ALK et Cancer bronchique

I Rouquette Service d’Anatomie Pathologique Rangueil

Plateforme génétique moléculaire des

cancers (génotypage cancer du poumon)

ONCOGENE ALK

RECEPTEUR A ACTIVITE TYROSINE

KINASE

C

H

R

O

M

O

S

O

M

E

2

Translocations, mutations, amplifications

CODE

+

Inversion bras court du chromosome 2 Fusion exons 1-13 d’EML4 /exons 20-29 de ALK (région codant pour la TK ALK) GENE DE FUSION

Fusion partie N-term.EML4 /portion intra-cellulaire du récepteur ALK :

PROTEINE DE FUSION ONCOGENIQUE

Réarrangement EML4 ALK

Réarrangement EML4 ALK

Dimérisation et Phosphorylation constitutive du domaine TK ACTIVATION VOIES PI3K/AKT RAS/MAPK

Variants les + fréquents

V1 33% V3a/b 29% V2 9%

Sur la plateforme on cherche

• Quoi? Un réarrangement de l’oncogène ALK conférant

une sensibilité au crizotinib

• Chez qui?

AMM traitement des patients adultes ayant reçu au moins un

traitement antérieur pour un cancer du poumon non à petites

cellules anaplasic lymphoma kinase (ALK) positif et avancé

• Comment? RT-PCR (reverse transcriptase PCR)

FISH (hybridation in situ en fluorescence)

IHC (immunohistochimie en paraffine)

RT-PCR (ARN)

• Mise en évidence des transcrits de fusion (le partenaire d’ALK est identifié)

• Technique multiplexe: une amorce commune pour l’exon 20 de ALK, amorces spécifiques pour le partenaire de fusion

• Très sensible, mais fragments amplifiés parfois très longs, donc mieux sur congelé

• Kits développés sur paraffine: 70% des variants détectés

• Confirmation nécessaire par une autre technique (faux négatifs)

FISH

Les sondes

• Sondes de « séparation » ( break-apart, split ): deux sondes de couleurs différentes s’hybridant de part et d’autre du point de cassure de ALK , rouge en 3’, verte en 5’. On n’identifie que la cassure d’ALK (partenaire?)

•Sondes de « fusion » une sonde rouge pour ALK, une

verte pour EML4

•Sondes combinées: sonde de séparation + une

troisième couleur pour le partenaire

From A Mc Leer Florin

“TriCheck™” (ZytoLight®

SPEC ALK/EML4

TriCheck™ Probe).

sonde Vysis® LSI® ALK

Dual Color Break Apart

Rearrangement Probe

Dako ALK FISH DNA

Probe, Split Signal Y5417

Lecture

• Région tumorale préalablement sélectionnée par le pathologiste

• Filtres en rapport avec la longueur d’onde des fluorochromes utilisés

• Au moins 100 noyaux intacts (pb petites biopsies)

• Distance split >=diamètre d’un signal

• Seuil de positivité: 15%

• Double lecture

• Problème de l’autofluorescence

• Si doute, vérifier par autre technique

- Filtre DAPI λexcitation 365±12 nm / λemission ≥397 nm

- Filtre Rhodamine-rfp λexcitation 546±12 nm / λemission ≥590 nm

- Filtre FITC-gfp λexcitation 475±40 nm / λemission 530±40 nm

Sonde split DAKO: texas red /FITC Sonde split Abbott: orange gold/FITC

Spectrum Orange Gold.

Excitation: 547 nm

Emission: 572 nm

Equivalent: Rhodamine

Impact du préanalytique

Prélèvement Délai ischémie froide

Fixation Biopsies 6/8h pièces 24/48h

Recoupe mise en cassettes

Inclusion enrobage Paraffine <60°, démarrages WE

Coloration biopsies Eosine autofluo, ADN

Stockage blocs Stabilité en paraffine

Support lames Superfrost IHC FISH

Délai conservation lames 4° +/- enrobage 8 j

Ecrasements

AFA: pas d’hybridation

Sous-fixation Os décalcification Autofluorescence éosine

Impact du préanalytique

•Formol neutre tamponné •Attention durée de fixation (protocoles week-end). •Décalcifiant = acide: si plusieurs sites métastatiques éviter de biopsier l’os Pièces osseuses: rinçage acide , vérifier pH hypercentres • Impact des colorants (éosine, autres): éviter de les utiliser

• Ne pas couper les lames trop longtemps avant la FISH et l’IHC, les conserver à 4°C, les protéger.

Pourcentage de résultats non interprétables

Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011

ADN non amplifiable

Bloc épuisé

% de cellules tumorales < seuil de détection

Les taux de résultats non interprétables ont légèrement diminué depuis le

début du programme

Taux de NI élevé pour le test ALK en FISH (14%)

0,0%

2,0%

4,0%

6,0%

8,0%

10,0%

12,0%

14,0%

16,0%

EGFR act EGFR res KRAS BRAF PI3KCA HER2 ALK (FISH)

FISH coûteuse, consommatrice de temps

IHC ALK Anticorps disponibles

3 clones: ALK1, D5F3 et 5A4 sensibilité 92 à 100%, spécificité 99 à 100% Dilutions 1/25e à 1/100e selon amplifications, clones, automates

Marquage modéré à intense (++ à +++), cytoplasmique diffus, >50% Faible et focal si AFA ou sous-fixation

X40 architecture acineuse

ALK 5A4 x40

X2,5

Scoring

• Score classique= Intensité x % CT positives

• H-score= (1 x % CT intensité à 1+) + (2x % CT 2+) + (3x %CT 3+)

• from weak and

multifocal(1+) to strong

and diffuse (2+)

J Thorac Oncol. 2013

Discordances

• IHC -/FISH + : attention interprétation IHC, compter signaux en FISH.

• IHC+/FISH- : plus rare, être exigeant sur la FISH, repérage zone tumorale, compter les noyaux, double lecture, pertinence de la limite à 15%?

• Utiliser 3e technique, contrôles hors site, EEQ

Discordances

Tumeur hétérogène: les pneumocytes ont été comptés

Biomarqueurs émergents Cancer du poumon 2011

Données globales :

Taux de translocation en FISH : 5,4 %

Taux de translocation en IHC : 4,8 %

Plateforme: 20% 1er trimestre, 4,7% dernier trimestre

Stratégies des laboratoires :

FISH uniquement : 10

FISH + IHC en parallèle : 5

IHC + FISH de confirmation : 21

Virchows Arch (2012) Thunnissen et al

Diagnostic algorithm for ALK fusion from the Japanese Lung Cancer

Society From Front. Oncol., 2012 Murakami

Sholl J Thorac Oncol. 2013

Plateforme séquentiel

EGFR 19 20 21 +

IHC ALK

EGFR MUTE ALK IHC -

STOP

ALK FISH

Prescription ou

Profil

IHC ALK - IHC ALK +

ALK +

ALK - EGFR18

KRAS BRAF

HER2 PI3K

Résistances acquises au crizotinib

Doebele Clin Cancer Res 2012

Résistance au crizotinib

Mutations domaine Tkinase ALK (Doebele Clin Cancer Res 2012)

L1196 M Saturation site de liaison

F1174C Favorise l’activation

conformationnelle du RTK

G1279A

D1203N

Giroux 2013

39

Conclusion

• Technique de référence: FISH « time consuming »+ impact préanalytique: aide des systèmes de traitement d’images.

• Place de l’immunohistochimie dans le screening, mais quelques discordances

• Importance de l’organigramme choisi (résultats des études nationale et internationales en cours)

• RT-PCR réservée à des cas particuliers

• Intérêt de la recherche des mutations de résistance?