analisis Propofol

Setelah dicuci berturut-turut dalam metilen klorida, rambut dipotongmenjadi segmen kecil 1 mm dengan gunting.

Sebanyak 50 mg ditambahkan ke tabung 20 ml kaca head-spacedengan tetrahidrofuran (THF) sebagai standar internal danditambahkan 1 ml larutan penyangga pH 7,6.

Tabung disegel dan diinkubasi semalaman pada suhu 40C.


18/34

E. Analisis Midazolam, 1-OH-midazolam dengan GC-

MS

Analisis dilakukan dengan menggunakan metode GC/MS dalam

mode NCI. Alikuot 1,5 l dari derivatisasi ekstrak diinjeksikan

dengan suhu injektor 250C ke kolom kapiler HP-5MS (30 m

0,25 mm ID 0,25 pM ketebalan Film).

Pemisahan dicapai dengan kecepatan alir konstan dari 1,0

ml/menit dari gas pembawa helium menggunakan suhu oven awal

60C dipertahankan selama 1 menit, kemudian naik 30C/menit

sampai 295C dan suhu akhir dipertahankan selama 6 menit.

Metana digunakan sebagai gas reaktan pada tekanan 1,3 Torr

dalam sumber ion. Spektrum massa yang direkam dalam mode fullscan 250-450 Amu.


19/34

Analit diidentifikasi berdasarkan waktu retensi

relatif mereka dan spektrum massa tertentu,

yaitu midazolam dengan waktu retensi 10,08

menit, m/z 325-327; 1 - OH - midazolamdengan waktu retensi 10,64 menit, m/z 325-

413-415; diazepam-d5dengan waktu retensi

9,55 menit, m/z 289. Kuantifikasi dilakukansetelah penentuan faktor respon terhadap

diazepam-d5.

Cont...


20/34

F. Analisis Propofol dengan GC-MS

Campuran yang telah homogen dianalisis secara langsung dengan sistem

operasi HS-GC/MS mode tumbukan elektron (electronic impact).

Untuk proses volatilisasi, tabung yang diberi tekanan selama 15 menit pada

80C dalam HS 40 (Perkin Elmer) dan aliquot dipindahkan ke kromatografigas (Hewlett Packard 5890) di bawah tekanan helium 100 kPa.

Kromatografi dioperasikan pada kolom lilin kapiler HP (30 m 0,25 mm ID

0,25 mm ketebalan film) menggunakan suhu oven berikut: 45C selama 3menit, 10C/menit sampai 180C dan 30C/menit sampai 240C.

Deteksi dilakukan dengan detektor massa selektif Hewlett Packard 5971menggunakan modeSelected ion monitoring(SIM).


21/34

Propofol diidentifikasi berdasarkan waktu

retensi dan kelimpahan relatif tiga ion

mengkonfirmasikan: propofol dengan waktu

retensi 18,34 menit, m/z 117-163-178; THFdengan waktu retensi 2,13 menit, m/z 72.

Kuantifikasi Propofol dibuat setelah penentuan

faktor respon terhadap THF.

Cont...


22/34


23/34

Presisi

Presisi ditentukan dengan simpangan baku dan simpangan

baku relatif dari larutan sampel yang ditetapkan. Simpangan

baku ditentukan menggunakan rumus berikut:

Nilai presisi midazolam dan 1-OH-midazolam padakonsentrasi 0.5 ng/mg masing-masing sebesar 6.3% dan

8.1%. Nilai presisi propofol pada konsentrasi 0,5 ng/mg

adalah 6,0%.


24/34

Akurasi

Data AUC dari pengukuran rentang linearitas digunakan kembali

untuk menentukan akurasi metode ini. Caranya adalah dengan

menghitung perolehan kembali Midazolam, 1-OH-midazolam dan

propofol yaitu mensubstitusikan nilai masing-masing AUCpengukuran pada persamaan regresi y = bx + a. Jadi, perolehan

kembali dihitung dengan rumus :

Pada analisis Midazolam dan 1-OH-midazolam, nilai akurasi

adalah rata-rata persen perolehan kembali untuk konsentrasi 0,5

ng/mg sebesar 93,8% dan 90,2%. Persen perolehan kembali untuk

propofol konsentrasi 0,5 ng/mg sebesar 27%.

%100sebenarnyakadar

pengukuranhasildarikadarkembaliPerolehan


25/34

LOD dan LOQ

Batas deteksi (LOD) dan batas kuantitasi (LOQ) ditentukan denganmenghitung simpang baku residual yang membandingkan hasil pengukurandengan hasil perhitungan. Rumus yang digunakan adalah:

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

Sb = simpangan baku residual

k = konstanta yaitu 3 untuk LOD atau 10 untuk LOQ

Sl = arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara responterhadap konsentrasi = slope (b pada persamaan garis y = a + bx)

Nilai LOQ Midazolam, 1-OH-midazolam, propofol pada kasus ini adalah1,05 ng/mg.


26/34


27/34

Cont..

Pencucian dengan metilen klorida untuk

menghilangkan pengotor-pengotor selain

analit pada sampel.

Pemotongan rambut menjadi beberapa bagian

dari akar untuk mengetahui deposisi analit

ada pada bagian rambut yang mana yang

ditunjukkan dengan kadar tertinggi analitpada bagian rambut tertentu.


28/34

Cont..

Analisis Midazolam dan 1-OH-midazolam derivatisasi GC/MS negative chemical ionization(NCI) menghilangkan gangguan bahan kimiasehingga menyediakan kemampuan untuk mengukur

dalam matriks yang kompleks.Headspace (HS) GC/MS analisis dengan kuat,

teknik sepenuhnya otomatis untuk penentuan melacaksenyawa organik volatil dengan jumlah sedikit

menghindari kesalahan karena kontaminasi silangdengan gelas dan hilangnya komponen volatil selamatransfer sampel.


29/34

Cont..

Linearitas: untuk midazolam konsentrasi mulai0,05 - 5,00 ng/mg (r = 0,97 dan 0,96) danpropofol konsentrasi mulai 0,1 - 10,00 ng/mg (r= 1,00).

Presisi & perolehan kembali: midazolam 6,3 dan93,8%; 1-OH-midazolam 8,1 dan 90,2%;propofol 6,0 dan 27% (untuk konsentrasi 0,5ng/mg).

Rasio signal-to-noise: midazolam 35 pada titikkalibrasi terendah 0,05 ng/mg; propofol padatitik kalibrasi terendah 0,01 ng/mg.


30/34

Tabel 1. Hasil analisis dari midazolam, 1-OH midazolam (1-OH-

M) and propofol pada tipe rambut yang berbeda


31/34


32/34

Cont..

Hasil kromatogram ion mode deteksi NCI: identifikasimidazolam waktu retensi 10,08 menit, m/z 325-327, 1-OH-midazolam dengan waktu retensi 10,64 menit, m/z325-413-415, diazepam-d5dengan waktu retensi 9,55

menit, m/z 289. Kuantifikasi dilakukan setelah penentuan faktor respon

terhadap diazepamd5.

berdasarkan waktu retensi dan kelimpahan relatif tiga ion

dengan hasil waktu retensi propofol 18,34 menit, m/z 117-163-178, THF dengan waktu retensi 2,13 menit, m/z 72.

Kuantifikasi Propofol dibuat setelah penentuan faktorrespon terhadap THF.


33/34

Kesimpulan

Penyalahgunaan agen oleh staf medis untuk tujuanhiburan sudah banyak diketahui tetapi bukti analisissering kurang. Etanol yang ditemukan dalam darahjuga dapat menjadi pemicu kematian dalam kasus ini.

Dalam situasi ini, analisis rambut dapat menjadipengatasannya. Hasil analisis yang dilakukanmenunjukkan GC / MS-NCI dapat digunakan untukmendeteksi agen anastesi dalam rambut manusia. Sifatfisiko-kimia propofol mendukung untuk dilakukannya

headspace preparation dari spesimen rambut dandilakukan pengembangan metode asli yang tidakmemerlukan prosedur ekstraksi yang lama.


34/34

Documents

Analisis Toksikologi Forensik Dan Klinik