LAPORAN PRAKTIKUM

ANALISIS KIMIA TUMBUHAN OBAT

ANALISA FLAVONOID DALAM DAUN KETELA POHON

(Manihot utilissima Pohl)

Disusun oleh :

Amaliani Candra Pradipta (FA/08847)

Harjanti Penjawi Siwi (FA/08855)

Golongan IV, kelompok 3

Asisten jaga : Fatiya, Ikhsan

Tgl. Praktikum : 1 Oktober 2014

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS GADJAH MADA

YOGYAKARTA

2014

Maserasi dengan 10 mL metanol (10’)

Remaserasi 2x dengan 10 mL etanol (@10’)

Dibagi menjadi 2 bagian @ 5 mL

diuapkan

Direfluks dengan 5 mL HCl 5%

Partisi aglikon dalam corong

pisah dengan ditambah 10 mL

eter, digojog, diulangi 2x

Diuapkan hingga 1 mL Ditambah 1 g Na-sulfat, disaring dan diuapkan

Dilarutkan dengan metanol hingga 5 mL

Dipipet 500 µL, Ditambah metanol, AlCl3, Na-asetat, akuades

Diukur serapan pada 415 nm Replikasi 2x

ANALISA FLAVONOID DALAM DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)

A. SKEMA KERJA

5 g serbuk bahan 5 g serbuk bahan

Filtrat diuapkan hingga 10 mL

Filtrat jernih

Sampel A Sampel B

Ekstrak kental

Cairan hasil hidrolisis

Fraksi air-asam

Sampel B2

KLT

Fraksi eter

residu

Sampel B1

Larutan campuran

Kadar flavonoid total

KLT

KLT

B. Hasil Dan Analisis Data

Analisis Kualitatif

1. Hasil KLT

Asam asetat sinar tampak BAW sinar tampak

Asam asetat UV 254 BAW UV 254

Asam asetat UV 366 BAW UV 366

asam asetat semprot sinar tampak BAW semprot sinar tampak

Asam asetat semprot UV 366 BAW semprot UV 366

2. Data Rf

Fase

gerak

Sampel Rf

Tampak UV 254 UV 366 tampak UV 366

Asam

asetat

A 0,03 kuning

0,13 Kuning

0,24 Kuning Kuning

0,27 kuning

0,49 Kuning

0,53 kuning Biru

kehitaman

Kuning

0,6 Kuning

0,67 kuning Biru Kuning

B1 0,03 kuning Kuning Kuning biru

0,36 Biru Kuning

0,44 Biru

0,56 Biru Kuning

0,73 Biru

0,8 Biru Biru

B2 0,04 Biru

0,33 Kuning

0,53 Kuning Kuning

0,8 Kuning Biru

BAW A 0,07 Kuning Kuning Biru

0,15 Kuning Kuning Biru

0,2 Biru

0,31 Kuning Kuning Biru

0,45 Biru Kuning

0,62 Kuning Kuning Kuning

0,82 Biru

0,85 Coklat Kuning

kecoklatan

Merah Coklat Merah

0,92

1 Coklat Kuning

kecoklatan

Merah Coklat Merah

B1 0,77 Kuning kuning Kuning Kuning

Biru

1 Coklat Merah Coklat Kuning

B2 0,15 Kuning

0,28 Kuning

0,31 Kuning

0,46 Kuning Kuning Kuning Kuning

0,62 Kuning

0,92

1 Coklat Biru Coklat

3. Sistem KLT

Fase diam : Silika gel F 254

Fase gerak : asam asetat 15 % dan n-butanol-asam asetat-air (4:1:5 v/v)

Jarak migrasi : 7,5 cm (fase gerak asam asetat) dan 6,5 (fase gerak BAW)

Deteksi : Pereaksi semprot sitroborat

Sampel : tiap bercak 6 penotolan

Analisis Kuantitatif Flavonoid Total

1. Pembuatan Larutan Standar

Pembuatan larutan stok :

25 µL larutan baku quersetin 0,1 %,ditambah metanol pa ad 25 mL

Kadar (%) Komponen yang ditambahkan

Larutan stok (mL) Metanol pa (mL)

0,0010 % 2 0

0,0008 % 1,6 0,4

0,0006 % 1,2 0,8

0,0004 % 0,8 1,2

0,0002 % 0,4 1,6

2. Pembuatan Sampel

Sampel dengan AlCl3 (mL) Sampel tanpa AlCl3 (mL)

AlCl3 0,1 0

Na-asetat 0,1 0,1

Aquades 2,8 2,9

Sampel B1 0,2 0,2

Metanol pa 1,8 1,8

3. Absorbansi Larutan Baku dan Persamaan Regresi Linier

Absorbansi (nm)

Kadar (%) Sampel dengan AlCl3 Sampel tanpa AlCl3

0,0002 % 0,140 0,086

0,0004 % 0,147 0,121

0,0006 % 0,200 0,128

0,0008 % 0,259 0,131

0,0010 % 0,272 0,171

Dari data di atas, lalu dibuat persamaan kurva baku, diperoleh

A = 0,0174

B = 98

r = 0,779 , sehingga

Y = 98 x + 0,0174

(dengan data absorbansi yang digunakan adalah ansorbansi dengan AlCl3 dikurangi

absorbansi tanpa AlCl3)

4. Absorbansi Sampel

No Sampel dengan AlCl3 Sampel tanpa AlCl3 Selisih

1 1,520 0,534 0,986

2 1,497 0,515 0,982

3 1,455 0,485 0,970

5. Perhitungan kadar Sampel

Y = 98 x + 0,0174

a. Sampel 1

0,986 = 98 x + 0,0174

X = 0,00988 %

b. Sampel2

0,982 = 98 x + 0,0174

X = 0,00984 %

c. Sampel 3

0,970 = 98 x + 0,0174

X = 0,00972 %

d. Kadar Flavonoid Total Rata-rata

% kadar = 0,00981%

Kadar flavonoid total rata-rata dalam sampel adalah 0,00981 %

C. Pembahasan

Ketela pohon atau Manihot utilissima Pohl. merupakan tumbuhan yang bagian

daunnya dikenal mengandung flavonoid. Pada percobaan ini, yang dipelajari adalah

melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon dan kemudian melakukan analisis

kualitatif menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) serta analisis kuantitatif

dengan metode spektrofotometri terhadap hasil isolasi tersebut.

Langkah pertama, simplisia serbuk daun ketela pohon dimaserasi dalam 20 ml

metanol untuk memisahkannya dengan senyawa senyawa lain yang tidak larut dalam metanol.

Flavonoid memiliki beberapa gugus –OH dan gugus keton sehingga cukup polar apalagi

dalam bentuk glikosidanya oleh karena itu digunakan pelarut yang cukup polar namun tidak

terlalu polar, yaitu metanol. Serbuk direndam selama 10 menit untuk memaksimalkan

perpindahan flavonoid dari sel sel daun menuju ke pelarut metanol secara difusi pasif.

Penggojogan dilakukan beberapa kali untuk memberikan gaya dorong (driving force)

tambahan bagi perpindahan tersebut. Maserasi dilakukan beberapa kali, pada maserasi kedua

dan ketiga digunakan 20 ml methanol. Dilakukan remaserasi agar jumlah flavonoid yang

didapat cukup banyak sehingga dapat terbaca ketika dielusi dengan KLT.

Filtrat hasil maserasi dikumpulkan kemudian diuapkan menjadi 10 ml sehingga lebih

pekat. Filtrat lalu dibagi dua bagian, sampel A dan sampel B. Sampel A ini dapat langsung

dilakukan KLT. Sedangkan sampel B diberi perlakuan pemekatan kemudian penambahan HCl

1% dan di refluks selama 30 menit. Penambahan HCl dan pemanasan ini menyebabkan

terjadinya hidrolisis terhadap glikosida. Jadi secara teoritis, sampel A mengandung flavonoid

dalam bentuk glikosida yaitu rutin, sedangkan sampel B mengandung flavonoid dalam bentuk

aglikon yaitu kuersetin, dan juga bagian gulanya. Hidrolisis glikosida secara refluks dapat

mempercepat reaksi karena terjadi tumbukan dalam bentuk uap yang energi kinetiknya lebih

besar. Berikut reaksi hidrolisis rutin dalm suasana asam oleh pemanasan :

HO

OH

O

O

OH

OH

O

O

O

OH

OHHO

OHO

H3C

HO

OH

HO

OH

O

O

OH

OH

OH

O

O

OH

OHHO

OHO

H3C

HO

OH

Rutin

Kuersetin

glukosa-o-ramnosa

H /H20

Di dalam sampel B, terdapat aglikon flavonoid dan gulanya. Untuk memisahkannya

dilakukan partisi terhadap sampel B dengan pelarut eter, pelarut eter bersifat nonpolar

sehinggga aglikon flavonoid yang lebih nonpolar dari gula akan cenderung terlarut dalam eter.

Bagian gula tetap berada dalam fase air asam karena banyaknya gugus –OH pada gula

sehingga mampu membentuk ikatan dengan air dalam ikatan hidrogen. Karena perbedaan

kelarutan aglikon flavonoid dengan gula di dalam fase air dan fase eter maka kedua zat

tersebut terpisah.

Fase eter dipisahkan dari fase air dan partisi diulang lagi terhadap fase air untuk

memperoleh aglikon flavonoid lebih banyak lagi. Fase air kemudian diambil dan fase eter

dijadikan satu. Kedalam fase eter, ditambahkan Na2SO4 anhidrat untuk menarik tapak tapak

air yang masuk ke dalam fase eter. Bila tidak dihilangkan, hal ini dapat menggangu analisis

karena dalam fase air juga terdapat senyawa senyawa lain. Fase eter diuapkan hingga kering

di dalam lemari asam tanpa bantuan pemanasan karena eter sangat mudah menguap. Setelah

kering, residu yang tertinggal dilarutkan dengan metanol untuk dianalisis secara KLT. Fase

air juga dipekatkan dalam penangas air karena air sulit menguap. Setelah dipekatkan, fase air

siap untuk dianalisis secara KLT. Fase eter disebut sampel B1 sedangkan pada fase air disebut

sampel B2.

Analisis secara KLT dilakukan 2x, yang pertama sampel A, sampel B1 dan sampel B2

dielusi secara bersama dengan fase gerak asam asetat 15% dan kedua yaitu sampel A dan

sampel B1, dan sampel B2 dielusi bersama dengan fase gerak butanol : asam asetat : air

(4:1:5). Asam asetat 15% bersifat lebih polar daripada butanol : asam asetat : air (4:1:5).

Penggunaan dua fase gerak yang memiliki perbedaan kepolaran ditujukan untuk

mengoptimalkan pemisahan antara glikosida dan aglikon.

Menurut teori, pada sampel B1 terkandung kuersetin hasil hidrolisis dari rutin,

sedangkan pada sampel B2 tidak terkandung apa-apa, karena apabila hidrolisis berjalan

sempurna, rutin telah terurai menjadi glikon dan aglikonnya.

Pada analisis KLT dengan fase gerak asam asetat 15%, secara teori rutin (glikosida)

akan lebih terbawa oleh fase gerak daripada aglikonnya karena glikosida bersifat lebih polar.

Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa hidrolisis yang dilakukan belum

sempurna karena masih terdapat banyak bercak baik pada sampel B1 maupun sampel B2,

namun pada sampel B1 terlihat bercak yang lebih tertahan pada fase diam dan berfluoresensi

kuning pada UV366, bercak tersebut diduga merupakan kuersetin. Pada sampel B2, masih

terdapat benyak bercak yang serupa dengan sampel A. Hidrolisis yang dilakukan di

laboratorium hanya berjalan 30 menit padahal seharusnya 1 jam. Apabila hidrolisis telah

berjalan sempurna maka pada sampel B1 akan terlihat bercak kuersetin dan pada sampel B2

tidak terdapat bercak. Selain itu pemisahan KLT yang kurang sempurna juga menyulitkan

analisis.

Pada analisis KLT dengan fase gerak butanol : asam asetat : air (4:1:5), secara teori

kuersetin (aglikon) akan lebih terbawa fase gerak daripada glikosidanya karena aglikon

bersifat lebih nonpolar. Berdasarkan hasil percobaan pada sampel B1 terlihat bercak yang

lebih terbawa fase gerak dan berfluoresensi kuning pada UV366, bercak tersebut diduga

merupakan kuersetin. Sedangkan pada sampel B2 masih terdapat banyak bercak yang hamper

serupa dengan sampel A sehingga disimpulkan hidrolisis belum berjalan sempurna. Rutin

belum terurai menjadi glikon dan aglikonnya.

Deteksi terhadap flavonoid dilanjutkan dengan pereaksi sitroborat. Pereaksi

sitroborat ini bereaksi dengan flavonoid menghasilkan kompleks berwarna kuning seperti

reaksi dengan AlCl3. Meskipun beda sisi reaksi keduanya menghasilkan kompleks yang

berwarna sama. Berdasarkan hasil percobaan terlihat bercak yang berwarna kuning namun

karena hidrolisis yang belum sempurna dan pemisahan KLT yang kurang sempurna membuat

analisis sulit dilakukan.

HO

OH

O

O

OH

OH

O

O

O

OH

OHHO

OHO

H3C

HO

OH

Kompleks dengan borat

Rutin dengan sitroborat

HO

OH

O

O

OH

OH

OH

Kompleks dengan AlCl3

Kompleks dengan borat

Kuersetin dengan sitroborat

Analisis kuantitatif flavonoid dilakukan dengan metode spektrofotometri. Kurva

baku dibuat dengan menggunakan pembanding kuersetin. Larutan baku kuersetin dibuat

dengan berbagai tingkat konsentrasi yaitu 0,0010%; 0,0008%; 0,0006%; 0,0004%; dan

0,0002% yang dibuat duplo. Seri konsentrasi pertama direaksikan dengan Na asetat, aquadest,

dan AlCl3, sedangkan seri konsentrasi kedua direaksikan dengan Na asetat dan aquadest tanpa

penambahan AlCl3. Kemudian semua seri konsentrasi diukur absorbansinya dan dilakukan

regresi linier, kadar kuersetin sebagai y dan selisih absorbansi larutan baku + AlCl3 dengan

absorbansi larutan baku tanpa AlCl3 sebagai x. Prinsipnya AlCl3 akan membantuk kompleks

asam yang stabil dengan C-4 keto maupun C-3 atau C-5 hidroksil flavon dan flavonol (Chang,

et al, 2002). Persamaan kurva baku yang diperoleh adalah Y = 98 x + 0,0174. Sampel yang

terdiri dari larutan sampel B2, Na asetat, aquadest, methanol, dengan dan tanpa AlCl3 diukur

absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm. Hasilnya diperoleh kadar flavonoid total tiap

sampel berturut-turut 0,00988%; 0,00984%; dan 0,00972%; dengan rata-rata kadar flavonoid

total 0,00981%.

Jawaban Pertanyaan :

1. Bagaimana dapat diketahui bahwa hidrolisis yang dikerjakan telah sempurna?

Jawab:

Cara untuk mengetahui apakah hidrolisis glikosida flavonoid telah sempurna adalah

dengan melihat bercak hasil pengembangan sampel A, sampel B1, dan sampel B2. Jika

hidrolisis sempurna, pada sampel B1 akan tampak bercak kuersetin dan pada sampel B2

tidak terlihat bercak.

2. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glikosida) dan aglikonnya dan bagaimana

sifat keduanya dalam dua jenis system fase gerak yang digunakan?

Jawab:

Fluoresensi rutin lebih terang daripada aglikonnya karena gugus kromofor rutin lebih

banyak. Gula atau glikon banyak mengandung gugus OH, dan gugus OH tersebut

merupakan auksokrom. Gugus auksokrom ini akan hilang jika ikatan glikosidik lepas.

Dalam sifat fase gerak, rutin lebih cenderung polar karena mengikat gula atau glikon yang

sifatnya polar sedangkan aglikonnya lebih cenderung non polar, sehingga rutin akan

mudah terbawa oleh fase gerak asam asetat 15% dan kuersetin (aglikon) akan cenderung

lebih terbawa oleh fase gerak BAW.

D. Pustaka

Chang, C., Yang, M., Wen, H., Chern, J., 2002, Estimation of Total Flavonoid Content in

Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods, Journal of Food and Drug

Analysis, Vol. 10, No. 3, Pages 178-182.

Harborne, J.B., 1996, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan,

Penerbit ITB, Bandung.

Mabry A.J., Markham K.R., Thomas M.B., 1970, The Systemic Identification of Flavonoids,

Springer, Verlog, Berlin.