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ACTIVACIÓN DE LA MICROGLÍA EN LA DEGENERACIÓN DE LA RETINA Y SU MODULACIÓN MEDIANTE AGENTES
ANTIAPOPTÓTICOS E INFLAMATORIOS
María Agustina Noailles Gil
/i'... Universitat d'Alacant !/-. "- Universidad de Alicante DEPARTAMENT DE FISI0L0GIA, GENETICA I MICR0BI0L0GIA DEPARTAMENTO DE FISI0L0GfA, GENÉTICA Y MICR0BI0LOCÍA
FACULTAD DE CIENCIAS
ACTIVACIÓN DE LA MICROGLÍA EN LA DEGENERACIÓN DE LA RETINA Y SU MODULACIÓN MEDIANTE AGENTES ANTIAPOPTÓTICOS E INFLAMATORIOS
MARIA AGUSTINA N0AILLES CIL
Tesis presentada para aspirar al ¡rado de DOCTOR/DOCTORA POft LA UNIVERSIDAD DE ALICANTE
BIOLOGÍA EXPERIMENTAL Y APLICADA (1809)
Dirigida por:
NICOLÁS CUENCA NAVARRO PEDRO LAX ZAPATA
AGRADECIMIENTOS
Siempre resulta particularmente complejo resumir grandes períodos y experiencias
personales en unos pocos párrafos, aun así, creo que vale la pena intentarlo. No me parece
adecuado iniciar estos agradecimientos con la frase: “Todo comenzó…”, por la sencilla
razón de que embarcarme en la realización de esta tesis fue un proceso gradual del que no
tuve plena conciencia hasta que la maquinaria ya llevaba bastante tiempo en marcha. Gran
parte del mérito de ilusionarme con este proyecto es de uno de mis directores de tesis, el Dr.
Nicolás Cuenca. De no haber sido por su dedicación y empeño, esta tesis no habría sido
posible. Ninguna de las palabras y frases de agradecimiento podrían bastar para agradecerle
todo lo que ha hecho por mí a nivel personal y profesional. Gracias por inculcarme la visión
crítica de la ciencia, a dudar, a preguntarme el porqué de todo, a buscar soluciones y a
trabajar meticulosamente. Gracias por esa confianza que desde el primer día depositaste en
mí, incluso cuando ni siquiera yo la tenía en mi misma. Muchísimas gracias.
Tampoco me olvido de mi co-director de tesis, el Dr. Pedro Lax. Gracias por su
infinita paciencia con mi temperamento de por sí inquieto, por su completa disposición para
resolver y explicarme cualquier duda, por proponerme soluciones cuando las cosas no salían
según lo previsto y por hacerme ver cualquier resultado experimental como un pequeño éxito
del que se podían sacar muchas conclusiones. Muchísimas gracias.
Todo gran trabajo se gesta bajo condiciones que favorecen su desarrollo y por eso,
como no podía ser de otra forma, esta tesis no podría haber sido sin la ayuda y apoyo de mis
compañeras de laboratorio.
A la Dra. Gema Esquiva Sobrino, gracias por echarme una mano cada vez que lo
necesitaba, por aportar su punto de vista sobre cualquier tema, por resolver mis profundas
dudas acerca del funcionamiento del Mac, por aguantar mis días de experimentación con su
campo visual periférico, por recibir cada pelotita con una sonrisa y por su espíritu alegre y
deportivo. Muchas gracias.
A la Dra. Laura Campello Blasco (“Flower Power”), gracias por iniciarme en el arte
de llevar a cabo un protocolo con una metodología escrupulosa, por hacerme partícipe de
sus cavilaciones y disyuntivas científicas, por tener en cuenta mi opinión (¡a pesar de los
rangos!), por su afán de perfeccionar cualquier técnica, por su sincero interés en mi trabajo
y por su complicidad y positividad. Gracias por iluminarme sobre la importancia del
parafilm en el día a día y por hacerme reír cuando no tenía un buen día. Muchas gracias.
A la Dra. Laura Fernández Sánchez (“Invierno-Verano”), gracias por estar siempre
dispuesta a ayudar, por resolver mis dilemas con las figuras, por compartir su extenso
conocimiento del Photoshop conmigo y, como no, por convertir el laboratorio en una
discoteca de vez en cuando, elemento vital para liberar el estrés de algunos días. Gracias por
traerme pelotitas de tus viajes al extranjero y por ofrecerme apoyo dentro y fuera del
laboratorio. Muchas gracias.
A la Dra. Violeta Gómez Vicente, gracias por acogerme nada más llegar al
laboratorio para ayudarle en sus experimentos de cultivos celulares; por confiar en mí, por
enseñarme numerosos protocolos y técnicas, por fomentar el debate científico sano e
inteligente, por estar en todo momento dispuesta a echar una mano. Simplemente, muchas
gracias.
A la Dra. Victoria Maneu, gracias por su espíritu alegre y activo, por estar
constantemente en busca de nuevos descubrimientos y experimentos, por compartir sus
conocimientos conmigo y por hacerme partícipe de sus éxitos. Y sobre todo, gracias por ser
una persona extremadamente positiva y constructiva. Muchas gracias.
A las chicas del laboratorio de Genética humana, Mary y Carmen, gracias por
compartir los buenos momentos en las comidas y ratos libres.
A Dora, gracias por los cafés matutinos amenizados con increíbles charlas, gracias
por buscar siempre mis consejos y confiar en mi criterio, por aguantar mis malos días y
brindarme apoyo. Muchas gracias.
Dar las gracias también a toda la gente que no he nombrado y que en algún momento
han colaborado conmigo, como el personal del animalario, Ana María, Patxi e Itxaso; Miguel
Ángel de farmacología; Cristina, de los servicios técnicos y a los fisiólogos, Sergi y Emilio
de Juan. ¡Gracias!
Si el entorno laboral ha sido clave en la consecución de esta tesis, mi entorno personal
no podía ser menos, nada hubiera sido posible sin el apoyo incondicional de mi familia y
amigos.
A mi madre, gracias por su fe ciega en mí, por apoyarme en cualquier decisión, por
animarme a mejorar y por estar siempre ahí. Muchísimas gracias.
A mis hermanos y a mi padre, gracias por inyectar moral a mis días grises, por
escucharme y aconsejarme, por ser un apoyo inconmensurable y por formar parte de mí día
a día. Mil gracias.
A mi abuela, perennemente presente en mis pensamientos, su apoyo y ánimo
incondicional han sido, ayer y hoy, baluartes de mi presente.
A mis amigas, Esther y Connie, ¡gracias por estar ahí!, ¡que siga la fiesta!
Y ya para terminar, si al leer estos agradecimientos no te encuentras entre las
personas citadas y en algún momento hemos coincidido, aprovecho este preciso instante para
decirte, ¡muchas gracias!
“La duda es uno de los nombres de la inteligencia”
Jorge Luis Borges
“La creación intelectual es el más misterioso y solitario de los oficios humanos.”
Gabriel García Márquez
“Es toda una experiencia vivir con miedo, eso es lo que significa ser esclavo.”
Blade Runner (1982)
“Cuanto más difícil es hacer algo, mayor es la recompensa que te espera al final.”
Big Fish (2003)
“Después de todo, mañana será otro día.”
Lo que el viento se llevó (1939)
A las mujeres de mi vida:
A mi madre,
a mi abuela.
ÍNDICE
RESUMEN GENERAL…………………………..……………………………………1
Introducción……………………………………………………………………….……..3
1. El ojo.2. La retina.3. Fototransducción.4. Células Gliales.
4.1 Células de Müller.4.2 Astrocitos.4.3 Microglía.
5. Retinosis Pigmentaria.6. Activación glial y enfermedades neurodegenerativas de la retina.
Bibliografía……………………...……………………………………………….……..19
Justificación de la memoria de la tesis doctoral y objetivos……………………………25
Estructura de la tesis……………………………………………………………………27
Resultados y discusión.....................................................................................................29
Conclusiones……………………………………………………………………………41
CAPÍTULO 1………………………………………………………………………….43
Retinal microglia are activated by systemic fungal infection.
CAPÍTULO 2………………………………………………………………………….53
Microglia activation in a model of retinal degeneration and TUDCA neuroprotective
effects.
CAPÍTULO 3………………………………………………………………………….71
Persistent inflammatory state and microglial activation after photoreceptor loss in an
animal model of retinal degeneration.
CAPÍTULO 4………………………………………………………………………...127
La estimulación crónica de la respuesta inflamatoria mediante lipopolisacárido agrava el
proceso degenerativo de la retina en un modelo animal de degeneración retiniana.
RESUMEN GENERAL
Resumen General
3
INTRODUCCIÓN
La Real Academia Española define el término “visión” como acción y efecto de ver.
Esta “visión” confiere la capacidad de interpretar el mundo que nos rodea, nos permite
adquirir conocimiento, comunicarnos con el resto de las personas e interaccionar con otros
estímulos. Esta información llega a nuestros órganos visuales en forma de fotones de luz
que correctamente interpretados conforman nuestra “visión” del entorno. La “visión” es, en
definitiva, uno de los más importantes sentidos, cuyo elemento fundamental son los ojos. A
través de dichos órganos, se produce el procesamiento de los fotones de luz, una señal
física que posteriormente se convertirá en una señal química y, finalmente, en señales
eléctricas que serán interpretadas por la corteza visual del cerebro. Nuestra “visión” del
mundo es, de este modo, una compleja lectura de potenciales eléctricos. Si la estructura
fundamental de la visión son los ojos, el elemento clave de dichos órganos es, sin lugar a
dudas, la retina. La comprensión de la estructura y función de la retina de los vertebrados
ha sido y sigue siendo el objetivo de muchos científicos en la actualidad. Ramón y Cajal,
ya en el siglo XIX, fue el primero en presentar descripciones anatómicas completas de los
tipos de células neuronales que constituyen la retina en varias especies de vertebrados
(Ramón y Cajal 1893). Posteriormente, se desarrollaron numerosos estudios para la
interpretación de la fotoquímica de los fotorreceptores, la adaptación a la oscuridad, la
visión del color y la formación de la imagen. A mediados del siglo XX, gracias a la
aparición de nuevas técnicas como la microscopía electrónica, los microelectrodos y la
inmunotinción, se producen importantes avances que permiten una comprensión más
profunda y detallada sobre la organización de la retina y el sistema visual. Actualmente, se
está profundizando en el conocimiento del tejido retiniano gracias a nuevas y potentes
herramientas de visualización.
1. El ojo
Una sección transversal del globo ocular revela la existencia de tres diferentes capas.
Una capa externa, constituida por una estructura transparente denominada córnea, que
cubre tanto a la pupila como al iris, y la esclera, la cual provee de soporte físico al globo
ocular formando una unidad continua con la córnea. Una capa intermedia, dividida en dos
partes: anterior, formada por el iris y el cuerpo ciliar; y posterior, constituida por la
coroides. Y finalmente, una capa interna, constituida por la parte sensorial (nerviosa) del
ojo, la retina. Los rayos de luz se concentran sobre la retina tras su paso a través de la
Resumen General
4
córnea, humor acuoso, cristalino y vítreo. En la retina humana, el punto central para el
enfoque de la imagen es la fóvea. Es en este punto, donde la imagen enfocada tiene la
mayor resolución y la mejor calidad de detalle gracias a una elevada concentración de
fotorreceptores de tipo cono. La información visual de alta calidad captada por la retina
será transportada a través del nervio óptico, pasando por el quiasma óptico hacia el núcleo
geniculado lateral, el cual proyecta prolongaciones nerviosas sobre la corteza visual
primaria, donde tendrá lugar la percepción e interpretación de la imagen. En la figura 1
observamos una sección sagital del globo ocular que nos permite visualizar los diferentes
componentes estructurales del ojo.
Figura 1. Sección sagital de un ojo humano adulto (Kolb y cols. 2015).
2. La retina
La retina es una estructura multicapa fotosensible localizada en la parte posterior
interna del ojo, que pertenece al sistema nervioso central (SNC). Su principal función es la
transmisión de la información visual hacia el córtex occipital del cerebro a través del
nervio óptico. La captación de la información visual no sería posible sin la existencia de
esta porción neural fotosensible. Analizando detenidamente la estructura retiniana gracias a
una sección transversal, observamos la presencia de varias capas que conforman una
estructura de elevada complejidad morfológica. En la retina interna, es decir, en la zona
más cercana al cristalino, la primera capa que encontramos es aquella constituida por las
Resumen General
5
células ganglionares, cuyos axones conformarán el nervio óptico. Los fotorreceptores
(bastones y conos) se localizan en la retina externa debajo del epitelio pigmentario y a la
coroides. La capa de fotorreceptores juega un papel clave en la percepción del estímulo
luminoso y en la fototransducción, proceso en el cual también están implicadas las células
del RPE (Reynolds y Lamba 2014). Por lo tanto, la luz debe atravesar todas las capas
internas de la retina para estimular a las células fotosensibles de la retina externa (bastones
y conos). La absorción de los fotones luminosos por parte del pigmento visual de los
fotorreceptores (rodopsina) se traduce primeramente en un mensaje bioquímico y luego
eléctrico que es capaz de estimular a todas las neuronas de la retina. Toda la información
visual adquirida y codificada en forma de potenciales de acción es transmitida al cerebro a
través de los axones de las células ganglionares.
A pesar de que esta visión general y concisa del tejido retiniano facilita la
comprensión, la realidad es que la retina es un tejido mucho más complejo y no supeditado
a unos pocos tipos celulares. Además de los fotorreceptores, las células del RPE y las
células ganglionares existen otros tipos celulares profundamente implicados en la
fototransducción y en la homeostasis de la retina. Todas las retinas de vertebrados se
componen de tres capas de cuerpos celulares nerviosos y dos capas plexiformes. La capa
nuclear externa (ONL) contiene los cuerpos celulares de los conos y bastones, la capa
nuclear interna (INL) está formada por los cuerpos celulares de las células bipolares,
células horizontales, amacrinas e interplexiformes y la capa de células ganglionares (GCL)
que contiene los cuerpos celulares de las células ganglionares y de células amacrinas
desplazadas. Entre estas tres capas de cuerpos celulares se encuentran dos capas
plexiformes donde tienen lugar los contactos sinápticos. La primera es la capa plexiforme
externa (OPL) donde se producen los contactos sinápticos entre los conos y bastones con
las células bipolares (información en dirección vertical) y horizontales. La segunda es la
capa plexiforme interna (IPL), donde se produce el contacto entre las células bipolares
(portadoras de información vertical) y las células ganglionares. Además en esta capa,
existe un flujo horizontal de la información a través de una gran variedad de células
amacrinas, que junto con las células bipolares integran la información que llega a las
células ganglionares. Es al final de todo este procesamiento neural en la IPL cuando el
mensaje relativo a la imagen se transmite finalmente al cerebro a través del nervio óptico
(Kolb y cols. 2001; Kolb y Marshak 2003).
Resumen General
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En la figura 2 podemos apreciar la estructura general de la retina de mamíferos (figura
2A), así también como la disposición de cada uno de los tipos celulares del tejido retiniano
(figura 2B).
Figura 2. Estructura de la retina de mamíferos. (A) Distribución de las capas de la retina
(tomado de www.retinalmicroscopy.com). (B) Tipos celulares principales de la retina
(Kolb y cols. 2015).
3. Fototransducción
La transducción de la luz en una señal neuronal tiene lugar en los segmentos externos
de los fotorreceptores tipo cono y bastón. Los segmentos externos de los fotorreceptores
tipo bastón presentan una gran superficie de bicapa lipídica que se encuentra densamente
empaquetada junto con el fotopigmento rodopsina, formando numerosos pliegues o sáculos
a modo de “discos”. El pigmento visual, la rodopsina, es uno de los componentes clave en
la fototransducción de la señal luminosa. Dicho pigmento visual está constituido por una
proteína llamada opsina y un cromóforo visual derivado de la vitamina A, el retinal. Cada
molécula de rodopsina presenta una molécula de opsina, que está constituida por tres
dominios diferentes: un dominio citoplasmático, el extremo C-terminal (implicado en la
transducción de la señal luminosa); un dominio transmembrana, formado por siete hélices
transmembrana que rodean al cromóforo (11-cis retinal); y un dominio extracelular, el
extremo N-terminal (Figura 3).
Resumen General
7
La absorción de un fotón de luz provoca la isomerización del 11-cis retinal a su
configuración trans, que actúa como un poderoso agonista capaz de provocar el cambio
conformacional en la proteína, activando a la rodopsina como enzima. La interacción de la
rodopsina activa con la forma inactiva de la transducina (proteína periférica de membrana
que pertenece a la familia de las proteínas G heterotriméricas) produce la unión de una
molécula de GTP que desencadena la activación de la transducina. La transducina activa
interactúa, como resultado de la difusión lateral, con una fosfodiesterasa que, una vez
activa, es capaz de incrementar la hidrólisis de GMP cíclico, con lo cual la concentración
de esta molécula en el citoplasma desciende. En condiciones de oscuridad el GMP cíclico
se encuentra unido a diferentes canales de intercambio iónico, manteniéndolos abiertos.
Con la activación de la fosfodiesterasa, la concentración de GMP cíclico en el citoplasma
cae, lo que provoca que se libere de los canales de intercambio iónico. Estos canales al no
tener GMP cíclico unido se cierran, generando una reducción de la corriente
transmembrana y la consiguiente hiperpolarización celular (Lamb y Pugh 2006).
Figura 3. Representación esquemática de la molécula rodopsina en los discos de los
segmentos externos de los fotorreceptores de tipo bastón (Kolb y cols. 2015).
4. Células gliales
Habitualmente, al hablar de la retina, olvidamos un componente celular importante
para el adecuado funcionamiento del tejido retiniano, la glía. Las células gliales son
responsables del mantenimiento de la homeostasis del tejido, además de contribuir a la
Resumen General
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supervivencia neuronal. Existen tres tipos de células gliales: las células de Müller, los
astrocitos y la microglía (Cuenca y cols. 2014).
4.1 Células de Müller
Las células de Müller, constituyen el tipo principal de célula glial en la retina de los
vertebrados. Este tipo celular, establece una relación anatómica entre las neuronas
retinianas y los compartimentos donde éstas realizan el intercambio de moléculas, como
por ejemplo los vasos sanguíneos. Esta relación no es meramente anatómica, sino también
funcional. Las células de Müller presentan una gran cantidad de canales iónicos, receptores
de ligandos, transportadores transmembrana y enzimas, que facilitan el intercambio de
moléculas entre las células de la retina y los compartimentos retinianos. Al ser el tipo glial
predominante en la retina, las células de Müller juegan numerosos papeles cruciales en el
mantenimiento de las neuronas y sus funciones. Desde etapas muy tempranas del
desarrollo retiniano, las células de Müller son esenciales en el establecimiento y
mantenimiento de la arquitectura neurorretiniana, además de fomentar la supervivencia
neuronal y regular el procesamiento de la información visual (Bringmann y cols. 2006). La
importancia de las células de Müller en el mantenimiento de la estructura retiniana queda
patente en estudios previos, donde la destrucción selectiva de este tipo celular provoca
displasia retiniana y apoptosis de fotorreceptores, que finalmente desemboca en una
degeneración retiniana (Dubois-Dauphin y cols. 2000). Además de las funciones
mencionadas anteriormente, las células de Müller desempeñan un papel clave en la
protección frente a estímulos patogénicos, ya que son capaces de responder a estos
estímulos convirtiéndose en células de Müller activas. Las células de Müller reactivas
ejercen efectos protectores y neurotóxicos sobre los fotorreceptores y las neuronas. Por un
lado, dentro de las funciones beneficiosas se incluyen, el aumento de enzimas capaces de
degradar el adenosín-5'-trifosfato (ATP), incrementando la disponibilidad extracelular del
componente neuroprotector adenosina y evitando la liberación osmótica de ATP, lo que
podría abortar el proceso apoptótico de las células ganglionares retinianas. Las células de
Müller reactivas están implicadas también en la liberación de numerosos factores
antioxidantes y neurotróficos (Bringmann y Wiedemann 2012). Por otro lado, contribuyen
al estrés oxidativo y a la toxicidad por glutamato, debido a un mal funcionamiento del
proceso de captación del glutamato y síntesis de glutatión. El transporte transcelular de
agua y potasio se ve afectado debido al descenso de la conductancia para el potasio,
provocando hiperexcitabilidad neuronal y edema (Bringmann y Wiedemann 2012). En la
Resumen General
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figura 4 podemos apreciar el aspecto típico de las células de Müller en estado de gliosis
reactiva en una rata P23H (modelo animal de retinosis pigmentaria).
Figura 4. Gliosis reactiva de las células de Müller en una rata P23H (tomado de
www.retinalmicroscopy.com). Escala 20µm.
4.2 Astrocitos
Los astrocitos son piezas clave en el mantenimiento de la homeostasis celular en el
SNC, incluyendo en el tejido retiniano. Sus proyecciones filamentosas interactúan con
vasos sanguíneos, neuronas y astrocitos vecinos a través de gap junctions, canales de sodio
y potasio voltaje-dependientes y canales de transporte de agua, las acuaporinas (figura 5).
Entre las diversas funciones llevadas a cabo por los astrocitos se incluyen la regulación de
la homeostasis iónica, síntesis y eliminación de neurotransmisores, mantenimiento de la
barrera hematoencefálica y señalización del calcio. Mediante todas estas actividades, los
astrocitos son capaces de asegurar el óptimo funcionamiento y supervivencia neuronal.
Cualquier alteración o disrupción en la interacción astrocito-neurona, puede conllevar una
disfunción neuronal (Mansour y cols. 2008). Los astrocitos están capacitados para
responder ante estímulos perjudiciales. En condiciones fisiológicas, los astrocitos maduros
exhiben finos y numerosos procesos laterales que se extienden desde sus ramas principales,
lo que les proporciona su típico aspecto ramificado. Sin embargo, bajo numerosas
Resumen General
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condiciones adversas, como isquemia, trauma o neurodegeneración, los astrocitos
experimentan una hipertrofia característica en sus ramificaciones. Además de esta
manifestación morfológica, los astrocitos reactivos presentan un incremento en la
expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), vimentina y nestina, todas ellas
involucradas en la formación de los filamentos intermedios (Pekny y Nilsson 2005).
Figura 5. Astrocitos en la retina de una rata Sprague-Dawley. Escala 10µm.
4.3 Microglía
El último tipo de célula glial presente en la retina es la microglía. Las células
microgliales actúan como células inmunes residentes del SNC, incluyendo la retina,
jugando el papel fundamental de mediadores primarios del proceso inflamatorio. En
condiciones fisiológicas, las células microgliales presentan una morfología ramificada, con
un pequeño y redondeado soma, y varios procesos laterales finos que le sirven para
monitorizar todo el microambiente circundante. En este estado, las células microgliales
juegan un papel crucial en el crecimiento axonal, remodelación sináptica y supervivencia
neuronal, a través de la fagocitosis de restos celulares y de la liberación de numerosos
factores de señalización celular (Dheen y cols. 2007; Smith y cols. 2012). Ante un estímulo
negativo, ya sea una lesión tisular, un incremento de especies reactivas del oxígeno y
Resumen General
11
nitrógeno o patógenos, las células microgliales asumen un estado reactivo, caracterizado
por un acortamiento y un ensanchamiento de sus ramificaciones (Beynon y Walker 2012).
Si el estímulo perjudicial persiste, estas células microgliales en estado temprano de
activación, pueden progresar hasta convertirse en células microgliales fagocíticas
ameboides. Una vez alcanzada esta morfología ameboide, las células microgliales
desempeñan las funciones características de los macrófagos celulares (fagocitosis y
secreción de sustancias pro-inflamatorias). La morfología característica de una célula
microglial en una retina sana aparece representada en la figura 6.
Figura 6. Células de microglía. (A) Célula microglial de la capa plexiforme interna de la
retina de una rata Sprague-Dawley. (B) Célula microglial de la capa plexiforme externa de la
retina de una rata Sprague-Dawley. Escala 20µm.
En diversos modelos animales y humanos, se ha observado que la activación glial
derivada del estrés oxidativo y las moléculas inflamatorias juega un papel clave en la
activación de rutas apoptóticas. La activación de dichas rutas desencadena fenómenos de
muerte neuronal y condiciona la posterior remodelación de los circuitos retinianos.
La neuroinflamación es un proceso celular coordinado que se desarrolla en respuesta al
daño tisular. Una regulación adecuada de dicho proceso conlleva la recuperación del daño.
Sin embargo, un proceso neuroinflamatorio desregulado puede desencadenar una lesión
secundaria o hacer que la lesión existente empeore. La neuroinflamación es un proceso
estrechamente relacionado con la progresión de varias enfermedades neurodegenerativas
retinianas como son la retinosis pigmentaria o el glaucoma (Cuenca y cols. 2014).
Resumen General
12
5. Retinosis pigmentaria
La retinosis pigmentaria (RP) es un tipo de degeneración retiniana hereditaria con altos
niveles de heterogeneidad clínica y genética. Se estima que la prevalencia mundial de la
RP es de alrededor de 1/4000 para un total de un millón de afectados. Esta enfermedad
puede ser heredable, en cuyo caso, podría presentarse con una herencia autosómica-
dominante (30-40% de los casos), autosómica-recesiva (50-60% de los casos) o ligada al
cromosoma X (5-15% de los casos) (Beynon y Walker 2012). Se sabe actualmente que
más de 100 mutaciones diferentes en el gen que codifica la rodopsina (RHO) están
relacionados con 30 a 40% de los casos autosómicos dominantes. La mutación Pro-23-His
es la causa más frecuente de RP dominante (Dryja y cols. 1990) siendo la causa genética
aproximadamente un 15% de los casos de RP autosómica dominante en los Estados Unidos
(Dryja y cols. 2000). Se sabe actualmente que la mutación P23H causa mal plegamiento y
retención de la rodopsina en el retículo endoplasmático (Kaushal y Khorana 1994). La RP
es una enfermedad que generalmente afecta solamente al ojo, sin embargo en un 20-30%
de los casos, los pacientes experimentan alteraciones no visuales además de los síntomas
típicos de la RP. En este caso, estaríamos hablando de un síndrome, de los que se conocen
actualmente más de 30 diferentes, como el síndrome de Usher o el síndrome de Bardet-
Biedl, entre otros (Hartong y cols. 2006).
Resumen General
13
Figura 7. Genes causantes de la RP y su contribución a la enfermedad en los casos de
herencia autosómica-recesiva, autosómica-dominante y ligada al cromosoma X (Hartong y
cols. 2006).
Como hemos mencionado anteriormente, la RP es una enfermedad que presenta una
enorme heterogeneidad clínica, algunos pacientes desarrollan una pérdida visual durante la
infancia, mientras que otros permanecen asintomáticos hasta la edad adulta. Un gran
número de enfermos presentan una sintomatología clásica, caracterizada por una pérdida
de la visión periférica y ceguera nocturna durante su edad adulta. Estos primeros síntomas
se deben a la degeneración primaria de los fotorreceptores tipo bastón de la retina, que son
los encargados de la visión acromática en condiciones de poca iluminación y están situados
sobre todo en la periferia retiniana. Con la progresión de la enfermedad los pacientes
Resumen General
14
pueden desarrollar la clásica visión en túnel, debido a que sólo los fotorreceptores tipo
cono (responsables de la visión cromática y agudeza visual en condiciones óptimas de
iluminación) de la fóvea permanecen funcionales. En la etapa final de la enfermedad, con
la pérdida de todos los fotorreceptores tipo cono, el campo visual central finalmente
degenera y conduce a una ceguera completa. También, en las fases más tardías de la
enfermedad, el resto de células retinianas (células amacrinas, bipolares, horizontales y
ganglionares) degeneran, produciendo una remodelación de la retina (Marc y cols. 2003;
Cuenca y cols. 2014) y acentuando aún más los síntomas. En muchas de las formas típicas
de RP, la pérdida de funcionalidad de los fotorreceptores tipo bastón excede la reducción
de la sensibilidad de los fotorreceptores tipo cono. Mientras que en otros tipos de RP, los
fotorreceptores tipo bastón y tipo cono degeneran conjuntamente. En ocasiones, el declive
de los fotorreceptores tipo cono es mayor que el de los fotorreceptores tipo bastón, esta
forma de RP está caracterizada por una pérdida de agudeza visual y visión cromática
defectuosa de forma temprana (Hartong y cols. 2006).
En la actualidad no existen tratamientos efectivos para combatir la enfermedad, no
obstante, se están desarrollando prometedoras terapias como las terapias génicas y
regenerativas con células madre (Reynolds y Lamba 2014; Solinis y cols. 2015). Estas
terapias plantean soluciones a largo plazo, sin embargo, existe la necesidad de proponer
soluciones más inmediatas que permitan retrasar la progresión de la enfermedad. Algunas
posibilidades son la utilización de ciertos componentes o sustancias capaces de promover
la supervivencia neuronal, tales como factores neurotróficos, antioxidantes o anti-
apoptóticos que han demostrado cierta efectividad en algunos modelos animales de RP y
otras neurodegeneraciones retinianas (Fernandez-Sanchez y cols. 2011; Musarella y
Macdonald 2011).
La apoptosis es la forma generalizada de muerte de los fotorreceptores en la RP
(Sancho-Pelluz y cols. 2008). La apoptosis es un proceso de muerte celular regulado
genéticamente, en el cuál la célula participa de forma activa en su propia destrucción.
Habitualmente, se ha considerado a las caspasas como las ejecutoras principales de la
muerte apoptótica, aunque otras proteasas como las calpaínas o las catepsinas parecen
desempeñar un rol igualmente clave en el proceso apoptótico. En modelos animales de
neurodegeneraciones retinianas se ha detectado la activación tanto de caspasas como de
calpaínas (Huang y cols. 2010). Por tanto, parece ser que, independientemente del estímulo
inicial, los mecanismos subyacentes a la muerte de fotorreceptores y otros tipos celulares
Resumen General
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de la retina son análogos. Estudios previos sugieren que el proceso patológico de la RP
incluye estrés celular, respuesta inflamatoria, remodelación retiniana y el paso final de
muerte programada de fotorreceptores o apoptosis (Illing y cols. 2002; Cuenca y cols.
2014).
6. Activación glial y enfermedades neurodegenerativas de la retina
Existe un factor que influye de forma clara en la progresión de las enfermedades
neurodegenerativas de la retina, y es la activación de la glía. Como hemos mencionado
anteriormente, las células gliales se encargan del mantenimiento de la homeostasis del
tejido retiniano, mediante la liberación de factores de neurotróficos y del mantenimiento
del metabolismo energético de las neuronas. En condiciones fisiológicas, tanto las células
de Müller, como los astrocitos y la microglía realizan sus funciones características de
mantenimiento del microambiente celular y promoción del crecimiento neuronal, además
de garantizar el funcionamiento idóneo del tejido retiniano. En los estadios tempranos de
una degeneración retiniana, todas las células gliales se activan en respuesta al estímulo
negativo, como parte de un proceso denominado gliosis. Por un lado, la gliosis reactiva
tiene un efecto neuroprotector directo sobre la retina, mediando el incremento de la
expresión de factores neurotróficos y/o neuroprotectores, favoreciendo la regulación de los
balances de neurotransmisores en las sinapsis y modulando las concentraciones de iones y
agua, entre otros beneficios. Sin embargo, por otro lado, la gliosis proliferativa podría
acelerar la neurodegeneración acontecida durante una enfermedad crónica, provocando
daños directos e indirectos a las neuronas y a los vasos retinianos. La gliosis crónica
incrementa la permeabilidad vascular, la infiltración de compuestos citotóxicos e incluso la
neovascularización (Cuenca y cols. 2014). En la gliosis proliferativa, las células de Müller
pueden promover la muerte neuronal mediante la síntesis y secreción de factor de necrosis
tumoral alfa (TNF-α), proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1) y óxido nítrico
(NO), además de interferir en el proceso de reparación del tejido y en la
neuroregeneración, a través de la formación de cicatrices gliales (Cuenca y cols. 2014).
Por otro lado, la astroglía reactiva puede tener efectos beneficiosos o perjudiciales sobre
las neuronas dañadas. Por una parte, es capaz de liberar factores neurotróficos que
promueven la supervivencia celular, y por otra parte, podría generar moléculas capaces de
inhibir la regeneración y reparación axonal, desencadenando neurotoxicidad o daño a
neuronas y células gliales cercanas (Cuenca y cols. 2014).
Resumen General
16
Como hemos mencionado anteriormente, cuando se produce un daño en la retina, ya
sea por causas endógenas o exógenas, la microglía se activa y ejerce una acción protectora
eliminando materiales de desecho y células dañadas, además de secretar factores de
supervivencia neuronal, evitando así la propagación de la lesión. Sin embargo, una
activación persistente, producida por un estímulo inflamatorio continuo o un fallo en la
respuesta autolimitante, puede reclutar más células inflamatorias convirtiendo el efecto
beneficioso en un estímulo perjudicial (Johnson y Morrison 2009). En las enfermedades
neurodegenerativas, la interacción entre el daño neuronal y la activación de la microglía
genera un ciclo vicioso autopropagado que causa una inflamación descontrolada y
prolongada, contribuyendo a la progresión crónica de la enfermedad (Gao y Hong 2008).
Las células microgliales reactivas secretan TNF-α, capaz de amplificar la reacción
inflamatoria y de activar la vía apoptótica extrínseca (Tweardy y cols. 1991). En modelos
de RP como el ratón rd1, la activación de la microglía y la expresión de citoquinas y TNF-
α precede a la apoptosis de los fotorreceptores, sugiriendo un papel importante en la
degeneración de la retina de este ratón (Zeng y cols. 2005; Langmann 2007).
Se han observado células microgliales activas en modelos murinos de RP autosómica
recesiva (Zeng y cols. 2005; Karlstetter y cols. 2010) en ratones SDR (Hughes y cols.
2003) y en ratas modelo de degeneración retiniana heredada, incluyendo las ratas RCS
(Royal College of Surgeons) (Roque y cols. 1996). Las células microgliales reactivas son
capaces de producir sustancias neurotróficas, transportadores de glutamato y antioxidantes,
que promueven el correcto funcionamiento neuronal. Sin embargo, estas células
microgliales, también generan sustancias potencialmente neurotóxicas como NO y
citoquinas pro-inflamatorias (IL-1α, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6, entre otras), que se
encuentran implicadas en un gran número de enfermedades neurológicas y perturbaciones
del SNC, como infecciones, daño químico o envejecimiento (Benveniste 1992; Lucin y
Wyss-Coray 2009; Polazzi y Monti 2010; Harry 2013). En enfermedades
neurodegenerativas de la retina la activación microglial crónica y la neuroinflamación, son
acontecimientos comunes. En RP, la muerte primaria de los bastones estimula la activación
de las células microgliales y su migración hacia retina externa para eliminar los residuos
celulares. Estudios anteriores postulan, que estas células microgliales activas podrían
liberar factores citotóxicos, como NO, que afectarían a los fotorreceptores adyacentes,
incluyendo a los conos (Gupta y cols. 2003).
Resumen General
17
En la degeneración macular asociada a la edad, estudios previos han demostrado que
las células microgliales se convierten en patogénicas con la edad, causando una activación
crónica que compromete la integridad de la retina (Penfold y cols. 2001; Ardeljan y Chan
2013).
Las células microgliales también juegan un papel crucial en la progresión del
glaucoma. Muchos estudios revelan que el número, morfología, distribución y actividad
presentadora de antígenos de las células microgliales cambia en los ojos glaucomatosos,
resaltando su importancia en el transcurso de la enfermedad (Bosco y cols. 2011; Bosco y
cols. 2012; Gallego y cols. 2012; Rojas y cols. 2014).
En modelos experimentales de retinopatía diabética, se observan alteraciones en las
células microgliales, demostrando también en este caso, que el proceso de activación
microglial se halla fuertemente relacionado con el devenir de la enfermedad. Sin embargo,
a día de hoy se desconoce qué grado de esta activación microglial se debe a la microglía
residente del tejido, y qué parte corresponde a la activación de células monocíticas
circulantes (Abcouwer 2013).
La activación microglial no es un proceso que pueda catalogarse de forma sencilla
como beneficioso o perjudicial para el tejido que ha experimentado un daño. Numerosos
estudios sugieren que la activación microglial es un proceso nocivo para la supervivencia
neuronal, demostrando que la inhibición de la microglía disminuye la secreción de
citoquinas pro-inflamatorias y, por lo tanto, reduce la pérdida neuronal (Gao y cols. 2002;
Ling y cols. 2006). No obstante, otras investigaciones aportan evidencias del efecto
neuroprotector de la activación microglial (Hayashi y cols. 2006; Imai y cols. 2007).
Algunos estudios respaldan que los efectores tróficos y tóxicos producidos por las células
microgliales están controlados diferencialmente dependiendo de la severidad de la lesión
neuronal que se produzca en cada caso (Lai y Todd 2008). Bajo condiciones patológicas,
las células microgliales están sujetas a una gran variedad de señales endógenas y exógenas.
Estos estímulos desencadenan una proliferación microglial local y cambios en su
morfología, además de alterar su localización en el tejido retiniano, el patrón de secreción
de citoquinas y la expresión de marcadores moleculares de superficie. Estos característicos
eventos inmunológicos sumados a la ausencia/fallo de la maquinaria de autorregulación
microglial, pueden inclinar la balanza hacia el incremento del daño retiniano y la
Resumen General
18
ocurrencia de eventos pro-apoptóticos (Gupta y cols. 2003; Langmann 2007; Karlstetter y
cols. 2010).
Es posible que el resultado neto de la activación microglial venga establecido por el
ratio coste/beneficio en cada tejido y patología en concreto. De esta forma, una activación
microglial podría ser beneficiosa en un modelo animal de degeneración del SNC, pero
sería perjudicial si tuviera lugar en un SNC sano. En ciertas condiciones patológicas, la
activación microglial supondría un precio demasiado elevado en comparación con el
beneficio final que se persigue, como podría ser en las enfermedades neurodegenerativas
de la retina, donde la fragilidad del tejido retiniano sería el factor clave (Schwartz y cols.
2006).
Por otro lado, existe una necesidad de desterrar el concepto tradicional de una respuesta
microglial estereotipada y sustituirlo por el concepto de diversidad en el comportamiento
microglial. La respuesta microglial es una respuesta definida y redefinida por un
ensamblaje o interpretación de varias señales de entrada o inputs. Dependiendo de la
naturaleza de esas señales de entrada y de la correcta interpretación de las mismas por
parte de las células microgliales se generará una señal de salida o respuesta. Esta respuesta
será más o menos adecuada en función del estado previo en el que se hallara la célula
microglial y de su correcto funcionamiento e implementación de las señales de entrada. Si
la respuesta estuviera correctamente implementada, el resultado final estaría sujeto, una
vez más, al ratio coste/beneficio tisular, que establecería si el tejido es capaz de tolerar la
respuesta microglial frente al daño. Solamente después de todas esas consideraciones
podríamos hablar del resultado final de la respuesta microglial que, como ha quedado
patente, no es meramente una sucesión lineal de acontecimientos (Schwartz y cols. 2006).
Resumen General
19
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Resumen General
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JUSTIFICACIÓN DE LA MEMORIA DE LA TESIS DOCTORAL Y OBJETIVOS
La neuroinflamación es un mecanismo celular coordinado que se desarrolla en
respuesta al daño tisular. Una regulación adecuada de dicho proceso tiene como finalidad
la recuperación del daño, sin embargo, una neuroinflamación desregulada puede
desencadenar una lesión secundaria. La neuroinflamación es un proceso estrechamente
relacionado con la progresión de varias enfermedades neurodegenerativas retinianas como
son la retinosis pigmentaria (RP), la degeneración macular asociada a la edad o el
glaucoma. Las células microgliales están profundamente implicadas en el proceso
neuroinflamatorio, no obstante, en la actualidad todavía se desconocen los mecanismos
concretos que determinan los efectos neuroprotectores o citotóxicos de la microglía en el
transcurso de una enfermedad neurodegenerativa. Por lo tanto, en el desarrollo de posibles
terapias resulta capital tener en cuenta la función y actividad de las células microgliales, ya
que este tipo de célula glial podría determinar el fracaso o el éxito de cada tratamiento.
Basándose en las consideraciones mencionadas anteriormente, los objetivos de esta tesis
doctoral son los siguientes:
1. Determinar si una infección fúngica sistémica provocada por Candida albicans,
puede desencadenar una activación microglial en la retina del ratón C57BL/6J
(Capítulo 1).
2. Evaluar si la utilización de un compuesto neuroprotector como el ácido
tauroursodeoxicólico (TUDCA) en un modelo animal de RP (rata P23H), es capaz de
reducir la activación microglial, modificar su patrón de expresión y retrasar la
pérdida de células fotorreceptoras (Capítulo 2).
3. Estudiar la progresión de la activación microglial a lo largo de la vida de un modelo
animal de RP (rata P23H) y establecer si tras la muerte de las células fotorreceptoras
de la retina, el estado inflamatorio persiste (Capítulo 3).
4. Determinar La estimulación crónica de la respuesta inflamatoria mediante
lipopolisacárido agrava el proceso degenerativo de la retina de la rata P23H.
(Capitulo 4).
Resumen General
27
ESTRUCTURA DE LA TESIS
La presente tesis doctoral incluye cuatro capítulos, dos de los cuales se
corresponden con artículos científicos ya publicados en revistas internacionales de
reconocido prestigio, y dos capítulos adicionales que recogen trabajos en vías de
publicación o ya enviados.
CAPITULO 1. Retinal microglia are activated by systemic fungal infection. (2014).
Maneu, V.; Noailles, A.; Megías, J.; Gómez-Vicente, V.; Carpena, N.; Gil, ML.; Gozalbo,
D.; Cuenca, N. Investigative Ophthalmology and Visual Science, 55(6), 3578–3585.
CAPITULO 2. Microglia activation in a model of retinal degeneration and TUDCA
neuroprotective effects. (2014). Noailles, A.; Fernández-Sánchez, L.; Lax, P.; Cuenca, N.
Journal of Neuroinflammation, 11, 1–15.
CAPITULO 3. Persistent inflammatory state and microglial activation after photoreceptor
loss in an animal model of retinal degeneration. Noailles, A.; Maneu, V.; Campello, L.;
Gómez-Vicente, V.; Lax, P.; Cuenca, N. En revisión.
CAPITULO 4. La estimulación crónica de la respuesta inflamatoria mediante
lipopolisacárido agrava el proceso degenerativo de la retina en un modelo animal de
degeneración retiniana. Noailles, A.; Maneu, V.; Lax, P.; Cuenca, N.
Resumen General
29
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En esta sección se describe de forma breve y concisa el contenido de cada capítulo.
CAPITULO 1. Retinal microglia are activated by systemic fungal infection. Noailles, A.;
Fernández-Sánchez, L.; Lax, P.; Cuenca, N.
El objetivo de este trabajo fue determinar si la infección fúngica sistémica causada
por Candida albicans puede provocar la activación de la microglía de la retina y, por lo
tanto, desencadenar efectos potencialmente dañinos en un marco de enfermedad
degenerativa retiniana. En este trabajo se utilizaron ratones C57BL/6J de 8-10 semanas de
edad repartidos en dos grupos experimentales. Uno de los grupos recibió de forma
intravenosa una concentración de levaduras viables (6x105 unidades de C. albicans en
100µl de PBS) y el otro grupo, que actuó como grupo control, recibió una dosis de
levaduras inactivas (1x107 unidades de C. albicans en 100µl de PBS). Para el estudio de las
células microgliales se utilizaron técnicas inmunohistoquímicas y de citometría de flujo.
Para las técnicas inmunohistoquímicas, la población microglial fue identificada por su
inmunorreactividad contra Iba1 (policlonal de conejo), además, el anticuerpo MHC-II
(monoclonal de ratón anti-MHCIIRT1B clon OX-6) fue utilizado para establecer el estado
activo. En la citometría de flujo, se emplearon tres anticuerpos: CD11b, como marcador de
toda la población microglial, y MHC-II y CD45, para detectar los estados microgliales
activos, ya que su expresión en células microgliales activas está ampliamente descrita en la
bibliografía previa. En los ratones control, las células microgliales presentaban una
morfología, reactividad y distribución características de células microgliales en reposo de
una retina saludable. Sin embargo, en las retinas de los ratones infectados se observó un
mayor número de células microgliales y la presencia de numerosos estados activos
caracterizados por un engrosamiento del soma y prolongaciones hinchadas y cortas.
Además, localizamos un gran número de células totalmente ameboides, lo que evidenciaba
un avanzado estado de activación, en el cual, las células microgliales habían perdido por
completo sus ramificaciones y eran completamente fagocíticas. El incremento en el
número de células microgliales observado en los ratones infectados podría deberse bien a
la proliferación de la microglía retiniana, o bien a la llegada de progenitores mieloides,
monocitos inflamatorios o macrófagos inflamatorios.
Por otro lado, el cuerpo ciliar de los ratones infectados presentaba una población de
células Iba1-positivas significativamente mayor que el cuerpo ciliar de los ratones control.
Resumen General
30
Muchas de estas células Iba1-positivas se localizaban en el interior de los vasos
sanguíneos, lo que respalda la hipótesis sobre la llegada de macrófagos/precursores
inflamatorios desde fuera del tejido retiniano.
El hecho de que las levaduras inactivas no provocan un aumento significativo en la
población microglial retiniana, demuestra que sólo los microorganismos viables son
capaces de desencadenar la activación microglial. No hemos podido detectar Candida
albicans dentro del tejido retiniano, por lo que la activación microglial parece producirse
en respuesta a las citoquinas pro-inflamatorias producidas durante la infección sistémica.
Sin embargo, no podemos descartar que exista una interacción directa entre las células
microgliales retinianas y ciertos ligandos fúngicos solubles circulantes en sangre, como
(1,3) β-D-glucano o manano, que podrían contribuir al proceso de activación microglial. Se
sabe que los receptores tipo Toll (TLRs), principalmente los de tipo TLR2 y TLR4, son
clave en la producción de citoquinas en respuesta a Candida albicans. Además, el receptor
del β-glucano, la Dectina-1, es necesario para la fagocitosis de las células fúngicas y
colabora con TLR2 en la producción de citoquinas. Probablemente, la microglía retiniana,
al igual que la microglía del SNC y otras células inmunes, es capaz de reconocer patrones
moleculares asociados a patógenos (PAMPs) a través de los TLRs y del receptor Dectina-
1. Estudios previos han demostrado que tanto los TLRs como el receptor Dectina-1 juegan
un papel clave tanto en la neuroinflamación mediada por la microglía, como en el daño del
SNC tras una infección. El β-glucano es capaz de activar a la microglía del SNC a través
del receptor Dectina-1, lo que respalda la importante función de este receptor en la
inmunidad anti-fúngica en el SNC. Previamente se ha demostrado que tanto TLR2 como el
receptor Dectina-1 se expresan en la microglía retiniana de ratón y que, además, están
implicados en el proceso de fagocitosis de Candida albicans. Por lo tanto, no se puede
descartar la posibilidad de que los ligandos fúngicos solubles pudieran provocar
directamente la activación de la microglía retiniana mediante el reconocimiento directo de
PAMPs a través de receptores específicos.
Aunque la activación microglial se asocia comúnmente con la neuroprotección, la
activación desregulada puede desencadenar una inflamación crónica, con importantes
efectos patológicos graves en la retina. La activación microglial crónica se ha relacionado
con un gran número de enfermedades neurodegenerativas, como la RP o el glaucoma,
probablemente exacerbando el daño tisular y precipitando varios eventos pro-apoptóticos.
Resumen General
31
Nuestros resultados demuestran que una infección sistémica por Candida albicans
es capaz de provocar una gran activación microglial en la retina, lo que se comprueba por
el aumento de la expresión de los antígenos MHC-II y CD45 en los ratones infectados,
detectado por citometría de flujo. Además, los importantes cambios morfológicos y de
distribución de la población microglial retiniana y el incremento de la población CD11b-
positiva demuestran un aumento de células microgliales (o de sus precursores) en la retina.
Por otro lado, nuestro estudio pone de manifiesto que la cuantificación de la zona
correspondiente a las células microgliales retinianas en los gráficos de densidad FSC-
CD11b-FITC constituye una herramienta útil para detectar la activación microglial.
Con este estudio hemos demostrado que una infección fúngica sistémica es capaz
de activar a la microglía retiniana, lo que indica que esta situación debe considerarse como
un factor de riesgo para pacientes afectados con enfermedades neurodegenerativas
oculares, tales como retinopatía diabética, glaucoma, degeneración macular asociada a la
edad o RP.
Resumen General
33
CAPITULO 2. Microglia activation in a model of retinal degeneration and TUDCA
neuroprotective effects. Noailles, A.; Fernández-Sánchez, L.; Lax, P.; Cuenca, N.
Trabajos recientes llevados a cabo por nuestro grupo de trabajo, ponen de
manifiesto la eficacia del TUDCA como agente antiapoptótico en modelos animales de RP
(Fernandez-Sanchez y cols. 2011). El TUDCA es el componente mayoritario de la bilis de
oso, que se ha utilizado en Asia desde hace más de 3.000 años para tratar desórdenes
visuales. Es un compuesto con actividad neuroprotectora que ha demostrado ser efectivo
en modelos de enfermedades neurodegenerativas tales como Parkinson y Huntington. En
este trabajo hemos utilizado ratas P23H a las que se les ha administrado TUDCA
intraperitonealmente para, posteriormente, evaluar el estado de la población microglial en
secciones transversales de retina y la distribución de estas células en retinas montadas en
plano. Como grupo control utilizamos ratas silvestres Sprague-Dawley (SD). La
inmunohistoquímica de las retinas enteras aplanadas se llevó a cabo utilizando un
inmunomarcaje con peroxidasa. El anticuerpo primario utilizado en este caso fue un
monoclonal de ratón anti-CD11b, clon OX-42. La inmunohistoquímica para obtener las
imágenes de fluorescencia se llevó a cabo en criosecciones transversales de retina que
fueron marcadas con los anticuerpos primarios policlonal de conejo anti-Iba1 y
monoclonal de ratón anti-MHCIIRT1B, clon OX-6. Criosecciones verticales de retinas se
utilizaron para realizar un inmunomarcaje con la técnica de Avidina Biotina Peroxidasa.
Este estudio demostró que la microglía se encuentra organizada homogéneamente
en mosaicos regulares en las capas GCL, IPL y OPL de la retina en ratas SD y P23H. Los
cambios que experimentan las células microgliales en la retina de la rata P23H están
relacionados con el aumento significativo en la densidad celular, así como la aparición de
un gran número de células ameboides CD11b-positivas, sobre todo en el espacio
subretiniano (SS).
Además, hemos podido comprobar, gracias a los resultados obtenidos, que el
tratamiento sistémico con el antiapoptótico TUDCA atenúa los cambios en el número, la
distribución y las características morfológicas de las células microgliales en ratas P23H.
En las retinas de las ratas normales SD, las células microgliales CD11b-positivas se
distribuyeron homogéneamente en GCL, IPL y OPL; además de exhibir una típica
morfología de microglía ramificada. A pesar de ello, observamos algunas células
Resumen General
34
microgliales CD11b-positivas con morfología ameboide en las áreas central, media y
periférica de la GCL de las ratas SD.
El análisis del patrón de distribución de las células microgliales en cada capa de la
retina, mostró que dichas células se encuentran dispuestas en un mosaico regular tanto en
ratas SD como en ratas P23H. Este resultado sugiere la existencia de mecanismos
reguladores del posicionamiento celular dentro de cada capa de la retina.
En la retina de ratas P23H no tratadas, la densidad microglial aumentó en GCL, IPL
y OPL, con respecto a lo observado en ratas SD, además de presentar un gran número de
células ameboides CD11b-positivas en el SS. Un gran número de estas células microgliales
expresaban el marcador MHC-II, lo que revelaba su estado activo. La densidad media de
los macrófagos en la GCL también fue mayor en las ratas P23H no tratadas en
comparación con las ratas SD.
Las células CD11b-positivas se distribuyen homogéneamente en las diferentes
capas de la retina de las ratas P23H, sin embargo, la degeneración de la retina de estas ratas
no ocurre homogéneamente en todo el tejido retiniano. Estudios previos muestran que en
etapas más avanzadas de la enfermedad, la degeneración se produce sobre todo en la zona
media de la retina, en comparación con la región central y periférica. Este resultado
demuestra que no existe una correlación aparente entre el estado de degeneración y la
activación glial en esa misma región. Por lo que, o bien la activación microglial no
depende directamente de la degeneración de una zona concreta, o, aunque la degeneración
condicione la activación microglial, las células microgliales no pierden su distribución
homogénea en el tejido.
En nuestro estudio, un pequeño grupo de células microgliales eran Iba1-/MHC-II+,
y aparecían sobre todo en las ratas P23H no tratadas. Esto podría deberse a la existencia de
diferentes patrones de expresión de marcadores microgliales dependiendo de la
procedencia de la célula. Tal vez, las células Iba1-negativas, son realmente células
microgliales/macrófagos que migran desde el exterior del tejido retiniano en respuesta al
estímulo negativo crónico. Otra posible explicación sería que las células Iba1-negativas
son células microgliales senescentes o defectuosas que han perdido las capacidades de
migración que regula Iba1, además de perder también la expresión de dicha molécula.
Posiblemente, la aparición de este nuevo patrón de expresión caracteriza una etapa
Resumen General
35
diferente dentro del proceso de activación microglial, en el que cada una de las etapas está
definida por un patrón de expresión común.
El TUDCA en las ratas P23H reduce el número y la activación de las células
microgliales. En las retinas de las ratas P23H tratadas con TUDCA las células microgliales
se distribuyeron principalmente en las capas retinianas más internas, GCL e IPL, mientras
que en OPL fueron escasas, y totalmente ausentes en SS, situación similar a la observada
en ratas SD. Este resultado sugiere que los efectos del TUDCA sobre la microglía retiniana
podrían ser debidos, al menos en parte, a una reducción de la capacidad migratoria de las
células microgliales. Este efecto se ha demostrado en estudios anteriores, en los cuales el
TUDCA reduce la migración microglial in vitro, y reduce la expresión de quimioatrayentes
necesarios para dicho proceso migratorio (Yanguas-Casas y cols. 2014). Los efectos del
TUDCA sobre las células microgliales de la retina podría deberse también al efecto del
TUDCA sobre las propias células microgliales, interfiriendo supuestamente, en el
“estallido respiratorio” de la microglía (Gaspar y cols. 2013; Park y cols. 2013), que es un
paso crítico en su activación. Además de su acción directa sobre las células microgliales, el
TUDCA podría actuar de una forma indirecta a través de sus propiedades antiapoptóticas,
retrasando la apoptosis del tejido retiniano, y por lo tanto, reduciendo la activación
microglial.
Las células microgliales actúan como sensores de perturbaciones en el
microambiente tisular. En condiciones fisiológicas desempeñan un papel clave en la
supervivencia neuronal. La activación microglial es un proceso común que aparece en
varias enfermedades neurodegenerativas, como Alzheimer, Parkinson, esclerosis lateral
amiotrófica y esclerosis múltiple, aunque sigue sin estar claro si dicho proceso es una
causa o una consecuencia del daño neuronal. El verdadero papel de la microglía en las
enfermedades neurodegenerativas, ya sea como factor beneficioso o perjudicial, aún resulta
un tema de gran controversia. Existe un gran número de estudios que apoyan ambas
hipótesis. Estudios in vitro han demostrado que la activación microglial es capaz de inducir
la muerte de fotorreceptores y que la inhibición de la activación microglial reduce la
apoptosis de los fotorreceptores y mejora significativamente la estructura y función de la
retina. En un modelo murino de RP, el rd10, se ha demostrado que la reducción en la
cantidad de citoquinas pro-inflamatorias mediante un tratamiento antioxidante, inhibe la
activación microglial y ralentiza la pérdida de fotorreceptores. Además, se ha demostrado
que la microglía es necesaria para que el factor IGF-I (factor de crecimiento similar a la
Resumen General
36
insulina) lleve a cabo su efecto neuroprotector en ratones rd10 (Arroba y cols. 2011). Por
lo tanto, la inhibición selectiva de la microglía y la preservación de sus funciones tróficas y
homeostáticas prometen ser un tratamiento eficaz de las enfermedades neurodegenerativas.
Sin embargo, cabe destacar que la microglía reactiva también tiene un efecto
neuroprotector en la retina dañada, y que su total inhibición podría tener efectos nocivos en
el tejido. En las primeras etapas del proceso neurodegenerativo, la activación microglial
podría tener un efecto neuroprotector a través de la fagocitosis de los restos celulares y de
la liberación de moléculas protectoras y anti-inflamatorias. En este caso, la acumulación de
microglía en las zonas isquémicas se correlaciona con una reducción del daño neuronal y
proporciona neuroprotección.
Resumiendo, nuestro estudio demuestra que en condiciones fisiológicas y de
enfermedad las células microgliales exhiben una distribución típica de mosaico en todo el
tejido retiniano, independientemente del estado de degeneración. Los datos obtenidos en
nuestro trabajo también demuestran que la activación microglial participa activamente en
la progresión de la RP. Por otra parte, hemos documentado que TUDCA reduce el número
y la activación de la microglía en un modelo de RP (P23H). Estos resultados ponen de
manifiesto nuevos efectos anti-inflamatorios del TUDCA, que tendrían potenciales
implicaciones terapéuticas en las enfermedades neurodegenerativas de la retina, incluyendo
la RP. Se necesitan más estudios para evaluar el impacto positivo y / o perjudicial de estos
efectos en la estructura y la función de la retina.
Resumen General
37
CAPITULO 3. Persistent inflammatory state and microglial activation after photoreceptor
loss in an animal model of retinal degeneration. Noailles, A.; Maneu, V.; Campello, L.;
Gómez-Vicente, V.; Lax, P.; Cuenca, N.
El estado inflamatorio de la retina puede ser un factor crítico a considerar cuando se
realizan terapias celulares o génicas para paliar los síntomas de las enfermedades
retinianas. Este tipo de tratamientos puede estar condenado al fracaso si el tejido tiene
condiciones desfavorables para la mejora funcional. El objetivo principal de este trabajo
fue estudiar la progresión de la activación microglial a lo largo de la vida de un modelo
animal de retinosis pigmentaria y aclarar si, a pesar de la muerte de una gran parte de la
población de células fotorreceptoras, la microglía se mantiene activa y continua liberando
moléculas pro-inflamatorias que perpetúan el estado inflamatorio. Hasta la fecha, existen
escasos estudios publicados sobre cómo la microglía evoluciona con el tiempo en una
enfermedad crónica de la retina o si el estado inflamatorio del tejido se mantiene después
de la muerte masiva de los fotorreceptores. Con este objetivo en mente, hemos utilizado
ratas P23H y Sprague-Dawley (SD) a diferentes edades y caracterizado la población
microglial, su morfología, la densidad y distribución dentro de la retina, con técnicas tales
como inmunohistoquímica, citometría de flujo y array de citoquinas. Además, se realizaron
electrorretinogramas (ERG) para caracterizar la respuesta funcional de la retina a cada
edad.
Es interesante que en ratas P23H, a pesar de la pérdida de una gran proporción de
células fotorreceptoras, el tejido de la retina sigue presentando una fuerte condición
inflamatoria. Muchos trabajos anteriores en modelos animales de RP, como ratones rd10 y
ratas RCS, mostraron que la producción de citoquinas pro-inflamatorias se incrementa
considerablemente en estos animales y que la activación microglial es un episodio
temprano en el proceso de degeneración de la retina. Los resultados de nuestra
investigación están en concordancia con estudios anteriores, pero, además, proporcionamos
información novedosa sobre cómo la respuesta inflamatoria del tejido retiniano evoluciona
con la edad en un modelo animal de RP. De esta manera, se demuestra que (1) en una fase
temprana de degeneración de la retina la señal de activación microglial estaba compuesta
principalmente por VEGF, CNTF y fractalquina; (2) con la edad, las células microgliales
de ratas P23H exhibieron una variación intensa, no sólo en fenotipos expresados sino
también en su organización y número en el tejido retiniano; (3) a los 12 meses de edad, en
las retinas en degeneración, la cantidad de citoquinas pro-inflamatorias se incrementó
Resumen General
38
notablemente en comparación con una retina normal; (4) la respuesta inflamatoria también
estaba presente en la coroides y el cuerpo ciliar, estructuras que podrían actuar como un
pool de células y moléculas pro-inflamatorias; (5) en una etapa avanzada de la
degeneración de la retina, la llegada de las células pro-inflamatorias y moléculas a través
de la coroides se reduce; y (6) el pico de células pro-inflamatorias en el cuerpo ciliar y la
coroides de ratas P23H es a los 4 meses de edad, y se correlaciona con el pico de la muerte
las células fotorreceptoras en la retina.
Tomados en conjunto, estos hallazgos sugieren que, en un modelo de RP, el estado
inflamatorio de la retina, una vez iniciado, es una respuesta sostenida a lo largo de la vida
de la rata, incluso después de la pérdida de la población de células fotorreceptoras, y otros
factores además de la muerte de los fotorreceptores deben estar implicados en su
mantenimiento. Estos factores son quizás importantes no sólo en el control de la activación
microglial, sino también en la regulación del estado inflamatorio y la integridad de las
estructuras que rodean la retina, como la coroides y el cuerpo ciliar. Como conclusión, los
resultados de nuestra investigación proporcionan una nueva visión global de la respuesta
inflamatoria microglial en la retina que sería importante tener en cuenta para futuras
terapias. La activación microglial de forma permanente puede desencadenar una respuesta
patológica a largo plazo que puede condicionar el éxito o fracaso de una terapia potencial.
En este sentido, el uso de medicamentos anti-inflamatorios, incluso en las etapas finales
del proceso neurodegenerativo, podría preservar la integridad de la retina para que la
aplicación de las terapias celulares o génicas fuera óptima.
Resumen General
39
CAPITULO 4. La estimulación crónica de la respuesta inflamatoria mediante
lipopolisacárido agrava el proceso degenerativo de la retina en un modelo animal de
degeneración retiniana. Noailles, A.; Maneu, V.; Lax, P.; Cuenca, N.
La activación crónica de la microglía se asocia con enfermedades
neurodegenerativas y se ha demostrado que puede contribuir al daño del tejido retiniano
durante un proceso patológico. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto que
produce la activación de la microglía por lipopolisacárido (LPS) en la progresión de las
alteraciones morfológicas y funcionales causadas por enfermedades degenerativas de la
retina. Para ello, utilizamos ratas P23H línea 3 como modelo de neurodegeneración
retiniana y ratas Sprague-Dawley (SD) como control. Los animales recibieron
semanalmente dos inyecciones de LPS (60 µg/Kg, i.p.), o dos inyecciones de vehículo
(PBS), durante las edades P20 a P60. A P60, evaluamos la respuesta visual mediante
registro electrorretinográfico (ERG) y, tras el sacrificio de los animales, analizamos la
estructura y la población microglial de la retina mediante técnicas de inmunohistoquímica
y citometría de flujo. La densidad de microglía y su distribución se analizó utilizando
anticuerpos anti-Iba1 y anti-CD11b y el grado de activación microglial se evaluó utilizando
anticuerpos anti-CD45 y anti-MHCII. El estado de degeneración de la retina en cada grupo
experimental se analizó mediante la valoración del número, morfología y conectividad de
diferentes poblaciones neuronales, utilizando marcadores específicos de células de la
retina. A las dosis ensayadas, la administración de LPS no produjo cambios significativos
en la densidad, morfología, distribución o grado de activación de la microglía en la retina
de ratas SD, en las que las células microgliales, localizadas sobre todo en la capa de células
ganglionares y en las capas plexiformes de la retina, mostraron un aspecto característico de
células con soma pequeño y redondeado, con finas ramificaciones. En cambio, el LPS
aumentó la densidad y la activación microglial en retinas P23H, con un incremento en la
expresión de los antígenos CD11b y CD45. Estos cambios se asociaron con mayor
deterioro en la respuesta ERG, mayor pérdida de fotorreceptores y empeoramiento de la
conectividad sináptica, en relación a lo observado en ratas P23H tratadas con vehículo.
Estos resultados sugieren que el exacerbamiento crónico de la respuesta inflamatoria
inducido por LPS provoca la aceleración de procesos neurodegenerativos en la retina.
Resumen General
41
CONCLUSIONES
1.- La infección sistémica por Candida albicans es capaz de activar a la microglía
retiniana, provocando un incremento en el número de células microgliales en la retina y en
el cuerpo ciliar de los ratones infectados. Por ello, las infecciones sistémicas deben
considerarse como un factor de riesgo para pacientes afectados por enfermedades
neurodegenerativas de la retina.
2.- El TUDCA en las ratas P23H reduce el número y la activación de las células de la
microglía. Este hecho confiere nuevos efectos anti-inflamatorios al TUDCA, que tendrían
potenciales implicaciones terapéuticas en las enfermedades neurodegenerativas de la
retina, incluyendo la retinosis pigmentaria.
3.- En un modelo de retinosis pigmentaria P23H, el estado inflamatorio de la retina se
mantiene a lo largo de la vida de la rata, incluso después de la pérdida de la población de
fotorreceptores. Este estado inflamatorio afecta a la esclera, coroides y cuerpo ciliar.
4.- El exacerbamiento crónico de la respuesta inflamatoria inducido por lipopolisacárido
provoca la aceleración de procesos neurodegenerativos en la retina de un modelo de
retinosis pigmentaria.
CAPÍTULO 1
Retinal microglia are activated by systemic fungal infection
Maneu, V.1, 2; Noailles, A.3; Megías, J.4; Gómez-Vicente, V.3; Carpena,
N.4; Gil, ML.4; Gozalbo, D.4; Cuenca, N.3
1Departamento de Óptica, Farmacología y Anatomía, Universidad de Alicante, España.
2Instituto Teófilo Hernando de I+D del Medicamento, Universidad Autónoma de Madrid, España. 3Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante, España. 4Departamento de Microbiología y Ecología, Universitat de València, Burjassot, España.
Investigative Ophthalmology and Visual Science, 55(6), 3578–3585 (2014)
Retina
Retinal Microglia Are Activated by Systemic FungalInfection
Victoria Maneu,1,2 Agustina Noailles,3 Javier Megıas,4 Violeta Gomez-Vicente,3 Nuria Carpena,4
M. Luisa Gil,4 Daniel Gozalbo,4 and Nicolas Cuenca3,5
1Departamento de Optica, Farmacologıa y Anatomıa, Universidad de Alicante, Alicante, Spain2Instituto Teofilo Hernando de IþD del Medicamento, Universidad Autonoma de Madrid, Madrid, Spain3Departamento de Fisiologıa, Genetica y Microbiologıa, Universidad de Alicante, Alicante, Spain4Departamento de Microbiologıa y Ecologıa, Universitat de Valencia, Burjassot, Spain5Instituto multidisciplinar para el estudio del medio Ramon Margalef, Universidad de Alicante, Alicante, Spain
Correspondence: Victoria Maneu,Departamento de Optica, Farm-acologıa y Anatomıa, Pabellon 13,Universidad de Alicante, CarreteraSan Vicente del Raspeig s/n, 03690,San Vicente del Raspeig (Alicante);[email protected].
VM and AN contributed equally tothe work presented here and shouldtherefore be regarded as equivalentauthors.
Submitted: January 28, 2014Accepted: May 6, 2014
Citation: Maneu V, Noailles A, MegıasJ, et al. Retinal microglia are activatedby systemic fungal infection. Invest
Ophthalmol Vis Sci. 2014;55:3578–3585. DOI:10.1167/iovs.14-14051
PURPOSE. We determined whether systemic fungal infection could cause activation of retinalmicroglia and, therefore, could be potentially harmful for patients with retinal degenerativediseases.
METHODS. Activation of retinal microglia was measured in a model of sublethal invasivecandidiasis in C57BL/6J mice by confocal immunofluorescence and flow cytometry analysis,using anti-CD11b, anti-Iba1, anti-MHCII, and anti-CD45 antibodies.
RESULTS. Systemic fungal infection causes activation of retinal microglia, with phenotypicchanges in morphology, surface markers expression, and microglial relocation in retinallayers.
CONCLUSIONS. As an excessive or prolonged microglial activation may lead to chronicinflammation with severe pathological side effects, causing or worsening the course of retinaldystrophies, a systemic infection may represent a risk factor to be considered in patients withocular neurodegenerative diseases, such as diabetic retinopathy, glaucoma, age-relatedmacular degeneration, or retinitis pigmentosa.
Keywords: microglial activation, retina, infection, candidiasis
Microglial cells are part of the mononuclear phagocytepopulation of the central nervous system (CNS) and the
retina, and have a relevant role in both physiologic andpathologic conditions. In a healthy retina, microglia are in a‘‘resting state,’’ in which, while scanning the environment, theysecrete neurotrophic factors that support surrounding neurons’survival. After injurious stimuli, such as ocular infections,trauma, or neurodegeneration processes, microglial cellsacquire an activated state, in which they proliferate, migrateto damaged sites, undergo morphologic transformation intoamoeboidic phagocytes, and secrete molecules that initiatetissue repair mechanisms.1–4 Hence, at first stages of aneurodegenerative process, microglia initiate repair mecha-nisms and are considered to have a neuroprotective role. Onthe other hand, excessive or prolonged microglial activationleads to chronic inflammation, due to the continuous secretionof neurotoxic agents that cause severe pathologic side effects,retinal damage, and neuronal apoptosis.2,3,5
To date, several CNS injuries, such as infections, neurode-generative diseases, chemical injury, or aging, have beencorrelated with microglial activation and high levels ofproinflammatory cytokines.3,4,6,7 In Parkinson’s disease, thereis an increased number of activated microglia in the brain,accompanied by increased expression of proinflammatorycytokines.8,9 Also in Alzheimer’s disease, activated microgliahave been associated with the amyloid plaques in the brain.10,11
Moreover, microglial activation has been demonstrated inseveral other neurodegenerative diseases, such as amyotrophic
lateral sclerosis or Huntington’s disease.3 Retinal neurodegen-erative diseases are associated with chronic microglial activa-tion and neuroinflammation as well, as is the case for retinitispigmentosa,12 age-related macular degeneration (AMD),13,14 orglaucoma.15,16 In the degenerating retina, endogenous signalsactivate microglial cells leading to local proliferation, migration,enhanced phagocytosis, and secretion of cytokines, chemo-kines, and neurotoxins. These immunologic responses and theloss of limiting control mechanisms may contribute significant-ly to retinal tissue damage and proapoptotic events in retinaldegenerations.1,2,12
Therefore, it can be assumed that different stimuli thatinduce prolonged microglial activation can be potentiallyharmful for neuronal tissue. In this sense, systemic infectionscan induce microglial activation in the brain and may beconsidered as a risk factor in neurodegenerative diseases. It hasbeen described that microglia are the most abundant defensepopulation in the brain, showing a 3-fold increase after 7 daysof infection in a model of systemic invasive candidiasis.17 Thestudy of microglial homeostasis in the retina meets sometechnical limitations, such as the heterogeneous distribution ofmicroglial cells in the retinal tissue and the lack of experimentaltools, which prevent an accurate quantification and molecularanalysis of this specialized neuronal macrophage population.1
The aim of this work was to determine whether systemic fungalinfection might cause activation of retinal microglia to discernwhether it should be considered as a risk factor for patientsaffected with ocular neurodegenerative diseases.
Copyright 2014 The Association for Research in Vision and Ophthalmology, Inc.
www.iovs.org j ISSN: 1552-5783 3578
MATERIALS AND METHODS
Mice
Female C57BL/6J mice (8–10 weeks old) purchased fromHarlan Iberica (Barcelona, Spain) were bred and maintainedunder specific pathogen-free conditions at the University ofValencia animal facilities. The protocol was approved by theCommittee on the Ethics of Animal Experiments of theUniversity of Valencia (Permit Number, A1264596506468).All animals were handled in accordance with currentregulations for the use of laboratory animals (NationalInstitutes of Health [NIH], ARVO Statement for the Use ofAnimals in Ophthalmic and Vision Research, and EuropeanDirective 2010/63/UE) to minimize animal suffering and limitthe number used for the experiments.
Yeast Strain and Infection Model
Viable and inactivated Candida albicans ATCC 26555 yeastswere used. Yeasts were obtained as reported previously.18,19
Briefly, starved yeast cells were inoculated (200 lg, dry weight,of cells per mL) in a minimal synthetic medium and incubatedfor 3 hours at 288C to obtain yeasts. Only yeast cells withoutgerm tubes were observed at 288C. Viable yeasts wereresuspended in PBS at the desired concentration and used ininfection experiments (see below). For inactivation, yeast cellswere resuspended (20 3 106 cells/mL) in 4% (wt/vol)paraformaldehyde (fixation buffer; eBioscience, San Diego,CA, USA) and incubated for 1 hour at room temperature. Aftertreatment, fungal cells were washed extensively in PBS andbrought to the desired cell density in PBS. For infection assays,mice were injected (day 1) with a sublethal dose (6 3 105
viable yeasts in 100 lL of PBS) of C. albicans, by intravenousadministration, according to the method described previouslyby our group.20,21 Alternatively, mice were injected with threedoses of 10 3 106 inactivated yeasts on days 1, 2, and 3. In bothcases the retinas were analyzed on day 4. Untreated mice wereused as controls.
To assess C. albicans invasion of retinal tissue in infectedanimals, retinal cryosections were stained with CalcofluorWhite M2R 0.1% (Sigma-Aldrich, Munich, Germany) for 15minutes, coverslipped, and observed under a fluorescencemicroscope. Alternatively, whole retinas were dissociated,resuspended in 100 lL of PBS, plated in Sabouraud-Dextroseagar, and cultured for 48 hours at 378C to allow colonyformation.
Immunohistochemistry
For immunohistochemistry assays, enucleated eyes were fixedusing 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer pH 7.4(PB), for 1 hour at room temperature. To maintain retinalorientation, a suture was placed on the superior pole of eacheye before enucleation. Following several washes with PB, theeyes sequentially were cryoprotected in 15% and 20% (wt/vol)sucrose for 1 hour, and 30% sucrose overnight. Next day, thecornea, lens, and vitreous were dissected out, and the eyecupswere embedded in Tissue-Tek (Sakura Finetek, Torrance, CA,USA), and frozen in liquid N2. Then, 16-lm vertical retinalcryosections along the nasotemporal axis were mounted onslides (Superfrost Plus; Menzel GmbH & Co. KG, Braunsch-weig, Germany), washed, and incubated with blocking solution(5% normal donkey serum in PB containing 0.5% Triton X-100)for 1 hour at room temperature. Immunostaining with acocktail of mouse anti-MHC class-II RT1B monoclonal antibody,1:50 (clone OX-6; AbD Serotec, Kidlington, United Kingdom),and rabbit anti-Iba1 polyclonal antibody, 1:500 (Wako Chem-
icals, Neuss, Germany) was performed overnight at roomtemperature in a wet chamber. After incubation with theprimary antibody, retinal sections were washed and incubatedin a mix of secondary antibodies: Alexa Fluor 555-conjugateddonkey anti-mouse IgG (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)and Alexa Fluor 488-conjugated donkey anti-rabbit IgG, both ata 1:100 dilution, for 1 hour. Finally, the sections were washedand mounted with Citifluor (Citifluor Ltd., London, UK) forvisualization under a laser scanning confocal microscope (TCSSP2; Leica Microsystems, Wetzlar, Germany). Immunohisto-chemical controls were performed by omission of either theprimary or the secondary antibodies. Only retinal sections thatcontained the optic nerve were used for cell scoring.
Flow Cytometry Analysis
First, the eyes were enucleated and the retinas were dissectedcarefully. Retinas were placed in 1 mL of PBS buffer and weredisaggregated by gently pipetting up and down. The cellsuspension was filtered through a 30-lm filter from BDBiosciences (San Diego, CA, USA) to avoid cell clumps.Disaggregated cells were labelled with rat FITC- or APC-conjugated anti-CD11b antibody at 1:200 dilution (Clone M1/70; eBioscience). For the detection of microglial activation,disaggregated retinal cells were triple-stained with a cocktail ofrat APC-conjugated anti-CD11b antibody, PE-conjugated anti-MHC class II antibody (clone M5/114.15.2; Milteny Biotec,Bergish Gladbach, Germany) and FITC-conjugated anti-mouseCD45 (clone 104.2, Milteny Biotec). Labelled cells from eachmouse retina were analyzed separately. Analyses were per-formed in a FACSCanto cytometer (BD Biosciences) and thedata were analyzed with FACSDiva software (BD Biosciences).To quantify the area corresponding to retinal microglial cells indensity plots, CD11b-positive cells were represented inforward scatter (FSC)-FITC and the total area was measuredfor each retinal sample.
Statistical Analysis
All experiments were performed in at least three animals.Student’s t-test was applied using GraphPad software (Graph-Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Results are expressedas mean 6 SD, and P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001 values wereconsidered significant.
RESULTS
In control mice, microglial cells labelled with anti-Iba1antibody appeared with the usual morphology of restingmicroglia in a healthy retina (Figs. 1A, 1C, 1G, 1I). Thesequiescent cells had a small, round soma with various branchingprocesses and showed no reactivity against MHC class IIantibody (Figs. 1B, 1C, 1H, 1I). Regarding cell distribution,microglial cells were located mainly in the inner plexiformlayer (IPL) and the outer plexiform layer (OPL) in control mice(Figs. 1A–C, 1G–I).
In the retinas of infected mice, after three days of infection,ramified cells experienced a transformation through gradationsof ‘‘activated’’ states, exhibiting changes in shape anddistribution: the cellular soma was enlarged, showing coarseand swollen appearance, processes were shortened andthickened with little branches (Figs. 1D–F, 1J–L). Some of themicroglial cells showed an amoeboid shape (Figs. 2A–C). Inthese retinas, microglial cells were immunoreactive to anti-MHC class II antibody, which colocalized with Iba1 in mostcells (Figs. 1E, 1F, 1K, 1L). Specifically, we found colocalizationof Iba1 and MHCIIRT1B antibodies in all amoeboid cells,
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FIGURE 1. Confocal immunoflouorescence images of retinal microglial cells from C57BL/6J mice from a control mouse showing typical ramifiedmorphology (A–C, G–I) and a mouse infected with viable yeasts of C. albicans ATCC26555 by intravenous administration showing activatedmicroglia with enlarged soma and short, thick processes (D–F, J–L). Retinal sections were stained with anti-Iba1 antibody (A, D, G, J), anti-MHCclass-II RT1B antibody (B, E, H, K), or both (C, F, I, L) showing the coexpression of MHC class-II RT1B and Iba1 in microglial cells of infected retinas.Arrows indicate microglial cell soma. Arrowheads point to nonspecific immunostaining of vessels with the secondary antibody. IS, inner segments,GCL, ganglion cell layer. Scale bars: 20 lm (A–F), 10 lm (G–L).
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including amoeboid microglial cells surrounding blood vessels(Figs. 2A–C).
In infected mice, microglial cells were detected not only inthe plexiform layers of the retina, but also in the nuclear layers,the outer nuclear layer (ONL), and the inner nuclear layer (INL;Figs. 1D–F, 1J–1L). Amoeboid microglial cells were observed in
the ONL, between the outer segments (OS) and the RPE, andsurrounding blood vessels (Figs. 2A–C). We also found Iba1þ/MHCIIRT1Bþ amoeboid microglial cells in the IPL (Figs. 2D–F),and Iba1þ cells getting out of blood vessels (Figs. 2G–I). Cellswithin the blood vessels appeared as Iba1þ/MHCIIRT1B�,while the ones within the retinal tissue were Iba1þ/
FIGURE 2. Distribution and morphology of microglial cells in the retinas of infected mice. Retinal sections were immunostained with anti-Iba1antibody (A, D, G, J), anti-MHC class-II RT1B antibody (B, E, H, K), or both (C, F, I, L). Arrowheads (A–C) and arrows (A–C) detail the characteristicmorphology of Iba1 and MHCII double positive microglial cells in infected animals, with amoeboid or ovoid forms that were widely distributed in allretinal layers. Small arrows (A–C) point to Iba1þcells that surrounded blood vessels. Small arrows (D–F) point to Iba1þcells leaving blood vesselsand getting into the retinal tissue. Arrows (D–F) mark the nonspecific immunostaining of blood vessels with the secondary antibody. Thearrowhead (D–F) points to an Iba1þ/MHCIIþ microglial cell with a typical activated morphology. The arrowhead (G–I) points to an Iba1þ cellwithin a blood vessel observed in a transversal section. Small arrows (G–I) point to immunoreactive cells that seem to be perivascular macrophagesas described by Guillemin and Brew.25 Arrows (G–I) mark the nonspecific immunostaining of blood vessels with the secondary antibody. The small
arrow (J–L) details the part of an immunopositive Iba1 microglial cell that was leaving a blood vessel. The arrowhead (J–L) points to the part of thesame microglial Iba1þ cell that still was into the blood vessel. Arrows (J–L) mark the nonspecific immunostaining of blood vessels with thesecondary antibody. Scale bars: 20 lm (A–C), 10 lm (D–L).
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MHCIIRT1Bþ (Figs. 2D–F). Microglial Iba1þ and MHCIIRT1Bþprocesses can be observed around the blood vessels in Figures2G through 2I and in Figures 2J through 2L.
In flow cytometry analyses, the whole microglial popula-tion of the retina was identified by its immunoreactivity againstCD11b antibody in control and infected mice (Fig. 3A). Tripleimmunostaining showed a significant increase in the expres-sion of MHCII and CD45 antigens in microglial cells of infectedmice (1.91- and 3.22-fold increase in fluorescence meanintensity respectively; Figs. 3A, 3B), as well as an increase inthe CD11b fluorescence mean intensity value (3.13-fold) withrespect to the mean value in control mice (Fig. 3B). In infectedmice, a CD11bþ CD45þþ population was observed. Microgliaactivated state also was detected by quantifying the area of theretinal microglial cell population identified in FSC-CD11b-FITCdensity plots. In control mice, CD11b-positive cells appearedas a homogeneous population in FSC-CD11b-FITC dot and
density plots, while retinal microglia of infected mice appearedas a much more heterogeneous population. The area value ofactivated microglia in infected mice was 3.5-fold increasedwith respect to control (Fig. 3C).
The percentage of CD11b cells was increased in the retinasof infected mice. As deduced by the flow cytometry analysis,the microglial population in control mice constituted 0.10% 60.07% of total cells analyzed, whereas in infected mice theCD11b-positive population raised to 0.61% 6 0.01% (Fig. 3A).In agreement with the flow cytometry data, the immunohis-tochemistry also revealed an increase in microglial cell number,as the number of Iba1þ cells per retinal section was 10.1 6 1.4in control mice versus 13.9 6 0.9 in infected mice (Fig. 4A). Aquantitative analysis of immunohistochemical sections showedthat the number of Iba1þ cells associated with blood vesselswas 26.7% in infected mice, while in control mice no Iba1þcells were associated with vessels (Fig. 4B).
FIGURE 3. Effect of fungal systemic infection on mouse retinal microglia, assessed by flow cytometry. (A) Retinal cells from C57BL/6J control andinfected mice were triple labelled with a cocktail of APC-conjugated anti-CD11b, PE-conjugated anti-MHC class-II, and FITC-conjugated anti-mouseCD45 antibodies, and analyzed by flow cytometry (106 cells were analyzed in each assay). The CD11b-positive cells were gated (the percentage ofgated cells is indicated). Double plots of CD11bþ cells presenting CD11b/MHCII and CD11b/CD45 double staining are shown in each case. Resultsshow data from a single experiment representative of eight independent assays. (B) Histograms showing mean fluorescence intensity values ofmicroglial cells (CD11b-positive population) labeled with anti-CD11b, anti-MHCII, and anti-CD45 antibodies (106 cells were analyzed in each assay)from control and infected mice. (C) Contour plots representing FSC against CD11b expression of gated cells. Results show data from a singlerepresentative experiment. Histograms show mean values 6 SD of the CD11b-positive population area delimited in FSC-CD11b contour plots. **P <0.01, ***P < 0.001, Student’s t-test.
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In the ciliary body of control mice, we found Iba1þ/MHCII�cells with ramified morphology (Figs. 5A, 5B), while in infectedmice some Iba1þ/MHCIIþ cells with a typical activatedamoeboid morphology were found (Figs. 5C, 5D). Also, inthe ciliary body of infected mice, blood-borne monocytes werefound within blood vessels (Figs. 5E, 5F). A significant increasein the number of Iba1þ cells was observed in the ciliary bodyof infected animals (12.9 6 0.1 cells/ciliary body section)compared to untreated controls (8.8 6 0.8 cells/ciliary bodysection, Fig. 4C).
The injection of three doses of 10 3 106 inactivated yeastson days 1 to 3 did not elicit a significant increase in the retinalmicroglia population. The FITC-CD11b fluorescence meanvalue appeared similar to the one in control, uninjected mice(not shown).
In our conditions, we could not detect C. albicans invasionof retinal tissue, neither by Calcofluor White M2R staining ofretinal sections nor by incubating retinal tissue of infectedmice in Sabouraud-Dextrose plates for 48 hours.
DISCUSSION
We studied the effect of a systemic fungal infection on retinalmicroglia in a mouse model of systemic candidiasis usedpreviously in our laboratory.20,21 The microglia population wasidentified by its immunoreactivity against Iba1 protein, as it islocalized specifically in microglia and not found in neurons,astrocytes, or oligodendroglia.22,23 The MHC class II antigensand the leukocyte common antigen CD45 were used to detectmicroglial activated states, as their upregulation is well knownto occur in an activated state.24–27 In control mice, microglialcells appeared with the characteristic morphology, reactivity,and distribution of microglial cells in a healthy state,2 whilemicroglia in the retinas of infected mice appeared in a greaternumber and with different activated states, from cells withenlarged soma, shortened and thickened processes to cellswith a real amoeboid shape; thus, in accordance with anadvanced activation stage, in which microglia turn intophagocytic microglia, morphologically defined by the com-plete absence of cellular processes.1,2
Hence, our observations indicated that a systemic fungalinfection causes retinal microglia activation and an increase ofmicroglial cells in the retina. Our result is in agreement with arecent publication by Zinkernagel et al.,28 who found thatsystemic cytomegalovirus infection caused migration move-ments of the microglial cells in the retina, also showing signs ofmorphologic activation.28
The increased microglial cell number in infected mice canbe due to the proliferation of retinal microglia and/or thearrival of infiltrating macrophages, as proliferation and thearrival of new blood-derived precursors that transform into
phagocytes have been described in pathological situa-tions.1,29–38 Zinkernagel et al.28 conclude that the increasednumber of retinal microglia cells after a systemic cytomegalo-virus infection, can be attributable just to proliferation in situ.Although the increase in the CD11bþ, MHCIIþ, and CD45þpopulations we observed in infected mice also could beconsistent with microglial proliferation, the appearance of ahigh-expressing CD45 population in infected mice favors thearrival of macrophages or infiltrating perivascular microglialcells.25,39 This is supported further by immunohistochemicalanalyses, as some of Iba1-expressing cells appeared associatedwith blood vessels and a number of these seemed to be gettingout of the vessels to reach the retinal tissue. In some cases,Iba1 and MHCII double positive cells were observed aroundblood vessels, probably corresponding to perivascular macro-
FIGURE 4. Histograms showing (A) Iba1þcells associated with vessels in infected and control animals, (B) Iba1þcells per mm2 of retina from retinalsections around the optic nerve head, and (C) total Iba1þ cell number in the ciliary body of control and infected mice. **P < 0.01, Student’s t-test.
FIGURE 5. Confocal immunoflouorescence images of Iba1þ cells in theciliary body from a C57BL/6J control mouse (A, B) and a mouseinfected with viable yeasts of C. albicans ATCC26555 (C–F). Sectionswere stained with anti-Iba1 and anti-MHCII RT1B antibodies (A, C, E),or anti-MHCII RT1B antibody (B, D, F). Arrows (C–F) point to MHCIIþmicroglial cells. (E, F) Detail of a ciliary body of an infected mouse.Arrows point to Iba1þ/MHCIIþ cells within blood vessels. Scale bars:20 lm.
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phage cells.24,25,39 Moreover, we observed a statisticallysignificant increased Iba1þ population in the ciliary body ofinfected mice, some of them within blood vessels, whichsupports the idea of the presence of blood-borne macrophag-es.31
The fact that inactivated yeasts did not elicit a significantincrease in the retinal microglia population showed that onlyviable microorganisms and not inactivated yeasts causemicroglial activation, probably due to a rapid clearance ofinactivated yeasts by phagocytotic cells.
We could not detect C. albicans invasion of retinal tissue,which supports the idea that the activation of retinal microglialcells is due to a massive cytokine production that occursduring systemic infections. This finding is in agreement withthat of Gallego et al.,16 who showed in a mouse model ofglaucoma that, after inducing ocular hypertension with laser inone eye, the glial cells in the contralateral eye also appearedactivated, maybe by immunologically mediated processes.However, a possible direct interaction of microglia withcirculating soluble fungal ligands, such as b-glucan andmannan,40 also may contribute to their activation.
As is well known, toll-like receptors (TLRs), mainly TLR2and TLR4, are critical for cytokine production in response toC. albicans, and Dectin-1, the b-glucan receptor, is requiredfor phagocytosis of fungal cells, and also collaborates withTLR2 in cytokine production.41,42 Retinal microglia, likemicroglia of the CNS and other immune cells, probablyrecognize pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)through TLRs and Dectin-1. Several studies have shown thatTLRs and Dectin-1 have an important role in microglial-mediated neuroinflammation and CNS injury followinginfection; b-glucan activates CNS microglia in a Dectin-1-dependent manner, suggesting that this receptor may have animportant role in antifungal immunity in the CNS.43,44
Moreover, we have demonstrated previously that TLR2 andDectin-1 are expressed in mouse retinal microglia, and thatDectin-1 is involved in the phagocytosis of C. albicans.45
Therefore, the possibility that fungal-derived ligands causemicroglia activation following direct recognition by PatternRecognition Receptors should not be ruled out.
Although microglial activation is associated commonly withneuroprotection, excessive or prolonged activation may lead tochronic inflammation, with severe pathologic side effects.5,46
In the retina, chronic microglia activation has been related tovarious neurodegenerative diseases, likely contributing toretinal tissue damage and proapoptotic events.1,2 Despite itsrelevance, the study of microglial homeostasis in the retina hasthe challenge of the lack of experimental tools to analyze itsactivation in a simple and rapid way. In this work, we describedthe retinal microglial activation induced by systemic infectionusing immunohistochemistry and flow cytometry analysis.Previous reports have shown that microglia in the brain can beactivated by systemic fungal infections,17 as well as bysystemically administered LPS47,48 and systemic viral infec-tions.28 Our results showed that a systemic infection by C.
albicans greatly activates microglia in the retina, as indicatedby the changes in microglial cell morphology and distribution;upregulation of MHC class II and CD45, as well as CD11bantigens; and increase of the microglial population. Further-more, our results demonstrated that quantifying the areacorresponding to retinal microglial cells in FSC-CD11b-FITCdensity plots constitutes a useful tool to detect microglialactivation.
In conclusion, we have demonstrated that a systemic fungalinfection activates the microglia in the retina, indicating that itmay be considered as a risk factor for patients affected withocular neurodegenerative diseases, such as diabetic retinopa-thy, glaucoma, AMD, or retinitis pigmentosa.
Acknowledgments
The authors thank the Servicio Central de Soporte a laInvestigacion Experimental (SCSIE) of the University of Valencia,for technical assistance.
Supported by project grants from the Spanish Ministry of Economyand Competitiveness-FEDER BFU2012-36845, Instituto de SaludCarlos III RETICS RD12/0034/0010, and ONCE (NCu); Instituto deSalud Carlos III PI080556 (DG); and MICINN-Juan de la CiervaPostdoctoral Fellowship JCI-2009-05224 (VG-V).
Disclosure: V. Maneu, None; A. Noailles, None; J. Megıas, None;V. Gomez-Vicente, None; N. Carpena, None; M.L. Gil, None; D.Gozalbo, None; N. Cuenca, None
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CAPÍTULO 2
Microglia activation in a model of retinal degeneration and TUDCA neuroprotective
effects
Noailles, A.1; Fernández-Sánchez, L.1; Lax, P.1; Cuenca, N.1
1Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante, España.
Journal of Neuroinflammation, 11, 1–15 (2014)
JOURNAL OF NEUROINFLAMMATION
Noailles et al. Journal of Neuroinflammation 2014, 11:186http://www.jneuroinflammation.com/content/11/1/186
RESEARCH ARTICLE Open Access
Microglia activation in a model of retinaldegeneration and TUDCA neuroprotective effectsAgustina Noailles1, Laura Fernández-Sánchez1, Pedro Lax1 and Nicolás Cuenca1,2*
Abstract
Background: Retinitis pigmentosa is a heterogeneous group of inherited neurodegenerative retinal disorderscharacterized by a progressive peripheral vision loss and night vision difficulties, subsequently leading to centralvision impairment. Chronic microglia activation is associated with various neurodegenerative diseases includingretinitis pigmentosa. The objective of this study was to quantify microglia activation in the retina of P23H rats, ananimal model of retinitis pigmentosa, and to evaluate the therapeutic effects of TUDCA (tauroursodeoxycholic acid),which has been described as a neuroprotective compound.
Methods: For this study, homozygous P23H line 3 and Sprague-Dawley (SD) rats were injected weekly with TUDCA(500 mg/kg, ip) or vehicle (saline) from 20 days to 4 months old. Vertical retinal sections and whole-mount retinaswere immunostained for specific markers of microglial cells (anti-CD11b, anti-Iba1 and anti-MHC-II). Microglial cellmorphology was analyzed and the number of retinal microglial was quantified.
Results: Microglial cells in the SD rat retinas were arranged in regular mosaics homogenously distributed withinthe plexiform and ganglion cell layers. In the P23H rat retina, microglial cells increased in number in all layerscompared with control SD rat retinas, preserving the regular mosaic distribution. In addition, a large number ofamoeboid CD11b-positive cells were observed in the P23H rat retina, even in the subretinal space. Retinas ofTUDCA-treated P23H animals exhibited lower microglial cell number in all layers and absence of microglial cellsin the subretinal space.
Conclusions: These results report novel TUDCA anti-inflammatory actions, with potential therapeutic implicationsfor neurodegenerative diseases, including retinitis pigmentosa.
Keywords: Glia, Retinitis pigmentosa, Neuroprotection, Confocal microscopy
BackgroundRetinitis pigmentosa (RP) is a type of hereditary retinaldegeneration with high levels of clinical and genetic het-erogeneity. This neurodegenerative retinal disorder ischaracterized by a primary degeneration of the photo-receptor rods causing peripheral vision loss and nightblindness. With the progression of the disease only thecone cells of the fovea remain functional, leading to aclassical tunnel vision. In the end stage of the diseasewith the dysfunction of all cone cells, the central visualfield degenerates and leads to a complete blindness. It iscurrently known that more than 100 different mutations
* Correspondence: [email protected], Genetics and Microbiology, University of Alicante, San VicenteUniversity Campus, E-03080 Alicante, Spain2Multidisciplinary Institute for Environmental Studies ‘Ramon Margalef’,University of Alicante, Alicante, Spain
© 2014 Noailles et al.; licensee BioMed CentraCommons Attribution License (http://creativecreproduction in any medium, provided the orDedication waiver (http://creativecommons.orunless otherwise stated.
in the rhodopsin-encoding gene (RHO) are related with30 to 40% of autosomal dominant cases. The Pro-23-Hismutation is the most prevalent cause of RP [1], beingthe genetic cause of about 15% of autosomal dominantRP cases in the United States [2]. It is currently knownthat the P23H mutation causes misfolding and retentionof rhodopsin in the endoplasmic reticulum [3]. Othersstudies suggest that the mechanism of RP involves cellularstress, inflammatory response, retinal remodeling, and thefinal common pathway of programmed photoreceptorcell death or apoptosis [4-6]. Similar mechanisms wereinvolved in other retinal degenerations like glaucoma,diabetic retinopathy or macular degeneration [6].Microglial cells act as the resident immune cells of the
central nervous system (CNS), including the retina, play-ing the role of primary mediators of inflammation. In the
l Ltd. This is an Open Access article distributed under the terms of the Creativeommons.org/licenses/by/4.0), which permits unrestricted use, distribution, andiginal work is properly credited. The Creative Commons Public Domaing/publicdomain/zero/1.0/) applies to the data made available in this article,
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absence of disease, microglial cells exhibit a ramifiedmorphology with a small, round soma, and variousbranching processes and play critical functions inaxonal growth, synaptic remodeling and neuronal sur-vival via phagocytosis of cellular debris and relief of avariety of cell signaling factors [7,8]. In response tonegative stimulus, tissue injury or free radicals, micro-glial cells assume a reactive state, characterized by ashortening and widening of microglial processes [9].These reactive microglial cells can progress into phago-cytic microglial cells. In this amoeboid form, microglialcells lack cellular processes and perform characteristicmacrophage functions. Activated microglial cells havebeen observed in mouse models of autosomal recessiveRP [10,11], in rds mice [12] and in rat models of inheritedretinal degeneration, including Royal College of Surgeonsrats [13].Activated microglial cells are able to generate trophic
biomolecules, glutamate transporters and antioxidantsthat promote the correct neuronal functioning. But, like-wise, activated microglial cells are capable of producingpotentially neurotoxic substances such as nitric oxide(NO) and pro-inflammatory cytokines (IL-1α, IL-1β, TNF-α,IFN-γ, IL-6, and so on) that are involved in neurologicaldiseases and CNS disturbances, like infections or chemicaldamage and aging [14-17].In retinal neurodegenerative diseases, chronic micro-
glial activation and neuroinflammation are commonphenomena. In RP, the primary death of rod photorecep-tors triggers the activation of microglial cells and theirmigration to the outer retina to eliminate cellular debris.It has been proposed that these activated microglial cellsmay release cytotoxic factors such as NO that kills adja-cent photoreceptors, including cones [18]. In age-relatedmacular degeneration, previous studies show that micro-glial cells become pathogenic with age, causing a chronicactivation that will influence the health of retinal tissue[19,20]. Microglial cells also play a critical role in the pro-gression of glaucoma. Many studies show that the number,morphology, distribution and antigen-presenting activityof microglial cells change in glaucomatous eyes highlight-ing their importance in the pathological process [21-23].In experimental models of diabetic retinopathy, microglialcells also appear altered suggesting that the activationprocess is underway. However, it is actually unknownwhat degree of this activation is due to resident microglialcells of the retina or to circulating monocytic cells [24].Due to this duality, the function(s) performed by micro-
glia in regulation of injured neurons remain uncertain.Numerous studies suggest that microglial activation isharmful for neuronal survival, showing that the inhibitionof microglial activation and cytokine secretion causes a re-duction of neuronal loss [25,26]. However, other researchmakes evident the neuroprotective effect of microglial
activation [27,28]. Some research support that the trophicand toxic effectors in microglia are controlled differen-tially depending on the severity of neuronal lesion [29].Under pathological conditions, microglial cells of theretina are subjected to various kinds of endogenous andexogenous signals. These stimuli trigger local proliferationand changes in shape and morphology. Also, microglialcells alter their location in the retinal tissue, cytokine re-lease pattern and expression of surface molecular markers.These characteristic immunological reactions and theabsence/failure of the self-regulation engine may leadto an increase of retinal damage and pro-apoptoticevents [10,18,30].In this study, we address the hypothesis that the
neuroprotective compound, tauroursodeoxycholic acid(TUDCA), is able to prevent microglial activation,modify its expression pattern and delay the photoreceptorcells loss in an animal model of RP. We have employed inour study, P23H and Sprague-Dawley (SD) rats to assessthe therapeutic potential of TUDCA on photoreceptordegeneration and functional activity of the retina in theseanimal groups.
MethodsAnimalsHomozygous P23H line 3 rats, obtained from MatthewLaVail [31], were used in this study as a model of RP.Age-matched wild-type SD rats (Harlan, IN, USA) wereused as control. All animals were housed in cages undercontrolled photoperiod (12 hours light/12 hours dark),temperature (23°C ±1°C) and humidity (55 to 60%). Foodand water were available ad libitum. All animals werehandled in accordance with current regulations for theuse of laboratory animals (NIH, ARVO and EuropeanDirective 2010/63/UE) in order to minimize animal suf-fering and limit the numbers used for the experiments.The study had the approval of the Research EthicsCommittee of the University of Alicante.
TUDCA treatmentTUDCA, purchased from Calbiochem (Gibbstown, NJ,USA), was dissolved in physiological saline (0.9% NaCl)just before administration by using an ultrasonic bath toavoid bubble formation. TUDCA was administered weeklyto P23H line 3 rats (n = 6) at 500 mg/kg (intraperitoneally,ip) from P (postnatal day) 20 to P120, when these animalscan be considered to have undergone extensive retinal de-generation [31-34]. Untreated P23H rats (n = 6) receivedthe same volume of saline at the same time points. Inorder to adjust the amount of TUDCA and vehicle admin-istered, the animal body weight was measured before eachdrug injection. Likewise, SD rats (n = 4) received a weeklyinjection of saline according to their weight.
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Retinal immunohistochemistryHistological studies of the retinas were performed atP120. Cryostat vertical sections and retinal whole-mounts were obtained and processed for immunola-beling following well established procedures [35-38].Animals were sacrificed in the morning by administrationof a lethal dose of pentobarbital. After marking the dorsalmargin of the limbus with a suture, eyes were enucleatedand fixed in 4% (w/v) paraformaldehyde during 1 hour atroom temperature (RT). After being washed in 0.1 Mphosphate buffer pH 7.4 (PB), eyes were cryoprotectedsequentially in 15, 20 and 30% sucrose. The cornea, lensand vitreous body were removed, and the eyecups wereprocessed for vertical sections and whole-mounts.For whole-mounts immunohistochemistry we utilized
immunoperoxidase labeling. After fixation, retinas weredissected out from choroid and flat-mounted on anitrocellulose filter, with the photoreceptor layer sideup. Endogenous peroxidase activity was suppressed byimmersion in 1% H2O2 (Sigma, St. Louis, MO, USA) inPB (10 minutes, RT). In order to break aldehyde bondsand enhance the permeability of the tissue, the retinaswere incubated first in 2.28% sodium m-periodate (Sigma,St. Louis, MO, USA) in PB (5 minutes, RT) and then in0.02% sodium borohydride (Panreac, Barcelona, Spain) inPB (5 minutes, RT). After a blocking step (10% normalgoat serum in PB plus 0.5% triton X-100 for 1 hour), ret-inas were incubated for 3 days at 4°C under agitation withthe primary antibody: mouse anti-rat integrin alpha M(CD11b) clone OX-42 (1:500; Chemicon, Temeluca, CA,USA), Retinas were washed 4 times in PB (5 minutes, RT)and then incubated for 1 day at 4°C in biotinylated goatanti-rabbit secondary IgG antibody at 1:100 dilution in PBplus 0.5% triton X-100. The retinas were washed be-fore transferring to a solution of avidin-biotin-peroxidasecomplex (ABC) (Elite ABC kit, Vector Laboratories Ltd,Cambridgeshire, UK) in PB containing 0.5% triton X-100for 1 day. Finally, the retinas were washed in PB and pre-incubated under agitation in the dark with 3,3′-diamino-benzidine tetrahydrochloride (DAB, Sigma, St. Louis, MO,USA; 0.5 mg/ml in PB) for 15 minutes and further incu-bated with fresh DAB solution with 0.033% H2O2 and0.025% ammonium nickel (II) sulfate hexahydrate (Sigma,St. Louis, MO, USA). Washing with distilled water stoppedthe DAB reaction. Whole retinas were flat-mounted inCitifluor (Citifluor Ltd; London, UK) with the ganglionlayer side up, and coverslipped for optical microscopyviewing on a Leica DMR microscope (Leica Microsystems,Wetzlar, Germany).For immunofluorescence imaging, vertical sections
were made. Eyecups were embedded in Tissue-Tek OCT(Sakura Finetek, Zoeterwouden, Netherlands) and frozenin liquid N2. Sixteen-micrometer-thick sections wereobtained at −25°C, mounted on slides (Superfrost Plus;
Menzel GmbH and Co. KG, Braunschweig, Germany) andair-dried. Before further use, slides were thawed andwashed 3 times in PB and treated with blocking solution(10% donkey serum, 0.5% triton X-100 in PB) for 1 hour.Sections were subjected overnight at room temperatureto single or double immunostaining with the primaryantibodies: polyclonal rabbit anti-ionized calcium-bindingadapter molecule 1 (Iba1, 1:1,000; Wako Chemicals,Richmond, VA, USA) and mouse anti-major histocom-patibility complex (MHC) class II RT1B clone OX-6(1:200, AbD Serotec, Kidlington, UK), diluted in PB plus0.5% triton X-100. The secondary antibodies used weredonkey anti-mouse or anti-rabbit IgG conjugated to AlexaFluor 488 or 555 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)at a 1:100 dilution. Images were finally obtained undera Leica (Wetzlar, Germany) TCS SP2 confocal laser-scanning microscope. The spatial resolution employedwas 1,024 × 1,024, the pinhole was set at 1 airy units (AU)and Z stacks were made with 15 pictures (1.5 μm steps).All stacks were collected using a x40 objective and theacquisition rate was 16 frames per second. Final imagesfrom SD and P23H groups were processed in parallelusing Adobe Photoshop 10 software (Adobe SystemsInc., San Jose, CA, USA). A subset of vertical sectionswas stained by immunoperoxidase labeling.
Analysis of microglia cell number and morphologyMorphology, spatial distribution and mean number ofmicroglial cells were analyzed in the inner and outer plexi-form layers (IPL, OPL), the ganglion cell layer (GCL) andthe subretinal space (SS) of whole-mount retinas. Macro-phages detected in the GCL during the analysis were alsoaccounted. Four to six retinas from each animal group(TUDCA-treated, untreated and SD animals) were exam-ined. In each retina, 12 representative regions of 0.227 mm2
each were analyzed, 6 regions equidistantly arranged on thesuperior-inferior axis of the retina and 6 fields disposed onthe temporal-nasal axis; thus sampling representative per-ipheral, medial and central areas of the superior, inferior,temporal and nasal quadrants of each retina. In each of the12 regions analyzed in each retina, every one of the cellbodies labeled with immunoperoxidase in each of the 3layers analyzed was manually traced using a cameralucida attached to the Leica DMR microscope (LeicaMicrosystems, Wetzlar, Germany). Each retinal layer wasdetermined according to the vascular stratification of theretinal tissue. The images created were subsequently digi-tized using the image-editing software Photoshop (AdobeSystems Inc., San Jose, CA, USA). The distribution patternof microglial cells in each retinal layer was assessed bymeasuring the distances to the nearest neighbors of eachmicroglial cell using ImageJ software [39]. The distancesto the nearest neighbors were classified in histograms, sta-tistically analyzed and compared with a nearest neighbor
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analysis of a random pattern of the same density andstandard deviation [39,40]. For nearest neighbor distanceanalysis we used images collected from the medial area ofthe retina (superior quadrant).To analyze microglial activation in each animal group,
we used cryostat vertical retinal sections immunostainedwith Iba1 and MHC-II. We examined three verticalsections non-consecutive per animal and we studiedsix animals per experimental group. All the imagesanalyzed were collected from the central area of theretina, close to the optic nerve. In every retinal sec-tion, the total number of microglial cells expressingone or both markers (Iba1+/MHC-II−, Iba1−/MHC-II+
and Iba1+/MHC-II+) was counted using light micros-copy at x63 magnification. The obtained data were re-ferred to the length of each retinal section, measuredusing the ImageJ software.
Statistical analysisStatistical analyses were performed using the GraphPadsoftware from Prism (La Jolla, CA, USA), in order toevaluate differences between SD, P23H untreated andP23H TUDCA-treated rats. A one-way ANOVA wasused to evaluate differences in the mean number ofmicroglial cells, and a two-way ANOVA was performedto compare the number of microglial cells correspondingto each one of the three expression patterns analyzed(Iba1+/MHC-II−, Iba1−/MHC-II+ and Iba1+/MHC-II+).When a 0.05 level of significance was found, post hocpairwise comparisons using Bonferroni’s test wereperformed. Normal distributions and homogeneity ofvariance were found for all analyzed categories. Valuesof P <0.05 were considered statistically significant. Datawere plotted as the average ± standard error of themean (SEM).
Figure 1 Distribution and morphology of microglial cells in Sprague-Dimmunolabeled with CD11b (OX-42). Note the presence of amoeboid CD1subretinal space. GCL, ganglion cell layer; IPL, inner plexiform layer; INL, innScale bar: 10 μm.
ResultsDistribution and morphology of retinal microglia in SDand P23H ratsMicroglial cells were identified by specific labeling withCD11b, a constitutive marker of microglia and macro-phages. In normal SD rat retinas, microglial cells weredistributed in a plexus located at the inner and outerplexiform and ganglion cell layers (Figure 1A). Microgliain SD retinas showed a tiny cell soma, little perinuclearcytoplasm, and a large number of fine, branched processescovered in numerous projections. In the ganglion celllayer, few CD11b-positive cells with amoeboid morph-ology were also found.In the untreated P23H rat retina, an increase in micro-
glial cell number was found compared with control SDrat retinas (Figure 1B). Moreover, numerous amoeboidCD11b-positive cells were observed in all retinal layers,with greater presence in IPL, OPL and the space that liesbetween the photoreceptors and the RPE, the SS. Themost apparent morphologic features of amoeboid CD11b-positive cells were scarce short and thick primary and ter-minal processes and enlarged soma. In P23H rats treatedwith TUDCA, amoeboid CD11b-positive cells were lessabundant than in untreated P23H rats in all layers of theretina, with absence of microglial cells into the SS. Also,the microglial morphology of P23H-treated group wasmost closely related with SD control group than withnon-treated P23H group. Figure 2 shows a schematicrepresentation of the distribution and morphology ofmicroglial cells in SD, P23H-untreated and P23H TUDCA-treated rats.Figure 3 illustrates the presence of microglia into the SS
of untreated P23H rats (Figure 3B). Nearly all microglialcells found in this stratum showed morphologic featuresof amoeboid CD11b-positive cells. These microglial cellsprobably reach the retina from the sclera and are not
awley (SD) (A) and P23H (B) rats. Retinal vertical sections were1b-positive cells in different layers of the P23H rat retina, including theer nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; ONL, outer nuclear layer.
Figure 2 Drawing of the most representative morphology and location of microglial cells in Sprague-Dawley (SD) (A), untreated P23H(B) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H (C) rats. Note the absence of microglial cells into the subretinal space of P23H ratstreated with TUDCA. GCL, ganglion cell layer; IPL, inner plexiform layer; INL, inner nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; ONL, outer nuclearlayer; SS, subretinal space.
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resident microglia. These cells were completely nonexis-tent not only in normal retinas of SD rats (Figure 3A), butalso in TUDCA-treated P23H rats (Figure 3C).
TUDCA reduces microglial cell number in P23H ratsTo assess the effect of TUDCA on the density and distribu-tion of retinal microglial cells in P23H rats, the relativenumber of CD11b-positive cells was determined in theGCL, IPL, OPL and SS of whole-mount retinas from SD (n= 4), untreated P23H (n = 6) and TUDCA-treated P23Hrats (n = 6). Considering together all sampled areas, un-treated P23H rats showed a relative number of immunopo-sitive cells significantly greater compared to normal SD rats(ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 4A). These dif-ferences were significant in the GCL, IPL, OPL and SS(ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001 in all cases; Figure 4B).TUDCA-treated P23H rats also showed a mean number ofmicroglial cells per mm2 significantly greater than SD rats(ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.01; Figure 4A), with sig-nificant differences in the GCL, IPL and OPL (ANOVA,Bonferroni’s test, P <0.05 in GCL and IPL, and P <0.001 inOPL; Figure 4B). However, the mean number of CD11b-positive cells was significantly lower in TUDCA-treatedP23H rats, as compared to untreated P23H rats (ANOVA,Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 4A), those differenceswere statistically significant in the GCL, IPL, OPL and SS(ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001 in all cases; Figure 4B).
Figure 3 Migration of microglia into the subretinal space of untreatetauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H (C) rat immunolabeled win the subretinal space of untreated P23H rats. Scale bar: 40 μm.
No microglial cells were found in the SS of TUDCA-treated P23H rats, as observed in normal SD rats.Figure 5 shows representative drawings of the CD11b-
positive cells found in the medial area of the retina (su-perior quadrant) of a SD, untreated P23H and TUDCA-treated P23H rat, differentiating microglial cells locatedin the GCL, IPL and OPL. According to data obtained inthe quantitative analysis shown in Figure 4, we can seethat TUDCA-treated P23H rat retinas (Figure 5C) had adensity of microglial cells intermediate between the onefound in SD rats (Figure 5A) and observed in untreatedP23H rats (Figure 5B), indicating a significant effect ofTUDCA reducing the relative number of microglial cellsin all retinal layers. Representative drawings in Figure 5(A-C) also show that, regardless of the microglia density,microglial cells are regularly distributed within each ret-inal layer in SD, untreated P23H and TUDCA-treatedP23H rats. As we can see in Figure 5 (D-F) the distribu-tion patterns of microglial cells in the GCL, IPL andOPL, obtained by measuring the distances to the nearestneighbors of each microglial cell, show a Gaussian formand are symmetric around the mean (Figure 5D-F, solidline). As we can see in the figure, these histograms can-not be described by the nearest neighbors analysis ofrandom patterns of the same density and standard devi-ation (Figure 5D-F, dotted line). It indicates that the dis-tances to the nearest neighbors are uniform, and that
d P23H rats. Whole-mount retina of a SD (A), untreated P23H (B) andith CD11b (OX-42), showing the presence of amoeboid microglial cells
Figure 4 Quantification of retinal microglial cells. (A) Average number of positively stained microglial cells quantified in whole-mount retinasfrom SD (n = 4; green), untreated P23H (n = 6; red) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H rats (n = 6; grey). (B) Average numberof microglial cells in the GCL, IPL, OPL and SS of the retinas analyzed in (A). *P <0.05, **P <0.01, ***P <0.001; ANOVA, Bonferroni’s test.
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microglial cells are arranged in a regular mosaic and arenot distributed at random.Regardless of the retinal layer in which they were
located, most of the microglia found in SD retinas showeda tiny cell soma, little perinuclear cytoplasm, and a largenumber of fine, branched processes covered in numerousprojections. CD11b-positive cells with amoeboid mor-phology were scarce in SD rats. By contrast, numerousamoeboid microglial cells, with scarce short and thickprimary and terminal processes and enlarged soma, wereobserved in all retinal layers of untreated P23H rats. InTUDCA-treated P23H rats, amoeboid CD11b-positivecells were less abundant than in untreated P23H rats in alllayers of the retina. Distribution of microglial cells withineach retinal layer (GCL, IPL and OPL; Figures 6, 7 and 8,respectively) was homogeneous in both SD and P23H rats.No differences in microglial density were found betweenthe 12 regions analyzed in each retinal layer. This resultimplies that the increase in the number of microglial cellsin P23H rats compared to SD rats (showed in Figure 4)was analogous in all regions of the GCL, IPL and OPL(Figures 6, 7 and 8, respectively). In TUDCA-treated P23Hrats, microglial cells were also homogeneously distributedwithin the retinal layers, the density of microglial cells ineach region of the retina being in these animals lower thanthat observed in untreated P23H rats.
TUDCA prevents activation of microglial cells in P23H ratsMicroglial activation was assessed in SD, untreatedP23H and TUDCA-treated P23H rats by analyzing verti-cal retinal sections immunostained with Iba1, a constitu-tively expressed microglial specific marker, and MHC-II,a marker that is frequently present on activated micro-glia. The total number of microglial cells expressingone or both markers was counted. As we can see inFigure 9, MHC-II-negative cells labeled with anti-Iba1
antibody (Iba1+/MHC-II−) had the typical appearance ofresting microglia, while MHC-II-positive cells showedmorphologic features of activated microglia; thus provingthat MHC-II expression is associated to microglial ac-tivation. In SD rat retinas, all Iba1-positive cells foundshowed morphologic features of resting microglia and werenot labeled by anti-MHC-II antibody (Iba1+/MHC-II−,Figure 9A-C and Figure 10B). In the retinas of untreatedP23H rats, microglia density was significantly higherthan the one observed in the SD rats (183%; ANOVA,Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 9D-E and Figure 10A).Moreover, a high proportion of microglial cells in un-treated P23H rat retinas were MHC-II-positive (43%;Figure 10B). Finally, a small group of MHC-II-positivecells found in untreated P23H rat retinas was not labeledby anti-Iba1 antibody (5%; Iba1−/MHC-II+; Figure 10B).In TUDCA-treated P23H rats, microglia density was simi-lar to the one observed in the SD rats (108%), and sig-nificantly smaller than that found in untreated P23H rats(59%; ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 9G-Iand Figure 10A). The relative number of MHC-II-positivecells not labeled by anti-Iba1 antibody in TUDCA-treatedP23H rats was also lower than in untreated P23H rats(27.8%; Iba1−/MHC-II+; Figure 10B).
TUDCA reduces the presence of macrophages in theP23H ratsImmunolabeling of whole-mount retinas with the micro-glia/macrophages marker CD11b revealed the presenceof CD11b-positive cells with morphological characteris-tics of macrophages in the central, medial and peripheralareas of the GCL in SD, untreated P23H and TUDCA-treated P23H rats (Figure 11). In untreated P23H rats,the mean density of macrophages in the GCL was sig-nificantly higher than in SD rats (ANOVA, Bonferroni’stest, P <0.001; 23.6 ± 4.8 cells/mm2 versus 8.1 ± 1.0 cells/
Figure 5 Analysis of the distribution pattern of microglial cells. (A-C) Drawings of microglial cell bodies labeled with immunoperoxidase in arepresentative area of the retina of a SD (A), untreated P23H (B) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H rat (C). The localization ofmicroglial cells in each of the retinal layers studied has been specified: GCL, red; IPL, green; OPL, blue. All images were collected from the medialarea of the retina, in the superior quadrant. (D-F) Histograms of the nearest neighbors analysis in the OPL, IPL and GCL of SD (D), untreated P23H(E) and TUDCA-treated P23H rats (F). The solid line indicates the Gaussian function fitted to the data. The nearest neighbors analysis of a randompattern of the same density and standard deviation has been included for comparisons (dotted line). GCL, ganglion cell layer; IPL, inner plexiformlayer; OPL, outer plexiform layer. Scale bar: 500 μm.
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mm2; Figure 11). However, TUDCA-treated P23H ratsshowed a mean density of macrophages in GCL (7.2 ±1.4 cells/mm2) similar to the one observed in SD ratsand significantly lower than that found in untreatedP23H rats (ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001;Figure 11).
DiscussionThe present study revealed that microglia are arrangedin regular mosaics homogeneously distributed within theGCL, IPL and OPL in the normal rat retina and degen-erative changes in the retina of P23H rats are associatedto significant increases in microglia density, as well as to
Figure 6 Morphology, number and distribution of microglial cells in the ganglion cell layer (GCL). (A-C) Representative images of whole-mount rat retinas from a SD (A), untreated P23H (B) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H rat (C) labeled with immunoperoxidase.(E, G, I) Magnifications of (A), (B) and (C), respectively. (D, F, H) Drawings of microglial cells from SD (D), untreated P23H (F) and TUDCA-treated P23Hrat (H). (J, K) Microglial density, expressed as number of cells per mm2, in each of 12 representative regions in each retina: 6 equidistantly arranged onthe superior-inferior axis of the retina (J) and 6 disposed on the temporal-nasal axis (K). The scheme in the margin of each panel represents the positionin the retina of each representative region analyzed. (A, B, C) scale bar: 40 μm; (D, F, H) scale bar: 20 μm; (E, G, I) scale bar: 10 μm.
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the appearance of a large number of amoeboid CD11b-positive cells, even into the SS. Previous studies havealready demonstrated the relation between microglialactivation and the progression of neurodegenerative dis-eases, including RP [18]. However, to our knowledge,this is the first time that changes in microglial cell num-bers, distribution and morphology have been describedin the P23H rat, a rat model of autosomal dominant RPcharacterized by a slow-pace retinal degeneration [40,41].In this study, we also documented that systemic treatmentwith the antiapoptotic TUDCA attenuates changes innumber, distribution and morphologic features of micro-glial cells in P23H rats.
We identified that in normal Sprague-Dawley rat retinasCD11b-positive microglial cells were homogeneously dis-tributed in the GCL, IPL and OPL; most of them showingmorphologic features of resting microglia, although fewCD11b-positive cells with amoeboid morphology werefound in the GCL. These results agree with previous stud-ies in rats showing that as the layers of the retina differen-tiate, microglial cells are increasingly restricted to theinner half of the retina [42]. More, recent studies haveshown that OX42-immunoreactive microglial cells aredistributed mainly in the nerve fiber layer (NFL) andGCL, with some cells localized in the IPL, but rarely inthe OPL [43]. On the other hand, previous studies have
Figure 7 Morphology, number and distribution of microglial cells in the inner plexiform layer (IPL). (A-C) Representative images ofwhole-mount rat retinas from a SD (A), untreated P23H (B) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H rat (C) labeled withimmunoperoxidase. (E, G, I) Magnifications of (A), (B) and (C), respectively. (D, F, H) Drawings of microglial cells from SD (D), untreated P23H (F)and TUDCA-treated P23H rat (H). (J, K) Microglial density, expressed as number of cells per mm2, in each of 12 representative regions in eachretina: 6 equidistantly arranged on the superior-inferior axis of the retina (J) and 6 disposed on the temporal-nasal axis (K). The scheme in themargin of each panel represents the position in the retina of each representative region analyzed. (A, B, C) scale bar: 40 μm; (D, F, H) scale bar:20 μm; (E, G, I) scale bar: 10 μm.
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reported the presence of a network of macrophages in theinner layers of the rat normal retina [44]. In agreementwith these previous findings, we found the presence ofCD11b-positive cells with morphological characteristics ofmacrophages in the central, medial and peripheral areasof the GCL in SD rats. The analysis of the distributionpattern of microglial cells in each retinal layer showed thatmicroglial cells are arranged in a regular mosaic in bothSD and P23H rats. This result is in accordance with thearrangement in a spatially regular manner of many typesof retinal neurons, including photoreceptors [45,46]. Theresult also suggests the existence of mechanisms involved
in the development of regular cellular positioning withineach retinal layer.In untreated P23H rat retinas, microglia density in-
creased in the GCL, IPL and OPL, microglial cells ap-peared in the SS, and a large number of CD11b-positivecells were labeled with anti-MHC-II, a marker of micro-glial activation, and showed morphological features ofamoeboid cells. The mean density of macrophages in theGCL was also higher in untreated P23H rats as com-pared to SD rats. These results are in accordance withchanges in microglial cells number, activation and distri-bution previously reported in different forms of disease
Figure 8 Morphology, number and distribution of microglial cells in the outer plexiform layer (OPL). (A-C) Representative images ofwhole-mount rat retinas from a SD (A), untreated P23H (B) and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H rat (C) labeled withimmunoperoxidase. (E, G, I) Magnifications of (A), (B) and (C), respectively. (D, F, H) Drawings of microglial cells from SD (D), untreated P23H (F)and TUDCA-treated P23H rat (H). (J, K) Microglial density, expressed as number of cells per mm2, in each of 12 representative regions in eachretina: 6 equidistantly arranged on the superior-inferior axis of the retina (J) and 6 disposed on the temporal-nasal axis (K). The scheme in themargin of each panel represents the position in the retina of each representative region analyzed. (A, B, C) Scale bar: 40 μm; (D, F, H) scale bar:20 μm; (E, G, I) scale bar: 10 μm.
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or retinal damage, like glaucoma [22,47], age-relatedmacular degeneration [20,48], light damage [49,50] andRP [18]. In the mouse model of RP rd10, high levels ofpro-inflammatory cytokines and chemokines and earlymicroglial activation have been demonstrated [51,52].Previous studies have also demonstrated increased densityof macrophages after microglial activation [44]. Here weshowed that CD11b-positive microglial cells were homo-geneously distributed within each of the retinal layers inP23H rats. Nonetheless, retinal degeneration in P23H ratswas not homogeneous throughout the retina. Previousstudies have reported more advanced stages of
degeneration in the medial retina compared with the cen-tral and peripheral retina [34,53]. This result evidencesthat there is no correlation between the state of degener-ation in different areas of the retina and glial activation inthe same region. The result also suggests that the signalsthat mediate activation of microglia either do not dependon the state of degeneration of the retina, or are homoge-neously distributed within each retinal layer.Microglial cells have been reported to exhibit the ex-
pression of the ionized calcium-binding adaptor molecule1 (Iba1), a microglia/macrophage-specific calcium-bindingprotein found in all microglial populations [54-57]. This
Figure 9 Activation of microglial cells. Vertical section of retinas from a SD (A-C), untreated P23H (D-F) and tauroursodeoxycholic acid(TUDCA)-treated P23H (G-I) rat stained for Iba1 (green; A, D, G) MHC-II RT 1B (red; B, E, H) or both (C, F, I). Nuclei stained with a nuclear marker(TO-PRO 3, blue). All images were collected from the central area of the retina, close to the optic nerve. GCL, ganglion cell layer; IPL, innerplexiform layer; INL, inner nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; ONL, outer nuclear layer. Scale bar: 20 μm.
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protein is involved in the membrane ruffling processes ofmacrophages/microglia so it is considered one of the mostimportant molecules in the motile properties of these cells[54]. In our study, a small group of MHC-II-positive cellswas not labeled by anti-Iba1 antibody in P23H rat retinas.This finding can be explained by assuming that microglialcells may have different expression pattern according totheir provenance. Perhaps, Iba1− cells are migrating mi-croglia that attend to the retinal tissue in response to achronic negative insult. Another explanation of the pres-ence of Iba1− microglial cells could be that these cells aredefective or senescent microglial cells that have lost theirmigrating capacities and down-regulated the Iba1 expres-sion. Possibly, the appearance of this novel expression pat-tern responds to a different stage of microglial cells withinthe microglial activation process, wherein each of thestages is characterized by a common expression pattern.TUDCA in P23H rats reduced the number and activa-
tion of microglial cells and macrophages. Moreover, inTUDCA-treated rat retinas microglia were mainly distrib-uted in more internal retinal layers, GCL and IPL, and
they were scarce in the OPL and missing in the SS, whichis similar to that found in normal SD rat retinas. Thisresult suggests that TUDCA effects on retinal microgliacould be due, at least in part, to a reduction in themicroglial migratory capacity. Attenuation of microglialactivation using TUDCA has been previously demon-strated in experimental models of neuroinflammation,in which it has been reported that TUDCA reducesin vitro microglial migration and the expression of che-moattractants required for microglial migration [58].The effects of TUDCA on retinal microglial cells could bealso attributed to an effect of TUDCA on microglial cellsbehavior, presumably interfering in the respiratory burstof the microglia, which is a critical step in its activa-tion [59,60]. Besides its direct action on microglial cells,TUDCA could act on an indirect way. Through its anti-apoptotic properties, TUDCA slows apoptosis of theretinal tissue [34].Microglial cells in the retina act as sensors of disar-
rangement in their micro-environment. Their balancedactivities play a key role in the survival of neurons [6,30].
Figure 10 Quantification of retinal microglial activation. (A) Average number of Iba1 and/or MHC-II positive microglial cells quantified invertical retinal sections from SD, untreated P23H and tauroursodeoxycholic acid (TUDCA)-treated P23H rats (6 animals per group). (B) Averagenumber of microglial cells showing the expression patterns Iba1+/MHC-II− (green), Iba1−/MHC-II+ (red) and Iba1+/MHC-II+ (yellow). ***P <0.001;ANOVA, Bonferroni’s test.
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Activation of the microglia has been demonstrated inassociation with several neurodegenerative diseases, suchas Alzheimer’s and Parkinson’s diseases, amyotrophic lat-eral sclerosis, and multiple sclerosis, although it remainsunclear whether microglial activation is a cause or a
Figure 11 Number and distribution of macrophages in the ganglion cretinas from a SD (A), untreated P23H (B) and tauroursodeoxycholic acid (TDensity of macrophages, expressed as number of cells per mm2, in each othe superior-inferior axis of the retina (D) and 6 disposed on the temporal-position in the retina of each representative region analyzed. Scale bar: 40
consequence of neuronal damage [17,61]. The true role ofmicroglia in neurodegenerative diseases, as either a bene-ficial or harmful factor, still remains controversial, and alarge body of results has been obtained to support bothhypotheses. Activated microglial cells have been shown to
ell layer (GCL). (A-C) Representative images of whole-mount ratUDCA)-treated P23H rat (C) labeled with immunoperoxidase. (D, E)f 12 representative regions in each retina: 6 equidistantly arranged onnasal axis (E). The scheme in the margin of each panel represents theμm.
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induce photoreceptor death in in vitro experiments[62,63], and inhibition of microglial activation reducedphotoreceptor apoptosis and significantly improved retinalstructure and function [51,64]. In the rd10 mouse modelof RP, it has been demonstrated that reductions in theamount of pro-inflammatory cytokines and chemokinesby antioxidant treatment inhibits microglial activation andslows the photoreceptor loss [52]. Moreover, it has beendemonstrated that microglia are required for the neuro-protective effect of insulin-like growth factor (IGF)-I inthe rd10 mouse retina [65]. Hence, the selective inhibitionof overacting microglial activity and preservation of theirtrophic and homeostatic functions appear to be a promis-ing treatment for degenerative diseases [30]. However, itmust also be noted that reactive microglial cells can alsohave a protective effect in damaged retina and that the in-hibition of microglial activation can have harmful effectsat the same time. In the early stages of the neurodegenera-tive process, microglial activation can display a protectivefunction through the phagocytosis of cell debris and therelease of protective molecules [7,8,17]. In this sense, ac-cumulation of microglia in ischemic areas correlates witha reduction of neuronal damage and confers neuroprotec-tion [66].
ConclusionThese experiments demonstrate that in normal and dis-ease conditions microglial cells exhibit a mosaic distri-bution throughout the retinal tissue, independently ofthe state of degeneration. The data obtained in our workalso prove that microglial activation is actively involvedin the progression of RP. Moreover, we documented thatTUDCA reduces the number and activation of micro-glial cells in a model of RP (P23H). These results reportnovel TUDCA anti-inflammatory actions, with potentialtherapeutic implications for neurodegenerative diseases,including RP. Further studies are required to evaluatethe beneficial and/or harmful impact of these effects onretinal structure and function.
AbbreviationsABC: avidin-biotin-peroxidase complex; ANOVA: analysis of variance;CNS: central nervous system; DAB: 3,3′-diaminobenzidine tetrahydrochloride;GCL: ganglion cell layer; Iba1: ionized calcium-binding adapter molecule 1;IFN-γ: interferon gamma; IGF: insulin-like growth factor; IL-1α: interleukin 1alfa; IL-1β: interleukin 1 beta; IL-6: interleukin 6; IPL: inner plexiform layer;NO: nitric oxide; OPL: outer plexiform layer; PB: phosphate buffer; RP: retinitispigmentosa; RPE: retinal pigment epithelium; RT: room temperature;SD: Sprague Dawley; SEM: standard error of the mean; SS: subretinal space;TNF-α: tumor necrosis factor alfa; TUDCA: tauroursodeoxycholic acid.
Competing interestsThe authors declare that they have no competing interests.
Authors’ contributionsConceived the experiments: AN, LFS, NC. Performed the experiments:AN, LFS. Analyzed the data: AN, PL. Contributed to the writing of themanuscript: AN, LFS, PL, NC. All authors read and approved the final manuscript.
AcknowledgementThis research was supported by grants from the Spanish Ministry ofEconomy and Competitiveness-FEDER (BFU2012-36845), Instituto de SaludCarlos III (RETICS RD12/0034/0010), Organización Nacional de CiegosEspañoles (ONCE), FUNDALUCE, Asociación Retina Asturias and FundaciónJesús de Gangoiti.
Received: 2 September 2014 Accepted: 14 October 2014
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doi:10.1186/s12974-014-0186-3Cite this article as: Noailles et al.: Microglia activation in a model ofretinal degeneration and TUDCA neuroprotective effects. Journal ofNeuroinflammation 2014 11:186.
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CAPÍTULO 3
Persistent inflammatory state and microglial activation after photoreceptor
loss in an animal model of retinal degeneration
Noailles, A.1; Maneu, V.2; Campello, L.1; Gómez-Vicente, V.2; Lax, P.1;
Cuenca, N.1
1Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante, España.
2Departamento de Óptica, Farmacología y Anatomía, Universidad de Alicante, España.
Manuscrito en revisión
CAPÍTULO 3
73
Persistent inflammatory state and microglial activation after photoreceptor loss in an
animal model of retinal degeneration.
Agustina Noailles1, Victoria Maneu2, Laura Campello1, Violeta Gómez-Vicente2, Pedro
Lax1, Nicolás Cuenca1,*.
1Physiology, Genetics and Microbiology, University of Alicante, Alicante, Spain.
2Optics, Pharmacology and Anatomy, University of Alicante, Alicante, Spain.
Corresponding author: Nicolás Cuenca, Department of Physiology, Genetics and
Microbiology, University of Alicante, San Vicente University Campus, E-03080 Alicante,
Spain; Phone: +34965909916, Fax: +34965903943, E-mail: [email protected]
CAPÍTULO 3
74
ABSTRACT
Microglia act as the resident immune cells of the central nervous system, including the
retina. In response to damaging stimuli microglia adopt an activated state, which can
progress into a phagocytic phenotype and play a potentially harmful role by eliciting the
expression and release of pro-inflammatory cytokines. The aim of the present study was
to assess longitudinal changes in microglia during retinal degeneration in the homozygous
P23H rat, a model of retinitis pigmentosa. Microglial phenotypes, morphology and density
were analyzed by immunohistochemistry, flow cytometry, and cytokine antibody array. In
addition, we performed electroretinograms to evaluate the retinal response. In the P23H
retina, sclera, choroid and ciliary body, microglia increased in number compared with
control at all ages analyzed. As the rats became older, a higher number of amoeboid
MHC-II-positive cells was observed in the P23H retina, which correlated with an increase
in the expression of pro-inflammatory cytokines. These findings suggest that, in the P23H
model, retinal neuroinflammation persists throughout the rat’s life span even after
photoreceptor depletion. Therefore, the inclusion of anti-inflammatory drugs at advanced
stages of the neurodegenerative process may provide better retinal fitness so the
remaining cells could still be used as targets of cellular or gene therapies.
CAPÍTULO 3
75
INTRODUCTION
Microglia, a type of glial cells that represent the resident immune population of the
central nervous system (CNS), including the retina, are involved in the maintenance of
tissue integrity under non-pathologic conditions. In the absence of a negative stimulus,
retinal microglial cells exhibit a surveillance state characterized by typical morphological
features, including a small, rounded soma with various ramified branching processes, and
play key functions in axonal growth, synaptic remodeling and neuronal survival via
phagocytosis of cellular debris and release of a wide range of cell signaling factors 1-3.
When a harmful stimulus occurs, like an ocular infection, trauma, or a neurodegenerative
process, microglial cells develop an active/reactive form. In this state, they are able to
proliferate, migrate to the damaged sites and secrete molecules that initiate tissue repair
mechanisms 4-8. In the early stages of microglial activation, their functions are aimed to
reparation and are considered potentially neuroprotective 9,10. After activation, microglial
cells adopt an amoeboid shape and display a response commensurate to the degree of
activation and the nature of the negative stimulus. In this amoeboid form, they are
characterized by the absence of cellular processes and develop macrophage behavior. If
microglial activation is excessive or prolonged, chronic inflammation takes place due to
the constant secretion of neurotoxic substances such as nitric oxide and pro-
inflammatory cytokines (for instance IL-1α, IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-6), leading to severe
pathologic side effects, including neuronal apoptosis and retinal damage 7,8,11. Activated
microglial cells have been observed in several retinal neurodegenerative diseases such as
in murine models of retinitis pigmentosa (RP) 6,12-15, age-related macular degeneration
(AMD) 2,16 or glaucoma 2,17-19.
CAPÍTULO 3
76
Many neurodegenerative diseases, such as Parkinson’s disease or Alzheimer’s disease,
have been correlated with neuroinflammation, microglial activation and high levels of
pro-inflammatory molecules 20-22. In addition, many other neurodegenerative diseases,
like amyotrophic lateral sclerosis or Huntington’s disease, have been associated with
microglial activation 8. These previous data demonstrate that it is a common
phenomenon in the neurodegenerative process and plays a critical role in the evolution of
the disease.
RP is a type of hereditary retinal degeneration with high levels of clinical and genetic
heterogeneity. This retinal disorder is characterized by a primary degeneration of rod
photoreceptors, causing a loss of peripheral vision and night blindness. With the
progression of the disease, only foveal cone photoreceptors remain functional, leading to
typical tunnel vision. In the final stages of the disease, the degeneration of cones leads to
central visual field loss and, eventually, to complete blindness 23. Nowadays, it is known
that over 100 different mutations in the gene encoding rhodopsin (RHO) are associated
with 30 to 40% of autosomal dominant cases of RP 24. One of the mutations is the Pro-23-
His substitution, which, as the majority of RHO gene-mutations, causes misfolding and
retention of rhodopsin in the endoplasmatic reticulum 23,25.
To date, there are no effective treatments for RP; therapeutic approaches are based
mainly on slowing the progression of the disease. However, numerous research groups
are developing promising gene and cell therapies, hoping to get a complete functional
recovery of the damaged tissue. Novel cell therapies allow tissue regeneration in many
retinal diseases like RP 26, AMD 26,27 or severe retinal vascular occlusion 26, through the
transplant of a wide range of stem/progenitor cells, such as human neural progenitor cells
(hNPCs), induced pluripotent stem cells or human embryonic stem cells, among others 26-
CAPÍTULO 3
77
30. These transplanted cells are able to differentiate into retinal neurons and, in some
cases, restore the correct retinal function.
Gene therapies are based on the intracellular release of genetic material that is able to
repress or activate the expression of a gene depending on whether its action is
dysfunctional or therapeutic. Although the strategy of gene therapy is promising, more
studies are needed to ensure the safety of the technique and to achieve sustained gene
expression over time 31,32. Currently, gene therapies are under study in glaucoma, RP and
AMD among others, and in some cases there are ongoing clinical trials in phases 1 and 2
32. In Leber´s congenital amaurosis, gene therapy improved visual responses and visual
acuity 33. Nevertheless, in the long term, it was unable to stop the continuous loss of
photoreceptors that characterizes the disease, suggesting that other factors, such as the
inflammatory state of the tissue, might be involved in the progression of retinal
degenerative diseases and should be taken into account for an appropriate design of
combined therapies 34.
The inflammatory condition of the retinal tissue can be a critical factor to consider when
performing cellular or gene therapies. This kind of treatments may be doomed to fail if
the target tissue has unfavorable conditions for functional improvement. The main
objective of this work was to study the progression of microglial activation through age in
an animal model of RP and to clarify if, despite the death of a great portion of the
photoreceptor population, the microglia remained active and releasing pro-inflammatory
molecules that maintained the neuroinflammatory state. We have found scarce studies
that investigate how microglia evolve over time in a chronic retinal disease 35 or if the
inflammatory state of the tissue changes after the massive death of photoreceptors. For
CAPÍTULO 3
78
this purpose, we have used P23H and Sprague-Dawley (SD) rats at different ages and
characterized the microglial population, its morphology, density and distribution within
the retina, with techniques such as immunohistochemistry, flow cytometry and cytokine
arrays. In addition, we performed electroretinograms (ERG) to characterize the retinal
response at each age.
CAPÍTULO 3
79
RESULTS
Electroretinograms recording
The study of ERG responses showed the progression of retinal functional activity in SD
and P23H rats at 1, 4 and 12 months old. As shown in figure 1A, the ERG responsiveness
of SD rats revealed small changes over time, even at 12 months old. However, in P23H
rats, a rapid degeneration in the ERG response was observed as early as 1 month old.
Figure 1B shows that, at 1 month old, P23H rats exhibited a 45% loss in the maximum b-
wave amplitude and an 84% loss in the maximum a-wave amplitude under scotopic
conditions. In addition, at 4 months old, P23H animals showed 86% and 97% losses in the
maximum b- and a-wave amplitudes respectively, under scotopic conditions. At 12
months old, the loss percentage in the b- and a-wave amplitudes was already 100% with
respect to age-matched SD rats (Figure 1B).
Morphology of microglial cells at different ages
The progressive loss of visual responsiveness in P23H rats was associated with a gradual
age-dependent reduction of the photoreceptor cell layer and structural changes in the
inner retina (Figure 2). Thus, we aimed to assess if functional and morphological retinal
changes were related to microglial changes. To do that, retinal microglial cells were
immunostained with Iba1, a constitutively expressed microglial specific marker, and MHC-
II, whose expression is a hallmark of activated microglia and macrophages. Microglia in SD
retinas showed a ramified morphology with a tiny cell soma, little perinuclear cytoplasm,
and a large number of fine, branched processes covered in various projections. These
microglial cells apparently maintained their characteristic ramified morphology during the
CAPÍTULO 3
80
progression of age, from 1 to 12 months old (Figure 2A-C), and showed few or no
immunostaining for MHC-II at any age (Figure 2D-F).
In contrast, microglial cells in the P23H retina became less branched and lost projections
with aging. Although at 1 month old we observed several microglial cells that presented
an almost normal ramified morphology (Figure 2G), as the animals became older,
microglia gradually turned in cells with enlarged soma and few, short and thick primary
and terminal processes (Figure 2H-I). Moreover, an increased number of MHC-II positive
cells were observed through age in the P23H rats (Figure 2J-L). Figure 3 provides a closer
view of typical microglial cells present in the ganglion cell layer (GCL), inner plexiform
layer (IPL) and outer plexiform layer (OPL) of SD (Figure 3A-C) and P23H (Figure 3D-F) rats
at 4 months old.
Flow cytometry analysis
The immunofluorescence technique allowed us to observe genotype- and age-dependent
differences in the shape and localization of retinal microglial cells. We wanted to verify
these results by an alternative method that also allowed quantification of the distinct
microglial cell populations in SD and P23H retinas, so we used flow cytometry analysis.
The microglial population was identified by CD11b expression (Figure 4A). The activation
state of microglia was evaluated by measuring the expression of MHC-II on CD11b+ cells
(Figure 4B, 4D) and the upregulation of CD45 expression (not shown). We could see that,
while a small CD11b+/MHC-II+ population (from 4.1 ± 1.7% to 12.0 ± 1.6%) was observed
in the retinas in control rats up to 6 months of age, we found a significantly increased
CD11b+/MHC-II+ population in P23H retinas at all ages studied (from 15.7 ± 2.7 to 35.6 ±
4.7%), with a greater double positive population in old animals (54.7 ± 4.0%). The
activation was minimal at 1 month of age and maximal at 12 months, with an apparent
CAPÍTULO 3
81
plateau from 2 to 6 months old (Figure 4C). Double immunostaining against CD11b and
CD45 showed an upregulation of CD45 in P23H rats, reaching significance at 1, 6 and 12
months old, as compared to SD rats at the same age point (1 month = 1.42-fold increase;
6 months = 1.47-fold increase; 12 months = 2.03-fold increase; data not shown). These
results confirmed the activated state of the microglia. Moreover, in P23H rats, the CD11b+
population was greater than in control rats at all ages studied (Figure 4D). The CD11b+
population increased in number with age from 3 months onwards, even though no
photoreceptors remained in the retina at late stages of the degenerative process.
Quantification, distribution and activation of microglial cells in the retina
To assess the effect of age progression on the density and distribution of the retinal
microglial cells in SD and P23H rats, the total number of microglial cells immunostained
with anti-Iba1 and/or anti-MHC-II antibodies was determined in vertical retinal sections
from SD (n=4, per age group) and P23H (n=4, per age group) rats at all ages tested (1, 4
and 12 months old). First, we studied the progression of the total microglial cell number
inside each animal group (SD and P23H) and then we made a comparison between animal
groups.
In SD rats the peak in the number of total microglial cells was observed at 1 month old
and, after a significant decrease at 4 months old (73%; ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.001;
Figure 5A), microglial density begins again to increase with age progression (84% and 90%
at 6 and 12 months old respectively, ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.05; Figure 5A).
In P23H rats, the total number of microglial cells was significantly higher at 6 and 12
months old as compared with 1 and 4 months old (ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.001;
Figure 5A). As compared to SD rats, P23H rats showed a number of total microglial cells
significantly greater at all ages tested (140% at 1 month old, 184% at 4 months old, 194%
CAPÍTULO 3
82
at 6 months old and 185% at 12 months old; ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.001; Figure
5A).
In addition, we analyzed the relative density of microglial cells in each retinal layer,
expressed as a percentage of the total. Figure 5B shows that SD rats had a distribution of
microglial cells relatively uniform through time; few variations in microglial localization
were observed. The percentage of microglial cells in the GCL of SD rats showed a
significant progressive decrease as the rats became older (51% at 1 month old vs. 42% at
4 months old; 42% at 4 months old vs. 29% at 12 months old; ANOVA, Bonferroni´s test,
P<0.05, P<0.001). The INL exhibited a continuous increase in the percentage of microglial
cells with the progression of age in SD rats, although these differences were not
statistically significant. The microglial population in the OPL did not experienced
significant changes through age in SD rats from 1 to 4 months old, however, the increase
of microglial cells observed in OPL from 4 to 12 months old was statistically significant
(15% at 4 months old vs. 24% at 12 months old; ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.01). These
soft variations in the organization of microglial population observed in SD rats can be due
to the normal aging process of the retinal tissue in these animals.
In contrast, the P23H rats experienced deep reorganizations in the distribution of
microglial cells among different retinal layers as the animals became older. Specifically,
from 1 to 4 months old we observed a significant increase in the percentage of microglial
cells present in the ONL (5% at 1 month old vs. 14% at 4 months old; ANOVA, Bonferroni´s
test, P<0.001), which decreased drastically at 12 months old as a consequence of the
death of all photoreceptor cells and the disappearance of the ONL (14% at 4 month old
vs. 0% at 12 months old; ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.001). The percentage of microglial
cells present in the OPL remained constant from 1 to 4 months old, but at 12 months old
CAPÍTULO 3
83
this retinal layer disappeared as a result of the retinal degeneration (20% at 4 month old
vs. 0% at 12 months old; ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.001). Due to the disappearance of
these two retinal layers (ONL and OPL), at 12 months old the INL suffered a significant
increase in the percentage of the microglial population (5% at 4 month old vs. 26% at 12
months old; ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.001), which could be explained, at least in
part, by the microglial relocation. P23H rats exhibited a constant population of microglial
cells in the subretinal space (SS) through the age progression.
Microglial activation through age was also assessed in SD and P23H retinal sections, by
phenotypic characterization of stained microglial cells (Iba1+/MHC-II-, Iba1-/MHC-II+ and
Iba1+/MHC-II+). At first, we analyzed the differences in phenotypes within each animal
group (SD and P23H) and after, we performed a comparison between animal groups.
In SD rats, the number of Iba1+/MHC-II- cells at 6 and 12 months old was not statistically
different (Figure 5C). However, the number of these Iba1+/MHC-II- cells showed a
significant decrease from 1 to 4 months old (9.4 ± 0.4 and 7.0 ± 0.4 cells/mm retina,
respectively; ANOVA Bonferroni´s test, P<0.001; Figure 5C) and a subsequent increase
from 4 to 12 months old (7.0 ± 0.4 and 8.4 ± 0.1 cells/mm retina, respectively; ANOVA
Bonferroni´s test, P<0.01; Figure 5C). In addition, we did not found significant differences
in the number of Iba1-/MHC-II+ and Iba1+/MHC-II+ cells between ages in the SD rats group
(Figure 5D-E).
In P23H rats, we observed a significant decrease in Iba1+/MHC-II- cells from 1 to 4 months
old (8.8 ± 0.3 and 6.3 ± 0.3 cells/mm retina, respectively; ANOVA Bonferroni´s test,
P<0.001; Figure 5C). From 4 to 12 months old Iba1+/MHC-II- cells increase in number, with
differences that were significant from 4 to 6 months old (6.3 ± 0.3 and 9.0 ± 0.2 cells/mm
retina, respectively; ANOVA Bonferroni´s test, P<0.001; Figure 5C) but not significant from
CAPÍTULO 3
84
6 to 12 months old (Figure 5C). Iba1-/MHC-II+ cells exhibited a significant increment from
1 to 12 months old (0.10 ± 0.04, 0.90 ± 0.15, 1.20 ± 0.09 and 1.60 ± 0.11 cells/mm retina
at 1, 4, 6 and 12 months, respectively; ANOVA Bonferroni´s test, P<0.001 in all cases;
Figure 5D). The amount of double immunostained Iba1+/MHC-II+ cells was significantly
increased from 1 to 4 months old (4.6 ± 0.2 and 5.7 ± 0.5 cells/mm retina, respectively;
ANOVA Bonferroni´s test, P<0.001; Figure 5E), but from 4 to 12 months old the number of
these Iba1+/MHC-II+ cells remains practically constant (Figure 5E).
Comparison of phenotypic properties of SD and P23H rat retinal microglia showed that SD
rat retinas of 6 and 12 months old exhibited a significantly lower number of Iba1+/MHC-II-
cells than those observed in P23H rat retinas at the same age (88% at 6 months old, 92%
at 12 months old; ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.01, P<0.001; Figure 5C). At 1 and 4
months old SD retinas showed a higher number of Iba1+/MHC-II- cells, compared to age-
matched P23H rats, but the differences were not statistically significant (Figure 5C). The
amount of Iba1-/MHC-II+ cells was greater in P23H retinas at 4, 6 and 12 months old
(ANOVA, Bonferroni´s test, P<0.001; Figure 5D). The double immunostained cells,
Iba1+/MHC-II+, appeared more numerously in P23H retinas at all ages tested (ANOVA,
Bonferroni´s test, P<0.001; Figure 5E).
Microglia/microglia-like cells in sclera, choroid and ciliary body
Previous studies showed that when a retinal damage occurs, various cells types
expressing microglia/macrophage markers reach the site of injury through the choroid
and optic nerve 36,37. For that reason, we analyzed changes in the microglia/microglia-like
cells population of the structures surrounding the retina: the sclera, choroid and ciliary
body. To study changes in density or activation of microglia/microglia-like cells in the
sclera and choroid we obtained mosaics of complete retinal sections and posteriorly
CAPÍTULO 3
85
analyzed the fluorescence area in pixels in four representative regions of interest. Figure
6 shows the general appearance of the sclera and choroid at 1 month old in
representative P23H and SD retinas (Figure 6A, 6C). The zoom image of both sections
(Figure 6B, 6D) reveals that in 1-month-old P23H rats, both layers, sclera and choroid, had
more immunoreactivity to Iba1 and MHC-II than in age-matched SD rats. In figure 7, in
addition to 1 month old, we show the sclera and choroid at 4 and 12 months old in SD
(7A-C) and P23H (7D-F) rats. We detected an increased immunoreactivity to Iba1 and
MHC-II at 4 months old in P23H rats as compared with SD rats. At 12 months old, we
could not establish clear differences in Iba1 and MHC-II immunoreactivity between P23H
and SD groups in sclera and choroid. Figure 7G-H gives us a more detailed view of the
sclera and choroid of SD and P23H rats at 1 month old.
In order to better understand the differences in the staining of microglia in the sclera and
choroid, we performed a quantification of the fluorescence area in each genotype (SD
and P23H), age group (1, 4 and 12 months old) and representative retinal region (nasal
peripheral, nasal central, temporal central and temporal peripheral). The results are
shown in Figure 8. At 1 month old, P23H rats showed a statistically significant higher
fluorescent area than the observed in SD rats (ANOVA, Bonferroni’s test, P<0.001; Figure
8A), with significant differences in the temporal peripheral retinal region (ANOVA,
Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 8B). At 4 months old P23H rats exhibited a greater
fluorescent area than the observed in SD rats (ANOVA, Bonferroni’s test, P<0.001; Figure
8A), with significant differences in the nasal central, temporal central and temporal
peripheral regions (ANOVA, Bonferroni’s test, P<0.001, P<0.001 and P<0.01, respectively;
Figure 8B). At 12 months old, the differences between groups were not statistically
significant in terms of total fluorescence measured (Figure 8A) although P23H rats
CAPÍTULO 3
86
showed a significant increase of the fluorescent area at compared to SD rats in the nasal
central region of the retina (ANOVA, Bonferroni’s test, P<0.01; Figure 8B). No significant
differences were observed through the age in neither SD nor P23H rats.
In figure 9 we can observe the characteristic appearance of the ciliary body of SD rats at 1
(Figure 9A), 4 (Figure 9C) and 12 (Figure 9E) months old. In the ciliary body of SD rats,
activated microglial cells were observed at all ages tested (Figure 9A, C, E), evidenced by
the immunofluorescence against MHC-II. The ciliary body of P23H rats at 1, 4 and 12
months old is shown in figure 9. In these images, we also appreciated activated microglial
cells at 1 (Figure 9B), 4 (Figure 9D) and 12 (Figure 9F) months old, with an apparent peak
of activated cells at 4 months old. Figure 10 presents a detailed view of immunopositive
cells in the ciliary body of SD and P23H rats at 4 and 12 months old.
The differences in the mean number of activated microglial cells in the ciliary body of
each animal group were quantified. In Figure 11A we show the quantification of cells
stained with one or both markers (Iba1/MHC-II) per mm2 of ciliary body section. In SD
rats, we found a peak value of immunopositive cells at 4 months old that was significantly
higher than the one observed at 1 and 12 months old. In P23H rats, we detected the same
tendency, with a peak value at 4 months old that was significantly higher than the values
obtained at 1 and 12 months old (ANOVA, Bonferroni’s test, P<0.001; Figure 11A).
The comparison between SD and P23H groups showed that at 1 month old, the ciliary
body of P23H rats presented a greater density of immunopositive cells than the observed
in the ciliary body of SD rats at the same age (1.5-fold increase; ANOVA, Bonferroni’s test,
P<0.05; Figure 11A). This trend was also observed at 4 and 12 months old with 1.3 and 1.4
fold-increase respectively (ANOVA, Bonferroni’s test, P<0.01 and P<0.05; Figure 11A).
CAPÍTULO 3
87
Figure 11B shows the differences in cells phenotype between SD and P23H rats at 1, 4 and
12 months old. In SD rats we observed a decreasing number of Iba1+/MHC-II- cells from 1
to 12 months old (ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 11B). Iba1+/MHC-II+ cells
showed a significant greater peak value at 4 months old as compared to 1 and 12 months
old (ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.01, P <0.001; Figure 11B), and Iba1-/MHC-II+ cells did
not experienced significant changes through age. In P23H rats, the number of Iba1+/MHC-
II- cells at 1 month old is the maximum value observed and, from that point, the amount
of these cells decreased up to 12 months old, with significant differences between 4 and
12-month-old animals (ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 11B). Iba1+/MHC-II+
cells exhibited a significant higher peak value at 4 months old as compared to 1 and 12
months old (ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 11B). The number of Iba1-/MHC-
II+ cells increased as the rat became older, with significant differences between 4 and 12-
month-old animals (ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 11B).
We found a statistically significant greater number of Iba1+/MHC-II- cells at 1 month old in
SD rats as compared with P23H rats (ANOVA, Bonferroni’s test, P <0.001; Figure 11B). At
1, 4 and 12 months old, the ciliary body of P23H rats exhibited a statistically significant
higher number of Iba1+/MHC-II+ cells than the number observed in the ciliary body of SD
rats at the same ages (ANOVA, Bonferroni’s test, P<0.001, P <0.001 and P<0.01,
respectively; Figure 11B). At 12 months old, the ciliary body of P23H rats showed a higher
number of Iba1-/MHC-II+ cells than the ciliary body of SD rats at the same age (ANOVA,
Bonferroni’s test, P<0.01; Figure 11B).
Cytokine Array
To assess if the evolution of microglial cells in normal and diseased retina correlated with
the inflammatory state of the retinal tissue, we analyzed the expression of pro- and anti-
CAPÍTULO 3
88
inflammatory molecules in the retina of SD and P23H rats at 2 and 12 months old using a
cytokine antibody array. Nineteen rat cytokines were detected and semi-quantified on a
glass chip array (Figure 12A). At 2 months old, P23H rats showed a significant up-
regulation of fractalkine (receptor for CX3C chemokine ligand 1; CX3CL1), vascular
endothelial growth factor (VEGF) and ciliary neurotrophic factor (CNTF) in comparison
with SD rats at the same age (Student’s t-test, P<0.05; Figure 12B-C).
At 12 months old, P23H rats exhibited highest concentrations of cytokine-induced
neutrophil chemoattractant-2 (CINC2), cytokine-induced neutrophil chemoattractant-3
(CINC3), CNTF, fractalkine (CX3CL1), granulocyte macrophage colony-stimulating factor
(GM-CSF), interferon gamma (IFN-γ), interleukin-1 beta (IL-1β), interleukin-6 (IL-6),
interleukin-10 (IL-10), leptin, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), macrophage
inflammatory protein-3 alpha (MIP-3α), nerve growth factor beta (β-NGF),
metallopeptidase inhibitor 1 (TIMP-1) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α) as
compared to SD rats at the same age (Student’s t-test, P<0.05; Figure 12B-D).
CAPÍTULO 3
89
DISCUSSION
The main result of the present study is that, in a model of retinal degeneration the
neuroinflammatory response persists in retinal layers, sclera, choroid and ciliary body in
advanced stages of the degenerative process, even after the death of most photoreceptor
cells. Previous studies have demonstrated the relationship between microglial activation
and the progression of neurodegenerative diseases, including RP 13,38. Here, we studied
the morphology, number, activation and distribution of microglial cells through the retinal
tissue at different age points in control (SD) and diseased (P23H) rats. Microglial cells
were identified by their immunoreactivity against two constitutive microglial markers:
Iba1 protein (a 17 kDa EF-hand protein which is expressed in microglia and macrophages)
39 and CD11b integrin 40. Microglial activation was assessed by the expression of MHC
class II antigens 41 and the leukocyte common antigen CD45 42,43. To date, there is not an
unequivocal way to distinguish between resident microglia and recruited circulating
monocytes and macrophages, thus, we can not exclude that a part of the cells that we
studied did not take part of the resident retinal microglial population, and therefore, we
considered relevant the study of the structures surrounding the retina. We have
demonstrated that, while in SD rat retinas the total number of immunopositive cells for
one or both microglial markers (Iba1 and MHC-II) remains approximately constant over
time, in the retina of P23H rats there is a significant increase in the total number of these
cells through age.
In the P23H rats, it is particularly significant the increased number of Iba1+/MHC-II+ cells,
which remains high from 1 to 12 months old. These results, taken together with the data
obtained in the flow cytometry show that microglial activation is a retinal tissue response
sustained over time. In addition, as the P23H rat became older we found an increased
CAPÍTULO 3
90
amount of Iba1-/MHC-II+ cells with a peak value at 12 months old. Previous works showed
that microglial cells exposed to proinflammatory cytokines derived from Th1 cells, like
IFN-γ, TNF-α, GM-CSF, among others, are stimulated to express MHC-II 44. The peak in the
expression of MHC-II observed at 12 months old in P23H rats could be explained by an
increase in the expression of the cytokines cited above, corroborated by the results
obtained in the cytokine antibody array experiments.
Recent work of our research group evidenced the presence of a small group of MHC-II+
cells that were not labeled by anti-Iba1 antibody in P23H rat retinas 13. This fact is
interesting since the Iba1 protein is considered as a constitutively expressed microglial
marker, and is one of the most important molecules in the motile properties of these cells
due to its participation in the membrane ruffling processes 45,46. The existence of these
Iba1-/MHC-II+ cells can be explained by supposing that microglial cells may exhibit
different expression patterns according to their provenance. Maybe, these Iba1-/MHC-II+
cells are migrating cells that attend to the retinal tissue in response to negative stimuli. In
addition, these cells may be down-regulating the expression of Iba1 molecule in response
to the nature or the duration of the activating signal. Perhaps, the occurrence of this
novel expression pattern corresponds with an intermediate activation state between
resting and reactive microglial states. Anyway, what is clear is that the presence of this
microglial population characteristically occurs in the rat P23H and presumably will play a
specific role in the course of the disease.
The microglial population in the retinas of SD rats was mostly located in the inner part of
the retinal tissue (GCL and IPL), while in the retina of P23H rats we could see microglial
cells towards the outer layers of the retinal tissue (OPL and ONL) until 4 months old. The
migration of microglial cells through the retina was previously described in retinal
CAPÍTULO 3
91
organotypic cultures 47 and in animal models of retinal degeneration, like rd mice 15 or
RCS rats 48. This fact is evident in our study since microglial cells were able to reorganize
their localization when outer retinal layers disappear due to the progression of retinal
degeneration in P23H rats.
Another objective of our work was to study the inflammatory state of sclera, choroid and
ciliary body in both experimental groups (SD/P23H) along the rat life. Preceding
investigation in light-induced retinal damage showed that blood-borne macrophages
enter to the retina via the optic nerve and ciliary body and migrate to the injured retinal
area 37. These studies also found that in dark control retinas, microglial cells and
macrophages were mainly located within choroidal and conjunctival blood vessels and in
connective tissue around the optic nerve. In our investigation, we observed that the
sclera and choroid of SD rats had a relatively high immunoreactivity to Iba1 and MHC-II,
but lower than that observed in P23H rat retinas of the same age at 1 and 4 months old.
This could be due to the massive arrival of circulating monocytes/macrophages to the
retina during the first steps of the degenerative process. At later stages of retinal
degeneration (12 months old), we did not observe significant differences in fluorescence
area in choroid and sclera between SD and P23H rats. Previous studies showed that, in
RP, photoreceptor cell loss is correlated with subsequent deterioration of the retinal
capillary network 49 and lower retinal blood flow 50. In addition, preceding works in the
P23H rats revealed that these animals exhibited a poor capillary network with clear signs
of degeneration at 4 months old 51. We can hypothesize that, at our final experiment
point (12 months), despite the strong chemoattractant signal, the great degeneration of
the capillary network in P23H rats impeded the affluence of macrophage-like cells to the
retina via the choroid.
CAPÍTULO 3
92
The results observed in sclera and choroid were complemented with the data found in
the ciliary body, where we appreciated a greater total number of immunopositive cells at
1, 4 and 12 months old in P23H rats. Iba1+/MHC-II+ cells were higher in the ciliary body of
P23H rats at all ages tested, and we observed a significant increase of the amount of Iba1-
/MHC-II+ cells that correlated with the results obtained in the retinal
immunohistochemistry. The ciliary body is one of the main pathways through which
inflammatory cells can reach the retina 37, and is presumably that the macrophage-like
cells that cannot reach the retina through choroid at 12 months (because of its great
deterioration), arrive directly to the retina via ciliary body and optic nerve. So, it is likely
that these inflammatory cells that colonize the ciliary body, are ready to enter to the
retina and sustain the inflammatory conditions.
The cytokine array gave us key information about the inflammatory state of the retinal
tissue along the age progression in both experimental groups (SD and P23H). At 2 months
old, the differences in the inflammatory profile between SD and P23H rats were minimal.
We found a significant increase in the expression of fractalkine, VEGF and CNTF in P23H
rat retinas at 2 months old. Prior studies in fractalkine knockout mice showed that
fractalkine is able to control microglia migration in the retina 52, for example, the soluble
form of fractalkine released from photoreceptors may function as a chemotactic factor to
trigger the activation and migration of retinal microglia 53. In the retinal tissue, various cell
types have been described to produce VEGF, among them the retinal pigment epithelium
(RPE), Müller cells, pericytes and astrocytes 54. VEGF is a proangiogenic molecule that
promotes vascular permeability 54. Previous investigations in a model of traumatic brain
injury suggest that VEGF is implicated in the recruitment and activation of microglial cells
55. In animal models of retinal laser injury, an accumulation of microglial cells was
CAPÍTULO 3
93
observed in the site of damage with the subsequent increase of various growth factors
and cytokines like VEGF, TNF-α and IL-6 among others 56. CNTF is one of the most studied
neurotrophic factors in retinal degenerative diseases, and it has been hypothesized that
this molecule is released from damaged cells under pathological conditions 57 and from
glial cells 58. It is possible that, at early stages of the degenerative process in the P23H
rats, these three cytokines (fractalkine, VEGF and CNTF) mediate the initial response to
the photoreceptor cells death and promote the ensuing massive affluence of pro-
inflammatory cells and molecules.
At 12 months old the panorama changed drastically, in P23H rat retinas we observed a
significant rise in the expression of all the cytokines assessed, except of IL-1α, IL-4 and
VEGF. Although a slight increase of concentration cytokine IL-1α, IL-4 and VEGF in the
P23H group was detected, no statistical differences were found as compared to SD group.
The expression of cytokines in the retina of 12-month-old P23H rats experienced a
marked magnification with respect to SD rats at the same age point, including pro-
inflammatory molecules such as TNF-α, IFN-γ, IL-1β and IL-6 56,59,60; chemoattractant
molecules like CINC-2, CINC-3, MCP-1; and some neuroprotective factors as CNTF 61, GM-
CSF 62, IL-10 63 and β-NGF 64. However, some neuroprotective factors such as β-NGF or
CNTF can also act like chemoattractant signals for microglial/macrophages cells 65,66,
demonstrating that one factor could be intrinsically neuroprotector but its indirect
actions could trigger inflammation responses.
It is interesting that in P23H rats, despite the loss of a large proportion of photoreceptor
cells, the retinal tissue continues to present a strong inflammatory condition. Many
preceding works in animal models of RP, like rd10 mice and RCS rats 48,67, showed that the
production of pro-inflammatory cytokines is considerably increased in these animals and
CAPÍTULO 3
94
that the microglial activation is an early episode among the retinal degeneration. The
results of our investigation are in accordance with the works previously mentioned but, in
addition, we provide novel information about how the inflammatory response of the
retinal tissue evolves through age in RP. In this way, we demonstrate that (1) in an early
phase of retinal degeneration the activating microglial signal was composed mainly by
VEGF, CNTF and fractalkine; (2) with age, microglial cells of P23H rats exhibited an intense
variation, not only in phenotypes expressed but also in their organization and number
through the retinal tissue; (3) at 12 months old degenerating retina, the amount of pro-
inflammatory cytokines was notably increased in comparison with a normal retina; (4) the
inflammatory response was also present in choroid and ciliary body, which may act like a
pool of pro-inflammatory cells and molecules; (5) at an advanced stage of retinal
degeneration, the arrival of pro-inflammatory cells and molecules through choroid was
diminished; and (6) the peak of pro-inflammatory cells in the choroid and ciliary body of
P23H rats is at 4 months old, and is correlated with the peak of photoreceptor cells death
in the retina 68.
Taken together, these findings suggest that, in a model of RP, the inflammatory state of
the retina, once started, is a sustained response along the rat life, even after the loss of
the photoreceptor cell population, and other factors besides from the photoreceptor
death should be involved in its maintenance. These factors are maybe important not only
in the control of the microglial activation, but also in the regulation of the inflammatory
state and the integrity of the structures surrounding the retina, like choroid and ciliary
body. In conclusion, the results of our investigation provide a new global view of the
retinal microglial inflammatory response that is important to take into account for future
therapies. The response of microglia toward a permanently activated state can trigger a
CAPÍTULO 3
95
long-term sickness response that may determine the success or fail of a potential therapy.
In this sense, the use of anti-inflammatory drugs, even at late stages of the
neurodegenerative process, could preserve the retina in a better state to be used for
stem cells transplantation or gene therapy.
CAPÍTULO 3
96
METHODS
Animals
Homozygous P23H line 3 rats, kindly provided by Matthew LaVail (UCSF School of
Medicine; www.ucsfeye.net/mlavailRDratmodels.shtml) were used in this study as a
model of RP. Age-matched wild-type Sprague-Dawley (SD) rats (Harlan Laboratories,
Barcelona, Spain) were used as control animals. Six SD and six P23H rats of each age
group were used for the study. All animals were housed in cages under controlled
photoperiod (12 h light/12 h dark), temperature (23 °C ± 1 °C) and humidity (55 - 60%).
Food and water were available ad libitum. All the procedures were carried out under the
Project License UA-2013-07-22 approved by the Ethics Committee for Animal Experiment
from the University of Alicante. All animals were handled in accordance with the current
regulations for the use of laboratory animals (NIH, ARVO and European Directive
2010/63/UE) in order to minimize animal suffering and limit the numbers used for the
experiments.
Retinal immunohistochemistry
Histological studies were performed at 1, 4, 6 and 12 months old. Cryostat vertical
sections were obtained and processed for immunolabeling following well-established
procedures 69-72. Animals were sacrificed in the morning by administration of a lethal dose
of pentobarbital (100 mg/kg, i.p.). After marking the dorsal margin of the sclerocorneal
limbus with a suture, the eyes were enucleated and fixed in 4% (w/v) paraformaldehyde
during 1 h at room temperature. After being washed in 0.1 M phosphate buffer pH 7.4
(PB), the eyes were cryoprotected sequentially in 15, 20 and 30% (w/v) sucrose. The
cornea, lens and vitreous body were removed. For retinal sectioning the eyecups were
embedded in Tissue-Tek OCT (Sakura Finetek, Zoeterwouden, Netherlands) and frozen in
CAPÍTULO 3
97
liquid N2. Sixteen-micrometer-thick sections were obtained at -25 °C using a Leica CM
1900 cryostat (Leica Microsystems, Wetzlar, Germany), mounted on slides (Superfrost
Plus; Menzel GmbH and Co. KG, Braunschweig, Germany) and air-dried. Slides were
washed three times in PB and incubated with blocking solution (10% donkey serum, 0.5%
triton X-100 in PB) for 1h. Sections were incubated overnight at room temperature for
single or double immunostaining with the primary antibodies: polyclonal rabbit anti-
ionized calcium binding adapter molecule 1 (Iba1, 1:1000; Wako Chemicals, Richmond,
VA, USA) and monoclonal mouse anti-major histocompatibility complex (MHC) class II
RT1B clone OX-6 (1:200, AbD Serotec, Kidlington, UK), diluted in PB containing 0.5% Triton
X-100. The secondary antibodies were donkey anti-mouse or anti-rabbit IgG conjugated
to Alexa Fluor 488 or 555 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) at 1:100 dilution. Finally,
images were obtained under a Leica (Leica Microsystems) TCS SP2 confocal laser-scanning
microscope. Images from SD and P23H rats were processed in parallel using Adobe
Photoshop 10 software (Adobe Systems Inc., San Jose, CA, USA).
Analysis of microglial cell numbers, activation and spatial distribution
To analyze microglial cell numbers and activation, we used retinal vertical cryosections
immunostained with anti-Iba1 and anti-MHC-II antibodies. We examined three non-
consecutive sections per animal and studied four animals per age group. All the images
analyzed were collected from the central area of the retina, close to the optic nerve. In
each retinal section, the total number of microglial cells expressing one or both markers
(Iba1+/MHC-II-, Iba1-/MHC-II+ and Iba1+/MHC-II+) was counted using a fluorescent
microscope (Leica DMR, Leica Microsystems) under 63X magnification. The data were
referred to the length of each retinal section, measured using ImageJ software 73.
CAPÍTULO 3
98
In a parallel count, we analyzed the percentage of microglia that were located in each
retinal layer, as referred to the total microglial cells (100%) in the same retinal section.
The counting was assessed using an optic Leica DMR microscope (Leica Microsystems)
under 40X magnification.
In addition, we studied changes in microglial density and activation in the sclera, choroid
and ciliary body. For this purpose, we obtained confocal images under 20X magnification.
We analyzed three groups of age (1, 4 and 12 months) and four animals per age group
and genotype (SD and P23H). The images were obtained in four representative retinal
regions of each animal section: nasal peripheral, nasal central, temporal central and
temporal peripheral. The images of peripheral regions (nasal/temporal) were taken at
0.45 mm from the ciliary body, and the images of central regions (nasal/temporal) were
taken at 0.45 mm from the optic nerve. In each of these images, we established
rectangular regions of interest (0.227 mm2) that covered both, the sclera and the choroid,
for the subsequent measurement of the fluorescence area (in pixels) using ImageJ
software.
CAPÍTULO 3
99
Flow Cytometry Analysis
The eyes from 1, 2, 3, 4, 6 and 12-month-old SD and P23H rats were enucleated and the
retinas were dissected. Retinas were placed in 1 ml of phosphate-buffered saline (PBS),
pH 7.4, and were disaggregated by gently pipetting up and down through a wide bore
pipette tip. The cell suspension was filtered through a 30-µm strainer from BD Biosciences
(San Diego, CA, USA) to avoid cell clumps. For the detection of microglia and its activated
state, disaggregated retinal cells were triple-stained with a cocktail of rat PE-conjugated
anti-CD11b antibody, APC-conjugated anti-MHC class II antibody (clone M5/114.15.2;
Milteny Biotec, Bergish Gladbach, Germany) and FITC-conjugated anti-mouse CD45 (clone
104.2; Milteny Biotec). Labelled cells from each rat retina were examined separately.
Analyses were performed in an LSRFortessa cytometer (BD Biosciences) and the data
were analyzed with FACSDiva software (BD Biosciences).
Cytokine Array
To determine the expression of inflammatory cytokines in the retina of SD and P23H rats,
a rat cytokine antibody array was used (RayBio® rat cytokine antibody array G-series 1;
Cat#AAR-CYT-G1-8; RayBiotech, Norcross, GA, USA). Following the manufacturer´s
instructions, protein lysates were obtained by homogenization of 2 and 12 months old
retinas in lysis buffer. Protein extracts were prepared at 1 µg/µl in blocking buffer, and
100 µl per well were used. Four samples for each age group (2 and 12 months old) were
incubated with the microarray glass chip overnight at 4°C under gentle rotation. After
washing, the glass chip was processed for posterior analysis. Finally, the slide was
scanned at 532 nm and analyzed using GenePix® Pro 6.0 software (Axon Instruments Inc.,
Union City, CA, USA).
CAPÍTULO 3
100
Electroretinograms recording
Scotopic electroretinograms (ERGs) were performed at 1, 4 and 12 months old, in SD and
P23H rats. Following overnight dark adaptation, animals were prepared for bilateral ERG
recording. Animals were anesthetized by intraperitoneal injection of ketamine (100
mg/kg) and xylazine (4 mg/kg), and maintained on a heating pad at 38°C. Pupils were
dilated by topical administration of 1% tropicamide (Alcon Cusí, Barcelona, Spain). A drop
of Viscotears 0.2% polyacrylic acid carbomer (Novartis, Barcelona, Spain) was infused on
the cornea to prevent dehydration and allow electrical contact with the recording
electrodes. Electrodes were DTL fiber with an X-Static silver-coated nylon conductive
strand, from Sauquoit Industries (Scranton, PA, USA). A 25-gauge platinum needle
inserted under the scalp between the eyes was used as the reference electrode. A gold
electrode was placed in the mouth and acted as ground. Anesthetized animals were
placed in a Faraday cage and all experiments were performed in absolute darkness.
Scotopic flash-induced ERG responses were recorded from both eyes in response to light
stimuli produced by a Ganzfeld stimulator. Light stimuli were presented for 10 ms at 11
different increasing luminances with ranges from −5.2 to 0 log cd s/m2. Three to ten
consecutive recordings were averaged for each light presentation. The interval between
light flashes was 10 s for dim flashes (−5.2 to −1.4 log cd s/m2) and up to 20 s for the
higher luminances (−0.8 to 0 log cd s/m2). The ERG signals were amplified and band-pass
filtered (1–1000 Hz, without notch filtering) using a DAM50 data acquisition board (World
Precision Instruments, Aston, UK). Stimulus presentation and data acquisition (4 kHz)
were performed using a PowerLab system (AD Instruments, Oxfordshire, UK). Recordings
were analyzed off-line. The amplitude of the a-wave was measured from the baseline.
CAPÍTULO 3
101
The amplitude of the b-wave was determined from the trough of the a-wave to the peak
of the b-wave.
Statistics and data analysis
Immunohistochemistry. Statistical analyses were performed using SPSS 20.0 software
(IBM, Armonk, NY, USA), in order to evaluate differences between SD and P23H rats at
the different ages tested. A one-way ANOVA was used to compare the mean number of
microglial cells, and a two-way ANOVA was performed to compare the number of
microglial cells corresponding to each of the three phenotypes analyzed (Iba1+/MHC-II−,
Iba1−/MHC-II+ and Iba1+/MHC-II+). When a 0.05 level of significance was found, post hoc
pairwise comparisons using Bonferroni’s test were performed. Normal distributions and
homogeneity of variance were found for all analyzed categories. Values of P < 0.05 were
considered statistically significant. Data were plotted as the average ± standard error of
the mean (SEM).
Flow cytometry. Student’s t-test was applied using GraphPad® software (Graph-Pad
Software, Inc., San Diego, CA, USA). Results are expressed as mean ± standard deviation
and values of P < 0.05 were considered significant.
Cytokine Array. Cytokines expression levels were obtained by measuring the fluorescence
intensity of each protein spot on the microarray glass chip with GenePix® Pro 6.0
software (Axon Instruments). Each cytokine was presented in duplicate and the analysis
was performed twice. The background was subtracted from the fluorescence intensity
values and these were normalized to the positive control signals. Then, we compared the
signal intensities between and among array images to determine relative differences in
the expression levels of each cytokine. Any ≥1.5-fold increase or ≤0.65-fold decrease in
CAPÍTULO 3
102
signal intensity for a single molecule between groups was considered a significant
difference in expression, provided that both sets of signals were well above background.
Student’s t-test was used to analyze statistical differences between groups; P < 0.05 was
considered statistically significant.
Electroretinograms recording. Statistical analyses were performed using SPSS 20.0
software (IBM) to evaluate differences between ERG responses in SD and P23H rats at 1,
4 and 12 months old. A MANOVA was performed to evaluate the effects of age
progression on ERG responses. When a 0.05 level of significance was observed, post hoc
pairwise comparisons using Bonferroni's test were made. Normal distributions and
homogeneity of variance were found for all analyzed categories. Values of P < 0.05 were
considered significant. Data were plotted as the mean ± SEM.
CAPÍTULO 3
103
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CAPÍTULO 3
111
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by grants from the Spanish Ministry of Economy and
Competitiveness-FEDER (BFU2012-36845), Instituto de Salud Carlos III (RETICS-FEDER
RD12/0034/0010), Organización Nacional de Ciegos Españoles (ONCE), Asociación Retina
Asturias, FUNDALUCE and Fundación Jesús de Gangoiti Barrera.
AUTHOR CONTRIBUTIONS
Conceived the experiments: AN, VM, NC. Performed the experiments: AN, VM, LCB, VGV.
Analyzed the data: AN, PL, LCB. Contributed to the writing of the manuscript: AN, VM,
LCB, PL, NC. All authors read and approved the final manuscript.
COMPETING INTERESTS
The author(s) declare that they have no competing interests.
CAPÍTULO 3
112
FIGURE LEGENDS
Figure 1. ERG responsiveness. (A) Scotopic ERG traces of SD and P23H rats at 1, 4 and 12
months old. Units on the left of the panel indicate input flash intensities in log cd s/m2. (B)
Luminance-response curves of SD (blue/circle) and P23H (red/square) rats at 1, 4 and 12
months old. Data are reported as mean ± SEM.
Figure 2. Activation of microglial cells. (A-F) Vertical section of retinas from SD rats at 1, 4
and 12 months old and (G-L) P23H 1, 4 and 12-month-old rats stained for Iba1 and MHC-II
RT 1B (green and red; A-C, G-I) or only MHC-II RT 1B (red; D-F, J-L). Nuclei stained with a
nuclear marker (blue, TO-PRO 3). All images were collected from the central area of the
retina, close to the optic nerve. GCL, ganglion cell layer; IPL, inner plexiform layer; OPL,
outer plexiform layer. Scale bar: 40 μm.
Figure 3. Microglial cells at 4 months old in SD and P23H rat retinas. This figure gives a
more detailed view of the characteristic appearance of microglial cells in the different
retinal layers, microglial cells were immunostained with Iba1 (green), MHC-II RT 1B (red)
and a nuclear marker, TO-PRO 3 (blue). GCL, ganglion cell layer; IPL, inner plexiform layer;
INL, inner nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; ONL, outer nuclear layer. Scale bar:
20 μm.
Figure 4. Flow cytometry analysis of rat retinas. (A) Retinal cells from single retinas were
labelled with a cocktail of PE-conjugated anti-CD11b, APC-conjugated anti-MHC class II
and FITC-conjugated anti-CD45 anti-rat antibodies, and analyzed by flow cytometry (106
cells were analyzed in each assay). The CD11b+ cells were gated. (B) Plots of FCS-CD11b+
cells presenting MHC-II- (green) and MHCII+ (yellow) staining are shown for SD and P23H
rats at the indicated ages. Results show data from a single experiment representative of 3
to 7 independent assays in each condition. 500.000 events are shown in each case. The
CAPÍTULO 3
113
percentage value of MHCII+ cells of the total CD11b+ population is also shown. (C) Line
graph showing the percentage of MHC-II+ cells of CD11b+ population in SD and P23H rats
at each age point. (D) Mean values of the percentage of CD11b+ population at each age
point studied (of the total retinal population analyzed). Data are reported as mean ±
standard deviation. *P<0.05, **P <0.01, ***P < 0.001, Student’s t-test.
Figure 5. Quantification and distribution of total microglial cells in the retinal tissue. (A)
Average number of microglial cells per mm of vertical retinal section analyzed at each age
point (4 animals per age group). Bars represent the average ± standard deviation. (B)
Distribution of microglial cells in the retina. Bars represent the percentage of microglial
cells quantified in each retinal layer. GCL, ganglion cell layer; IPL, inner plexiform layer;
INL, inner nuclear layer; OPL, outer plexiform layer; ONL, outer nuclear layer; SS,
subretinal space. (C-E) Quantification of retinal microglial activation at different age
points. (C) Average number of microglial cells showing the phenotype Iba1+/MHC-II-, (D)
Iba1-/MHC-II+ and (E) Iba1+/MHC-II+ (E), quantified in vertical retinal sections from SD 1, 4
and 12 months old and P23H 1, 4 and 12-month-old rats (4 animals per age group). Bars
represent the average ± standard deviation. Different letters indicate significant
differences inside each animal group throughout time (1, 4, 6 and 12 months old) and
between experimental groups.
Figure 6. General view of microglial cells in the sclera and choroid. (A, C) Complete
sections of a SD (A) and a P23H 1-month-old rats (C) retinas stained for Iba1 (green),
MHC-II RT 1B (red) and a nuclear marker, TO-PRO 3 (blue) (B, D) Zoom image in a central
zone of the retinal section shown in (A) and (C), respectively. Note the differences in the
fluorescent area in sclera and choroid at 1 month old. Scale bar: (A, C) 500 µm; (B, D) 100
µm.
CAPÍTULO 3
114
Figure 7. Closer view of microglial cells in the sclera and choroid. (A-F) Vertical retinal
sections of a SD (A-C) and a P23H 1, 4 and 12-month-old rats (D-F) stained for Iba1
(green), MHC-II RT 1B (red) and a nuclear marker, TO-PRO 3 (blue). Scale bar: 100 µm. (G-
H) Detailed view of sclera and choroid in SD and P23H rats at 1 month old. This figure
shows a closer view of the typical features of immunopositive cells that were present in
sclera and choroid. Cells were stained for Iba1, MHC-II RT 1B and TO-PRO 3. (A-F) Scale
bar: 50 µm; (G-H) scale bar: 100 µm.
Figure 8. Quantification of microglial cells in the sclera and choroid. (A) Fluorescent area
in pixels of sclera and choroid in the whole vertical retinal section of SD and P23H 1, 4 and
12-month-old rats. (B) Fluorescent area in pixels at representative retinal regions (nasal
peripheral, nasal central, temporal central and temporal peripheral) of SD and P23H 1, 4
and 12-month-old rat retinas measured in the sclera and choroid regions. Bars represent
the average ± SD. The scheme in the margin of each panel represents the position in the
retina of each representative region analyzed ** P <0.01, ***P <0.001; ANOVA,
Bonferroni’s test.
Figure 9. Microglial cells in the ciliary body of SD and P23H rats. (A, C, E) Vertical sections
of the ciliary body of SD rats at 1 (A), 4 (C) and 12 (E) months old stained for Iba1 (green)
and MHC-II RT 1B (red). (B, D, F) Vertical sections of the ciliary body of P23H rats at 1 (B),
4 (D) and 12 (F) months old stained for Iba1 and MHC-II RT 1B. Scale bar: 50 µm.
Figure 10. High magnification view of the ciliary body of SD and P23H rats. Characteristic
appearance of immunopositive cells in the ciliary body of SD (A, C) and P23H rats (B, D) at
4 (A, B) and 12 (C, D) months old stained for Iba1 (green) and MHC-II RT 1B (red). Nuclei
CAPÍTULO 3
115
stained with a nuclear marker (blue, TO-PRO 3). Arrowheads point non-specific
immunostaining of vessels with the secondary antibody. Scale bar: 50 µm.
Figure 11. Quantification of microglial activation in the ciliary body. (A) Total
immunopositive cells (Iba1+ and/or MHC-II+) per mm2 in the ciliary body of SD and P23H
1, 4 and 12-month-old rats. (B) Number of microglial cells showing the phenotypes
Iba1+/MHC-II-, Iba1+/MHC-II+ and Iba1-/MHC-II+ in the ciliary body of SD and P23H 1, 4
and 12-month-old rats. Bars represent the average ± standard deviation. Different letters
indicate significant differences inside each animal group throughout time (1, 4 and 12
months old) and between experimental groups.
Figure 12. Cytokine-expression profile analysis. (A) RayBio® rat cytokine antibody array G-
series 1 map. (B) Representative scanning of SD and P23H rats at 2 and 12 months old. (C)
Average normalized fluorescence intensity for each pair of cytokine spot at 2 months old
in SD and P23H rats. (D) Average normalized fluorescence intensity for each pair of
cytokine spot at 12 months old in SD and P23H rats. *P <0.05, Student’s t-test.
CAPÍTULO 3
116
Figure 1
CAPÍTULO 3
117
Figure 2
CAPÍTULO 3
118
Figure 3
Figure 4
CAPÍTULO 3
119
Figure 5
CAPÍTULO 3
120
Figure 6
CAPÍTULO 3
121
Figure 7
CAPÍTULO 3
122
Figure 8
CAPÍTULO 3
123
Figure 9
CAPÍTULO 3
124
Figure 10
CAPÍTULO 3
125
Figure 11
CAPÍTULO 3
126
Figure 12
CAPÍTULO 4
La estimulación crónica de la respuesta inflamatoria mediante lipopolisacárido
agrava el proceso degenerativo de la retina en un modelo animal de degeneración
retiniana
Noailles, A.1; Maneu, V.2; Lax, P.1; Cuenca, N.1
1Departamento de Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante, España.
Manuscrito en preparación
CAPÍTULO 4
129
La estimulación crónica de la respuesta inflamatoria mediante lipopolisacárido agrava el
proceso degenerativo de la retina en un modelo animal de degeneración retiniana.
Agustina Noailles1, Victoria Maneu2, Pedro Lax1, Nicolás Cuenca1.
1 Fisiología, Genética y Microbiología, Universidad de Alicante, España.
2Óptica, Farmacología y Anatomía Universidad de Alicante, España.
Este trabajo fue financiado por subvenciones del Ministerio español de Economía y
Competitividad-FEDER (BFU2012-36845), Instituto de Salud Carlos III (RETICS-FEDER RD12
/ 0034/0010), Retina Asturias, Fundación Jesús de Gangoiti Barrera, Organización Nacional
de Ciegos Españoles (ONCE) y FUNDALUCE.
Resumen
La activación crónica de la microglía se asocia con enfermedades
neurodegenerativas y se ha demostrado que puede contribuir al daño del tejido retiniano
durante un proceso patológico. El objetivo de este trabajo fue estudiar el efecto que
produce la activación crónica de la respuesta inflamatoria en la progresión de las
alteraciones morfológicas y funcionales causadas por enfermedades degenerativas de la
retina. Para ello, provocamos la activación de la microglía mediante la administración de
lipopolisacárido (LPS) a ratas P23H línea 3 como modelo de retinosis pigmentaria y ratas
Sprague-Dawley (SD) como control. Los animales recibieron semanalmente dos inyecciones
de LPS (60 µg/Kg, i.p.), o dos inyecciones de vehículo (PBS), durante las edades P20 a P60.
A P60, evaluamos la respuesta visual mediante registro electrorretinográfico (ERG) y, tras
el sacrificio de los animales, analizamos la estructura y la población microglial de la retina
mediante técnicas de inmunohistoquímica y citometría de flujo. La densidad de microglía y
su distribución se analizó utilizando anticuerpos anti-Iba1 y anti-CD11b y el grado de
activación microglial se evaluó utilizando anticuerpos anti-CD45 y anti-MHCII. El estado de
degeneración de la retina en cada grupo experimental se analizó mediante la valoración
CAPÍTULO 4
130
del número, morfología y conectividad de diferentes poblaciones neuronales, utilizando
marcadores específicos de células de la retina. A las dosis ensayadas, la administración de
LPS no produjo cambios significativos en la densidad, morfología, distribución o grado de
activación de la microglía en la retina de ratas SD, en las que las células microgliales,
localizadas sobre todo en la capa de células ganglionares y en las capas plexiformes de la
retina, mostraron un aspecto característico de células con soma pequeño y redondeado,
con finas ramificaciones. En cambio, el LPS aumentó la densidad y la activación microglial
en retinas P23H, con un incremento en la expresión de los antígenos CD11b y CD45. Estos
cambios se asociaron con mayor deterioro en la respuesta ERG, mayor pérdida de
fotorreceptores y empeoramiento de la conectividad sináptica, en relación a lo observado
en ratas P23H tratadas con vehículo. Estos resultados sugieren que el exacerbamiento
crónico de la respuesta inflamatoria inducido por LPS provoca la aceleración de procesos
neurodegenerativos en la retina.
CAPÍTULO 4
131
1. Introducción
La microglía forma parte de la población de fagocitos mononucleares del sistema
nervioso central (SNC), incluyendo la retina, y juega un papel relevante bajo condiciones
fisiológicas y patológicas. En una retina sana, las células microgliales se encuentran en un
estado de “reposo", caracterizado por la liberación de factores neurotróficos, que
favorecen la supervivencia neuronal, y por el mantenimiento de la homeostasis del
microambiente celular. Cuando se produce algún tipo de estímulo negativo, como
infecciones oculares, trauma o procesos de neurodegenerativos, la microglía adquiere un
estado activado, en el que es capaz de proliferar, migrar a los sitios dañados, experimentar
una transformación hacia una morfología ameboide y secretar moléculas que inician los
mecanismos de reparación tisular (Langmann 2007; Karlstetter y cols. 2010; Polazzi y Monti
2010; Harry 2013; Cuenca y cols. 2014). En las primeras etapas de un proceso
neurodegenerativo, las células microgliales inician los mecanismos de reparación y se
considera que tienen un papel neuroprotector. Sin embargo, la activación microglial
excesiva o prolongada es capaz de desencadenar una inflamación crónica, debido a la
secreción mantenida de sustancias neurotóxicas que provocan efectos secundarios
patológicos graves, daño en la retina y apoptosis neuronal (Langmann 2007; Polazzi y Monti
2010; Czeh y cols. 2011).
Varias lesiones del SNC tales como infecciones, enfermedades neurodegenerativas,
lesiones químicas o envejecimiento están asociadas a una activación de la microglía y a
elevados niveles de citoquinas pro-inflamatorias (Benveniste 1992; Lucin y Wyss-Coray
2009; Polazzi y Monti 2010; Harry 2013). En la enfermedad de Parkinson se ha observado
un mayor número de microglía activa en el cerebro, acompañado por incremento en la
expresión de citoquinas pro-inflamatorias (Tansey y cols. 2007; Hirsch y Hunot 2009). En
modelos animales de Parkinson crónico, se ha visto que las células microgliales conservan
sus características fagocíticas en las áreas cerebrales donde se ha producido la
degeneración de las neuronas dopaminérgicas, incluso varios años después del daño
provocado por la toxina 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) (Barcia y
cols. 2013). La activación microglial también está estrechamente ligada con la enfermedad
del Alzheimer, en la que se han visto células microgliales activas asociadas a las placas
amiloides que aparecen en el cerebro (Bornemann y cols. 2001; Griffin y cols. 2006).
CAPÍTULO 4
132
Estudios previos llevados a cabo con pacientes enfermos de Alzheimer han demostrado
que los elevados niveles de TNF-α producidos por una inflamación crónica sistémica,
empeoran los síntomas de la enfermedad y aceleran el declive cognitivo (Holmes y cols.
2009). Además, en otras enfermedades neurodegenerativas, como la esclerosis lateral
amiotrófica o la enfermedad de Huntington también se ha observado activación microglial
(Polazzi y Monti 2010). Las enfermedades neurodegenerativas de la retina llevan asociada
una activación microglial crónica y un proceso neuroinflamatorio, como ocurre en la
retinosis pigmentaria (Gupta y cols. 2003), degeneración macular asociada a la edad
(Penfold y cols. 2001) o glaucoma (Bosco y cols. 2012; Gallego y cols. 2012). En la retina en
degeneración, las señales endógenas son capaces de activar a las células microgliales, lo
que desencadena su proliferación local, migración, aumento de la fagocitosis y secreción
de citoquinas, quimioquinas y neurotoxinas. Estas respuestas inmunológicas y la pérdida
de los mecanismos de autorregulación podrían contribuir de forma significativa al daño en
la retina y a acelerar los eventos pro-apoptóticos (Gupta y cols. 2003; Langmann 2007;
Karlstetter y cols. 2010). Por ello, los diferentes estímulos negativos que desencadenan una
activación prolongada de la microglía pueden ser potencialmente perjudiciales para el
tejido neuronal. En este sentido, las infecciones sistémicas son capaces de inducir la
activación microglial en el cerebro, convirtiéndose en un factor de riesgo a tener en cuenta
en las enfermedades neurodegenerativas. Así, estudios anteriores han demostrado que la
microglía en el cerebro es capaz de activarse en respuesta a infecciones fúngicas sistémicas
(Lionakis y cols. 2011), a inflamación periférica (Villaran y cols. 2010; Machado y cols. 2011)
o en caso de inmunosupresión (Hao y cols. 2001). También en la retina, la microglía se
activa en caso de administración sistémica de LPS, principal componente de la pared celular
de las bacterias gram-negativas y responsable de la actividad antigénica (Halder y cols.
2013; Tremblay y cols. 2013), así como en caso de infecciones virales sistémicas
(Zinkernagel y cols. 2013) o fúngicas (Maneu y cols. 2014).
El objetivo fundamental de este trabajo fue estudiar si un daño producido por un
proceso inflamatorio periférico crónico podría considerarse como un factor de riesgo que
pudiera empeorar la progresión de una enfermedad degenerativa de la retina. Para ello
estudiamos el efecto que produce una administración sistémica de lipopolisacárido (LPS) a
un animal modelo de retinosis pigmentaria (rata P23H).
CAPÍTULO 4
133
2. Materiales y métodos
2.1 Animales
En este estudio se utilizaron ratas de la línea 3 homocigótica P23H, amablemente
proporcionadas por Matthew LaVail (UCSF School of Medicine;
www.ucsfeye.net/mlavailRDratmodels.shtml) como modelo de retinosis pigmentaria (RP)
y ratas Sprague-Dawley (SD) como grupo control (Harlan Laboratories, Barcelona, España).
Para el estudio se utilizaron doce ratas SD y doce ratas P23H. Todos los animales fueron
alojados en jaulas bajo condiciones controladas de fotoperiodo (12 h de luz / 12 h de
oscuridad), temperatura (23 ± 1 °C) y humedad (55 - 60%). Los alimentos y agua estuvieron
disponibles ad libitum. Todos los procedimientos se llevaron a cabo bajo la Licencia del
proyecto UA-07/22/2013 aprobado por el Comité de Ética para la Experimentación Animal
de la Universidad de Alicante. Los animales fueron tratados de acuerdo con la normativa
vigente para el uso de animales de laboratorio (NIH Directiva Europea, ARVO y 2010/63 /
UE) a fin de minimizar el sufrimiento animal y limitar los números utilizados para los
experimentos.
2.2 Administración del LPS
El LPS fue adquirido en Sigma-Aldrich (L2630-25MG). Se preparó una disolución stock de
400 µg/ml en solución de cloruro sódico al 0,9% que fue almacenada en alícuotas de 1ml a
-20 °C hasta el momento de la administración. Seis ratas SD y seis ratas P23H recibieron
tres inyecciones semanales de LPS intraperitonealmente (i.p.) (60 μg/kg en tampón PBS),
otros dos grupos de seis ratas SD y seis ratas P23H se utilizaron como grupos control
recibiendo inyecciones de solución salina. El tratamiento comenzó a P20, edad previa a la
degeneración, y continuó hasta P60. Alcanzada esta edad se llevaron a cabo los
correspondientes registros electrorretinográficos, tras los cuales los animales fueron
sacrificados recibiendo una dosis letal de pentobarbital sódico (100 mg/kg, i.p.).
2.3 Registros electrorretinográficos
Los electrorretinogramas (ERG) en condiciones escotópicas se realizaron a P60 una vez
concluidos los tratamientos. Después de la adaptación a la oscuridad durante la noche, los
animales se prepararon para los ERG bilaterales, llevados a cabo bajo luz roja tenue.
CAPÍTULO 4
134
Los animales fueron anestesiados mediante una inyección i.p. de una mezcla de
ketamina (100 mg/kg) y xilazina (4 mg/kg) y durante el registro se mantuvieron en una
manta térmica a 38 °C. Las pupilas se dilataron por la aplicación tópica de tropicamida al
1% (Alcon, Barcelona, España). Se aplicó una gota de Viscotears 0,2% carbómero ácido
poliacrílico (Novartis, Barcelona, España) en la córnea para prevenir la deshidratación y
facilitar el contacto eléctrico con los electrodos de registro. Los electrodos utilizados eran
de fibra de DTL con una hebra conductora de nylon X-Static recubierta de plata de Sauquoit
Industries (Scranton, PA). Como electrodo de referencia se utilizó una aguja de platino de
calibre 25 insertada debajo del cuero cabelludo, en la línea que une el ángulo temporal de
los ojos sobre la línea media. Un electrodo de oro se colocó en la boca del animal y sirvió
como electrodo de tierra.
Los animales anestesiados se colocaron dentro de una jaula de Faraday y se realizaron
los registros en condiciones de oscuridad absoluta. Los estímulos luminosos fueron
producidos por un estimulador Ganzfeld y las respuestas escotópicas originadas se
registraron en ambos ojos. Los estímulos luminosos fueron de 10 ms de duración y se
correspondieron con 11 luminancias diferentes en orden creciente de intensidad (desde -
5,2 a 0 log cd s/m2). El intervalo entre destellos de luz fue de 10 s para destellos tenues (-
5,2 a -1,4 log cd s/m2) y un máximo de 20 s para las luminancias superiores (-0,8 a 0 log cd
s/m2).
Las señales ERG fueron amplificadas y filtradas (paso de banda 1-1000 Hz, sin filtrado
de muesca) utilizando una tarjeta de adquisición da datos DAM50 (World Precision
Instruments, Aston, Reino Unido). La presentación del estímulo y adquisición de datos (4
kHz) se realizaron utilizando un sistema PowerLab (AD Instruments, Oxfordshire, Reino
Unido). Los registros se guardaron y se analizaron posteriormente. La amplitud de la onda
a se midió desde la línea de base hasta el punto más bajo. La amplitud de la onda b se midió
desde el valle de la onda a al pico de la onda b.
Una vez finalizado los registros ERG, el animal fue sacrificado por dislocación cervical
tras administrarle una dosis letal de pentobarbital sódico, los ojos fueron enucleados y
procesados de acuerdo con la técnica a utilizar: inmunohistoquímica o citometría de flujo.
CAPÍTULO 4
135
2.4 Inmunohistoquímica
Los estudios histológicos se realizaron a P60 en los grupos control y en los tratados con
LPS de las ratas SD y P23H. Se obtuvieron secciones verticales de criostato y se procesaron
para el inmunomarcaje siguiendo procedimientos bien establecidos previamente (Cuenca
y Kolb 1989; Martinez-Navarrete y cols. 2007; Esteve-Rudd y cols. 2010). Tras el sacrificio
de los animales y tras marcar el margen dorsal del limbo esclerocorneal con una sutura, los
ojos fueron enucleados y se fijaron en 4% (p / v) de paraformaldehído durante 1 h a
temperatura ambiente. Tras ser lavados con tampón fosfato 0,1M pH 7,4 (PB), los ojos
fueron secuencialmente crioprotegidos en 15, 20 y 30% de sacarosa. La córnea, cristalino y
cuerpo vítreo fueron eliminados y la copa óptica se procesó para obtener criosecciones
verticales de retina. La inmunohistoquímica para obtener las imágenes de fluorescencia se
llevó a cabo en criosecciones transversales de retina. La copa óptica se embebió en Tissue-
Tek OCT (Sakura Finetek, Zoeterwouden, Holanda) y se congeló en nitrógeno líquido.
Utilizando un criostato Leica CM 1900 (Leica Microsystems, Wetzlar, Alemania), se
obtuvieron secciones de 16 µm, se recogieron en portas (Superfrost Plus; Menzel GmbH y
Co. KG, Braunschweig, Alemania) y se almacenaron hasta su posterior utilización.
Para realizar las tinciones, cada portaobjetos se descongeló, se lavó con PB 0,1M y se
bloqueó durante una hora con solución de bloqueo (10% de suero de asno, 0,5% de Triton
X-100 en PB). A continuación, las secciones son incubadas durante 24 horas a temperatura
ambiente con combinaciones de anticuerpos primarios para diferentes marcadores
moleculares en las diluciones indicadas en la Tabla 1, diluidos en 0,5% Triton X-100 en PB
0,1M. Al día siguiente se realizó la incubación con una mezcla de anticuerpos secundarios:
Alexa Fluor 488 anti-rabbit (verde) y/o Alexa Fluor 555 anti-mouse (rojo) (Molecular
Probes; dilución 1:100 en 0,5% Triton X-100 en PB 0,1M) y TO-PRO 3-iodide (azul) con el fin
de teñir los núcleos celulares, durante una hora a temperatura ambiente. Finalmente, cada
porta se lavó con PB 0,1M y se montó la preparación con Citifluor (Citifluor Ltd; Londres,
UK). Las imágenes se obtuvieron con un microscopio confocal Leica (Wetzlar, Alemania)
TCS SP2 y posteriormente se procesaron utilizando el software Adobe Photoshop 10
(Adobe Systems Inc., San Jose, CA, EE.UU).
CAPÍTULO 4
136
Tabla 1. Anticuerpos primarios utilizados en el estudio.
Anticuerpo Primario Casa Comercial Dilución
Mouse monoclonal anti-bassoon Stressgen 1:1000
Rabbit polyclonal anti-cone arrestin Millipore 1:500
Rabbit polyclonal anti-calbindin Swant 1:500
Rabbit polyclonal anti-Iba1 Wako 1:1000
Mouse monoclonal anti-MHC Class II
RT1B
ABD Serotec 1:200
2.5 Análisis del número de células microgliales en secciones de tejido
Para analizar la activación microglial en cada uno de los grupos de animales, utilizamos
las criosecciones verticales de retina inmunomarcadas con Iba1 y MHCIIRT1B. Examinamos
3 secciones verticales, que incluían el nervio óptico, no consecutivas de cada animal y
estudiamos 6 animales por grupo experimental. En cada sección de retina, el número total
de células que expresan uno o ambos marcadores (Iba1+/MHCII-, Iba1-/MHCII+ y
Iba1+/MHCII+) fue contabilizado mediante microscopia óptica con una amplificación X63.
Los datos obtenidos se refirieron a la longitud total de la sección analizada y
posteriormente extrapolados a mm de tejido retiniano (medida obtenida gracias al
software ImageJ; National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, EEUU).
2.6 Cuantificación de filas de fotorreceptores, conectividad sináptica e integridad de los
fotorreceptores tipo cono
Para el estudio de la degeneración de la retina en los dos grupos experimentales se
realizó un contaje de las filas de fotorreceptores utilizando un marcador nuclear, el TO-PRO
3. Se cuantificaron las filas de fotorreceptores en, al menos, dos secciones no consecutivas
de cada animal que incluían el nervio óptico. En el eje temporal-nasal, cada sección vertical
fue dividida en 6 regiones equidistantes, 3 en la zona temporal (temporal-periférica,
temporal-medial y temporal-central) y 3 en la zona nasal (nasal-periférica, nasal-medial y
nasal-central). Para cada animal estudiado se calculó el promedio de filas de
fotorreceptores para cada región de estudio.
CAPÍTULO 4
137
Evaluamos la conectividad sináptica en la capa plexiforme externa (OPL) de cada uno
de los grupos animales (Bassoon, Stressgen; 1:1000). Se analizaron secciones transversales
de retina y la cuantificación de la conectividad sináptica se realizó en zonas cercanas al
nervio óptico en todos los casos. Utilizamos el software ImageJ para estimar la cantidad de
fluorescencia que presentaba la OPL e IPL.
La integridad de los fotorreceptores de tipo cono fue evaluada mediante la observación
y el contaje en secciones inmunomarcadas con el anticuerpo policlonal de conejo anti-
arrestina de cono en ambos grupos experimentales.
2.7 Citometría de flujo
En primer lugar, los ojos fueron enucleados y las retinas se extrajeron cuidadosamente.
Las retinas se colocaron en 1 ml de tampón PBS (tampón fosfato salino) y se disgregaron
pipeteando suavemente. La suspensión celular se filtró a través de un filtro de 30 micras-
de BD Biosciences (San Diego, CA, EE.UU.) para evitar los agregados celulares. Para el
marcaje de la población y la detección de la activación microglial, las células de la retina
fueron sometidas a un triple marcaje con un cóctel de anticuerpos anti-CD11b conjugado
con APC (aloficocianina - Azul) preparado a 1:200 (Clon M1/70; eBioscience), anti-MHC de
clase II conjugado con PE (ficoeritrina - Rojo) (clon M5 / 114.15.2; Milteny Biotec, Bergish
Gladbach, Alemania) y anti-CD45 conjugado con FITC (clon 104.2, Milteny Biotec).
Las células marcadas de cada retina de rata se analizaron por separado. Los análisis se
realizaron en un citómetro LSRFortessa (BD Biosciences) y los datos se analizaron con el
software FACSDiva (BD Biosciences).
2.8 Análisis estadístico
Para estudiar los datos obtenidos en los registros ERG se realizaron análisis estadísticos
utilizando el paquete informático de tratamiento estadístico SPSS 20.0 (IBM Armonk, NY).
Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) para evaluar los efectos del tratamiento
(Control vs. LPS) sobre las respuestas ERG a P60. Cuando se encontró un nivel de
significancia de 0,05, se hicieron comparaciones pareadas post hoc utilizando el test de
Bonferroni. Se encontraron distribuciones normales y homogeneidad de varianza para
todas las categorías analizadas. Valores de p inferiores a 0,05 fueron considerados
CAPÍTULO 4
138
estadísticamente significativos. Los datos se representan como la media ± error estándar
de la media (SEM).
Para analizar los resultados obtenidos en la citometría de flujo se utilizó la prueba t de
Student empleando el software GraphPad (La Jolla, CA, EE.UU.). Los resultados se expresan
como media ± desviación estándar y valores de P<0,05 fueron considerados significativos.
Para evaluar las diferencias en la activación y número de células microgliales entre P23H
control, P23H+LPS y SD control, SD+LPS, se realizaron análisis estadísticos con el software
GraphPad (La Jolla, CA, EE.UU.). Para estudiar las diferencias observadas en el número total
de células microgliales utilizamos un ANOVA de un factor, mientras que para analizar las
diferencias halladas en el número de células microgliales correspondientes a cada uno de
los 3 patrones de expresión analizados (Iba1+/MHCII-, Iba1-/MHCII+ y Iba1+/MHCII+),
utilizamos un ANOVA de dos factores. Cuando encontramos un nivel de significación de
0,05, realizamos un test post-hoc de Bonferroni con comparaciones pareadas. Todas las
categorías analizadas presentaron una distribución normal y una homogeneidad de
varianzas. Valores de p<0,05 fueron considerados estadísticamente significativos. Los
datos aparecen representados como la media ± error estándar de la media (SEM).
Para analizar las diferencias en el número de filas de fotorreceptores entre P23H
control, P23H+LPS y SD control, SD+LPS, se realizó un análisis estadístico con el paquete
informático de tratamiento estadístico SPSS 20.0 (IBM Armonk, NY). Se realizó un análisis
de la varianza (ANOVA) para estudiar los efectos de cada tratamiento (Control vs. LPS)
sobre el número de filas de fotorreceptores.
La conectividad sináptica también fue analizada mediante un análisis estadístico
utilizando un paquete informático de tratamiento estadístico SPSS 20.0 (IBM Armonk, NY).
Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) para estudiar los efectos de cada tratamiento
(Control vs. LPS) sobre el área fluorescente de la OPL, que está correlacionada con el estado
de la conectividad sináptica.
CAPÍTULO 4
139
3. Resultados
3.1 Registros electrorretinográficos
A fin de evaluar el efecto de la administración de LPS en la actividad funcional de la
retina en las ratas P23H y SD, las respuestas electrorretinográficas inducidas por el flash
escotópico fueron registradas en los dos grupos de tratamiento (Grupos Control y LPS; n =
6 ). Como se muestra en la figura 1, la respuesta ERG de las ratas P23H del grupo control
(P60) estaba menos deteriorada que las ratas P23H tratadas con LPS. Las amplitudes
registradas en la onda b a P60 en condiciones escotópicas fueron mayores en el grupo P23H
control que en el grupo P23H+LPS (ANOVA, test de Bonferroni, p<0,05 y p<0,001; figura
1B). A P60, las amplitudes registradas en la onda a en condiciones escotópicas también
fueron mayores en el grupo P23H control que en el grupo P23H+LPS (ANOVA, test de
Bonferroni, p<0,001; figura 1C). La amplitud máxima registrada en la onda b en el grupo de
ratas P23H tratadas con LPS fue un 34% menor a la observada en el grupo P23H control. La
amplitud máxima obtenida en la onda a el grupo P23H+LPS fue un 34% menor que la
observada en las ratas del grupo P23H control.
CAPÍTULO 4
140
Figura 1. Registros electrorretinográficos y amplitudes de las ondas a y b en los diferentes
grupos experimentales de las ratas P23H. Representación de las respuestas ERG escotópicas
en una rata P23H control y P23H+LPS (A). Las unidades de la izquierda del panel indican las
intensidades de entrada del flash en log cd s/m2. Curvas estímulo-respuesta de las ratas
P23H control (círculo negro) y P23H+LPS (círculo rojo) a P60 (B, C). Las amplitudes de la
onda b fueron superiores en las ratas control, en comparación con las ratas tratadas con
LPS a P60 (ANOVA, test de Bonferroni p<0,001). Las amplitudes de la onda a fueron mayores
en los animales control (n=5) que en las ratas tratadas con LPS (n=5) a P60 (ANOVA, test de
Bonferroni, p<0,001). *p<0,05, ***p<0,001; ANOVA, test de Bonferroni.
La administración de LPS a las ratas SD no modificó la respuesta funcional de la retina,
como se puede apreciar en la figura 2. La respuesta ERG de las ratas SD no mostró
diferencias entre los dos grupos experimentales.
CAPÍTULO 4
141
Figura 2. Registros electrorretinográficos y amplitudes de las ondas a y b en los diferentes
grupos experimentales de las ratas SD. Representación de las respuestas ERG escotópicas
en una rata SD control y SD+LPS (A). Las unidades de la izquierda del panel indican las
intensidades del flash en log cd s/m2. Curvas estímulo-respuesta de las ratas SD control
(círculo negro) y SD+LPS (círculo rojo) a P60 (B, C). No se observan diferencias en las
amplitudes de las ondas a y b entre los diferentes grupos experimentales.
La figura 3 muestra una comparación de ambas ondas (a y b) en los diferentes grupos
experimentales SD y P23H, donde queda patente la pérdida en la respuesta ERG de las ratas
P23H+LPS en comparación con las ratas SD+LPS, que no experimentaron pérdida alguna.
CAPÍTULO 4
142
Figura 3. Comparación de las amplitudes de las ondas b (A) y a (B) en los diferentes grupos
experimentales de las ratas SD y P23H.
3.2 Estudio de filas de fotorreceptores, conectividad sináptica e integridad de los fotorreceptores tipo cono
Al estudiar las secciones verticales de cada animal inmunomarcadas con TO-PRO 3
observamos que las ratas P23H+LPS presentaron un menor número promedio de filas de
fotorreceptores en comparación con las P23H control (52%, ANOVA, test de Bonferroni,
p<0,001; figura 4A). Mientras que en las retinas de las ratas P23H observamos grandes
diferencias entre grupos experimentales, en las retinas de las ratas SD no encontramos
diferencias estadísticamente significativas entre los diferentes grupos (figura 4B).
Figura 4. Representación del valor promedio de filas de fotorreceptores en cada región del
eje temporal–nasal en las ratas P23H (A) y en las ratas SD (B). En las ratas P23H se observan
diferencias significativas en todas las regiones (A). En las ratas SD no encontramos
diferencias significativas (B). ***p<0,001 ANOVA, test de Bonferroni.
CAPÍTULO 4
143
En la figura 5 se puede apreciar el aspecto de las secciones verticales marcadas con
TO-PRO 3 en cada uno de los grupos experimentales de ratas P23H y SD. Las diferencias
observadas en el número de filas de fotorreceptores (y por lo tanto, en el grosor de la ONL)
en las ratas P23H resultaron más evidentes en la región nasal de la sección (figura 6). En las
ratas SD no encontramos diferencias (figura 5).
Figura 5. Filas de fotorreceptores de cada grupo experimental inmunomarcadas con TO-
PRO 3. ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell layer. Escala=20
µm, objetivo 40X.
CAPÍTULO 4
144
Figura 6. Fotografía panorámica de una sección transversal de cada grupo experimental (A,
B). Los núcleos celulares están teñidos con un marcador fluorescente, el 4',6-diamino-2-
fenilindol (DAPI). El grupo P23H control presenta un mayor grosor de la ONL que el grupo
P23H + LPS (B-E). Barra de escala: 1000 µm (A, B), 40 µm (D, E), objetivo 20X.
El estudio de la conectividad sináptica llevado a cabo con el software imageJ, reveló
diferencias significativas en el área fluorescente de la OPL (capa plexiforme externa) entre
CAPÍTULO 4
145
las ratas P23H control y las P23H+LPS (figura 7A, 7B). La conectividad sináptica fue mayor
en las ratas P23H control en comparación con el grupo tratado con LPS (350%, ANOVA, test
de Bonferroni, p<0,001; figura 7C). Sin embargo, no observamos diferencias significativas
entre las ratas P23H control y P23H+LPS a nivel de la IPL (capa plexiforme interna) (figura
7D). En el grupo de ratas SD no encontramos diferencias significativas en el área
fluorescente de ninguna de las capas plexiformes (datos no incluidos).
Figura 7. Conectividad sináptica en las ratas P23H. Inmunomarcaje con bassoon en las ratas
P23H control (A) y P23H + LPS (B). Cuantificación del área de fluorescencia en la OPL en los
dos grupos experimentales (C). Cuantificación del área de fluorescencia en la IPL en los dos
grupos experimentales (D). ***p<0,001; ANOVA, test de Bonferroni. OPL, outer plexiform
layer; IPL, inner plexiform layer. Escala = 40 µm, objetivo 40X.
Al estudiar las secciones inmunomarcadas con el anticuerpo policlonal de conejo anti-
calbindina no se encontraron diferencias significativas en el número y morfología de las
células horizontales de la retina, ni en el grupo de las ratas P23H ni en el grupo de las ratas
SD (figura 8 y 9).
CAPÍTULO 4
146
Figura 8. Secciones transversales de ratas SD control y SD+LPS (A, B) y P23H control y
P23H+LPS (C, D), inmunomarcadas con los anticuerpos bassoon, calbindina y un marcador
nuclear, el TO-PRO 3. ONL, outer nuclear layer; INL, inner nuclear layer; GCL, ganglion cell
layer. Escala = 40 µm, objetivo 40X.
CAPÍTULO 4
147
Figura 9. Vista detallada de la capa plexiforme externa de ratas SD control y SD+LPS (A, B)
y P23H control y P23H+LPS (C, D), inmunomarcadas con los anticuerpos bassoon, calbindina
y un marcador nuclear, el TO-PRO 3. Escala = 10 µm, objetivo 40X.
Uno de nuestros objetivos fue evaluar la morfología e integridad de los fotorreceptores
de tipo cono en la retina de las ratas P23H control y P23H+LPS para establecer si el
tratamiento activador de la microglía tenía efectos directos sobre este tipo de células. En
el grupo de ratas SD control y SD+LPS no encontramos diferencias entre los tratamientos
ni en morfología ni en número de fotorreceptores tipo cono (figura 10).
CAPÍTULO 4
148
Figura 10. Fotorreceptores tipo cono en las ratas SD control y SD+LPS (A, B) y P23H control
y P23H+LPS (C, D) marcados con el anticuerpo arrestina de conos (verde) y un marcador
nuclear, el TO-PRO 3 (azul). Escala = 40 µm, objetivo 40X. (E) Cuantificación del número de
fotorreceptores tipo cono por mm de retina en las ratas P23H control y P23H+LPS.
***p<0,001; ANOVA, test de Bonferroni.
CAPÍTULO 4
149
En la figura 10 observamos las diferencias en la morfología de los fotorreceptores tipo
cono en los diferentes tratamientos en las ratas P23H. Los fotorreceptores de las ratas P23H
tratadas con LPS muestran una clara degeneración morfológica (figura 10C, 10D), además de
aparecer en menor número en comparación con las ratas P23H control (figura 10E).
3.3 Citometría de flujo
En los análisis de citometría de flujo, toda la población microglial de la retina se
identificó por su inmunorreactividad contra el anticuerpo CD11b en las ratas SD control y
SD+LPS (figura 11) y P23H control y P23H+LPS (figura 12).
El análisis de la población de la microglía en las retinas de las ratas SD no mostró
diferencias significativas entre los diferentes tratamientos recibidos (0,8 ± 0,2% del total de
células analizadas en los controles frente a un 0,9 ± 0,2% en los animales tratados) (figura
11A, 11C).
CAPÍTULO 4
150
Figura 11. Efecto del tratamiento con LPS en las ratas SD evaluado por citometría de
flujo. Células retinianas procedentes de ratas SD control y SD+LPS, fueron triplemente
marcadas con un cóctel de anticuerpos formado por: anti-CD11b conjugado con APC, anti-
MHCII conjugado con PE y anti-CD45 conjugado con FITC (se analizaron 106 células en cada
ensayo) (A). El porcentaje de células CD11b-positivas de la población total aparece indicado
en la figura. Los dobles plots de células CD11b-positivas que co-expresan o bien CD45 o bien
MHCII se muestran en cada caso. Los resultados que se muestran se corresponden con una
única muestra representativa de cada uno de los grupos experimentales analizados.
Histograma que muestra la intensidad media de fluorescencia de las células microgliales
marcadas con los anticuerpos anti-CD11b (células CD11b-positivas), anti-MHCII (células
MHCII-positivas) y anti-CD45 (células CD45-positivas) en cada uno de los grupos
experimentales (B). Histograma que representa la cantidad de células de microglía en
función de la población total de células de la retina en porcentaje (C).
En las ratas P23H tratadas con LPS, la triple inmunotinción reveló un incremento
significativo en la expresión de los antígenos CD45 y CD11b en las células microgliales
(figura 12A, 12B) con respecto al valor medio de las ratas P23H control (figura 12A, 12B).
CAPÍTULO 4
151
En cuanto a la población, en las ratas P23H control la microglía representó un 4,0 ± 1,2 %
del total de células analizadas. En las ratas P23H+LPS la población CD11b-positiva fue de un
4,1 ± 0,8 % (figura 12A), si bien estas diferencias no fueron estadísticamente significativas
(figura 12C).
Figura 12. Efecto del tratamiento con LPS en las ratas P23H evaluado por citometría de
flujo. Células retinianas procedentes de ratas P23H control y P23H+LPS, fueron triplemente
marcadas con un cóctel de anticuerpos formado por: anti-CD11b conjugado con APC, anti-
MHCII conjugado con PE y anti-CD45 conjugado con FITC (se analizaron 106 células en cada
ensayo) (A). El porcentaje de células CD11b-positivas de la población total aparece indicado
en la figura. Los dobles plots de células CD11b-positivas que co-expresan o bien CD45 o bien
MHCII se muestran en cada caso. Los resultados que se muestran se corresponden con una
única muestra representativa de cada uno de los grupos experimentales analizados.
Histograma que muestra la intensidad media de fluorescencia de las células microgliales
marcadas con los anticuerpos anti-CD11b, anti-MHCII y anti-CD45 en cada uno de los
CAPÍTULO 4
152
grupos experimentales ** p<0,01, *** p<0,001; ANOVA, test de Bonferroni (B). Histograma
que representa la cantidad de microglía en función a la población total de células de la
retina en porcentaje (C).
3.4 Análisis del número células microgliales en secciones de retina
Para evaluar el efecto del tratamiento con LPS en la densidad de las células microgliales
de la retina en ratas P23H y SD, se determinó el número de células que aparecían
inmunomarcadas con alguno de los anticuerpos primarios utilizados para localizar células
microgliales (Iba1 y MHCIIRT1B). Se analizaron, al menos, dos secciones verticales no
consecutivas de cada animal perteneciente a cada grupo experimental (P23H control, n=5;
P23H+LPS, n=5 y SD control, n=5; SD+LPS, n=5) y los contajes fueron referidos a la longitud
total de cada sección vertical.
Considerando conjuntamente todas las secciones muestreadas de cada animal y
calculando los promedios para cada grupo experimental, las ratas P23H+LPS mostraron un
número total de células microgliales significativamente mayor que la observada en las ratas
P23H control (120%; ANOVA, test de Bonferroni, p<0,01; figura 13A).
Para evaluar el estado de activación, estudiamos el patrón de expresión de dos
marcadores microgliales (Iba1 y MHCIIRT1B) y cuantificamos el número de células que
exhiben dicho patrón de expresión. El número relativo de células Iba1+/MHCII- en las ratas
P23H+LPS fue mayor que en las ratas P23H control (112%; ANOVA, test de Bonferroni,
p<0,05; figura 13B).
El número de células doblemente marcadas Iba1+/MHCII+ fue significativamente mayor
en las ratas P23H + LPS en comparación con las P23H control (135%; ANOVA, test de
Bonferroni, p<0,001; figura 13B).
CAPÍTULO 4
153
Figura 13. Cuantificación de la activación microglial de la retina en secciones de tejido.
Número promedio de células microgliales Iba1 y/o MHCII positivas cuantificadas en
secciones verticales de P23H control y P23H+LPS (n=5) y SD control y SD+LPS (n=5) (A).
**p<0,01; ANOVA, test de Bonferroni. Número promedio de células microgliales que
mostraron los patrones de expresión Iba1+/MHCII- (verdes), Iba1+/MHCII+ (amarillas) e Iba1-
/MHCII+ (rojas) (B). Las diferentes letras indican diferencias significativas entre los
fenotipos.
En las ratas SD que recibieron los diferentes tratamientos, no encontramos diferencias
significativas en el número total de células microgliales ni en la cantidad y distribución de
los distintos fenotipos microgliales (figura 13A, 13B). En la figura 14 observamos que no
aparecen diferencias morfológicas en las células microgliales entre los diferentes
tratamientos y no encontramos inmunoreactividad frente a MHCII (marcador de activación
microglial).
CAPÍTULO 4
154
Figura 14. Células microgliales de las ratas SD control y SD+LPS inmunomarcadas con Iba1
(verde), MHCIIRT1B (rojo) y un marcador nuclear, el TO-PRO 3 (azul). OPL, outer plexiform
layer; IPL, inner plexiform layer; GCL, ganglion cell layer. Escala = 40 µm. Objetivo 40X.
En la figura 15 observamos la morfología de las células microgliales en las ratas P23H
control y P23H+LPS. En las ratas P23H+LPS además de la clara disminución del número de
filas de fotorreceptores, observamos una mayor proporción de células microgliales
Iba1+/MHCII+ en comparación con las ratas P23H control (figura 15). En la figura se observa
que, tanto las ratas P23H control como las ratas P23H+LPS presentan células microgliales
con ramificaciones engrosadas y cercanas al soma, lo que indica claramente su estado
activo.
CAPÍTULO 4
155
Figura 15. Células microgliales de las ratas P23H control y P23H+LPS inmunomarcadas con
Iba1 (verde), MHCIIRT1B (rojo) y un marcador nuclear, el TO-PRO 3 (azul). OPL, outer
plexiform layer; IPL, inner plexiform layer; GCL, ganglion cell layer. Escala = 40 µm. Objetivo
40X.
4. Discusión y conclusiones
En este estudio analizamos los efectos de un estado inflamatorio inducido por la
presencia de un agente antigénico como LPS en la retina de un modelo animal de RP. La
población microglial se identificó gracias a la expresión de la proteína Iba1, un marcador
constitutivo de dicha población que no se encuentra en neuronas, astrocitos ni
oligodendroglía (Imai y cols. 1996; Ito y cols. 1998). Para detectar el estado activo de la
microglía en las técnicas inmunohistoquímicas utilizamos MHCIIRT1B. En citometría de
flujo empleamos un marcador constitutivo, como es el CD11b y dos marcadores de
activación: MHCIIRT1B y CD45 (Dick y cols. 1995; Guillemin y Brew 2004).
Otros autores han demostrado que la administración intraperitoneal de LPS induce la
activación de la microglía en modelos animales de rata y ratón (Ho y cols. 2015; Krishna y
CAPÍTULO 4
156
cols. 2016). Nuestra aproximación experimental consistió en evaluar si estados
inflamatorios periféricos crónicos leves pueden empeorar la progresión de la enfermedad
en un modelo animal de retinosis pigmentaria. Para ello administramos dosis bajas LPS,
que no indujeron alteraciones fisiológicas ni morfológicas en retinas sanas. Sin embargo,
gracias a las técnicas inmunohistoquímicas, observamos que en las ratas P23H tratadas con
LPS no solo aumenta el número total de células microgliales por mm de retina, sino que
también aparece un mayor número de células Iba1+/MHC-II+, lo que refleja una activación
más acentuada en las ratas que reciben este tratamiento. Esta mayor activación microglial
se traduce en una drástica reducción del número de células fotorreceptoras y de la
conectividad sináptica en la OPL, lo que explica las bajas respuestas electrorretinográficas
de las ratas P23H+LPS. Las ratas SD que recibieron el mismo tratamiento no
experimentaron ningún efecto negativo en la retina, ni a nivel estructural ni a nivel
fisiológico. Este resultado corrobora que una retina en degeneración es más propensa a
sufrir alteraciones cuando aparece una señal nociva o perjudicial. Es de esperar que las
ratas SD requieran un tratamiento con mayores dosis de LPS para experimentar algún tipo
de alteración retiniana a nivel estructural o fisiológico, tal y como se ha descrito en cerebro
en otros modelos animales (Ho y cols. 2015; Krishna y cols. 2016). Mediante citometría de
flujo también comprobamos un incremento en la expresión de los antígenos CD11b y CD45,
lo que indica un mayor grado de activación microglial. En cuanto a la población total de
microglía, con esta técnica observamos ligeras diferencias en el número total entre las ratas
P23H+LPS y P23H control, si bien estas diferencias no alcanzaron significación.
El aumento en la población de la microglía que hemos observado concuerda con lo
expuesto en la bibliografía previa, donde se demuestra que una infección sistémica por
citomegalovirus (Zinkernagel y cols. 2013) o por Candida albicans (Maneu y cols. 2014) es
capaz de desencadenar una activación microglial y un incremento en el número de células
microgliales en la retina. El aumento en el número de células de microglía en las ratas P23H
tratadas con LPS podría ser debido a la proliferación de la microglía retiniana o a la llegada
de macrófagos inflamatorios, precursores mieloides o monocitos inflamatorios; ya que
estos tipos celulares son capaces de proliferar in situ una vez diferenciados (Kettenmann y
cols. 2011). El aumento que observamos no es muy elevado, pero hay que tener en cuenta
que en la retina de las ratas P23H ya hay un número muy elevado de células de microglía
CAPÍTULO 4
157
respecto al que aparece en una retina sana (aproximadamente cinco veces superior), con
lo que el aumento en la población puede no ser tan evidente.
La estimulación microglial por LPS se utiliza comúnmente como un modelo de
neuroinflamación, donde se demuestra que la activación microglial en respuesta al LPS es
mediada por el receptor Toll-like 4 (TLR4) y conlleva la producción y liberación de citoquinas
pro-inflamatorias como IL-1β, IL -6 y TNF-α a través de las vías de MAPK y NFkβ (Jeong y
cols. 2014; Su y cols. 2014). Los TLRs son un tipo de receptores que permiten a las células
inmunes reconocer patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs) (Akira y cols.
2006). La activación microglial por LPS también se ha estudiado en otros tipos de
enfermedades retinianas, como la retinopatía diabética. En este modelo se observa que la
administración de LPS, además de desencadenar la producción de citoquinas pro-
inflamatorias (IL-1β, TNF-α, etc.), también favorece la afluencia de células dendríticas
derivadas de la médula ósea que son capaces de contribuir al proceso inflamatorio de la
retina (Chakravarthy y cols. 2016). Es posible que el incremento de la expresión de CD11b
y CD45 que hemos observado en las ratas P23H+LPS se deba, al menos en parte, al
incremento de células microgliales que han adoptado un estado reactivo. Estudios previos
bajo condiciones estresantes demuestran que un incremento en la fluorescencia de los
marcadores CD11b y CD45 se corresponden con un aumento de las células microgliales
reactivas (Vargas-Caraveo y cols. 2015). Como hemos comentado, es esperable que las
dosis de LPS administradas a las ratas P23H en este estudio sean insuficientes para provocar
una afluencia masiva de células pro-inflamatorias desde fuera de la retina, sin embargo,
serían suficientes para desencadenar el estado de alerta de las células microgliales. La
activación microglial ya existente en la retina de una rata P23H, sumada a una estimulación
externa de la misma provocaría unas condiciones inflamatorias perjudiciales para el tejido
retiniano.
Aunque la activación microglial se asocia comúnmente con la neuroprotección, la
activación excesiva o prolongada puede conducir a la inflamación crónica, con efectos
secundarios patológicos graves (Czeh y cols. 2011; Magrone y cols. 2012). En la retina, la
activación microglial crónica se ha relacionado con diversas enfermedades
neurodegenerativas, probablemente contribuyendo al daño retiniano y promoviendo
eventos pro-apoptóticos (Langmann 2007; Karlstetter y cols. 2010). Nuestros resultados
demuestran que una inflamación periférica inducida por LPS en un modelo de RP es capaz
CAPÍTULO 4
158
de acentuar los síntomas negativos de la enfermedad, provocando una pérdida prematura
de la funcionalidad retiniana y número de fotorreceptores. Este hecho es particularmente
importante para los pacientes que padezcan enfermedades neurodegenerativas oculares
tales como retinopatía diabética, glaucoma, RP o degeneración macular asociada a la edad,
ya que un daño periférico, como una infección sistémica o un proceso inflamatorio crónico,
puede activar la microglía y desencadenar un empeoramiento en la progresión de la
enfermedad.
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