1

ทีมวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพทางทะเลกลุ่มวิจัยเทคโนโลยีชีวภาพสัตว์น้ําแบบบูรณาการศูนย์พันธุวิศวกรรมและเทคโนโลยีชีวภาพแห่งชาติ

กลไกภูมิต้านทานโรคในกุ้ง :

ระบบโพรฟีนอลออกซิเดส และเปปไทด์ต้านจุลชีพ

กลไกภูมิต้านทานโรคในกุ้ง :

ระบบโพรฟีนอลออกซิเดส และเปปไทด์ต้านจุลชีพ

ปิติ อ่ําพายัพ

2

การพัฒนาสารชีวโมเลกุลเพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันให้กุ้ง การพัฒนาสารชีวโมเลกุลเพื่อกระตุ้นภูมิคุ้มกันให้กุ้ง

การศึกษากลไกการสร้างเมลานินโดยระบบโพรฟีนอลออกซิเดสใน

กุ้งต่อการต้านเชื้อโรค

การค้นหาและศึกษายีนอื่นๆ (เปปไทด์ต้านจุลชพี) ที่มีการ

ตอบสนองทางระบบภูมิคุม้กันในกุ้งและสัตว์น้ํา

การศึกษาการตอบสนองทางระบบภูมิคุ้มกันต่อสภาวะความเครียด

ของสิ่งแวดล้อมในกุ้งและสัตว์น้ํา

การศึกษากลไกการต้านโรคในกุ้งและสัตว์น้ํา การศึกษากลไกการต้านโรคในกุ้งและสัตว์น้ํา

งานวิจัยการศึกษาระบบภูมิคุ้มกันและสุขภาพของกุ้งและสัตว์น้ํา

Effective peptides และการนําไปใช้

การตรวจสุขภาพกุ้ง

นักวิจัย ศช.

ดร. ปิติ อ่ําพายัพ ดร. วลัยพร เจริญทรัพย์ศรี

นักวิจัย ศช.

Target

Use of key immune molecules for

control, protection and treatment

of diseases in shrimp industry

Need for control, protection and

treatment of shrimp diseases

Shrimp

Shrimp immunity --> Key immune

pathways/molecules to resist emerging

diseases and reemerging diseases

Rationale

3

กลวิธีในการควบคุมโรคในการเพาะเลี้ยงกุ้ง

Use of domesticated and specific

pathogen free (SPF) shrimp

Use of probiotics /

immunostimulants / AMPs

Development of “vaccine” for

major viral pathogens

Effective strategies for

disease control

Require a comprehensive

understanding of

shrimp immunity

4

ระบบภูมิคุ้มกันหลักของกุ้ง

Tassanakajon et al. Fish Shellfish Immunol. 2013;34:954-967.

เชื้อก่อโรค

เปปไทด์ต้านจุลชีพ

การแข็งตัวของเลือด

โพรฟีนอลออกซิเดส

5

Review Articles :

กลไกภูมิต้านทานโรคในกุ้งระบบโพรฟีนอลออกซิเดสของกุ้ง

เปปไทด์ต้านจุลชีพของสัตว์น้ํา

Cited by:

1262013

2011

20152018

Cited by:

30

Cited by:

102

Cited by:

63

6

• ระบบโพรฟีนอลออกซิเดส (Prophenoloxidase system; proPO system) หรือ ระบบการสร้างเมลานิน (Melanization) เป็นระบบ

ภูมิคุ้มกันแบบไม่จําเพาะ (Innate immunity) ที่มีบทบาทสําคัญในการต้านเชื้อก่อโรคในกุ้ง

การตรวจจับเชื้อก่อโรคโดยโปรตีนจดจําเชื้อโรค (Pattern recognition proteins; PRPs)

การกระตุ้นซีรีนโปรติเนสเป็นลําดับขั้น(Serine proteinase cascade activation)

การกระตุ้นเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดส(Phenoloxidase; PO)

การสร้างเมลานิน (Melanin) เพื่อล้อมจับและทําลายเชื้อโรค

การตรวจจับเชื้อก่อโรคโดยโปรตีนจดจําเชื้อโรค (Pattern recognition proteins; PRPs)

การกระตุ้นซีรีนโปรติเนสเป็นลําดับขั้น(Serine proteinase cascade activation)

การกระตุ้นเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดส(Phenoloxidase; PO)

การสร้างเมลานิน (Melanin) เพื่อล้อมจับและทําลายเชื้อโรค

(Tassanakajon et al., 2018)

ระบบโพรฟีนอลออกซิเดส (proPO system)

7

ระบบโพรฟีนอลออกซิเดส (proPO system)

ระบบโพรฟีนอลออกซิเดสมีบทบาทสําคัญในระบบ

ภูมิคุ้มกันต้านเชื้อแบคทีเรีย Vibrio spp. ในกุ้ง

ระบบโพรฟีนอลออกซิเดสมีบทบาทสําคัญในระบบ

ภูมิคุ้มกันต้านเชื้อรา Fusarium solani ในกุ้งระบบโพรฟีนอลออกซิเดสมีบทบาทสําคัญในระบบ

ภูมิคุ้มกันต้านเชื้อไวรัส White spot syndrome

virus (WSSV) ในกุ้งอัตราการตายของกุ้งที่ถูกยับยั้ง

ยีนโพรฟีนอลออกซิเดส และฉีด

ด้วยเชือ้แบคทเีรีย V. harveyi

(Amparyup et al., 2009; Charoensapsri et al., 2014; Chomwong et al., 2018)

อัตราการตายของกุ้งที่ถูกยับยั้งยีนโพรฟีนอลออกซิเดส

และฉีดด้วยเชื้อรา F. solaniอัตราการตายของกุ้งที่ถูกยับยั้งยีนโพร

ฟีนอลออกซิเดส และทําให้ติดเชื้อ

แบคทีเรีย V. parahaemolyticus

สัณฐานวิทยาของเซลล์แบคทีเรีย V. harveyi ภายหลังจากการบ่ม

กับปฏิกิริยาการสร้างเมลานินโดยระบบโพรฟีนอลออกซิเดสของกุ้ง

สัณฐานวิทยาของเชื้อรา F. solani ภายหลังจากการบ่มกับ

ปฏิกิริยาการสร้างเมลานินโดยระบบโพรฟีนอลออกซเิดสของกุ้ง

(Charoensapsri et al., 2014)

อัตราการตายของกุ้งที่ถูกยับยั้งยีนโพรฟีนอลออกซิเดส

และฉีดด้วยเชื้อไวรัส WSSV

อัตราการตายของกุ้งภายหลังจากฉีดด้วยเชื้อไวรัส WSSV ที่ผ่าน

การบ่มกับปฏิกิริยาการสร้างเมลานินโดยระบบ

โพรฟีนอลออกซิเดสของกุ้ง

(Sutthangkul et al., 2015)

8

กุ้งสุขภาพ

อ่อนแอ

กุ้งสุขภาพ

แข็งแรง

ตัวอย่างกุ้งเก็บตัวอย่างน้ําเลือดกุ้งเก็บตัวอย่างน้ําเลือดกุ้ง

เตรียมตัวอย่างเลือดใส่ใน

96-well microplate

เตรียมตัวอย่างเลือดใส่ใน

96-well microplate

เติมสับสเตรทของเอนไซม์

ฟีนอลออกซิเดส

(L-DOPA หรือ Dopamine)

เติมสับสเตรทของเอนไซม์

ฟีนอลออกซิเดส

(L-DOPA หรือ Dopamine)

L-DOPAL-DOPA

DopamineDopamine

วัดค่าการดูดกลืนแสงที่

ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตร

วัดค่าการดูดกลืนแสงที่

ความยาวคลื่น 490 นาโนเมตร

PO activity

ต่ํา

PO activity

ต่ํา

PO activity

สูง

PO activity

สูง

คํานวณค่า PO activityคํานวณค่า PO activity

PO activity ต่ํา PO activity สูง

ระบบโพรฟีนอลออกซิเดส (proPO system)

การติดเชื้อไวรัส WSSV ทําให้กิจกรรมของเอนไซม์

ฟีนอลออกซิเดสในน้ําเลือดกุ้งลดต่ําลง

การติดตามสุขภาพกุ้งจากกิจกรรมของเอนไซม์ฟีนอลออกซิเดส (PO activity)

(Chomwong et al., 2018)

(Sutthangkul et al., 2015)

การเสริมด้วยโปรไบโอติกทําให้กิจกรรมของเอนไซม์

ฟีนอลออกซิเดสในน้ําเลือดกุ้งเพิ่มสูงขึ้น และกุ้งต้าน

เชื้อแบคทีเรีย V. parahaemolyticus ได้ดีขึ้น

9

เปปไทด์ต้านจุลชีพในครัสเตเชียน(Antimicrobial peptides, AMPs)

• มีฤทธิ์ยับยั้งการเจริญเติบโตของเชื้อจุลชีพได้ใน

ช่วงกว้าง (Broad spectrum)

เปปไทด์ต้านจุลชีพ

มีฤทธิ์ทําลายเชื้อแบคทีเรียชนิดแกรมบวก

และแกรมลบ รวมทั้งเชื้อแบคทีเรียก่อโรค Vibrio harveyiและ V. parahaemolyticus

Effective Peptides (เปปไทด์ต้านจุลชีพ และ โปรตีนจดจําเชื้อโรค)

โปรตีนจดจําเชื้อโรค(Pattern recognition proteins, PRPs)

• ทําหน้าที่จับกับส่วนประกอบของผนังเซลล์เชื้อโรค

• กระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันเพื่อการต้านทานเชื้อโรคในกุ้ง

โปรตีนจดจําเชื้อโรค

สามารถจับกับเชื้อโรคและกระตุ้นระบบโพรฟีนอลออกซิเดสในกุ้ง

L. vannamei shrimp

Feeding with AMP-supplemented feed

AMP-supplemented feed

immersion challenge test with VPAHPND

Cumulative mortality

Application of AMP to

control the pathogenic

VPAHPND infection in shrimp

Application of AMP to

control the pathogenic

VPAHPND infection in shrimp

10

National Center for Genetic

Engineering and Biotechnology

(BIOTEC), NSTDA

Acknowledgements

Chulalongkorn

University