วิธีมาตรฐาน ส าหรับการ ...dmsc-library.moph.go.th/ebooks/files/วิธี...2- Mercaptobenzothaizole (MBT) ท แพร ออกมาจากผล

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร

Standard Methodsfor Food Analysis

เลมท 2

Volume II

กรมวทยาศาสตรการแพทยDepartment of Medical Sciences

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสขwww.dmsc.moph.go.th

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 2 Standard Methods for Food Analysis Volum

e II

วธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 2Standard Methods for Food Analysis, Volume II

กนยายน 2557 จานวน 1,000 เลม

ISBN 978-616-11-2236-2

สงวนลขสทธ

จดพมพเผยแพรโดย

กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข อ.เมอง จ.นนทบร

โทรศพท/โทรสาร 0-2951-1021

http://dmsc2.dmsc.moph.go.th/webroot/BQSF/index.htm

พมพท

โรงพมพสานกงานพระพทธศาสนาแหงชาต

314-316 ถนนบารงเมอง ปอมปราบฯ กรงเทพมหานคร 10100

โทร. 0 2223 3351, 0 2223 5548

คำปรำรภ การคมครองสขภาพของผบรโภคใหไดรบอาหารทมคณคาทางโภชนาการ มความปลอดภย จากสารเคมอนตราย และเชอโรคตางๆ เปนภารกจหนงของกระทรวงสาธารณสข ซงกรมวทยาศาสตร การแพทย มบทบาทในการวเคราะห วจย พฒนาองคความรในเรองดงกลาวมาเปนระยะเวลายาวนาน ไดนาระบบมาตรฐานสากลISO/IEC17025มาใชในการดาเนนการทางหองปฏบตการเพอใหการตรวจวเคราะหมคณภาพมาตรฐานเปนทยอมรบทงภายในประเทศและนานาชาตไดมอบหมายใหสานกคณภาพและความปลอดภยอาหารซงเปนหองปฏบตการอางองระดบประเทศรวบรวมวธวเคราะหใหเปนมาตรฐานไวใชโดยมการกาหนดหลกเกณฑในการคดเลอกวธอยางเปนระบบซงไดรวบรวมและจดพมพ เผยแพรไปแลว1 เลมนนมหนวยงานทงภาครฐภาคเอกชน ใหความสนใจนาไปใชและอางอง เพอประโยชน ทงดานการศกษางานวจยการพฒนาหองปฏบตการซงสามารถนาผลวเคราะหไปใชในการวางแผนงานดานการคมครองผบรโภค รวมทงการดาเนนการดานกฏหมายของหนวยงานตางๆ เชน สานกงาน คณะกรรมการอาหารและยาสานกงานสาธารณสขจงหวดและสานกงานตารวจแหงชาตเปนตน

ในการน เพอการดาเนนการอยางตอเนอง ไดจดทาวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท2มการเพมเตมทงดานเคมจลชววทยากายภาพรวมทงวสดสมผสอาหารวธวเคราะหเหลานไดผานการคดเลอกตามหลกเกณฑแลวทงสน จงหวงวาจะเปนประโยชนตองานวเคราะหอาหาร สามารถพฒนาระบบประกนคณภาพใหมคณภาพมาตรฐานไปในทศทางเดยวกนเพอประโยชนในการแกไขปญหาสาธารณสขของประเทศทจะสามารถสรางเสรมสขภาพทดแกประชาชนตอไป

(นายแพทยอภชยมงคล) อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

26สงหาคม2557

สารบญ

หนา

วธมาตรฐานทางเคมสาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย 9

นยามและคายอ 11

รหสวธ 13

DMSc F 1025: การวเคราะหปรมาณสารทงหมดในนา 15

DMSc F 1026: การหาปรมาณความกระดางทงหมดในนา 19

DMSc F 1027: การวเคราะหปรมาณไขมนในไอศกรม 25

DMSc F 1028: การวเคราะหไนโตรเจนในไอศกรม 29

โดย Kjeldahl method

DMSc F 1029: การวเคราะหของแขงทงหมดในไอศกรม 37

DMSc F 1030: การวเคราะหปรมาณกรดซตรกในเครองดม 39

DMSc F 1031: การวเคราะหปรมาณ ไนไตรต และไนเตรต 43

ในผลตภณฑเนอสตว

DMSc F 1032: การวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจาก 47

การระเหยอาหารจาลอง

DMSc F 1033: การวเคราะหปรมาณบสฟนอล เอ 55

(Bisphenol A;2,2-bis (4- hydroxyphenyl propane)

ทแพรลงสอาหารจาลอง

DMSc F 1034: การวเคราะหปรมาณ 4,4'- Dichlorodiphenyl 65

sulfone ทแพรลงสอาหารจาลอง

DMSc F 1035: การวเคราะหปรมาณ 4,4'- Dihydroxydiphenyl 73

sulfone ทแพรลงสอาหารจาลอง

DMSc F 1036: การวเคราะหปรมาณฟอรมาลดไฮด 81

(Formaldehyde) ทแพรจากผลตภณฑยาง

DMSc F 1037: การวเคราะหปรมาณสงกะสทแพรจากผลตภณฑยาง 87

DMSc F 1038: การวเคราะหปรมาณ N-Nitrosamines 91

และ N-Nitrosatable substances

ทแพรจากหวนมยาง

DMSc F 1039: การวเคราะหปรมาณสารทระเหยได 103

ในหวนมยางสงเคราะห

DMSc F 1040: การวเคราะหปรมาณ 105

2- Mercaptobenzothaizole (MBT)

ทแพรออกมาจากผลตภณฑ valcanised rubber

DMSc F 1041: การวเคราะหปรมาณ 2,6-bis(1,1-dimethylethyl) 111

-4-methyl-phenol (Antioxidant BHT) และ 2,2'-

Methylethylenebis (6-(1,1-dimethylethyl)

- 4-methyl-phenol) (Antioxidant 2246)


วธมาตรฐานทางจลชววทยาสาหรบการวเคราะหอาหารของ 117

กรมวทยาศาสตรการแพทย

นยามและคายอ 119

รหสวธ 119

DMSc F 2009: วธตรวจวเคราะหยสตและราในอาหาร 121

โดยวธ pour plate และ spread plate

DMSc F 2010: วธตรวจวเคราะห Vibrio cholerae ในอาหาร 131

DMSc F 2011: วธตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus 147

ในอาหาร

DMSc F 2012: วธตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus 163

ในอาหารโดยวธ MPN

DMSc F 2013: วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรย 179

หรอแบคทเรยทงหมดในอาหารโดยวธ pour plate

หนา

หนา

DMSc F 2014: วธตรวจวเคราะหจานวนจลนทรย หรอแบคทเรย 187

ทงหมดในนาและนาแขงโดยวธ pour plate และ

spread plate

วธมาตรฐานทางกายภาพสาหรบการวเคราะหอาหารของ 199

กรมวทยาศาสตรการแพทย

รหสวธ 201

DMSc F 3001: การวเคราะหนาหนกสทธและนาหนกเนอ 203

ในผกกระปอง

DMScF 3002: การวเคราะหปรมาณนาอสระในผกกระปอง 205

วธมาตรฐานทางเคม

สำาหรบการวเคราะหอาหาร

ของกรมวทยาศาสตรการแพทย

คณะผจดทำา

1. นางกนกพรอธสข ผเชยวชาญเฉพาะดานมาตรฐานของอาหาร

(นกวทยาศาสตรการแพทย)

2. นางสาวทพวรรณนงนอย ผเชยวชาญเฉพาะดานความปลอดภยของอาหาร


3. นางนภาภรณลกษณสมยา นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

4. นางสาวสวรรณธรภาพธรรมกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

5. นางอมาบรบรณ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

6. นางกญญาพกสน นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

11

วธมาตรฐานสำาหรบการวเคราะหอาหาร เลมท 2กรมวทยาศาสตรการแพทย

นยามและคำายอ (Definition and Abbreviation) 1. “H2O”หมายถงนากลน(distilledwater)ยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

2. สารเคม(reagents)ทงหมดเปนreagentgradeยกเวนทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

3. กรดและดางหมายถงกรดและดางทมความเขมขนดงในตารางยกเวนทกาหนดไวเฉพาะ

ในวธนนๆ

ความเขมขน

Sulfuricacid 95.0-98.0%H2SO4

Hydrochloricacid 36.5-38.0%HClNitricacid 69.0-71.0%HNO3

Fumingnitricacid ≥90%HNO3

Aceticacid ≥99.7%CH3COOHHydrobromicacid 47.0-49.0%HBrAmmoniumhydroxide 28-30%NH3

Phosphoricacid ≥85%H3PO4

4. การใชสญลกษณ(ตวเลข+ตวเลข)หลงชอของสารเคมเชนHCl(1+2)หมายถงสารผสม

ระหวางHCl1หนวยปรมาตรกบH2O2หนวยปรมาตร

5. คายอทใชและคาเตมแสดงในตาราง

Abbreviation Word/คำาเตม

A AmpereAAS AtomicabsorptionspectrometerAc acetyl,CH3CO-cm Centimeterdiam. diameterdm2 SquaredecimeterFAAS FlameatomicabsorptionspectrophotometerFLD Fluorescencedetectorg gramg gravityincentrifugingGC GasChromatographGFAAS GraphitefurnaceatomicabsorptionspectrophotometerHPLC Highperformanceliquidchromatograph

hr hour

id innerdiameterordimensionin Inch(es)(2.54cm)kg Kilogram(s)L Liter(s)

12


LC LiquidChromatographlb Pound(s)(453.6g)M MolarMe Methyl,CH3-MeOH Methanol,CH3OHm Meter(s),milli-asprefixmΩ Megaohmmg Milligram(s)min Minutesml Milliliter(s)mm Millimeter(s)MS MassspectrometerMW molecularweightN Normalng Nanogram(10-9g)nm Nanometer(10-9m)-OAc acetate-OCN cyanateod outerdiameterordimensionppm Partspermillion(10-6)ppb Partsperbillion(10-9)sec secondSPE SolidphaseextractionUV Ultravioletv/v Volumepervolumew/v Weightpervolumew/w Weightperweightwt Weightµµ Micro-asprefixµg Microgram(10-6g)µ µL Microliter(10-6L)µ µm Micron,micrometer(10-6m)/ Per% Percent> Morethan< Lessthan≥≥ Equaltoandmorethan≤≤ Equaltoandlessthan


13


วธมาตรฐานทางเคมสำาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

DMScF1025 นาดม สารทงหมด(totalsolids) I 15

นาแขง

นาใชในการผลตอาหาร

นาประปา

นาบาดาล

นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย

DMScF1026 นาดม ความกระดางทงหมด I 19

นาแขง (totalhardness)

นาใชในการผลตอาหาร

นาประปา

นาบาดาล

นาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย

DMScF1027 ไอศกรม ไขมน(fat) I 25

DMScF1028 ไอศกรม ไนโตรเจน(nitrogen) I 29

DMScF1029 ไอศกรม ของแขงทงหมด(totalsolids) I 37

DMScF1030 เครองดม กรดซตรก(citricacid) I 39

DMScF1031 ผลตภณฑเนอสตว ไนไตรตและไนเตรต I 43

(nitriteandnitrate)

DMScF1032 ขวดนมภาชนะบรรจนมและอปกรณตางๆ สารตกคางทเหลอจากการระเหย I 47

ทาดวยพลาสตกใชเพอการบรโภคของทารก (residuesleftafterevaporation)

และเดกเลก

DMScF1033 ขวดนมภาชนะบรรจนมและอปกรณตางๆ บสฟนอลเอ(BisphenolA) I 55

DMScF1034 ขวดนมภาชนะบรรจนมและอปกรณตางๆ 4,4'-Dichlorodiphenyl I 65

ทาดวยพลาสตกชนดPolyethersulfone sulfone

(PES)และPolyarylsulfone(PASF)

DMSc F 1035 ขวดนม ภาชนะบรรจนมและอปกรณตางๆ 4,4'- Dihydroxydiphenyl I 73 ทาดวยพลาสตกชนด Polyethersulfone sulfone (PES)

DMSc F 1036 ผลตภณฑยางธรรมชาต และยางสงเคราะห ฟอรมาลดไฮด (Formaldehyde) I 81

Method รหสวธ ชนดอาหาร สารทตองการวด หนา Type

14


DMSc F 1037 ผลตภณฑยางธรรมชาต และยางสงเคราะห สงกะส (Zinc) I 87

DMSc F 1038 หวนมยางประเภทใชกบขวดนมและ N-Nitrosamines และ I 91 ใชดดเลนทงยางธรรมชาตและยางสงเคราะห N-Nitrosatable substances

DMSc F 1039 หวนมยางสงเคราะห สารทระเหยได I 103 (volatile compounds)

DMSc F 1040 ผลตภณฑ valcanised rubber 2- Mercaptobenzothaizole I 105 (MBT)

DMSc F 1041 ผลตภณฑ valcanised rubber Antioxidant BHT และ I 111

Antioxidant 2246



15


1. ขอบขาย (Scope) ใชวเคราะหปรมาณสารทงหมดในนาดมนาแขงนาใชในการผลตอาหารนาประปานาบาดาล

และนาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสยในชวง25-2,000mg/L

2. เอกสารอางอง (Reference)RiceEW,BairdRB,EatonAD,ClesceriLS,editors.Standardmethodsfortheexamination

ofwaterandwastewater.22nded.WashingtonDC:AmericanPublicHealthAssociation;

2012.p.2-64.

3. หลกการ (Principle)ปรมาณสารทงหมดในนาเปนผลรวมของสารแขวนลอยทงหมด (total suspended solids) และ

สารทละลายนาทงหมด(totaldissolvedsolids)หาไดโดยการระเหยนาจนแหงและอบในตอบรอน

ท103-105oCจนนาหนกคงท

4. เครองมอ (Apparatus)4.1 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.2 อางนารอน(waterbath)

4.3 ตอบรอน(hotairoven)สาหรบใชงานทอณหภม103-105oC

4.4 โถดดความชน(desiccator)

4.5 MagneticstirrerwithTFEstirringbar(ใชในกรณทนามความขน)

4.6 คมคบ(forcep)

4.7 ถวยระเหย (evaporating dish) ขนาดความจ 100 ml เปนแกวชนด high silica หรอ

เปนกระเบองporcelain

4.8 Pipetteขนาด100ml

4.9 Lowformbeaker

DMSc F 1025: การวเคราะหปรมาณสารทงหมดในนำา

Determination of total solids in water

16


5. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)5.1 การจดการตวอยางกอนการวเคราะห

วเคราะหทนททไดรบตวอยางถาไมสามารถทาไดใหเกบตวอยางในตเยนท≤≤ 6oCและ

วเคราะหภายใน7วน

5.2 การเตรยมตวอยางผสมตวอยางใหเปนเนอเดยวกน

6. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)6.1 อบถวยระเหยทลางสะอาดแลวในตอบท103-105oCนาน1hrเกบในโถดดความชนทงไว

ใหเยนชงทนทกอนใชงานและบนทกนาหนกทแนนอน(A)

6.2 ปเปตตวอยางนาขณะทผสมเปนเนอเดยวกน100ml โดยดดทระดบกลางภาชนะใสในถวย

ระเหยทชงนาหนกแลวและระเหยบนอางนารอนจนแหงกรณทนามความขนใหใช magnetic

stirrerwithTFEstirringbar

6.3 อบในตอบรอนทอณหภม 103-105oC อยางนอย 1 hr หลกเลยงการวางถวยระเหย

ณตาแหนงในตอบทอณหภมไมอยในชวงทเหมาะสมทงนพจารณาจากผลการสอบเทยบตอบ

6.4 เกบในโถดดความชนใกลบรเวณเครองชงทงไวใหเยนชงและบนทกนาหนกทแนนอน(B)

6.5 อบซาอก1hrชงและบนทกนาหนกทแนนอน(B)เกบในโถดดความชนคานวณผลตางของ

การชงนาหนกครงกอน(ขอ6.4)ถาผลตางเกน0.5mgอบซาอก1hrทาเชนนจนนาหนก

ทชงตดตอกน2ครงตางกนไมเกน0.5mg

7. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results)7.1 การคานวณ

ปรมาณสารทงหมด(mg/L)=

(B-A)×106

V

โดย B = นาหนกของถวย+สงทเหลอจากการอบแหง(g)(ใชนาหนกสดทาย)

A = นาหนกถวย(g)

V = ปรมาตรของตวอยาง(ml)

7.2 การรายงานผล

รายงานผลปรมาณสารทงหมด หนวยเปน มลลกรมตอลตร รายงานคาทพบเปนเลข

จานวนเตม

17


8. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)8.1 เครองมอและอปกรณ

8.1.1 สอบเทยบเครองชงโดยหองปฏบตการสอบเทยบจากภายนอกปละ1ครงหรอมากกวา

หากพบวาสภาวะของเครองชงมการเปลยนแปลงไปจากทเคยสอบเทยบ

8.1.2 ตรวจสอบเครองชงประจาวน(dailycheck)

8.1.3 สอบเทยบตอบรอนโดยหองปฏบตการสอบเทยบจากภายนอกปละ1ครงหรอมากกวา

หากพบวาสภาวะของตอบรอนมการเปลยนแปลงไปจากทเคยสอบเทยบ

8.1.4 ตรวจสอบsilicagelในโถดดความชนใหเปนสนาเงนเมอจะใชงาน

8.2 การวเคราะห

ทกชดตวอยาง(ชดละไมเกน10ตวอยาง)ทาการวเคราะห2ซา(duplicate)1ตวอยาง

ในการวเคราะห2ซา(duplicate)คาRPDตองไมเกน5%

9. รายละเอยดอน9.1 หามจบถวยระเหยดวยมอเปลาใหใชคมคบ

9.2 ถานาหนกในขอ6.4นอยกวาหรอเทากบนาหนกถวยเปลา(ในขอ6.1)ใหทาขอ6.3-6.4

ซาอกเพยงครงเดยว

9.3 ถา total solids มากกวา 200 mg ใหวเคราะหใหมโดยลดปรมาตรตวอยางใหเหมาะสม

เนองจากอาจมการเกดเปนwater-trappingcrustไดทาใหนาไมสามารถระเหยไดหมด

19


1. ขอบขาย (Scope)

ใชหาปรมาณความกระดางทงหมด(totalhardness)ในนาดมนาแขงนาใชในการผลตอาหาร

นาประปานาบาดาลและนาจากแหลงตางๆยกเวนนาเสย

2. เอกสารอางอง (Reference)

RiceEW,BairdRB,EatonAD,ClesceriLS,editors.Standardmethodsfortheexamination

ofwaterandwastewater.22nded.WashingtonDC:AmericanPublicHealthAssociation;

2012.p.2-44to2-47.

3. หลกการ (Principle)

ความกระดางในนามสาเหตจากไอออนบวกของโลหะทมวาเลนซ 2 ไดแกแคลเซยม (Ca2+) กบ

แมกนเซยม (Mg2+) ทมอยในนา ความกระดางหมายถงผลรวมความเขมขนของแคลเซยมกบ

แมกนเซยม โดยคานวณเปนแคลเซยมคารบอเนต (CaCO3) มหนวยเปนมลลกรมตอลตร

วธวเคราะหหาปรมาณความกระดางทงหมดในนาไดอยางรวดเรว คอการไตเตรทดวย EDTA

(disodiumethylenediaminetetraacetatedihydrate)โดยEDTAเปนchelatingagentสามารถ

สรางไอออนเชงซอนกบไอออนบวกของโลหะ ทเปนสาเหตของความกระดางในนา เมอเตม

eriochrome black T เปน indicator จานวนเลกนอยลงไปในสารละลายท pH 10.0± 0.1

eriochromeblackTจะรวมกบCa2+และMg2+เกดเปนสารละลายสมวงแดงเมอเตมEDTAซง

เปน titrantลงไปในสารละลายจะไปดงไอออนบวกของCa2+,Mg2+เกดเปนสารประกอบเชงซอน

สของสารละลายจะเปลยนเปนสนาเงนแสดงวาถงจดยต(endpoint)

metal2++eriochromeblackT<----->(metal2+-eriochromeblackT)(สมวงแดง)

(metal2+-eriochromeblackT)+EDTA<---->(metal2+-EDTA)+eriochromeblackT(สนาเงน)

DMSc F 1026: การหาปรมาณความกระดางทงหมดในนำา

Determination of total hardness in water

20


4. เครองมอ (Apparatus)

4.1 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.2ตอบรอน(hotairoven)

4.3เตาไฟฟา(hotplate)

4.4 pH-Meter

4.5 โถดดความชน(desiccator)

4.6 ชอนตกสาร

4.7 Beaker

4.8 Volumetricflask

4.9 Erlenmeyerflask

4.10Glassfunnel

4.11Dropper

4.12Graduatedcylinder

4.13ขวดพลาสตกชนดpolyethyleneหรอขวดแกวชนดborosilicate

4.14Pipette

4.15Buret

5. สารเคม (Reagent)

สารเคมทกชนดเปนARgradeหรอเทยบเทาและH2Oทใชเปนนากลนหรอนาปราศจากไอออน

(deionizedwater)

5.1 EDTA

5.2 0.1%methylredindicator:ละลายmethylred0.01gใน95%ethanolปรบปรมาตร

ครบ10ml

5.3 3 N NH4OH:เจอจางNH4OHเขมขน10มลลลตรดวยนาแลวปรบปรมาตรเปน50มลลลตร

NH4OH

5.4 1:1HCl:คอยๆเตมconc.HClลงในH2Oในปรมาตรทเทากนคนใหเขากนทงใหเยน

21


5.5 0.5%eriochromeblackTindicator:ผสมeriochromeblackT0.5gซงเปนเกลอโซเดยม

ของ1-(1-hydroxy-2-naphthylazo)-5-nitro-2-naphthol-4-sulfonicacid;No.203

และNaCl100gเขาดวยกน

5.6 MgCl2.6H2O

5.7 NH4Cl

5.8 NaCl

5.9 CaCO3,anhydrous

5.1095%ethanol

5.11การเตรยมสารละลายbufferและindicator

ชงEDTA1.179gและMgCl2.6H2O644mgละลายในH2O50mlเตมสารละลายน

ลงในNH4Clทชงมา16.9gและเตมconc.NH4OH143mlเทลงในvolumetricflask

ปรบปรมาตรดวยH2Oจนครบ250mlเกบสารละลายในขวดพลาสตกชนดpolyethylene

หรอขวดแกวชนด borosilicate ปดฝาใหสนทเกบไวในตเยนปองกนการสญเสยแอมโมเนย

เกบไวใชไดไมเกน1เดอน

5.12สารมาตรฐาน(Standards)

5.12.1สารละลายมาตรฐาน0.01MEDTA

ชงEDTA3.723gละลายในนาปรบปรมาตรจนครบ1Lvolumetricflaskใชเปน

สารละลาย titrant เกบในขวดพลาสตกชนด polyethylene หรอขวดแกวชนด

borosilicate(หากเกบในขวดแกวธรรมดาสารละลายEDTAสามารถดงไอออนบวก

จากแกวได)

5.12.2สารละลายมาตรฐาน0.01MCaCO3

CaCO3ทสามารถสอบกลบได(traceabletoSIunitหรอCRM);primarystandard

หรอ ชนดพเศษมโลหะหนก ความเปนดาง และ magnesium ตา ชง CaCO3

(ทผานการอบแหงและทาใหเยนในโถดดความชน)1.000gใสลงในErlenmeyer

flask ขนาด 500ml วาง funnel ไวบนคอ flask คอยๆ เตม 1:1 HCl ลงไป

ทละนอยเพอละลายCaCO3จนหมดเตมH2O200mlนาไปตมใหเดอดประมาณ

2–3minเพอไลCO2 ทงไวใหเยนทอณหภมหองหยดmethylredลงไปเลกนอยดวย

22


dropperแลวปรบใหเปนกลางดวย3NNH4OHหรอ1:1HClจนมสเหลองสม

ถายลงในvolumetricflaskปรบปรมาตรดวยนาจนครบ1L;1ml=1.00mg

CaCO3

5.12.3การปรบเทยบสารละลายมาตรฐาน

ใชpipetteดด0.01MCaCO3ใสลงในErlenmeyerflaskเตมสารละลายbuffer

1–2mlแกวงใหเขากนเตมeriochromeblackTเลกนอยแกวงใหเขากนนาไป

ไตเตรทดวย0.01MEDTAจนถงจดยตไดสารละลายเปนสนาเงน

คานวณความเขมขนสารละลายมาตรฐาน0.01MEDTAจากสมการ

N1=(N2 × V2)/V1

N1 = ความเขมขนสารละลายมาตรฐาน0.01MEDTA

N2 = ความเขมขนสารละลายมาตรฐาน0.01MCaCO3

V1 = ปรมาตร(ml)สารละลายมาตรฐาน0.01MEDTA

V2 = ปรมาตร(ml)สารละลายมาตรฐาน0.01MCaCO3

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)

ผสมตวอยางใหเปนเนอเดยวกน

7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)

7.1 ใชpipetteดดตวอยางปรมาตรตามตองการใสลงในerlenmeyerflask

7.2 เตมสารละลายbuffer1-2mlใหไดpHชวง10.0±0.1แกวงใหเขากน

7.3เตมeriochromeblackTลงไปเลกนอยแกวงใหเขากน

7.4ไตเตรทดวยสารละลายมาตรฐาน0.01MEDTAทปรบเทยบแลวจนถงจดยตซงสารละลาย

จะเปลยนจากสมวงแดงเปนสนาเงน

7.5blankใชH2Oแทนตวอยางแลวดาเนนการตามขอ7.2-7.4

23


8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results)

8.1ปรมาณความกระดางทงหมดโดยคานวณเปนCaCO3 (mg/L)จากสตร

ปรมาณความกระดางทงหมดคานวณเปนCaCO3=A×B×1,000

V

เมอA = ปรมาตร0.01MEDTAทใช(ml)

B=CaCO3(mg)ซงคอปรมาตรของCaCO3ทใช(เนองจาก1ml=1.00mgCaCO3)

V = ปรมาตรตวอยางทใช(ml)

8.2รายงานปรมาณความกระดางทงหมด โดยคานวณเปน CaCO3 ในหนวย มลลกรมตอลตร

(mg/L)ทศนยม2ตาแหนง

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the Quality of Test Results)

ทกชดตวอยาง(ชดละไมเกน10ตวอยาง)ทาการวเคราะห2ซา(duplicate)1ตวอยาง

10. รายละเอยดอน

10.1 ในการวเคราะห2ซา(duplicate)คาRPDตองไมเกน5%

10.2 จดยตจะชดเจนทคา pH ของสารละลายสงแตหากสงเกนไปจะเกดการตกตะกอนของ

CaCO3 หรอMg(OH)2คาpHของสารละลายควรอยในชวง10.0±0.1และใชเวลาในการ

ไตเตรทหลงจากเตมสารละลายbufferภายใน5minมวธทชวยลดการเกดตะกอนไดแก

10.2.1เจอจางตวอยางดวยนาเพอลดความเขมขนของCaCO3หากเจอจางท1:1ยงเกด

ตะกอนใหใชวธดงน

10.2.1.1 ประมาณคาความกระดางแลวเตม titrant ใหได 90% หรอมากกวา

ลงไปในตวอยางกอนปรบpHดวยbufferหรอ

10.2.1.2 ทาตวอยางใหเปนกรดแลวกวน2minเพอไลCO2กอนปรบpH

10.2.2การไตเตรทควรทาทอณหภมหองเนองจากทอณหภมตาสเปลยนชาทอณหภมสง

indicatorจะสลายตว

24


10.2.3ในการไตเตรทควรเลอกใชปรมาตรตวอยางโดยพจารณาจากปรมาตร EDTA

ทใชใหนอยกวา15mlและไตเตรทใหเสรจภายใน5minหลงจากเตมสารละลาย

buffer

10.2.4กรณไมเหนจดยตใชปรมาตรตวอยาง25mlเจอจางดวยH2O25mlเตมสารละลาย

buffer 1-2 ml ซงปกตใช 1 ml เพยงพอทจะทาใหได pH 10.0-10.1 เตม

indicatorปรมาณทเหมาะสมเตมEDTAอยางชาๆและกวนอยางตอเนองจนกระทง

ไมปรากฏสอมแดงออนๆจงเตมหยดสดทายเลกนอยในชวงเวลา3-5secจดยต

จะไดสารละลายสนาเงน

10.2.5ตวอยางมความกระดางตา(นอยกวา5mg/L)เชนนาทผานการแลกเปลยนไอออน

นาออน นาธรรมชาต สามารถเพมปรมาตรของตวอยางเปน 100 - 1000 ml

ในการไตเตรทและเพมปรมาณของสารละลายbufferและindicatorไดตามสวน

10.2.6blankใชH2OทปรมาตรเดยวกบตวอยางเตมEDTAอยางชาๆนาปรมาตรทใช

ไปลบออกจากEDTAทใชกบตวอยาง

25


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณไขมนในไอศกรมโดยใชหลกการRoese-Gottlieb

2. เอกสารอางอง (Reference)AOACOfficialMethod952.06Fat in IceCreamandFrozenDesserts.IDF-ISO-AOAC

Method.Codex–Adopted–AOACMethod*

*AdoptedasaCodexDefiningMethod(TypeI)forgravimetry(Roese-Gottlieb)offatin

edibleices.

3. หลกการ (Principle) หลงจากทากรดในนมใหเปนกลาง (neutralization) และละลายโปรตนในนม (casein) ดวย

ammoniasolutionเตมalcoholเพอปองกนการเกดemulsionระหวางการสกดไขมนจะถกสกด

ออกจากตวอยางโดยdiethyletherและpetroleumetherหลงจากระเหยetherออกแลวอบไขมน

ใหแหง คานวณปรมาณไขมนในหนวยรอยละโดยนาหนก หลกการนเรยกวา Roese-Gottlieb

principle


4.2ตอบรอน(hotairoven)ซงสามารถปรบตงอณหภมไดท100± 1oC

4.3อางนารอน(waterbath)

4.4Fat-extraction flasks or tube ชนดมจกปดททาดวยวสดทไมมผลตอ solvent ทใชในการ

วเคราะหเชนPTFE

4.5ถวยระเหย(evaporatingdish)ขนาดความจประมาณ125ml

5. สารเคม (Reagent) 5.1Ammoniasolutionความเขมขนประมาณ25%[p20 (NH3)=910g/L]

5.2Petroleumether,boilingrange30-60oC

DMSc F 1027: การวเคราะหปรมาณไขมนในไอศกรม

Determination of fat content in ice cream

26


5.3Diethyletherชนดไมมสารperoxide

5.4Ethanolความบรสทธไมนอยกวา94%โดยปรมาตร

5.5Potassiumiodide(KI)10%

6. การเตรยมตวอยาง (Sample preparation)6.1การสมตวอยางตวอยางทมขนาดเลกใหเกบตวอยางประมาณ3-4หนวยในขวดปากกวาง

ปดฝาใหแนนหรออาจเกบในสภาพภาชนะบรรจเดมสาหรบตวอยางมขนาดใหญใหตดไอศกรม

ออกเปนชน เกบในขวดปากกวาง ใหไดนาหนกประมาณ 100 - 150 g ปดฝาใหแนน

เกบในตแชแขงทอณหภม≤-18oC

6.2นาตวอยางทเกบไวออกจากตเยนตงทงไวใหละลายคนใหเขากนในกรณทตวอยางไอศกรม

มอาหารอนผสมอยเชนถวผลไมใหกรองเอาอาหารออกแลวคนไอศกรมใหเขากนดตวอยาง

ทวเคราะหเพอนาผลทไดไปทาฉลากโภชนาการใหปนตวอยางทงเนอไอศกรมและอาหารอน

ดวยเครองปนจนเปนเนอเดยวกน

7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)7.1การเตรยมถวยระเหย

อบถวยระเหยในตอบรอนทอณหภม100± 1oCเปนเวลา1hrเอาออกจากตอบทงใหเยน

ลงจนถงอณหภมหองชงในโถดดความชน(ประมาณ1hr)ชงนาหนก(W1)

7.2ชงตวอยางประมาณ4-5gลงในfat-extractionflaskortubeบนทกนาหนกทแนนอน

(W)เจอจางดวยนาจนไดปรมาตรประมาณ10mlผสมใหเขากน เตมammoniasolution

2mlผสมใหเขากนแชในwaterbathทอณหภม60oCนาน20minโดยเขยาเปนครง

คราวปลอยทงไวใหเยนเตมethanol10mlผสมใหเขากน

7.3สกดไขมนออกจากตวอยางครงท1โดยการเตมdiethylether25mlปดจกเขยาอยางแรง

1min เตมpetroleumether25mlปดจก เขยาอยางแรง1minตงทงใหแยกชน เทชน

organic solvent ลงในถวยระเหย ระเหย solvent ออกจากไขมนโดยตงถวยระเหยบน

อางนารอนทอณหภมประมาณ40-60oC

7.4เตมethanol5mlลงในextractingflaskสกดไขมนออกจากตวอยางครงท2และ3โดย

การเตมdiethylether15mlปดจกเขยาอยางแรง1minเตมpetroleumether15ml

ปดจกเขยาอยางแรง1minตงทงใหแยกชนเทชนorganicsolventลงในถวยระเหยใบเดม

ระเหยsolventออกจากไขมนโดยตงถวยระเหยบนอางนารอนทอณหภมประมาณ40-60oC

27


7.5อบถวยระเหยทมไขมนในตอบทอณหภม100± 1oCจนไดนาหนกคงท(ประมาณ1hr)

ตงทงใหเยนจนถงอณหภมหองชงในโถดดความชน(ประมาณ1hr)ชงนาหนก(W2)

7.6วเคราะหblankโดยใชนา10mlแทนตวอยางนาหนกของสารทเหลออยในถวยระเหย(WB)

ควรนอยกวา0.001g

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results)8.1คานวณปรมาณไขมนจากสตร

ปรมาณไขมน(รอยละโดยนาหนก)=(W2-W1-WB)x100/W

เมอ W1 = นาหนกของถวยระเหย(g)

W2 = นาหนกของถวยระเหยทมไขมนอย(g)

WB = นาหนกสารทเหลออยทไดจากการวเคราะหblank=WB2-WB1(g)

W = นาหนกของตวอยาง(g)

8.2รายงานปรมาณไขมนในหนวยกรมตอ100กรม(g/100g)หรอรอยละของนาหนกทศนยม

2ตาแหนง

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results) วเคราะห2ซา(duplicate)ในทกตวอยาง

10. รายละเอยดอน10.1ในการวเคราะห2ซา(duplicate)ปรมาณไขมนในตวอยาง100gควรตางกนไมเกน0.2g

10.2ทดสอบperoxideในdiethyletherโดยการปเปตdiethylether10mlลงในกระบอกตวง

ชนดทมจกปดซงผานการrinseดวยdiethylether เตมสารละลาย10%KI1ml เขยา

กระบอกตวงและตงทงไว1minจะตองไมเกดสเหลองในชนของdiethyletherทดสอบเมอ

เปดใชงานครงแรกทดสอบครงตอไปสปดาหละ1ครง

10.3อบถวยระเหยจนไดนาหนกคงทหมายถงเมอนาถวยระเหยไปอบซาทสภาวะเดมนาน30min

นาหนกทไดจากการอบ2ครงตดตอกนตางกนไมเกน0.001gและใหใชนาหนกของคาท

นอยกวาในการคานวณ

10.4etherเปนสารทระเหยงายและมอนตรายตอผวเคราะหจงควรทาการวเคราะหในตดดควน

และเนองจากสารทงสองตดไฟงายจงควรทาในทไมมเปลวไฟอยใกล

10.5ไขมนทสกดไดจะตองใสไมมสงอนเจอปน

29


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณไนโตรเจนและโปรตนในไอศกรม

2. เอกสารอางอง (Reference)2.1AOACOfficialMethod930.33(A)ProteininIceCreamandFrozenDesserts

2.2 ISO1871:2009(E),FoodandFeedProducts-Generalguidelinesforthedetermination

ofnitrogenbytheKjeldahlmethod

2.3AOACOfficialMethod936.15StandardSolutionofHydrochloricAcid.

3. หลกการ (Principle) โปรตนในตวอยางถกยอยในH2SO4ใชCuSO4.5H2OเปนcatalystและK2SO4ชวยเพมจดเดอด

ของH2SO4ไนโตรเจนจะถกเปลยนไปเปนเกลอแอมโมเนยมเตมNaOHมากเกนพอและกลน

ดวยไอนาNH3ถกจบไวในH3BO3วเคราะหปรมาณไนโตรเจนโดยการไตเตรทดวยหลกการเดยวกน

สามารถดาเนนการได 2 วธ คอ Traditionalmethod และBlock digestion/Steam distillation

method

4. เครองมอ (Apparatus)Traditionalmethod


4.2Digestionflasks-Kjeldahlflaskขนาด500หรอ800ml

4.3Distillation flasks-Kjeldahl flask ขนาด 500 หรอ 800 ml ทมจกยาง สามารถตอกบ

trapทปองกนNaOHลนระหวางการกลนและตอกบcondenserใชgraduatedErlenmeyer

titrationflaskขนาด500mlเกบdistillate

4.4Digestion/distillationsystem-Traditionalapparatusสามารถควบคมอณหภมได

4.5Titrationburet-ClassAขนาด50mlหรอAutomatictitratorprovidedwithapHmeter

ทสามารถวดคาpHในชวง4-7

DMSc F 1028: การวเคราะหไนโตรเจนในไอศกรมโดย Kjeldahl method

Determination of nitrogen in ice cream by

the Kjeldahl method

30


Blockdigestion/Steamdistillationmethod


4.2Digestion block-Aluminium alloy block หรอเครองมออนทเทยบเทา ทสามารถปรบและ

ควบคมอณหภมไดพรอมทงอปกรณวดอณหภม

4.3Digestiontubesขนาด250ml

4.4Distillation unit-ใชสาหรบ steam distillation สามารถตอไดกบ digestion tubes ขนาด

250mlและdistillationtitrationflasksขนาด500ml

4.5Distillationtitrationflask-graduatedErlenmeyertitrationflaskขนาด500ml

4.6Titrationburet-ClassAขนาด50mlหรอAutomatictitratorprovidedwithapHmeter

ทสามารถวดคาpHในชวง4-7

5. สารเคม (Reagent) 5.1 H2SO4 ความเขมขน95-98%Nitrogenfree

5.2Coppercatalystsolution-CuSO4.5H2ONitrogenfreeเตรยมเปนสารละลาย0.05g/ml

H2O

5.3K2SO4Nitrogenfree(หรอใชKjeldahlcatalysttabletsสาเรจรปแทนcatalystในขอ5.2

และ5.3)

5.4Sodiumhydroxidesolution-50%(w/w)nitratefreeNaOH(ความเขมขนและปรมาณ

เปลยนแปลงไดตามคาแนะนาของผผลต)

5.5Boilingchips-Meshsize10

5.6Methyl red/Bromocresol green indicator solution-ละลายmethyl red 0.2g ใน 95%

ethanolและปรบปรมาตรดวย95%ethanolครบ100mlละลายbromocresolgreen1g

ใน 95% ethanol และปรบปรมาตรดวย 95% ethanol ครบ 500 ml ผสมสารละลาย

ทงสองชนดเขาดวยกน

5.7Boricacidsolution-4%withindicatorละลายH3BO340gดวยนาเจอจางจนครบปรมาตร

1Lเตมindicator(5.6)3mlสารละลายนจะมสสมออน(1-4%สาหรบBlockdigestion)

5.80.1000 M Hydrochloric acid standard solution-เตรยมเอง หรอใช สารละลายทม

ใบรบรองความเขมขน0.0995-0.1005Mและใชคา0.1000Mในการคานวณ

5.8.1 ปเปตconc.HCl8.6mlใสลงในvolumetricflaskขนาด1Lซงมนาอยประมาณ

600mlปรบใหครบปรมาตร1LดวยH2Oผสมใหเขากน

5.8.2 standardization0.1000MHCl:ชงanh.Na2CO3(อบท120°Cเปนเวลา3hr

และเกบในdesiccator)ประมาณ0.25gลงในErlenmeyerflaskขนาด250ml

ละลายดวยH2O(ใชH2OทตมใหเดอดเพอไลCO2และทงใหเยนทอณหภมหอง)

31


ประมาณ80mlเตมmethylredindicatorประมาณ5หยดจะไดสารละลายสสมออน

นาไปไตเตรทกบ0.1000MHClทเตรยมไวจนกระทงสของสารละลายเปลยนจากส

ของ reference solution เลกนอย (reference solution: H2O ทปราศจาก CO2

80ml เตมmethyl red indicator5หยด)นาไปตมใหเดอดเบาๆบนhot plate

นานประมาณ2minทงใหเยนทอณหภมหองแลวนาไปไตเตรทตอกบ0.1000MHCl

จนกระทงสของสารละลายเปลยนเปนสสมบนทกปรมาตรรวมของ0.1000MHCl

ทใชไตเตรทคานวณความเขมขนทแนนอนของ0.1000MHClจากสมการ

M =[(Wx1000)/(Vx52.994)]

โดย M=MolarityของHCl(mole/L)

W =นาหนกของanh.Na2CO3(g)

V=ปรมาตรของสารละลาย0.1000MHClทใชไตเตรท(ml)

52.994 =นาหนกสมมลยของNa2CO3

5.9 Ammoniumsulfate-99.9%(NH4)2SO4

5.10Tryptophanหรอlysinehydrochloride-99%C11H12 N2O2หรอC6H15ClN2O2

5.11Sucrose-Nitrogenfree

6. การเตรยมตวอยาง (Sample preparation)6.1การสมตวอยางตวอยางทมขนาดเลกใหเกบตวอยางประมาณ3-4หนวยในขวดปากกวาง


ออกเปนชน เกบในขวดปากกวาง ใหไดนาหนกประมาณ100-150กรมปดฝาใหแนน






7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)Traditional method

7.1ชงตวอยางทผานการเตรยมใหเปนเนอเดยวกนแลวใสในbeakerประมาณ4-5g(ปรมาณ

ไนโตรเจน0.005-0.2g)

7.2ถายตวอยางลงในdigestionflaskใชH2Oประมาณ25mlrinseตวอยางทตดอยทคอขวด

ลงไปใน flask เตม K2SO4 15.00 g, CuSO4.5H2O solution 1 ml และ boiling chips

8-10ชนลงในdigestionflaskแลวปดจกและวเคราะหblankโดยใชH2Oแทนตวอยาง

32


7.3Digestion burner setting - ปรบตง heater โดย ใช flask ทม H2Oประมาณ250ml

เตมboilingchips3-4ชนตงความรอนใหสามารถทาใหนาเดอดไดภายในเวลา5-6min

7.4Digestion-ยอยตวอยางโดยใชความรอนตาไมใหเกดฟองลนออกจากคอของKjeldahlflask

เปนเวลาประมาณ20minหรอจนกวามควนขาวเกดขนหลงจากนนเพมความรอนประมาณ

ครงหนงของความรอนทไดทดลองไวในขอ7.3ประมาณ15minแลวเพมความรอนเทากบ

ความรอนทไดทดลองไวในขอ 7.3 จนกระทงไดตวอยางมสเขยวอมฟาจางๆ และใส ตม

ใหเดอดตอไปอก 1 - 1.5 hr หลงจากนน ทงใหเยนทอณหภมหอง ประมาณ 25 min

เตม H2O 300 ml แกวง flask เพอใหสารละลายผสมกน ทงใหเยนทอณหภมหองกอน

นาไปกลนขนตอนนสามารถเกบไวไดโดยปดจกใหแนน

7.5Distillation-เปดนาหลอเยน เตมH3BO3 solutionทม indicator 50ml ลงใน graduated

Erlenmeyer titration flask ขนาด 500ml ตอ flask รองรบ distillate โดยใหปลายของ

tube ทตอจากปลายของ condenser จ มอย ใน H3BO3solution คอยๆ เตม 50%

NaOH 75 ml อยางระมดระวงโดยเทลงขางๆ flask ชาๆ หามแกวง ชนของ NaOH

จะอยขางใต ประกอบ flask เขากบ condenser ทนท หลงจากนน เขยาอยางแรงเพอ

ใหสารละลายผสมกนใหความรอนจนกระทงNH3 ถกกลนออกมา(≥150mldistillateหรอ ≥ 200ml total volume) ระหวางกลนตองเฝาดตลอดเวลา เนองจากอาจเกดการ bump ทจดน เมอการกลนสมบรณ ยก receiving flask ออก หยดใหความรอน ไตเตรท H3BO3

solutionดวย0.1000MHClจนกระทงจดยตเปนสชมพบนทกปรมาตรHClทใช

Block digestion/Steam distillation method

7.1ชงตวอยางประมาณ0.1-5gใสลงในdigestiontubeทมK2SO412g,CuSO4.5H2O

solution1ml(หรอใชKjeldahlcatalysttablets)เตมH2SO420ml(หรอตามคาแนะนา

ของผผลต)และวเคราะหblankโดยใชH2Oแทนตวอยาง

7.2นาdigestiontubeวางลงในtuberackวางheatshieldsแลวสวมexhaustmanifoldลงบน

ปากของdigestiontubeใหปดพอดยกrackไปวางบนdigestionblock180-230 °C

เปดระบบดดควน (ในกรณทใชนาเปนตวดดควนใหตอสายจาก exhaust manifold ไปยง

กอกนาทเตรยมไวและเปดนา)ยอยจนกระทงเกดควนสขาว(ประมาณ30min)เพมอณหภม

ของ digestion block 410 - 430 °C ยอยจนไดตวอยางสเขยวอมฟาจางๆ และใส

(clear with light blue-green color) และยอยตวอยางใหเดอดตออกประมาณ 1 hr

(เวลาทใชในการยอยทงหมดประมาณ1.75-2.5hr)

7.3ยก tube rack ออกจากเครองยอย โดยยงม exhaust manifold สวมอย ตงหลอดยอยให

เยนลงถงอณหภมหอง(ประมาณ25min)เตมH2O85mlแกวงเบาๆเพอใหสารในหลอด

ยอยผสมกนตองทงใหเยนกอนนาไปกลน(blankใหเตมH2O100ml)

33


ขอควรระวง

• หลงจากทงใหเยนแลวของเหลวทไดควรใสไมมตะกอนหรอมตะกอนเพยงเลกนอยทกนของ

หลอดยอย การเกดตะกอนแสดงวาปรมาณ H2SO4 ทเหลออยในหลอดยอยนอยเกนไป

ซงอาจมผลทาใหปรมาณโปรตนทวเคราะหไดนอยกวาความเปนจรง

• การเกดตะกอนอาจเปนผลมาจากการใชเวลาในการยอยนานเกนไปหรอการดดของexhaust

manifoldในสวนของscrubberunitแรงเกนไป

• ถาเกดตะกอนในหลอดยอยใหอนหลอดยอยในblockdigestorจนกระทงตะกอนละลาย

• ในกรณทมความจาเปนตองตงหลอดยอยทยงไมวเคราะหคางคนใหเตมนาลงในหลอดยอย

ประมาณ20mlเพอปองกนการตกตะกอนของสารในหลอด

7.4วางหลอดยอยในเครองกลน เตม 50% NaOH 65 ml ทาการกลน เกบ distillate ใน

diatillation titration flask ทม H3BO3 50 ml กลนจนได distillate ประมาณ 150 ml

(รวมปรมาตรทงหมด200ml)

7.5ไตเตรทdistillateทไดดวย0.1000MHClถงจดยตเหนเปนสชมพบนทกปรมาตรของHCl

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results) 8.1คานวณปรมาณไนโตรเจนจากสตร

ไนโตรเจน(g/100g) = 14.007xMx(VA-VB)x100

1000xW

โดย VA =ปรมาตรของHClทใชในการไตเตรทตวอยาง(ml)

VB =ปรมาตรของHClทใชในการไตเตรทblank(ml)

M =MolarityของHClsolution

W =นาหนกของตวอยาง(g)

8.2คานวณปรมาณโปรตนจากสตร

โปรตน(g/100g) = ไนโตรเจนx6.38

โดย6.38 = factor ในการคานวณปรมาณไนโตรเจนเปนปรมาณโปรตน

ทงหมดในตวอยางนมและผลตภณฑนม

8.3 เกณฑยอมรบความแตกตางของปรมาณโปรตนจากการวเคราะห2ซา(duplicate);relative

percentagedifferent(%RPD)≤1.3%protein

8.4รายงานปรมาณโปรตนในหนวย กรมตอ 100 กรม (g/100 g) ทศนยม 2 ตาแหนง

และแสดงfactorทใชในการเปลยนไนโตรเจนเปนโปรตน

34


9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)9.1ทดสอบประสทธภาพการยอย(digestionefficiency)

ชง lysinemonohydrochloride0.1g(หรอ tryptophan0.18g)และsucrose0.67g

พรอมสารตางๆทาการยอยกลนและไตเตรทเชนเดยวกบตวอยางrecoveryทไดควรมคา

ระหวาง 98-101%โดย lysine monohydrochloride ม ไนโตรเจน = 15.34% และ

tryptophan ม ไนโตรเจน = 13.72% ถาคา recovery ทไดตากวา 98% ใหทดสอบ

การสญเสยไนโตรเจนในขอ9.3

9.2ทดสอบประสทธภาพการกลนและการไตเตรท

ชงammoniumsulfate(อบท102oCนาน3hrเกบในdesiccator)0.12gลงในหลอดยอย

นาไปกลนและไตเตรท recovery ทไดควรมคาอยในชวงระหวาง 99-101%(ammonium

sulfateมไนโตรเจน=21.2%)ถา%recoveryนอยกวา99%แสดงวามการสญเสยไนโตรเจน

ในขนตอนการกลนหรอความเขมขนของกรดทใชในการคานวณนอยกวาทควรเปน

9.3ทดสอบการสญเสยไนโตรเจน(nitrogenloss)

ชง ammoniumsulfate (อบท 102oCนาน3hr เกบไวในdesiccator)0.12g,sucrose

0.67gใสสารตางๆทาการยอยกลนและไตเตรทเชนเดยวกบตวอยางrecoveryทไดควร

มคาอยระหวาง99-101%ถา%recoveryไดตามเกณฑโดยผลการทดสอบประสทธภาพ

การยอยไมไดตามเกณฑแสดงวาเวลาและอณหภมทใชในการยอยไมเหมาะสม

การคานวณ

ไนโตรเจนทวเคราะหได(%) recovery(%)= x100ไนโตรเจนของสารมาตรฐานทใช(%)xความบรสทธของสารมาตรฐาน

10. รายละเอยดอน10.1 ขอมลผล Interlaboratory study นมพรอมดม (milk) - แสดงเปนปรมาณโปรตน

(N x 6.38) : sr=0.006; sR = 0.012; RSDr = 2.817%; RSDR = 5.707%;

rvalue=0.038และRvalue=0.049

10.2 ถา blank มสชมพกอนการไตเตรท แสดงวาอาจเกดขอผดพลาด เชน titration vessel

ไมสะอาดใหเปลยนblankใหม

35


10.3 สาเหตและการแกไขขอผดพลาดตางๆทอาจเกดขน

ขนตอนการยอย

สงทเกดขน สาเหต การแกไข

เกดฟองมาก - ตวอยางมนาตาลหรอไขมนสง -เตมantifoamเชนsilicone

- ปรมาณของตวอยางมากเกนไป -ลดปรมาณตวอยาง

หลงการยอยมตะกอนดา - เวลาและ/หรออณหภมในการ -ปรบอณหภมและเวลาในการยอย

ยอยไมเหมาะสม

- catalystทใชไมเหมาะสม -ใชปรมาณตวอยางกรดและชนด

ของcatalystใหเหมาะสม

หลงการยอยเกดผลก - มการสญเสยกรด -ลดความแรงของการดดควน

จานวนมาก -ใชปรมาณตวอยางกรดและชนด

ของcatalystใหเหมาะสม

ระหวางการกลนและการไตเตรท

สงทเกดขน สาเหต การแกไข

%recoveryของการกลน - มการสญเสยแอมโมเนย -ตรวจสอบอปกรณเครองมอ

และการไตเตรท บรเวณทมการรวได

ตากวาเกณฑกาหนด - ปรมาณH3BO3ไมเพยงพอ -เพมความเขมขนหรอปรมาตรของ

H3BO3

- การกลนยงไมสมบรณ -เพมเวลาในการกลน

- ความเขมขนของกรดไมถกตอง -ตรวจสอบความถกตองของ

ความเขมขนของกรด

- คาของblankสงเกนไป -ทาblankซา

%recoveryของการกลน - ความเขมขนของกรดไมถกตอง -ตรวจสอบความถกตองของความ

และการไตเตรทสงเกนไป เขมขนของกรด

- เกดการปนเปอนเนองจากไอของ -หลกลยงการกลนในบรเวณทมไอ

แอมโมเนย ของแอมโมเนย

37


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณของแขงทงหมดในไอศกรม

2. เอกสารอางอง (Reference)AOACOfficialMethod941.08TotalSolidsinIceCreamandFrozenDesserts.Gravimetric

method

3. หลกการ (Principle) ระเหยนาออกจากตวอยางดวยอางนารอนและทาตวอยางใหแหงในตอบรอนทอณหภม100± 1oC

สารทเหลออยคอของแขงทงหมด

4. เครองมอ (Apparatus)4.1เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.2ตอบรอน(dryingoven)ซงสามารถปรบตงอณหภมไดท100± 1oC

4.3อางนารอน(waterbath)

4.4โถดดความชนพรอมสารดดความชน(desiccatorwithdesiccant)

4.5ถวยอลมเนยมชนดมฝาปด(flatbottomaluminumdish)ขนาดเสนผานศนยกลาง≥5cm

5. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)5.1การสมตวอยางตวอยางทมขนาดเลกใหเกบตวอยางประมาณ3-4หนวยในขวดปากกวาง


ออกเปนชน เกบในขวดปากกวาง ใหไดนาหนกประมาณ 100-150 g ปดฝาใหแนน






DMSc F 1029: การวเคราะหของแขงทงหมดในไอศกรม

Determination of total solids content in ice cream

38


6. ขนตอนการทดสอบ (Procedures)6.1 เตรยมถวยอลมเนยม: เขยนรหสบนถวยอลมเนยมทแหงและสะอาด นาไปอบพรอมฝาโดย

เปดฝาขณะอบในตอบรอนท100± 1oCเปนเวลา1.5hrปดฝาถวยอลมเนยมและเอาออก

จากตอบรอน เกบในโถดดความชนทนท ทงไวใหเยนจนถงอณหภมหองชง (ประมาณ

30min)ชงนาหนก(W1)

6.2 ชงตวอยางประมาณ1-2g ใสในถวยอลมเนยมทเตรยมไวบนทกนาหนกทแนนอน (W)

แลวนาไประเหยใหแหงบนอางนาเดอด 30min อบถวยอลมเนยมพรอมตวอยางโดยเปดฝา

ขณะอบในตอบรอนทอณหภม100± 1oC เปนเวลา3.5hrปดฝาถวยอบ เอาออกจาก

ตอบรอนเกบในโถดดความชนทนททงไวใหเยน(ประมาณ30min) ชงนาหนกอบอกครงละ

1hrจนไดนาหนกคงท(W2)

7. การคำานวณและการรายงานผล (Calculationand expression of results) 7.1การคานวณ

ปรมาณของแขงทงหมด(รอยละของนาหนก)=(W2-W1)x100/W

เมอ W1 = นาหนกของถวยอลมเนยมหลงอบ(g)

W2 = นาหนกของถวยอลมเนยมและตวอยางหลงอบ(g)

W = นาหนกของตวอยาง(g)

7.2รายงานผลการทดสอบ(Testreport)

รายงานปรมาณของแขงทงหมดในหนวยรอยละของนาหนกดวยทศนยม2ตาแหนง

8. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results) วเคราะห2ซา(duplicate)ในทกตวอยาง

9. รายละเอยดอน 9.1นาหนกคงท หมายถง นาหนกทไดจากการอบ 2 ครง ตดตอกน ตางกนไมเกน 0.001 g

และใหใชนาหนกของคาทนอยกวาในการคานวณ

9.2หามจบถวยอลมเนยมทอบแลวดวยมอเปลาใหใชtongหรอสวมถงมอทสะอาด

9.3 ในการวเคราะห2ซา(duplicate)ปรมาณของแขงทงหมดในตวอยาง100gควรตางกน

ไมเกน0.2g

39


1. ขอบขาย (Scope)ใชเปนวธตรวจวเคราะหปรมาณกรดซตรก(citricacid)ในนาผลไมและเครองดมเกลอแร

2. เอกสารอางอง (Reference) AOACOfficialMethodsofAnalysis986.13Quinic,Malic,andCitricAcids inCranberry

JuiceCocktailandAppleJuice.

3. หลกการ (Principle)กรดซตรกในตวอยางถกกรองผานSPEcartridgeเพอกาจดตวรบกวนและนาไปวเคราะหหาปรมาณ

ดวยเครองHPLC-UVdetector

4. เครองมอ (Apparatus)4.1HPLC-UVdetectorหรอdiodearraydetector

4.2 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001กรม

4.3Mixer/blender

4.4Ultrasonicbath

4.5pHmeter

4.6อปกรณ

4.6.1Column:reversedphaseC18 (5 µµm,4.6x250mm)หรอเทยบเทา 4.6.2ชดกรองสารละลาย (solvent clarification kit) และชดกรองตวอยาง (sample

clarificationkit):membrane filter(CA,0.45µm,dia.47mm),syringe filter

(CA,0.45µm,dia.13mm)

4.6.3Luer-Loksyringeขนาด10ml

4.6.4SPEcartridges,Sep-Pak®Vac3cc(500mg)C18หรอเทยบเทา

4.6.5Volumetricflaskขนาด50,100,200,250และ1,000ml

4.6.6Beakerขนาด10,50และ1,000ml

4.6.7Pipetteขนาด1,2,5,10,20และ50ml

DMSc F 1030: การวเคราะหปรมาณกรดซตรกในเครองดม

Determination of citric acid in beverage

40


5. สารเคม (Reagent)5.1Acetonitrile(HPLCgrade)

5.2Methanol(HPLCgrade)

5.3Potassiumphosphatemonobasic(KH2PO4)

5.485%phosphoricacid(H3PO4)

5.5 H2Oใชนากลน3ครงหรอนาทมคณภาพเทยบเทา

5.6mobilephase(phosphatebuffer,0.2MKH2PO4,pH2.4):ชงKH2PO427.2gลงใน

beaker50mlละลายดวยH2Oและถายลงในbeakerขนาด1,000mlเตมH2Oใหมปรมาตร

950mlจากนนนามาปรบpHใหได2.4ดวย85%H3PO4 แลวถายลงในvolumetricflask

ขนาด 1,000 ml ปรบปรมาตรดวย H2O และกรองผานกระดาษกรองชนด CA ขนาด

0.45µmและdegasนาน5minในเครองultrasonicbath

5.7Conditioningsolution(acetonitrile:H2O=50:50)

5.8สารมาตรฐานกรดซตรก(monohydrate):purity≥99.5% 5.8.1 สารละลายมาตรฐานกรดซตรก(2,000µµg/ml):ชงสารมาตรฐานกรดซตรก0.2000g

ในbeakerขนาด10mlละลายดวยH2Oถายลงในvolumetricflaskขนาด100ml

แลวปรบปรมาตรดวยH2O

5.8.2 intermediate standard solution (1,000 µg/ml): ปเปตสารละลายมาตรฐาน

ความเขมขน 2,000µg/ml (5.8.1) ปรมาตร 50 ml ลงใน volumetric flask ขนาด100mlปรบปรมาตรดวยH2O

5.8.3workingstandardsolution(10,20,50,100และ200µg/ml):ปเปตสารละลาย มาตรฐานความเขมขน1,000µg/ml(5.8.2)ปรมาตร1,2,5,10และ20ml ลงในvolumetricflaskขนาด100mlแตละใบแลวปรบปรมาตรดวยH2O

5.8.4working standard solution (400 และ 800µg/ml): ปเปตสารละลายมาตรฐาน

ความเขมขน2,000µg/ml(5.8.1)ปรมาตร10และ20mlลงในvolumetricflask ขนาด50mlแตละใบแลวปรบปรมาตรดวยH2O

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)6.1สมตวอยางทเปนเนอเดยวกนแลวนามาเจอจางหรอละลายดวยนากลนโดยการปเปต(V1)

ลงใน volumetric flask ขนาด 100 ml (V2) หรอตามความเหมาะสม ในกรณทตวอยาง

อดแกสใหทาการdegasโดยนาไปsonicateประมาณ3-5minกอนเจอจาง

6.2condition cartridge โดยใช Luer-Lok syringe ดด conditioning solution (5.7) จานวน

10mlผานลงในSPEcartridge

41


6.3ปเปตสารละลายทไดจากขอ6.1ปรมาตร10mlผานSPEcartridgeทไดทาการcondition

แลว(6.2)ทงสารละลายทไดประมาณ4-5mlไปแลวเกบสวนทเหลอไว

6.4กรองสวนทเหลอดวยsyringefilter

7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)7.1ฉดworkingstandardsolutionทไดจากขอ5.8.3และ5.8.4เขาเครองHPLCสรางกราฟ

มาตรฐานโดยplotระหวางpeakareaกบความเขมขนของสารละลายมาตรฐานและคานวณ

คาR2โดยเกณฑการยอมรบคอ≥0.99957.2นาสารละลายทไดจาก6.4มาวเคราะหดวยเครองHPLCและหาปรมาณโดยอานจากกราฟ

มาตรฐาน

7.3สภาวะเครองHPLC

Column:RPC18 (5 µµm,4.6x250mm)

Detector:UV214nmหรอDAD

Flowrate:1.0ml/min

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results)8.1การคานวณ

กรดซตรก(mg/L)=(cxv2xd)/v1

กรดซตรกคานวณเมอปราศจากนา(mg/L)=(cxv2x192.124xd)/(v1x210.14)

หรอปรมาณกรดซตรกคานวณเปนซเตรต(mg/L)=(cxv2x189.1xd)/v1x210.14

เมอ c =ปรมาณกรดซตรกในตวอยางทอานจากกราฟมาตรฐาน(µg/ml)

v1 = ปรมาตรของตวอยาง(ml)

v2 = ปรมาตรของตวอยางทเตรยม(ml)

d = dilutionfactor

192.124=molecularweightของcitricacidanhydrous

210.14 =molecularweightของcitricacidmonohydrate

189.1 =molecularweightของcitrate

8.2การรายงานผล

ใหรายงานผลปรมาณกรดซตรกคานวณเมอปราศจากนา หรอกรดซตรกคานวณเปนซเตรต

ในหนวยมลลกรมตอลตร

42


9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)9.1ทาการตรวจเชคระบบของเครองHPLC(systemsuitability)โดยการฉดสารมาตรฐาน1ระดบ

ความเขมขน 5 ซา กอนทาการวเคราะหทกครง โดย% RSD ของ retention time และ

peakareaตองไมเกน1และ2.5ตามลาดบ

9.2 เตรยมกราฟมาตรฐานกอนการวเคราะหตวอยางโดยR2 ตองมากกวา0.9995

9.3ทาการวเคราะหซา (duplicate analysis) ไมนอยกวา 10% ของการวเคราะหแตละรนและ

%RPDไมเกน5

9.4ทก10ตวอยางใหฉดสารละลายมาตรฐาน1ครงโดย%differenceของสารละลายมาตรฐาน

ทฉดกบความเขมขนของสารละลายมาตรฐานทเตรยมตองไมเกน5

9.5กรณทตวอยางมปรมาณกรดซตรกสง ใหเจอจางหรอลดขนาดตวอยางตามความเหมาะสม

โดยคาความเขมขนทอานตองอยภายในชวงของกราฟมาตรฐานทเตรยม

9.6ทก10ตวอยางใหทาการวเคราะหcontrolsampleโดยคาทไดตองอยในชวง±± 3SD

43


1. ขอบขาย (Scope)ใชเปนวธตรวจวเคราะหปรมาณไนไตรตและไนเตรต(nitriteandnitrate)ในเนอสตวและผลตภณฑ

2. เอกสารอางอง (Reference)BSEN12014-4:2005.Foodstuffs-Determinationofnitrateand/ornitritecontent-Part

4:Ion-exchangechromatographic(IC)methodforthedeterminationofnitrateandnitrite

contentofmeatproducts.

3. หลกการ (Principle)ไนไตรต และไนเตรตจะถกสกดออกจากเนอสตวและผลตภณฑดวยนารอน และเตม acetonitrile

เพอกาจดสารรบกวน แลวนาไปวเคราะหหาปรมาณดวยเครอง HPLC โดยใช Ion-exchange

columnและUVdetectorทความยาวคลน205nm

4. เครองมอ (Apparatus)4.1HPLC-UVdetectorหรอdiodearraydetector

4.2 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.3Mixer/blender

4.4Ultrasonicbath

4.5pHmeter

4.6Magneticstirrer

4.7อปกรณ

4.7.1 Column:anionexchange(4.6mm×150mm),packingmaterial:polymethacrylate

resinwithaquarternaryammoniumfunctionalgroup,particlesizeof10µ µm,

capacity(30±± 3 µµeq/ml)withaprecolumn

4.7.2 ชดกรองตวอยาง (sample clarification kit) และ ชดกรองสารละลาย (solvent

clarificationkit):membranefilter(nylon,0.2µm,dia.47mm),syringefilter

(nylon,0.45และ/หรอ0.2µm,dia.13mm)

DMSc F 1031: การวเคราะหปรมาณไนไตรตและไนเตรตในผลตภณฑเนอสตว

Determination of nitrite and nitrate in meat products

44


4.7.3กระดาษกรองWhatmanNo.1หรอเทยบเทา

4.7.4Volumetricflaskขนาด100,200และ1,000ml

4.7.5Beakerขนาด20,50และ100ml

4.7.6Pipetteขนาด1,5,10,15และ20ml

4.7.7Cylinderขนาด25,50และ100ml

4.7.8Wideneckconicalflaskขนาด150ml

5. สารเคม (Reagent)สารเคมทกชนดใชARgradeยกเวนทระบไวเพมเตมและH2Oใชนากลน3ครงหรอทมคณภาพ

เทยบเคยง

5.1Acetonitrile(HPLCgrade)

5.2Glycerol

5.3Lithiumhydroxideanhydrousorlithiumhydroxidemonohydrate

5.4Boricacid(purity ≥99.0%)

5.5Hydrochloricacid(1.8Mและ0.1M)

- 1.8MHCl:ตวงHCl(conc.)ปรมาตร15mlลงในvolumetricflaskขนาด100ml

ทมH2Oอยประมาณ50mlแลวปรบปรมาตรใหครบดวยH2O

- 0.1MHCl:ตวง1.8MHClประมาณ5.6mlลงในvolumetricflaskขนาด100ml

ทมH2Oอยประมาณ50mlแลวปรบปรมาตรใหครบดวยH2O

5.6Gluconic acid solution: เจอจาง gluconic acid solution ปรมาตร 50 ml ดวย H2O

ในvolumetricflaskขนาด100ml

5.7Lithiumborategluconatebuffersolution:ละลายboricacid(5.4)34gและgluconic

acidsolution(5.6)19.6mlลงในvolumetricflaskทมH2Oอยปรมาณ500mlเตม

lithiumhydroxideanhydrous(5.3)11g(หรอlithiumhydroxidemonohydrate19.26g)

เตมglycerol(5.2)ปรมาตร125mlและปรบปรมาตรใหครบ1,000mlดวยH2Oแลว

เขยาใหเขากน(สารละลายนสามารถเกบในตเยนทอณหภม4oCไดนาน6เดอน)

5.8 mobilephase:ผสมbuffersolution(5.7)ปรมาตร17mlและacetonitrileปรมาตร125ml

ลงในvolumetric flaskขนาด1,000mlทมH2Oอยปรมาณ500mlแลวปรบปรมาตร

ใหครบดวยH2OและเขยาใหเขากนจากนนนามาปรบpHดวย1.8MHClปรบใหไดpH

ประมาณ 7.0 จากนนคอยๆ หยด 0.1 M HCl เพอปรบ pH เปน 6.5 ±± 0.1 จากนน

กรองผานmembranefilterขนาด0.2µmชนดnylonและdegasนาน5minในเครอง

ultrasonicbath

45


5.9สารมาตรฐานpotassiumnitrateและsodiumnitrite:purity≥99.0% 5.9.1 stocksolutionofnitrateandnitrite(2,000µg/mlสาหรบnitrateและ1,000µg/ml

สาหรบnitrite):ชงสารมาตรฐานpotassiumnitrate3.258gและsodiumnitrite

1.500 g ใน beaker ขนาด20ml ละลายดวยH2Oถายลงใน volumetric flask

ขนาด 1,000ml แลวปรบปรมาตรใหครบดวย H2O (สารมาตรฐานผสมนสามารถ

เกบในตเยนท4oCไดนาน2สปดาห)

5.9.2 intermediate standard solution (200µg/ml สาหรบ nitrate และ 100µg/ml

สาหรบnitrite):ปเปตstockstandardsolutionปรมาตร10mlลงในvolumetric

flaskขนาด100mlแลวปรบปรมาตรดวยH2O

5.9.3working standard solution (0, 1, 5, 10, 15 และ 20µg/ml สาหรบ nitrate

และ0,0.5,2.5,5.0,7.5และ10µg/mlสาหรบnitrite):ปเปตintermediate

standard solutionปรมาตร0,1,5,10,15และ20ml ลงในขวดวดปรมาตร

ขนาด200mlแตละใบแลวปรบปรมาตรดวยH2O

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)นาตวอยางมาสบและบดใหละเอยดดวยblenderแลวผสมตวอยางจนเปนเนอเดยวกน

7. ขนตอนการวเคราะห (Procedure) 7.1การสกดและกาจดสารรบกวน

7.1.1ชงตวอยางประมาณ10g(บนทกนาหนกทแนนอน)ลงในwideneckconicalflask

ขนาด150mlเตมนารอน(50-60oC)50mlทาการกวนใหเขากนแลวถายใส

volumetricflaskขนาด200ml

7.1.2เตม acetonitrile 50 ml เขยาใหเขากน แลวตงทงไวใหอณหภมเทากบอณหภม

หองและปรบปรมาตรดวยH2O

7.1.3กรองผานกระดาษกรองWhatmanNo.1หรอเทยบเทา

7.1.4กรองผานsyringefilterชนดnylonขนาด0.45µmถาตวอยางไมใสใหกรองผาน

syringefilterขนาด0.2µm

7.1.5วเคราะหblankโดยใชนากลน10mlแทนตวอยาง

7.2การเตรยมกราฟมาตรฐาน

7.2.1ฉดworkingstandardsolutionความเขมขนละ1ซาปรมาตร40µµlเขาเครองHPLC

7.2.2สรางกราฟมาตรฐานของไนเตรต และไนไตรต โดย plot ระหวาง peak area กบ

ความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน และคานวณคา R2 โดยเกณฑการยอมรบคอ≥

≥0.9995

46


7.3นาสารละลายทไดจาก 7.1.4 มาวเคราะหดวยเครอง HPLC และหาปรมาณโดยอานจาก

กราฟมาตรฐาน

7.4สภาวะเครองHPLC

Column:anionexchange(4.6mm×150mm)

Detector:UV,205nmหรอDAD

Flowrate:2.0ml/min

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results) 8.1การคานวณ

ปรมาณไนไตรตหรอไนเตรต(mg/kg)=(cxvxF)/w

เมอ c = ปรมาณไนไตรตหรอไนเตรตในตวอยางทอานจากกราฟ(µ µg/ml)

v = ปรมาตรของตวอยาง(200ml)

w = นาหนกตวอยาง(g)

F = dilutionfactor

8.2การรายงานผล

รายงานผลเปนจานวนเตมหนวยเปนมลลกรมตอกโลกรม

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)9.1ทาการตรวจเชคระบบของเครองHPLC(systemsuitability)กอนการใชงานทกครงโดยการ

ฉดสารมาตรฐาน 1 ระดบความเขมขน จานวน 5 ซา%RSD ของ retention time และ

peakareaตองไมเกน1และ2.5ตามลาดบ

9.2 เตรยมกราฟมาตรฐานกอนการวเคราะหตวอยางโดยR2ตองมากกวา0.9995

9.3ทาการฉดblankทกครงกอนฉดsample

9.4ทก5ตวอยางใหทาการวเคราะหซา(duplicateanalysis)โดย%RPDไมเกน5

9.5ทก5ตวอยางใหฉดสารละลายมาตรฐาน1ครงโดย%differenceของสารละลายมาตรฐาน

ทฉดกบความเขมขนของสารละลายมาตรฐานทเตรยมตองไมเกน5

9.6กรณทตวอยางมปรมาณไนเตรต หรอไนไตรต ไมอยในชวงความเปนเสนตรงของวธ ให

เจอจางตามความเหมาะสมดวยmobilephase โดยคาความเขมขนทอานตองอยภายในชวง

ของกราฟมาตรฐานทเตรยม

9.7ทก10ตวอยางใหทาการวเคราะหcontrolsampleโดยคาทไดตองอยในชวง±± 3SD

47


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหยอาหารจาลอง(foodsimulamts)ทไดจากการ

ทดสอบmigrationภายใตสภาวะทดสอบทกาหนดโดยวธนของขวดนมภาชนะบรรจนมและอปกรณ

ตางๆทาดวยพลาสตกใชเพอการบรโภคของทารกและเดกเลก

2. เอกสารอางอง (Reference) 2.1BSEN1186-1:2002Materialandarticlesincontactwithfoodstuffs-Plastics-Part

1:Guidetotheselectionofconditionsandtestmethodsforoverallmigration

2.2BSEN1186-3:2002Materialandarticlesincontactwithfoodstuffs-Plastics-Part

3:Testmethodsforoverallmigrationintoaqueousfoodsimulantsbytotalimmersion

2.3BSEN1186-9:2002Materialandarticlesincontactwithfoodstuffs-Plastics-Part

9:Testmethodsforoverallmigrationintoaqueousfoodsimulantsbyarticlefilling

2.4Commissionregulation(EU)No10/2011of14January2011onplasticmaterials

andarticlesintendedtocomeintocontactwithfood

3. หลกการ (Principle)สกดสารตางๆทตกคางในตวอยางพลาสตกภายใตสภาวะการทดสอบmigrationทอณหภม70oC

เปนเวลา2hrโดยมethanol50%(v/v)inaqueoussolutionและaceticacid3%(w/v)in

aqueoussolutionเปนfoodsimulantsระเหยสารละลายออกไปจนหมดแลววเคราะหปรมาณสาร

ตกคางทเหลออย(non-volatilesubstances)โดยการชงนาหนก

4. เครองมอ (Apparatus) 4.1 เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.2ตอบรอน(hotairoven)หรอตควบคมอณหภม (incubator)สามารถควบคมอณภมไดท

70±±2oCและ105-110oC

4.3อางนารอน(steambath)

4.4 เตาไฟฟา(hotplate)

DMSc F 1032: การวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหยอาหารจำาลอง

Determination of residues left after evaporation of food simulants

48


4.5 อปกรณสาหรบวดอณหภมเชนเทอรโมมเตอรหรอเทอรโมคพเปล(thermocouple)

4.6 อปกรณสาหรบตดตวอยางเชนกรรไกรมดคดเตอรเปนตน

4.7 อปกรณสาหรบวดระยะเชนไมบรรทดหรอvernierทมความละเอยด0.1mm

4.8 ตะแกรงลวดทาดวยเหลกกลาไรสนม(stainlesssteelgauze)

4.9 ถวยระเหย(dish)เสนผานศนยกลาง50-90mmนาหนกไมเกน100gทาดวยแกวหรอ

วสดอนทเหมาะสมเชนแพลตนม(platinum),แพลตนมอลลอยด(platinumalloy),เซรามก

(glassceramicandglazedceramic)เปนตน

4.10 โถดดความชน(desiccator)และสารดดความชนanhydrouscalciumchlorideหรอsilicagel

4.11 Glass tubeชนดgroundglassstopperเสนผานศนยกลาง35mmสง120-200mm

ปรมาตร125ml

4.12 Measuringcylinder

4.13 Beaker

4.14 Pipette

4.15 ขวดแกวปากกวางพรอมฝาปดสามารถบรรจตวอยางทดสอบได

4.16 ขวดแกวปากเกลยว (glass bottle with screw finish) หรอภาชนะแกวประเภทอนท

เหมาะสม

4.17 Flaskชนดgroundglassstopper

4.18 Glassbeadsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mm

4.19 Glassrodsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mm

4.20 แผนอะลมเนยมเปลว (aluminium foil) หรอวสดทนความรอนอน ทไมมผลรบกวนในการ

วเคราะห


หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอนสารเคมทกชนดไมตากวาARgradeและH2Oทใชเปนนากรอง

(deionized)หรอนากลนทมคณภาพเทยบเทากน

5.1Foodsimulants

5.1.1 3%aceticacid(w/v)inaqueoussolution(foodsimulantB):ละลายaceticacid

(glacial)3gในH2O100ml

5.1.2 50% ethanol (v/v) in aqueous solution (food simulant D1): ผสม ethanol

(HPLCgrade)กบH2Oในอตราสวน1:1

49


6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample) 6.1ตวอยางทบรรจของเหลวไดเชนขวดนมหรอภาชนะบรรจนมแบบใชซาใชตวอยางทดสอบ

(testspecimen)จานวน3ชนเพอทดสอบmigrationและจานวน2ชนเพอวดปรมาตร

ของfoodsimulantทใชทดสอบวดปรมาตรโดยใสfoodsimulantลงในตวอยางจนถงระดบ

สงสดทกาหนดไวเพอการใชงาน(ถาม)หรอทระดบตากวาขอบบนสด5mmบนทกปรมาตร

และคานวณคาเฉลยหนวยเปนml

6.2ตวอยางทบรรจของเหลวไมไดเชนฝาและอปกรณประกอบอน

6.2.1 ฝาใชตวอยางทดสอบจานวน3ชน

6.2.2 อปกรณประกอบอน

6.2.2.1 ตวอยางทมพนทประมาณ1.0dm2ใชตวอยางทงชนถามรปทรงไมสมมาตร

(irregular shape) ตดใหมขนาดและรปรางทสมมาตร จานวนชนทดสอบ

ทใช3ชน เพอทดสอบmigrationและใชชนทดสอบ2ชน เพอคานวณ

พนทผวคานวณพนทผวเฉพาะดานทสมผสอาหารของชนทดสอบแตละชน

แลวคานวณคาเฉลยพนทผวทตองการ1.0dm2วดละเอยดถง0.01dm2

6.2.2.2 ตวอยางทมพนทนอยกวา 1.0 dm2 ใชชนทดสอบหลายชนประกอบกน

เปนชดจานวน3ชดเพอทดสอบmigrationและจานวน2ชดเพอคานวณ

พนทผวคานวณพนทผวใหไดรวมกน1.0dm2วดละเอยดถง0.01dm2

คานวณคาเฉลยของชนทดสอบแตละชด

หมายเหต วธคานวณพนทผวปฏบตตามENISO8442-2:1997annexBหรอ

วธอนทเหมาะสม

6.3ตวอยางทใชทดสอบmigrationทาความสะอาดดวยผาหรอแปรงขนนมตมในนาเดอดเปนเวลา

10minผงใหแหงในทปลอดฝนหรอปฎบตตามคาแนะนาของผผลตสนคา(ถาม)

7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure) 7.1Migrationtestทาการทดสอบโดยใชfoodsimulantทง2ชนดแตละชนดแยกกน

7.1.1 ตวอยางทสามารถบรรจของเหลวไดใชวธArticlefillingดงน

7.1.1.1 ใสfoodsimulant(5.1)ลงในbeakerปรมาตรใหเพยงพอเพอใสในตวอยาง

ทดสอบตามทคานวณไวในขอ6.1และเพมอก200mlเพอเตรยมblank

นาไปอนบนhotplateหรออปกรณใหความรอนอนๆจนไดอณหภม70±±2oC

เทใสตวอยางทเตรยมไวในขอ 6.3 แตละตวอยางใหมปรมาตรตามทได

คานวณไวในขอ6.1±±2mlจมอปกรณสาหรบวดอณหภม(4.5)ลงใน

ตวอยางเพยง 1 ตวอยาง ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทน

ความรอนหรอใสขวดแกวปากกวาง (4.15)ปดฝาสารละลายทเหลอใน

beakerปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอนเพอใชเตรยมblank

50


7.1.1.2 นาตวอยางและblankไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมท70±±2oC

สงเกตอณหภมของfoodsimulantเมอถงระดบ70±±±2oCจบเวลา2hr

ไมใหเกน5minนาตวอยางและblankออกมาตรวจดระดบของสารละลาย

ทเหลอตองไมตากวาเดมมากกวา10mm(กรณทไมเปนไปตามขอกาหนด

นตองทาการทดสอบใหมตงแตตนโดยใชตวอยางชดใหม)ปเปตสารละลาย

ออกจากตวอยางทงหมดเกบใน flask (4.17) และเทสารละลายออกจาก

beaker เกบใน flask ปดฝาวางทงไวใหเยนทอณหภมหองใชเปน test

solutionและblank

7.1.1.3 ทดสอบ migration ซาอก 2 ครง โดยใชตวอยางเดม ลางดวยนาสะอาด

ผงใหแหงและปฎบตตามขนตอน7.1.1.1-7.1.1.2

7.1.2 ตวอยางทบรรจของเหลวไมไดประเภทฝาใชวธFillinginjar/containerดงน

7.1.2.1 ใสfoodsimulantลงในขวดปากเกลยว(4.16)หรอภาชนะแกวชนดอน

ทสวมไดพอดกบฝาจานวน5ใบแตละใบปรมาตรเทากบความจของภาชนะ

ทใชประกอบกบฝานน± 2 ml ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทน

ความรอน จ มอปกรณสาหรบวดอณหภม ลงในภาชนะทบรรจ food

simulantเพยง1ใบ(ใชเปนblank)ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสด

ทนความรอนนาไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมท70±±2oCเมอ

ไดระดบอณหภมตามทตองการแลว นาวสดทปดไวออกสวมฝาทเตรยมไว

ในขอ 6.3 กบภาชนะบรรจ food simulant แตละฝากบภาชนะแตละใบ

จานวน3ใบทเหลอใชเปนblankหมนเกลยวหรอยดใหแนนกรณฝาชนด

เปดดานบนใชแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอนปดทบสวนทเปด

ไวเพอกนไมใหสารละลายไหลออก แลวควาภาชนะบรรจ food simulant

ลงใหตวอยางฝาทสวมไวอยดานลาง และสมผสกบ food simulant อาจใช

beaker รองรบเพอปองกนภาชนะบรรจ food simulant ลม ทกขนตอน

ควรทาอยางรวดเรวเพอรกษาระดบอณหภมใหคงท

7.1.2.2 นาไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมตามเดม เมออณหภมของ

food simulant ถงระดบ 70±±± 2oC จบเวลา 2 hr ไมใหเกน 5 min

นาภาชนะบรรจ food simulant ออกมา นาฝาตวอยางออกเหลอ food

simulantไวในภาชนะบรรจตรวจดระดบของสารละลายทเหลอตองไมตา

กวาเดม10mm(กรณทไมเปนไปตามขอกาหนดนตองทาการทดสอบใหม

ตงแตตนโดยใชตวอยางชดใหม) ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทน

ความรอนวางทงไวใหเยนทอณหภมหองใชเปนtestsolutionและblank

7.1.2.3 ทดสอบ migration ซาอก 2 ครง โดยใชชนทดสอบเดม ลางนาสะอาด


51


7.1.3 ตวอยางทบรรจของเหลวไมไดประเภทอปกรณประกอบอนๆใชวธTotalimmersion

ดงน

7.1.3.1 ใสfoodsimulantลงในglasstube(4.11)จานวน5ใบแตละใบปรมาตร

100±±±2mlปดฝาจมอปกรณสาหรบวดอณหภมลงในglasstubeเพยง

1ใบปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอนนาglasstube

ไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมท70±±±2oCเมอไดระดบอณหภม

ตามทตองการแลวใสชนทดสอบทเตรยมไวตามขอ6.3แตละชนหรอแตละ

ชดลงในglasstubeแตละใบจานวน3ใบglasstubeทเหลอใชเปนblank

ใชglassbead(4.18)หรอglassrod(4.19)รองชนทดสอบไมใหสมผส

ผนง tube แยกชนทดสอบไมใหซอนทบกนดวย glass rod ชนทดสอบ

ทกชนตองจมในสารละลาย ถามชนทดสอบลอยขนมาใช stainless steel

gauze(4.8)กดทบกรณทใช foodsimulantB ใหใช glass rodแทน

ปดฝาใหสนททกขนตอนควรทาอยางรวดเรวเพอรกษาระดบอณหภมใหคงท

7.1.3.2 นาglasstubeไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมตามเดมเมออณหภม

ของfoodsimulantถงระดบ70±±±2oCจบเวลา2hrไมใหเกน5min

นาglasstubeออกมายกชนทดสอบและอปกรณทงหมดทใสในglasstube

ขน ปลอยใหสารละลายทตดคางอยไหลลงส glass tube จนหมด ตรวจด

ระดบของสารละลายทเหลอตองไมตากวาเดม 10 mm (กรณทไมเปนไป

ตามขอกาหนดน ตองทาการทดสอบใหมตงแตตนโดยใชตวอยางชดใหม)

ปดฝาวางทงไวใหเยนทอณหภมหองใชเปนtestsolutionและblank

7.1.3.3 ทดสอบmigrationซาอก2ครง โดยใชชนทดสอบเดมลางนาสะอาดผง

ใหแหงและปฎบตตามขนตอน7.1.3.1.-7.1.3.2

7.2การวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหย

7.2.1 การเตรยมถวยระเหย

อบถวยระเหย(4.9)ทลางสะอาดแลวในตอบรอนอณหภม105-110oCเปนเวลา

30±±±5minทงใหเยนในโถดดความชน(4.10)ประมาณ1hrชงนาหนกและบนทก

ปฎบตตามขนตอนนซาจนกวาจะไดนาหนกถวยคงท(มคาความแตกตางของนาหนก

ทไดไมเกน 0.5 mg) หามจบถวยระเหยทอบแลวดวยมอเปลา ใหใช tong หรอ

สวมถงมอทสะอาด

7.2.2 การระเหยtestsolutionและblank

7.2.2.1 กรณทดสอบmigrationดวยวธArticlefilling(7.1.1)และFillinginjar/

container(7.1.2)ปรมาตรทใชระเหย200mlทงtestsolutionและblank

52


กรณtestsolutionทเตรยมไดมปรมาตรนอยกวา200mlใหนามาใชทงหมด

เทใสถวยระเหย(7.2.1)ครงละประมาณ50mlนาไประเหยบนอางนารอน

หรอhotplateจนหมดลางภาชนะบรรจดวยสารละลายfoodsimulantชนด

เดยวกบ test solution 10ml 2 ครง เทลงในถวยระเหยใบเดม ระเหย

ตอไปจนเหลอประมาณ1ml

7.2.2.2 กรณทดสอบmigrationดวยวธTotalimmersion(7.1.3)ใชtestsolution

และblankทเตรยมไดทงหมด(ปรมาตรประมาณ100ml)เทใสถวยระเหย

ครงละประมาณ 50 ml นาไประเหยบนอางนารอน หรอ hot plate

จนหมด ลาง glass tubes ดวยสารละลาย food simulant ชนดเดยวกบ

testsolution5ml2ครงเทลงในถวยระเหยใบเดมระเหยตอไปจนเหลอ

ประมาณ1ml

7.2.3 นาถวยระเหยไปอบในตอบรอน ทอณหภม 105-110oC เปนเวลา 30± ±±5 min

ทงไวใหเยนในโถดดความชนประมาณ 1 hr ชงและบนทกนาหนกทได ปฎบตตาม

ขนตอนนซาจนกวาจะไดนาหนกคงท (มคาความแตกตางของนาหนกทไดไมเกน

0.5mg)เมอนาหนกของถวยระเหยคงทแลวใหใชนาหนกคาทนอยกวาในการคานวณ

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results) 8.1 การคานวณ

8.1.1 กรณใชวธArticlefillingหรอFillinginjar/containerคานวณผลดงน

(Wa-Wb)x1000 สารตกคางทเหลอจากการระเหย(mg/L)= V

เมอ Wa = นาหนกทเหลอของสารจากการระเหยtestsolutionหลงจากหกนาหนกถวย

ระเหย(g)

Wb = นาหนกทเหลอของสารจากการระเหยblankหลงจากหกนาหนกถวยระเหย(g)

V = ปรมาตรของfoodsimulantทใชระเหย(L)เชน0.2L(200ml)หรอ

0.1L(100ml)เปนตน

คานวณผลวเคราะหจากหนวย mg/L เปน mg/kg โดยใชคาตวแปร 1 L เทากบ

1kg

53


8.1.2 กรณใชวธTotalimmersionคานวณผลวเคราะหจากสตร

(Wa-Wb)x1000 สารตกคางทเหลอจากการระเหย(mg/dm2)= S

เมอ Wa = นาหนกทเหลอของสารจากการระเหยtestsolutionหลงจากหกนาหนกถวย

ระเหย(g)

Wb = นาหนกทเหลอของสารจากการระเหยblankหลงจากหกนาหนกถวยระเหย(g)

S = พนทผวของตวอยางทใชทดสอบ(dm2)

คานวณผลวเคราะหจากหนวยmg/dm2เปนmg/kgโดยใชfactor=6

8.2 การรายงานหนวยเปนmg/kg

8.2.1 รายงานผลการวเคราะหปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหยในการทดสอบ

migrationทง3ครงของfoodsimulantทง2ชนด

8.2.2 ผลการทดสอบmigrationแตละครงรายงานจากคาเฉลยในการทดสอบตวอยาง3ซา

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)9.1 ทกตวอยางวเคราะห 3 ซา (triplicate) กรณทผลการวเคราะหคานอยทสด ตางจากคาอน

มากกวา6mg/kg(analyticaltolerance)ตองทาการวเคราะหตวอยางนนซา

9.2ปรมาณสารตกคางทเหลอจากการระเหยblankตองนอยกวา5mg/L

10. รายละเอยดอน10.1ขวดนม หมายถง ภาชนะสาหรบใชบรรจนมหรอของเหลวเพอการบรโภคของทารกและ

เดกเลกซงประกอบดวยขวด(feedingbottle)ฝาครอบ(protectivecover)หวนมยาง

(feedingteat)ฝายดหวนมยาง(lockingring)หลอดดด(straw)จกหดดด(feedingspout)

เปนตน

10.2ภาชนะบรรจนมสาหรบทารกและเดกเลก หมายถง ภาชนะททาขนโดยมเจตนาสาหรบใช

บรรจนมหรอของเหลวอนเพอการบรโภคซงมทงแบบใชซา เชน ถวยหดดม เปนตน และ

แบบใชครงเดยว เชน ถงพลาสตกทใชเกบนานมมารดา และถงพลาสตกบรรจนมแบบใช

ครงเดยวทตองใชรวมกบขวดนม

10.3การทดสอบmigration(migrationtest)หมายถงการดาเนนการเพอกระตนใหเกดการเคลอน

ยายของสารออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบซงเปนตวแทนอาหารทจะใชบรรจ

(อาหารจาลอง,foodsimulants)ภายใตสภาวะทมการควบคม

54


10.4ตามเอกสารอางองCommissionregulation(EU)No10/2011กาหนดให

10.4.1 3% acetic acid (w/v) in aqueous solution (food simulant B) เปนอาหาร

จาลองตวแทนอาหารทม pH≤≤ 4.5 และ 50% ethanol (V/V) in aqueous

solution(foodsimulantD1)เปนอาหารจาลองตวแทนอาหารนม(AnnexIII)

10.4.2 กาหนดสภาวะทดสอบ migration ท 70oC เปนเวลา 2 hr สาหรบตวอยาง

ซงอาจตองสมผสอาหารทอณหภมสงสด 70oC ในระยะเวลาสงสด 2 hr หรอ

ทอณหภมสงสด100oCในระยะเวลาสงสด15min(AnnexVChapter3)

10.4.3 กรณตวอยางแบบใชงานซาตองทาการตรวจวเคราะหตวอยางนนๆซา3ครงและ

พจารณาผลการวเคราะหครงท 3 เปรยบเทยบกบคามาตรฐาน อยางไรกตาม

ถาสามารถพสจนไดวาผลวเคราะหจากการทดสอบmigration ครงท 2 และ 3

ไมเพมขนและถาผลวเคราะหจากการทดสอบmigrationครงท1ไมเกนคามาตรฐาน

ไมจาเปนตองทาการทดสอบmigrationอก(AnnexVChapter3)

10.5ตามเอกสารอางองBSEN1186-3:2002

“Theprecisiondataweredeterminedforapolyamidesampleunderthetestconditions

of24hrat40oCwithsimulantsBlevel10.7mg/dm2,Repeatability(r)=1.1mg/dm2,

Reproducibility(R)=2.3mg/dm2”

55



ใชวเคราะหปรมาณBisphenolAทแพรจากขวดนมภาชนะบรรจนมและอปกรณตางๆลงสอาหาร

จาลอง(foodsimulants)ภายใตสภาวะทดสอบmigrationทกาหนดโดยวธนปรมาณตาสดทสามารถ

วเคราะหไดโดยHPLC-FLDเทากบ0.04ng(signal/noise=3)

2. เอกสารอางอง (References)

2.1 EURL-FoodContactMaterialILC2009/02BPAin50%ethanol;AnnexIStandard

OperationProcedure:DeterminationofBisphenolAin50%aqueousethanol

2.2 BSEN13130-1:2004Material andarticles in contactwith foodstuffs-Plastics

substances subject to limitation-Part 1 Guide to test methods for the specific

migrationofsubstancesfromplasticstofoodsandfoodsimulantsandthedetermination

ofsubstancesinplasticsandtheselectionofconditionsofexposuretofoodsimulants

2.3 Commissionregulation(EU)No10/2011of14January2011onplasticmaterials



สกดBisphenolAจากตวอยางภายใตสภาวะทดสอบmigrationทอณหภม70oCเปนเวลา2hr

ใชethanol50%(V/V)inaqueoussolutionและaceticacid3%(W/V)inaqueoussolution

เปน food simulants วเคราะห Bisphenol A ดวย HPLC - FLD และวดปรมาณเทยบกบ


DMSc F 1033: การวเคราะหปรมาณบสฟนอล เอ

(Bisphenol A;2,2-bis (4-hydroxyphenyl) propane)

ทแพรลงสอาหารจำาลอง

Determination of migrated Bisphenol A (2,2-bis

(4-hydroxyphenyl) propane) into food simulants

56



4.1 เครองHPLC-FLdetector


4.3ตอบรอน(hotairoven)หรอตควบคมอณหภม(incubator)สามารถควบคมอณหภมไดท

70±± 2oC


4.5 อปกรณวดอณหภมเชนเทอรโมมเตอรหรอเทอรโมคพเปล(thermocouple)



4.8 ตะแกรงลวดทาดวยเหลกกลาไรสนม(stainlesssteelgauze)อนใหรอนกอนใช

4.9 Glass tube ชนด ground glass stopper เสนผานศนยกลาง 35mmสง 120-200mm


4.10Volumetricflask

4.11 VialสาหรบHPLC

4.12 measuringcylinder

4.13Beaker

4.14ขวดแกวสชาgroundglassstopper

4.15ขวดแกวปากกวางพรอมฝาปดใชเพอบรรจตวอยางทดสอบ

4.16ขวดแกวปากเกลยว(glassbottlewithscrewfinish)หรอภาชนะแกวประเภทอนทเหมาะสม

4.17เยอกรอง(membranefilter)poresize0.45µm

4.18glassbeadsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mmอนใหรอนกอนใช

4.19glassrodsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mmอนใหรอนกอนใช

4.20แผนอะลมเนยมเปลว (aluminium foil) หรอวสดทนความรอนชนดอนทไมมผลรบกวน

ในการวเคราะห

5. สารเคม (Reagents)

หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอน สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและH2Oทใชเปน

นากรอง(deionized)ชนดHPLCgradeหรอนากลนทมคณภาพเทยบเทากน


5.2Foodsimulants

57


5.2.13% acetic acid (w/v) in aqueous solution (food simulant B): ละลาย

aceticacid(glacial)3gในH2O100ml

5.2.250% ethanol (v/v) in aqueous solution (food simulant D1): ผสม ethanol


5.3กาซไนโตรเจนสาหรบระเหยตวอยาง

5.4สารมาตรฐาน Bisphenol A; (2, 2-bis (4-hydroxyphenyl) propane) ความบรสทธ

ไมนอยกวารอยละ99

5.4.1 สารละลายมาตรฐานBisphenolA0.75mg/ml:ชงสารมาตรฐานBisphenolA75mg

ใหละเอยดถง0.1mgลงในvolumetricflaskขนาด100mlละลายและปรบปรมาตร

ดวย methanol สารละลายมอายการใชงาน 3 เดอน เมอเกบในภาชนะปดสนท

อณหภม +20oC ถง -20oC ในทมด เตรยมสารละลายมาตรฐาน Bisphenol A

ทความเขมขนเดยวกนซาอกชดเพอใชตรวจสอบไขวกน หรออาจใชวธอนทเหมาะสม

ตอการควบคมคณภาพ

5.4.2สารละลายมาตรฐาน Bisphenol A 0.075 mg/ml ปเปตสารละลายมาตรฐาน

Bisphenol A จาก 5.4.1 ปรมาตร 2 ml ลงใน volumetric flask ขนาด 20 ml

ปรบปรมาตรดวยmethanolเตรยมซาอกครงทความเขมขนเดยวกนเพอใชตรวจสอบ

ไขวกน

5.4.3สารละลายมาตรฐาน Bisphenol A 0.0075 mg/ml ปเปตสารละลายมาตรฐาน

Bisphenol A จาก 5.4.2 ปรมาตร 2 ml ลงใน volumetric flask ขนาด 20 ml

ปรบปรมาตร ดวย methanol เตรยมซาอกครงทความเขมขนเดยวกน เพอใช

ตรวจสอบไขวกน

5.4.4working standard solution ใน food simulant B 0, 0.0018,0.003,0.006,

0.009, 0.012, 0.018, 0.024 และ 0.03 mg/l ปเปตสารละลายมาตรฐาน

BisphenolAจาก5.4.3ปรมาตร0,6,10,20,30,40,60,80,และ100µ µl

ลงในvolumetricflaskขนาด25mlแตละขวดปรบปรมาตรดวยfoodsimulantB

5.4.5working standard solution ใน food simulantD10,0.0018,0.003,0.006,

0.009, 0.012, 0.018, 0.024 และ 0.03 mg/l ปเปตสารละลายมาตรฐาน

BisphenolAจาก5.4.3ปรมาตร0,6,10,20,30,40,60,80,และ100µ µlลงใน

volummetricflaskขนาด25mlแตละขวดปรบปรมาตรดวยfoodsimulantD1

58



6.1ตวอยางทบรรจของเหลวไดเชนขวดนมหรอภาชนะบรรจนมแบบใชซาใชตวอยางทดสอบ


ของ food simulant ทใชทดสอบ วดปรมาตรโดยใส food simulant ลงในตวอยางจนถง

ระดบสงสดทกาหนดไวเพอการใชงาน (ถาม)หรอทระดบตากวาขอบบนสด5mmบนทก

ปรมาตรและคานวณคาเฉลยหนวยเปนml


6.2.1ฝาใชตวอยางทดสอบจานวน3ชน

6.2.2อปกรณประกอบอน




พนทผวคานวณพนทผวเฉพาะดานทสมผสอาหารของชนทดสอบแตละชน

แลวคานวณคาเฉลยพนทผวทตองการ0.6dm2วดละเอยดถง0.05dm2

6.2.2.2 ตวอยางทมพนทนอยกวา0.6dm2ใชชนทดสอบหลายชนประกอบกนเปน

ชดจานวน3ชด เพอทดสอบmigrationและจานวน2ชด เพอคานวณ

พนทผวคานวณพนทผวใหไดรวมกน0.6dm2วดละเอยดถง0.05dm2


หมายเหต วธคานวณพนทผวปฏบตตาม EN ISO 8442-2: 1997 annex B

หรอวธอนทเหมาะสม

6.3ตวอยางทใชทดสอบ migration ทาความสะอาดดวยผาหรอแปรงขนนม ตมในนาเดอดเปน

เวลา10minผงใหแหงในทปลอดฝนหรอปฏบตตามคาแนะนาของผผลตสนคา(ถาม)


7.1Migrationtestทาการทดสอบโดยใชfoodsimulantทง2ชนดแตละชนดแยกกน

7.1.1ตวอยางทบรรจของเหลวไดใชวธArticlefillingดงน


ตามทคานวณไวในขอ6.1และเพมอก100mlเพอเตรยมblankจมอปกรณ

สาหรบวดอณหภม(4.5)ลงในbeakerนาไปอนบนhotplateหรออปกรณ

59


ใหความรอนอนๆ จนไดอณหภม 70± 2oC เทใสตวอยางทเตรยมไวใน

ขอ6.3แตละตวอยางใหมปรมาตรตามทไดคานวณไวในขอ6.1± 1ml

ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอนใหสนทหรอใสขวดแกว

ปากกวาง (4.15) ปดฝา สารละลายทเหลอใน beaker ปดดวยแผน

อะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอนเพอใชเตรยมblank

7.1.1.2 นาตวอยางและ blank ไปวางในต อบรอน หรอต ควบคมอณหภม ท

70± 2oCเมออณหภมถงระดบทตองการจบเวลา2hrไมใหเกน5min

นาตวอยางและ blank ออกมาทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหอง

ปเปตสารละลาย(testsolution)ออกจากตวอยางและblankใสในขวดแกว

สชา(4.14)กรองดวยเยอกรอง(4.17)กอนนาไปวเคราะหดวยHPLC

7.1.2ตวอยางทบรรจของเหลวไมไดประเภทฝาใชวธFillinginjar/containerดงน

7.1.2.1 ใส food simulant ลงในขวดปากเกลยว (4.16)หรอภาชนะแกวชนดอน


ทจะใชประกอบกบฝานน± 1ml ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลว หรอวสด

ทนความรอนใหสนท นาไปวางในต อบรอนหรอต ควบคมอณหภมท

70± 2oC เมอไดระดบอณหภมตามทตองการแลว นาวสดทปดไวออก

สวมฝาทเตรยมไวในขอ6.3กบภาชนะบรรจ foodsimulantแตละฝากบ

ภาชนะแตละใบ จานวน3 ใบทเหลอใชเปน blankหมนเกลยวหรอยด

ใหแนน กรณฝาชนดเปดดานบนใชแผนอะลมเนยมเปลว หรอวสดทน

ความรอน ปดทบสวนทเปดไว เพอกนไมใหสารละลายไหลออก แลวควา

ภาชนะบรรจfoodsimulantลงใหตวอยางฝาทสวมไวอยดานลางและสมผส

กบ food simulant อาจใช beaker รองรบเพอปองกนภาชนะบรรจ food

simulantลมทกขนตอนควรทาอยางรวดเรวเพอรกษาระดบอณหภมใหคงท

7.1.2.2 นาไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมตามเดม เมออณหภมถงระดบ

70± 2oCจบเวลา2hrไมใหเกน5minนาภาชนะบรรจfoodsimulant

ออกมา ทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหอง ปเปต test solution

และblankออกจากภาชนะบรรจใสในขวดแกวสชากรองดวยเยอกรองกอน

นาไปวเคราะหดวยHPLC

60


7.1.3ตวอยางทบรรจของเหลวไมไดประเภทอปกรณประกอบอนๆใชวธTotalimmersion

ดงน


100 ± 1 ml ปดฝา นาไปวางในตอบรอน หรอตควบคมอณหภม ท

70± 2oCเมอไดระดบอณหภมตามทตองการแลวใสชนทดสอบทเตรยม

ไวตามขอ6.3แตละชนหรอแตละชดลงในglasstubeแตละใบจานวน3

ใบglasstubeทเหลอใชเปนblankใชglassbead(4.18)หรอglassrod

(4.19)รองชนทดสอบไมใหสมผสผนงtubeแยกชนทดสอบไมใหซอนทบ

กนดวยglassrodชนทดสอบตองจมในสารละลายทงหมดถามชนทดสอบ

ลอยขนมาใชstainlesssteelgauze(4.8)กดทบกรณทใชfoodsimulant

B ใหใช glass rod แทน ปดฝาใหสนท ทกขนตอนควรทาอยางรวดเรว

เพอรกษาระดบอณหภมใหคงท


ถงระดบ70±±2oCจบเวลา2hrไมใหเกน5minนาglasstubeออกมา

ทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหองปเปตtestsolutionและblank

ออกจากglasstubeใสในขวดแกวสชากรองดวยเยอกรองกอนนาไปวเคราะห

ดวยHPLC

7.2การวเคราะห

7.2.1สภาวะเครองHPLC

column:stainlesssteel150x3.0mmpackedwithC18coatedspherical

silicagel,particlesize5µm,(loadof17.5%carbonandend-capped)

mobilephase:methanol/water(70:30)

injectionvolume:20µl(maximum200µl)

flowrate:0.5ml/min

detector:fluorescencedetector

excitation:235nm

emission:317nm

alternativefluorescenceexcitationandemissionwavelengthsat

excitation:275nm

emission:305nm

ปรบสภาวะการใชงาน ใหสามารถวเคราะห Bisphenol A ไดทปรมาณ 0.04 ng

โดยมsignal/noise=3

61


7.2.2กราฟมาตรฐาน(calibrationcurve)

เตรยมกราฟมาตรฐานโดยใชworkingstandardsolutionในfoodsimulantB(5.4.4)

สาหรบtestsolutionทไดจากfoodsimulantBและใชworkingstandardsolution

ในfoodsimulantD1(5.4.5)สาหรบtestsolutionทไดจากfoodsimulantD1

สรางกราฟความสมพนธระหวาง peak area กบ ความเขมขนของ Bisphenol A

โดยคาcorrelationcoefficient(r)ตอง≥0.998 7.2.3วเคราะหBisphenolAโดยฉดtestsolutionและblankไมนอยกวา2ครงหรอ

ระเหยดวยกาซไนโตรเจนเพอทาใหเขมขนขนกอนฉด หรอเพมปรมาตรทฉดเพอ

เพมความไว(sensitivity)ของการวเคราะหและวดปรมาณโดยเทยบกบกราฟมาตรฐาน

หรอคานวณจากregressionlineequation


8.1การคานวณผลจากregressionlineequation:y=(ax)+b

y-b ความเขมขนของBisphenolAในfoodsimulant(x)(mg/L)= a

เมอ y = peakareaของBisphenolA

a = slopeของกราฟมาตรฐาน(regressionline)

b = interceptของกราฟมาตรฐาน(regressionline)

8.2กรณใชวธ Article filling หรอ Filling in jar/container คานวณผลวเคราะหจาก mg/L

เปนmg/kgโดยนาคาความหนาแนน(density)ของfoodsimulantsมาใชคานวณคา

8.3กรณใชวธTotalimmersionคานวณผลวเคราะหจากสตร

(CxV) M= S

เมอ M= ปรมาณBisphenolA(mg/dm2)

C= ปรมาณBisphenolAทอานไดจากกราฟมาตรฐาน(mg/L)

V= ปรมาตรของfoodsimulantทใช(L;100ml=0.1L)

S= พนทผวของตวอยางทใชทดสอบ(dm2)


8.4รายงานผลวเคราะหปรมาณBisphenolAในfoodsimulantทง2ชนดจากคาเฉลยในการ

ทดสอบตวอยาง3ซาหนวยเปนmg/kgทศนยม5ตาแหนง

62


9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)

9.1ตรวจสอบความเหมาะสมการทางานของเครองHPLC(systemsuitability)กอนการวเคราะห

9.2วเคราะห blank เพอตรวจสอบการปนเปอน chromatogram ของ blank ตองไมม peak

ทมretentiontime(RT)ตรงกบpeakของBisphenolA

9.3วเคราะหspikedfoodsimulantsเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑ

%recoveryทระดบความเขมขนµg/lอยในชวง60-115%

10 รายละเอยดอน

10.1ขวดนม หมายถง ภาชนะสาหรบใชบรรจนมหรอของเหลวเพอการบรโภคของทารกและ



เปนตน

10.2ภาชนะบรรจนมสาหรบทารกและเดกเลก หมายถง ภาชนะททาขนโดยมเจตนาสาหรบ

ใชบรรจนม หรอของเหลวอนเพอ การบรโภคซงมทงแบบใชซา เชน ถวยหดดม และแบบ

ใชครงเดยวเชนถงพลาสตกทใชเกบนานมมารดาและถงพลาสตกบรรจนมแบบใชครงเดยว

ทตองใชรวมกบขวดนม

10.3 การทดสอบmigration(migrationtest)หมายถงการดาเนนการเพอกระตนใหเกดการเคลอนยาย

หรอแพรของสารออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบซงเปนตวแทนอาหารทจะใช

บรรจ(อาหารจาลอง,foodsimulants)ภายใตสภาวะทมการควบคม


10.4.1 3%aceticacid(w/v)inaqueoussolution(foodsimulantB)เปนอาหารจาลอง

ตวแทนอาหารทม pH≤≤ 4.5 และ50%ethanol (v/v) in aqueous solution

(foodsimulantD1)เปนอาหารจาลองตวแทนอาหารนม(AnnexIII)

10.4.2 กาหนดสภาวะทดสอบ migration ท 70oC เปนเวลา 2 hr. สาหรบตวอยาง

ซงอาจตองสมผสอาหาร อณหภม สงสด 70oC ในระยะเวลาสงสด 2 hr หรอ


10.4.3 กรณตวอยางแบบใชงานซาตองทาการตรวจวเคราะหตวอยางนนซา3ครงและ

พจารณาผลการวเคราะหครงท 3 เปรยบเทยบกบคามาตรฐาน ยกเวนในกรณ

ทมาตรฐานกาหนดตองตรวจไมพบใหพจารณาผลการวเคราะหครงท1เปรยบเทยบ

กบคามาตรฐาน(AnnexVChaper2)

63


10.5ขอมลprecisionการวเคราะหBisphenolAใน50%ethanolตามตาราง(EURL-Food

ContactMaterialILC2009/02BPAin50%ethanol)

TableSummaryofresultsfromtheprecisionexperimentforvalidationofthemethod

ConcentrationLevel Reproducibility(R),% HorratR Repeatability(r),%

mg/kg

0.0067 15 0.7 5

0.021 10 0.4 4

0.075 7 0.3 1.5

0.56 6 0.3 0.8

65


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณ 4, 4'- Dichlorodiphenyl sulfone ทแพรจากขวดนม ภาชนะบรรจนมและ

อปกรณตางๆ ทาดวยพลาสตกชนด Polyethersulfone (PES) และ Polyarylsulfone (PASF)

ลงสอาหารจาลอง(foodsimulants)ภายใตสภาวะทดสอบmigrationทกาหนดโดยวธนวเคราะห

และวดปรมาณโดยHPLC–UV

2. เอกสารอางอง (References) 2.1 KoreaFoodandDrugAdministration(KFDA).2013.KoreaStandardsandSpecifications

forUtensils,ContainersandPackagingforFoodProducts

2.2 CommissionRegulation(EU)No.10/2011of14January2011onplasticmaterials


2.3 BS EN 13130-1:2004Material and articles in contact with foodstuffs-Plastics


migrationofsubstancesfromplasticstofoodsandfoodsimulantsandthedetermination


3. หลกการ (Principle) สกด4,4'-Dichlorodiphenylsulfoneจากตวอยางภายใตสภาวะทดสอบmigrationทอณหภม70C

เปนเวลา2hrโดยมethanol50%(v/v)inaqueoussolutionและaceticacid3%(w/v)in

aqueous solution เปน food simulants วเคราะห 4,4'- Dichlorodiphenyl sulfone ดวย

HPLC-UVและวดปรมาณเทยบกบกราฟมาตรฐาน

4. เครองมอ (Apparatus) 4.1 HPLCUVdetector


4.3 ตอบรอน(hotairoven)หรอตควบคมอณหภม(incubator)สามารถควบคมอณหภมได

ท70±± 2oC

DMSc F 1034: การวเคราะหปรมาณ 4, 4'- Dichlorodiphenyl sulfone


Determination of migrated 4, 4'- Dichlorodiphenyl

sulfone into food simulants

66




4.6 อปกรณสาหรบตดตวอยางเชนกรรไกรมดคตเตอรเปนตน



4.9 Glasstubeชนดgroundglassstoppersเสนผานศนยกลาง35mmสง120-200mm


4.10Volumetricflask

4.11VialสาหรบHPLC

4.12Measuringcylinder

4.13Beaker

4.14ขวดแกวสชาgroundglassstopper

4.15ขวดแกวปากกวางพรอมฝาปดใชเพอบรรจตวอยางทดสอบ

4.16ขวดแกวปากเกลยว(glassbottlewithscrewfinish)หรอภาชนะแกวประเภทอนทเหมาะสม


4.18Glassbeadsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mmอนใหรอนกอนใช

4.19Glassrodsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mmอนใหรอนกอนใช

4.20แผนอะลมเนยมเปลว (aluminium foil) หรอวสดทนความรอนชนดอน ทไมมผลรบกวน


5. สารเคม (Reagents)หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอน สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและH2Oทใชเปน


5.1 Methanol(HPLCgrade)

5.2 Foodsimulants

5.2.1 3%aceticacid(w/v)inaqueoussolution(foodsimulantB):เจอจางacetic

acid(glacial)3gในH2O100ml

5.2.2 50%ethanol (v/v) in aqueous solution (food simulantD1):ผสมethanol


5.3 สารมาตรฐาน4,4'-Dichlorodiphenylsulfoneความบรสทธไมนอยกวารอยละ99

5.3.1 สารละลายมาตรฐาน 4,4'- Dichlorodiphenyl sulfone 100µ µg/ml : ชงสาร

มาตรฐาน 4,4'- Dichlorodiphenyl sulfone (5.3) 10 mg ควรใหละเอยดถง

0.1mgลงในvolumetricflaskขนาด100mlละลายและปรบปรมาตรดวยmethanol

67


5.3.2 สารละลายมาตรฐาน4,4'-Dichlorodiphenylsulfone5µg/ml:ปเปตสารละลาย

มาตรฐาน 4,4'- Dichlorodiphenyl sulfone จาก 5.3.1 ปรมาตร 5 ml ลงใน

volumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวยmethanol

5.3.3 working standard solution 0.05 µg/ml ปเปตสารละลายมาตรฐาน 4,4'-

Dichlorodiphenyl sulfone จาก 5.3.2 ปรมาตร 1 ml ลงใน volumetric flask

ขนาด100mlปรบปรมาตรดวยmethanol

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample) 6.1 ตวอยางทบรรจของเหลวไดเชนขวดนมหรอภาชนะบรรจนมแบบใชซาใชตวอยางทดสอบ


ของfoodsimulantทใชทดสอบ

วดปรมาตรโดยใสfoodsimulantลงในตวอยางจนถงระดบสงสดทกาหนดไวเพอการใชงาน

(ถาม)หรอทระดบตากวาขอบบนสด5mmบนทกปรมาตรและคานวณคาเฉลยหนวยเปนml

6.2 ตวอยางทบรรจของเหลวไมไดเชนฝาและอปกรณประกอบอน

6.2.1 ฝาใชตวอยางทดสอบจานวน3ชน

6.2.2 อปกรณประกอบอน

6.2.2.1 ตวอยางทมพนทประมาณ 0.6 dm2 ใชตวอยางทงชน ถามรปทรง

ไมสมมาตร(irregularshape)ตดใหมขนาดและรปรางทสมมาตรจานวน

ชนทดสอบทใช 3 ชน เพอทดสอบmigration และใชชนทดสอบ2ชน

เพอคานวณพนทผว

คานวณพนทผวเฉพาะดานทสมผสอาหารของชนทดสอบแตละชนแลว

คานวณคาเฉลยพนทผวทตองการ0.6dm2วดละเอยดถง0.05dm2



พนทผว

คานวณพนทผวใหไดรวมกน0.6dm2วดละเอยดถง0.05dm2คานวณ

คาเฉลยของชนทดสอบแตละชด

หมายเหต วธคานวณพนทผวปฏบตตาม EN ISO 8442-2: 1997 annex B หรอ


6.3 ตวอยางทใชทดสอบ migration ทาความสะอาดดวยผาหรอแปรงขนนม ตมในนาเดอด

เปนเวลา 10 min แลวผงใหแหงในทปลอดฝน หรอปฎบตตามคาแนะนาของผผลต

สนคา(ถาม)

68


7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure) 7.1 Migrationtestทาการทดสอบโดยใชfoodsimulantทง2ชนดแตละชนดแยกกน

7.1.1 ตวอยางทบรรจของเหลวไดใชวธArticlefillingดงน


ตามทคานวณไวในขอ 6.1 และเพมอก 100 ml เพอเตรยม blank

จมอปกรณสาหรบวดอณหภม(4.5)ลงในbeakerนาไปอนบนhotplate

หรออปกรณใหความรอนอนๆจนไดอณหภม70± ±2oCเทใสตวอยาง

ทเตรยมไวในขอ 6.3 แตละตวอยางใหมปรมาตรตามทไดคานวณไวใน

ขอ 6.1± 1 ml ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลว หรอวสดทนความรอน

ใหสนท หรอใสขวดแกวปากกวาง (4.15) ปดฝา สารละลายทเหลอ

ใน beaker ปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอน เพอใช

เตรยมblank

7.1.1.2 นาตวอยางและ blank ไปวางในตอบรอน หรอตควบคมอณหภม ท

70± 2oCเมออณหภมถงระดบทตองการจบเวลา2hrไมใหเกน5min

นาตวอยางและblankออกมาทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหองปเปต

สารละลาย (test solution) ออกจากตวอยาง และ blank ใสในขวดแกว

สชา(4.14)กรองดวยเยอกรอง(4.17)กอนนาไปวเคราะหดวยHPLC

7.1.1.3 ทดสอบ migration ซาอก 2 ครง โดยใชตวอยางเดม ลางนาสะอาด

ผงใหแหงและปฎบตตาม7.1.1.1-7.1.1.2


7.1.2.1 ใสfoodsimulantลงในขวดปากเกลยว(4.16)หรอภาชนะแกวชนดอน

ทสวมไดพอดกบฝา จานวน 4 ใบ แตละใบปรมาตรเทากบความจของ

ภาชนะทจะใชประกอบกบฝานน±±1mlปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอ

วสดทนความรอนใหสนท นาไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมท


สวมฝาทเตรยมไวในขอ6.3กบภาชนะบรรจfoodsimulantแตละฝากบ

ภาชนะแตละใบจานวน3ใบทเหลอใชเปนblankหมนเกลยวหรอยด

ใหแนน กรณฝาชนดเปดดานบนใชแผนอะลมเนยมเปลว หรอวสดทน

ความรอน ปดทบสวนทเปดไว เพอกนไมใหสารละลายไหลออก แลว

ควาภาชนะบรรจ food simulant ลงใหตวอยางฝาทสวมไวอยดานลาง

และสมผสกบ food simulant อาจใช beaker รองรบเพอปองกนภาชนะ

บรรจ foodsimulantลมทกขนตอนควรทาอยางรวดเรวเพอรกษาระดบ

อณหภมใหคงท

69


7.1.2.2 นาไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมตามเดมเมออณหภมถงระดบ


ออกมาทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหองปเปตtestsolution

และ blankออกจากภาชนะบรรจ ใสในขวดแกวสชากรองดวยเยอกรอง

กอนนาไปวเคราะหดวยHPLC

7.1.2.3 ทดสอบ migration ซาอก 2 ครง โดยใชชนทดสอบเดม ลางนาสะอาด



ดงน


100 ± 1 ml ปดฝา นาไปวางในตอบรอน หรอตควบคมอณหภม

ท 70 ± 2oC เมอไดระดบอณหภมตามทตองการแลว ใสชนทดสอบ

ทเตรยมไวตามขอ6.3แตละชนหรอแตละชดลงในglasstubeแตละใบ

จานวน 3 ใบ glass tube ทเหลอใชเปน blank ใช glass bead หรอ

glassrodรองชนทดสอบไมใหสมผสผนงtubeแยกชนทดสอบไมใหซอน

ทบกนดวย glass rod ชนทดสอบตองจมในสารละลายทงหมด ถามชน

ทดสอบลอยขนมาใช stainless steel gauze กดทบ กรณทใช food

simulantBใหใชglassrodแทนปดฝาใหสนททกขนตอนควรทาอยาง

รวดเรวเพอรกษาระดบอณหภมใหคงท

7.1.3.2 นา glass tube ไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมตามเดม เมอ

อณหภมถงระดบ70± ±2oCจบเวลา2hrไมใหเกน5minนาglass

tube ออกมา ทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหอง ปเปต test

solutionและblankออกจากglass tube ใสในขวดแกวสชากรองดวย

เยอกรองกอนนาไปวเคราะหดวยHPLC

7.1.3.3 ทดสอบmigrationซาอก2ครงโดยใชชนทดสอบเดมลางนาผงใหแหง

และปฎบตตามขนตอน7.1.3.1.-7.1.3.2


7.2.1 สภาวะเครองHPLC

column :C18(4.6mmx250mm,5µµm)หรอคอลมนอนทเทยบเทากน mobilephase :H2O(A)/acetonitrile(B)lineargradientfromA:B(70:30)

toA:B(20:80)for20min

injectionvolume:50µl columnoven :40C

flowrate :1.0ml/min

detector :UVabsorbancedetector(wavelength247nm)

70


7.2.2การวเคราะหคณภาพ(Qualitativetest)

ฉดสารละลายมาตรฐาน working standard solution (5.3.3) test solution และ

blank(7.1)เปรยบเทยบretentiontime(RT)ของสารมาตรฐานกบtestsolution

ถาตรงกนแสดงวาม 4,4' Dichlorodiphenyl sulfone และตองไมพบ peak ท

RTเดยวกนนในblank

7.2.3การวเคราะหปรมาณ(Quantitativetest)

กรณทพบ 4,4’- Dichlorodiphenyl sulfone และม peak area≥ peak area ทระดบLOQ วเคราะหปรมาณโดยสรางกราฟมาตรฐานใหมระดบความเขมขนตาสด

ทระดบ LOQ วดปรมาณ 4,4'- Dichlorodiphenyl sulfone ใน test solution

เทยบกบกราฟมาตรฐาน

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results) 8.1 กรณใชวธArticlefillingหรอFillinginjar/containerคานวณผลวเคราะหจากmg/Lเปน

mg/kgโดยนาคาความหนาแนน(density)ของfoodsimulantsมาใชคานวณคา

8.2 กรณใชวธTotalimmersionคานวณผลวเคราะหจากสตร

(CxV) M = S

เมอ M = ปรมาณ4,4'-Dihydroxydiphenylsulfone(mg/dm2)

C = ปรมาณ4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneทอานไดจากกราฟมาตรฐาน(mg/L)

V = ปรมาตรของfoodsimulantทใช(L;100ml=0.1L)



8.3 การรายงานหนวยเปนmg/kgทศนยม3ตาแหนง

8.3.1รายงานผลการวเคราะหปรมาณ 4, 4'-Dichlorodiphenyl sulfone จากการทดสอบ


8.3.2ผลการทดสอบmigrationแตละครงรายงานจากคาเฉลยในการทดสอบตวอยาง3ซา

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)9.1 ตรวจสอบความเหมาะสมการทางานของเครองHPLC(systemsuitability)กอนการวเคราะห

9.2 วเคราะห blank เพอตรวจสอบการปนเปอน chromatogram ของ blank ตองไมม peak

ทมRTตรงกบpeakของ4,4'-Dichlorodiphenylsulfone

9.3 วเคราะหspikedfoodsimulantsเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑ

%recoveryทระดบความเขมขน0.05mg/kg(ระดบคามาตรฐาน)อยในชวง80-110%

71


10. รายละเอยดอน10.1ขวดนม หมายถง ภาชนะสาหรบใชบรรจนมหรอของเหลวเพอการบรโภคของทารกและ

เดกเลก ซงประกอบดวยขวด (feeding bottle) ฝาครอบ (protective cover) หวนมยาง


เปนตน

10.2ภาชนะบรรจนมสาหรบทารกและเดกเลก หมายถง ภาชนะททาขนโดยมเจตนาสาหรบ

ใชบรรจนมหรอของเหลวอนเพอการบรโภคซงมทงแบบใชซาเชนถวยหดดมและแบบใช

ครงเดยว เชน ถงพลาสตกทใชเกบนานมมารดา และถงพลาสตกบรรจนมแบบใชครงเดยว

ทตองใชรวมกบขวดนม

10.3การทดสอบ migration (migration test) หมายถง การดาเนนการเพอกระตนใหเกดการ

เคลอนยาย หรอแพรของสารออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบซงเปนตวแทน

อาหารทจะใชบรรจ(อาหารจาลอง,foodsimulants)ภายใตสภาวะทมการควบคม



ตวแทนอาหารทม pH≤≤ 4.5 และ50%ethanol (v/v) in aqueous solution



ซงอาจตองสมผสอาหารทอณหภมสงสด 70oC ในระยะเวลาสงสด 2 hr หรอ


10.4.3 กรณตวอยางแบบใชงานซา ตองทาการตรวจวเคราะหตวอยางนน ซา 3 ครง

และพจารณาผลการวเคราะหครงท3เปรยบเทยบกบคามาตรฐานอยางไรกตาม




73



ใชวเคราะหปรมาณ 4,4'- Dihydroxydiphenyl sulfone ทแพรจากขวดนม ภาชนะบรรจนมและ

อปกรณตางๆทาดวยพลาสตกชนดPolyethersulfone(PES)ลงสอาหารจาลอง(foodsimulants)

ภายใตสภาวะทดสอบmigrationทกาหนดโดยวธนวเคราะหและวดปรมาณโดยHPLC–UV


2.1 Korea Food and Drug Administration (KFDA). 2013. Korea Standards and

SpecificationsforUtensils,ContainersandPackagingforFoodProducts

2.2 Commission Regulation (EU) No. 10/2011 of 14 January 2011 on plastics

materialsandarticlesintendedtocomeintocontactwithfood

2.3 BS EN 13130-1:2004Material and articles in contact with foodstuffs-Plastics


migrationofsubstancesfromplastictofoodsandfoodsimulantsandthedetermination



สกด4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneจากตวอยางภายใตสภาวะทดสอบmigrationทอณหภม

70oCเปนเวลา2hrโดยมethanol50%(v/v)inaqueoussolutionและaceticacid3%(w/v)

inaqueoussolution เปน foodsimulantsวเคราะห4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneดวย

HPLC-UVและวดปรมาณเทยบกบกราฟมาตรฐาน

DMSc F 1035: การวเคราะหปรมาณ 4, 4'- Dihydroxydiphenyl sulfone


Determination of migrated 4, 4'- Dihydroxydiphenyl

sulfone into food simulants

74



4.1HPLCUVdetector


4.3 ตอบรอน(hotairoven)หรอตควบคมอณหภม(incubator)สามารถควบคมอณหภมไดท

70±± 2oC






4.9glasstubeชนดgroundglassstopperเสนผานศนยกลาง35mmสง120-200mm


4.10 Volumetricflask


4.12 measuringcylinder

4.13 Beaker

4.14 ขวดแกวสชาgroundglassstopper

4.15 ขวดแกวปากกวางพรอมฝาปดใชเพอบรรจตวอยางทดสอบ

4.16 ขวดแกวปากเกลยว(glassbottlewithscrewfinish)หรอภาชนะแกวประเภทอนทเหมาะสม

4.17 เยอกรอง(membranefilter)poresize0.45µm

4.18 Glassbeadsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mmอนใหรอนกอนใช

4.19Glassrodsขนาดเสนผานศนยกลาง2-3mmอนใหรอนกอนใช

4.20 แผนอะลมเนยมเปลว (aluminium foil) หรอวสดทนความรอนชนดอน ทไมมผลรบกวน



หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอนสารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและH2Oทใชเปน



5.2Foodsimulants

75


5.2.13%aceticacid(w/v)inaqueoussolution(foodsimulantB):ละลายaceticacid


5.2.250% ethanol (v/v) in aqueous solution (food simulant D1): ผสม ethanol


5.3สารมาตรฐาน4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneความบรสทธไมนอยกวารอยละ99

5.3.1สารละลายมาตรฐาน4,4'-Dihydroxydiphenylsulfone1,000µg/ml

ชงสารมาตรฐาน 4,4'-Dihydroxydiphenyl sulfone(5.3) 100 mg ใหละเอยดถง

0.1 mg ลงใน volumetric flask ขนาด 100 ml ละลายและปรบปรมาตรดวย

methanol

5.3.2สารละลายมาตรฐาน4,4'-Dihydroxydiphenylsulfone10µg/ml

ปเปตสารละลายมาตรฐาน จาก 5.3.1 ปรมาตร 1 ml ลงใน volumetric flask

ขนาด100mlปรบปรมาตรดวยmethanol

5.3.3workingstandardsolution0.05µg/ml

ปเปตสารละลายมาตรฐาน4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneจาก5.3.2ปรมาตร

0.5mlลงในvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวยmethanol


6.1ตวอยางทบรรจของเหลวไดเชนขวดนมหรอภาชนะบรรจนมแบบใชซาใชตวอยางทดสอบ

(testspecimens)จานวน3ชนเพอทดสอบmigrationและจานวน2ชนเพอวดปรมาตร

ของfoodsimulantทใชทดสอบ

วดปรมาตรโดยใส food simulant ลงในตวอยางจนถงระดบสงสดทกาหนดไวเพอการใชงาน

(ถาม) หรอทระดบตากวาขอบบนสด 5 mm บนทกปรมาตรและคานวณคาเฉลยหนวย

เปนml


6.2.1ฝาใชตวอยางทดสอบจานวน3ชน

6.2.2อปกรณประกอบอน




พนทผว

76


คานวณพนทผวเฉพาะดานทสมผสอาหารของชนทดสอบแตละชนแลวคานวณ

คาเฉลยพนทผวทตองการ0.6dm2วดละเอยดถง0.05dm2



พนทผว

คานวณพนทผวใหไดรวมกน 0.6 dm2 วดละเอยดถง 0.05 dm2


หมายเหต วธคานวณพนทผวปฏบตตามENISO8442-2:1997annexBหรอ


6.3ตวอยางเพอทดสอบ migration ทาความสะอาดดวยผาหรอแปรงขนนม แลวตมในนาเดอด

เปนเวลา10minผงใหแหงในทปลอดฝนหรอปฏบตตามคาแนะนาของผผลตสนคา(ถาม)


7.1Migrationtestทาการทดสอบโดยใชfoodsimulantทง2ชนดแตละชนดแยกกน

7.1.1ตวอยางทบรรจของเหลวไดใชวธArticlefillingดงน

7.1.1.1 ใส food simulant (5.2) ลงใน beaker ปรมาตรใหเพยงพอเพอใสใน

ตวอยางตามทคานวณไวในขอ 6.1 และเพมอก 100 ml เพอเตรยม

blank จมอปกรณสาหรบวดอณหภม (4.5) ลงใน beaker นาไปอนบน

hotplateหรออปกรณใหความรอนอนๆจนไดอณหภม70± 2oCเทใส

ตวอยางทเตรยมไวในขอ6.3แตละตวอยางใหมปรมาตรตามทไดคานวณ

ไวในขอ6.1± 1mlปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอน

ใหสนท หรอใสขวดแกวปากกวาง (4.15) ปดฝา สารละลายทเหลอ

ในbaekerปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสดทนความรอนเพอใชเตรยม

blank

7.1.1.2 นาตวอยางและblankไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมท70± 2oC

เมออณหภมถงระดบทตองการจบเวลา2hrไมใหเกน5minนาตวอยาง

และ blank ออกมาทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหอง ปเปต

สารละลาย(testsolution)ออกจากตวอยางและblankใสในขวดแกวสชา

(4.14)กรองดวยเยอกรอง(4.17)กอนนาไปวเคราะหดวยHPLC

77


7.1.1.3 ทดสอบ migration ซาอก 2 ครง โดยใชตวอยางเดมลางนาสะอาด



7.1.2.1ใสfoodsimulantลงในขวดปากเกลยว(4.16)หรอภาชนะแกวชนดอน


ทจะใชประกอบกบฝานน± ±1mlปดดวยแผนอะลมเนยมเปลวหรอวสด

ทนความรอนใหสนท นาไปวางในต อบรอนหรอต ควบคมอณหภมท


สวมฝาทเตรยมไวในขอ6.3กบภาชนะบรรจfoodsimulantแตละฝากบ

ภาชนะแตละใบจานวน3ใบทเหลอใชเปนblankหมนเกลยวหรอยดใหแนน

กรณฝาชนดเปดดานบนใชแผนอะลมเนยมเปลว หรอวสดทนความรอน

ปดทบสวนทเปดไวเพอกนไมใหสารละลายไหลออกแลวควาภาชนะบรรจ

food simulant ลงใหตวอยางฝาทสวมไวอยดานลาง และสมผสกบ food

simulant อาจใช beaker รองรบเพอปองกนภาชนะบรรจ food simulant

ลมทกขนตอนควรทาอยางรวดเรวเพอรกษาระดบอณหภมใหคงท

7.1.2.2 นาไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมตามเดม เมออณหภมถงระดบ


ออกมาทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหอง ปเปต test solution

และ blank ออกจากภาชนะบรรจ ใสในขวดแกวสชา กรองดวยเยอกรอง

กอนนาไปวเคราะหดวยHPLC

7.1.2.3 ทดสอบmigrationซาอก2ครงโดยใชชนทดสอบเดมลางนาสะอาดผง

ใหแหงและปฎบตตามขนตอน7.1.2.1-7.1.2.2


ดงน


100 ± 1 ml ปดฝา นาไปวางในต อบรอน หรอต ควบคมอณหภม

ท70± ±2oCเมอไดระดบอณหภมตามทตองการแลวใสชนทดสอบทเตรยม

ไวตามขอ6.3แตละชนหรอแตละชดลงในglasstubeแตละใบจานวน

3ใบglasstubeทเหลอใชเปนblankใชglassbead(4.18)หรอglass

78


rod(4.19)รองชนทดสอบไมใหสมผสผนงtubeแยกชนทดสอบไมใหซอน

ทบกนดวย glass rod ชนทดสอบตองจมในสารละลายทงหมด ถามชน

ทดสอบลอยขนมาใชstainlesssteelgauze(4.8)กดทบกรณทใชfood

simulantBใหใชglassrodแทนปดฝาใหสนททกขนตอนควรทาอยาง

รวดเรวเพอรกษาระดบอณหภมใหคงท


ถงระดบ 70± 2oC จบเวลา 2 hr ไมใหเกน 5 min นา glass tube

ออกมาทาใหเยนลงอยางรวดเรวจนถงอณหภมหอง ปเปต test solution

และblankออกจากglasstubeใสในขวดแกวสชากรองดวยเยอกรองกอน

นาไปวเคราะหดวยHPLC

7.1.3.3 ทดสอบ migration ซาอก 2 ครง โดยใชชนทดสอบเดมลางนาสะอาด

ผงใหแหงและปฎบตตามขนตอน7.1.3.1.-7.1.3.2

7.2การวเคราะห


column : C18(4.6mmI.D.x250mm,5µµm)หรอคอลมนอนทเทยบ

เทากน

mobilephase : H2O(A)/acetonitrile(B)lineargradientfromA:B(70:30)

toA:B(20:80)for20min

injectionvolume : 50µl

columnoven : 40oC

flowrate :1.0ml/min

detector :UVabsorbancedetector(ทความยาวคลน259nm.)

7.2.2 การวเคราะหคณภาพ(Qualitativetest)ฉดสารละลายมาตรฐานworkingstandard

solution(5.3.3)testsolutionและblank(7.1)เปรยบเทยบretentiontime(RT)

ของสารมาตรฐานกบtestsolutionถาตรงกนแสดงวาม4,4'-Dihydroxydiphenyl

sulfoneและตองไมพบpeakทRTเดยวกนนในblank

7.2.3 การวเคราะหปรมาณ (Quantitative test) กรณทพบ 4,4’- Dihydroxydiphenyl

sulfone และม peak area≥ peak area ทระดบ LOQ วเคราะหปรมาณโดย

สรางกราฟมาตรฐานใหมระดบความเขมขนตาสดทระดบ LOQ วดปรมาณ 4, 4'-

Dihydroxydiphenylsulfoneในtestsolutionเทยบกบกราฟมาตรฐาน

79



8.1 กรณใชวธ Article filling หรอ Filling in jar/container คานวณผลวเคราะห จาก mg/l

เปนmg/kgโดยนาคาความหนาแนน(density)ของfoodsimulantsมาใชคานวณคา

8.2กรณใชวธTotalimmersionคานวณผลดงน

M = (CxV)

S

เมอ M= ปรมาณ4,4'-Dihydroxydiphenylsulfone(mg/dm2)

C = ปรมาณ4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneทอานไดจากกราฟมาตรฐาน(mg/L)

V = ปรมาตรของfoodsimulantทใช(L;100ml=0.1L)


คานวณผลวเคราะหจากหนวยmg/dm2 เปนmg/kgโดยใชfactor=6

8.3การรายงานผลหนวยเปนmg/kgทศนยม3ตาแหนง

8.3.1 รายงานผลการวเคราะหปรมาณ4,4'-Dihydroxydiphenylsulfoneจากการทดสอบ


8.3.2 ผลการทดสอบmigrationแตละครงรายงานจากคาเฉลยในการทดสอบตวอยาง3ซา


9.1ตรวจสอบความเหมาะสมการทางานของเครองHPLC(systemsuitability)กอนการวเคราะห

9.2วเคราะห blank เพอตรวจสอบการปนเปอน chromatogramของ blankตองไมม peakท

RTตรงกบpeakของ4,4'-Dihydroxidiphenylsulfone

9.3 วเคราะหspikedfoodsimulantsเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑ%

recoveryทระดบความเขมขน0.05mg/kg(ระดบคามาตรฐาน)อยในชวง80-110%


10.1 ขวดนม หมายถง ภาชนะสาหรบใชบรรจนมหรอของเหลวเพอการบรโภคของทารกและ



เปนตน

80


10.2 ภาชนะบรรจนมสาหรบทารกและเดกเลก หมายถง ภาชนะททาขนโดยมเจตนาสาหรบ

ใชบรรจนมหรอของเหลวอนเพอการบรโภคซงมทงแบบใชซาเชนถวยหดดมเปนตนและ

แบบใชครงเดยวเชนถงพลาสตกทใชเกบนานมมารดาและถงพลาสตกบรรจนมแบบใชครง

เดยวทตองใชรวมกบขวดนม

10.3 การทดสอบ migration (migration test) หมายถง การดาเนนการเพอกระตนใหเกดการ

เคลอนยายของสารออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบซงเปนตวแทนอาหาร

ทจะใชบรรจ(อาหารจาลอง,foodsimulants)ภายใตสภาวะทมการควบคม

10.4 ตามเอกสารอางองCommissionregulation(EU)No10/2011กาหนดให


ตวแทนอาหารทม pH≤≤ 4.5และ50%ethanol (v/v) in aqueous solution



ซงอาจตองสมผสอาหารทอณหภมสงสด 70oC ในระยะเวลาสงสด 2 hr หรอท

อณหภมสงสด100oCในระยะเวลาสงสด15นาท(AnnexVChapter3)

10.4.3 กรณตวอยางแบบใชงานซา ตองทาการตรวจวเคราะหตวอยางนน ซา 3 ครง

และพจารณาผลการวเคราะหครงท3เปรยบเทยบกบคามาตรฐานอยางไรกตาม




81



ใชวเคราะหปรมาณformaldehydeทแพรจากผลตภณฑยางธรรมชาตและยางสงเคราะหภายใต

สภาวะทดสอบ migration ทกาหนดโดยวธน โดยมขดจากดของการตรวจพบ (LOD) เทากบ

1mg/dm3


2.1 JapanExternalTradeOrganization.IIStandardsandTestingMethodsforImplements,

Containers and Packaging, Specifications, Standards and Testing Methods for

Foodstuffs,Implements,ContainersandPackaging,Toys,Detergents2008,JETRO

OverseasResearchDepartment,P.103,117,125-126.

2.2 Japan External Trade Organization. Specification and Standards for Foods, Food

Additives,etc.Under theFoodSanitationAct(Abstracts)2008,JETROOverseas

ResearchDepartment,P.128,131-132.

2.3 ISO14184-1:1998(E).Textiles-Determinationof formaldehyde-Part1:Free

and hydrolized formaldehyde (water extraction method), Annex A. 1st edition

1998-12-15.


สกด formaldehyde จากตวอยางดวย H2O ภายใตสภาวะทดสอบmigration ทอณหภม 40oC

เปนเวลา24hrformaldehydeในH2Oทาปฏกรยากบacetylacetoneไดdimethylpyridine

นาไปวเคราะหดวยเครอง spectrophotometer ทความยาวคลน 413 nm วดปรมาณเทยบกบ


DMSc F 1036 : การวเคราะหปรมาณฟอรมาลดไฮด (Formaldehyde)

ทแพรจากผลตภณฑยาง

Determination of migrated formaldehyde from rubber

products

82



4.1 อางนารอน(waterbath)สามารถควบคมอณหภมไดท40±± 2oC


4.3 เครองสเปกโทรโฟโตมเตอร(spectrophotometer)

4.4อปกรณสาหรบตดตวอยางเชนกรรไกรมดคตเตอรเปนตน

4.5อปกรณสาหรบวดระยะเชนไมบรรทดหรอvernierทมความละเอยด0.1mm

4.6 Volumetricflask

4.7ปเปตแบบปรบปรมาตรได(adjustablepipette)

4.8glasstubeชนดgroundglassstopperขนาด20ml

4.9Buretteทมความละเอยด0.1ml

4.10 flaskชนดgroundglassstopper


หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอนสารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและH2Oทใชเปน

นากรอง(deionized)หรอนากลนทเทยบเทากน

5.1 Ammoniumacetate

5.2 Aceticacid(glacial)

5.3 Acetylacetonereagent(Nashreagent):ชงammoniumacetate150gละลายH2O

เตมaceticacid(5.2)3mlและacetylacetone2mlปรบปรมาตรเปน100mlดวยH2O

เกบในขวดสชา

5.4 Sulfuricacid0.01mol/Lสอบเทยบความเขมขนแลว(standardized)

5.5 Thymolphthaline indicator 10 g/L : ชง thymolphaline 10 g ละลายและปรบปรมาตร

เปน1000mlดวยethanol

5.6 Sodiumsulfite1mol/L:ชงanhydroussodiumsulfite126gละลายและปรบปรมาตร

เปน1000mlดวยH2O

5.7 สารมาตรฐาน(Standards)

5.7.1สารละลายมาตรฐานformaldehydeเขมขน(stocksolution)ความเขมขนประมาณ

1,000 mg/L : ปเปตสารละลาย formaldehyde (ความเขมขนรอยละ 37-40)

0.25mlลงในvolumetricflaskขนาด100mlปรบปรมาตรดวยH2O(ใชไดไมเกน

1 เดอน) สอบเทยบความเขมขน (standardized) ของสารละลายมาตรฐาน

formaldehydeดงน

83


5.7.1.1 ปเปตสารละลาย sodium sulfite (5.6) ปรมาตร 50 ml ลงใน flask

หยด thymolphthaline indicator 2 หยด สารละลายจะเปลยนเปนสฟา

หยดsulfuricacid(5.4)2-3หยดจนกระทงสฟาจางหายไป

5.7.1.2 ปเปตสารละลายมาตรฐานformaldehydeเขมขน(stocksolution)ปรมาตร

10mlลงในflaskเดมจะไดสารละลายสฟากลบมาไตเตรทดวยsulfuricacid

จนแสดงถงจดยต(สฟาจางหายไป)บนทกปรมาตรของsulfuricacidทใช

คานวณความเขมขนของสารละลายมาตรฐานformaldehydeตามสตร

0.6xAx1000 ความเขมขน(mg/l)= B

A=ปรมาตรของsulfuricacidทใชไตเตรท(ml)

B=ปรมาตรของสารละลายมาตรฐานformaldehyde(ml)

หมายเหต sulfuric acid 0.01 mol/L ปรมาตร 1 ml ทาปฏกรยาพอดกบ

fomaldehyde0.6mgกรณทความเขมขนของ sulfuric acid ตางออกไป

ตองนาความเขนขนคาจรงมาใชคานวณ

5.7.2สารละลายมาตรฐาน formaldehyde 100 mg/l : ปเปตสารละลายมาตรฐาน

formaldehydeเขมขน(5.7.1)(ปรมาตรไดจากการคานวณโดยองกบคาความเขมขน

ทstandardizedแลว)ลงในvolumetricflaskขนาด20mlปรบปรมาตรดวยH2O

คานวณปรมาตรสารละลายมาตรฐานformaldehydeทใชจากสตร

100(mg/l)x20(ml) ปรมาตร(ml)= Cfor

(mg/l)

Cfor= ความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน formaldehyde จากการ

Standardized

5.7.3workingstandardsolutionความเขมขน0.0,1.00,1.50,2.00,2.50,3.00,

3.50และ4.00mg/l:ปเปตสารละลายมาตรฐานformaldehyde(5.7.2)ปรมาตร

0.0, 0.250, 0.375, 0.500, 0.625, 0.750, 0.875 และ 1.000 ml ลงใน

volumetricflaskขนาด25mlปรบปรมาตรดวยH2O

84



ตวอยางหวนมยางใชตวอยางทงชนเปนชนทดสอบ(testspecimens)ตวอยางประเภทอนตดเปน

ชนใหมนาหนก ประมาณ 2-5 g จานวน 3 ชน เพอทดสอบ migration ลางดวยนา กรณ

ยางธรรมชาตทมสารเคลอบ ลางดวยสารละลาย detergent ตามดวยนาจนสะอาด วางใหแหงใน

ทปลอดฝน


7.1Migrationtest

7.1.1 ชงชนทดสอบทเตรยมไวใหละเอยดถง0.0001gลงในflaskใสH2Oตามอตราสวน

20ml:1gปดฝานาไปวางในอางนารอนควบคมอณหภมท40± 2oCเปนเวลา

24 hr คบตวอยางออก สารละลายทเหลอใน flask วางทงไวใหเยนทอณหภมหอง

ใชเปนtestsolution

7.1.2 เตรยม blank โดยปเปต H2O ลงใน flask ปรมาตรเทากบทใชทดสอบตวอยาง

แลวปฏบตตาม7.1.1โดยไมมตวอยาง


7.2.1 ปเปตสารละลายมาตรฐาน(5.7.3)5mlลงในglasstubeใสacetylacetonereagent

(5.3)5mlปดฝาเขยาใหเขากน

7.2.2 แชในอางนาเดอด 10 นาท นาออกมาวางไวใหเยน วด absorbance (Abs) ดวย

spectrophotometerทความยาวคลน413nm

7.2.3 สรางกราฟความสมพนธระหวาง Abs กบ ความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน

formaldehydeคาR2 ≥0.995 7.2.4 วเคราะห blank และ test solution โดยปฏบตตาม 7.2.1-7.2.2 วดปรมาณ

formaldehydeเทยบกบกราฟมาตรฐาน

7.2.5กรณทปรมาณformaldehydeสงกวากราฟมาตรฐานใหเจอจางtestsolutionดวย

H2Oแลวปฏบตตาม7.2.1-7.2.2จนสามารถวดไดในชวงกราฟมาตรฐาน


8.1 คานวณปรมาณformaldehyde(mg/L)จากสตร=(a-b)xF

เมอ a(mg/L) = ความเขมขนของformaldehydeในtestsolution

b(mg/L) = ความเขมขนของformaldehydeในblank

F = dilutionfactor(ถาม)

8.2 รายงานผลจากคาเฉลย3ซาหนวยเปนmg/Lหรอmg/dm3ทศนยม1ตาแหนง

85



วเคราะหspikedblankเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑ%recovery

ทระดบความเขมขน1mg/Lอยในชวง80-110%


10.1 การทดสอบ migration (migration test) หมายถง การดาเนนการเพอกระตนใหเกด

การเคลอนยายของสารออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบภายใตสภาวะทม

การควบคม

10.2 ตามเอกสารอางองJETRO2008กาหนดใหใชนาเปนสารละลายในการทดสอบmigration

87



ใชวเคราะหปรมาณสงกะส (Zinc, Zn) ทแพรจากผลตภณฑยางธรรมชาต และยางสงเคราะห

ภายใตสภาวะทดสอบmigrationทกาหนดโดยวธนวเคราะหและวดปรมาณโดยAtomicabsorption

spectrometerชนดFlame(FlameAAS)มขดจากดของการตรวจพบ(limitofdetection)เทากบ

0.1mg/dm3


2.1 JapanExternalTradeOrganization,II.StandardsandTestingMethodsforImplements,

Containers and Packaging, Specifications, Standards and Testing Methods for

Foodstuffs,Implements,ContainersandPackaging,Toys,Detergents2008,JETRO

OverseasResearchDepartment,P.125-126.

2.2 Japan External Trade Organization, Specification and Standards for Foods, Food

Additives,etc.UndertheFoodSanitationAct(Abstracts)2008,JETROOverseas

ResearchDepartment,P.131.


สกดZnจากตวอยางดวยH2Oภายใตภาวะทดสอบmigrationทอณหภม40oCเปนเวลา24hr

วเคราะหดวยflameAASและวดปรมาณเทยบกบกราฟมาตรฐาน

4. เครองมอและอปกรณ (Apparatus)

4.1เครองFlameAASพรอมZnhollowcathodelampหรอlampชนดอนทเหมาะสม

4.2อางนารอน(waterbath)สามารถควบคมอณหภมไดท40± 2oC

4.3เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g

4.4อปกรณสาหรบตดตวอยางเชนกรรไกรมดคตเตอรเปนตน

4.5อปกรณสาหรบวดระยะเชนไมบรรทดหรอvernierทมความละเอยด0.1mm

4.6 Volumetricflask

DMSc F 1037: การวเคราะหปรมาณสงกะสทแพรจากผลตภณฑยาง

Determination of migrated Zinc from rubber products

88


4.7 ปเปตแบบปรบปรมาตรได(adjustablepipette)

4.8 Glasstubeชนดgroundglassstopper



หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอนสารเคมทกชนดไมตากวาARgradeและH2Oทใชเปนนากรอง

(deionized)หรอนากลนทเทยบเทากน

5.1Aceticacid(glacial)

5.2Nitricacid(HNO3)เขมขน,65%

5.31%HNO3:ละลายH2NO3 เขมขนปรมาตร1mlในH2Oปรบปรมาตรเปน100ml

5.4 สารมาตรฐาน(Standards)

5.4.1 สารละลายมาตรฐานZn1,000mg/l

5.4.2 สารละลายมาตรฐานZn100mg/lปเปตสารละลายมาตรฐานZn(5.4.1)ปรมาตร

1mlลงในvolumetricflaskขนาด10mlปรบปรมาตรเปน10mlดวย1%HNO3

5.4.3 workingstandardsolutionความเขมขน0.0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50,

0.60และ0.70mg/L:ปเปตสารละลายมาตรฐานZn(5.4.2)ปรมาตร0.0,0.10,

0.20,0.30,0.40,0.50,0.60และ0.70mlลงในvolumetricflaskขนาด100ml

ปรบปรมาตรดวย1%HNO3


ตวอยางหวนมยางใชตวอยางทงชนเปนชนทดสอบ(testspecimens)ตวอยางประเภทอนตดใหม

นาหนกประมาณ2-5gจานวน3ชนเพอทดสอบmigrationลางดวยนาสะอาดกรณยางธรรมชาต

ทมการเคลอบสารกนตดลางดวยสารละลายdetergentตามดวยนาจนสะอาดวางใหแหงในทปลอดฝน


7.1 Migrationtest

7.1.1 ชงชนทดสอบทเตรยมไวในขอ6ใหละเอยดถง0.0001gลงในflaskใสH2Oตาม

อตราสวน20ml:1gปดฝานาไปวางในอางนารอนควบคมอณหภมท40± 2oC

เปนเวลา24hrคบตวอยางออกสารละลายทเหลอในflaskทงไวใหเยนทอณหภม

หองใชเปนtestsolution

7.1.2 เตรยมblankโดยปเปตH2Oลงในflaskปรมาตรเทากบทใชทดสอบตวอยางแลว

ปฏบตตาม7.1.1โดยไมมตวอยาง

89



7.2.1 วเคราะหและวดปรมาณดวยflameAASทความยาวคลน213.9nm

7.2.2 สรางกราฟความสมพนธระหวาง Abs กบความเขมขนของสารละลายมาตรฐาน

Zn(5.4.3)คาr≥ ≥0.995 7.2.3 ปเปต test solution ปรมาตร 10 ml ลงใน volumetric flask ขนาด 20 ml

เตมHNO3(5.2)ปรมาตร0.2mlปรบปรมาตรเปน20mlดวย test solution

เขยาใหเขากน

7.2.4 ปเปตblankปรมาตร10mlลงในvolumetricflaskขนาด20mlเตมHNO3(5.2)

ปรมาตร0.2mlปรบปรมาตรเปน20mlดวยblankเขยาใหเขากน

7.2.5 วเคราะห blank และ test solution ดวยเครองมอตาม 7.2.1 วดปรมาณ Zn

เทยบกบกราฟมาตรฐาน

7.2.6 กรณทปรมาณ Zn สงกวากราฟมาตรฐานใหเจอจาง test solution ดวย H2O

กอนวเคราะหดวยflameAASจนสามารถวดไดในชวงกราฟมาตรฐาน


8.1 คานวณปรมาณZnจากสตร

M= (a-b)xF

เมอ M = ปรมาณZnในtestsolution(mg/Lหรอmg/dm3)

a= ความเขมขนของZnในtestsolutionทอานไดจากกราฟมาตรฐาน(mg/L)

b= ความเขมขนของZnในblankทอานไดจากกราฟมาตรฐาน(mg/L)

F= dilutionfactor(ถาม)

8.2 รายงานผลการวเคราะหจากคาเฉลย3ซาหนวยเปนmg/Lหรอmg/dm3ทศนยม2ตาแหนง


9.1 กอนใชงานตรวจสอบเครองมอโดยทา sensitivity check ใชความเขมขนของสารละลาย

มาตรฐานตามทกาหนดในคมอการใชเครองAAS

9.2 ควรตรวจสอบการdriftของเครอง โดยการวดworkingstandardsolutionทความเขมขน

สงสดเมอวดตวอยางไปแลวทกๆ 10-12 ตวอยาง และหลงสนสดการวด คาทเบยงเบน

ตองไมเกน5%

9.3 วเคราะห spiked blank เพอประเมน % recovery ทกครงททาการวเคราะห เกณฑ %

recoveryทระดบความเขมขน2mg/L(คามาตรฐาน)ตองอยในชวง80-110%

90



10.1 การทดสอบ migration (migration test) หมายถง การดาเนนการเพอกระตนใหเกดการ

เคลอนยายของสารออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบภายใตสภาวะทมการ

ควบคม

10.2ตามเอกสารอางองJETRO2008กาหนดใหใชนาเปนสารละลายในการทดสอบmigration

91



ใชวเคราะหปรมาณN-NitrosaminesและN-Nitrosatablesubstancesทแพรจากหวนมยางประเภท

ใชกบขวดนมและใชดดเลนทงยางธรรมชาตและยางสงเคราะหลงสนาลายเทยม(artificalsaliva)

ภายใตสภาวะทดสอบmigrationทกาหนดโดยวธนวดปรมาณดวยGaschromatograph-thermal

energydetector(GC-TEA)ทระดบµg/kg


EN 12868: 1999 Child use and care articles-Methods for determining the release

of N-Nitrosamines and N-Nitrosatable substances from elastomer or rubber teats and

soothers


สกด N-Nitrosamines และ N-Nitrosatable substances จากหวนมยางภายใตสภาวะทดสอบ

migration ทอณหภม 40oC เปนเวลา 24 hr ดวย nitrite- containing artificial saliva

saltsolutionแบงสารละลายทไดเปนsolutionAและsolutionBแยกsolutionAไปวเคราะห

N-NitrosaminesสวนsolutionBทาปฏกรยากบกรดเพอเปลยนN-Nitrosatablesubstances

เปน N-Nitrosamines สารละลายทไดทาใหเขมขนขน นาไปวเคราะห N-Nitrosamines

โดยเทคนคแกสโครมาโตกราฟ (GC) ซงม chemiluminescence detector (Thermal Enengy

Analyzer: TEA) หรอ detector อนทมความเหมาะสมและไดรบการตรวจสอบความถกตองแลว

(validatedanalyticaltechnique)ปรมาณทสามารถวเคราะหไดระดบµµg/kg


เครองแกวลางดวยสารละลายกรดกลวดวยammoniasolutionและH2Oแลวอบใหแหง

4.1 เครอง GC -TEA กรณใช detector อน ตองตรวจสอบความถกตองของวธวเคราะห

(methodvalidation)กอนนามาใชสภาวะของเครองมอตองสามารถแยกสารN-Nitrosamines

DMSc F 1038 : การวเคราะหปรมาณ N-Nitrosamines และ N-Nitrosatable

substances ทแพรจากหวนมยาง

Determination of the release of N-Nitrosamines and

N-Nitrosatable substances from rubber nipples

92


ตามทกาหนดในมาตรฐานได โดยใช internal standardและตองสามารถแยกN-Nitrosodi

methylamineกบN-Nitrosodiethylamineออกจากกนได

4.2 ตอบรอน(hotairoven)สามารถควบคมอณหภมไดท40±2°oC

4.3 อางนารอน(waterbath)สามารถควบคมอณหภมไดท40°Cหรอ60°oC

4.4 อปกรณ Kuderna-Danish (K-D) evaporator หรออปกรณอนสาหรบระเหยสารละลาย

ไดเทาเทยมกน


4.6 กรวยแยก(separatingfunnel)ขนาด200mlและ100ml

4.7 ใยแกว(glasswool)ลางดวยdichloromethaneกอนใช

4.8 คอลมนแกว (glass column)จกปดและปรบอตราการไหล (outlet and stopper)ทาดวย

PTFEความยาว300mm,id15mmและชนดความยาว300mm,id26mm

4.9 Sinteredglassขนาดเสนผานศนยกลางพอดกบคอลมนแกว

4.10 VialสาหรบวเคราะหดวยGCหรอampouleพรอมฝาปดชนดPTFE-cotedพรอมอปกรณ

ปดผนก

4.11 ขวดแกวสชาชนดgroundglassstopper

4.12 Flaskชนดgroundglassstopperขนาด25และ50ml

4.13 Beaker

4.14 Glassrod

4.15 Measuringcylinderชนดgroundglassstopper

5. สารเคม (Reagent) หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอนสารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและH2Oทใชเปน


5.1 Sodiumhydrogencarbonate

5.2 Sodiumchloride

5.3 Potassiumcarbonate

5.4 Sodiumnitrile(อายการใชงานประมาณ2ป)

5.5 HCl0.1mol/Lและ1.0mol/L

5.6 NaOH0.1mol/Lและ1.0mol/L

5.7 Artificial saliva salt solution : ละลาย sodium hydrogen carbonate 4.2 g, sodium

chloride0.5g,potassiumcarbonate0.2gและsodiumnitrite30mgในH2Oและ

เจอจางดวย H2O เปน 900ml ปรบ pH เปน 9.0 ดวย HCl 0.1mol/L หรอ NaOH

0.1mol/Lทละหยดแลวปรบปรมาตรเปน1,000mlดวยH2O

93


5.8 Dichloromethaneกลนในภาชนะแกวหรอทมคณสมบตเทยบเทากนตรวจสอบการปนเปอน

ของN-NitrosaminesและN-Nitrosatablesubstancesกอนใช

5.9 n–hexane

5.10 กาซไนโตรเจนบรสทธ

5.11 Anti-bumpinggranules

5.12 Acetone

5.13 Anhydrous sodiumsulfateชนดผง (granular)หรอWhatmanphaseseparating filter

ทเหมาะสม : ชง anhydrous sodium sulfate 30 g ลางดวย dichloromethane 25ml

อบใหแหง

5.14 Ammoniasolution0.1mol/L

5.15 Silicagel(kieselguhr)surface1m2/g,poresize3,000nm-8500nm,particle

size 150 µµm - 650 µµm : อบท 200oC เปนเวลา 1 hr ทาใหเยน ลางดวย

dichloromethaneอบใหแหง(อาจใชสารอนไดเมอทดสอบแลววาเหมาะสม)

5.16 ทราย(sand,acidwashedandcalcined)

5.17 สารมาตรฐาน(standards)

5.17.1สารละลายมาตรฐานN-Nitrosamines

เตรยมสารละลายมาตรฐาน N-Nitrosamines เขมขนจากสารมาตรฐานบรสทธ

ใน n-hexane ใหมความเขมขนในชวง 100-300 ng/ml หรอใชสารละลาย

มาตรฐานเตรยมสาเรจ (certified solutions) ประกอบดวย N-Nitrosamines

ดงตอไปน

- N-nitrosodimethylamine(NDMA);

- N-nitrosodiethylamine(NDEA);

- N-nitrosodipropylamine(NDPA);

- N-nitrosodibutylamine(NDBA);

- N-nitrosopiperidine(NPIP);

- N-nitrosopyrrolidine(NPYR);

- N-nitrosomorpholine(NMOR);

- N-nitrosodibenzylamine(NDBzA);

- N-nitrosodiisononylamine (NDiNA), i.e. N-nitroso 3,5,5-trimethyl

hexylamine;

- N-nitrosoN-methylN-phenylamine(NMPhA);

- N-nitrosoN-ethylN-phenylamine(NEPhA)

94


อยางไรกตาม ชนดของ N-Nitrosamines ไมไดจากดเพยงแคน กรณทพบ

N-Nitrosaminesอนควรนามาวเคราะหและหาปรมาณดวย

5.17.2สารละลายInternalstandardN-nitrosodiisopropylamine(NDiPA)200ng/ml:

ชงสารมาตรฐานบรสทธNDiPAละลายในacetoneหรอตวทาละลายอนทเหมาะสม

หรอใชสารละลายมาตรฐาน certified solutions นามาเจอจางใหไดความเขมขน

ตามตองการ

หมายเหต N-nitrosamines ถกทาลายดวยแสงอลตราไวโอเลต ในการวเคราะหควร

หลกเลยงการสมผสทงแสงอาทตยและแสงสวางจากหลอดฟลออเรสเซนท

สารละลายมาตรฐานและสารละลายตวอยางควรหมดวยแผนเปลวอลมเนยม

หรอเกบในภาชนะปองกนแสงเกบทอณหภมไมเกน5°oC


6.1 ใชเฉพาะสวนททาดวยยางเทานน นาสวนประกอบซงทไมใชยางออกไป ใชตวอยางทงชน

เปนชนทดสอบ (test specimens) ชงชนทดสอบใหไดนาหนกประมาณ40 g ถาตวอยาง

มจานวนไมมากนาหนกทใชตองไมตากวา10g

6.2 ตมH2Oในbeakerใหเดอดใสชนทดสอบลงไปตมเปนเวลา10minใชคมคบชนทดสอบ

ออกมาวางทงไวใหเยนทอณหภมหอง

6.3 ตดชนทดสอบแตละชนเปน2สวนตามแนวตงวางไวใหแหงในทปลอดฝน


7.1 Migrationtest

7.1.1 ชงชนทดสอบทเตรยมไว(6.3)นาหนก10gใหละเอยดถง0.1gลงในflaskขนาด

50mlทกตวอยางเตรยม2ซา(duplicate)ปเปตสารละลายartificialsalivasalt

(5.7)ปรมาตร40mlลงในflaskปดฝาเขยาเบาๆใหสารละลายทวมชนทดสอบ

นาไปวางในตอบรอน ควบคมอณหภมไวท 40± 2oC เปนเวลา 24 hr (ไมเกน

30min)กรณทนาหนกของชนทดสอบเกน10gเพมปรมาตรสารละลายสารเคม

และภาชนะทใชตามอตราสวน

7.1.2 รนสารละลายออกจากflaskลงในmeasuringcylinderจนหมดลางชนทดสอบดวย

สารละลาย artificial saliva salt ปรมาตร4ml และเกบสารละลายทใชลางรวมกน

ในmeasuring cylinder เดม ปรบปรมาตรเปน 50ml ดวยH2Oปดฝา ผสมให

เขากน

95


7.1.3 ปเปตสารละลายทได (7.1.2) ปรมาตร 10 ml ใส flask ขนาด 25 ml ปดฝา

เกบแยกไวเปนsolutionBสวนทเหลอเกบไวเปนsolutionA

7.2 การวเคราะหN-NitrosaminesจากsolutionA

7.2.1 การสกดN-Nitrosamines

ปเปตสารละลายinternalstandard(5.17.2)ปรมาตร1mlและNaOH1mol/L

(5.6)ปรมาตร1mlลงในmeasuringcylinderทเกบsolutionA

หมายเหต ในขนตอนการทา clean-up solution A สามารถใช Method A หรอ

MethodBกได

Method A

A.1เตรยมsilicagelคอลมน:ใสsilicagelทเตรยมไว(5.15)นาหนก25gลงใน

คอลมนแกวขนาดid26mm(4.8)รองดานลางดวยใยแกว(4.7)ปดดานบนดวย

sinteredglass(4.9)หรอใสทราย(5.16)ลกประมาณ1cmขณะทเตมsilicagel

ใหเคาะเบาๆเพอใหsilicagelบรรจลงในคอลมนสมาเสมอเปนเนอเดยวกน

A.2 นาsolutionAทเตรยมไว(7.2.1)เขยาเบาๆใหผสมกนกอนเทลงในsilicagelคอลมน

ชาๆใหสารละลายซมลงสsilicagelภายในเวลา10–15minจะเหลอสวนsilicagel

แหงอยดานลางระยะประมาณ50-70mm

A.3 เตมdichloromethane60-80mlลงในคอลมนเกบสารละลายทไหลออกมาจากคอลมน

ลงสK-D flaskหรอภาชนะทจะใชระเหยในขนตอไปใหไดประมาณ40mlภายใน

เวลา15-25minระหวางทาการeluteดวยdichloromethaneระยะขอบของsilica

gel ทแหงอาจลดลงเหลอ 15-30 mm เนองจากความแตกตางระหวางสวนทเปน

H2Oกบสวนของdichloromethaneระวงไมใหสวนทแหงหายไปไมเชนนนสารละลาย

ทไดจะมH2Oรวมอยดวย

Method B

B.1 นา solution Aทเตรยมไว (7.2.1)มาเขยาเบาๆใหผสมกน กอนเทใสในกรวยแยก

ขนาด200ml

B.2 เตมdichloromethane20mlเขยาตอเนองเปนเวลา1minทงไวใหแยกชนกรณ

ทสารละลายแยกไดยากให ใชวธ centrifuge ปลอยของเหลวชนลางใหไหลผาน

anhydroussodiumsulfateทเตรยมไว(5.13)ลงสK-Dflaskหรอภาชนะทจะใช

ระเหยในขนตอไป

B.3 ทาซาตามขอB.2อก2ครงลางanhydroussodiumsulfateดวยdichloromethane

25 ml และเกบ สารละลายทไดทงหมดรวมกนใน K-D flask ใบเดม หรอภาชนะ

ทใชใบเดม

96


7.2.2 การทาใหเขมขน

7.2.2.1 ใส n–hexane 2 ml ลงในสารละลายทสกดได จาก Method A หรอ

Method B ใส anti-bumping 2-3 ชน ตอทออากาศกบ K-D flask

ระเหยใหเหลอปรมาตร4-6mlทอณหภมเรมตน40± 2oCแลวคอยๆ

เพมอณหภมเปน60± 2oCในอตราเรว2oC/minระวงอยาใหสารละลาย

ระเหยไปหมด กรณทใชเครองระเหยสญญากาศตองควบคมความดนและ

อณหภม อยาใชสารละลายระเหยอยางรวดเรวหรอระเหยไปหมด เพราะ

จะทาใหสญเสยสารทต องการไปได ล างอปกรณ ท ใช ระเหยดวย

dichloromethane ปรมาตรประมาณ 2 ml เกบรวมกบสารละลายทเหลอ

จากการระเหย

7.2.2.2นาสารละลายทเหลอจากการระเหยไป เปาดวยกาซไนโตรเจนเบาๆ

(ระวงสารละลายกระฉอกและไมควรระเหยมากไปจนเกอบหมด)ใหเหลอ

1ml ถายสารละลายใส vial (4.10)ทาการวเคราะหภายใน1 hr หรอ

ภายใน1วนกรณทตองเกบไวใหเกบในทมดอณหภมไมเกน5oC

7.2.3 การวเคราะหและวดปรมาณN-nitrosamines

7.2.3.1 วเคราะหดวยเครองGC-TEAสภาวะเครองมอทใชปรมาตรของสารละลาย

มาตรฐานและสารละลายตวอยางทฉด GC ตองเทากน เปรยบเทยบ

retention time (RT) ของ N-nitrosamines จากสารละลายตวอยางกบ

สารมาตรฐาน ถาตรงกน ทาการวเคราะหปรมาณโดยคานวณเทยบกบ

สารมาตรฐาน N-Nitrosamines กรณทใช detector อนใหปรบสภาวะ

เครองมอทใชใหเหมาะสมตามทไดทาการตรวจสอบความถกตองของ

วธวเคราะหไว ตงสภาวะเครอง GC ตามสภาวะท 1 หรอ 2 หรอตาม

ความเหมาะสม

สภาวะท1 Packedcolumns

Injectortemp: 200oC.

Oventemp: 200oC.

Column: 1.2.5-3.0mglass,externaldiameter1/8”packed

with: 15% Carbowax 20W, TPA on Chromsorb

WHP100/120meshหรอ10%Carbowax20W,

2%KOHonChromsorbWHP100/120mesh

97


2.4.0-5.0mglass,externaldiameter1/8”packed

with 15% SP 1200, 1% H3PO4 on Chromsorb

WAW100/120mesh.

Pyrolyzertemp: 480°oC.

Carriergas: Argon,heliumornitrogenataflowrateofapproximately

20ml/min.

Coupling: directbetweenGCcolumnandpyrolysisoven,orusing

aninterfaceheatedat250°oC.

สภาวะเครองGCทเหมาะสมตอการวเคราะหalkylphenylN-nitrosamines:

Injectortemp: 150o°C.

Oventemp: approximately(120–130oC)

Column: 2.0mglass,externaldiameter¼1/4",internaldiameter

2.0 mm, pack with: 10% OV-101 on Chromsorb

WHP80/100meshหรอ3%OV-225onChromsorb

WHP80/100mesh

Pyrolyzertemp: 480oC.

Interfacetemp: 250oC.

สภาวะท2 Capillarycolumns

Injectortemp: 200°oC

Oventemp: 60oC,230o°C(10oC/min).

Column: 25.0mfusedsilica0.53mmFFAP1µµm


Interfacetemp: 250°oC.

หรอ

Injectortemp: 50°oC1min,200oC(75°oC/min).

Overtemp: 40oC7min,60oC(1°oC/min),230°oC(14oC/min).

Column: 30.0mfusedsilica0.53mmSE-54film2µµµm.


Interfacetemp: 250oC.

98


7.3 การวเคราะหN-nitrosatablesubstancesจากsolutionBในรปN-Nitrosamines

7.3.1 การสกดN-Nitrosamines

7.3.1.1 ปเปตHCl1mol/l(5.5)ปรมาตร1mlลงในsolutionBทเกบไว(7.1.3)

เขยาเพอผสมใหเขากน สารละลายม pH ประมาณ 1.4 วางไวในทมด

30min

7.3.1.2 ปเปตNaOH1mol/l(5.6)ปรมาตร2mlลงในsolutionBเพอใหม

สภาพเปนดางและสารละลายมาตรฐานinternalstandardปรมาตร1ml

หมายเหต ในขนตอนการทา clean-up solution B สามารถใช Method C หรอ

MethodDกได

Method C

C.1 เตรยมsilicagelคอลมน:ใสsilicagelทเตรยมไว(5.15)นาหนก8gลงในคอลมน

แกวขนาดid15mm(4.8)รองดานลางดวยใยแกว(4.7)ปดดานบนดวยsintered

glass (4.9) หรอใสทราย (5.16) ลกประมาณ 1 cm ขณะทเตม silica gel ให

เคาะเบาๆเพอใหsilicagelบรรจลงในคอลมนสมาเสมอเปนเนอเดยวกน

C.2 นาsolutionBทเตมกรด-ดางไวแลว(7.3.1.2)มาเขยาเบาๆใหผสมกนกอนเทลงใน

silica gel คอลมนชาๆ ใหสารละลายซมลงส silica gel ภายในเวลา 10-15 min

จะเหลอสวนsilicagelแหงอยดานลางระยะประมาณ50-70mm

C.3 เตม dichloromethane 25-30 ml ลงในคอลมน เกบสารละลายทไหลออกมาจาก

คอลมน ลงส K-D flask หรอภาชนะทใชระเหยในขนตอไป ใหไดประมาณ 15 ml

ภายในเวลา15-25minระหวางทาการeluteดวยdichloromethaneระยะขอบของ

silica gel ทแหงอาจลดลงเหลอ 15-30mm เนองจากความแตกตางระหวางสวนท

เปน H2O กบสวนของ dichloromethane ระวงไมใหสวนทแหงหายไปไมเชนนน

สารละลายทไดจะมH2Oรวมอยดวย

Method D

D.1 นาsolutionBทเตมกรด-ดางไวแลว(7.3.1.2)มาเขยาเบาๆใหผสมกนกอนเทใสในกรวย

แยกขนาด100ml

D.2 เตมdichloromethane10ml เขยาตอเนอง เปนเวลา1minทงไวใหแยกชนกรณ

ทสารละลายแยกไดยากให ใชวธ centrifuge ปลอยของเหลวชนลางใหไหลผาน

anhydrous sodium sulfate ทเตรยมไวลงส K-D flask หรอภาชนะทใชระเหย

ในขนตอไป

D.3 ทาซาตามขอD.2อก2ครงลางanhydroussodiumsulfateดวยdichloromethane

10 ml และเกบสารละลายทไดทงหมดรวมกนใน K-D flask ใบเดมหรอภาชนะ

ทใชใบเดม

99


7.3.2 การทาใหเขมขน

ใสn-hexane2mlลงในสารละลายทสกดไดจากMethodCหรอMethodDใส

anti-bumping2-3ชนทาการระเหยสารละลายโดยปฏบตเชนเดยวกบขอ7.2.2

7.3.3 การวเคราะหN-nitrosatablesubstancesในรปN-Nitrosaminesปฏบตเชนเดยว

กบการวเคราะหN-Nitrosaminesในขอ7.2.3

7.4 วเคราะห blank โดยใชสารละลาย artificial saliva salt ทไมมตวอยางปฎบตตามขนตอน

เดยวกนกบการวเคราะหตวอยาง

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results)8.1 การคานวณปรมาณN-nitrosamineในsolutionA

5 f. ANA

m (µµg/kg) = (1) 4 ANDiPA

R

เมอ M = ปรมาณของ N-nitrosamine ทแพรจากตวอยางลงส สารละลาย

artificial saliva salt เทยบอตราสวนกบปรมาณ internal standard

(NDiPA)แลว

F = Factorจาก(2)

ANA = Peak area ของสาร N-nitrosamine ทอานไดจากการวเคราะห

solutionA

ANDiPAR = Peakareaของinternalstandard(NDiPA)ทอานไดจากการวเคราะห

solutionA

V.C.ANDiPA1 VNASTD

F = (2) g.ANASTD VNDiPA

1

เมอ V = ปรมาตรของinternalstandard(NDiPA)ทเตม(ml)

C = ความเขมขนของN-nitrosamineแตละชนดในสารละลายมาตรฐาน(µg/l) G = นาหนกตวอยาง(g)

ANASTD = PeakareaของN-nitrosamineแตละชนดในสารมาตรฐาน

ANDiPA1 = Peakareaของinternalstandard(NDiPA)ทฉด

VNASTD = ปรมาตรของสารละลายมาตรฐานN-nitrosamineทฉดGC(µ µµl) VNDiPA

1 = ปรมาตรของinternalstandard(NDiPA)ทฉดGC(µ µl)

100


คานวณปรมาณ N-nitrosamines ทงหมดโดยการนาปรมาณ N-nitrosamine แตละชนด

ทตรวจพบมารวมกนกรณทเครองมออานคาสารไดนอยกวา3เทาของbackgroundnoise

ใหคดเปน“Notdetected”หรอ“ND”และคดคาเปน0

8.2 การคานวณปรมาณN-nitrosatablesubstancesในsolutionBในรปN-nitrosamineจากสตร

5 f. ANA N = (3) ANDiPA

R

เมอ N = ปรมาณของ N-nitrosamine ทแพรจากตวอยางลงส สารละลาย

artificial saliva salt เทยบ อตราสวนกบปรมาณ internal standard

(NDiPA)แลว(µg/kg)

F = Factorจาก(2)

ANA = PeakareaของN-nitrosamineทอานไดจากการวเคราะหsolutionB

ANDiPAR = Peakareaของinternalstandard(NDiPA)ทอานไดจากการวเคราะห

solutionB

คานวณปรมาณN-nitrosatablesubstancesแตละชนดหลงจากหกลบดวยN-nitrosamine

ทมอยเดมจากsolutionAออกไปแลวคานวณปรมาณN-nitrosatablesubstancesทงหมด

โดยนาปรมาณ N-nitrosatable substances แตละชนดทตรวจพบมารวมกน กรณท

เครองมออานคาสารไดนอยกวา3เทาของbackgroundnoiseใหคดเปน“Notdetected”

หรอ“ND”และคดคาเปน0

8.3 การปรบคาผลวเคราะห(analyticalcorrection)ในกรณทตองการเปรยบเทยบกบคามาตรฐาน

คาทคานวณไดจากขอ8.1และ8.2ตองปรบคาโดยลบคาanalyticalcorrectionออกไป

AnalyticalcorrectionของN-nitrosamines = 0.01mg/kg

AnalyticalcorrectionของN-nitrosatablesubstances = 0.1mg/kg

หมายเหต จากการทดสอบ precision ในการทา method specified เฉพาะวธน และ

จากการทา inter laboratory พบวาจาเปนตองใชคา analytical correction

มาปรบคาผลวเคราะหดวย

ตวอยางการปรบคาผลวเคราะห

ผลวเคราะหพบN-nitrosamines =0.018mg/kg

คาanalyticalcorrection = 0.010mg/kg

ผลวเคราะหทปรบคาแลว =0.018-0.010=0.008mg/kg

101


8.4 การรายงาน

รายงานชนด ปรมาณแตละชนด ปรมาณรวมของ N-nitrosamines และ N-nitrosatable

substancesทพบในหนวยmg/kgทศนยม3ตาแหนง

9. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results) 9.1 กรณทปรมาณรวมของ N-nitrosamines เทากบหรอมากกวาคากาหนดตามมาตรฐาน

หรอกฎหมายทเกยวของทาการทดสอบเพอยนยนความถกตองโดยวธใดวธหนงดงน

9.1.1 นาสารละลายทเหลอจากการวเคราะห โดยวธ GC มาผาน (expose) รงส UV

ทความยาวคลน 366 nm เปนเวลา 3 hr พรอมกบสารละลายมาตรฐานแลวนาไป

วเคราะหดวยGCpeakของN-nitrosamineทเคยปรากฏจะหายไปหรอลดลงเนองจาก

การสลายตวของสารถา peak ของตวอยางไมลดลงภายหลงไดรบรงส UV แสดงวา

peak นนไมใช N-nitrosamine จงไมจาเปนตองทาการวเคราะห เพอวดปรมาณ

ในขนตอไป

9.1.2 วเคราะหยนยนโดยใชGCColumnทแตกตางออกไปอยางนอยอก1ชนด

9.1.3 ตรวจยนยนโดยวธmassspectrometry

หลงการทดสอบยนยนหากพบวามpeakทไมใชN-nitrosamineชนดใดชนดหนง

ตองคานวณปรมาณN-nitrosaminesทงหมดใหมโดยไมรวมคาเดมทยนยนแลววา

ไมใชN-nitrosamine


ทมRTตรงกบpeakของN-nitrosamines

9.3 วเคราะห spikedartificial saliva salt เพอประเมน% recoveryทกครงททาการวเคราะห

เกณฑ % recovery ทระดบ ความเขมขน 0.01 mg/kg (ระดบคามาตรฐาน) อยในชวง

60-115%

10. รายละเอยดอน10.1 การทดสอบ migration (migration test) หมายถง การดาเนนการเพอกระตนใหเกด

การเคลอนยาย หรอแพรของสาร ออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบภายใต

สภาวะทมการควบคม

10.2 สถานททาการวเคราะห ตองปองกนแสง หรอรงส UV ไมใหสมผสสารละลายมาตรฐาน

และสารละลายตวอยางไดและปราศจากสารระเหยN-Nitrosaminesในบรรยากาศ

103


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณสารทระเหยได(volatilecompounds)ในหวนมยางสงเคราะหเชนยางsilicone

ทระดบมากกวาหรอเทากบ0.01%w/w

2. เอกสารอางอง (Reference) EN14350-2:2004Childuseandcarearticles–Drinkingequipment–Part2:Chemical

requirementsandtests

3. หลกการ (Principle) อบตวอยางทอณหภม200oCเปนเวลา4hrแลวชงนาหนกนาหนกทหายไปเปนนาหนกของสาร

ทระเหยไดในเนอยาง


4.2 ตอบรอน(hotairoven)สามารถควบคมอณหภมไดท100± 5oCและ200± 5oC

4.3 โถดดความชน(desiccator)พรอมสารดดความชนcalciumchlorideหรอsilicagel

4.4 ถวยระเหย(dish)ทนความรอนไดสงกวา200oC

4.5 ถงมอผาหรอพลาสตกสาหรบจบตวอยาง

4.6 ภาชนะทนความรอนใชตมตวอยาง

5. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)ใชเฉพาะสวนททาดวยยางสงเคราะหเทานน นาสวนประกอบทไมใชยางออกไป ตมชนทดสอบ

(test specimen) ในนาเดอด เปนเวลา 10 min โดยไมใหสวนของตวอยางสมผสกบภาชนะ

เพอชะสารเคลอบผวทใชในขบวนการผลต และใหเกดความมนใจวาวสดทใชทามความคงตวไดใน

นาเดอดเมอครบเวลานาชนทดสอบออกมาผงใหแหงในทปลอดฝน

DMSc F 1039 : การวเคราะหปรมาณสารทระเหยไดในหวนมยาง

สงเคราะห

Determination of volatile compounds content in

synthetic rubbers

104


6. ขนตอนการทดสอบ (Procedure) 6.1 อบถวยระเหย(4.4) ในตอบรอนทอณหภม100±5°oC เปนเวลา1hr (อบครงท1)

ทงใหเยนในโถดดความชน(4.3)เปนเวลา1hrชงนาหนกและบนทก(Wa)

6.2 นาชนทดสอบทเตรยมไว (5) ใสถวยระเหย (6.1) ชงใหไดนาหนกของตวอยางประมาณ

10 g และบนทกคาทชงได (Ws) นาไปอบในตอบรอนทอณหภม 100± 5oC เปนเวลา

1 hr (อบครงท 2) ทงใหเยนในโถดดความชน เปนเวลาไมนอยกวา 2 hr ชงนาหนก

และบนทกคา(Wb)

6.3 นาไปอบซาทอณหภม200± 5oCเปนเวลา4hr(อบครงท3)ทงใหเยนในโถดดความชน

เปนเวลาไมนอยกวา2hrชงนาหนกและบนทกคา(Wc)

7. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results) 7.1 การคานวณ

(Wb–Wc)x100 ปรมาณสารทระเหยได(%w/w)=(Ws–Wa)

เมอ Wa =นาหนกถวยระเหยทผานการอบครงท1(g)

Wb =นาหนกถวยระเหยพรอมตวอยางทผานการอบครงท2(g)

Wc =นาหนกถวยระเหยพรอมตวอยางทผานการอบครงท3(g)

Ws =นาหนกถวยระเหยและตวอยาง(g)

7.2 การรายงาน

รายงานปรมาณสารทระเหยไดจากคาเฉลยหนวยเปน%ทศนยม2ตาแหนง

8. การควบคมคณภาพผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)วเคราะห2ซา(duplicate)ในทกตวอยาง

9. รายละเอยดอนในการวเคราะห2ซา(duplicate)คาความแตกตางสมพนธ(Relativepercentdifference;RPD)

ตองไมเกน20%

105


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณ2-Mercaptobenzothaizole(MBT)ทแพรจากผลตภณฑvalcanisedrubber

เชนยางธรรมชาต ภายใตสภาวะทดสอบ migration ทกาหนดโดยวธน วเคราะหและวดปรมาณ

โดยHPLC–UVมขดจากดของการตรวจพบ(LOD)เทากบ0.1mg/L

2. เอกสารอางอง (References) 2.1 EN14350–2:2004Childuseandcarearticles–Drinkingequipment–Part2:

Chemicalrequirementsandtests



3. หลกการ (Principle) สกดMBTซงเปนvalcanisingagentsและmetal-saltsของMBTจากตวอยางภายใตสภาวะ

ทดสอบmigrationทอณหภม40oCเปนเวลา24hrโดยมethanol50%(v/v) inaqueous

solutionและaceticacid3%(w/v)inaqueoussolutionเปนfoodsimulantsสกดเพอแยก

MBTจากaqueoussolutionดวยdichloromethaneเตรยมใหสะอาดและเขมขนขนแลววเคราะห

ดวยHPLC-UVวดปรมาณเทยบกบกราฟมาตรฐาน


4.2เครองชงละเอยด(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.0001g


40± 2oC


4.5 เครองระเหยสญญากาศ(vacumnevaporator)


DMSc F 1040 : การวเคราะหปรมาณ 2- Mercaptobenzothaizole (MBT)


Determination of migrated 2- Mercaptobenzothaizole

(MBT) from valcanised rubber products

106





4.10Volumetricflask

4.11VialสาหรบHPLC


4.13Beaker

4.14กรวยแยก(separatingfunnel)


5. สารเคม (Reagents)หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอน สารเคมทกชนดไมตากวาระดบARgradeและH2Oทใชเปน


5.1 Acetonitrile(HPLCgrade)

5.2 Dichloromethane(Residueanalysisgrade)

5.3 Anhydroussodiumsulfate

5.4 Foodstimulants





5.5 สารมาตรฐาน2-Mercaptobenzothaizole(MBT)ความบรสทธไมนอยกวารอยละ98

5.5.1 working standard solution ความเขมขน 1.0, 2.0, 5.0, 10.0, 15.0 และ

20.0µg/ml เตรยมworking standard solution จากสารมาตรฐานMBT (5.5) ละลายในacetonitrile

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample) 6.1 ใชเฉพาะสวนททาดวยยางเทานนนาสวนประกอบทไมใชยางออกไป

6.1.1 หวนมยาง จานวนตวอยาง (test specimen) เพอทดสอบ migration 2 ชนและ

เพอคานวณพนทผว2ชนคานวณพนทผวทง2ดาน(นอก-ใน)ใหไดประมาณ

1 dm2 ถาตวอยางทงชนมพนทนอยกวา 1 dm2 สวนทขาดใหตดหวนมยางชนอน

นามาคานวณพนทรวมกน วธคานวณพนท ตดชนทดสอบเปนชนสเหลยม วางทาบ

บนตารางกระดาษ(millimetrepaper)นบจานวนตารางและคานวณกลบเปนพนท

รวมพนททง2ดานหรออาจใชวธอนทเหมาะสมและเทยบเทา

107


6.1.2 ผลตภณฑอนเตรยมใหมขนาดพนทประมาณ1dm2(รวมทง2ดาน)จานวนชน

ทดสอบเพอทดสอบmigration2ชดและเพอคานวณพนทผว2ชดวธคานวณพนท

ปฏบตตาม6.1.1

6.2 ใสH2Oในbeakerตมใหเดอดนาตวอยางทใชเพอทดสอบmigrationใสลงไปตมเปนเวลา

10minใชคมคบตวอยางออกมาวางทงไวใหเยนทอณหภมหอง

6.3 ตวอยางหวนมยาง ตดแบงเปน 2 สวนตามแนวตง ตวอยางอนตดเปนชนเลกๆ ใหมขนาด

พอเหมาะเพอใสในflaskขนาด250mlแลววางไวใหแหงในทปลอดฝน


7.1.1 ชงชนทดสอบทเตรยมไวตามขอ6.3ใหละเอยดถง0.0001gลงในflaskใสสารละลาย

foodstimulants(5.4)ในอตราสวนพนทผวตอปรมาตร1cm2:2mlปดฝานาไป

วางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมท40± 2oCเปนเวลา24hrคบชนทดสอบ

ออกสารละลายทเหลอในflaskวางทงไวใหเยนทอณหภมหองใชเปนtestsolution

7.1.2 นาtestsolutionมาเขยาเบาๆใหผสมกนกอนเทลงในกรวยแยกใสdichloromethane

50 ml เขยาตอเนองเปนเวลา 1 min ทงไวใหแยกชน ปลอยของเหลวชนลาง

(dichloromethane) ใหไหลผาน anhydrous sodium sulfate (5.3) ลงสภาชนะ

ทใชระเหย

7.1.3 ทาซาตามขอ7.1.2อกครงลางanhydroussodiumsulfateดวยdichloromethane

เกบสารละลายทไดทงหมดรวมกนในภาชนะทใชระเหย

7.1.4 ระเหยสารละลายทไดอยางระมดระวงจนเกอบแหงดวยเครองระเหยสญญากาศ

ถายใสvolumetricflaskลางและปรบปรมาตรเปน5mlดวยacetonitrileกรองดวย


หมายเหต ในขนตอนการการสกด และทาใหเขมขน อาจใช concentration column ท

เหมาะสมแทนการสกดดวยdichroromethane

7.1.5 เตรยมblankโดยปเปตสารละลายfoodstimulantsลงในflaskปรมาตรเทากบทใช

ทดสอบตวอยางแลวปฏบตตาม7.1.1-7.1.4โดยไมมตวอยาง



column: stainless steel 250 x 4.6 mm packed with reversed phase C8

(e.g.SpherisorbC8),particlesize5µm

mobilephase:EluteA:1%acetonitrileในH2OและEluteB:acetonitrile

108


gradientprogramme

Time(min) %EluteA %EluteB

0to2 70 30

2to17linearlyto 10 90

17to22 10 90


25to28orlonger 70 30

injectionvolume:20µl

flowrate:1ml/min

detector: UV 320, Diode array spectrum from 240-360 nm, Detector

programmingfromtime5minto12min

ปรบสภาวะเครองมอใหเหมาะสมกบชนดของคอลมนทใช และสามารถวเคราะหปรมาณ

MBTไดทความเขมขนนอยทสด(detectionlimit)0.1mg/L

7.2.2 กราฟมาตรฐาน(calibrationcurve)

เตรยมกราฟมาตรฐานโดยฉด working standard solution ในขอ 5.5.1 ระดบ

ความเขมขนละ 3 ครง สรางกราฟความสมพนธระหวางคาเฉลยของ peak area

กบความเขมขนของMBTโดยคาcorrelationcoefficient(r)ตอง≥0.997 7.2.3 ฉดสารละลายตวอยางและblankวเคราะหและหาปรมาณเทยบกบกราฟมาตรฐาน

7.3 การตรวจยนยน

ยนยน MBT ทตรวจพบใน test solution ดวย UV-spectrum ทไดจากการวดดวย diode

arraydetectorเปรยบเทยบกบสารมาตรฐาน

8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results) 8.1 คานวณปรมาณMBTจากสตร

CxVM = W

เมอ M =ปรมาณMBTในตวอยาง(µg/g) C =ความเขมขนของMBTในสารละลายตวอยาง(µµg/ml) V =ปรมาตรของสารละลายตวอยางสดทายทได(5ml)

W =นาหนกชนทดสอบ(testspecemen)(g)

109


8.2 รายงานผลหนวยเปนmg/kgทศนยม1ตาแหนง

8.2.1 รายงานผลวเคราะหปรมาณ MBT ในตวอยางจากการทดสอบ migration โดย

foodsimulantทง2ชนด

8.2.2 ผลการทดสอบmigrationรายงานจากคาเฉลยในการทดสอบตวอยาง2ซา



ทretentiontime(RT)ตรงกบpeakของMBT

9.3 วเคราะหspikedfoodsimulantsเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑ

%recoveryทระดบความเขมขน8mg/kg(ระดบคามาตรฐาน)อยในชวง80–110%

10. รายละเอยดอน10.1 การทดสอบ migration (migration test) หมายถง การดาเนนการเพอกระตนใหเกดการ

เคลอนยายของสารออกมาจากตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบซงเปนตวแทนอาหาร


10.2 ตามเอกสารอางองCommissionregulation(EU)No10/2011(AnnexIII)กาหนดให

3%aceticacid(w/v)inaqueoussolution(foodsimulantB)เปนอาหารจาลองตวแทน

อาหารทมpH≤≤ 4.5และ50%ethanol(V/V)inaqueoussolution(foodsimulantD1)

เปนอาหารจาลองตวแทนอาหารนม

10.3 ขอมลcollaborativelaboratory(n=7)แสดงrepeatabilityและreproducibilityตามเอกสาร

อางอง

Averagerepeatability(r) = 3.0และCVr = 10.4%

Averagereproducibily(R) =7.4และCVR = 23.4%

111


1. ขอบขาย (Scope)ใชวเคราะหปรมาณAntioxidantBHTและAntioxidant2246ทแพรจากผลตภณฑvulcanised

rubber เชน ยางธรรมชาต ภายใตสภาวะทดสอบ migration ทกาหนดโดยวธน วเคราะหและ

วดปรมาณโดยHPLC-UVมขดจากดของการตรวจพบ(LOD)เทากบ0.1mg/L

2. เอกสารอางอง (References)2.1 EN 14350-2: 2004 Child use and care articles-Drinking equipment-Part 2:

Chemicalrequirementsandtests



3. หลกการ (Principle) สกด Antioxidant BHT และ Antioxidant 2246 จากตวอยางภายใตสภาวะทดสอบ migration

ทอณหภม40oCเปนเวลา24hrโดยมethanol50%(v/v)inaqueoussolutionและacetic

acid3%(w/v)inaqueoussolutionเปนfoodsimulantsสกดเพอแยกAntioxidantBHTและ

Antioxidant2246จากaqueoussolutionดวยdichloromethaneเตรยมใหสะอาดและเขมขนขน

แลววเคราะหดวยHPLC-UVวดปรมาณเทยบกบกราฟมาตรฐาน

DMSc F 1041 : การวเคราะหปรมาณ 2,6-Bis(1,1-dimethylethyl)-

4-methyl-phenol (Antioxidant BHT) และ 2,2'-Methylethylenebis

(6-(1,1-dimethylethyl)-4-methyl-phenol) (Antioxidant 2246)

ทแพรออกมาจากผลตภณฑ vulcanised rubber

Determination of migrated 2,6-Bis (1,1-dimethylethyl)-

4-methyl-phenol (Antioxidant BHT) and 2,2'-

Methylethylenebis (6-(1,1-dimethylethyl) -4-methyl-

phenol) (Antioxidant 2246) from vulcanised

rubber products

112





40±± 2oC

4.4 เครองระเหยสญญากาศ(vacumnevaporator)




4.8 Volumetricflask



4.11Beaker

4.12กรวยแยก(separatingfunnel)


5. สารเคม (Reagents)หากไมไดกาหนดไวเปนอยางอนสารเคมทกชนดไมตากวาARgradeและH2Oทใชเปนนากรอง

(deionized)ชนดHPLCgradeหรอนากลนทมคณภาพเทยบเทากน

5.1 Acetonitrile(HPLCgrade)

5.2 Dichloromethane(Residueanalysisgrade)

5.3 Anhydroussodiumsulphate

5.4 Foodstimulants





5.5 สารมาตรฐานAntioxidantBHTและAntioxidant2246ความบรสทธไมนอยกวารอยละ98

5.5.1 workingstandardsolutionAntioxidantBHTและAntioxidant2246ความเขมขน

6และ3µg/mlตามลาดบ:เตรยมworkingstandardsolutionจากสารมาตรฐาน

AntioxidantBHTและAntioxidant2246(5.5)ละลายในacetonitrile

113


6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample) 6.1 ใชเฉพาะสวนททาดวยยางเทานนนาสวนประกอบทไมใชยางออกไป

6.1.1 หวนมยาง จานวนตวอยาง (test specimen) เพอทดสอบ migration 2 ชน และ

เพอคานวณพนทผว2ชนคานวณพนทผวทง2ดาน(นอก-ใน) ใหไดประมาณ

1 dm2 ถาตวอยางทงชนมพนทนอยกวา 1 dm2 สวนทขาดใหตดหวนมยางชนอน

นามาคานวณพนทรวมกนวธคานวณพนทตดตวอยางเปนชนสเหลยมวางทาบบน

ตารางกระดาษ (millimetre paper) นบจานวนตาราง และคานวณกลบเปนพนท

รวมพนททง2ดานหรออาจใชวธอนทเหมาะสมและเทยบเทา

6.1.2 ผลตภณฑอนเตรยมใหมขนาดพนทประมาณ1dm2(รวมทง2ดาน)จานวนชน

ทดสอบเพอทดสอบmigration2ชดและเพอคานวณพนทผว2ชดวธคานวณพนท

ปฏบตตาม6.1.1

6.2 ใสH2Oในbeakerตมใหเดอดนาตวอยางทใชเพอทดสอบmigrationใสลงไปตมเปนเวลา

10minใชคมคบตวอยางออกมาวางทงไวใหเยนทอณหภมหอง

6.3 ตวอยางหวนมยาง ตดแบงเปน 2 สวนตามแนวตง ตวอยางอนตดเปนชนเลกๆ ใหมขนาด

พอเหมาะเพอใสในflaskขนาด250mlแลววางไวใหแหงในทปลอดฝน


7.1.1 ชงชนทดสอบทเตรยมไวตามขอ6.3ใหละเอยดถง0.0001gลงในflaskใสสารละลาย

food stimulants (5.4) ในอตราสวนพนทผวตอปรมาตร 1 cm2: 2 ml ปดฝา

นาไปวางในตอบรอนหรอตควบคมอณหภมท40± 2oCเปนเวลา24hrคบชน

ทดสอบออก สารละลายทเหลอใน flask วางทงไวใหเยนทอณหภมหองใชเปน

testsolution

7.1.2 นาtestsolutionมาเขยาเบาๆใหผสมกนกอนเทใสในกรวยแยกใสdichloromethane

50 ml เขยาตอเนองเปนเวลา 1 min ทงไวใหแยกชน ปลอยของเหลวชนลาง

(dichlorometane) ใหไหลผาน anhydrous sodium sulfate (5.3) ลงสภาชนะ

ทใชระเหย

7.1.3 ทาซาตามขอ7.1.2อกครงลางanhydroussodiumsulfateดวยdichloromethane

เกบสารละลายทไดทงหมดรวมกนในภาชนะทใชระเหย

7.1.4 ระเหยสารละลายทไดอยางระมดระวงจนเกอบแหงดวยเครองระเหยสญญากาศ

ถายใสvolumetricflaskลางและปรบปรมาตรเปน5mlดวยacetonitrileกรองดวย


หมายเหต ในขนตอนการการสกด และทาใหเขมขน อาจใช concentration column ท

เหมาะสมแทนการสกดดวยdichroromethane

114


7.1.5เตรยมblankโดยปเปตสารละลายfoodstimulantลงในflaskปรมาตรเทากบทใช

ทดสอบตวอยางและปฏบตตาม7.1.1-7.1.4โดยไมมตวอยาง



column: stainless steel 250 x 4.6 mm packed with reversed phase C8

(e.g.SpherisorbC8),particlesize5µm

mobilephase:EluteA:1%acetonitrileinH2OและEluteB:acetonitrile

gradientprogramme

Time(min) %EluteA %EluteB

0to2 70 30


17to22 10 90


25to28orlonger 70 30

injectionvolume:20µl flowrate:1ml/min

detector: UV 280, Diode array spectrum from 240-360 nm, Detector

programmingfromtime12mintotime25min

กรณใชคอลมนชนดอน ปรบสภาวะการใชงานใหเหมาะสมกบชนดของคอลมนทใช

เพอวเคราะหปรมาณ Antioxidant BHT และ Antioxidant 2246 ไดทระดบความ

เขมขนนอยทสด(detectionlimit)0.1mg/L

7.2.2 ฉดworkingstandardsolutionในขอ5.5.1ระดบความเขมขนละ3ครงคานวณ

คาเฉลยของpeakarea

7.2.3 ฉดสารละลายตวอยางและblankเปรยบเทยบretentiontime(RT)กบสารมาตรฐาน

กรณตรวจพบ antioxidants RT ตองอยในตาแหนงดยวกน เตรยมกราฟมาตรฐาน

โดยฉดworkingstandardsolutionทมความเขมขนไมนอยกวา5ระดบสรางกราฟ

ความสมพนธ ระหวาง peak area กบ ความเขมขนของ antioxidant โดยคา

correlationcoefficient(r)≥0.997และหาปรมาณเทยบกบกราฟมาตรฐาน

7.3 การตรวจยนยน

ยนยนantioxidantsทตรวจพบในtestsolutionดวยUV-spectrumจากการวดดวยdiode

array detector เปรยบเทยบกบสารมาตรฐาน และตรวจเพมเตมดวยวธ thin layer

chromatography(TLC)หรอgasliquidchromatography(GLC)

115


8. การคำานวณและการรายงานผล (Calculation and expression of results) 8.1 คานวณปรมาณAntioxidantBHTและAntioxidant2246จากสตร

2(CxV) M = A

เมอM = ปรมาณAntioxidantในตวอยาง(µg/dm2)

C= ความเขมขนของ antioxidant ในสารละลายตวอยางทอานไดจากกราฟ

มาตรฐาน(µ µg/ml) V= ปรมาตรของสารละลายตวอยาง(5ml)

A= พนทผวชนทดสอบ(testspecemens)ทใช(dm2)

8.2รายงานผลหนวยเปนmg/dm2ทศนยม1ตาแหนง

8.2.1 รายงานผลการวเคราะหปรมาณ antioxidants จากการทดสอบ migration โดย

foodsimulantทง2ชนด

8.2.2 ผลการทดสอบmigrationรายงานจากคาเฉลยในการทดสอบตวอยาง2ซา



ทRTตรงกบpeakของAntioxidantBHTและAntioxidant2246

9.3 วเคราะหspikedfoodsimulantเพอประเมน%recoveryทกครงททาการวเคราะหเกณฑ%

recovery Antioxidant BHT ทระดบความเขมขน 60µg/dm2 หรอ 30 µg/100 ml (ระดบคามาตรฐาน) และ Antioxidant 2246 ทระดบความเขมขน 30 µg/dm2 หรอ

15 µg/100ml(ระดบคามาตรฐาน)อยในชวง80–110%

10. รายละเอยดอน10.1 การทดสอบ migration (migration test) หมายถง การดาเนนการเพอกระตนใหเกดการ

เคลอนยายของสารออกมาจาก ตวอยางลงสสารละลายทใชทดสอบซงเปนตวแทนอาหาร


10.2 ตามเอกสารอางองCommissionregulation(EU)No10/2011(AnnexIII)กาหนดให

3%aceticacid(w/v)inaqueoussolution(foodsimulantB)เปนอาหารจาลองตวแทน

อาหารทมpH≤≤4.5และ50%ethanol(v/v)inaqueoussolution(foodsimulantD1)

เปนอาหารจาลองตวแทนอาหารนม


1. นายปรชาจงสมานกล ผเชยวชาญเฉพาะดานสขลกษณะการผลต


2. นายทนงพนธสจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

3. นางลดาพรรณแสงคลาย นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

4. นางดวงดาววงศสมมาตร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

5. นางสาวอรารตนวฒกรภณฑ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

6. นางอชฌาสจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

7. นางลดาวลยจงสมานกล นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

8. นางสาวอารณศรพรหม นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

9. นางสาวมณฑนาพนธบวหลวง นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

10. นายสมภพวฒนมณ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

11. นางสาวกรณาตรสมทธ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

12. นางปยมาศแจมศร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

วธมาตรฐานทางจลชววทยาสำาหรบการวเคราะหอาหาร


119


นยามและคำายอ (Definition and Abbreviation)

1. อาหาร หมายถงอาหารทคนสามารถบรโภคได และใหหมายความรวมถงเครองดม ยกเวน

ทกาหนดไวเฉพาะในวธนนๆ

2. นาหมายถงนาสาหรบอปโภคและบรโภครวมทงนาในสงแวดลอมแตไมรวมนาเสย

3. Dilutionหมายถงการเจอจางของตวอยาง

4. นากรองหมายถงนาทมคณสมบตเทยบเทานากลนหรอdeionizedwater

5. คายอทใชและคาเตมแสดงในตาราง


CFU colonyformingunit

MPN mostprobablenumber

EAPC estimatedaerobicplatecount

TNTC toonumeroustocount

H2S hydrogensulphide

วธมาตรฐานทางจลชววทยาสำาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

Method รหสวธ ชนดอาหาร รายการ หนา Type

DMScF2009 อาหาร ยสตและรา Ι 121

DMScF2010 อาหาร Vibrio cholerae Ι 131

DMScF2011 อาหาร Vibrio parahaemolyticus Ι 147

DMScF2012 อาหาร MPN Vibrio parahaemolyticus Ι 163

DMScF2013 อาหาร จานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมด Ι 179

DMScF2014 นาและนาแขง จานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมด Ι 187

121



วธนใชในการตรวจวเคราะหยสตและราในอาหารครอบคลมการตรวจปรมาณ(enumeration)

2. เอกสารอางอง (Normative reference)

U.S.FoodandDrugAdministration.BacteriologicalAnalyticalManual,2001,Chapter18

“Yeasts,MoldsandMycotoxins”.[ออนไลน].2001;[สบคน25กรกฎาคม2557].เขาถงไดท

http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm071435.htm.

3. นยามศพทและคำายอ (Term and abbreviation)

-


ยสตและราสวนใหญตองการออกซเจนในการเจรญเตบโต(obligateaerobes)เจรญไดทอณหภม

10-35oCความเปนกรด-ดางระหวาง2-9ปรมาณนาอสระ(wateractivity)เทากบหรอนอยกวา

0.85 การตรวจนบจานวนยสตและราทาไดโดยเจอจางตวอยางดวยสารละลายสาหรบเจอจาง 10

เทาตามลาดบ (serial ten-fold dilutions) ใหไดความเขมขนของสารละลายตวอยางทเหมาะสม

ใสในอาหารเลยงเชอเฉพาะ(สวนใหญจะใสสารยบยงการเจรญของแบคทเรย)บมเพาะเชอทอณหภม

25oC5-7วนนามานบจานวนและคานวณจานวนยสตและราตอตวอยาง1กรมหรอมลลลตร

DMSc F 2009 : วธตรวจวเคราะหยสตและราในอาหาร โดยวธ pour plate

และ spread plate

Analytical method of yeasts and molds in food

by pour plate and spread plate

122


การตรวจปรมาณแบบdilutionplatingtechniqueม2วธคอpourplateและspreadplate

4.1 วธpourplate

นาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสม(1:10หรอ1:100,…)ปเปตลงบนจาน

เพาะเชอเทดวยอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงผสมใหเขากนตงทงไวใหวนแขงนาไปบม

นบจานวนโคโลนทมลกษณะเฉพาะ

4.2 วธspreadplate

นาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสม(1:10หรอ1:100,…..)ปเปตลงบน

ผวหนาอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง ใชแทงแกวงอเกลยใหทวจนกระทงผวหนาของ

วนแหงนาไปบมนบจานวนโคโลนทมลกษณะเฉพาะ

5. อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents): ภาคผนวก1

5.1 อาหารเลยงเชอ

5.1.1 Dichloranrosebengalchloramphenicol(DRBC)agar

5.1.2Dichloran18%glycerol(DG18)agar

5.1.3Platecountagar(PCA)ผสมchloramphenicol100มลลกรมตอลตร

5.1.4สารละลายสาหรบเจอจาง(diluent)ไดแก0.1%peptonewater

5.2 สารเคม

5.2.1 Chloramphenicol

5.2.2 Glycerol

6. เครองมอและเครองใช (Equipment and materials)

6.1 เครองมอ

6.1.1 เครองนงทาลายเชอ(autoclave)121± 3oC

6.1.2 เครองชง(balance)

6.1.3 เครองบดปน(blender)หรอเครองตผสมอาหาร(stomacher)

6.1.4 เครองนบโคโลน(colonycounter)

6.1.5 ตอบเพาะเชอ(incubator)25oC

6.1.6 เครองวดความเปนกรด-เบส(pH-meter)

6.1.7 เครองผสม(vortexmixer)

6.1.8 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)45± 1oC

123


6.2 เครองใช

6.2.1 โถปน(blenderjar)หรอถงตผสมอาหาร(stomacherbag)

6.2.2 ขวดรปชมพ(flask)หรอขวดแกวฝาเกลยว

6.2.3 แทงแกวงอ(glassspreader)

6.2.4 จานเพาะเชอ(petridish)

6.2.5 ปเปต(pipette)

7. ขนตอนการทดสอบ (Procedures)

7.1 การสมตวอยาง(Sampling)

7.1.1 กรณทตวอยางเปนของแขง ตดตวอยางจากหลายๆ ตาแหนงใหเปนชนเลกๆ ผสม

ใหเขากนกรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทวสมตวอยาง25-50กรม

ใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.2กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทหรอ

ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆ กนใสในภาชนะปราศจากเชอ

ไมนอยกวา100มลลลตรและเขยาใหเขากน(ตวอยางเรมตน)

7.2 การเตรยมตวอยาง(Preparationoftestsample)

เจอจางตวอยางตามลาดบๆละ10เทาดวยสารละลายสาหรบเจอจางดงน

7.2.1 กรณ7.1.1เทสารละลายสาหรบเจอจางลงในตวอยางใหไดตวอยางทเจอจาง1:10

ผสมใหเขากนโดยใชเครองบดปน 30-60 วนาท หรอเครองตผสมอาหาร 2 นาท

(initialsuspensionหรอprimarydilution)

7.2.2 กรณ7.1.2ปเปตตวอยาง10มลลลตรใสในสารละลายสาหรบเจอจาง90มลลลตร

เขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:10(initialsuspensionหรอprimarydilution)

7.2.3 ปเปตตวอยางทเจอจาง 1:10 มา 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง

90มลลลตรเขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:100ทาเชนนตอไปจนไดตวอยาง

ทเจอจางตามตองการ

7.3 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธpourplate:ภาคผนวก2

7.3.1 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทระดบความเจอจาง 1:10 หรออนๆ ตาม

ความเหมาะสม1มลลลตรลงในจานเพาะเชอระดบความเจอจางละ3จานเพาะเชอ

(triplicate)

124


7.3.2 เท PCAผสม chloramphenicol หรอ DG18 agar ประมาณ20-25มลลลตร

ลงในแตละจานเพาะเชอผสมใหเขากนตงทงไวใหวนแขง

7.3.3 บมท 25oC 5 วน โดยไมตองควาจานเพาะเชอ และวางซอนกนไมเกน 3 จาน

เพาะเชอเมอครบ5วนถาไมมการเจรญของเชอใหบมตออก48ชวโมง

7.3.4 นบจานวนโคโลนในจานเพาะเชอทมเชอเจรญ10-150โคโลน(ในกรณทมปรมาณ

ราจานวนมากจานวนโคโลนสงสดทเหมาะสมในการนบอาจนอยกวา150โคโลน)

7.4 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธspreadplate:ภาคผนวก3

7.4.1 เทDRBCagarหรอDG18agarหรอPCAผสมchloramphenicolลงในจาน

เพาะเชอ หมนใหอาหารเลยงเชอกระจายทว ตงทงไวใหวนแขง แลวทาใหผวหนา

วนแหง


ความเหมาะสม0.1มลลลตรลงบนผวหนาDRBCagarหรอDG18agarหรอ

PCAผสมchloramphenicolระดบความเจอจางละ3จานเพาะเชอ(triplicate)ใช

แทงแกวงอเกลยใหทวจนกระทงผวหนาของวนแหง

7.4.3บมท 25oC 5 วน โดยไมตองควาจานเพาะเชอ และวางซอนกนไมเกน 3 จาน

เพาะเชอเมอครบ5วนถาไมมการเจรญของเชอใหบมตออก48ชวโมง

7.4.4 นบจานวนโคโลนในจานเพาะเชอทมเชอเจรญ10-150โคโลน(ในกรณทมปรมาณ

ราจานวนมากจานวนโคโลนสงสดทเหมาะสมในการนบอาจนอยกวา150โคโลน)

หมายเหต: 1. อาหารเลยงเชอ DG 18 agar ใชไดเฉพาะตวอยางมปรมาณนาอสระ

(wateractivity)นอยกวา0.95

2. อาหารเลยงเชอ PCA ผสม chloramphenicol ไมเหมาะสาหรบตวอยาง

ทมราชนดspreadermolds

3. ระยะเวลาตงแตสนสดการทา initial suspension หรอ primary dilution

จนกระทงเทว นหรอเกลยตวอยางบนจานเพาะเชอ ไมควรนานเกน

20นาท(ทเหมาะสมควรภายใน10นาท)

4. ไมเคลอนยายจานเพาะเชอจนกวาจะทาการนบจานวน

125


8. การคำานวณ (Calculation of results)

คานวณจานวนยสตหรอราเปนคาเฉลยของการนบโคโลนจาก 3 จานเพาะเชอ และคณดวย

ระดบความเจอจางตาสด

ตวอยาง การตรวจโดยใชปรมาตร 1 มลลลตร (โดยวธ pour plate) ทระดบความเจอจาง

1:100นบจานวนโคโลนจาก3จานเพาะเชอได18,20และ22

จานวนยสตหรอราCFU/กรม = คาเฉลยโคโลนทนบไดxระดบความเจอจางตาสด

= 20x100

= 2,000

ตวอยาง การตรวจโดยใชปรมาตร0.1มลลลตร(โดยวธspreadplate)ทระดบความเจอจาง

1:100นบจานวนโคโลนจาก3จานเพาะเชอได18,20และ22

จานวนยสตหรอราCFU/กรม = คาเฉลยโคโลนทนบไดxระดบความเจอจางตาสดx10

= 20x100x10

= 20,000

9. การรายงานผลการทดสอบ (Test report)9.1 จานวนยสตCFU/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)

9.2 จานวนราCFU/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)

9.3 จานวนยสตและราCFU/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)

9.4 กรณทไมพบโคโลนยสตและรา

ใชตวอยาง1มลลลตร(โดยวธpourplate) รายงานเปนนอยกวา1xระดบความเจอจางแรกททดสอบ

ใชตวอยาง0.1มลลลตร(โดยวธspreadplate) รายงานเปนนอยกวา1xระดบความเจอจางแรกททดสอบx10

9.5 รายงานผลเปนตวเลขนยสาคญสองตาแหนง ตวเลขตงแตตาแหนงทสามขนไปใหปรบเปน

เลขศนยและเพมตวเลขตาแหนงทสองขนหนงอนดบเมอตวเลขตาแหนงทสามเปน6,7,8,

9 และคงตวเลขตาแหนงทสองไวเชนเดม เมอตวเลขตาแหนงทสามเปน 1, 2, 3, 4

แตถาตาแหนงทสามเปน5ตองดตวเลขตาแหนงทสองหากตวเลขตาแหนงทสองเปนเลขค

ใหคงตวเลขตาแหนงทสองไวเชนเดม แตถาตวเลขตาแหนงทสองเปนเลขค ใหเพมตวเลข

ตาแหนงทสองขนหนงอนดบ

126


ตวอยาง: 456 รายงานเปน 460

454 รายงานเปน 450



10. รายละเอยดอน (Supplementary notes)

10.1 ภาคผนวก1 : อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

10.2 ภาคผนวก2 : แผนภมท 1 การตรวจปรมาณ (enumeration) ยสตและราในอาหาร

โดยวธpourplate

10.3 ภาคผนวก3 : แผนภมท 2 การตรวจปรมาณ (enumeration) ยสตและราในอาหาร

โดยวธspreadplate

127


ภาคผนวก 1

อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents)

อาหารเลยงเชอกรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ

1. Dichloranrosebengalchloramphenicol(DRBC)agar

Glucose 10 กรม

Bacteriologicalpeptone 5 กรม

Potassiumphosphatemonobasic 1 กรม

Magnesiumsulfateheptahydrate 0.5 กรม

Rosebengal(5%soln.,w/v) 0.5 มลลลตร

Dichloran(0.2%inethanol,w/v) 1 มลลลตร

Agar 15 กรม

Chloramphenicol 0.1 กรม

นากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร

ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจนวนละลาย ฆาเชอท

121oC15นาทpH5.6

2. Dichloran18%glycerol(DG18)agar


Peptone 5 กรม

Potassiumphosphatemonobasic 1 กรม

Magnesiumsulfateheptahydrate 0.5 กรม

Dichloran(0.2%inethanol,w/v) 1 มลลลตร

Agar 15 กรม


นากลนหรอนากรอง 800 มลลลตร

ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 800 มลลลตร ปรบปรมาตรใหได 1,000 มลลลตร

เตมglycerol220กรมใหความรอนจนวนละลายฆาเชอท121oC15นาทpH5.6

128


3. Platecountagar(PCA)ผสมchloramphenicol

3.1 Basemedium

Tryptone 5 กรม

Yeastextract 2.5 กรม

Dextrose 1 กรม

Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร

3.2 Stockantibioticsolution



ละลายChloramphenicolในนากลนหรอนากรอง40มลลลตร

การใชงาน

เตมStockantibiotic solution(ขอ3.2)40มลลลตรลงในBasemedium(ขอ3.1)

960 มลลลตร ผสมใหเขากน ใหความรอนจนวนละลาย ฆาเชอท 121oC 15 นาท

pH7.0±0.2

4. 0.1%Peptonewater

Peptone 1 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอด หรอขวดตามปรมาตร

ทตองการฆาเชอท121oC15นาทpH7.0±0.2

129



ตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม(1:10หรอ1:100,…..)

เทDG18หรอPCAผสมchloramphenicol20-25มลลลตร

นบจานวนโคโลน(10-150โคโลน)

คานวณ

รายงานผล

แผนภมท 1 การตรวจปรมาณ(enumeration)ยสตและราในอาหาร

โดยวธpourplate

1มลลลตร(triplicate)

25oC5-7วน

130




DRBCหรอDG18หรอPCAผสมchloramphenicol


คานวณ


แผนภมท 2 การตรวจปรมาณ(enumeration)ยสตและราในอาหาร

โดยวธspreadplate

0.1มลลลตร(triplicate)

25oC5-7วน

131



วธนใชในการตรวจวเคราะหVibrio cholerae ในอาหารครอบคลมการตรวจหา(detection)


ISO/TS21872-1:2007/Cor.1:2008.Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-Horizontal

methodforthedetectionofpotentiallyenteropathogenicVibriospp.-Part1:Detectionof

Vibrio parahaemolyticus andVibrio cholerae.


V. cholerae = Vibrio cholerae


V. choleraeเปนแบคทเรยแกรมลบรปรางเปนทอนตรงหรอทอนโคงเคลอนทไดดวยแฟลกเจลลา

ทปลายเซลล ไมสรางสปอร สรางเอนไซม oxidase สามารถเปลยนนาตาลกลโคสเปนกรดโดย

ไมสรางกาซสามารถเจรญไดในสภาวะทมเกลอ0-2%เชอนพบไดปรมาณนอยและมกพบรวมกบ

Vibrionaceaefamilyหรอfamilyอนๆทมปรมาณมากดงนนการตรวจหา V. cholerae จงจาเปน

ตองทาขนตอนselectiveenrichmentตอเนองกน2ครง

การตรวจหาV. cholerae มขนตอนสาคญ4ขนตอนดงน

4.1 การเพมปรมาณเชอขนตน (first selective enrichment) เปนขนตอนทใชอาหารเลยง

เชอจาเพาะชนดเหลวระยะเวลาการบมสนเพอให V. cholerae ทมจานวนนอยหรอบาดเจบ

ไดฟนตวขณะทเชออนถกยบยง

4.2 การเพมปรมาณเชอขนทสอง (secondary selective enrichment) เปนขนตอนทใชอาหาร

เลยงเชอจาเพาะชนดเหลว บมขามคน เพอให V. cholerae ทฟนตวสามารถเจรญเพม

จานวนขนขณะทเชออนถกยบยง

DMSc F 2010 : วธตรวจวเคราะห Vibrio cholerae ในอาหาร

Analytical method of Vibrio cholerae in food

132


4.3 การแยกเชอ(isolation)บนอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขง

4.4 การตรวจยนยน(confirmation)นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะตรวจยนยนเบองตนตรวจยนยน

ทางชวเคมและนาเหลองวทยา



5.1.1 Alkalinesalinepeptonewater(ASPW)

5.1.2 Salinemediumfordetectionofargininedihydrolase(ADH)

5.1.3 Salinemediumfordetectionofindole(tryptone-tryptophansalinemedium)

5.1.4 Salinemediumfordetectionoflysinedecarboxylase(LDC)

5.1.5 Salinemediumfordetectionofornithinedecarboxylase(ODC)

5.1.6 Salinenutrientagar(SNA)

5.1.7 0%,2%,6%,8%และ10%salinepeptonewaters

5.1.8 Salinetriplesugariron(TSI)agar

5.1.9 Thiosulfate citrate bile and sucrose (TCBS) agar และอาหารเลยงเชอจาเพาะ

ชนดแขงอกหนงชนดเชนSoyapeptonetriphenyltetrazoliumchorideagar(TSAT),

Sodiumdodecylsulfatepolymyxinsucroseagar(SDSPS)หรออนๆ


5.2.1 β-galactosidasereagent 5.2.2 Gramstainreagents

5.2.3 Kovacs’reagent

5.2.4 Oxidasereagent

5.2.5 Polyvalent V. cholerae O1antiserum

5.2.6 PolyvalentV. cholerae O139antiserum

5.2.7 Sterilemineraloil

5.2.8 Toluene

5.2.9 V. choleraeInabaantiserum

5.2.10V. cholerae Ogawaantiserum

5.2.11นาเกลอ0.85%และ1%

133






6.1.3 ตอบเพาะเชอ(incubator)37± 1oC

6.1.4 ตอบเพาะเชอ(incubator)หรออางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)

41.5 ± 1oC

6.1.5 กลองจลทรรศน(microscope)


6.1.7 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)37± 1oCและ44-50oC


6.2.1 แผนกระจกทบหนา(coverslip)


6.2.3 แผนกระจก(glassslide)

6.2.4 หวงและเขมเขยเชอ(loopandneedle)



6.2.7 หลอดทดลอง(testtube)

6.2.8 ตะแกรงหลอดทดลอง(testtuberack)

7. ขนตอนการทดสอบ (Procedures): ภาคผนวก2

7.1การสมตวอยาง(Sampling)


ใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทว สมตวอยางตามปรมาณ

ทตองการเชน25กรมใสในภาชนะปราศจากเชอ


ปเปตตวอยางจากแตละภาชนะปรมาตรเทาๆ กน ใสในภาชนะปราศจากเชอ

ไมนอยกวา 100 มลลลตร เขยาใหเขากน และสมตวอยางตามปรมาตรทตองการ

เชน25มลลลตรใสในภาชนะปราศจากเชอ

134


7.1.3กรณทตองการลดปรมาณงานสาหรบตวอยางรนเดยวกน (same batch) สามารถ

นาตวอยางทดสอบมารวมกนเชนการตรวจวเคราะห10ตวอยางใหสมตวอยางละ

25กรมรวมเปน250กรม

7.2 ขนตอนการเพมปรมาณเชอขนตน(firstselectiveenrichment)

เตม ASPW ปรมาตร 9 เทาของปรมาณตวอยาง เชน เตม ASPW 225 มลลลตร

ลงในตวอยาง25กรม เขยาใหเขากน (initial suspension)บมท 37oC6± 1ชวโมง

สาหรบอาหารแชเยอกแขง อาหารแหง หรออาหารดองเกลอ สวนอาหารสดบมท 41.5oC

6 ±1ชวโมงถาไมสามารถบมใหครบ6 ± 1ชวโมงภายในวนเดยวกน ใหเกบ initial

suspensionท5± 3oCแลวเรมบมในวนรงขน

7.3 ขนตอนการเพมปรมาณเชอขนทสอง(secondselectiveenrichment)

ปเปต1มลลลตรบรเวณผวหนาจากขอ7.2ใสใน ¬ASPW10มลลลตรบมท41.5oC

18±1ชวโมง

7.4 ขนตอนการแยกเชอ(isolation)

7.4.1 นา1loopจากบรเวณผวหนาอาหารเลยงเชอขอ7.2และ7.3ขดบนTCBSagar

และอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงอนอกหนงชนดชนดละ1จานเพาะเชอ

7.4.2 บมท 37oC 24 ± 3 ชวโมง (อาหารเลยงเชออนบมตามคาแนะนาของผผลต)

ลกษณะโคโลนเฉพาะของVibrio cholerae

TCBSagarโคโลนผวเรยบสเหลองขนาดเสนผานศนยกลาง2-3มลลเมตร

อาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงอนเปนไปตามคาแนะนาของผผลต

7.4.3 เลอกโคโลนลกษณะเฉพาะหรอโคโลนทสงสยอยางนอย5โคโลนจากอาหารเลยงเชอ

แตละชนดกรณนอยกวา5โคโลนใหเลอกทงหมดขดบนSNAplateหรอSNAslant

บมท37oC24±3ชวโมง

7.5 ขนตอนการตรวจยนยน(confirmation)

7.5.1 การตรวจยนยนเบองตน

นาเชอจากSNAplateหรอSNAslant(ขอ7.4.3)ทดสอบดงน

oxidasetest

นาเชอขดบนกระดาษกรองทหยด oxidase reagent (ไมใชหวงนเกล-โครเมยม

หรอลวดโลหะ)

135


ผลบวก: กระดาษกรองเปลยนเปนสมวงออนมวงหรอมวงเขมภายใน

10วนาท

ผลลบ : กระดาษกรองไมเปลยนส

V. choleraeใหผลบวก

microscopicexamination

- การยอมสแกรม

V. cholerae เปนแบคทเรยแกรมลบ (สแดง) รปทอนตรง หรอทอนโคง

ไมสรางสปอร

- motilitytest

นาเชอ1loopใสในASPWบมท37oC1-6ชวโมงหยดASPWลงบน

แผนกระจก ปดทบดวยแผนกระจกทบหนา ดการเคลอนทของเชอภายใต

กลองจลทรรศน

ผลบวก: เชอเคลอนทได

ผลลบ : เชอไมเคลอนท


7.5.2 การตรวจยนยนทางชวเคมและนาเหลองวทยา

เขยเชอจากSNAslantหรอSNAplateในขอ7.4.3ทใหผลตรวจยนยนเบองตน

ทสงสยวาเปนV. choleraeนาไปทดสอบดงน

7.5.2.1 การตรวจยนยนทางชวเคม:ภาคผนวก3

การทดสอบดวยSalineTSIagar

ขดเชอบนผวหนา slant และ stab ในสวนของ butt บมท 37oC

24 ±3ชวโมง

butt

- สเหลอง(ใชนาตาลglucose)

- สแดงหรอไมเปลยนส(ไมใชนาตาลglucose)

- สดา(สรางH2S)

- มฟองอากาศหรอรอยแตกของวน(สรางกาซจากนาตาลglucose)

136


slant

- สเหลอง(ใชนาตาลlactoseและ/หรอsucrose)

- สแดงหรอไมเปลยนส(ไมใชทงนาตาลlactoseและsucrose)

V. choleraeใหผลslantสเหลองbuttสเหลองไมสรางH2Sและกาซ

หมายเหต : ระยะเวลาบมเพาะเชอไมควรเกน 24 ชวโมง เพราะ slant ทใหผล

สเหลองอาจเปลยนเปนสแดงหลงจาก24ชวโมง

การตรวจหาornithinedecarboxylase

เขยเชอลงในอาหารเลยงเชอODCบรเวณใตผวหนาแลวทบหนาดวย

sterilemineraloilประมาณ1มลลลตรบมท37oC24±3ชวโมง

ผลบวก: อาหารเลยงเชอขนสมวง

ผลลบ : อาหารเลยงเชอสเหลอง


การตรวจหาL-lysinedecarboxylase

เขยเชอลงในอาหารเลยงเชอ LDC บรเวณใตผวหนา แลวทบหนาดวย





การตรวจหาargininedihydrolase

เขยเชอลงในอาหารเลยงเชอADHบรเวณใตผวหนา แลวทบหนาดวย




V. choleraeใหผลลบ

การตรวจหาβ-galactosidase เขยเชอลงในนาเกลอ1%ปรมาตร0.25มลลลตรหยดtoluene1หยด

เขยาหลอด วางหลอดในอางนาแบบควบคมอณหภม 37oC 5 นาท

เตมβ-galactosidase reagent 0.25 มลลลตร เขยาหลอด บมตอ 24 ±3ชวโมง

137


ผลบวก: เปลยนเปนสเหลอง

ผลลบ : ไมเปลยนส


กรณใชแผนONPGdiscสาเรจรปใหทาตามคาแนะนาของผผลต

การตรวจหาindole

เขยเชอลงใน tryptone-tryptophan saline medium บมท 37oC

24 ± 3ชวโมงเตมkovacs’reagent1มลลลตร

ผลบวก: เกดวงแหวนสแดง

ผลลบ : เกดวงแหวนสเหลอง


การทดสอบhalotolerance

เตรยมsuspensionของเชอและใส1loopลงในsalinepeptonewater

ความเขมขนของเกลอ(NaCl)0%,2%,6%,8%และ10%บมท37oC


ผลบวก: อาหารเลยงเชอขน(มการเจรญของเชอ)

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมขน(ไมมการเจรญของเชอ)

V. cholerae ใหผลบวกในอาหารเลยงเชอทมความเขมขนของ

เกลอ(NaCl)ท0%และ2%

7.5.2.2 การยนยนทางนาเหลองวทยา

7.5.2.2.1เขยเชอทใหผลการตรวจยนยนทางชวเคมแลวแตะบนแผนกระจก

ทสะอาดหยดนาเกลอ0.85%1หยดใชloopผสมใหเขากน

สงเกตการจบกนเปนตะกอน(agglutination)ถามตะกอนแสดง

วาเปนauto-agglutination

7.5.2.2.2ถาไมเกดauto-agglutinationใหทดสอบตอโดยเขยเชอแตะบน

แผนกระจกทสะอาด หยด polyvalent V. cholerae O1

antiserum1หยดผสมใหเขากนเอยงแผนกระจกไปมา30-60

วนาท สงเกตการจบกนเปนตะกอน และทาเชนเดยวกบ

polyvalentV. choleraeO139antiserumถามการจบกนเปน

ตะกอนแสดงวาใหผลบวก

138


กรณการทดสอบpolyvalentV. choleraeO1antiserum ให

ผลบวก อาจทดสอบเชอกบ V. cholerae Inaba antiserum

และ V. cholerae Ogawaantiserum

7.6 การแปลผล

โคโลนทเกดauto-agglutinationหรอโคโลนททดสอบทางชวเคมและ/หรอทางนาเหลองวทยา

แลวใหผลวาเปนหรอสงสยวาเปนV. choleraeใหสงตรวจยนยนทสถาบนวจยวทยาศาสตร

สาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข หรอสถาบนอนทเชอถอได

โดยเกบเชอบนผวหนาของSNAslantเพอสงตรวจ

8. รายงานผลการทดสอบ (Test report)

V. cholerae/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ


9.1 ภาคผนวก1: อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

9.2 ภาคผนวก2: แผนภมการตรวจหา(detection) V. choleraeในอาหาร

9.3 ภาคผนวก3: ตารางแสดงผลการทดสอบทางชวเคมของV. cholerae

139



อาหารเลยงเชอและสารเคม

(Culture media and reagents)


1. Alkalinesalinepeptonewater(ASPW)

Peptone 20 กรม

Sodiumchloride(NaCl) 20 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตร


2. Salinemediumfordetectionofargininedihydrolase(ADH)

Argininemonohydrochloride 5 กรม

Yeastextract 3 กรม

Glucose 1 กรม

Bromocresolpurple 0.015 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบงใสหลอด2-5มลลลตรฆาเชอ

ท121oC15นาทpH6.8±0.2

3. Salinemediumfordetectionofindole(tryptone-tryptophansalinemedium)

Enzymaticdigestofcasein 10 กรม

DL-Tryptophan 1 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอด 5 มลลลตร ฆาเชอ


140


4. Salinemediumfordetectionoflysinedecarboxylase(LDC)

L-Lysinemonohydrochloride 5 กรม


Glucose 1 กรม






5. Salinemediumfordetectionofornithinedecarboxylase(ODC)

l-Ornithinemonohydrochloride 5 กรม


Glucose 1 กรม






6. Salinenutrientagar(SNA)

Meatextract 5 กรม

Peptone 3 กรม


Agar 8-18* กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนจนวนละลายแบงใสขวด

หรอหลอดตามปรมาตรทตองการ ฆาเชอท 121oC 15 นาท pH 7.2 ± 0.2 เอยงหลอด

และปลอยใหวนแขง

*ขนกบความแขงของวน(gelstrengthoftheagar)

141


7. Salinepeptonewaters(0%,2%,6%,8%และ10%)


Sodiumchloride(NaCl) 0,20,60,80หรอ100 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการ

ฆาเชอท121oC15นาทpH7.2±0.2

8. Salinetriplesugariron(TSI)agar





Lactose 10 กรม

Sucrose 10 กรม

Glucose 1 กรม

Iron(III)citrate 0.3 กรม

Phenolred 0.024 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนจนวนละลายแบงใสหลอด

10มลลลตรฆาเชอท121oC15นาทpH7.4±0.2 เอยงหลอดและปลอยใหวนแขง โดย

ใหสวนของbuttสงประมาณ2.5เซนตเมตร

9. Thiosulfatecitratebileandsucrose(TCBS)agar



Sodiumcitrate 10 กรม

Sodiumthiosulfate 10 กรม

Iron(III)citrate 1 กรม


142



Driedbovinebile 8 กรม


Bromothymolblue 0.04 กรม

Thymolblue 0.04 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรตมเดอดจนวนละลายpH8.6±0.2

สารเคม กรณใชสารเคมสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ

1. β-galactosidasereagent 1.1 Buffersolution

Sodiumdihydrogenphosphate(NaH2PO4) 6.9 กรม

Sodiumhydroxide(NaOH),10mol/lsolution 3 มลลลตร

นากลน 50 มลลลตร

(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย)

ละลายNaH2PO4 ในนากลน45มลลลตรปรบpH7.0± 0.2ดวยNaOHแลวปรบปรมาตร

เปน50มลลลตรดวยนากลน

1.2 ONPGsolution

2-ortho-Nitrophenyl 0.08 กรม

β-D-galactopyranoside(ONPG) นากลน 15 มลลลตร

ละลายONPGในนากลนทอณหภมประมาณ50oC


Buffer solution (ขอ 1.1) 5 มลลลตร กบ ONPG solution (ขอ 1.2) 15 มลลลตร

ผสมใหเขากน


143


2. Gramstainreagentsใชชนดสาเรจรป

3. Kovacs’reagent

4-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม

Hydrochloricacid 25 มลลลตร

2-Methybutan-2-ol 75 มลลลตร

ผสมสวนประกอบใหเขากน

4. Sterilemineraloilใชชนดสาเรจรป

5. Oxidasereagent

N, N, N', N'-tetramethyl-p-phenylenediamine 1 กรม

dihydrochloride(C10H16N2.2HCl)


ละลายสวนประกอบในนาเยนกอนใชงาน

6. นาเกลอ0.85%และ1%

Sodiumchloride(NaCl) 8.5หรอ10 กรม

นากลน 1,000 มลลลตร

ละลายNaClในนากลน1,000มลลลตรฆาเชอท121oC15นาทpH7.0±0.2

7. V. choleraeanti-seraใชชนดสาเรจรป

144


ตวอยาง25กรมหรอมลลลตร+ASPW225มลลลตร

1. FIRSTSELECTIVE

2. SECONDSELECTIVE

ASPW10มลลลตร

3. การแยกเชอ(ISOLATION)

4.การตรวจยนยน(CONFIRMATION)

โคโลนทมลกษณะเฉพาะหรอสงสย

ตรวจยนยนเบองตน


ตรวจยนยนทางชวเคมและนาเหลองวทยา

เขยเชออยางนอย5โคโลน/ชนดอาหารเลยงเชอลงบนSNAagar

อาหารแชเยอกแขงหรออาหารแหงหรออาหารดองเกลอ

TCBSagarและอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดอนอกชนดหนง

37oC6±1ชวโมง

1loopful(จากผวหนา)

41.5oC6± 1ชวโมง



และอาหารเลยงเชออนบมตามผผลต


oxidaseบวกตดสแกรมลบ

รปทอนเชอเคลอนทได

อาหารสด

แผนภมการตรวจหา (detection) V. cholerae ในอาหาร


1มลลลตร(จากผวหนา)

145



ตารางแสดงผลการทดสอบทางชวเคมของ V. cholerae

การทดสอบ V. choleraea

(อาหารเลยงเชอทม 1% NaCl)

Oxidase +

Productionofgas(glucose) -

Lactose -

Sucrose +

ODC +

LDC +

ADH -

ONPGhydrolysis +

Productionofindole +

Growthinpeptonewaterwith

0% NaCl +

2% NaCl +

6% NaCl -

8% NaCl -

10%NaCl -

aเครองหมาย+หมายถงใหผลบวก76%ถง89%

147



วธนใชในการตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus ในอาหาร ครอบคลมการตรวจหา

(detection)


ISO/TS21872-1:2007/Cor.1:2008.Microbiologyoffoodandanimalfeedingstuffs-

Horizontal method for the detection of potentially enteropathogenic Vibrio spp.-Part 1:

DetectionofVibrio parahaemolyticus andVibrio cholerae.


V. parahaemolyticus = Vibrio parahaemolyticus


V. parahaemolyticus เปนแบคทเรยแกรมลบรปรางเปนทอนตรงหรอทอนโคงเคลอนทไดดวย

แฟลกเจลลาทปลายเซลลไมสรางสปอรสรางเอนไซมoxidaseสามารถเปลยนนาตาลกลโคสเปน

กรดโดยไมสรางกาซ เปนแบคทเรยทชอบเกลอ(halophilicbacteria)สามารถเจรญไดในสภาวะ

ทมเกลอ2-8%เชอนพบไดปรมาณนอยและมกพบรวมกบVibrionaceaefamilyหรอfamilyอนๆ

ทมปรมาณมาก ดงนนการตรวจหาV. parahaemolyticus จงจาเปนตองทาขนตอน selective

enrichmentตอเนองกน2ครง

การตรวจหาV. parahaemolyticus มขนตอนสาคญ4ขนตอนดงน

4.1 การเพมปรมาณเชอขนตน (first selective enrichment) เปนขนตอนทใชอาหารเลยงเชอ

จาเพาะชนดเหลว ระยะเวลาการบมสน เพอให V. parahaemolyticus ทมจานวนนอยหรอ

บาดเจบไดฟนตวขณะทเชออนถกยบยง

DMSc F 2011 : วธตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus ในอาหาร

Analytical method of Vibrio parahaemolyticus in food

148


4.2 การเพมปรมาณเชอขนทสอง (secondary selective enrichment) เปนขนตอนทใชอาหาร

เลยงเชอจาเพาะชนดเหลว บมขามคน ทาใหV. parahaemolyticus ทฟนตวสามารถเจรญ

เพมจานวนขณะทเชออนถกยบยง


4.4 การตรวจยนยน (confirmation) นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะ ตรวจยนยนเบองตน

และตรวจยนยนทางชวเคม



5.1.1 Alkalinesalinepeptonewater(ASPW)

5.1.2 Salinemediumfordetectionofargininedihydrolase(ADH)

5.1.3 Salinemediumfordetectionofindole(tryptone-tryptophansalinemedium)

5.1.4 Salinemediumfordetectionoflysinedecarboxylase(LDC)

5.1.5 Salinemediumfordetectionofornithinedecarboxylase(ODC)

5.1.6 Salinenutrientagar(SNA)

5.1.7 0%,2%,6%,8%และ10%salinepeptonewaters

5.1.8 Salinetriplesugariron(TSI)agar

5.1.9 Thiosulfate citrate bile and sucrose (TCBS) agar และอาหารเลยงเชอจาเพาะ

ชนดแขงอกชนดหนงเชนSoyapeptonetriphenyltetrazoliumchorideagar(TSAT),

Sodiumdodecylsulfatepolymyxinsucroseagar(SDSPS)หรออนๆ(ไมแนะนา

ใหใชmCPC,CPCและCCagar)



5.2.3 Kovacs’reagent


5.2.5 Sterilemineraloil

5.2.6 Toluene

5.2.7 นาเกลอ1%

149







6.1.4 ตอบเพาะเชอ(incubator)หรออางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)41.5± 1oC



6.1.7 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)37± 1oCและ44-50oC


6.2.1 แผนกระจกทบหนา(coverslip)








7. ขนตอนการทดสอบ (Procedures): ภาคผนวก2



ใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทว สมตวอยางตามปรมาณ

ทตองการเชน25กรมใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.2 กรณทตวอยางเปนของเหลว เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทหรอ


ไมนอยกวา 100 มลลลตร เขยาใหเขากน และสมตวอยางตามปรมาตรทตองการ

เชน25มลลลตรใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.3 กรณทตองการลดปรมาณงานสาหรบตวอยางรนเดยวกน (same batch) สามารถ

นาตวอยางทดสอบมารวมกนเชนการตรวจวเคราะห10ตวอยางใหสมตวอยางละ

25กรมรวมเปน250กรม

150


7.2 ขนตอนการเพมปรมาณเชอขนตน(firstselectiveenrichment)

เตม ASPWปรมาตร9 เทาของปรมาณตวอยาง เชน เตม ASPW225มลลลตร ลงใน

ตวอยาง25กรมเขยาใหเขากน(initialsuspension)บมท37oC6±1ชวโมงสาหรบ

อาหารแชเยอกแขงอาหารแหงหรออาหารดองเกลอสวนอาหารสดบมท41.5oC6± 1

ชวโมงถาไมสามารถบมใหครบ6±1ชวโมงภายในวนเดยวกนใหเกบinitialsuspension

ท5± 3oCแลวเรมบมในวนรงขน

7.3 ขนตอนการเพมปรมาณเชอขนทสอง(secondselectiveenrichment)

ปเปต1มลลลตรบรเวณผวหนาจากขอ7.2ใสในASPW10มลลลตรบมท41.5oC

18±1ชวโมง

7.4 ขนตอนการแยกเชอ(isolation)

7.4.1 นา1loopจากบรเวณผวหนาอาหารเลยงเชอขอ7.2และ7.3ขดบนTCBSagar

และอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงอนอกหนงชนดชนดละ1จานเพาะเชอ

7.4.2 บมท 37oC 24 ± 3 ชวโมง (อาหารเลยงเชออนบมตามคาแนะนาของผผลต)

ลกษณะโคโลนเฉพาะของ Vibrio parahaemolyticus

TCBSagarโคโลนผวเรยบสเขยวขนาดเสนผานศนยกลาง2-3มลลเมตร

อาหารเลยงเชอจาเพาะชนดแขงอนเปนไปตามคาแนะนาของผผลต

7.4.3 เลอกโคโลนลกษณะเฉพาะหรอโคโลนทสงสยอยางนอย5โคโลนจากอาหารเลยงเชอ

แตละชนดกรณนอยกวา5โคโลนใหเลอกทงหมดขดบนSNAplateหรอSNAslant

บมท37oC24±3ชวโมง

151


7.5 ขนตอนการตรวจยนยน(confirmation)


นาเชอจากSNAplateหรอSNAslant(ขอ7.4.3)ทดสอบดงน

oxidasetest

นาเชอขดบนกระดาษกรองทหยดoxidase reagent (ไมใชหวงนเกล-โครเมยม

หรอลวดโลหะ)

ผลบวก : กระดาษกรองเปลยนเปนสมวงออน มวง หรอมวงเขม

ภายใน10วนาท


V. parahaemolyticus ใหผลบวก

microscopicexamination

- การยอมสแกรม

V. parahaemolyticus เปนแบคทเรยแกรมลบ (สแดง) รปทอนตรง หรอ

ทอนโคงไมสรางสปอร

- motilitytest

นาเชอ1loopใสในASPWบมท37oC1-6ชวโมงหยดASPWลงบน

แผนกระจก ปดทบดวยแผนกระจกทบหนา ดการเคลอนทของเชอภายใต

กลองจลทรรศน

ผลบวก : เชอเคลอนทได

ผลลบ : เชอไมเคลอนท

V. parahaemolyticusใหผลบวก

152


7.5.2 การตรวจยนยนทางชวเคม:ภาคผนวก3

เขยเชอจากSNAslantหรอSNAplateในขอ7.4.3ทใหผลตรวจยนยนเบองตน

ทสงสยวาเปนV. parahaemolyticus นาไปทดสอบดงน

การทดสอบดวยSalineTSIagar

ขดเชอบนผวหนาslantและstabในสวนของbuttบมท37oC24± 3ชวโมง

butt

- สเหลอง(ใชนาตาลglucose)

- สแดงหรอไมเปลยนส(ไมใชนาตาลglucose)

- สดา(สรางH2S)

- มฟองอากาศหรอรอยแตกของวน(สรางกาซจากนาตาลglucose)

slant

- สเหลอง(ใชนาตาลlactoseและ/หรอsucrose)

- สแดงหรอไมเปลยนส(ไมใชทงนาตาลlactoseและsucrose)

V. parahaemolyticus ใหผล slant สแดง และ butt สเหลอง ไมสราง H2S

และกาซ

การตรวจหาornithinedecarboxylase

เขยเชอลงในอาหารเลยงเชอ ODC บรเวณใตผวหนา แลวทบหนาดวย sterile

mineraloilประมาณ1มลลลตรบมท37oC24± 3ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขนสมวง


V. parahaemolyticus ใหผลบวก

การตรวจหาL-lysinedecarboxylase

เขยเชอลงในอาหารเลยงเชอ LDC บรเวณใตผวหนา แลวทบหนาดวย sterile





153


การตรวจหาargininedihydrolase

เขยเชอลงในอาหารเลยงเชอ ADH บรเวณใตผวหนา แลวทบหนาดวย sterile




V. parahaemolyticusใหผลลบ

การตรวจหาβ-galactosidase เขยเชอลงในนาเกลอ 1% ปรมาตร 0.25 มลลลตร หยด toluene 1 หยด

เขยาหลอดวางหลอดในอางนาแบบควบคมอณหภม37oC5นาทเตม

β-galactosidasereagent0.25มลลลตรเขยาหลอดบมตอ24± 3ชวโมง

ผลบวก : เปลยนเปนสเหลอง


V. parahaemolyticusใหผลลบ


การตรวจหาindole

เขยเชอลงในtryptone-tryptophansalinemediumบมท37oC24±3ชวโมง

เตมkovacs’reagent1มลลลตร

ผลบวก : เกดวงแหวนสแดง

ผลลบ : เกดวงแหวนสเหลอง


การทดสอบhalotolerance

เตรยม suspension ของเชอ และใส 1 loop ลงใน saline peptone water

ความเขมขนของเกลอ (NaCl) 0%, 2%, 6%, 8% และ 10% บมท 37oC


ผลบวก : อาหารเลยงเชอขน(มการเจรญของเชอ)


V. parahaemolyticus ใหผลบวกในอาหารเลยงเชอทมความเขมขนของเกลอ

(NaCl)2%,6%และ8%

154


7.6 การแปลผล

โคโลนททดสอบทางชวเคมแลวสงสยวาเปน V. parahaemolyticus ใหสงตรวจยนยน

ทสถาบนวจยวทยาศาสตรสาธารณสข กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข

หรอสถาบนอนทเชอถอไดโดยใหเกบเชอบนผวหนาของSNAslantเพอสงตรวจ

8. รายงานผลการทดสอบ (Test report)

V. parahaemolyticus/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)พบหรอไมพบ


9.1 ภาคผนวก1:อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

9.2ภาคผนวก2: แผนภมการตรวจหา(detection) V. parahaemolyticusในอาหาร

9.3ภาคผนวก3:ตารางแสดงผลการทดสอบทางชวเคมของV. parahaemolyticus

155






1. Alkalinesalinepeptonewater(ASPW)






2. Salinemediumfordetectionofargininedihydrolase(ADH)

Argininemonohydrochloride 5 กรม


Glucose 1 กรม




ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอด 2-5 มลลลตร


3. Salinemediumfordetectionofindole(tryptone-tryptophansalinemedium)

Enzymaticdigestofcasein 10 กรม

DL-Tryptophan 1 กรม



ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร แบงใสหลอด 5 มลลลตร ฆาเชอท

121oC15นาทpH7.0±0.2

156


4. Salinemediumfordetectionoflysinedecarboxylase(LDC)

L-Lysinemonohydrochloride 5 กรม


Glucose 1 กรม




ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบงใสหลอด2-5มลลลตรฆาเชอท

121oC15นาทpH6.8±0.2

5. Salinemediumfordetectionofornithinedecarboxylase(ODC)

l-Ornithinemonohydrochloride 5 กรม


Glucose 1 กรม






6. Salinenutrientagar(SNA)


Peptone 3 กรม




ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรใหความรอนจนวนละลายแบงใสขวด

หรอหลอดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121oC15นาทpH7.2±0.2เอยงหลอดและปลอย

ใหวนแขง


157


7. Salinepeptonewaters(0%,2%,6%,8%และ10%)


Sodiumchloride(NaCl) 0,20,60,80หรอ100 กรม




8. Salinetriplesugariron(TSI)agar





Lactose 10 กรม


Glucose 1 กรม

Iron(III)citrate 0.3 กรม

Phenolred 0.024 กรม




10มลลลตรฆาเชอท121oC15นาทpH7.4±0.2เอยงหลอดและปลอยใหวนแขงโดยให

สวนของbuttสงประมาณ2.5เซนตเมตร

9. Thiosulfatecitratebileandsucrose(TCBS)agar



Sodiumcitrate 10 กรม

Sodiumthiosulfate 10 กรม

Iron(III)citrate 1 กรม



158


Driedbovinebile 8 กรม


Bromothymolblue 0.04 กรม






1. β-galactosidasereagent 1.1Buffersolution




(ปรมาณเพยงพอเพอใหไดปรมาตรสดทาย)

ละลายNaH2PO4 ในนากลน45มลลลตรปรบpH7.0±0.2ดวยNaOHแลวปรบปรมาตร

เปน50มลลลตรดวยนากลน

1.2ONPGsolution

2-ortho-Nitrophenyl 0.08 กรม

β-D-galactopyranoside(ONPG) นากลน 15 มลลลตร



Buffer solution (ขอ 1.1) 5 มลลลตร กบ ONPG solution (ขอ 1.2) 15 มลลลตร




159


3. Kovacs’reagent

4-Dimethylaminobenzaldehyde 5 กรม

Hydrochloricacid 25 มลลลตร

2-Methybutan-2-ol 75 มลลลตร

ผสมสวนประกอบใหเขากน

4. Sterilemineraloilใชชนดสาเรจรป

5. Oxidasereagent


Dihydrochloride(C10H16N2.2HCl)



6. นาเกลอ1%



ละลายNaClในนากลน1,000มลลลตรฆาเชอท121oC15นาทpH7.0±0.2

160



แผนภมการตรวจหา (detection) V. parahaemolyticus ในอาหาร

ตวอยาง25กรมหรอมลลลตร+ASPW225มลลลตร

1. FIRSTSELECTIVE

ENRICHMENT

2. SECONDSELECTIVE

ENRICHMENT

3. การแยกเชอ

(ISOLATION)

ASPW10มลลลตร

4.การตรวจยนยน(CONFIRMATION)

โคโลนทมลกษณะเฉพาะหรอสงสย

ตรวจยนยนเบองตน


ตรวจยนยนทางชวเคม

เขยเชออยางนอย5โคโลน/ชนดอาหารเลยงเชอลงบนSNAagarหรอslant

อาหารแชเยอกแขงหรออาหารแหงหรออาหารดองเกลอ

TCBSagarและอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดอนอกชนดหนง


1loopful(จากผวหนา)




และอาหารเลยงเชออนบมตามผผลต


oxidaseบวกตดสแกรมลบ

รปทอนเชอเคลอนทได

อาหารสด

1มลลลตร(จากผวหนา)

161



การทดสอบ V. parahaemolyticusa

(อาหารเลยงเชอทม 1% NaCl)

Oxidase +

Productionofgas(glucose) -

Lactose -

Sucrose -

ODC +

LDC +

ADH -

ONPGhydrolysis -

Productionofindole +

Growthinpeptonewaterwith

0%NaCl -

2%NaCl +

6%NaCl +

8%NaCl +

10%NaCl -

aเครองหมาย+หมายถงใหผลบวก76%ถง89%

ตารางแสดงผลการทดสอบทางชวเคมของ V. parahaemolyticus

163


1. ขอบขาย (Scope) วธนใชในการตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus ในอาหาร ครอบคลมการตรวจปรมาณ

(enumeration)

2. เอกสารอางอง (Normative reference) 2.1 U.S.FoodandDrugAdministration.BacteriologicalAnalyticalManual,2004,Chapter9

“Vibrio”.[ออนไลน].2004;[สบคน25กรกฎาคม2557].เขาถงไดทhttp://www.fda.

gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm070830.htm.

2.2 U.S. Food and Drug Administration. Bacteriological Analytical Manual, 2010,

Appendix2:MostProbableNumberfromSerialDilutions. [ออนไลน].2010;[สบคน

25 กรกฎาคม 2557]. เขาถงไดท http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/

LaboratoryMethods/ucm109656.htm.

3. นยามศพท (Term and abbreviation) V. parahaemolyticus=Vibrio parahaemolyticus

4. หลกการ (Principle) V. parahaemolyticus เปนแบคทเรยแกรมลบรปรางเปนทอนตรงหรอทอนโคง เคลอนทไดดวย

แฟลกเจลลาทปลายเซลลไมสรางสปอรสรางเอนไซมoxidaseสามารถเปลยนนาตาลกลโคสเปน

กรดโดยไมสรางกาซเปนแบคทเรยทชอบเกลอ(halophilicbacteria)

การตรวจหาปรมาณV. parahaemolyticusดวยวธMPNแบงเปน3ขนตอนดงน

4.1 การเพมปรมาณเชอ(enrichment)ในอาหารเลยงเชอจาเพาะชนดเหลวใชตวอยางทเจอจาง

ตามความเหมาะสมอยางนอย3ระดบตดตอกนระดบละ3หลอด


4.3 การตรวจยนยน(confirmation)นาโคโลนทมลกษณะเฉพาะตรวจยนยนทางชวเคม

DMSc F 2012: วธตรวจวเคราะห Vibrio parahaemolyticus

ในอาหาร โดยวธ MPN

Analytical method of Vibrio parahaemolyticus

in food by MPN Technique

164


5. อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents) :ภาคผนวก1 5.1 อาหารเลยงเชอ

5.1.1 Alkalinepeptonewatersinglestrength(APW)และdoublestrength(2xAPW)

5.1.2 Arginineglucoseslant(AGS)

5.1.3 Carbohydrateutilizationbroth(cellobioseและlactose)

5.1.4 Christensen’sureaagar

5.1.5 Motilitytestmedium

5.1.6 Phosphatebufferedsaline(PBS)

5.1.7 Thiosulfatecitratebilesaltsucrose(TCBS)agar

5.1.8 Trypticase(tryptic)soyagar(TSA)

5.1.9 Trypticase(tryptic)soybroth(TSB)

5.1.10 1% Tryptone broth ไมเตมเกลอ (0% NaCl) และเตมเกลอ 3%, 6%, 8%

และ10%(T1N0,T1N3,T1N6,T1N8andT1N10)

5.1.11 API20Ediagnosticstripsandreagents(BioMerieux)




5.2.4 Toluene

5.2.5 นาเกลอ0.85%และ2%

6. เครองมอและเครองใช (Equipment and materials) 6.1 เครองมอ



6.1.3 เครองบดปน(blender)






165


6.2เครองใช








7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure):ภาคผนวก2

7.1การสมตวอยาง(Sampling)

7.1.1 ในกรณทตวอยางเปนอาหารทะเลโดยทวไปสมตวอยาง12ตวสมสวนเหงอกลาไส

และสวนเนอเยอบรเวณผวของลาตวสาหรบอาหารทะเลทมเปลอก(shellfish)เชน

กง กง ป ถาเปนไปไดใหใชทงหมด แตถามขนาดใหญใหเลอกบรเวณตรงกลาง

รวมทงสวนเหงอก และลาไส ผสมใหเขากนโดยใชเครองบดปนนาน 90 วนาท

สมตวอยาง50กรมใสในภาชนะปราศจากเชอ

7.1.2 ในกรณทตวอยางเปนหอย(molluscanshellfish)สมตวอยาง12ตวใสในภาชนะ

ปราศจากเชอ เทสารละลายสาหรบเจอจาง PBS ปรมาตรเทากบนาหนกตวอยาง

ผสมใหเขากนโดยใชเครองบดปนนาน90วนาทจะไดตวอยางเจอจาง1:2

7.1.3 ในกรณทตวอยางเปนผลตภณฑทผานกระบวนการแปรรปเชนแชแขงการทาแหง

หรอผานความรอนสมตวอยาง50กรมใสในภาชนะปราศจากเชอ


เจอจางตวอยางตามลาดบๆละ10เทา(serialten-folddilutions)ดวยสารละลายสาหรบ

เจอจางดงน

7.2.1 กรณ7.1.1และ7.1.3เทสารละลายสาหรบเจอจาง450มลลลตรผสมใหเขากน

โดยใชเครองบดปน 1 นาท ทความเรวรอบ 8,000 รอบตอนาท จะไดตวอยาง

ทเจอจาง1:10

166


7.2.2 กรณ 7.1.2 ชงตวอยางเจอจาง 1:2 จานวน 20 กรม (ไมใชปเปต เนองจากม

ฟองอากาศในตวอยางท เจอจาง 1:2 อาจทาใหได ปรมาตรทไม ถกตอง)

ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง 80 มลลลตร เขยาใหเขากน จะไดตวอยางท

เจอจาง1:10

7.2.3 เจอจางตวอยาง (ขอ 7.2.1 และ 7.2.2) ตามลาดบๆ ละ 10 เทา (เชน

ปเปตตวอยางทเจอจาง 1:10 มา 1 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง

9 มลลลตร เขยาใหเขากน จะไดตวอยางเจอจาง 1:100) ทาเชนนเรอยไปจนได

ตวอยางทเจอจางตามตองการ

7.3 การตรวจปรมาณ(enumeration)

7.3.1 ปเปตตวอยางทระดบความเจอจาง1:10หรออนๆตามความเหมาะสมอยางนอย

3ระดบตดตอกนระดบความเจอจางละ3หลอดโดยทระดบความเจอจาง1:10

ปเปตตวอยาง10มลลลตร(1กรม)ลงใน2xAPW10มลลลตรและตวอยาง

ทระดบความเจอจาง 1:10, 1:100 และ 1:1000 ปเปต 1 มลลลตร ลงใน

APW10มลลลตร

7.3.2 บมขามคนท35± 2oC

7.3.3 เลอกหลอดขนท3ระดบการเจอจางสงสดถายเชอโดยใชหวงเขยเชอจมลงตากวา

ผวหนาอาหารเลยงเชอ1เซนตเมตรแลวขดบนTCBSagar

7.3.4 บมขามคนท35± 2oC

โคโลนทมลกษณะเฉพาะคอ กลม ทบแสง สเขยว หรอนาเงน ขนาดเสนผาน

ศนยกลาง2-3มลลเมตร

7.3.5 เขยโคโลนทมลกษณะเฉพาะหรอโคโลนทสงสยอยางนอย 2 โคโลน ลงใน TSB

และTSAslant(2%NaCl)

7.3.6 บมขามคนท35± 2oCนาไปตรวจยนยนตอไป

7.4 การตรวจยนยนV. parahaemolyticus


นาเชอจากขอ7.3.6ทดสอบทางชวเคมกบอาหารเลยงเชอทมเกลอ2%หรอ3%

ดงตอไปน(อาจใชAPI20Eเปนวธทางเลอกโดยเตรยมcellsuspensionของเชอ

ในนาเกลอ2%)

167


Arginineglucoseslant(AGS)

นาเชอจาก TCBS agar ขดบนผวหนา slant และ stab ในสวน butt ปดฝา

ใหหลวมบมขามคนท35± 2oC

V. parahaemolyticus ใหผล slant เปนดาง (สมวง) และ butt เปนกรด

(สเหลอง) แสดงวาไมสรางเอนไซม arginine dihydrolase และไมเกดกาซ

หรอH2S

การเจรญในอาหารเลยงเชอทมเกลอ

เขยเชอจาก TSB ลงในหลอดอาหารเลยงเชอ T1N0 และ T1N3 บมขามคนท

35 ± 2oC

ผลบวก: อาหารเลยงเชอขน(มการเจรญของเชอ)


V. parahaemolyticusเจรญไดในอาหารเลยงเชอT1N3แตไมเจรญในT1N0

การยอมสแกรม

V. parahaemolyticus เปนแบคทเรยแกรมลบ (สแดง) รปทอนตรง หรอ

ทอนโคงไมสรางสปอร

Motilitytestmedium

เขยเชอจาก TSB แลว stab ใหลกประมาณ 5 เซนตเมตร บมขามคนท

35 ± 2oC

ผลบวก : เชอเจรญออกนอกแนวstab

ผลลบ : เชอเจรญเฉพาะแนวstab


Oxidasetest

นาเชอจาก TSB ขดบนกระดาษกรองทหยด oxidase reagent (ไมใชหวง

นเกล-โครเมยมหรอลวดโลหะ)

ผลบวก :กระดาษกรองเปลยนเปนสมวงเขมภายใน10วนาท



168


7.4.2 การตรวจยนยนทางชวเคม

นาเชอจากขอ7.3.6ทดสอบทางชวเคมกบอาหารเลยงเชอทมเกลอ2%หรอ3%

ดงตอไปน(อาจใชAPI20Eเปนวธทางเลอก)

การทดสอบONPG

เขยเชอลงในนาเกลอ0.85%ปรมาตร0.25มลลลตรหยดtoluene1หยด

เขยาหลอด นาไปบมท 37oC 5 นาท แลวเตมβ-galactosidase reagent 0.25มลลลตรเขยาหลอดบมตอท35-37oCตรวจสอบเปนระยะๆภายใน

24ชวโมง

ผลบวก : เปลยนเปนสเหลอง


V. parahaemolyticus ใหผลลบ


การทดสอบSalt-tolerance

เขยเชอลงในหลอดอาหารเลยงเชอ T1N0, T1N3, T1N6, T1N8 และ T1N10

บมขามคนท35± 2oC

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขน(มการเจรญของเชอ)


V. parahaemolyticus เจรญไดในอาหารเลยงเชอทมเกลอผสมอย 3%, 6%

และ8%

การทดสอบการใชcellobioseและlactose

เขยเชอลงในcarbohydrateutilizationbroth(cellobioseและlactose)บมท

35 ± 2oC24-48ชวโมงถาไมมการเปลยนแปลงใหบมตอจนครบ5วน

ผลบวก : อาหารเลยงเชอขนและเปลยนจากสมวงเปนสเหลอง

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส

V. parahaemolyticus ใหผล cellobiose เปนบวกหรอลบ (variable results)

และใหผลlactoseลบ

การทดสอบUrease

นาเชอแตะบนผวหนาของ urea agar plate หรอ slant บมท 35± 2oC

18-24ชวโมง

ผลบวก : อาหารเลยงเชอเปลยนเปนสชมพแดง

ผลลบ : อาหารเลยงเชอไมเปลยนส

V. parahaemolyticus ใหผลเปนบวกหรอลบ(variableresults)

169


8. การคำานวณ (Calculation of results)

8.1 นาจานวนหลอดทใหผลบวก เปรยบเทยบกบตาราง MPN (ภาคผนวก 3) จะไดคา

MPN/กรมและขดความเชอมนทระดบ95%(95%confidenceintervals)

8.2 กรณจานวนหลอด APW ใหผลบวกไมเปนไปตามตาราง MPN ใหใชสตรคานวณ

(Thomas,1942)ดงน

MPN/กรม = (∑gj)/(∑tjmj ∑(tj-gj)mj)(1/2)

∑gj = จานวนหลอดทงหมดทใหผลบวก

∑(tj-gj)mj = นาหนกรวมเปนกรมของตวอยางในหลอดทใหผลลบ

∑tjmj = นาหนกรวมเปนกรมของตวอยางในหลอดทงหมด

ใหเลอกระดบความเจอจางสาหรบการคานวณโดยเลอกระดบความเจอจางตาสดทใหผลบวก

ไมครบทกหลอด แลวเลอกระดบความเจอจางสงสดทมผลบวกอยางนอย 1 หลอด จากนน

เลอกทกระดบความเจอจางทอยระหวางสองระดบทเลอกไวแลวดงตวอยางขางลาง

ตวอยางท 1ระดบความเจอจาง 1:1 1:10 1:100 1:10001:10000

จานวนหลอดทใหผลบวก 5/5 10/10 4/10 2/10 0/5

ในทนเลอกระดบความเจอจางท1:100และ1:1000จะได

∑gj = 6

∑(tj-gj)mj = (6x0.01)+(8x0.001)

= 0.068

∑tjmj = (10x0.01)+(10x0.001)

= 0.11

แทนคาในสตร

MPN/กรม =6/√√(0.068)(0.11)

= 6/0.086

= 70

170


8.3 กรณไมมผลบวกในตารางMPNใหใชสตรคานวณ

ตวอยางท 2 ระดบความเจอจาง1:10 1:100 1:1000

จานวนหลอดทใหผลบวก2/3 0/3 3/3

ในทนเลอกทงสามระดบความเจอจางจะได

∑∑gj = 5

∑∑∑(tj-gj)mj = (1x0.1)+(3x0.01)+(0x0.001)

= 0.13

∑∑tjmj = (3x0.1)+(3x0.01)+(3x0.001)

= 0.333

แทนคาในสตร

MPN/กรม =5/√√ (0.13)(0.333)= 5/0.208

=24

8.4ในตารางMPN(ภาคผนวก3)ปรมาณตวอยางทใชทดสอบเปน0.1,0.01,0.001กรม

แตถาปรมาณตวอยางทใชทดสอบไมตรงกบตารางใหคณคาMPNและขดความเชอมนดวย

ตวคณททาใหคา MPN สอดคลองกบคาในตาราง เชน ปรมาณตวอยางทใชทดสอบ

เปน0.01,0.001,0.0001กรมใหคานวณคาMPNโดยคณดวย10

ตวอยาง ถาผลทไดจากในตารางเทากบ43ใหคณดวย10จะไดคา

MPN/กรม =43x10=430

9. การรายงานผลการทดสอบ (Test report)

V. parahaemolyticusMPN/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)


10.1 ภาคผนวก1:อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

10.2 ภาคผนวก2:แผนภมการตรวจปรมาณ(enumeration) V. parahaemolyticusในอาหาร

โดยวธMPN

10.3ภาคผนวก3:ตารางMPN3-3-3

171






1. Alkalinepeptonewatersinglestrength(APW)และdoublestrength(2xAPW)

Peptone 10หรอ(2x10) กรม

Sodiumchloride(NaCl) 10หรอ(2x10) กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000มลลลตร สาหรบความเขมขนสองเทา ชงสวน

ประกอบแตละชนดเปนสองเทา ละลายในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตรแบงใสหลอด10

มลลลตรฆาเชอท121oC10นาทpH8.5±0.2

2. Arginineglucoseslant(AGS)

Peptone 5 กรม




Glucose 1 กรม

L-Arginine(hydrochloride) 5 กรม

Ferricammoniumcitrate 0.5 กรม

Sodiumthiosulfate 0.3 กรม


Agar 13.5 กรม



ขนาด13x100มลลเมตร5มลลลตรฆาเชอท121oC10-12นาทpH6.8-7.0เอยงหลอด

และปลอยใหวนแขง

172


3. Carbohydrateutilizationbroth(cellobioseและlactose)

3.1Base

Proteosepeptone 10 กรม


Sodiumchloride(NaCl) 5* กรม

Bromcresolpurple 0.02 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรองฆาเชอท121oC15นาทpH6.8±0.2

3.2 Carbohydratesolutions(cellobioseและlactose)

Carbohydratesolutions(cellobioseหรอlactose) 5 กรม


ละลายนาตาลแตละชนดในนาฆาเชอโดยการกรอง


นานาตาลแตละชนด(cellobioseหรอlactose)ผสมลงในbaseในอตราสวน1:9

4. Motilitytestmedium

Beefextract 3 กรม

Peptoneorgelysate 10 กรม


Agar 4 กรม



ฝาเกลยวขนาด16x150มลลเมตร8มลลลตรฆาเชอท121oC15นาทpH7.4±0.2

*เตมเกลอ(NaCl)โดยใหอาหารเลยงเชอมความเขมขนสดทาย2-3%

173


5. Phosphatebufferedsaline

Sodiumchloride(NaCl) 7.65 กรม

Disodiumhydrogenphosphate 0.724 กรม

(Na2HPO4),anhydrous

Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 0.21 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลน1,000มลลลตรแบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการฆาเชอ

ท121oC15นาทปรบpH7.4ดวย1NNaOH

6. Thiosulfatecitratebilesaltsucrose(TCBS)agar




Sodiumthiosulfate.5H2O 10 กรม

Sodiumcitrate.2H2O 10 กรม

Sodiumcholate 3 กรม

Oxgall 5 กรม


Ferriccitrate 1 กรม

Bromthymolblue 0.04 กรม


Agar 15 กรม



174


7. Trypticase(tryptic)soyagar

Trypticasepeptone 15 กรม

Phytonepeptone 5 กรม


Agar 15 กรม



ตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121oC15นาทpH7.3±0.2เอยงหลอดและปลอยใหวนแขง

8. Trypticase(tryptic)soybroth

Trypticasepeptone 17 กรม

Phytonepeptone 3 กรม


Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 2.5 กรม





9. Tryptonebrothandtryptonesaltbroths(T1N0,T1N1,T1N3,T1N6,T1N8,T1N10)

TrypticaseหรอTryptone 10 กรม

Sodiumchloride(NaCl) 0,10,30,60,80,100 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตรสาหรบ T1N0 ไมตองเตม NaCl

สวนT1N1,T1N3,T1N6,T1N8และT1N10เตมNaCl10,30,60,80และ100กรมตามลาดบ

แบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121oC15นาทpH7.2±0.2

*เตมเกลอ(NaCl)โดยใหอาหารเลยงเชอมความเขมขนสดทาย2-3%

175


10. Christensen’sureaagar

10.1 Basemedium

Peptone 1 กรม


Dextrose 1 กรม

Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 2 กรม

Phenolred(6mlof1:500solution) 0.012 กรม

Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง900มลลลตรฆาเชอท121oC15นาท

10.2 Ureaconcentrate

Urea 20 กรม


ละลายUreaในนากลนหรอนากรอง100มลลลตรทาใหปราศจากเชอดวยการกรอง


เตม Urea concentrate 100 มลลลตร ใน Base medium 900 มลลลตร ผสมให

เขากนโดยใชaseptictechniquepH6.8±0.1แบงใสหลอดตามปรมาตรทตองการ

เอยงหลอดและปลอยใหวนแขง โดยใหสวน butt มความสง 2 เซนตเมตร และสวน

slantมความยาว3เซนตเมตร

*สาหรบhalophilicVibriospp.ซงรวมถงV. parahaemolyticusใหเตมเกลอ(NaCl)

เพมอก15กรมเพอใหอาหารเลยงเชอมเกลอความเขมขนสดทาย2%

176



1. β-galactosidasereagent 1.1 Buffersolution




ละลายNaH2PO4ในนากลน45มลลลตรปรบpH7.0±0.2ดวยNaOHปรบปรมาตร

เปน50มลลลตร

1.2 ONPGsolution

o-Nitrophenylβ-D-galactopyranoside(ONPG) 0.08 กรม




Buffersolution(ขอ1.1)5มลลลตรกบONPGsolution(ขอ1.2)15มลลลตร



3. Oxidasereagent


Dihydrochloride(C10H16N2.2HCl)



4. นาเกลอ0.85%และ2%

Sodiumchloride(NaCl) 8.5หรอ20 กรม


ละลายNaClในนากลน1,000มลลลตรฆาเชอท121oC15นาทpH7.0

177



ตวอยางทเจอจาง1:10 ตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม(1:10หรอ1:100,...)

10มลลลตร 1มลลลตร

10มลลลตร2xAPW3หลอด 10มลลลตรAPWระดบความเจอจางละ3หลอด

35 ± 2oCขามคน

TCBSagar


โคโลนทมลกษณะเฉพาะหรอทสงสยอยางนอย2โคโลน


ตรวจยนยนโดยทดสอบทางชวเคมหรอใชชดทดสอบสาเรจรป

เปรยบเทยบตารางMPNและคานวณ


แผนภม การตรวจปรมาณ (enumeration) V. parahaemolyticus ในอาหารโดยวธ MPN

178



ตาราง MPN 3-3-3

Pos.tubes Conf.Lim. Pos.tubes Conf.Lim. MPN/g MPN/g .10 .01 .001 Low High .10 .01 .001 Low High 0 0 0 <3.0 -- 9.5 2 2 0 21 4.5 42

0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94

0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94

0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94

0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94

0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94

1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110

1 0 1 7.2 1.3 18 3 0 2 64 17 180

1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180

1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200

1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420

1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420

1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420

1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420

2 0 0 9.2 1.4 3.8 3 2 2 210 40 430

2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1,000

2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1,000

2 1 0 15 3.7 42 3 3 1 460 90 2,000

2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4,100

2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 --

179



วธนใชในการตรวจวเคราะหจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในอาหารครอบคลมการตรวจ

ปรมาณ(enumeration)


U.S.FoodandDrugAdministration.BacteriologicalAnalyticalManual,2001,Chapter3

“AerobicPlateCount”.[ออนไลน].2001;[สบคน25กรกฎาคม2557].เขาถงไดท

http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/LaboratoryMethods/ucm063346.htm


-


การตรวจนบจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมด(mesophilicaerobes)ทยงมชวตอยในตวอยาง

ทาไดโดยการเจอจางตวอยางใหอยในชวงทสามารถนบจานวนของจลนทรยไดจลนทรยจะปรากฏ

เปนโคโลนบนอาหารเลยงเชอซงเรยกวา“colonyformingunit(CFU)”นบจานวนโคโลนแลว

คานวณเปนจานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในตวอยาง(aerobicplatecount)และรายงาน

ผลเปนCFUตอหนวยของตวอยางอาจใชคาวาtotalplatecount,standardplatecount,viable

platecountหรอheterotrophicplatecountแทน“aerobicplatecount”ซงสามารถตรวจสอบ

ดวยวธconventionalplatecountmethodโดยนาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสม

(1:10 หรอ 1:100, …) ปเปตลงบนจานเพาะเชอ เทดวยอาหารเลยงเชอไมจาเพาะชนดแขง

ผสมใหเขากนตงทงไวใหวนแขงนาไปบมและนบจานวน

DMSc F 2013: วธตรวจวเคราะหจำานวนจลนทรย หรอแบคทเรยทงหมด

ในอาหาร โดยวธ pour plate

Analytical method of aerobic plate count in food

by pour plate

180


5. อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents):ภาคผนวก1 5.1 อาหารเลยงเชอ

5.1.1 Platecountagar(PCA)

5.1.2สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent) ไดแก Butterfield’s phosphate buffered -

dilutionwater(BPB)


-




6.1.3 เครองบดปน(blender)หรอเครองตผสมอาหาร(stomacher)


6.1.5 ตอบเพาะเชอ(incubator)35± 1oCและ32± 1oC



6.1.8 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)45± 1oC






7. ขนตอนการทดสอบ (Procedures) 7.1 การสมตวอยาง(Sampling)


ใหเขากน กรณทตวอยางเปนของเหลวขนหนดเขยาใหทว สมตวอยาง 50 กรม

ใสในภาชนะปราศจากเชอ



ไมนอยกวา100มลลลตรและเขยาใหเขากน(ตวอยางเรมตน)

181



เจอจางตวอยางตามลาดบๆละ10เทา(serialten-folddilutions)ดวยสารละลายสาหรบ

เจอจางดงน

7.2.1 กรณ 7.1.1 เทสารละลายสาหรบเจอจาง 450 มลลลตร ผสมใหเขากนโดยใช

เครองบดปนหรอเครองตผสมอาหาร1-2นาท(initialsuspensionหรอprimary

dilution)

7.2.2กรณ7.1.2ปเปตตวอยาง10มลลลตรใสในสารละลายสาหรบเจอจาง90มลลลตร

เขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:10(initialsuspensionหรอprimarydilution)

7.2.3 ปเปตตวอยางทเจอจาง 1:10 มา 10 มลลลตร ใสในสารละลายสาหรบเจอจาง

90มลลลตรเขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:100ทาเชนนตอไปจนไดตวอยาง

ทเจอจางตามตองการ

7.3 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธconventionalplatecountmethod:ภาคผนวก2


ความเหมาะสม1มลลลตรลงในจานเพาะเชอระดบความเจอจางละ2จานเพาะเชอ

(duplicate)

7.3.2เทPCAประมาณ12-15มลลลตรลงในจานเพาะเชอผสมใหเขากนตงทงไวให

วนแขงแลวพลกจานเพาะเชออกดานหนงขน(invertplates)

หมายเหต : ระยะเวลาตงแตสนสดการทาinitialsuspensionหรอprimarydilutionจนกระทง

เทวนภายใน15นาท

7.3.3 บมท35oC48±2ชวโมงสาหรบตวอยางนมบมท32oC48±2ชวโมง

7.3.4นบจานวนโคโลนทอยในชวง 25-250 โคโลน ในจานเพาะเชอของ 2 ระดบการ

เจอจางทตดกน

182


8. การคำานวณ (Calculation of results) 8.1 นบจานเพาะเชอทม25-250โคโลนโดยใชเครองนบโคโลนแลวนาผลมาคานวณตามสตร

N = ∑C/[(1xn1)+(0.1xn2)]x(d)

เมอ N = จานวนโคโลนตอกรมหรอตอมลลลตรของตวอยาง

∑C = ผลรวมของจานวนโคโลนทงหมดทนบไดจากทกจานเพาะเชอ

n1 = จานวนจานเพาะเชอทนามานบโคโลนทระดบการเจอจางแรก

n2 = จานวนจานเพาะเชอทนามานบโคโลนทระดบการเจอจางถดไป

d = ระดบการเจอจางแรกของการนบจานวนโคโลน

ตวอยาง โคโลน

1:100 1:1000

232,244 33,28

N = (232+244+33+28)/[(1x2)+(0.1x2)]x10-2

= 537/0.022

= 24,409

≈ 24,000 หมายเหต: การทา2จานเพาะเชอ(duplicate)ตอระดบการเจอจางถาพบวามจานเพาะ

เชอทมจานวนโคโลนอยในชวง และไมอยในชวง 25-250 โคโลน ใหเลอก

เฉพาะจานทอยในชวงมาใชในการคานวณ

8.2 ถาทกระดบการเจอจางมจานวนโคโลนในจานเพาะเชอนอยกวา 25 โคโลน ใหบนทกผล

เปนคาทอานไดจรงแตรายงานวานอยกวา25คณดวย1/dเมอd=dilution factorของ

ระดบการเจอจางแรกทนบได และบนทกผลเปนคาประมาณ (estimated aerobic plate

count,EAPC)


1:100 1:1000 EAPC/ml(g)

18 2 <2,500

0 0 <2,500

8.3 ถาไมมจานเพาะเชอใดมโคโลนในชวง 25-250 โคโลน และแตละจานเพาะเชอมนอยกวา

100 โคโลนตอตารางเซนตเมตร ใหนบจานวนโคโลนในจานเพาะเชอทมจานวนใกล 250

มากทสด แลวคณดวยระดบการเจอจางและบนทกผลเปนคาประมาณ(estimated aerobic

platecount,EAPC)

183



1:100 1:1000 EAPC/ml(g)

TNTC 640 640,000

TNTC,toonumeroustocount

8.4การนบโคโลนทแผกระจาย

โคโลนทแผกระจายแบงออกเปน3ประเภทดงน

8.4.1 สายโคโลนทเรยงตอเนองกน ซงเกดจากกลมเซลลแบคทเรยทไมแยกจากกน

ขณะทเทอาหารวนผสมกบตวอยาง

8.4.2 โคโลนทแผกระจายเปนแผนฟลม(film)อยระหวางวนและกนจานเพาะเชอ

8.4.3โคโลนทแผกระจายเปนแผนฟลมอยบรเวณขอบจานเพาะเชอ หรอบนผวหนาวน

การพจารณาวามการเจรญของโคโลนทแผกระจายขนในจานเพาะเชอมากเกนไป

และใหรายงานผลวเคราะหวาspreader(SPR)มหลกเกณฑดงน

ก. ถกปกคลมดวยโคโลนทแผกระจาย รวมทงพนททงหมดทมการยบยงการเจรญ

ของเชอจลนทรยมมากกวา50%ของพนทจานเพาะเชอ

ข. พนททมการยบยงการเจรญของเชอจลนทรยมมากกวา 25% ของพนทจาน

เพาะเชอ

กรณทจานเพาะเชอมโคโลนทแผกระจายขน (นอกเหนอจาก ขอ ก และ ข)

และมความจาเปนตองนบจานวนใหนบวาแตละโคโลนทแผกระจายเกดจากแหลง

ตนกาเนด 1 แหลงดงน มโคโลนทแผกระจายแบบขอ 8.4.1 จานวน 1 สาย

นบเปน1 โคโลน ถามมากกวา 1 สายและมตนกาเนดจากแหลงทแยกจากกน

ใหนบแตละแหลงเปน1โคโลนไมนบการเจรญแตละโคโลนในสายเดยวกนเปน

1โคโลน

สาหรบโคโลนทแผกระจายแบบขอ 8.4.2 และ 8.4.3 มกขนแยกใหเหนเปนโคโลน

ทชดเจนนบจานวนโคโลนของโคโลนทแผกระจายและโคโลนปกตรวมกนเพอนามา

คานวณหาจานวนจลนทรย

184


8.5 ถาทกจานเพาะเชอมคาเฉลยของจานวนโคโลนมากกวา 100 โคโลนตอตารางเซนตเมตร

ใหรายงานผลวามากกวา100คณดวยระดบการเจอจางสงสดและคณพนทของจานเพาะเชอ

ทใชทดสอบบนทกผลเปนคาประมาณ(estimatedaerobicplatecount,EAPC)


1:100 1:1000 EAPC/ml(g)

TNTC 7,150(a) >6,500,000

TNTC 6,490(b) >5,900,000

ตวอยางอานคาเฉลยของการนบได110โคโลนตอตารางเซนตเมตร

(a) พนทของจานเพาะเชอ65ตารางเซนตเมตร

(b) พนทของจานเพาะเชอ59ตารางเซนตเมตร

9. การรายงานผลการทดสอบ (Test report) 9.1 จานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดCFU/นาหนกหรอปรมาตร(เชนกรมหรอมลลลตร)

9.2 รายงานผลเปนตวเลขนยสาคญสองตาแหนง ตวเลขตงแตตาแหนงทสามขนไปใหปรบเปน

เลขศนย และเพมตวเลขตาแหนงทสองขนหนงอนดบเมอตวเลขตาแหนงทสามเปน 6, 7,

8, 9 และคงตวเลขตาแหนงทสองไวเชนเดม เมอตวเลขตาแหนงทสามเปน 1, 2, 3, 4

แตถาตาแหนงทสามเปน 5 ตองดตวเลขตาแหนงทสอง หากตวเลขตาแหนงทสองเปน

เลขค ใหคงตวเลขตาแหนงทสองไวเชนเดม แตถาตวเลขตาแหนงทสองเปนเลขค ใหเพม

ตวเลขตาแหนงทสองขนหนงอนดบ

ตวอยาง: 12,700 รายงานเปน 13,000

12,400 รายงานเปน 12,000

15,500 รายงานเปน 16,000

14,500 รายงานเปน 14,000

10. รายละเอยดอนๆ (Supplementary notes) 10.1 ภาคผนวก1: อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

10.2ภาคผนวก2: แผนภมการตรวจปรมาณ(enumeration)จานวนจลนทรยหรอแบคทเรย

ทงหมดในอาหาร

185





อาหารเลยงเชอ กรณใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปเตรยมตามสตรและวธทผผลตระบ

1. Platecountagar(PCA)



Glucose 1 กรม

Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง 1,000 มลลลตร ใหความรอนจนวนละลาย ฆาเชอ


2. Butterfield'sphosphatebuffered-dilutionwater(BPB)

2.1 Stocksolution

Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO4) 34 กรม


ชง KH2PO4 34กรม ละลายในนากลน 500มลลลตรปรบ pH7.2ดวย1NNaOH

(NaOH40กรมละลายนาและเตมนาใหครบ1,000มลลลตร)ปรบปรมาตรเปน1,000

มลลลตรฆาเชอท121oC15นาท

2.2 Diluent

ปเปตstocksolution(ขอ2.1)1.25มลลลตรนามาปรบปรมาตรเปน1,000มลลลตร

ดวยนากลนหรอนากรองแบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121oC15นาท

186




1มลลลตร(duplicate)

เทPCA12-15มลลลตร

35

o

C48±2ชวโมง


คานวณ


แผนภม การตรวจปรมาณ (enumeration) จำานวนจลนทรย หรอแบคทเรยทงหมดในอาหาร

187



วธนใชในการตรวจวเคราะหจานวนจลนทรย หรอแบคทเรยทงหมดในนา และนาแขง ครอบคลม

การตรวจปรมาณ(enumeration)


AmericanPublicHealthAssociation.StandardMethodsfortheExaminationofWaterand

Wastewater.22nded.Washington,D.C.;2012.9215A-C,p.9-49-9-56.


จานวนจลนทรยทงหมดหมายถงจานวน“liveculturableheterotrophicbacteria”


การตรวจนบจานวนจลนทรยทยงมชวตอยในตวอยาง ทาไดโดยการเจอจางตวอยางใหอยในชวง

ทสามารถนบจานวนของจลนทรยได จลนทรยในตวอยางจะเจรญเปนโคโลนในอาหารเลยงเชอ

เรยกวา“colonyformingunit(CFU)”จานวนโคโลนบนอาหารเลยงเชอทนบไดนาไปคานวณเปน

จานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในตวอยาง(heterotrophicplatecount)และรายงานผลเปน

CFUตอหนวยของตวอยางอาจใชคาวาaerobicplatecount,standardplatecount,viableplate

countหรอtotalplatecountแทน“heterotrophicplatecount”ซงสามารถตรวจสอบดวยวธpour

plateและspreadplate

DMSc F 2014: วธตรวจวเคราะหจำานวนจลนทรย หรอแบคทเรยทงหมด

ในนำาและนำาแขง โดยวธ pour plate และ spread plate

Analytical method of Heterotrophic plate count in water

and ice by pour plate and spread plate

188


4.1 วธpourplate

นาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสม ปเปตลงบนจานเพาะเชอ เทดวย

อาหารเลยงเชอไมจาเพาะชนดแขงผสมใหเขากนตงทงไวใหวนแขงนาไปบมและนบจานวน

โคโลน

4.2 วธspreadplate

นาตวอยางเรมตนหรอทเจอจางตามความเหมาะสม ปเปตลงบนผวหนาอาหารเลยงเชอ

ไมจาเพาะชนดแขง ใชแทงแกวงอเกลยใหทวจนกระทงผวหนาของวนแหง นาไปบม และ

นบจานวนโคโลน

5. อาหารเลยงเชอและสารเคม (Culture media and reagents):ภาคผนวก1 5.1 อาหารเลยงเชอ

5.1.1 Platecountagar(PCA)หรอ

5.1.2 R2Aagarหรอ

5.1.3 NWRIagar(HPCA)

5.1.4 สารละลายสาหรบเจอจาง (diluent)ไดแก buffered water หรอ 0.1% peptone

water


-





6.1.4 ตอบเพาะเชอ(incubator)35oCและ20oC-28oC



6.1.7 อางนาแบบควบคมอณหภม(waterbath)44oC-46oC

189




6.2.2 แทงแกวงอ(glassspreader)





7. ขนตอนการทดสอบ (Procedures)


7.1.1 กรณทตวอยางเปนนา เขยาตวอยางในแตละภาชนะบรรจใหเขากน เทตวอยาง

จากแตละภาชนะปรมาตรเทา ๆ กน ใสในภาชนะปราศจากเชอใหไดไมนอยกวา

100มลลลตรหรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ(ตวอยางเรมตน)

7.1.2 กรณทตวอยางเปนนาแขงเทตวอยางจากแตละหนวยภาชนะบรรจใสรวมกนในภาชนะ

ปราศจากเชอทาใหตวอยางละลายจนหมดสมใหไดตวอยางไมนอยกวา100มลลลตร

หรอปรมาตรอนทตองการทดสอบ(ตวอยางเรมตน)


7.2.1 วธpourplate

เจอจางตวอยางตามลาดบๆละ100เทา(serial100-folddilutions)ดวยสารละลาย

สาหรบเจอจาง(ภาคผนวก2)ดงน

7.2.1.1 ปเปตตวอยาง 1 มลลลตรใสในสารละลายสาหรบเจอจาง 99 มลลลตร

เขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:100

7.2.1.2 ปเปตตวอยางทเจอจาง 1:100 จานวน 1 มลลลตรใสในสารละลาย

สาหรบเจอจาง99มลลลตรเขยาใหเขากนจะไดตวอยางเจอจาง1:10,000

ทาเชนนตอไปจนไดตวอยางทเจอจางตามตองการ

7.2.2 วธspreadplate

เจอจางตวอยางตามลาดบๆละ10เทา(serial10-folddilutions)ดวยสารละลาย

สาหรบเจอจางตามความเหมาะสมเชนปเปตตวอยาง1มลลลตรใสในสารละลาย

สาหรบเจอจาง9มลลลตรทาเชนนตอไปจนไดตวอยางทเจอจางตามตองการ

190


7.3 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธpourplate:ภาคผนวก3

7.3.1 ปเปตตวอยางเรมตน 1 มลลลตร และ 0.1 มลลลตร ลงในจานเพาะเชอระดบ

ความเจอจางละ2จานเพาะเชอ(duplicate)

7.3.2 ปเปตตวอยางทระดบการเจอจาง1:100ปรมาตร1มลลลตร และ0.1มลลลตร

ลงในจานเพาะเชอระดบความเจอจางละ 2 จานเพาะเชอ ทาเชนนตอไปทระดบ

เจอจางอน

7.3.3 เทอาหารเลยงเชออยางนอย 10-12 มลลลตร ลงในจานเพาะเชอ ผสมใหเขากน

ตงทงไวใหวนแขงแลวพลกจานเพาะเชออกดานหนงขน(invertplates)

หมายเหต: ขนตอนตงแตเจอจางตวอยางจนถงเทอาหารเลยงเชอในจานเพาะ

เชอสดทายไมเกน20นาท

7.3.4 บมท35oC48ชวโมงหรอท20oC-28oC5-7วน

7.3.5 นบจานวนโคโลนในจานเพาะเชอทกโคโลนทอยในชวง30-300โคโลนถาไมสามารถ

นบโคโลนหลงการบมสามารถเลอนการนบไดโดยเกบจานเพาะเชอท5oC-10oC

ไมเกน24ชวโมง

7.4 การตรวจปรมาณ(enumeration)โดยวธspreadplate:ภาคผนวก4

7.4.1 เทอาหารเลยงเชอลงในจานเพาะเชอ หมนใหอาหารเลยงเชอกระจายทว ตงทงไวให

วนแขงแลวทาใหผวหนาวนแหง

7.4.2 ปเปตตวอยางเรมตนหรอตวอยางทระดบความเจอจางอนๆ ตามตองการ 0.1

ถง0.5มลลลตรลงบนผวหนาอาหารเลยงเชอระดบความเจอจางละ2จานเพาะเชอ

(duplicate)ใชแทงแกวงอเกลยตวอยางใหทวจนกระทงผวหนาของวนแหง

7.4.3 บมท35oC48ชวโมงหรอท20oC-28oC5-7วน

หมายเหต: ถาใช R2A agar จะใหผลดทสดเมอบม 28oC 5-7 วน หรอถาใช

NWRIagarบมท20oC7วน

7.4.4 นบจานวนโคโลนในจานเพาะเชอทกโคโลนทอยในชวง30-300โคโลนถาไมสามารถ

นบโคโลนหลงการบมไดสามารถเลอนการนบไดโดยเกบจานเพาะเชอท5oC-10oC

นานไมเกน24ชวโมง

191


8. การคำานวณ (Calculation of results) 8.1 นบจานเพาะเชอทม30-300โคโลนโดยใชเครองนบโคโลนแลวนามาคานวณตามสตร

จานวนโคโลนทนบได CFU/มลลลตร = ปรมาตรของตวอยางในจานเพาะเชอ(มลลลตร)

8.2 ถาไมมจานเพาะเชอใดมโคโลนในชวง30-300โคโลนแตม1จานเพาะเชอหรอมากกวา

มจานวนโคโลนมากกวา 300 โคโลน ใหนบจานวนโคโลนในจานเพาะเชอทมจานวนใกล

300มากทสดแลวคานวณตามสตรในขอ8.1

8.3 ถาทกจานเพาะเชอจากทกระดบเจอจางไมมโคโลนขนเลย ใหรายงานเปน นอยกวา 1

หารดวยปรมาตรตวอยางสงสดทใชวเคราะห เชน ถาไมมโคโลนขนเลยจากตวอยางปรมาตร

สงสด0.01มลลลตรใหรายงานวานอยกวา100CFU/มลลลตร

8.4 ถาทกจานเพาะเชอมมากกวา300โคโลนใหนบจานวนโคโลนดงน

8.4.1 ถามจานวนโคโลนนอยกวา 10 โคโลนตอตารางเซนตเมตร (1 ชองของเครองนบ

โคโลน=1ตารางเซนตเมตร)

- สาหรบจานเพาะเชอแกวขนาด65ตารางเซนตเมตร(100×15มลลเมตร)

ใหนบจานวนโคโลนรวมทงหมด 13 ชอง โดยนบในแนวนอน 7 ชอง แนวตง

6ชองและใหชองทนบตอเนองกนระวงอยาอานชองซานาคาทไดทงหมดบวกกน

แลวคณดวย5

- สาหรบจานเพาะเชอพลาสตกขนาด57ตารางเซนตเมตร(90×15มลลเมตร)

ใหสมนบโคโลนรวมทงหมด19ชองนาคาทไดทงหมดบวกกนแลวคณดวย3

8.4.2 ถาจานวนโคโลนมมากกวา100โคโลนตอตารางเซนตเมตรสาหรบจานเพาะเชอแกว

ใหรายงานมากกวา 6,500 หารดวยปรมาตรตวอยางทนอยทสดในจานเพาะเชอ

ทใชวเคราะหและสาหรบจานเพาะเชอพลาสตกใหรายงานมากกวา5,700หารดวย

ปรมาตรตวอยางทนอยทสด

192


8.5 ถาจานเพาะเชอทเลอกพบโคโลนทแผกระจายในจานเพาะเชอ (spreading colony)

ใหนบเฉพาะโคโลนทแยกเปนโคโลนเดยวในบรเวณทไมมการแผกระจายและบรเวณทโคโลน

แผกระจายตองครอบคลมพนทไมเกนครงจานเพาะเชอ ถามากเกนใหรายงานผลเปน

Spreaders(Spr.)

8.6 การนบโคโลนทแผกระจาย(spreader)ใหนบแตละลกษณะตอไปนเปน1โคโลน

8.6.1 สายโคโลนทเรยงตอเนองกน ซงเกดจากกลมเซลลแบคทเรยทไมแยกจากกนขณะท

เทอาหารวนผสมกบตวอยาง

8.6.2โคโลนทแผกระจายเปนแผนฟลม(film)อยระหวางวนและกนจานเพาะเชอ

8.6.3โคโลนทแผกระจายเปนแผนฟลมอยบรเวณขอบจานเพาะเชอหรอบนผวหนาวน

8.7 นบแยกโคโลนทมลกษณะคลายกนและอยใกลกนมากแตไมตดกนโดยมระยะหางกนอยางนอย

เทากบขนาดเสนผานศนยกลางของโคโลนทเลกทสดทขนบนจานเพาะเชอ

8.8 นบแยกโคโลนทอยตดกนแตมลกษณะโคโลนหรอสทแตกตางกน

9. การรายงานผลการทดสอบ (Test report) 9.1 จานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดCFU/มลลลตร

9.2รายงานผลเปนตวเลขนยสาคญสองตาแหนง ตวเลขตงแตตาแหนงทสามขนไปใหปรบเปน

เลขศนย และเพมตวเลขตาแหนงทสองขนหนงอนดบเมอตวเลขตาแหนงทสามเปน

5, 6, 7, 8, 9 และคงตวเลขตาแหนงทสองไวเชนเดม เมอตวเลขตาแหนงทสามเปน

1,2,3,4

ตวอยาง: 35 รายงานเปน 35



10. รายละเอยดอน (Supplementary notes) 10.1 ภาคผนวก1: อาหารเลยงเชอและสารเคม(Culturemediaandreagents)

10.2 ภาคผนวก2: รปการเจอจางตวอยางสาหรบวธpourplate

10.3 ภาคผนวก3: แผนภมท1การตรวจปรมาณ(enumeration)จานวนจลนทรย

หรอแบคทเรยทงหมดในนาและนาแขงโดยวธpourplate

10.4 ภาคผนวก4: แผนภมท2การตรวจปรมาณ(enumeration)จานวนจลนทรย

หรอแบคทเรยทงหมดในนาและนาแขงโดยวธspreadplate

193






1. Platecountagar(PCA)



Glucose 1 กรม

Agar 15 กรม



ท121oC15นาทpH7.0±±0.2

2. R2Aagar


ProteosepeptoneNo.3 0.5 กรม

หรอpolypeptone

Casaminoacids 0.5 กรม

Glucose 0.5 กรม

Solublestarch 0.5 กรม

Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO4) 0.3 กรม

Magnesiumsulfateheptahydrate(MgSO4.7H2O) 0.05 กรม

Sodiumpyruvate 0.3 กรม

Agar 15 กรม


ละลายสวนประกอบในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร ยกเวนวนปรบ pH เปน7.2ดวย

K2HPO4 หรอ KH2HPO4 เตมว นและใหความรอนจนวนละลาย ฆาเชอท 121oC 15 นาท

pH7.2±0.2(ถาใชอาหารเลยงเชอสาเรจรปไมควรปรบpHหลงฆาเชอ)

194


3. NWRIagar(HPCA)

Peptone 3 กรม

Solublecasein 0.5 กรม

Dipotassiumhydrogenphosphate(K2HPO

4) 0.2 กรม

Magnesiumsulfate(MgSO4) 0.05 กรม

Ferricchloride(FeCl3) 0.001 กรม

Agar 15 กรม




4. Bufferedwater

4.1Stockphosphatebuffersolution

Potassiumdihydrogenphosphate(KH2PO

4) 34 กรม


ละลาย KH2PO4 ในนากลน 500 มลลลตร ปรบเปน pH 7.2 ดวย 1 N NaOH (NaOH

40กรมละลายนาและเตมนาใหครบ1,000มลลลตร)ปรบปรมาตรเปน1,000มลลลตร

ฆาเชอท121oC15นาทแลวเกบแชเยน

4.2Magnesiumchloridestocksolution

Magnesiumchloride(MgCl2) 38 กรม

หรอMgCl2.6H

2O 81.1 กรม


ละลายMgCl2 หรอMgCl2.6H2O ในนากลนหรอนากรองฆาเชอท 121oC 15 นาท แลว

เกบแชเยน


ปเปตStockphosphatebuffersolution(ขอ4.1)1.25มลลลตรและMagnesium

chloridestocksolution(ขอ4.2)5มลลลตรใสในนากลนหรอนากรอง1,000มลลลตร

แบงใสหลอดหรอขวดตามปรมาตรทตองการฆาเชอท121oC15นาทpH7.2± 0.1

5. 0.1%Peptonewater

Peptone 1 กรม



ทตองการฆาเชอท121oC15นาทpH7.0± 0.2

195



ตวอยาง

นา/นาแขง

ปรมาตรทใสในplate

จานเพาะเชอ

ปรมาตรตวอยาง

ในจานเพาะเชอ

99mL

buffer

1 mL

1mL 0.1mL 1mL 0.1mL

1mL 0.1mL 0.01mL 0.001mL

รปการเจอจางตวอยางสำาหรบวธ pour plate

196



ตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม

1และ0.1มลลลตร(duplicate)

PCAหรอR2AหรอNWRIagar

35oC48ชวโมงหรอ20oC-28oC5-7วน


คานวณ


แผนภมท 1 การตรวจปรมาณ(enumeration)จานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในนา

และนาแขงโดยวธpourplate

197



ตวอยางเรมตนหรอตวอยางทเจอจางตามความเหมาะสม

0.1ถง0.5มลลลตร(duplicate)

PCAหรอR2AหรอNWRIagar

35oC48ชวโมงหรอ20oC-28oC5-7วน


คานวณ


แผนภมท 2 การตรวจปรมาณ(enumeration)จานวนจลนทรยหรอแบคทเรยทงหมดในนา

และนาแขงโดยวธspreadplate

วธมาตรฐานทางกายภาพสำาหรบการวเคราะหอาหาร



1. นายทนงพนธสจจปาละ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการพเศษ

2. นายกอเกยรตศาสตรนทร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

3. นางสาวขนทองเพชรนอก นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

4. นายสมภพวฒนมณ นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

5. นางปยมาศแจมศร นกวทยาศาสตรการแพทยชานาญการ

วธมาตรฐานทางกายภาพสำาหรบการวเคราะหอาหาร


201


วธมาตรฐานทางกายภาพสำาหรบการวเคราะหอาหารของกรมวทยาศาสตรการแพทย

Method รหสวธ ชนดอาหาร รายการ type หนา

DMScF3001 ผกกระปอง นาหนกสทธและนาหนกเนอ I 203

DMScF3002 ผกกระปอง ปรมาณนาอสระ I 205

203


1. ขอบขาย (Scope)วธนใชในการวเคราะหนาหนกสทธและนาหนกเนอในผกกระปอง

2. เอกสารอางอง (Normative reference)AOACOfficialMethod968.30:CannedVegetablesDrainedWeight

3. หลกการ (Principle)ชงนาหนกอาหารทไมรวมภาชนะบรรจและชงนาหนกเนออาหารโดยแยกสวนทเปนของเหลวออก

4. เครองมอและอปกรณ (Apparatus) 4.1 เครองชง(analyticalbalance)ทมความละเอยด0.01กรม

4.2 ตะแกรง(sieve)

4.3 ทเปดกระปอง

5. สารเคม (Reagent) -

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)-

7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)7.1 ชงนาหนกของตวอยางพรอมภาชนะบรรจบนทกคาทอานได

7.2 ชงนาหนกตะแกรง บนทกคาทอานได โดยเลอกใชตะแกรงขนาดเสนผานศนยกลาง

20 เซนตเมตร สาหรบตวอยางทมขนาดบรรจนอยกวาหรอเทากบ 1.36 กโลกรม หรอ

DMSc F 3001: การวเคราะหนำาหนกสทธและนำาหนกเนอในผกกระปอง

Determination of net weight and drained weight

in canned vegetables

204


ขนาดเสนผานศนยกลาง30เซนตเมตรสาหรบตวอยางทมขนาดบรรจมากกวา1.36กโลกรม

มะเขอเทศกระปองใชตะแกรงเบอร8และเบอร14สาหรบมะเขอเทศบด

7.3 เปดฝาภาชนะบรรจ เทตวอยางลงบนตะแกรง เอยงตะแกรงทามม 17-20o เพอใหของ

เหลวไหลออกไดสะดวกโดยไมเคลอนตวอยางทงไว2นาท

7.4 เมอครบเวลาชงนาหนกตะแกรงพรอมตวอยางบนทกคาทอานได

7.5 นาฝาและภาชนะเปลาทเทตวอยางออกในขอ7.3ลางทาความสะอาดนาไปผงใหแหง

7.6 ชงนาหนกฝาและภาชนะเปลาทแหงบนทกคาทอานได


8.1.1 นาหนกสทธ = นาหนกของตวอยางพรอมภาชนะ - นาหนกฝาและภาชนะเปลา

ทแหง

8.1.2 นาหนกเนออาหาร=นาหนกตะแกรงพรอมเนอตวอยาง-นาหนกตะแกรง

8.1.3 รอยละของนาหนกเนออาหาร=นาหนกเนออาหาร×100

นาหนกสทธ


8.2.1 รายงานนาหนกสทธหนวยเปนกรมหรอกโลกรม

8.2.2 รายงานนาหนกเนออาหารหนวยเปนกรมหรอกโลกรม

9. การควบคมผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)ใชหมายเลขตะแกรงตรงตามวธวเคราะหและมใบรบรองคณภาพ(certificateofexamination)

10. รายละเอยดอน (Supplementary notes)-

205


1. ขอบขาย (Scope)วธนใชในการวเคราะหปรมาณนาอสระในผกกระปอง

2. เอกสารอางอง (Normative references)2.1 AOACOfficialMethod978.18:WateractivityofCannedVegetables

2.2 AmericanPublicHealthAssociation.CompendiumofMethodsfortheMicrobiological

ExaminationofFoods.4thed.WashingtonDC.:2001.Chapter64,p.649-654.

3. หลกการ (Principle)คาปรมาณนาอสระ(aw)เปนอตราสวนของแรงดนไอของนาในผลตภณฑกบแรงดนไอของนาบรสทธ

ทอณหภมเดยวกนมคาเทากบ1/100ของคาความชนสมพทธ(RelativeHumidity,RH)ของ

ผลตภณฑทอยในระบบปด(closedsystem)คาRHสามารถคานวณจากการวดแรงดนไอโดยตรง

หรอจากการวดทางออมโดยใชหววดซงมคณสมบตทางกายภาพหรอทางไฟฟาทสามารถแสดงคา

RHจากตวอยางอาหารและตองสอบเทยบเครองวดโดยใชเกลอมาตรฐาน

4. เครองมอและอปกรณ (Apparatus) 4.1 เครองwateractivity,awประกอบดวยสวนประกอบหลกคอกลองวดตวอยางทมฉนวนหม

เพอทาอณหภมใหคงทและสวนทแสดงคาอณหภมคาRH

4.2ตลบใสตวอยาง

4.3คมคบ

4.4ชอนตกตวอยาง

4.5เครองปนผสมอาหาร

DMSc F 3002: การวเคราะหปรมาณนำาอสระในผกกระปอง

Determination of water activity in canned vegetables

206


5. สารเคม (Reagent) เกลอมาตรฐาน(saltstandards)ทใชในการสอบเทยบเชน

MgCl2 0.328

K2CO3 0.432

Mg(NO3)2 0.529

NaBr 0.576

CoCl2 0.649

SrCl2 0.709

NaNO3 0.743

NaCl 0.753

KBr 0.809

(NH4)2SO4 0.810

KCl 0.843

Sr(NO3)2 0.851

BaCl2 0.902

KNO3 0.936

K2SO4 0.973

Salt aw

6. การเตรยมตวอยาง (Preparation of test sample)6.1 เปดกระปองแลวดาเนนการตอทนท

6.2ทาตวอยางผกใหเปนเนอเดยวกนโดยปนเปนระยะเวลาสนๆ เพอไมใหเกดความรอนสง

เกนไปจะทาใหคาawของตวอยางคลาดเคลอน

6.3ใชชอนตกตวอยางทเปนเนอเดยวกนใสลงในตลบใสตวอยางทนทโดยใหมปรมาณเหมาะสม

แตตองไมมากจนเกนไปจนรบกวนระบบการทางานของเครอง

207


7. ขนตอนการทดสอบ (Procedure)7.1 การสอบเทยบเครองวดawและการทวนสอบ

7.1.1 เปดเครองทงไวเพอใหอณหภมของเครองอานท25oC

7.1.2สอบเทยบเครองดวยเกลอมาตรฐาน 2 คาทครอบคลม และใกลเคยงกบคา aw

ของตวอยาง

7.1.3 ทาการทวนสอบดวยเกลอมาตรฐานทรคาawแตตางรนการผลต

7.2 ขนตอนการวดคาawในตวอยางอาหาร

7.2.1นาตลบใสตวอยางมาใสในกลองวดตวอยางปดฝาเครอง

7.2.2 รอจนเครองอานคา aw แสดงคาคงท หรอคาทแตกตางกนนอยกวา 0.01 ซง

ระยะเวลาถงจดสมดลจะชาหรอเรวขนอยกบชนด และสวนประกอบของตวอยางนน

เชน ถาเปนตวอยางทมสวนผสมของนามนตองใชเวลานานเปนชวโมงกวาจะถง

จดสมดล


คาปรมาณนาอสระ=(คาปรมาณนาอสระครงท1+คาปรมาณนาอสระครงท2)/2


รายงานคาawทศนยม2ตาแหนง

9. การควบคมผลการทดสอบ (Assuring the quality of test results)9.1 สอบเทยบและทวนสอบเครองวดawทกครงกอนการใชงาน

9.2ตรวจตวอยางละ2ซา(duplicate)

9.3 การสมตวอยางจะตองทาอยางรวดเรวเพอใหมการเปลยนแปลงคาawของตวอยางนอยทสด

10. รายละเอยดอน (Supplementary notes)10.1 เกณฑยอมรบของผลการทาซา2ครง(Repeatability)ตองมความแตกตางกนไมเกน0.01

10.2 เกณฑยอมรบของการทวนสอบตองมดงน

- คาความแมน(accuracy)โดยคานวณเปนคา%recoveryตองอยระหวาง97-103%

-คาความเทยง(precisionหรอRSD)ไมเกน0.01

209


คาสงกรมวทยาศาสตรการแพทย

ท๓๖๕/๒๕๕๗

เรองแตงตงคณะทางานกาหนดหลกเกณฑเงอนไขและวธการตรวจวเคราะหอาหาร

.....................

ตามทกรมวทยาศาสตรการแพทยไดจดทาโครงการกาหนดหลกเกณฑเงอนไขและวธการตรวจ

วเคราะหอาหารเพอใชในการคดเลอกและรบรองวธการวเคราะหอาหารรวมทงจดทาเอกสารวธมาตรฐาน

การตรวจวเคราะหคณภาพและความปลอดภยอาหารนา เครองดม วสดสมผสอาหาร (FoodContact

material)นน

เพอให การดาเนนงานบรรลผลตามเป าหมายและเกดประโยชน สงสดต อประเทศ

กรมวทยาศาสตรการแพทย จงเหนสมควรยกเลก คาสงกรมวทยาศาสตรการแพทยท ๒๒๔ /๒๕๕๔

สงณวนท๗มนาคมพ.ศ.๒๕๕๔และใหแตงตงคณะทางานกาหนดหลกเกณฑเงอนไขและวธการตรวจ

วเคราะหอาหารรวม๓คณะดงรายละเอยดตอไปน

คณะท๑ คณะทางานวชาการกาหนดหลกเกณฑและเงอนไขในการคดเลอกวธวเคราะหอาหาร

โดยประกอบดวยบคคลดงตอไปน

๑. ผอานวยการสานกคณภาพและความปลอดภยอาหาร ประธานคณะทางาน

๒. ผเชยวชาญเฉพาะดานมาตรฐานของอาหาร คณะทางาน


๓. ผเชยวชาญเฉพาะดานความปลอดภยของอาหาร คณะทางาน


๔. ผเชยวชาญเฉพาะดานสขลกษณะการผลต คณะทางาน


๕. ประธานคณะทางานคณะท๒ คณะทางาน

๖. ประธานคณะทางานคณะท๓ คณะทางาน

๗. เลขานการคณะทางานคณะท๒ คณะทางาน

๘. เลขานการคณะทางานคณะท๓ คณะทางาน

๙. นางนตยาพนธบว คณะทางานและเลขานการ

๑๐. นางปวณาพานชกล คณะทางานและผชวยเลขานการ

๑๑. นางกรรณการนมเลก คณะทางานและผชวยเลขานการ

210


ใหคณะทางานคณะท๑มอานาจหนาทดงน

๑. วางแผนและกาหนดหลกเกณฑการพจารณาขอมลวชาการเกยวกบวธการตรวจวเคราะห

คณภาพและความปลอดภยอาหารนาเครองดมวสดสมผสอาหาร

๒. เสนอแนะหลกเกณฑและแนวทางการคดเลอกวธการตรวจวเคราะหคณภาพและ

ความปลอดภยของอาหาร นา เครองดม วสดสมผสอาหาร ดานเคมและดานจลชววทยา

GMOsและกายภาพ

๓. พจารณาวธวเคราะหทจดทาโดยคณะทางานฯดานเคมและดานจลชววทยาGMOsและ

กายภาพเพอนาไปใชเปนมาตรฐานของประเทศ

๔. กาหนดรปแบบเอกสารวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร

๕. รวบรวม เรยบเรยง และจดทาเอกสารวธมาตรฐานสาหรบการวเคราะหอาหาร

(ดานบรรณาธการ)

๖. ประสานงานกบโรงพมพในการจดพมพเอกสาร

๗.ปฏบตงานอนตามทไดรบมอบหมาย

คณะท ๒ คณะทางานคดเลอกวธวเคราะหอาหารและจดทาคมอวธวเคราะหอาหาร นา

เครองดมวสดสมผสอาหารดานเคมโดยประกอบดวยบคคลดงตอไปน

๑. นางกนกพรอธสข ทปรกษาคณะทางาน

๒. นางสาวทพวรรณนงนอย ทปรกษาคณะทางาน

๓. นางนภาภรณลกษณสมยา ประธานคณะทางาน

๔. นางสาวสวรรณธรภาพธรรมกล คณะทางาน

๕. นางกญญาพกสน คณะทางาน

๖. นางสาวปษยาแสงวรฬห คณะทางาน

๗. นางสาวสธาทพยวทยชยวฒวงศ คณะทางาน

๘. นางสาวมยรอรารงโรจน คณะทางาน

๙. นางสาวอรณดนดล คณะทางาน

๑๐. นางสาวกรรณกาจตตยศรา คณะทางาน

๑๑. นางจนตนากจเจรญวงศ คณะทางาน

๑๒. นางสาวศศธรหอมดารงวงศ คณะทางาน

๑๓. นางสาวพนาวลยกลงกลางดอน คณะทางาน

๑๔. นางสาวกตตมาโสนะมตร คณะทางาน

๑๕. นางอมาบรบรณ คณะทางานและเลขานการ

๑๖.นางลดดาแกวกลาปญญาเจรญ คณะทางานและผชวยเลขานการ

211


ใหคณะทางานคณะท๒มอานาจหนาทดงตอไปน

๑. รวบรวมและคดเลอกวธการตรวจวเคราะหคณภาพและความปลอดภยของอาหาร นา

เครองดมวสดสมผสอาหารดานเคมตามหลกเกณฑและเงอนไขทกาหนดโดยคณะทางานคณะท๑

๒.ปฏบตงานอนตามทไดรบมอบหมาย

คณะท๓ คณะทางานคดเลอกวธวเคราะหและจดทาคมอวธวเคราะหอาหารนา เครองดม

วสดสมผสอาหารดานจลชววทยาGMOsและกายภาพโดยประกอบดวยบคคลดงตอไปน

๑. นายปรชาจงสมานกล ทปรกษาคณะทางาน

๒. นายทนงพนธสจจปาละ ประธานคณะทางาน

๓. นางลดาพรรณแสงคลาย คณะทางาน

๔. นางดวงดาววงศสมมาตร คณะทางาน

๕. นางสาวอรารตนวฒกรภณฑ คณะทางาน

๖. นางอชฌาสจจปาละ คณะทางาน

๗. นางนตยาพนธบว คณะทางาน

๘. นางลดาวลยจงสมานกล คณะทางาน

๙. นางสาวมณฑนาพนธบวหลวง คณะทางาน

๑๐. นางปวณาพานชกล คณะทางาน

๑๑. นางปยมาศแจมศร คณะทางานและเลขานการ

๑๒. นายสมภพวฒนมณ คณะทางานและผชวยเลขานการ

๑๓. นางสาวกรณาตรสมทธ คณะทางานและผชวยเลขานการ

ใหคณะทางานคณะท๓มอานาจหนาทดงตอไปน

๑. รวบรวมและเลอกวธการตรวจวเคราะหคณภาพและความปลอดภยของอาหาร นา

เครองดม วสดสมผสอาหารดานจลชววทยา GMOs และกายภาพตามหลกเกณฑและเงอนไขทกาหนด

โดยคณะทางานคณะท๑

๒. ปฏบตงานอนตามทไดรบมอบหมาย

ทงนตงแตบดนเปนตนไป

สงณวนท๒๕กมภาพนธพ.ศ.๒๕๕๗

(นางจรภรณบณยวงศวโรจน)

รองอธบดปฏบตราชการแทน

อธบดกรมวทยาศาสตรการแพทย

Documents

วิธีมาตรฐาน ส าหรับการ ...dmsc-library.moph.go.th/ebooks/files/วิธี...2- Mercaptobenzothaizole (MBT) ท แพร ออกมาจากผล