392 VESMÍR 80, červenec 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir

„...Posledný gén musí mať špeciálnu funkciu – zale-piť koniec chromozómu, pretože chromozóm s „neza-lepenými“ koncami z neznámych dôvodov nie jeschopný dlhodobej existencie. Tento gén treba ozna-čiť nejakým špeciálnym termínom, napríklad ,telomé-ra‘ (nezávisle aplikovaným mnou, Darlingtonoma Haldaneom)...“ Hermann J. Müller, 1938

Povie vám to každý komik: nech je scénka akokoľvekvtipná a plná originálnych nápadov, bez pointy z nejostáva len trápny dojem. A pointami chromozómovsú teloméry (gr. telos, koniec, meros, časť), štruktú-ry na konci lineárneho chromozómu zabezpečujúcejeho ochranu pred degradáciou a fúziou s inýmichromozómami. Akokoľvek je replikácia chromozó-mu bezchybná a rýchla, bez syntézy a stabilizácie te-

Alternatívnestratégie replikácietelomér I.alebo keď dvaja robia to isté...

ĽUBOMÍR TOMÁŠKAJOZEF NOSEK

lomér sa neubráni istej dávke rozpačitosti. Všimli sito už Barbara McClintocková a Hermann J. Müllerv 30. rokoch minulého storočia: chromozómys narušenými koncami majú tendenciu fúzovaťa vytvárať štruktúry, ktoré nie sú stabilné pri dele-ní bunky. A bol to práve Müller, ktorý do cytogene-tiky zaviedol termín teloméra. Po štyridsiatich rokochrelatívneho ticha zadunel telomérami ďalší problém,ktorý nezávisle od seba formulovali James D. Wat-son a ruský biofyzik Alexej M. Olovnikov. Práve sakončila éra Arthura Kornberga, ktorý v priebehu 15rokov odhalil základné princípy replikácie DNA. Jed-ným z nich bol prekvapivý fakt, že DNA-polymerázy(enzýmy zodpovedné za syntézu DNA) sú tvrdohlavojednosmerné (od konca 5‘ ku koncu 3‘) a všetky po-trebujú pre začiatok syntézy dcérskeho vlákna voľnúhydroxylovú skupinu. Ani jednu z týchto požiada-viek im koniec chromozómu nedokáže splniť. Repli-

Doc. RNDr. Ľubomír Tomáška, CSc., (*1966) a doc. RNDr. Jo-zef Nosek, CSc., (*1967) vyštudovali molekulárnu biológiua genetiku na Prírodovedeckej fakulte Univerzity Komenské-ho v Bratislave. V laboratóriu prof. Ladislava Kováča sa za-čali venovať mitochondriálnej genetike, biológii telomér, bio-energetike a morfogenéze kvasiniek. Dnes vedú spoločné la-boratórium katedier genetiky a biochémie Prírodovedeckejfakulty UK (http://www.fns.uniba.sk/~kbi/kovlab).

SLOVNÍČEKDNA-polymeráza – Enzým katalyzujúci syntézu dcérskeho vlák-

na DNA polymerizáciou jeho stavebných jednotiek, nukleotidov.ALT – Alternative Lenghtening of Telomeres. Termín zaviedol

Roger Reddel pre mechanizmy replikácie telomér bez účastitelomerázy.

D-slučka – Štruktúra tvaru písmena D, ktorá vzniká v dôsledkuvytesnenia jedného z vláken DNA jednovláknovým úsekomnukleovej kyseliny

est mutanty – (Ever Shorter Telomeres). Mutanty Saccharo-myces cerevisiae, u ktorých dochádza k progresívnemu skra-covaniu telomér a po niekoľkých generáciách k postupnej stra-te proliferačnej aktivity.

FISH – Fluorescent in situ hybridization.imortalizácia – Proces, pri ktorom sa z pôvodne smrteľnej bun-

kovej kultúry stáva nesmrteľná bunková línia.makrojadro – Transkripčne aktívne jadro niektorých prvokov,

ktoré vzniká fragmentáciou chromozómov mikrojadra a na-sledujúcou amplifikáciou fragmentov DNA na niekoľko tisíckópií. Každý fragment je opatrený identickou telomerickousekvenciou.

mikrojadro – Transkripčne neaktívne jadro niektorých prvokov,ktoré slúži ako genetická jednotka.

PML – Promyelocytic leukemiaSSB proteíny – (Single-Stranded DNA Binding proteins). Pro-

teíny, ktoré sa s vysokou afinitou a bez sekvenčnej preferen-cie viažu na jednovláknovú DNA. Ich hlavná úloha spočívav zabraňovaní reasociácie dvoch komplementárnych vlákenDNA počas replikácie a rekombinácie.

tandemová repetícia – Sekvencia DNA, ktorá sa v tej is-tej orientácii opakuje niekoľkokrát za sebou.

telomeráza – DNA-polymeráza závislá od RNA, predlžujúcaprečnievanie na telomerickom konci 3’. Je zložená z RNA-podjednotky plniacej úlohu templátu a katalytickej proteíno-vej podjednotky.

teloméra – (Gr. telos, koniec, meros, časť). Štruktúra na koncilineárneho chromozómu zabezpečujúca jeho ochranu preddegradáciou a fúziou s inými chromozómami.

telomérový pozičný efekt – Represia (umlčanie) prepisu génulokalizovaného do oblasti telomerického chromatínu.

transpozón – Segment DNA, ktorý sa môže pohybovať z miestana miesto v genóme tej istej bunky. Významný zdroj gene-tickej variability.

t-slučka – Lasovitá štruktúra na konci cicavčích chromozómov,ktorá vzniká vnorením telomerického prečnievania na konci3’ do dvojvláknovej telomerickej oblasti. Zabezpečuje ochra-nu telomér pred degradáciou a DNA-opravným systémamibunky i alternatívny spôsob ich replikácie.

5‘

3‘

5‘

3‘

5‘

3‘

5‘

3‘

5‘

3‘

teloméra centroméra

replikácie DNA

vyštiepenieRNA primera

medzera

1. PROBLÉM REPLIKÁCIE KONCOV LINEÁRNYCH MOLEKÚL DNA. Po oddelení rodi-čovských vláken DNA (čierne čiary) sa syntetizujú dcérske vlákna(tmavosivé čiary) v smere od konca 5’ ku koncu 3’. Jedno dcérskevlákno sa syntetizuje kontinuálne (plná tvamosivá čiara) a druhé pokrátkych fragmentoch (tvamosivé šípky). DNA-polymeráza potrebu-je pre začiatok syntézy krátky úsek RNA (primer, bledosivá čiara),ktorý je pred koncom replikácie odstránený a vzniknuté medzerydoplní DNA-polymeráza. Problém nastáva s medzerou na konci 5’,ktorú bežná DNA-polymeráza nie je schopná doplniť.

kácia telomér teda nevyhnutne vyžaduje špeciálnymechanizmus a podľa všetkého špeciálny proteíno-vý aparát. Bez jeho existencie by po každom kolereplikácie dochádzalo ku skracovaniu chromozómua po erózii nevyhnutných génov v blízkosti teloméraj k smrti bunky (obr. 1).

Problém replikácie a stabilizácie koncov lineárnychmolekúl DNA sa stal jednou z najvzrušujúcejšíchtém, pretože bol v úzkom vzťahu k mitotickej nesta-bilite spojenej s nádorovou transformáciou na jed-nej strane a bunkovým starnutím na strane druhej.Olovnikov totiž jasnozrivo predpovedal, že telomérymôžu predstavovať mitotické hodiny normálnej bun-ky. Práca Leonarda Hayflicka zo 60. rokov naznači-li, že ľudská bunka má len limitovaný deliaci poten-ciál (50 až 100 generácií – Hayflickov limit), po pre-kročení ktorého sa zapína program jej starnutia. Mi-totické hodiny sú na začiatku života organizmu na-tiahnuté len na tento počet generácií a skracovanietelomér by mohlo predstavovať hodinovú ručičku,ktorá sa zastaví pri kritickej dĺžke koncov chromo-zómov a nepustí bunku do ďalšieho bunkového cyk-lu. Naopak, keď sa hodinový mechanizmus poško-dí, napríklad patologickým predlžovaním telomér,bunka ignoruje Hayflickov limit a je na najlepšej ces-te k nesmrteľnosti (Vesmír 75, 5, 1996/1).

Začiatkom 70. rokov boli teda problémy telomérdefinované: nebolo jasné akým spôsobom sa repli-kujú, ako je tento proces regulovaný a ako sa koncechromozómov bránia proti vzájomnej fúzii. Okremtoho, teloméry sú prototypom dvojvláknových zlomovDNA s veľmi nestabilnou štruktúrou, ktorá pripomí-na chorý prvok na jadrovej scéne a reparačné bun-kové systémy ju vedia rozpoznať. Teloméry tedamusia byť schopné brániť sa aj proti snahám bunkyo ich „opravu“. A pritom hypotéza o vzťahu dynami-ky telomér k starnutiu bunky a nádorovej premeneostávala visieť vo vzduchu bez experimentálnehooverenia.

Cesta k riešeniu:sekvenčná analýza telomér

Keďže chvíľu trvalo, kým sanašli vhodné experimentálneprostriedky, na problém savrhli teoretici. Výsledkom ichsnaženia bola séria špekulatív-nych prác s krkolomnýmischémami. Prielom do tohtozmätku vniesla až ElisabethBlackburnová, ktorá roku1978 stanovila sekvenciu pr-vej jadrovej teloméry. Ako mo-delový organizmus si vybralaprvoka Tetrahymena thermo-phila. Jeho zvláštnosťou je to,že pri delení buniek sa v pro-cese prepisu (transkripcie) ge-netickej informácie spontánnevytvárajú tisíce podobnýchminichromozómov a každýz nich má špecifickú telome-rickú sekvenciu. To znamená,že v procese tvorby makrojad-ra dochádza k prirodzenémuklonovaniu telomér.

Tento fakt Blackburnová vy-užila na stanovenie sekvencietelomér prvoka a zistila, žepozostávajú z niekoľkých de-siatok opakovaní tej istej sek-vencie TTGGGG. Zakrátko bolastanovená sekvencia telomérďalších organizmov, vrátanečloveka (tab. I a II). Na všeobec-né prekvapenie, ľudské telomé-ry sa od telomér prvoka Tetra-hymena odlišovali len jedinýmnukleotidom (TTAGGG). Väčši-na doteraz známych telomérjadrových chromozómov sa lennepatrne odlišuje od telomérTetrahymena. A nielen to: ďal-šou spoločnou črtou jadrovýchtelomér je existencia jedno-vláknového prečnievania nakonci 3‘ (obr. 2, 3). Takmeruniverzálna organizácia telo-mér – séria jednoduchých tan-demových opakovaní nasledo-vaná prečnievaním na konci 3‘– naznačila, že možno budeuniverzálny aj spôsob ich re-plikácie.

Telomeráza

Začiatkom 80. rokov E. Black-burnová spolu s Jackom W.Szostakom a Janis Shampayo-vou navrhli riešenie problémureplikácie telomér, ktoré bolozaložené na existencii (v tomčase hypotetického) enzýmu,ktorý by bol schopný aktivity,akou nedisponujú známeDNA-polymerázy. Opäť do hryvstúpil prvok Tetrahymena.Extrakty z jeho makrojadier sapre Blackburnovú a jej štu-dentku Carol Greiderovú

1931

1938

1961

1972–1973

1978

1984

1984

1988

1989

1990

1994

1996

1997

1999

2000

B. McClintocková pozorovala, estrata koncov chromozómovkukurice má za následok ichfúziu a tvorbu chromozomálnychmostov

H. Müller zaviedol pojemteloméra na oznaèeniekoncových štruktúrchromozómov

L. Hayflick a P. Mooreheaddokázali, e ¾udské bunkyv tkanivovej kultúre majúlimitovaný proliferaènýpotenciál

J. Watson a A. Olovnikovnezávisle od seba formulovaliproblém replikácie koncovlineárnych DNA molekúl (

)

E. Blackburnová a J. Gallstanovili sekvenciu prvejteloméry

E. Blackburnová, J Szostaka J Shampayová navrhli riešenieproblému replikácie telomérprostredníctvom špeciálnehoenzýmu

E Blackburnová a C Greiderováidentifikovali telomerázovúaktivitu v extraktoch makrojadier

C Harley a C Greiderováukázali, e v somatickýchbunkách dochádzas replikaèným vekomk skracovaniu telomér

G. Morin identifikoval telomerázuv ¾udských nádorovýchbunkách

E Blackburnová ukázala, epotrebuje

telomeráza na zachovanienesmrte¾nosti svojichbuniek

C Harley a J Shay detegovalitelomerázovú aktivitu v 90 %vzoriek ¾udských nádorov

J Fajkus a kol. prvýkrátdetegovali telomerázovú aktivituv rastlinných bunkách

V Greiderovej laboratóriu bolaskonštruovaná a analyzovanámyš bez funkènej telomerázy

J Griffith a T de Langeová zistili,e teloméry cicavcov vytvárajúlasovité štruktúry, tzv. t-sluèky

R Reddel dokázal, e nádorovébunky neexprimujúce telomerázuudriavajú svoje teloméryrekombinaène závislýmmechanizmom

end−replication problem

Tetrahymena

Tetrahymena

.. 

. .

. .

.

. .

.

. .

.

NAJVÝZNAMNEJŠIE OBJAVYV OBLASTI ŠTÚDIA TELOMÉR

kvasinky G−reazec od konca 5’ ku koncu 3’

C. albicansC. tropicalisC. maltosaC. guillermondiiC. pseudotropicalisC. glabrataK. lactisS. cerevisiae

ACGGATGTCTAAC--TTCT

AAGGATGTCACGA--TCAT

ACGGATGCAGACT--CGCT

AC-----------------

ACGGATTTGATTAGTTATG

CTGGGTGC---------TG

ACGGATTTGATTAGGTATG

-------------------

TGGTGT

TGGTGT

TGGTGT

TGGTGT

TGGTGT

TGGGGT

TGGTGT

T(G) (TG)2–3 1–6

prvoky

huby

riasy

stavovce

rastliny

konsenzus

Tetrahymena, GlaucomaParameciumOxytricha, Euplotes, StylonychiaPlasmodiumTrypanosoma

SchizosaccharomycesNeurospora

Chlamydomonas

èlovek

Arabidopsis

T G

T (G/T)G

T G

A (T/G)AG

T AG

2 4

2 3

4 4

2 3

2 3

T ACA C G

T AG

1–3 0–2 0–1 1–8

2 3

T AG4 3

(T/A) G1–4 1–8

T AG2 3

T AG3 3

Tab. I. Príklady sekvencie jadrových telomerických repetícií

Tab. II. Jadrové telomerické repetície niektorých druhov kvasiniek

394 VESMÍR 80, červenec 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir

(všimnite si dominanciu žien v tejto oblasti) staliv roku 1984 zdrojom na identifikáciu hľadanéhoenzýmu, ktorý pomenovali telomeráza. V krátkomslede publikovali dve práce, ktoré možno bude razzvažovať nobelovská komisia. Tento enzým je schop-ný opakovane pripájať k prečnievajúcemu koncu 3’sekvenčný motív TTGGGG. Naviac dokázali, že tátofascinujúca DNA-polymeráza nepotrebuje na svojuaktivitu pridanie templátu (vzoru pre syntézu DNA)do reakčnej zmesi!

Greiderová a Blackburnová zistili, že telomerázasama obsahuje templát v podobe krátkej molekulyRNA. Telomeráza sa tak zaradila do rodiny DNA-po-lymeráz závislých od RNA. Dôverne ich poznáme pre-dovšetkým vďaka životnému cyklu retrovírusov (Ves-

2. slúžiť ako templát pre proteínovú podjednotkukatalyzujúcu syntézu DNA; 3. premiestniť celý telomerázový komplex.Výsledkom je predĺžený reťazec na konci 3‘ (obr. 4),ktorý sa tak stáva templátom pre štandardnú DNA-polymerázu. Už v 80. rokoch bola telomerázová ak-tivita detegovaná v jadrách mnohých ďalších orga-nizmov. Vyvrcholením tohto obdobia bolo úspechomkorunované úsilie Gregga B. Morina – dôkaz telo-merázy v bunkách ľudskej nádorovej línie (pozri Ves-mír 75, 155, 1996/3).

Zatiaľ čo identifikácia telomerickej podjednotkyRNA nepredstavovala zásadný problém, izoláciu pro-teínového katalyzátora sprevádzalo množstvo neú-spechov a v dôsledku nesmiernej súťaživosti aj po-merne veľa falošných kandidátov. Paradoxne, Tet-rahymena spolu s Carol Greiderovou ostala tento-

TELOMÉRY, TELOMERÁZA,STARNUTIE A NESMRTEĽNOSŤZačiatkom 90. rokov už konečne boli k dispozícii pro-striedky na testovanie Olovnikovovej hypotézy: bola zná-ma sekvencia telomér a bolo teda možné zmerať ich dĺž-ku v rôznych typoch buniek. Prvýkrát podnikli takúto ex-kurziu Calvin B. Harley, Carol Greiderová a Nicholas D.Hastie. Výsledky boli veľmi povzbudivé. V somatickýchbunkách dochádzalo s vekom k ich skracovaniu. Naopak,ako dokázal Howard J. Cooke, zárodočné bunky dispo-novali dlhými telomérami bez náznakov skracovania.Pôvodné výsledky využívajúce klasické techniky DNA-DNA hybridizácie boli v zásade potvrdené aj sofistikova-nejšími analýzami (napr. fluorescent in situ hybridization,FISH).

Analýza rôznych typov nádorov v laboratóriách Cal-vina Harleya a Jerryho W. Shaya odhalila, že väčšinaz nich má teloméry stabilnej dĺžky bez náznakov skra-covania. Zárodočné bunky a bunky s vysokým prolife-račným potenciálom vykazovali telomerázovú aktivitu,somatickým bunkám podliehajúcim starnutiu telomerá-za chýbala a väčšina nádorových buniek prekročila Hayf-lickov limit a telomeráza bola opätovne aktivna. Farma-ceutické firmy začali zháňať odborníkov na telomerázus víziou prípravy telomerázového inhibítora ako univer-zálneho prostriedku boja proti nádorovým chorobám.Ich nadšenie však narazilo na prekážku: akokoľvek jetelomeráza elegantným riešením problému replikáciekoncov jadrových chromozómov, teloméry sú priveľmidôležitou štruktúrou chromozómu, aby sa spoliehali lenna jeden mechanizmus údržby. Boli objavené nádorovébunkové línie (10 % zo všetkých testovaných línií), ktorénemali detegovateľnú telomerázovú aktivitu, a predsa saich teloméry vyznačovali stabilnou dĺžkou. Myš bez funk-čnej telomerázy (následkom delécie génu pre RNA-pod-jednotku), ktorú skonštruovala Maria Blascová, nevyka-zovala rezistenciu voči vytváraniu nádorov. Tieto a ďalšievýsledky naznačili, že replikácia cicavčích telomér je podkomplexnou kontrolou.

...AATCCCAATCCC

...TTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG

5‘3‘

2. Ľudská jadrová teloméra pozostáva zo série krátkych sekvencií(TTAGGG)n

3‘

5‘

3‘

5‘

3‘

5‘

3‘

5‘

3‘

5‘

elongácia

translokácia

elongácia

3‘5‘

5‘

5‘

5‘

3‘

3‘

3‘

4. Predlžovanie telomér enzýmom telomeráza. Ide o ribonukleopro-teín, ktorého RNA-podjednotka má sekvenciu komplementárnuk prečnievaniu konca 3’ teloméry a slúži ako templát pre DNA-poly-merázovú aktivitu závislú od RNA.

mír 80, 332, 2001/6). Na rozdiel od reverzných tran-skriptáz sú telomerázy veľmi prieberčivé enzýmy,v bunke si zásadne vyberajú len jediný substrát, svo-ju vlastnú podjednotku RNA. Tá má tri úlohy:1. prechodne ukotviť telomerázu na vlákno prečnie-vajúce na konci 3‘;

raz v poli „porazených“. Víťazom sa stal Tom Cech,ktorého študent Joachim Lingner izoloval hľadanýproteínový komponent z prvoka Euplotes aedicula-tus. Paralelne s Cechovými štúdiami sa objavili prá-ce Victorie Lundbladovej, ktorá svoj kredit vyťažilaz potenciálu kvasinkovej genetiky. Izolovala sériu šty-roch est (ever shorter telomeres) mutantov, ktorýmsa progresívne skracujú teloméry. Keďže v normál-nych kmeňoch kvasinky Saccharomyces cerevisiaeje telomeráza permanentne aktívna, bola šanca, žejeden z mutantov bude mať poškodený gén kódujú-ci proteínovú podjednotku telomerázy. Predpokladbol správny: gén EST2 kódoval proteín s vysokýmstupňom sekvenčnej podobnosti s proteínom izolo-vaným v Cechovom laboratóriu z Euplotes. Zakrát-ko boli identifikované homologické proteíny z ďalšíchorganizmov vrátane ľudského. Ich sekvenčná ana-

3. Teloméry ľudských chromozómovdetegované fluorescenčnou metódou(fotografiu láskavo poskytla M.Skleničková, Laboratoř analýzybiologicky významných molekulárníchkomplexů, Masarykova univerzita, Brno)

http://www.cts.cuni.cz/vesmir l VESMÍR 80, červenec 2001 395

lýza potvrdila predpoklad, že patria do skupiny re-verzných transkriptáz.

Rekombinácia

Jedným zo skeptikov v tejto oblasti bol aj Roger Red-del, ktorý pred piatimi rokmi dokázal, že niektorénádorové bunky rastú bez problémov aj bez aktív-nej telomerázy a že napriek tomuto „defektu“ majúteloméry nezvyčajne dlhé. Tieto pozorovania viedlik hypotéze, že cicavčie bunky disponujú alternatív-nym mechanizmom replikácie telomér nezávislým odtelomerázy, ktorý označil ALT (alternative lengthen-ing of telomeres).

Pre ľudí študujúcich replikáciu telomér kvasiniekSaccharomyces cerevisiae neboli Reddelove experi-menty prekvapujúce. Virginia Zakianová a Tom Pe-tes už v polovici 80. rokov (pred objavom telomerázy)experimentálne potvrdili „rekombinačnú dráhu“ re-plikácie telomér u kvasiniek. Ich experimenty bolivýsledkom logickej úvahy: keďže teloméry všetkýchchromozómov majú veľmi podobné sekvencie (vo väč-šine organizmov sú identické), malo by medzi nimidochádzať k pomerne častým výmenám (rekombiná-ciám). V prípade, že táto rekombinácia nie je reciproč-ná, môže sa predlžovať jedna z telomér bez účasti te-lomerázy. Od Zakianovej a Petesových pionierskychobjavov bolo identifikovaných niekoľko proteínových„hráčov“ tejto dráhy replikácie. Väčšina z nich (napr.proteíny Rad51 a Rad52) sa zúčastňuje napríkladv procese opravy rôznych typov poškodení DNA.

Analogický rekombinačný systém sa podieľa aj naalternatívnej dráhe replikácie cicavčích telomér. ALTbunkové línie (na rozdiel od línií s aktívnou telome-rázou) obsahujú vo svojich jadrách mimochromo-zómové štruktúry, označované ako APB (ALT-asso-ciated PML bodies), ktoré sú zložené z telomerickejDNA, telomerických proteínov a rekombinačnýchproteínov Rad51 a Rad52. To bol len krok k experi-mentu, ktorý ukázal, že v bunkách ALT sa telomérypredlžujú mechanizmom využívajúcim výmenu sek-vencií DNA (génovú konverziu) (obr. 5). Ukázalo sa,že pôvodné odvážne predstavy o využití telomerázo-vých inhibítorov v chemoterapii nádorových bunieksú príliš zjednodušené a že replikáciu jadrových te-lomér kontrolujú minimálne dva systémy. Situáciaje však ešte komplikovanejšia.

Telomérové slučky

Na chvíľu odbočme od replikácie telomér a pozrimesa bližšie na ich štruktúru. Identifikácia proteínov,ktoré špecificky interagujú s koncami chromozómov,bola ďalšou stratégiou na ceste k spoznaniu mecha-nizmov udržiavania telomerických sekvencií. Prvýproteín viažuci teloméru (TP) izoloval z makrojadierprvoka Oxytricha nova začiatkom 80. rokov Dan Gott-schling. Biochemická analýza odhalila, že väzba pro-teínu na telomerické prečnievanie konca 3’ je dote-raz najstabilnejšou interakciou medzi bielkovinoua nukleovou kyselinou (v podmienkach in vitro saproteín uvoľňuje približne raz za niekoľko týždňov).Keďže teloméry Oxytricha sú organizáciou i sekvenč-ne podobné teloméram väčšiny organizmov (vrátanecicavcov), nasledujúcich 15 rokov bolo venovanýchpátraniu po proteínoch, ktoré viažu teloméru.

Pátranie bolo vzrušujúce predovšetkým kvôli tomu,že okrem makrojadier prvokov nebol proteín podob-ný TP Oxytricha izolovaný zo žiadneho modelovéhoorganizmu. V kvasinkách a rastlinách boli identifi-kované proteíny, ktoré rozpoznávajú prečnievanie nakonci 3’ (napr. proteíny Cdc13 a Est1, ktoré slúžiaako „lákadlo“ pre telomerázový komplex), ich sek-

vencia a schopnosť viazať DNA sa však od TP Oxyt-richa značne odlišovali. U cicavcov bola detegovanádoteraz jediná bielkovina, ktorá sa špecificky viažena jednovláknové telomerické sekvencie.

Na druhej strane Titia de Langeová izolovala dvaproteíny (TRF1 a TRF2), ktoré sa s vysokou afinitouviažu na dvojvláknové časti telomér. Pomerne dlhosa TRF1 a TRF2 považovali za analógy kvasinkovéhoproteínu Rap1, ktorý v 80. rokoch identifikovali Da-vid Shore a Kim Nasmyth. Rap1 je promiskuitný pro-teín, ktorý sa viaže na rôzne sekvencie DNA vrátanedvojvláknových telomerických úsekov. Tam sa okreminého zúčastňuje na procese „utišovania“ prepisu gé-nov, ktoré sú lokalizované v blízkosti telomér (tzv. te-lomérovom pozičnom efekte). D. Shore zistil, že kva-sinky používajú Rap1 ako proteínové „počítadlo“ te-lomerických opakovaní. Pred rokom de Langeová do-kázala, že cicavce majú svoj vlastný proteín Rap1. Narozdiel od kvasinkového homológu sa však neviažes DNA a s telomérami sa spája prostredníctvom TRF1.Bez ohľadu na to sa zdá, že aj cicavčie bunky majúsvoje telomérové počítadlo s potenciálnym významompre regulácie bunkového cyklu a starnutie.

Charakterizácia cicavčích proteínov TRF1 a TRF2vyústila do jedného z najzaujímavejších objavov

3‘

5‘

3‘

5‘

elongáciagénovou konverziou

3‘

5‘

5‘

3‘

5. Predlžovanie telomér rekombinačným mechanizmom pozorova-ným v bunkách kvasiniek a niektorých typov nádorov bez aktívnejtelomerázy

6. Telomerická slučka (obrázok láskavo poskytol Dr. J.D.Griffith, Uni-versity of North Carolina, Chapel Hill, USA)

396 VESMÍR 80, červenec 2001 l http://www.cts.cuni.cz/vesmir

REVÍZIA TELOMÉROVEJ HYPOTÉZYBUNKOVÉHO STARNUTIA A NESMRTEĽNOSTIPôvodná telomérová hypotéza predpokladala, že dĺžku telomér udr-žiava aktivita telomerázy len v zárodočných bunkách. V ľudskýchsomatických bunkách je v dôsledku ich diferenciácie produkciatohto enzýmu potlačená. Vypnutie telomerázovej aktivity más rastúcim počtom bunkových delení za následok postupné skra-covanie dĺžky koncov chromozómov, pričom po dosiahnutí ichkritickej dĺžky bunka vstúpi do fázy starnutia. Úlohu telomerázyako faktora rozhodujúceho o nesmrteľnosti buniek potvrdzovalajej aktivita v bunkách väčšiny nádorov a nesmrteľných bunkovýchlínií. Podobne aj v experimentoch s umelo navodenou tvorbou te-lomerázy umožnila jej aktivita delenie buniek fibroblastov v čase,keď kontrolné línie boli už dávno vo fáze starnutia. Preto sa podľatelomérovej hypotézy považuje skracovanie telomér za mechaniz-mus potláčajúci vznik nádorov a reaktivácia telomerázy je nevy-

v oblasti telomér z posledných piatich rokov.V 70. rokoch vyvinul Griffith v laboratóriu ArthuraKornberga niekoľko revolučných techník elektróno-vomikroskopickej vizualizácie DNA a DNA-proteíno-vých komplexov a odvtedy azda každý zaujímavý pro-teín viažuci DNA prešiel jeho rukami. Nebolo to inakani v prípade TRF1 a TRF2, u ktorých si všimol vág-nu podobnosť s bakteriálnym proteínom recA, ktorýsa zúčastňuje takmer na všetkých rekombinačnýchtransakciách v Escherichia coli. Potom stačil letmýpohľad na cicavčiu teloméru: prečnievanie konca 3‘a dvojvláknová oblasť s identickou sekvenciou súpriam ideálnym substrátom pre proteíny podobnérecA, ktoré s obľubou katalyzujú prienik jednovlák-novej DNA do dvojvlákna za vzniku tzv. D-slučky.Ostávalo dokázať, že cicavčie telomerické proteínymajú podobnú aktivitu, ktorej následkom telomérycicavcov nekončia „do stratena“, ale tvoria lasovitételomerické slučky (t-slučky, t-loops).

Ako však túto hypotézu testovať experimentálne?Bolo treba prekonať niekoľko problémov: stabilizo-vať t-slučky, izolovať dostatočne koncentrovanú po-puláciu telomér, pripraviť elektrónovomikroskopic-ký preparát a zistiť, či možno detegovať koncové la-sovité štruktúry (obr. 6). V priebehu niekoľkých me-

Výskum v našom laboratóriu je sponzorovaný grantom HowardHughes Medical Institute (55000327), a grantami Slovenskej ve-deckej grantovej agentúry VEGA (1/6168/99, 1/7248/20).

t−sluèka (t−loop)

D−sluèka (D−loop)

75–200 nt

7. Tvorba t-slučiek inváziou telomerického prečnievania konca 3’ dodvojvláknovej oblasti teloméry slúži nielen ako ochrana koncov chro-mozómov pred degradáciou a DNA-opravnými mechanizmami bun-ky, ale aj ako ďalší možný mechanizmus replikácie telomér

då

ka te

lom

eric

kých

sek

venc

ií [k

bp

]

14

12

10

8

6

4

2

bunkovéstarnutie

kríza poèet bunkových delení

somatickébunkové línie(telomerázavypnutá)

nesmrte¾né bunkové linie(telomeráza zapnutá)

bunky s aktívnoutelomerázou,ale narušenourovnováhou

zárodoèná bunková línia (telomeráza zapnutá)

bunky bez aktívnejtelomerázy vyuívajúceALT mechanizmus

bunkové línie s prirodzeneaktívnou telomerázou

normálne bunkypo reaktiváciitelomerázy

prekroèenieHayflickovho

limitu

8. Možné scenáre osudov cicavčích bunkových línií podľa telomérovejhypotézy

siacov boli tieto problémy vyriešené. Griffith a deLangeová dokázali, že významná časť cicavčích te-lomér sa skutočne vyskytuje vo forme slučiek, zaktorých tvorbu je zodpovedný proteín TRF2. Výsled-ky poslali Benovi Levinovi do jedného z najprestíž-nejších biologických časopisov Cell. Bol nimi takýnadšený, že osobne urýchlil posudzovanie článku,v dôsledku čoho ho prijali do tlače v rekordne krát-kom čase: od poslania do prijatia revidovanej verzieuplynulo 18 dní!

Levinovo nadšenie bolo pochopiteľné. Objav t-slu-čiek naznačil riešenia viacerých telomerických zá-had. Ochranu proti nukleázam a reparačným sys-témom bunky zabezpečuje špeciálna štruktúra telo-méry. A čo je azda najpodstatnejšie, t-slučka pred-stavuje možné riešenie replikácie telomér, ktoré jenezávislé od telomerázy: vnorením prečnievania kon-ca 3‘ do dvojvláknovej telomerickej oblasti získavaštandardná DNA-polymeráza primer (obr. 1) aj tem-plát, ktorý jej v prípade „voľného“ zakončenia telo-méry chýba (obr. 7).

Zdá sa, že telomerické slučky nemajú iba cicavce.Nedávno boli identifikované aj u trypanozóm a, mož-no paradoxne, aj u Oxytricha. Teda u tých istýchprvokov, z ktorých bol izolovaný prvý telomerickýproteín špecifický k jednovláknovému prečnievaniuna konci 3‘. Vysvetlenie tohto paradoxu je v dvojtvár-nosti makro- a mikrojadier týchto prvokov. V makro-jadrách sú teloméry veľmi krátke, čo im znemožňu-je ohýbanie a tvorbu slučiek. Namiesto lasovitýchštruktúr ich chráni telomerický proteín. V mikrojadretento proteín nie je potrebný. Dĺžka mikrojadrovýchtelomér im umožňuje tvorbu t-slučiek analogickýchso slučkami cicavcov. Oxytricha teda predstavujeunikátny príklad riešenia toho istého problému dvo-ma dramaticky odlišnými stratégiami v jednej a tejistej bunke. o

hnutným krokom ku vzniku nesmrteľných bunkových línií. Z tohtohľadiska inhibítory telomerázy predstavovali nádejný prostriedokv terapii nádorových ochorení.

Avšak situácia je zložitejšia než opisuje tento jednoduchý mo-del a spomínaná hypotéza musela byť modifikovaná (obr. 8). Pr-vou komplikáciou je fakt, že telomeráza je aktívna aj v normál-nych somatických bunkových líniách s vysokou proliferačnoukapacitou (napr. bunkách imunitného systému, kože, vlasovýchfolikulov). Ďalšie pozorovania ukázali, že v niektorých prípadochsa môže telomeráza znovu aktivovať ešte pred vstupom buniek dofázy starnutia. Alebo sa naruší rovnováha medzi procesmi predlžo-vania a skracovania, pričom sa dĺžka telomér zväčší. Naviac –v približne 10 % nádorov a nesmrteľných bunkových línií aktivitatelomerázy nie je detegovateľná. Hoci by sa na prvý pohľad mohlozdať, že je to spôsobené chybou v rutinnej laboratórnej diagnosti-ke, štúdie viacerých bunkových linií ukázali, že ich teloméry sapredlžujú alternatívnym mechanizmom nezávislým od telomerá-zy. Vzhľadom na to, že takéto alternatívne dráhy môžu pracovaťparalelne s telomerázou, alebo môžu byť špecificky indukovanév bunkách, v ktorých bola jej aktivita vyradená použitím inhibíto-rov, tieto mechanizmy predstavujú nielen zaujímavý biologickýfenomén, ale zároveň aj závažný terapeutický problém.

Najnovšia korekcia hypotézy vychádza zo skutočnosti, že sa-motná dĺžka polí telomerických repetícií sa neukázala ako dosta-točne spoľahlivý molekulárny marker starnutia alebo nesmrteľ-nosti buniek. Podľa Blackburnovej je viac než samotná dĺžka dôle-žitá jedna z esenciálnych funkcií telomér, ktorá je v angličtine na-zývaná capping. Táto funkcia zabezpečuje integritu chromozómov,ochranu pred enzymatickou degradáciou, zabraňuje vzájomnej fúziichromozómov a maskuje teloméru pred rozpoznaním opravnoumašinériou. Funkcia je závislá nielen od dĺžky polí telomerickýchrepetícií, ale aj od aktivity telomerázy a špecifických proteí-nov viažucich telomerickú DNA. Ak koniec chromozómu nie jechránený, dochádza k zastaveniu bunkového cyklu, prípadnek ďalším následkom (napr. k programovanej smrti bunky). Pretoje ochranná funkcia telomér, bez ohľadu na ich dĺžku, kľúčovýmfaktorom rozhodujúcim o osude chromozómu i samotnej bunky.