A multiplex endokrin neoplasia 1-es típusának

klinikai és genetikai vizsgálata

Doktori értekezés

Dr. Balogh KatalinDr. Balogh KatalinDr. Balogh KatalinDr. Balogh Katalin

Semmelweis Egyetem

Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Rácz Károly, egyetemi tanár, MTA doktora

Hivatalos bírálók: Dr. Garami Miklós, egyetemi docens, PhD Dr. Kovács László, főorvos, PhD

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Szende Béla, egyetemi tanár, MTA doktora

Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Váradi András, tudományos tanácsadó, MTA doktora

Dr. Alföldi Sándor, egyetemi docens, PhD

Budapest, 2006.

2

TARTALOMTARTALOMTARTALOMTARTALOM OLDALOLDALOLDALOLDAL

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 4.

I. BEVEZETÉS 6.

Irodalmi háttér 8.

I. 1. Klinikum 8.

Definíció és prevalencia 8.

Klinikai tünetek, diagnózis és kezelés 9.

1. Hyperparathyreosis 9.

2. Enteropancreatikus neuroendokrin daganatok 11.

3. Hypophysis daganatok 14.

4. Carcinoid tumorok 15.

5. Mellékvesekéreg dagantok 16.

6. Nem endokrin daganatok 16.

I. 2. Genetika 17.

„Pre-screening” módszerek 26.

1. SSCP 26.

2. DGGE, TGGE és CSGE 28.

3. Ritkábban használt, alternatív módszerek 32.

A családszűrés jelentősége 34.

Szomatikus genetikai eltérések MEN 1-asszociált tumorokban 36.

II. CÉLKITŰZÉSEK 37.

III. AZ ÁLTALUNK VIZSGÁLT BETEGEK 38.

IV. MÓDSZEREK 41.

DNS-izolálás 41.

PCR-reakciók 41.

3

TGGE 42.

DNS-szekvenálás 43.

V. EREDMÉNYEK 44.

A TGGE paraméterek optimalizálása 44

Előszűrés és szekvenálás 53.

Esetbemutatás és családszűrés 54.

VI. MEGBESZÉLÉS 63.

VII. KÖVETKEZTETÉSEK 69.

MAGYAR NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÓ 71.

ANGOL NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÓ 72.

IRODALOMJEGYZÉK 73.

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA 89.

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 91.

4

RÖVIDÍTÉSEK

ACTH adenokortikotropin

ASO allél-specifikus oligonukleotid hibridizáció

BMP csont morfogenetikus fehérje

(bone morphogenetic protein)

CRH kortikotrop releasing hormon

CSGE konformáció-szenzitív gél elektroforézis

(conformation-sensitive gel electrophoresis)

DGGE denaturáló grádiens gél elektroforézis

(denaturing gradient gel electrophoresis)

DHPLC denaturáló HPLC

DNS dezoxi-ribonukleinsav

FHH familiáris hypercalcaemiás hypocalciuria

FIHP familiáris izolált hyperparathyreosis

F-SSCP fluoreszcens SSCP

GFAP glia fibrilláris savas protein

GH növekedési hormon

GHRH növekedési hormon releasing hormon

GTP guanidin triszfoszfát

HPLC magas felbontású folyadék-kromatográfia

(high-performance liquid chromatography)

IF intermedier filamentum

MEN multiplex endokrin neoplasia

MEN1 multiplex endokrin neoplasia 1 gén

MEN 1 multiplex endokrin neoplasia 1-es típus

MEN 2 multiplex endokrin neoplasia 2-es típus

MIP menin interakciós proteinek

mRNS messenger ribonukleinsav

PCR polimeráz láncreakció

5

RAS rat sarcoma protoonkogén

RFLP restrikciós fragmenthossz polimorfizmus

(restriction fragment length polymorphism)

RT-PCR reverz transzkripciós polimeráz láncreakció

SSCP egyszálú konformáció polimorfizmus

(single strand conformational polymorphism)

TGF-ß transformáló növekedési faktor-béta

TGGE hőmérséklet-grádiens elekroforézis

(temperature gradient gel electrophoresis)

VIP vazoaktív intesztinális peptid

WDHA vízszerű diarrhoea, hypokalaemia, achlorhydria szindróma

6

I. BEVEZETÉS

A multiplex endokrin neoplasia (MEN) szindrómákban az endokrin szervek

daganatai jellegzetes társulás szerint, családon belüli halmozódással fordulnak elő

[Arnold 1999, Brandi és mtsai 2001]. Két fő típusa a MEN 1 és MEN 2 szindróma; az

utóbbin belül további alcsoportok különíthetők el. Az eltérő klinikai megjelenés és a

különböző genetikai háttér ellenére a MEN 1 és MEN 2 szindróma néhány közös

sajátossággal is bír: mindkét szindróma autoszomális domináns öröklődésű, a benignus

vagy malignus daganatok az érintett endokrin szervekben gyakran több gócban

fejlődnek ki és a sporadikus endokrin daganatokhoz képest általában korábbi életkorban

jelentkeznek. [Frank-Raue és mtsai 2005, Tóth és mtsai 1993] A MEN 1 szindróma

(Wermer-kór) (OMIM 131100) három fő komponense a primer hyperparathyreosis

(általában többszörös mellékpajzsmirigy adenoma vagy hyperplasia), az

enteropancreatikus neuroendokrin daganat és a hypophysis adenoma, azonban a

szindrómához előbél carcinoid tumor, mellékvese daganat, valamint nem endokrin

szervek daganatai is társulhatnak (1. táblázat). [Burgess és mtsai 1998] A tünetek

nagymértékben függenek a daganatok lokalizációjától, illetve azok hormontermelő

sajátosságaitól. [Brandi és mtsai 2001]

A MEN 1 szindróma az egészséges populációhoz képest a morbiditás és

mortalitás jelentős növekedésével jár. A betegek 28 %-ában a mortalitás a MEN 1

szindróma részjelenségeire, illetve azok közvetlen szövődményeire vezethető vissza

(gastrinoma esetében gastrointestinális vérzés, insulinoma esetében hypoglycaemia,

stb.). Valószínűnek tartják azonban, hogy a MEN 1 szindrómával közvetlenül nem

összefüggő halálozásban a betegséghez társuló metabolikus és elektrolit eltéréseknek is

jelentős szerepe lehet (pl. a hyperparathyreosis miatt kialakuló hypercalcaemia

myocardialis kalcifikációt, magas vérnyomást, bal kamra hypertrophiát okozhat, sőt az

emelkedett parathormon szint közvetlenül szívizomsejt hypertrophiát is kiválthat

[Schussheim és mtsai 2001, Tsukada és mtsai 2001]).

7

1. táblázat: A MEN 1 szindrómához társuló daganatok relatív gyakorisága*

[Brandi és mtsai 2001]

Endokrin daganatok

� Mellékpajzsmirigy adenoma 90 %

� Enteropancreatikus daganat

o Gastrinoma 40%

o Insulinoma 10%

o Egyéb hormontermelő daganat 2%

o Nem hormontermelő daganat 20%

� Hypophysis daganat

o Prolaktinoma 20%

o GH- és prolaktin-termelő adenoma 5%

o GH-termelő adenoma 5%

o ACTH-termelő adenoma 2%

o TSH-termelő adenoma ritka

o Nem hormontermelő adenoma 5%

� Előbél carcinoid

o Thymus carcinoid 2%

o Bronchus carcinoid 2%

o Gyomor ECL sejt carcinoid 10%

� Mellékvesekéreg

o Primer aldosteronizmus ritka

o Cushing szindróma ritka

o Nem hormontermelő daganat 25%

Nem endokrin daganatok

� Lipoma 30%

� Angiofibroma (arcon) 85%

� Kollagenoma 70%

*40 év feletti életkorban, MEN1 szindrómás betegben

(ECL sejt: entrochromaffin-szerű sejt)

8

A MEN1 gén a 11q13 kromoszómarégióban található tumorszuppresszor gén,

melynek csírasejtes mutációi okozzák a MEN 1 szindrómát [Guru és mtsai 1998.]. Az

elmúlt években hazánkban is egyre több munkacsoport foglalkozott a különböző

öröklődő betegségek hátterében álló genetikai eltérések vizsgálatával, melyek

eredményei fontos szerepet kapnak a klinikumban is; számos esetben a nemzetközi

ajánlások genetikai diagnózisra építve tesznek javaslatot a terápiás stratégiákra, követési

protokollokra. Munkámban a mulitplex endokrin neoplasia 1-es típusának klinikai és

genetikai vonatkozásait foglalom össze, különös tekintettel a nemzetközi ajánlások

hazai megvalósításának lehetőségeire és a munkacsoportunk által végzett genetikai

szűrés révén gyűjtött hazai tapasztalatokra.

Irodalmi háttér

I.1. Klinikum

Definíció és prevalencia

Nemzetközi irodalmi adatok alapján a MEN 1 szindróma prevalenciája

~1/30000 [Roijers és mtsai 2000.]. Hazai adatok nem állnak rendelkezésre, azonban

feltehetően a betegség Magyarországon is a nemzetközi adatokkal megegyező

gyakoriságú. A betegek több mint 95%-ában a betegség első manifesztációi az ötödik

évtizedig megjelennek.

A legegyszerűbb klinikai definíció szerint MEN 1 szindrómáról akkor

beszélünk, ha a 3 fő komponens közül legalább 2 jelen van. MEN 1 szindrómás

családnak tekintjük azt a családot, amelyben legalább egy MEN 1 szindrómás

családtagon kívül legalább egy elsőfokú vérrokon családtagban a 3 fő MEN 1

komponens közül legalább 1 előfordul. Fontos megfigyelés, hogy a mutációk egy része

de novo alakul ki, ezért negatív családi anamnézis nem zárja ki MEN 1 szindróma

lehetőségét [Arnold 1999]. Nemzetközi ajánlások szerint MEN 1 szindróma gyanúja

akkor megalapozott, ha bármely fő lézió fiatal korban (<35év) jelentkezik, vagy

multiplex formában fordul elő, illetve ha egy fő lézió mellett legalább egy MEN 1-

asszociált minor eltérést is találunk [Stratakis és mtsai 2000].

9

Klinikai tünetek, diagnózis és kezelés

1. Hyperparathyreosis

A MEN 1 szindróma leggyakoribb és általában legkorábban kialakuló

komponense. Legtöbbször fiatal felnőttkorban (20-30 éves korban), de néha már

gyermekkorban kialakul. MEN 1 szindrómás családok 40 év feletti érintett tagjaiban a

hyperparathyreosis valószínűsége 90%. A betegek nagy részében előbb-utóbb mind a 4

mellékpajzsmirigyben daganat alakul ki [Pannett és Thakker 1999], de a daganatok

mérete általában egymástól eltérő. A daganatok rendszerint benignus adenomák [Haven

és mtsai 2004]. Becslések szerint a MEN 1 hyperparathyreosisok az összes primer

hyperparathyreosis eset mindössze 1-3%-át teszik ki.

MEN 1 szindrómához társuló hyperparathyreosisban a szérum kalcium és

parathormon koncentrációk közötti negatív szabályozás mértéke különbözik a

sporadikus hyperparathyreosis esetekhez képest. A mellékpajzsmirigy adenomás

sejteken a kalcium-érzékelő receptorok számának csökkenésével magyarázzák, hogy a

megnövekedett szérum kalcium szint hatására létrejövő parathormon szuppresszió

küszöbértéke magasabb érték felé tolódik el. A küszöbérték eltolódás MEN 1

szindrómához társuló hyperparathyreosisban kisebb mértékű, mint sporadikus

hyperparathyreosis eseteiben.

A MEN 1 szindrómához társuló hyperparathyreosis klinikai tünetei

megegyeznek a sporadikus hyperparathyreosis tüneteivel; kalcium-tartalmú vesekövek

alakulnak ki, a hypercalcaemia okozta renális diabetes insipidus miatt polyuria és

polydipsia jelentkezik, a csontok ásványianyag tartalma csökken. Súlyos

hypercalcaemia esetén gyakran alakulnak ki gastrointestinalis tünetek, exsiccosis és

izomtünetek.

A MEN 1 szindrómához társuló hyperparathyreosis diagnózisának alappillérei

az emelkedett szérum kalcium (ionizált kalcium) és emelkedett szérum parathormon

szint [Glascock és mtsai 2002]. A mellékpajzsmirigy daganatok lokalizálására alkalmas

vizsgálatok (ultrahang és Tc99m-sestamibi szcintigráfia, ritkán CT, MRI, kivételesen

PET és invazív vizsgálatok) megegyeznek a sporadikus eseteknél alkalmazható

vizsgálatokkal. A sporadikus esetektől eltérően azonban MEN 1 szindrómához társuló

hyperparathyreosis esetén mind a négy mellékpajzsmirigy feltárása indokolt, ezért a

lokalizációs vizsgálatok túlzott alkalmazására általában nincs szükség. Műtét utáni

10

recidíva esetén azonban a képalkotó vizsgálatok széles körére szükség lehet. [Doherty

2005].

MEN 1 szindrómán kívül más örökletes szindrómák is társulhatnak

hyperparathyreosissal, amelyeket a differenciáldiagnózis során számításba kell venni.

Ezek közé tartozik a MEN 2 szindróma, a familiáris hypercalcaemiás hypocalciuria

(FHH), valamint a familiáris izolált hyperparathyreosis különböző altípusai (FIHPT)

[Corbetta és mtsai 2005, Pannett és mtsai 2003]. Az FHH autoszomális domináns

öröklődésű betegség, a kalcium-érzékelő receptor gén (CasR gén) inaktiváló mutációi

okozzák. A diagnózist a rendszerint tünetmentes hypercalcaemia családon belüli

halmozódásán kívül az emelkedett szérum parathormon szint és a vizeletben a csökkent

kalciumürítés (kalcium/kreatinin clearance arány <0.01) alapozzák meg. Az FIHPT

esetek mintegy 20%-át a MEN1 gén mutációk okozzák. [Villablanca és mtsai 2002] Az

FIHPT 2. altípusában a multiplex cystás mellékpajzsmirigy adenomák állkapocs

fibromával társulnak; a betegséget a parafibromint kódoló HRPT2 gén inaktiváló

mutációi okozzák [Moon és mtsai 2005, Rubin és mtsai 2005]. A mellékpajzsmirigy

daganatok kialakulásában a cyclin D1 (CCND1) és a D-vitamin receptor (VDR) gének

mutációi is szerepet játszhatnak [Haven és mtsai 2004].

A MEN 1 szindrómához társuló hyperparathyreosis műtéti kezelése mind a

választandó időpont, mind a műtét típusa tekintetében eltér a sporadikus

hyperparathyreosis eseteknél alkalmazott eljárástól. Tünetmentes egyéneknél, 3 mmol/l-

nél kisebb szérum kalcium szint esetén a műtét halasztása javasolt. Bár a

megnövekedett szérum kalcium szint növeli a szérum gastrin szintet, a Zollinger-Ellison

szindróma hatásos gyógyszeres kezelési lehetősége miatt a hyperparathyreosishoz

társuló gastrinoma nem jelent egyértelmű indikációt a mellékpajzsmirigy műtét

elvégzésére. A mellékpajzsmirigy műtét során mind a négy mellékpajzsmirigy

feltárásának szükségessége miatt a minimálisan invazív műtéti módszer nem javasolt,

bár egyes munkacsoportok postoperatív követéses vizsgálataik során arra a

következtetésre jutottak, hogy háromnál kevesebb mellékpajzsmirigy érintettsége

esetében a szelektív parathyroidectomia eredményei nem maradnak el a radikálisabb

műtétek eredményeitől [Lee és mtsai 2006]. MEN1 szindrómában a leggyakrabban

alkalmazott eljárás a szubtotális mellékpajzsmirigy eltávolítás (mind a négy

mellékpajzsmirigy feltárása után 3 mellékpajzsmirigy teljes és 1 részleges eltávolítása

11

mintegy 50 mg épnek tűnő mellékpajzsmirigy szövet megőrzésével). Végezhető teljes

parathyroidectomia és a leginkább épnek tűnő mellékpajzsmirigyből szövetdarabkák

autotranszplantációja a nem domináns alkar brachioradiális izmainak rostjai közé.

Ilyenkor a mellékpajzsmirigyszövet krioprezervációja is indokolt, ami műtét utáni tartós

hypoparathyreosis esetén később ismételt beültetést tesz lehetővé [Johnson és mtsai

2005]. MEN 1 szindrómás betegek mellékpajzsmirigy műtéte során részleges

thymectomia elvégzése is ajánlott (részben a thymuson belül elhelyezkedő

mellékpajzsmirigy, részben a thymusban előforduló carcinoid miatt) [Lambert és mtsai

2005]. Az említett műtétek során meghagyott mellékpajzsmirigy-szövetben évekkel

vagy évtizedekkel később recidíva alakulhat ki, ezért egyes szerzők MEN 1 szindrómás

betegekben totális mellékpajzsmirigy eltávolítást (és élethossziglan D-vitamin analóg

kezelést) javasolnak. [Doherty és mtsai 2005] A hyperparathyreosis gyógyszeres

kezelésében perspektívát jelentő kalcium-érzékelő receptor agonisták klinikai vizsgálata

jelenleg folyamatban van.

2. Enteropancreatikus neuroendokrin daganatok

A MEN 1 szindróma második leggyakoribb megjelenési formája, az érintett

esetek 30-75%-ában alakul ki [Pannett és mtsai 1999]. A hasnyálmirigy szigetsejtekből

kiinduló hormontermelő daganatok rendszerint 40 éves kor után, a daganat által termelt

hormonoknak megfelelő szindrómák képében jelentkeznek. A szigetsejtekből kiinduló

daganatok rendszerint multicentrikusak [Hoff és mtsai 2000], méretük a néhány mm-es

adenomától a több cm-es invazív és metasztatikus carcinomáig terjedhet. A pancreas

szigetsejtes daganatok chromogranin A-t, pancreas polypeptidet, glukagont, inzulint,

proinzulint, szomatosztatint, gasztrint, vazoaktív intesztinális peptidet, szerotonint,

calcitonint, GH-releasing peptidet és ACTH-t termelhetnek. Malignus szigetsejtes

daganat 30 éves életkor alatt ritkán fordul elő, a későbbi életkorban azonban

gyakrabban.

Gastrinoma a MEN 1 szindrómás betegek mintegy 30%-ában alakul ki.

Klinikai megfigyelések szerint az összes gastrinoma 25 %-a MEN 1 szindróma

részjelensége. A MEN 1 szindrómához társuló gastrinomák jelentős része a

duodenumban helyezkedik el, ezek gyakran kisméretűek és többszörösek [Asgharian és

mtsai 2004, Anlauf és mtsai 2005]. A pancreas eredetű gastrinomák általában rosszabb

12

prognózisúak: a sporadikusan jelentkező Zollinger-Ellison szindrómához (ZES) képest

MEN 1 szindrómában átlagosan 10 évvel korábban kezdődik a betegség, és a nyelőcső

elváltozások (Barrett oesophagus, stricturák, oesophagitis, hiatus hernia) általában

gyakoribbak és súlyosabbak [Hoffmann és mtsai 2005.]. Nem ritka a malignus daganat,

a felismeréskor a betegek felében daganat-metasztázis mutatható ki. A gastrinoma a

gasztrin túltermelés révén gyomorsav-túltermelést, nehezen gyógyuló, gyakran

többszörös és szövődményekhez vezető pepticus fekélyeket, oesophagitist és hasmenést

okoz (ZES). A diagnózist a megnövekedett gyomorsav szekréció, a nagy szérum

gasztrin szint (rendszerint >115 pmol/l) és a szekretin vagy kalcium infúzió után

túlzottan nagy szérum gasztrinszint növekedés bizonyítják. Bár definitív gyógyulás csak

a gastrinoma teljes műtéti eltávolításától várható, a műtéti kezelés hosszú távú

eredményei (valószínűleg a MEN1 szindrómában gyakori több gócú gastrinoma, vagy a

kis primer daganat esetén is gyakori lokális metasztázisok miatt) gyakran alulmaradnak

a várakozástól. Újabban kiterjesztett műtéti eljárásokat vezettek be, de ezeknek az

eredményeknek az értékeléséhez további vizsgálatok szükségesek. [Doherty 2005] A

gastrinomák gyógyszeres kezelésére a H2 hisztamin-receptor blokkolók és proton-

pumpa gátlók hatásos kiegészítő terápiás lehetőséget jelentenek, használatuk óta a

totális gastrectomia elkerülhetővé vált. Szomatosztatin-analógok is eredményesen

alkalmazhatók; mind a gastrin, mind a gyomorsav szekréciót hatásosan gátolják, és a

MEN 1 szindrómában gyakori gyomor carcinoid regresszióját válthatják ki.

Insulinoma a MEN 1 szindrómás betegek közel 10%-ában fejlődik ki; az összes

insulinoma mintegy 10 %-a MEN 1 szindrómához társul. A MEN 1 szindrómában

kialakuló insulinomák általában multicentrikusak, méretük 1-3 cm és a hasnyálmirigy

bármely részéből kiindulhatnak, 25%-uk malignus. A klinikai tünetek (éhezési

hypoglycaemia neuroglycopenia tüneteivel, hízás) megegyeznek a sporadicus

insulinoma tüneteivel. A diagnózishoz alkalmazható legérzékenyebb teszt a vércukor,

szérum inzulin és C-peptid meghatározással egybekötött éhezési teszt. Az insulinoma

kezelése sebészi; a kisméretű és gyakran multiplex daganatok miatt a műtét előtti

lokalizáció nehéz lehet. A műtéti megoldás a tumor enucleatiótól a totális

pancreatectomiáig terjedhet [Doherty 2005]. Inoperábilis, vagy kiterjedten

metasztatizáló esetekben diétás (gyakori étkezés) és gyógyszeres kezelés alkalmazható

13

(diazoxid, streptozocin). A szomatosztatin-analógok kevésbé hatásosak, mint

gastrinomában.

Glucagonoma ritkán fordul elő; jellegzetes bőrtünetekkel (necroticus migráló

erythema), fogyással, anaemiával, stomatitissel és csökkent glukóz toleranciával járhat.

Leggyakoribb lokalizációja a pancreas farki része; a diagnózis időpontjában az esetek

50 %-ában metasztázis mutatható ki. A diagnózishoz a hyperglucagonaemia bizonyítása

szükséges. Kezelése sebészi; a műtét előtt a betegek állapotának javítására, illetve

inoperábilis esetekben somatostatin-analógok alkalmazhatók. Inoperábilis daganat vagy

metasztázis esetén cytotoxikus kemoterápia is alkalmazható.

VIPoma MEN1 szindrómában ritka; jellemzői a vízszerű diarrhoea,

hypokalaemia és achlorhydria (WDHA szindróma, vagy Verner-Morrison szindróma).

A diagnózist az megnövekedett szérum VIP koncentráció bizonyítja. Gyakran a

pancreas farokban helyezkednek el, sebészi eltávolításuk végleges gyógyulást

eredményezhet. Kiegészítő kezelésként somatostatin-analógok is alkalmazhatók.

Egyéb hormontermelő enteropancreatikus daganatok a termelt hormonnak

megfelelő szindrómákat okozhatják (pl. akromegalia, Cushing szindróma). Kezelésük

sebészi.

Hormonálisan inaktív enteropancreatikus daganatok a MEN 1 szindrómához

társuló összes enteropancreaticus daganat mintegy 30-40 %-át teszik ki. Ezek a

daganatok nem okoznak hormontúltermelés szindrómát, bár ilyen esetekben is a

részletes vizsgálatok kórosan emelkedett hormonszinteket (pl. pancreas polypeptid)

mutathatnak ki. A daganatok gyakran nagy méretűek, sok esetben malignusak és már a

felismeréskor metasztázisok lehetnek jelen. Kezelésük sebészi; MEN 1 szindrómás

betegekben a kisméretű (rendszerint szűrővizsgálattal felismert) hormonálisan inaktív

daganatok esetén azonban a műtéti indikációval kapcsolatban nem alakult ki egységes

álláspont [Lairmore és mtsai 1999].

Az enteropancreatikus neuroendokrin daganatok lokalizálására ultrahang,

endoszkópos ultrahang, angio-CT, angio-MRI és radionuclid szcintigráfiás módszerek

(szomatosztatin-receptor szcintigráfia, pozitron emissziós tomográfia) alkalmazhatók

[Hellman P és mtsai 2005]. Az intraoperatív ultrahang vizsgálat közel teljes

biztonsággal segíti a pancreas endokrin daganatok detektálását, ezért ezek műtéti

megoldásához ennek biztosítása indokolt.

14

Hasnyálmirigy szigetsejtes daganatok esetén gyakori a májmetasztázis, ezekben

az esetekben intervenciós radiológiai eljárások (artéria hepatica embolizáció,

kemoembolizáció, radiofrekvenciás tumor-abláció), illetve kemoterápia (5-fluorouracil,

streptozocin, doxorubicin, dacarbazin) végezhető. A korai és agresszív sebészeti kezelés

megelőzheti a májmetasztázisok kialakulását. [Bartsch és mtsai 2005]

3. Hypophysis daganatok

MEN 1 szindrómás esetek 10-60%-ában fordulnak elő [Dean és mtsai 2000]. A

daganatok kétharmada mikroadenoma, egyharmada makroadenoma. Az esetek 25%-

ában a MEN 1 szindróma első jeleként alakulnak ki. A hypophysis adenomák

valamennyi típusa előfordulhat, ezek közül leggyakoribb a prolactinoma [Verges és

mtsai 2002]. A familiáris prolactinoma hátterében is MEN 1 szindróma állhat [Hoff és

mtsai 2000]. A MEN 1 szindrómában kialakuló akromegáliát ritkán nem GH-termelő

hypophysis daganat, hanem GHRH-termelő carcinoid vagy szigetsejtes tumor okozza.

A MEN 1 szindrómához társuló Cushing szindróma oka szintén többféle lehet (ACTH-

termelő hypophysis adenoma, ectopiás ACTH-termelő carcinoid vagy szigetsejtes

tumor, illetve ectopiás CRH-termelő daganat). Thyreotrop és gonadotrop tumorok ritka

eseteit is leírták [Benito és mtsai 2005, Burgess és mtsai 1996]. A MEN 1 szindrómához

társuló hypophysis daganatok klinikai tünetei megegyeznek a sporadikus hypophysis

daganatok tüneteivel; a hormontermelő daganatok a termelt hormonnak megfelelő

klinikai szindrómákat okozzák (prolactinoma, akromegalia, Cushing kór), illetve mind a

hormontermelő, mind a hormonálisan inaktív daganatok a környező struktúrákon

kompressziós tüneteket válthatnak ki (fejfájás, bitemporális hemianopsia, szemmozgató

izombénulás, hypopituitarismus). A sporadikus esetekhez hasonlóan a hypophysis

daganatok MEN 1 szindrómában is rendszerint jóindulatúak, de igen ritka esetben

carcinoma is előfordulhat [Benito és mtsai 2005].

A MEN 1 szindrómához társuló hypophysis daganatok diagnózisára az MRI

vizsgálat a legérzékenyebb és leggyakrabban alkalmazott módszer. A hypophysis

daganatok hormontermelésének kivizsgálása megegyezik a sporadikus hypophysis

daganatoknál alkalmazott eljárásokkal. Mutáció-hordozó egyénekben a prolactinoma

szűrésére a bazális prolactin szint vizsgálat, a GH-termelő hypophysis adenoma

szűrésére a klinikai tüneteken (akromegalia) kívül szérum IGF-I vizsgálat javasolt

15

[Dreijerink és mtsai 2005]. A MEN 1 szindróma atípusos prolactinoma (Burin) variánsa

esetén az érintett egyénekben a hyperparathyreosis mellett szokatlanul nagy

gyakorisággal alakul ki prolactinoma és carcinoid típusú tumor, míg a gastrinoma igen

ritka [Olufemi és mtsai 1998, Petty és mtsai 1994, Verges és mtsai 2002, Hao és mtsai

2004]. Egy másik, Tasmániában talált, több mint 200 fős családban szintén igen nagy

gyakorisággal fordult elő prolactinoma (76%), míg nem-funkcionáló hypophysis

adenomát az esetek 24%-ában figyeltek meg. Ezt a variációt Tasmán variációként írták

le. [Beckers és mtsai 2003, Burgess és mtsai 2000]

A MEN 1 szindrómás betegekben kialakuló hypophysis daganatok kezelése nem

különbözik a sporadikus hypophysis daganatos esetek kezelésétől. [Doherty 2005]

4. Carcinoid tumorok

MEN 1 szindrómás esetek 5-15 %-ában fordulnak elő [Görtz és mtsai 1999];

kialakulásuk a többi daganathoz képest későbbi életkorban várható. Csaknem minden

esetben előbél eredetűek (thymus, bronchus, gyomor carcinoid). Megfigyelések szerint

mediastinalis lokalizáció esetén a MEN 1 szindrómához társuló carcinoid az elülső, míg

a sporadikus carcinoid a hátsó mediastinumban fordul elő. Jellegzetes a nemi

megoszlás: thymus carcinoid főleg dohányzó férfiakban, míg a bronchus carcinoid főleg

nőkben fordul elő [Snabboon és mtsai 2005]. MEN 1 szindrómában a thymus carcinoid

rendszerint agresszív kórlefolyású, 70%-uk malignus [Ferolla és mtsai 2005]. A gyomor

hisztamin-termelő ECL sejtjeiből származó carcinoid tumorok elsősorban ZES-hez

társulva fordulnak elő, ritkán okoznak hormontúltermelésre visszavezethető endokrin

tüneteket, többségüket hormonálisan nem funkcionáló daganatként ismerik fel és ritkán

malignusak. Carcinoid szindróma MEN 1 szindrómában ritkán alakul ki.

A MEN 1 szindrómához társuló carcinoid tumorokhoz ritkán társul

hormontúltermelés szindróma. A biokémiai vizsgálatok közül a szérum chromogranin A

koncentráció tűnik a legfontosabbnak A MEN 1 szindrómában ritkán előforduló

carcinoid szindróma esetén megnövekedett szerotonin, szerotonin metabolit (5-hidroxi-

indolecetsav), illetve hisztamin szintek mutathatók ki. A bronchus és thymus

carcinoidok ritkán ACTH-t, GHRH-t vagy calcitonint termelhetnek, ilyen esetek

igazolása a megfelelő hormonvizsgálatokkal lehetséges [Baudin és mtsai 1999, Yano és

mtsai 2005]. A gyomor carcinoid kimutatásában a gastroscopiának és az endoszkópos

16

ultrahang vizsgálatnak, a thymus és a bronchus carcinoid lokalizálásában a CT és a

szomatosztatin-receptor szcintigráfiás vizsgálatnak van kiemelt jelentősége [Doherty

2005].

Ritka előfordulásuk miatt kevésbé ismert a MEN 1 szindrómához társuló

carcinoidok optimális kezelési stratégiája.

5. Mellékvesekéreg daganatok

MEN 1 szindrómás betegek 20-40%-ában fordulnak elő. Hyperplasia, nodularis

hyperplasia, adenoma és ritkán carcinoma egyaránt előfordulhat, az elváltozás gyakran

mindkét mellékvesét érinti [Bhuiyan és mtsai 2001]. Többségük hormonálisan inaktív,

ritkán Cushing szindrómával vagy primer aldosteronismussal társul [Guo és Sawicki

2001, Libé és Bertherat 2005]. A MEN 1 szindrómához társuló kétoldali

mellékvesekéreg hyperplasia és nodularis hyperplasia a MEN 1 szindróma egyéb

részjelenségeinek, mint pl. insulinoma vagy ACTH-termelő adenoma másodlagos

következménye is lehet. A daganatok CT vizsgálattal és hormontúltermelés esetén

(Cushing szindróma, primer aldosteronismus) a sporadikus eseteknél alkalmazott

hormonvizsgálatokkal mutathatók ki. MEN 1 szindrómás betegben hormontermelő vagy

malignitásra gyanús mellékvesekéreg daganat esetén javasolt a mellékvese műtét.

6. Nem endokrin daganatok.

MEN 1 szindrómás betegek egyharmadában bőr alatti és viscerális lipomák

alakulnak ki; az elváltozás gyakran multiplex és gyakran érinti a pleurát vagy

retroperitoneumot. Gyakoriak az arc angiofibromái (esetek 40-85%-ában), melyek

legtöbbször a felső ajkon, orron és az arcon helyezkednek el. Kollagenomák az esetek

több mint 70%-ában a felsőtesten, nyakon és vállakon lehetnek jelen. A bőrtumorok

jelenléte segítheti a tünetmentes mutáció-hordozók szűrését [Asgharian és mtsai 2004].

MEN 1 szindrómában multiplex leiomyomák is előfordulhatnak (ureter, nyelőcső,

gyomor, tüdő, uterus és bőr) [Ikota és mtsai 2004].

17

I.2.Genetika

A multiplex endokrin neoplasia 1-es típusáért felelős MEN1 gént 1997-ben

azonosították a 11. kromoszóma hosszú karjának pericentromérás területén (11q13)

[Chandrasekharappa és mtsai 1997, The European Consortium on MEN1 1997]. (1.

ábra).

1. ábra: A MEN1 gén pozícionális klónozása, a gén szerkezete [Guru és mtsai 1997]

1

2

3

4

56

7

8

9

10

1

2

3

4

56

7

8

9

10

Baloldalon a 11-es kromoszóma látható, külön jelölve a hosszú karon a

pericentromérás területen elhelyezkedő 11q13 régió. MEN 1 szindrómás családok

18

”linkage analysis” vizsgálatával szoros kapcsoltságot mutattak ki a 11q13 régió

polimorf DNS markereivel, majd két rekombináns szakasszal ezt a területet a

nagyobb szürke téglalapnak megfelelő részre szűkítették (~2Mb). MEN 1-

asszociált és sporadikus tumorok LOH analízisével a területet a kisebb szürke

téglalap méretűre (~600kb) szűkítették, majd a megfelelő DNS szakaszt

szekvenálták. Számos kandidáns gént fedeztek fel, végül a MEN 1 szindrómás

családokban előforduló mutációk segítségével azonosították a betegségért felelős

gént, melyet MEN1 génnek neveztek el. A MEN1 gén exon-intron szerkezetét és a

kódoló régió sémás ábráját az ábra jobb oldali része mutatja be. A nyíl a

transzkripció irányát jelzi; a ferde vonalakkal kiemelt terület az exonok nem-

kódoló régiójának felelnek meg.

A MEN1 gén egy tumor szuppresszor gén [Guru és mtsai 1998]; 10 exont

tartalmaz, amelyből az első és a 10. exon második fele nem íródik át. A kódoló szakasz

1830 bp méretű [Heppner és mtsai 1999]. Az eddigi vizsgálatok során összesen több

mint 400 mutációt írtak le a gén területén [Pannett és Thakker 1999]; ezek legtöbbje

csonkolt fehérje kialakulásához vezet. A gén területén nincs mutációs “hot spot”, és

eddig genotípus-fenotípus összefüggést sem sikerült felfedezni [Hoff és mtsai 2000,

Kouvaraki és mtsai 2002].

A gén egy 610 aminosavból álló fehérjét kódol, melyet meninnek neveztek el. A

menin nem mutat homológiát az eddig ismert fehérjékkel; interakciói alapján azonban

feltételezhető, hogy szerepet játszik a sejt ciklus, a sejt növekedés és a genom stabilitás

szabályozásában. (2. ábra)

A homozigóta menin-null egerek embrionális korban 10,5 és 12,5 nap között

elpusztulnak, ezért a menin hiányát az élettel összeegyeztethetetlennek tartják.

Heterozigóta gén-kiütött egerek 24%-ában 9 hónapos korra mellékpajzsmirigy adenoma

alakul ki, bár a szérum kalcium szint nem változik. 16 hónapos egerek 26%-ában nagy

hypophysis adenoma, 22 hónapos korukra pedig 28%-ukban pancreas szigetsejt

adenoma alakul ki; utóbbiak nagy része (83%) insulinoma. A heterozigóta gén-kiütött

egerek 20%-ában mellékvesekéreg carcinomát találtak. [Crabtree és mtsai 2001.]

19

2. ábra: A menin fehérje szerkezeti doménjei [Poisson és mtsai 2003]

Leucin Zippek

Nukleárislokalizációsszekvenciák

aminosavak

Prolin gazdag régióGTPáz konszenzus

Leucin Zippek

Nukleárislokalizációsszekvenciák

aminosavak

Prolin gazdag régióGTPáz konszenzus

Az ábra felső részén a menin fehérje szerkezetében azonosított domének láthatók;

ezek alatt a téglalapok a menin fehérjével kölcsönhatásba lépő fehérjék kötési

helyeit illusztrálják.

A menin nukleáris fehérje; szerkezetén belül más fehérjékkel való interakcióhoz

szükséges területeket azonosítottak, melyeken keresztül a menin hatásai

érvényesülhetnek (menin interakciós fehérjék, MIP). Ezek közül a legismertebbeket az

alábbiakban sorolom fel.

A menin gátolja a JunD által mediált transzkripciós aktivációt. A JunD fehérje

az AP-1 családba tartozó transzkripciós faktor. A többi AP-fehérjétől eltérően a

sejtnövekedésre gátló/szabályozó hatást fejt ki. A menin antagonista hatása ezért nem

egyértelműen magyarázható tumorszuppresszor hatással, ugyanis egy sejtnövekedést

gátló hatást gátol, ami (eddig ismeretlen módon) szabályozza a transzkripciót és az

apoptózist. [Kaji és mtsai 2001]. Ugyanakkor mind a menin, mind JunD gátló hatással

bír a RAS (patkány sarcoma protoonkogén) indukált daganatképződésre. Kimutatták

továbbá, hogy a JunD proapoptotikus faktorként szerepel a p53 jelátvitelben. Felmerül

20

annak a lehetősége is, hogy a JunD két ismert izoformájához a menin nem egyforma

affinitással kötődik [Yazgan és Pfarr 2001, Ikeo és mtsai 2004].

A menin az NF-κB nukleáris faktor család három tagjával lép kölcsönhatásba

(NF-KappaB1, -B2 és a RelA transzkripciós regulátorok). Ezek a fehérjék homo- és

heterodimerek formájában számos gén expresszióját szabályozzák. A menin a JunD-hez

hasonló hatást fejt ki: gátolja az NF-KappaB által szabályozott transzaktivációt. A JunD

és NF-KappaB együttműködését (és direkt kölcsönhatását) patkány hepatocytákban

bizonyították. Kaji és mtsai kimutatták, hogy a menin a TGF-ß jelátvivő rendszerrel a

Smad3 szintjén lép kölcsönhatásba [Kaji és mtsai 2001]. Napjainkra az is ismertté vált,

hogy számos átkapcsolódás van a Smad-mediált TGF-ß jelátviteli rendszer és a RAS

foszforilációs útvonal között. Ez vezet például az AP-1 komplexek aktiválásához,

melyek egyik legfőbb összetevője a JunD, és lehetséges komponense a menin (GTP-áz

aktivitása révén).

A következő fehérje a Pem, melynek meninhez történő direkt kapcsolódását is

kimutatták [Lemmens és mtsai 2001]. A Pem egy homeobox-fehérje, amely elsősorban

a herében expresszálódik és feltehetően transzkripciót szabályozó szereppel bír.

Bár a menin alapvetően nukleáris lokalizációjú fehérje, több munkacsoport

beszámolt a menin citoplazmában való szekvesztrációjáról [Huang és mtsai 1999,

Lopez Egido és mtsai 2002, Wautot és mtsai 2000] Kimutatták, hogy a GFAP (glia

fibrilláris savas protein) az intermedier filamentum (IF) része, melyben a vimentin az

egyik fő alkotóelem. In vivo és in vitro vizsgálatokkal bizonyították a vimentin és a

menin direkt kapcsolódását, ezért a meninnek a citoplazma IF hálózattal való

kölcsönhatása és a menin citoplazmatikus szekvesztrációja is valószínűsíthető. Szintén a

GFAP-tartalmú IF hálózattal és ezáltal indirekt módon a meninnel is kapcsolatot létesít

az Nm23 metasztázis szuppresszor fehérje, amely egyben lehetővé teszi a menin

számára a GTP hidrolízisét azáltal, hogy a menint Ras-közeli GTP-ázokhoz (mint pl. a

Rad) köti [Yaguchi és mtsai 2002].

Ezeken a kapcsolatokon kívül a menin számos transzkripciós faktorral és

fehérjével alakít ki kölcsönhatást. A DNS-repairben résztvevő fehérjék közül, pl. az

RPA [Sukhodolets és mtsai 2003] és a FancD2 [Jin és mtsai 2003] direkt módon

befolyásolja a ciklin dependens kinázok expresszióját [Milne és mtsai 2005]. Továbbá a

menin kettősszálú DNS-hez való közvetlen kötődését is kimutatták [La és mtsai 2004].

21

Ezeken a kölcsönhatásokon keresztül a meninnek szerepet tulajdonítanak a sejt-

növekedés [Karnik és mtsai 2005], illetve sejt-ciklus szabályozásában [Ratineau és

mtsai 2004, Schnepp ás mtsai 2004], valamint a genom stabilitásban [Poisson és mtsai

2003, Agarwal és mtsai 2004.] (3. ábra)

3. ábra: A menin fehérje feltételezhető szerepe és más fehérjékkel való

kölcsönhatásai [Poisson és mtsai 2003]

RAS+ MAP kinázok

Transzkripció

Apoptózis

Sejtnövekedés szabályozásaSejtciklus szabályozásaGenom stabilitásSinapszis plaszticitás

RAS+ MAP kinázok

Transzkripció

Apoptózis

Sejtnövekedés szabályozásaSejtciklus szabályozásaGenom stabilitásSinapszis plaszticitás

Az ábra szemlélteti, hogy bár a meninnek más fehérjékkel való kölcsönhatásai

révén betöltött szerepe még számos ponton tisztázatlan, a menin főbb hatásai már

körvonalazódtak.

A menin in vivo funkciójával kapcsolatban is számos új funkcióra derült fény az

utóbbi időben, az endokrin szövetekben betöltött szabályozó mechanizmusok is egyre

nagyobb részletességgel válnak ismertté. A menin fehérje szerepének vizsgálatakor

Hendy és mtsai MEN 1-asszociált tumorokban kimutatták, hogy agyalapi mirigy

22

sejtekben a menin inaktivációja gátolta a TGF-ß és aktivin jelátvitelt és antagonizálta

azok növekedés-gátló hatását. A menin szerepét mutatták ki a prolaktin expresszió

aktivin-indukálta gátlásában is; ebben a szabályozó mechanizmusban a Smad

fehérjékkel és a Pit-1 transzkripciós faktorral való együttműködés tűnt jelentősnek. A

menin inaktivációja mellékpajzsmirigy sejtekben megszűntette a proliferációt és a PTH-

szekréciót gátló TGF-ß hatást. Kimutatták azt is, hogy MEN 1 szindrómás betegek

mellékpajzsmirigy sejtjeiben a TGF-ß nem képes a sejtek proliferációjának és PTH-

szekréciójának szabályozására. MEN1-null egerek magzataiban cranialis/facialis

hypoplasiát észleltek, ami a menin csontfejlődésben betöltött szerepét is felveti. Menin

fehérje szükséges a multipotens mesenchymális őssejtek osteoblast sejtvonalba történő

differenciálódásához is. A menin fizikailag és funkcionálisan is kapcsolatban áll a

BMP-2 (csont morfogenetikus fehérje-2) szabályozása alatt álló Smad fehérjékkel (pl.

Smad 1 és Smad5) és az osteoblast kulcsszabályozó Runx2 fehérjével is. Ezeknek az

interakcióknak a hatásai megszűnnek, amint az osteoblastok tovább differenciálódnak.

Ekkor a menin a Smad3 fehérjével lép kapcsolatba, ami a Runx2 fehérje TGF-ß által

történő negatív szabályozásához vezet. A menin fehérje a JunD fehérje differenciálódást

serkentő hatásainak gátlása révén is gátolja az osteoblast érést [Hendy és mtsai 2005,

Sowa és mtsai 2003].

A MEN1 gén mutációk többsége a menin fehérje hiányát, vagy rövidebb és ezért

funkcióképtelen menin fehérje képződését okozza [Guru és mtsai 1998, Brandi és mtsai

2001]. Napjainkig több mint 400 MEN 1 szindrómát okozó veleszületett (minden

sejtben jelenlevő, csírasejtes) mutációt írtak le, melyek mintegy 22 %-a nonsense, 56 %-

a deléciós/inserciós, 17 %-a missense és 5 %-a donor-splice mutáció [Pannett és mtsai

1999]. A betegek 5-10 %-ában a mutáció nem a kódoló szakaszon, hanem a promoter

vagy az intronikus szakaszokon található, melyek rutin módszerekkel nem, vagy

nehezen detektálhatók. A mutációk az 1. exon kivételével (amely nem íródik át a

transzláció során [Karges és mtsai 2000]) az összes exont érinthetik [Goebel és mtsai

2000, Kouvaraki és mtsai 2002].

23

A menin tumor szuppresszor fehérje, a betegségre jellemző endokrin daganatok

mindkét allél defektusa esetén alakulnak ki (Knudson-féle ”két ütés” modell). Az

érintett egyénekben típusosan az egyik allél veleszületett mutációján kívül a

daganatszövetben a másik allél szerzett, szomatikus defektusa alakul ki (rendszerint

allél-vesztés; LOH: a heterozigótaság elvesztése) [Agarwal és mtsai 2005]. Szomatikus

MEN1 gén mutációk a MEN 1 szindrómához társuló endokrin daganatokon kívül

sporadikus endokrin daganatokban is előfordulhatnak (VIPomák 50 %-ában,

hypophysis adenomák 40 %-ában, bronchus carcinoidok 25-35 %-ában, gastrinomák 25

%-ában, insulinomák, nem funkcionáló pancreas neuroendokrin tumorok és

mellékpajzsmirigy adenomák 10-20 %-ában, angiofibromák és lipomák 10-17 %-ában)

[Kawamura és mtsai 2005, Libé és mtsai 2005, Miedlich és mtsai 2000]. Családi

anamnézis hiányában is kialakulhat a későbbiekben öröklődő csírasejtes MEN1 mutáció,

ilyen esetekben a betegséget rendszerint de novo mutáció okozza (4. ábra).

4. ábra: A Knudson-féle „két ütés” modell A csírasejtes MEN1 mutációk esetén, familiáris és de novo esetben is, a proband

utódjai öröklik a betegséget okozó genetikai eltérést. Sporadikus MEN 1-asszociált

daganatokban kialakult mutáció esetén azonban csak az adott endokrin őssejt és a

belőle származó endokrin sejtek tartalmazzák majd a betegség kialakulásáért

felelős mutációt, a csírasejtek nem, így ezen daganatok esetében nem kell

öröklődésre számítani. A daganatsejt a normál endokrin sejtből mindhárom

esetben ugyanazon folyamat eredményeként jön létre: egy második „csapás”,

szomatikus mutáció (leggyakrabban allélvesztés) eredményeképpen. A daganatsejt

tehát a MEN1 allélra nézve vagy hemizigóta, vagy compound heterozigóta lesz.

24

25

A MEN1 gén mutációinak vizsgálata munka- és időigényes feladat, mégis

kulcsfontosságú, hiszen a betegek, a betegségre gyanús személyek és mutáció-hordozó

egyének követéskor és ellenőrzésekor a nemzetközi ajánlásokban megfogalmazott

szempontok érvényesítése szükséges. A MEN1 gén mutációk vizsgálatának széles

körűen elfogadott jelenlegi indikációit a 2. táblázat foglalja össze.

2. táblázat: A MEN1 gén mutációanalízisének indikációi [Brandi és mtsai 2001]

A genetikai szűrés indikációi

Index eset:

▪ Klinikailag definiált MEN 1 szindróma

(sporadikus vagy familiáris formában: 2 major lézió, vagy 3 major és/vagy

minor eltérés)

▪ Klinikailag gyanús, vagy atípusos MEN 1 szindróma

2 vagy több MEN 1-tumor; multiplex mellékpajzsmirigy tumor 30 éves kor

alatt; eredményes műtét után kiújuló hyperparathyreosis; gastrinoma vagy

multiplex pancreas szigetsejt tumor bármely életkorban

(Familiaris izolált hyperparathyreosis.)

Ismert MEN1 mutációval rendelkező egyén vérrokon családtagjai:

▪ Minden tünetmentes vérrokonnál

▪ Bármely rokonnál, aki a MEN 1 szindróma bármely jelét mutatja

(megerősítésként)

Klinikailag MEN 1 szindrómás betegben, MEN1 mutáció hiányában :

▪ Mint fent, csak a MEN1 mutációanalízis nem hozzáférhető; abban az esetben is

ez az ajánlás, ha a genetikai szűrés negatív*

* ajánlható haplotípus-analízis, linkage-analízis és klinikai kémiai tesztek.

26

„Pre-screening” módszerek

Az utóbbi időkben a nagy formátumú DNS-szekvenálási módszerek elterjedése

és a különböző mutáció detektáló rendszerek fejlődése a genetikai betegségek

pontosabb diagnózisát teszik lehetővé. Bár a mutációk és más genetikai eltérések

kimutatására napjaink ”gold standard” módszerének az adott gén teljes automata

szekvenálása tekinthető, ez az eljárás költség- és időigényes, sőt nagyobb génszakaszok

deléciója esetén nem minden esetben informatív. A szekvenálás hátrányai miatt számos

módszert dolgoztak ki, melyeket gyakran a szekvenálás előtti szűrőmódszerként („pre-

screening”) alkalmaznak egy adott génen belül a genetikai eltérést tartalmazó

génszakasz (exon) azonosítására. A szűrőmódszerek nagymértékben csökkenthetik a

mutációk kimutatásának költségeit, azonban hasznosságukat döntően megbízhatóságuk

határozza meg. A szűrőmódszerekkel a genetikai eltérések (polimorfizmusok, mutációk)

jelenléte vagy hiánya állapítható meg, ezért megbízható szűrőmódszer alkalmazása

esetén a genetikai eltérést pontosan kimutató DNS szekvenálást nem szükséges az

összes DNS szakaszon (exonon) elvégezni. A szűrőmódszerek családszűrésre is

hasznosak lehetnek, ha a betegségben szenvedő családtagban már korábban kimutattuk

a keresett genetikai eltérést.

A MEN1 gén mutációanalízisére jelenleg használt módszerek a gén összes

exonjának PCR-sokszorosításán alapulnak. A munkacsoportok nagy része a „The

European Consortium on MEN1” által korábban leírt oligonukleotid primereket

használja [The European Consortium on MEN1 1997], bár néhány módszer egyedi

tervezésű primereket igényel.

1. SSCP (egyszálú konformáció polimorfizmus analízis)

Irodalmi adatok alapján a MEN1 gén mutációk szűrésére az SSCP tűnik a

leggyakrabban használt módszernek [Cetani és mtsai 2000, Costa és mtsai 2001, Karges

és mtsai 1998]. A módszer azon alapul, hogy az egyszálú nukleinsavak másodlagos

szerkezetét szekvenciájuk határozza meg, és akár egyetlen nukleotid cseréje a

másodlagos szerkezet olyan változását hozhatja létre, amely megváltoztatja a DNS

szakasz elektroforetikus mobilitását [Orita és mtsai 1989]. Az elektroforézishez nem

27

denaturáló körülmények mellett poliakrilamid gélt alkalmaznak. Nagyméretű PCR

termékek restrikciós emésztése vagy multiplex PCR használata esetében a módszer

multiplex fragmens-szűrésre is lehetőséget ad. Optimális eredményt 150-200 bp méretű

DNS-szakaszokkal lehet elérni. A genetikai eltérés kimutatásának valószínűsége

fordított arányban áll a PCR-termékek méretével; minél hosszabb a termék, annál

kisebb a kimutatási valószínűség. A módszer érzékenysége a gél összetételétől (pl.

glicerin koncentráció) és az elektroforézis alatt biztosított egyenletes hőmérséklettől is

függ (ingadozó hőmérséklet esetén csökken a szenzitivitás). Optimális feltételek mellett

a báziscserék ~80-90%-a mutatható ki SSCP-vel [Perrier és mtsai 2002, Bassett és mtsai

1998]. Az elektroforézis után a DNS-t általában ezüstözéssel (ritkábban

autoradiográfiával) mutatják ki. A MEN1 gén SSCP-vel történő genetikai szűrésének

néhány részletét a 3. táblázat foglalja össze.

3. táblázat: MEN1 gén eltérések szűrése SSCP-vel

N bp T Gél t P Szenz. Ref.

15 200-300 Szobahő 25% MDE 14-16 h 6 W NA [0]

15 200-300 Szobahő 25% MDE 12 h 6-8 W NA [0]

12

18

211

NA Szobahő 0.5x MDE 14-18 h 4 W

76%

75%

[0]

n: fragmens szám, bp: fragmens hossz, T: az elektroforézis hőmérséklete, t:

elektroforézis idő, P: teljesítmény, Szenz.: szenzitivitás, Ref.: irodalmi hivatkozás,

NA: Nincs adat

Park és mtsai 7 nem-rokon családban végzett vizsgálatai során 4 különböző

csírasejtes mutációt azonosítottak, de a 7-es exon Tyr323Stop mutációját nem sikerült

SSCP-vel kimutatniuk, noha DHPLC-vel detektálták ezt a mutációt [Park és mtsai

2003]. Bassett és mtsai 63 család-reprezentáló MEN 1 szindrómás beteg vizsgálata

alapján az SSCP szenzitivitását >85%-nak találták (a Glu388stop mutációt nem sikerült

SSCP-vel kimutatniuk), és a vizsgált esetek 7%-ában álpozitív eredményt kaptak

28

[Bassett és mtsai 1998]. A reagensek összetétele, illetve az elektroforézis körülményei

lényegesen befolyásolhatják az eredményeket; ugyanannak a PCR-terméknek többféle

elektroforetikus környezetben történő vizsgálata javíthatja a mutáció kimutatásának

valószínűségét. A módszer hátrányai közé tartozik, hogy az optimális körülmények

meghatározása empirikus módszerekkel történik. Jelenleg nem áll rendelkezésre olyan

számítógépes szoftver, amelynek segítségével pontosan számíthatóak lennének a

kérdéses paraméterek (gélösszetétel, hőmérséklet).

Kapilláris elektroforézis, standardizálás és automatizálás segítségével a szűrés

ideje lerövidíthető. A fluoreszcens kapilláris elektroforézis SSCP (F-SSCP)

szenzitivitását ~95%-osnak, specificitását ~97%-osnak találták [Mogensen és mtsai

2003]. Az F-SSCP nagy mennyiségű minta feldolgozására is alkalmas, azonban a

készülék költséges beruházást jelent.

2. DGGE (denaturáló grádiens gél elektroforézis), TGGE (hőmérséklet grádiens

gél elektroforézis) és CSGE (konformáció-szenzitív gél elektroforézis)

Ezekkel a módszerekkel poliakrilamid gélen kétszálú DNS fragmentek

elektroforézisét végzik. DGGE esetében a gél fokozatosan növekvő koncentrációban

tartalmaz valamely denaturáló ágenst (urea, vagy formamid). TGGE esetében a

denaturáló ágens (általában urea) konstans koncentrációja mellett a hőmérséklet

növelésével biztosítható a fokozatos denaturáció. CSGE esetében pedig konstans

koncentrációjú denaturáló ágens és állandó hőmérséklet mellett mutatják ki a kétszálú

DNS fragmentek közötti konformáció-eltérést. E módszerek közös sajátossága, hogy a

hagyományos PCR protokollt követően heteroduplex képzésre van szükség. Erre

számos leírást találhatunk az irodalomban:

� denaturálás 94°C-on 3 percig, majd inkubáció 68°C-on 1 órán át, ezt

követően lassú hűtés szobahőig [Cebrián és mtsai 2002]

� denaturálás 94°C-on 5 percig, majd inkubáció 1 órán át szobahőn [Morelli

és mtsai 2000] vagy

29

� denaturálás 94°C-on 5 percig, melyet 35 lassú ciklus követ 94°C-ról

indulva 2°C/1 perc alatt csökkenő hőmérséklettel, majd 1 perces inkubáció

25°C-on [Howell és mtsai 2003]

DGGE és TGGE esetében a mutáns és vad típusú homoduplex és heteroduplex

molekulák a mutáció területén kialakuló ”mismatch” által okozott különböző olvadási

tulajdonságaiknak megfelelően válnak szét. A homoduplex és heteroduplex molekulák

más-más időben kezdődő denaturálódása miatt a korábban denaturáló fragmentek

lemaradnak a gélen. DGGE során a denaturáló ágens koncentrációjának, TGGE során

pedig a használt puffer vagy a gél hőmérsékletének folyamatos növekedése hozza létre a

lineáris denaturációs grádienst. Amint elkezdődik a denaturálódás, az elektroforetikus

mobilitás csökken és a minták haladása a gélen lelassul. A tapasztalatok azt mutatják,

hogy e módszerek esetében az ideális fragment hosszúság kb 1000 bp. Az ún. ”melting”

domének (közel azonos olvadási hőmérsékletű szerkezeti egységek) számát GC-gazdag

régiók („GC-clamp”-ek) segítségével növelhetjük úgy, hogy a primer végére GC-

gazdag szakaszt kötünk, így a „clamp” a keletkező PCR termék megfelelő végére is

rákerül. Ez azért fontos, mert a GC-clampnak megfelelő terület a fragmenten belül igen

magas olvadáspontú szakaszt képez és mivel az összes ”melting” domén analizálható,

kivéve a legmagasabb hőmérsékleten denaturálódót (Tm), a GC-gazdag régión kívül az

adott fragmens minden eleme vizsgálhatóvá válik. A nemzetközi irodalomban olvasható

eredmények azt mutatják, hogy a heteroduplex képzés alapján GC-clampek alkalmazása

esetén csaknem minden mutáció detektálhatóvá válik [Nollau és Wagener 1997]. A

MEN1 gén DGGE-vel történő mutáció analízisének részleteit Morelli és mtsai

ismertették [Morelli és mtsai 2000] Ennek részleteit és eredményeit a 4. táblázat foglalja

össze.

30

4. táblázat: DGGE paraméterek a MEN1 gén különböző exonjai esetében [76]

Exon

Denaturáló

grádiens

(%)

Futtatási

idő (h)

Fragment-

hossz (bp)

DGGE-vel detektált (+) és

álnegatív (-) mutációk

2.1 Rcl 50-80 4 216 E45K (+)

2.2 Rcl 50-80 15 298 311ins5 (+)

2.3 Rcl 40-70 15 195 359del4 (+)

3 Fcl 50-80 15 279 738del4 (+); V215M (+)

Intron3 765-4delT (+)

4 Fcl 40-70 15 203 765-1G→C (+)

893+1G→A (+)

5 Fcl 40-70 15 118 Nem találtak mutációt

6 Fcl 50-80 15 164 Nem találtak mutációt

7 Fcl 40-70 15 209 1059delC (+)

T344R (+)

8.1 Fcl 40-85 4 141 1264delC (-)

8.2 Rcl 30-70 4 154 1267delG (-)

9 Rcl 50-80 15 260 R415X (+)

Q450X (+)

10.1 Fcl 50-80 4 190 1555insG (-)

10.2 Fcl 60-90 15 298 Q508X (+)

10.3 Rcl 50-80 15 249 Nem találtak mutációt

Rcl: Reverz primer GC-clamppel, Fcl: Forvard primer „GC-clamp”-pel a PCR

reakcióban. A DGGE-vel nem észlelt mutációkat vastag betűk jelzik (álnegatív

eredmények).

31

Az előzőekben említett tanulmány során az elekroforézist 15 órán keresztül, 44

V feszültséggel, vagy 4 órán át, 160 V-tal végezték, 58˘C-on, 9%-os akrilamid gélen, a

denaturáló grádiens növekvő koncentrációja mellett. A DGGE szenzitivitását ~82%-

osnak találták; a szűrés során 2 deléciós és egy inzerciós mutáció esetében álnegatív

eredményt kaptak, melyeket végül direkt szekvenálással azonosítottak. A módszer

hátránya, hogy a kémiai denaturáló ágensekkel készülő akrilamid gélek nem mindig,

vagy nem pontosan reprodukálhatóak.

TGGE-vel a fent említett problémák kikerülhetőek. A módszer könnyen

kivitelezhető, költséghatékony és az eredmények jól reprodukálhatóak. További előnye,

hogy a vizsgált DNS fragmentek teoretikus olvadási profiljainak és az elektroforetikus

paraméterek kiszámolásához szoftverek is rendelkezésre állnak, mint pl. a WinMelt

(Bio-Rad, Munich, Germany) vagy a Poland [Steger 1994] (http://www.biophys.uni-

duesseldorf.de/local/POLAND/poland.html). Az elektroforetikus paraméterek

optimalizálásának lépéseit az „Eredmények” című alfejezetben ismertetem.

CSGE esetében állandó koncentrációjú denaturáló ágens (formamid)

alkalmazásával a homo- és heteroduplexek különböző konformációjuk alapján

választhatók szét. A módszer alapelve, hogy az egy-bázisú ”mismatch”-eltérések a

kétszálú DNS-ben konformációs különbségeket hoznak létre, melyek MDE gélen a

hetero- és homoduplexek különböző vándorlása alapján mutathatók ki [Cebrián és mtsai

2002, Cebrián és mtsai 2003]. A MEN1 gén mutációanalízise során CSGE-vel több

fragment együttes futtatása is lehetséges (multiplex PCR amplifikációt követően a 2. +

5.-6. exonok, a 3. + 10. exonok, a 7. + 8. exonok vagy a 9. + 4. exonok). Az 1xMDE

gélek összetétele az alábbi: 15% formamid, 10% ethylen glycol, és 0.6xTBE. Az

elektroforézis 150 V-tal, 20 órán keresztül szobahőn, vagy 7 W-tal 17-20 órán át

0.6xTBE pufferben történik. A módszer előnyei közé tartozik, hogy a MEN1 szekvencia

eltéréseket ~96%-ban mutatja ki (az A541T polimorfizmust ezzel a módszerrel nem

lehetett detektálni). További előnye, hogy a fenti összeállításban a MEN1 gén összes

kódoló régiójának szűrését 4 elektroforézissel el lehet végezni [Cebrián és mtsai 2002,

Cebrián és mtsai 2003]. Az elektroforézis után az eredmények mind ethidium bromidos

festéssel, mind ezüstözéssel vizualizálhatók.

32

3. Ritkábban használt, alternatív módszerek

A heteroduplex analízis nem denaturáló poliakrilamid gélen történik, melynek

során vad típusú és mutáns PCR termékek keverékéből felmelegítéssel, majd re-

annelálással heteroduplexeket képezünk. Az optimális fragmenthoszzúság 200-600 bp.

A módszer szenzitivitását 80%-ra becsülik [Morelli és mtsai 2000, Nollau és mtsai

1997, Agarwal és mtsai 1997].

A denaturáló HPLC (DHPLC; denaturing high-performance liquid

chromatography) alapelve a TGGE módszeréhez hasonló, azonban a kromatográfiás

oszlopról leoldott fragmentek detektálása UV fényben történik és az eredményeket a

chromatogram alapján értékelik. Ez a módszer is heteroduplex-képzést igényel; a

vizsgálati paraméterek optimalizálása WAVEMAKER szoftverrel (Transgenomic,

Omaha, NJ) történik, mellyel a szükséges hőmérséklet minden egyes PCR termékre

nézve meghatározható. A módszer szenzitivitását és specificitását egyaránt közel 100%-

osnak találták. Mogensen és mtsai az eredmények reprodukálhatósága érdekében a

DHPLC analízisre szánt minták -20°C-on történő tárolását ajánlották, ugyanis azt

tapasztalták, hogy a heteroduplexek szobahőn nem stabilak [Mogensen és mtsai 2003].

A módszer gyors és nagyszámú minta analízisét teszi lehetővé. Egyedüli hátrányként

említendő a készülék nagy költsége. A nemzetközi irodalomban Park és mtsai

használták a DHPLC-t MEN1 gén analízisre; a gént 12 részletben amplifikálták, de

további részleteket nem közöltek [Park ás mtsai 2003].

Számos olyan egyéb módszer is ismert, melyek alkalmasak lehetnek, de még

nem használták a MEN1 gén vizsgálatára, mint pl. a cysticus fibrosis vizsgálatára bevált

PNA-DNA hybrid-kötő cyanin festés [Wilhelmsson és mtsai 2002], vagy a dupla GC-

clamp módszer, amelyet eredményesen alkalmaztak az 1-es típusú neurofibromatosis

gén (NF1) mutációk TGGE-vel történő szűrésére [Fahsold és mtsai 2000]. Napjaink

vívmánya a DNS chip módszer, amellyel egyre több gén mutációanalízisére nyílik

lehetőség, melyet a MEN 1 szindróma genetikai szűrésére még nem alkalmazták, noha a

MEN 1 asszociált tumorok génexpressziós mintázatát DNS chip segítségével már több

esetben vizsgálták [Dilley és mtsai 2005, Forsberg és mtsai 2005].

A tapasztalatok alapján a klinikailag MEN 1 szindrómás betegek 10-15%-ában

ezeknek a módszereknek egyikével sem lehet mutációt kimutatni a MEN1 gén kódoló

33

régióban és az exon-intron határokon. Ezért számos erőfeszítés történt a MEN1 gén

promoter régiójának és nem-kódoló szakaszainak, illetve a nagyméretű csírasejtes

deléciók kimutatására. Ezeknek a vizsgálatoknak az eredményei alapján ajánlásokat is

kidolgoztak; az egyik ilyen ajánlás elsőként a MEN1 mRNS RT-PCR analízisét

javasolja, mellyel a splicing mechanizmushoz szükséges intronikus régiók konzervatív

szakaszait érintő rendellenességek is kizárhatók. Megemlíthető, hogy Mutch és

mtsainak 5 esetből 3-ban nem sikerült splicing mutációt felfedni annak ellenére, hogy

más módszerrel kimutatták a kóros splicing termékek jelenlétét [Mutch és mtsai 1999].

Azokban a betegekben, akikben az RT-PCR nem hozott eredményt a haplotípus analízis

ajánlott, mellyel megerősíthetjük, hogy valóban a 11q13 kromoszómarégióban található

génterület felelős a betegség kialakulásáért. A vizsgálattal a polimorf markerek co-

segregációja mutatható ki (pl. PYGM, D11S449, D11S913, D11S4946). Az

intragenikus lókuszokat érintő nagy deléciók mind a korábban részletezett „pre-

screening” módszerekkel, mind a DNS szekvenálással álnegatív eredményt adnak. E

deléciók egy része a gyakori intragenikus polimorfizmusok vizsgálatával is

felfedezhető, ugyanis a polimorfizmusok öröklődését követve a mutáns MEN1 allélek

öröklődése is nyomon követhető [Cavaco és mtsai 2002]. A nagy deléciók pontos

méretének megítélése nehéz, de egy hozzávetőleges méretbecslés ezekkel a

módszerekkel is végezhető. További lehetőségként a Southern-blot analízis említhető. A

genomikus DNS-t különböző restrikciós enzimekkel feldarabolva (pl. KpnI, SmaI, SacI,

SacII), majd Southern-blot vizsgálatot végezve a MEN1 cDNS szegmentek (pl. 152-753

nukleotidok a 2-3. exonokat lefedve, illetve a 1012-1474 nukleotidok a 7-10. exonokat

tartalmazva) vizsgálhatók és denzitometriás analízissel pl. a GAPHD (humán

gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz) cDNS szegmentek korrigált intenzitásai

összehasonlíthatók [Cavaco és mtsai 2002].

Azokban a családokban, ahol a betegség genetikai hátterét nem sikerül

felderíteni, a mutáció-hordozókra vonatkozó protokoll szerint a klinikai követéses

vizsgálatok alkalmazása ajánlott minden családtag esetében, akik örökölhették a

mutációt.

34

A családszűrés jelentősége

A „pre-screening” módszerek és a direkt szekvenálás családszűrésre is

alkalmazhatók. Ezeken kívül családszűrésre az alábbiakban felsorolt módszerek is

rendelkezésre állnak, melyek alkalmazásához a mutáció előzetes ismerete szükséges.

Az allél-specifikus oligonukleotid hibridizáció (ASO) alapja, hogy a PCR

termékhez allél-specifikus oligonukleotidokat hibridizálunk dot blot (a PCR terméket

blottoljuk a membránon) vagy reverz dot blot módszerrel (számos különböző

oligonukleotid-blot a membránon). Napjainkban leginkább e módszerek mikrotiter

formáit használják.

Allél-specifikus amplifikáció esetén a PCR reakcióban allél specifikus

primereket használunk; a mutáció jelenlétét vagy hiányát a PCR termék képződése vagy

hiánya jelzi.

A családszűrés leggyakrabban használt módszere a restrikciós fragmenthossz

polimorfizmusok vizsgálata (RFLP). Azokban az esetekben bizonyult nagyon

hasznosnak, ahol a genetikai eltérés valamely restrikciós enzim hasítási helyét

változtatja meg. A módszer könnyen kivitelezhető, költséghatékony és automatizálható.

A MEN1 gén területén található mutációk igen nagy számúak, a gén bármely

szakaszán kialakulhatnak. Ha a család klinikai és genetikai szűrése sem tudja feltárni a

betegségben szenvedő egyénben kimutatott mutáció eredetét, de novo mutáció

lehetőségére kell gondolnunk. Ha egy mutáció több olyan családban is fellelhető,

melyek rokonsági kapcsolata nem ismert, haplotípus analízist végezhetünk 11q13

markerekkel az esetleges közös eredet (”founder effect”) felderítésére (pl. D11S956,

D11S1765, D11S480, D11S457, D11S449, D11S913, D11S987 és INT2-telomer

markererrel) [Mutch és mtsai 1999, Agarwal és mtsai 1997].

A genetikai vizsgálat egyik legfőbb haszna, hogy MEN 1 szindrómás családok

tagjaiban a mutáció-hordozó állapot kizárása feleslegessé teszi a további klinikai

szűrővizsgálatokat, míg a mutáció-hordozó állapot genetikai igazolása segítheti a

potenciálisan kialakuló daganatok korai klinikai szűrését. A családszűrésen kívül a

genetikai szűrővizsgálat olyan esetekben is hasznos, amikor klinikai vizsgálatokkal a

betegben csak egyetlen manifesztáció mutatható ki, de bizonyos körülmények a MEN 1

35

szindróma gyanúját vetik fel (pl. familiáris izolált hyperparathyreosis, 30 év alatt 2 vagy

több mellékpajzsmirigy adenoma; recidiváló hyperparathyreosis; gastrinoma vagy

multiplex szigetsejtes daganat bármely életkorban) [Thakker 1998]. Genotípus-

fenotípus összefüggés nem ismert, ezért a mutációt hordozó egyénekben az összes

lehetséges manifesztáció rendszeres klinikai szűrése szükséges. A nemzetközi ajánlások

szerinti követéses vizsgálatokat az 5. táblázat foglalja össze.

5. táblázat: MEN1 gén-mutáció hordozó egyénekben endokrin daganatok

szűrésére javasolt tesztek és követéses vizsgálatok [Dean és mtsai 2000]

Tumor A szűrés kezdetének

javasolt időpontja

Évente javasolt

biokémiai tesztek

3 évente javasolt

képalkotó

vizsgálatok

Mp. ad. 8 éves kor Szérum kalcium,

parathormon -

Gastr. 20 éves kor Szérum gastrin -

Ins. 5 éves kor Vércukor, szérum

insulin -

Egyéb ent.

pancr. tu. 20 éves kor

Tüneteknek

megfelelő hormonok CT vagy MRI

Hypoph. tu. 5 éves kor Szérum prolactin MRI

Carcinoid 20 éves kor - CT

36

Szomatikus genetikai eltérések MEN 1-asszociált tumorokban

A MEN1 gén mutációk nagy része korai fehérje-rövidülést eredményez, és

gyakran okoz gén inaktivációt (Knudson hipotézis szerinti első csapás) [Thakker 1993,

Gou és Sawicki 2001, Agarwal és mtsai 1997, Agarwal és mtsai 2004]. A második

csapás az érintett szövetekben jön létre, általában a vad típusú allél elvesztése miatt

(LOH). MEN 1-es betegek tumorszövetéből származó DNS mintákban az allélvesztés

vizsgálatára a 11q13 szakaszon proximálisan (cen-PYGM, D11S449, D11S913-qter),

vagy intragenikusan (D11S4946) elhelyezkedő polimorf microsatellita lókuszok

használhatók [Teh és mtsai 1998, Cavaco és mtsai 2002].

37

II. CÉLKITŰZÉSEK

A MEN 1 szindróma genetikai vizsgálatát a Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz.

Belgyógyászati Klinika és az Élettani Intézet együttműködésével hazánkban elsőként,

2001. szeptemberében vezettük be. Munkámban 32 MEN 1 szindrómás vagy MEN 1-

szerű állapotban szenvedő beteg és családtagjaik klinikai és genetikai vizsgálatával az

alábbi célok megvalósítását tűztem ki:

(1) A MEN1 gén mutációk vizsgálatát számos körülmény nehezíti, melyek

elsősorban a gén nagy méretével és a mutációs ”hot-spot” hiányával

állnak összefüggésben. Ezért munkámban célul tűztem ki az

irodalomban közölt genetikai ”pre-screening” módszerek előnyeinek és

hátrányainak szisztematikus elemzését követően egy megbízható,

könnyen reprodukálható, idő- és költségkímélő szűrőmódszer

bevezetését a MEN1 gén kódoló régióiban előforduló rendellenességek

kimutatásának elősegítésére.

(2) Célkitűzéseim közé tartozott a szűrőmódszerként bevezetett

hőmérsékletgrádiens elektroforézis rendszerek optimális technikai

paramétereinek kidolgozása és az ily módon optimalizált ”pre-

screening” módszerek specificitásának és szenzitivitásának

meghatározása.

(3) A MEN 1 szindrómás és MEN 1-szerű állapotban szenvedő betegekben

a ”pre-screening” vizsgálatot követően a MEN1 gén kódoló szakaszain

előforduló mutációk direkt DNS szekvenálással történő kimutatásával

elemezni kívántam a magyarországi betegek mutációs spektrumát és a

mutációknak az irodalomban közölt adatokhoz való viszonyát.

(4) A MEN 1 szindrómában és MEN 1-szerű állapotban szenvedő

betegekben tanulmányozni kívántam, hogy van-e összefüggés a MEN 1

szindróma tüneteinek száma, típusa, vagy egyéb fenotípus jellemzők és a

MEN1 mutációanalízis hatékonysága között.

(5) MEN1 gén mutációhordozó egyének vérrokon családtagjainak genetikai

szűrésével tanulmányozni kívántam a genetikai vizsgálatra alapozott

családszűrés közvetlen jelentőségét és klinikai értékét.

38

III. AZ ÁLTALUNK VIZSGÁLT BETEGEK

2001 szeptembere óta összesen 32 MEN 1 szindrómás vagy MEN 1-szerű

állapotban szenvedő beteget vizsgáltunk. A betegeket kezelőorvosaik és vagy genetikai

tanácsadáson tájékoztatták a genetikai vizsgálatról és beleegyező nyilatkozatot írtak alá.

A betegek között összesen 19 beteg (59.3%) volt klinikailag biztosan MEN 1

szindrómás, 1 beteg (3.1%) familiáris izolált hyperparathyreosisban szenvedett és 12

betegben (37.5%), klinikailag MEN 1-hez hasonló, MEN 1-szerű állapotot találtunk.

MEN 1–szerű állapot esetében, legalább egy fő és egy nem fő komponens volt

jelen; ebbe soroltuk azokat a betegeket is, akiknél 30 éves kor előtt kialakult multiplex

mellékpajzsmirigy tumorban, vagy rekurrens hyperparathyreosisban vagy familiáris

izolált hyperparathyreosisban szenvedtek. A vizsgált 32 beteg közül 19 MEN 1

szindrómás volt (6 familiáris, 13 sporadikus) és 13 beteg MEN 1-szerű állapotban

szenvedett ( 2 familiáris és 11 sporadikus).

A betegek tüneteit a 6. táblázat foglalja össze; a klinikailag biztosan MEN 1

szindrómás betegek közül 2 betegben találták meg mind a három major léziót (6.25%),

míg 17 betegben (53.13%) a vizsgálatkor két major elváltozás fordult elő. A MEN 1-

szerű állapotban szenvedők közül 2 betegben fiatalkori sporadikus MEN 1 tumor

(6.25%), 2 betegben egyféle MEN 1 daganat mellett a családi anamnézis (6.25%), 9

esetben (28.13%) pedig egy MEN 1 major lézió mellett valamely ismert minor lézió

megjelenése vetette fel a betegség gyanúját.

6. táblázat: MEN 1 daganatok az általunk vizsgált betegekben és a genetikai

vizsgálat eredménye

Indexeset száma

Hyperpara-thyreosis

Pancreas neuroendocrine

tumor

Agyalapi mirigy tumor

Minor MEN 1 lézió A genetikai

vizsgálat eredménye

Familiáris MEN 1 Betegek 2 fő MEN 1 lézióval

1. + + - Mv kéregadenoma Q209X 2. + - + - Nt657insC 3. + - + - A91V 4. + - + - L301R 5. + - + - Nt359del4bp

39

6. + - + - E26X

Sporadikus MEN 1 Betegek 3 fő MEN 1 lézióval

7. + + + - negatív 8. + + + - Nt317ins5bp

Betegek 2 fő MEN 1 lézióval

9. + - + Mv kéregadenoma Negatív 10. - + + - Nt738del4bp 11. + - + - Negatív 12. + - + Mv kéregadenoma Negatív 13. - + + - Negatív 14. + + - Hasfali lipoma C354X 15. + (rekurrens) + - - Negatív 16. + - + - Negatív 17. - + + - Negatív 18. + - + - Negatív 19. + - + - Negatív

Familiáris MEN 1-szerű állapot Betegek 1 fő MEN 1 lézióval

20. + (familiáris) - - - Negatív 21. - + (multiplex) - - Negatív

Sporadikus MEN 1-szerű állapot Betegek 1 fő MEN 1 lézióval

22. + (fiatal kori) - - - G28A 23. - - + Mv kéregadenoma Negatív 24. - + - Mv kéregadenoma Negatív 25. + (fiatal kori) - - - Negatív 26. + - - Mv kéreg carcinoma Negatív 27. - - + Kétoldali mv

kéregadenoma Negatív

28. + - - Carotis glomus tumor Negatív 29. + - - Mv kéregadenoma Negatív 30. + - - Mv angiomyolipoma Negatív 31. + - - Mv kéregadenoma Negatív 32. - - + Mv kéregadenoma Negatív

+: a kezelőorvos a dokumentációban leírta; -: a kezelőorvos a dokumentációban

nem írta le; mv: mellékvese.

A 32 beteg közül primer hyperparathyreosis 24 betegben (75%), pancreas

neuroendokrin daganat 10 betegben (31.25%) és hypophysis daganat 19 betegben

40

(59.38%) fordult elő. A minor léziók közül a leggyakoribb a mellékvesekéreg adenoma

volt (9 betegben: 28.13%). A mutáció azonosítása esetén a genetikai vizsgálatokat a

vérrokon családtagokban is elvégeztük.

41

IV. MÓDSZEREK

DNS-izolálás

EDTA-val vagy citráttal alvadásgátolt teljes perifériás vérből a kereskedelemben

forgalmazott kit-tek segítségével (DNA Isolation Kit for Mammalian Blood, Boehringer

Mannheim, Németország) genomiális DNS-t izoláltam. Az DNS törzsoldatokat a

felhasználásig –80 ˚C-on, a higított mintákat –20 ˚C-on tároltam.

PCR reakciók

A genomiális DNS-ből a MEN1 gén exonjait polimeráz láncreakcióval (PCR)

amplifikáltam. Minden PCR reakcióhoz 200-400 ng DNS-t használtam templát DNS-

ként 50 µl végtérfogatban. A reakció összetétele az alábbi volt: 15 és 35 pmol GC-

clamppel kiegészített és hagyományos (GC-clamp nélküli) oligonukleotid primer,

10mM Tris-HCl, 2,5mM MgCl2, 50mM KCl, 0.2 mmol/l dezoxinukleotid trifoszfát, 2 U

Taq Polymerase (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, Missouri, USA) és 5% glicerin.

TGGE-vel történő előszűréshez minden primerpár esetében az egyik egy 40 bázis

hosszúságú GC-gazdag régiót (GC-clampet) tartalmazott a futtatás során a teljes

denaturáció megelőzésére. A primereket Morelli és mtsai munkája alapján terveztem

[Morelli és mtsai 2000], a módszer optimalizálásához szükséges minimális

változtatásokkal (7. táblázat). Szekvenáláshoz ugyanezeket a primereket használtam

GC-clamp nélkül, de M13-véggel kiegészítve (lásd később).

A PCR reakció az alábbi lépéseket tartalmazta: kezdeti denaturáció 95 ˚C-on 5

percig, melyet 95 ˚C-on 1 perc denaturáció, 55-65 ˚C-on (a primernek megfelelő

speciális „annealing” hőmérséklet) 1,5 perc anellálás és 72 ˚C-on 1,5 perc elongáció

követett 35 ciklusban. A végső extenzió 72 ˚C-on 5 percig tartott. E hagyományos PCR

protokoll után a TGGE vizsgálathoz heteroduplex képzésre is szükség volt, melyhez az

alábbi módszert választottam: denaturáció 95 ˚C-on 5 percig, majd inkubáció szobahőn

1 órán át [Morelli és mtsai 2000]. A mintákat a mutáció-analízisig -20 ˚C-on tároltam. A

szekvenáláshoz használt PCR termékek esetében nem volt szükség heteroduplex

képzésre, viszont tisztításra igen, amit High Pure PCR Product kit-tel (Roche

Diagnostics, Mannheim, Germany) végeztem.

42

7. táblázat: A MEN1 gén mutációanalíziséhez használt primerek

Exon Forvard primer Reverz primer

2.1 Rcl 5’ggA ACC TTA gCg gAC CCT3’ 5’Rcl-AgT Agg TgA ggC CgC CAg 3’

2.2 Rcl 5’TCC CgA GCT CAC CTT CCA gC3’ 5’Rcl-ATg gAg ggT TTT gAA gAA gT3’

3 Fcl 5’Fcl-CTg TTA AAg CAC AgA ggA CC3’ 5’CAA ggC Tgg ggg gAg ggA AC3’

4 Fcl 5’Fcl-gAg ACA TAA TgA TCT CAT CC3’ 5’AAg TCT ggC CTA gCC CAg TC3’

5-6 Fcl 5’ Fcl- ggC TCA TAA CTC TCT CCT TC3’ 5’CAC TgT Tag ggT CTC CCT TC3’

7 Rcl 5’gAT CCT CTg CCT CAC CTC CA3’ 5’Rcl-gAg ggg AAg AAA ggA CAg gC3’

8 Rcl 5’gCC CgC CTC CAg CAA gCT gg3’ 5’Rcl-CCA TCC CTA ATC CCg TAC3’

9Rcl 5’ATC TgT gCC CTC CCT TCC CC3’ 5’Rcl-CTg TCA CCA CCT gTA gTg CC3’

10.1 Rcl 5’gCA ACC TTg CTC TCA CCT Tg3’ 5’Rcl-gAA AgT gAg AgC ACT ggA CCC TC3’

10.2 Fcl 5’Fcl-AgC ACC CgC AgC ATC ACC AC3’ 5’AAA ACA AgC ggT CCg AAg TC3’

Az általam alkalmazott forvard és reverz GC-clamp szekvenciája és jelölése a

táblázatban: Fcl: 5’ gCggCCgCCgCgTCCCgCCgCCCCCgCCCCgCCgCggCCg

3’ és Rcl: 5’ CggCCgCggCggggCgggggCggCgggACgCggCggCCgC 3’.

TGGE

TGGE esetében többféle szoftver áll rendelkezésre a futtatási paraméterek

optimalizálásához [Gille és Gille 2002].

Vizsgálataim során kétféle számítógépes programmal, a WinMelt (BioRad,

München, Németország) és az interneten is hozzáférhető Poland programmal

dolgoztam. A programok a megadott szekvencia alapján számolják ki a teoretikus

olvadási profilt, és grafikusan ábrázolják azt. Az általam használt kétféle TGGE

készülékhez (BioRad és Whatman, lásd később) a gyártói leírásban kétféle szoftvert

ajánlottak és az olvadási profilok kiértékeléséhez is több ponton eltérő ajánlásokat

tettek, ezért a módszer hatékonyságának növelésére összehasonlítottam a programokkal

számított eredményeket azokkal a hőmérséklet tartományokkal, amelyeket

perpendiculáris grádiens gél használatával állapítottam meg a MEN1 gén exonok

vizsgálata során.

43

DNS-szekvenálás

A TGGE-vel lokalizált genetikai eltéréseket automata szekvenálással

azonosítottuk. A DNS mintákat tisztítás után Big Dye Terminator Cycle-Sequencing kit

segítségével (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ABI Prism 310 automata

szekvenálóval (Genetic analyser, Applied Biosystems) vagy Cycle-sequencing kit with

7-deaza (Pharmacia Biotech, Uppsala, Svédország) segítségével LiCOR IR2 (Li-COR

Inc., Lincoln, USA) készülékkel szekvenáltuk. Utóbbi esetben a módszer M13-véggel

kiegészített primereket igényelt, melyek szekvenciája forward primer esetében 5’-3’

irányban ”CAC GAC GTT GTA AAA CGA C” szakasszal, reverse primer esetében

pedig 5’-3’ irányban ”GGA TAA CAA TTT CAC ACAGG” szakasszal bővült.

44

V. EREDMÉNYEK

A TGGE paramétereinek optimalizálása

A 8. táblázat adataiból látható, hogy ugyanazon DNS szekvencia esetében a

WinMelt program általában alacsonyabb hőmérséklet értékeket ad meg a Poland

programhoz képest, és mindkét program esetében a számított értékek különböznek a

tapasztalati úton, perpendiculáris futtatás segítségével nyert értékektől. Perpendiculáris

futtatás során egyetlen PCR-termék denaturációját követhetjük végig: a futtatás iránya

és a hőmérséklet grádiens egymásra merőlegesek, így megfigyelhető, hogy az adott

minta a gélben különböző hőmérsékleteken hogyan viselkedik. Láthatóvá válik festés

után, melyik hőmérsékleti ponton kezdődött a denaturáció és milyen hőmérsékleten

válik szét teljesen, azaz két külön szálra a DNS. Itt térnék ki ismét a GC-clampek

alkalmazásának jelentőségére: ha a PCR reakcióban az általunk amlifikált termék egyik

végére egy GC-gazdag régiót készíttetünk a Taq polimerázzal (előre megtervezett GC-

clampes primerek segítségével), a keletkezett PCR-termék azon része, amely ezt a

régiót tartlmazza, sokkal magasabb hőmérsékleti tatományokban fog denaturálódni. Így

az egész fragmens olvadási profilja megváltozik, jobban vizsgálhatóvá válik, azáltal,

hogy nem egy hőmérsékleti ponton, hirtelen egyszálú DNS-re esik szét, hanem lassan,

fokozatosan nyílik fel a DNS kettős spirál, ezáltal az egészen kis területet érintő,

egyetlen nukleotidot érintő mismatch-ek is kimutathatóvá válnak. Ez alapján érthető,

hogy a módszer specificitása és szenzitivitása a megfelelő primer tervezéstől és az

optimális hőmérsékleti tartományoktól kritikus mértékben függ.

Mivel egy adott DNS-szakasz denaturálási tulajdonságai nem csak a

szekvenciától, hanem a DNS koncentrációjától, az alkalmazott pufferek

ionkoncentrációjától is függ, szoftverek segítségével igen nehéz az adott futtatás precíz

körülményeinek in silico modellezése. Sokkal megbízhatóbbnak és

reprodukálhatóbbnak bizonyultak a perpendiculáris futtatás által „mérhető”

(kiszámítható) hőmérsékleti tartományok, mivel itt egy általunk beállított hőmérsékleti

grádiens az általunk használt körülmények (pl. só- és DNS koncentráció) mellett teszi

lehetővé, hogy a hőmérsékleti skálát a denaturációs profilhoz rendelve megállapítsuk a

denaturáció hőmérsékleti kezdő- és vágpontját. Vizsgálataim során azt tapasztaltam,

hogy a perpendiculáris elektroforézis segítségével kiszámított futtatási paraméterek

45

alkalmazásával kiküszöbölhetők a genetikai eltérés kimutatását nehezítő ”zavaros

sávok”-ból eredő problémák, melyeket a WinMelt programmal számított paraméterek

alkalmazásakor több exon esetében tapasztaltunk.

8. táblázat: A MEN1 gén TGGE-vel történő genetikai szűréséhez használt

módszerek hőmérsékleti tartományainak összehasonlítása

Magyarázat a táblázat rövidítéseihez:

Rcl: reverz primer GC-clamppel, Fcl: forvard primer GC-clamppel a PCR

reakcióban; „-„: az adott exon területén nem találtunk mutációt. (+): TGGE-vel

kimutatott mutáció; (-): TGGE-vel mutációt nem sikerült kimutatni.

Eredményeinket direkt szekvenálással ellenőriztük. *Bio-Rad, München,

Germany; **Ref. [Steger 1994]

46

nt1657insC (-)52-56°°°°C59-74°°°°C75-90°CZavaros band-ek58-68°°°°C74-84°CExon 10 Fcl

D418D (+)L432L (+)

60-67°°°°C29-74°°°°C45-90°CD418D (+)L432L (+)

40-67°°°°C56-83°CExon 9 Rcl

C354X (+)60,4-67,2°°°°C46-71°°°°C62-87°CC354X (+)35-65°°°°C51-81°CExon 8 Rcl

-50,2-53,6°°°°C32-74°°°°C48-90°CZavaros band-ek32-64°°°°C48-80°CExon 7 Rcl

-48,4-55,6°°°°C46-74°°°°C62-90°C-52-64°°°°C68-80°CExon 5-6 Fcl

-48,4-57,4°°°°C36-70°°°°C52-86°C-52-64°°°°C68-80°CExon 4 Fcl

nt738del4bp (+)Q209R (+)R171Q (+)

53-60,5°°°°C44-74°°°°C60-90°Cnt738del4bp (+)

Q209R (+)R171Q (+)

46-64°°°°C62-80°CExon 3 Fcl

nt317ins5bp54,8-66°°°°C53-74°°°°C69-90°C-58-63°°°°C74-79°CExon 2.2 Rcl

-46-58°°°°C49-75°°°°C65-91°CZavaros band-ek54-68°°°°C70-84°CExon 2.1 Rcl

Tm perpendicular electroforésis segítségével meghatározva, 8M urea használatával, a szűrés eredményei

Tm Poland software-rel** számolva, 8M

ureával(-16°°°°C)

Tm Poland program-mal

számolva

Tm by Winmelt software-rel*Számítva, 8M urea (-16°°°°C)

használatával, a szűrés eredményei

Tm WinMeltSoftware-rel

számítvaExon

nt1657insC (-)52-56°°°°C59-74°°°°C75-90°CZavaros band-ek58-68°°°°C74-84°CExon 10 Fcl

D418D (+)L432L (+)

60-67°°°°C29-74°°°°C45-90°CD418D (+)L432L (+)

40-67°°°°C56-83°CExon 9 Rcl

C354X (+)60,4-67,2°°°°C46-71°°°°C62-87°CC354X (+)35-65°°°°C51-81°CExon 8 Rcl

-50,2-53,6°°°°C32-74°°°°C48-90°CZavaros band-ek32-64°°°°C48-80°CExon 7 Rcl

-48,4-55,6°°°°C46-74°°°°C62-90°C-52-64°°°°C68-80°CExon 5-6 Fcl

-48,4-57,4°°°°C36-70°°°°C52-86°C-52-64°°°°C68-80°CExon 4 Fcl

nt738del4bp (+)Q209R (+)R171Q (+)

53-60,5°°°°C44-74°°°°C60-90°Cnt738del4bp (+)

Q209R (+)R171Q (+)

46-64°°°°C62-80°CExon 3 Fcl

nt317ins5bp54,8-66°°°°C53-74°°°°C69-90°C-58-63°°°°C74-79°CExon 2.2 Rcl

-46-58°°°°C49-75°°°°C65-91°CZavaros band-ek54-68°°°°C70-84°CExon 2.1 Rcl

Tm perpendicular electroforésis segítségével meghatározva, 8M urea használatával, a szűrés eredményei

Tm Poland software-rel** számolva, 8M

ureával(-16°°°°C)

Tm Poland program-mal

számolva

Tm by Winmelt software-rel*Számítva, 8M urea (-16°°°°C)

használatával, a szűrés eredményei

Tm WinMeltSoftware-rel

számítvaExon

47

Az 5. ábra a MEN1 gén 9. exonjának példáján keresztül azt illusztrálja, hogy optimális

paraméterek alkalmazása esetén a TGGE módszerrel nem csak a heterozigóta, hanem a

homozigóta genetikai eltérések is kimutathatóak. Látható továbbá, hogy az elekroforézis

gélképe alapján egyértelműen elkülöníthető a D418D mutáció heterozigóta formája attól

a mintától is, mely compound heterozigóta formában hordoz két gyakori

polimorfizmust: a D418D-t és az L432L-et, vagyis a különböző genetikai eltérések

elektroforetikus képük alapján is biztonsággal elkülöníthetőek.

5. ábra: A MEN1 gén 9. exonjának szűrése TGGE-vel

Az első oszlopban a negatív kontroll látható, a 2-14. oszlopig pedig a betegek

mintái. A 2., 3., 5., 7., 8., 9., 10. és 12. oszlopban egy gyakori MEN1 polimorfizmus

(D418D) heterozigóta formája, a 4., 13. és 14. oszlopokban ugyanezen

polimorfizmus homozigóta formája látható. A 6. oszlopban pedig a két gyakori

polimorfizmust (D418D és L432L) compound heterozigóta formában hordozó

DNS-fragmens elektroforetikus mintázata látható (a genetikai eltéréseket minden

esetben DNS szekvenálással azonosítottunk). A 11. oszlopban ezen az exonon

genetikai eltérést nem hordozó PCR-fragment képe látható.

A TGGE módszerrel nyert eredményeket ugyanazon DNS minták direkt

szekvenálásával nyert eredményeivel összehasonlítva megállapítottam, hogy a TGGE

módszerrel álpozitív eredmény egyetlen esetben sem fordult elő. Ugyanakkor egy 10-es

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

48

exonon található mutációt (nt1657insC) nem sikerült kimutatnom sem TGGE-vel, sem

heteroduplex analízissel annak ellenére, hogy a két program által számított

paramétereken kívül a perpendiculáris futtatás során kapott paramétereket is használtam

(a mutációt végül direkt szekvenálással azonosítottam), több DNS mintából is

megpróbáltam, minden családtagnál, akik az adott mutációt örökölték. Ezen álnegatív

eredmény okát felderíteni nem sikerült. Megemlíthető, hogy a 10-es exonon a TGGE

módszerrel álnegatívnak bizonyuló mutációt Bassett és mtsai SSCP-vel ki tudták

mutatni [Bassett és mtsai 1998].

Egy másik szűrőprogramban, ahol WinMelt-TGGE paramétereket használtak, az

összes mutációt sikerült lokalizálni, azonban 4 esetben álpozitív eredményt kaptak

[Wrocklage és mtsai 2002], feltehetően a kétszálú DNS teljes denaturálása miatt. A két

számítógépes program között azonban nem volt különbség az adott DNS szakaszon

meghatározott melting domének és a GC-clampek helyzetének kiszámításában (6. ábra).

Összefoglalva tehát, saját tapasztalataim megerősítik, hogy a TGGE módszer

sikeres alkalmazásához jelentős segítséget nyújt a PCR primerek szoftverrel történő

megtervezése és az ideális hőmérsékletgrádiens kiszámítása. A jelenleg elérhető

szoftverek használata segítheti annak eldöntését, hogy a forward vagy a reverse primer

tartalmazza-e a GC-clampet. A szofverekkel modellezhető, hogy a keletkező PCR

fragmens 3’ vagy 5’ végére érdemes a GC-gazdag régiót illeszteni: TGGE-vel történő

elektroforézishez az a termék ideális, melyben az egymást követő melting domének

egyre magasabb hőmérsékleti tartományokban denaturálnak, és a legmagasabb

denaturációs hőmérséklet a GC-gazdag régió „olvadásához” szükséges. Így biztosítható,

hogy az általunk vizsgált exon a GC-gazdag régióval elletétes végén kezdjen „felnyílni”

és ez a faág-szerű denaturáció folyamatos legyen a termék teljes hosszában.

49

6. ábra: WinMelt (A) és Poland (B) szoftverek összehasonlítása a MEN1 gén 8-as

exonján meghatározható melting domének tekintetében

1 67 133 199 265 33147.0

58.8

70.6

82.4

94.2

106.0

Sequence position (bp)

Melting temperature (°C)

MNexon8Rcl

A

1. melting domén

2. melting domén

3. meltingdomén (GC-

clamp)62˘C

87˘C

105˘C

95˘C

81˘C

51˘C

1. melting domén

2. melting domén

3. meltingdomén (GC-

clamp)

Melting hőmérséklet (°C)

Szekvencia (bázispár)

Melting hőmérséklet (°C)

Szekvencia (bázispár)

B

1 67 133 199 265 33147.0

58.8

70.6

82.4

94.2

106.0

Sequence position (bp)

Melting temperature (°C)

MNexon8Rcl

A

1. melting domén

2. melting domén

3. meltingdomén (GC-

clamp)62˘C

87˘C

105˘C

95˘C

81˘C

51˘C

1. melting domén

2. melting domén

3. meltingdomén (GC-

clamp)

Melting hőmérséklet (°C)

Szekvencia (bázispár)

95˘C

81˘C

51˘C

1. melting domén

2. melting domén

3. meltingdomén (GC-

clamp)

Melting hőmérséklet (°C)

Szekvencia (bázispár)

Melting hőmérséklet (°C)

Szekvencia (bázispár)

B

50

A korrekt denaturációs hőmérséklet-tartomány meghatározásához, a teljes

denaturáció, vagy a mutáció detektálási szempontból érdektelen alacsony hőmérsékletek

elkerüléséhez azonban hasznosabbnak tűnik a perpendiculáris elektroforézis használata.

(7. ábra).

7. ábra: A futtatási paraméterek meghatározása perpendiculáris electrophoresis

segítségével [Balogh és mtsai 2004]

34

˘C7

0˘C

52°C 56°C

T1 T2

Lineáris grádienssel emelkedő hőmérséklet

ele

ktr

ofo

rézis

34

˘C7

0˘C

52°C 56°C

T1 T2

Lineáris grádienssel emelkedő hőmérséklet

ele

ktr

ofo

rézis

Kis hőmérsékleten (T1 alatt) a DNS kétszálú molekulaként vándorol; közepes

hőmérsékleten (T1 és T2 között) a DNS egyik oldalán denaturálódás kezdődik (a

másik oldalon a GC-clamp összetartja a két szálat) és a részlegesen denaturált

DNS fokozatosan lelassul. Nagy hőmérsékleten (T2 felett) a DNS irreverzibilisen 2

külön szálra bomlik. A minták analízise csak a T1 és T2 hőmérsékletek között

értékelhető. (Ha a paramétereket WinMelt vagy Poland szoftverekkel számoljuk,

általában T2 feletti hőmérséklet tartományokban futtatjuk a DNS-t).

Munkám során két különböző mutáció detektáló rendszerrel dolgoztam.

Elsőként a DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, München,

Németország) készüléket használtam (8. ábra).

51

8. ábra: DCode Universal Mutation Detection System (Bio-Rad, München,

Németország)

A DCode Universal Mutation Detection System készüléken a puffer

hőmérsékletének növelésével érhető el az elekroforézis alatt a gél és a benne lévő DNS

minták melegítése. A futtatási paramétereket kezdetben a készülékhez ajánlott WinMelt

szoftverrel számoltam. Munkám során azonban többször találkoztam értékelési

nehézségeket okozó ”zavaros band”-ekkel.

Az általam használt másik készülék a TGGE standard system (Whatman

Biometra, Göttingen, Németország) volt (9. ábra), melyhez a forgalmazó a Poland

szoftver használatát ajánlotta, azonban az optimális hőmérséklet tartományok

beállításához perpendiculáris futtatásokat is végeztem. A TGGE standard system

készülék egy száraz rendszerű elektroforézis módszert alkalmaz; a gél polybond filmen

keresztül egy teflon bevonatú, szabályozható hőmérsékletű felületen fekszik, melyre az

akrilamid kovalens kötéssel kötődik. A gél két oldalán található pufferterek közötti

összeköttetést szűrőpapírok biztosítják. A készülék lehetővé teszi a gél hőmérsékletének

közvetlen szabályozását, és ezáltal a minták hőmérsékletének pontosabb beállítását.

52

9. ábra: TGGE standard system (Whatman Biometra, Göttingen, Németország)

Az elekroforézis mindkét készüléken 8%-os acrylamid/bisacrylamid (37.5:1)

gélen történik, 8 M urea jelenlétében (az urea csökkenti a DNS olvadási hőmérsékletét),

1xTAE pufferben. A két rendszer közötti különbséget a 9. táblázat foglalja össze.

9. táblázat: A két TGGE rendszer összehasonlítása

DCode (BioRad) TGGE standard system

(Whatman Biometra)

Gélösszetétel

8% acrylamid/bisacryl-

amid, 8M urea

8% acrylamid/bisacryl-

amid, 8M urea,

2% glicerin

Gél mérete 16 cm x 16 cm 8 cm x 8 cm

Gélen vizsgálható minták

száma 16 12

Elektroforézis típusa nedves száraz

Melegítés puffer gél

Szükséges puffermennyiség 7 l/futtatás 0,5 l/futtatás

PCR termék mennyisége 8 µl 1,5-2,5 µl

Futtatási idő 6-9 óra 50 perc

Feszültség 140V 250V

Festés Ethidium bromiddal Ezüst nitráttal

53

Az elektroforézis után a DCode (BioRad) rendszer esetében ethidium bromid

festést követően Fluor-S MultiImager (Bio-Rad) készülékkel fényképet készítettem, a

TGGE standard system használatakor pedig ezüst nitráttal történő festés után

fényképeztem le a géleket.

ELŐSZŰRÉS ÉS SZEKVENÁLÁS

A TGGE módszerrel a 2-es exonon 4 esetben, a 3-as exonon 9 esetben, az 5-6-os

exonokat tartalmazó szakaszon 1 esetben, a 8-as exonon 1 esetben, a 9-es exonon pedig

18 esetben heterozigóta és 3 esetben homozigóta genetikai eltérést találtam. Az összes

DNS minta és a MEN1 gén összes kódoló exonja esetében szekvenálást is végeztem.

10. táblázat. MEN1 gén mutációk és polimorfizmusok az általunk vizsgált

betegekben

Mutáció Polimorfizmus

Exon 2 nt317ins5bp

A91V

G28A

nt359del4bp

E26X*

S145S

Exon 3 nt738del4bp

Q209X

R171Q

Exon 5-6 L301R -

Exon 8 C354X -

Exon 9 - D418D

L432L

Exon 10 nt1657insC** -

A vastag betűkkel jelölt mutációkat a nemzetközi irodalomban korábban még nem

írták le. *:PCR optimalizálási probléma miatt a TGGE analízis nem volt

kivitelezhető, **:TGGE-vel álnegatív eredmény

54

Összesen 10 probandban találtam betegség-okozó MEN1 gén mutációt (2

esetben deléció, 2 esetben inzerció, 3 esetben nonsense és 3 esetben missense mutáció).

A 10 mutáció közül 5 a nemzetközi irodalomban korábban még nem ismertetett, új

mutációnak felelt meg. A mutációkon kívül több ismert, betegséget nem okozó

polimorfizmust is azonosítottam (10. táblázat): heterozigóta formában S145S

polimorfizmust 1 betegben, heterozigóta R171Q polimorfizmust 7 betegben, hetero- és

homozigóta formában a D418D polimorfizmust 18, illetve 3 betegben, és heterozigóta

formában egy betegben az L432L polimorfizmust. Érdekességként említeném meg,

hogy az egyik betegünkben 3 különböző polimorfizmust (R171Q, L432L, D418D) is

találtunk a betegségokozó mutáció mellett (C354X).

A módszertani részben tárgyalt álnegatív eredményű TGGE vizsgálaton kívül

(10-es exon TGGE vizsgálat negatív, de direkt DNS szekvenálással inzerciós mutáció)

egy további esetben a 2-es exon vizsgálatakor GC-clampet tartalmazó primerekkel nem

sikerült kellő mennyiségű és tisztaságú PCR terméket előállítani a pre-screeninghez,

viszont DNS szekvenálással egy új, a nemzetközi irodalomban még nem közölt

nonsense mutációt találtam.

Családvizsgálattal két esetben bizonyítottam, hogy a betegség-okozó MEN1 gén

mutáció de novo alakult ki; további két esetben az egyik szülő korai halála miatt nem

sikerült a mutáció eredetét, esetleges de novo voltát megállapítani. Családszűrést azon

betegek elsőfokú rokonainál végeztem, akiknél sikerült azonosítani a betegség-okozó

mutációt, összesen 6 szimptómás és 15 aszimptomatikus első-fokú családtagnál. Egy

családban a mutációanalízis egy tünetmentes, fiatal gyermekben mutatta ki a mutáció

öröklését, a többi családtagnál a genetikai vizsgálat a klinikai képnek megfelelő

eredményt adott.

ESETBEMUTATÁS, CSALÁDSZŰRÉS

Az első, általunk vizsgált család vizsgálata egy atípusos MEN1 szindrómás

proband genetikai vizsgálatával kezdődött. A fiatal nő 25 éves korában a betegség első

tünete egy nagyméretű (11 cm-es), multiplex nem funkcionáló pancreas neuroendokrin

daganat volt, melyet distális pancreatectomiával távolítottak el (10. ábra). A műtét során

egy 3 cm-es hasfali lipoma is eltávolításra került.

55

10. ábra: MEN 1 szindrómás beteg pancreas neuroendokrin tumorának

makroszkópos és hisztológiai képe

1cm

a, b: HE festésc: synaptophysind: chromogranin Ae: neuron specifikus enolázf: inzulin immunhisztokémia

1cm

a, b: HE festésc: synaptophysind: chromogranin Ae: neuron specifikus enolázf: inzulin immunhisztokémia

A kép bal oldalán látható neuroendokrin pancreas daganatot egy MEN 1

szindrómás fiatal beteg operációja során distális pancreatectomiával távolították

el. A kép jobb oldala a hisztológiai és immunhisztokémiai vizsgálatok eredményeit

illusztrálja; a daganatban endocrin jellegű sejtekből álló nodulusok trabecularis

(100x) (a) és solid (200x) (b) szerkezete ismerhető fel hematoxilin-eosin festéssel. A

daganat synatophysin (400x) (c), chromogranin A (600x) (d) és neuron specifikus

enoláz (400x) (e) pozitivitást mutatott és egy kisméretű nodulusban insulin

jelenlétét is ki lehetett mutatni (400x) (f).

A beteg családi anamnézise ugyan nem utalt MEN 1 szindróma lehetőségére,

azonban a pancreas neuroendokrin daganat multiplex jellege és a társuló lipoma már

ekkor felvethette volna atípusos MEN 1 szindróma diagnózisát. A diagnózist azonban

csak 2 évvel később állapították meg, amikor a MEN 1 szindróma új tüneteként primer

hyperparathyreosist észleltek és mellékpajzsmirigy műtétet végeztek. A genetikai

vizsgálatok a probandban egy új, a nemzetközi irodalomban korábban nem ismertetett

nonsense MEN1 gén mutáció jelenlétét bizonyították (Q354X) (11./a, b ábra). Ez a

mutáció a kodonok szintjén egy glutamint kódoló bázistriplet stop kodonra cserélődését

eredményezi a 8-as exonon, ami egy rövidebb és feltehetően kóros funkciójú fehérje

56

képződésével jár. A betegség-okozó mutáción kívül több polimorfizmust is találtam;

egy arginint glutaminra cserélő polimorfizmust a 3-as exon (R171Q) és két, aminosavat

nem cserélő polimorfizmust a 9-es exon területén (L432L, D418D). A proband

édesanyja és testvére nem hordozták a betegség-okozó mutációt, ezért feltételezhető,

hogy a mutáció de novo keletkezett, vagy a proband ismeretlen okból korán elhunyt

édesapjától öröklődhetett. Az édesanya a probandban észlelt polimorfizmusok közül a

D418D-t heterozigóta formában hordozta, míg a beteg testvérében egyik genetikai

eltérés sem volt jelen (11./c, d ábra).

11. ábra: C354X mutáció szűrése TGGE módszerrel (a), direkt DNS

szekvenálással történő azonosítása (b), a családszűrés eredményei (c) és a

polimorfizmusok vizsgálata (d)

--

++--

a) b)

c)

C

R171Q

d)D418D

D418D, L432L

--

++--

--

++--

--

++--

--

++--

--

++--

a) b)

c)

C

R171Q

d)D418DD418D

D418D, L432L

Atípusos MEN 1 szindrómás beteg családfája: A MEN1 gén mutáció jelenlétét a

ferde vonalakkal kitöltött szimbólum jelzi. ↑↑↑↑ proband; + klinikai tünetek vannak; -

klinikai tünetek nincsenek; † elhunyt; ���� férfi; O nő. A betegség hátterében álló

TGC→→→→TGA mutáció a 354. kodon területén Cys →→→→STOP cserét eredményez.

57

A 12. ábra egy típusos MEN 1 szindrómás családban mutatja be a betegség

öröklődését. A proband a két MEN 1 szindrómás leánytestvér egyike volt, akik

édesanyja klinikailag igazolt MEN 1 szindrómában szenvedett és fiatalon

gyomorvérzésben hunyt el. A probandban és lánytestvérében már fiatal korban primer

hyperparathyreosis alakult ki. A probandban „pre-screening” módszerrel nem lehetett

genetikai eltérést kimutatni, a DNS szekvenálás azonban a két leánytestvérben és a

proband tünetmentes gyermekében a MEN1 gén inzerciós mutációjának jelenlétét

bizonyította (nt1657insC). A mutáció következtében a 10-es exon területén egy citozin

ékelődik be a normál bázissorrendbe, ami a leolvasási keret eltolódását (”frameshift”) és

ettől a ponttól kezdve kóros fehérjeszerkezet, illetve korai STOP kodon kialakulását

okozza. A genetikai vizsgálat eredménye a tünetmentes mutáció-hordozó gyermekben

különösen fontos adatot jelent a követéses vizsgálatok megfelelő tervezéséhez.

12. ábra: MEN 1 család 13. ábra: MEN 1 család 14. ábra: MEN 1 család

(nt1657insC) (nt738del4bp) (Q209X)

++ ++

--

--

++

--

? -

+-

+

+

-++ ++

--

--

++

--

nt1657insC

? -

+-

nt738del4bp

+

+

-

Q209X

++ ++

--

--

++

--

? -

+-

+

+

-++ ++

--

--

++

--

nt1657insC

? -

+-

nt738del4bp

+

+

-

Q209X

A 13. ábrán illusztrált családban a fiatal férfibeteg hypoglycaemia tüneteivel

került kórházi felvételre. Endokrinológiai kivizsgálása során pancreas insulinomát és

prolactin-termelő hypophysis adenomát találtak. Évekkel később primer

hyperparathyreosisa is kialakult. A MEN1 gén mutáció analízis a 3-as exon területén

egy korábban már leírt, 4 bázist érintő deléciós mutációt (nt738del4bp) mutatott ki. A 4

bázis deléciója a kereteltolódás miatt kóros fehérjeszerkezettel jár és korai STOP kodon

kialakulását okozza. A betegben egy gyakori, aminosavat nem cserélő polimorfizmus

58

(D418D) is jelen volt homozigóta formában. A beteg édesanyja klinikailag és

genetikailag is negatívnak bizonyult, a beteg édesapja korán elhunyt (oka ismeretlen). A

beteg testvére nem járult hozzá a genetikai vizsgálathoz, de klinikailag tünetmentes volt,

és más családtagban sem jelentkeztek eddig a MEN1 szindróma tünetei. Ezek alapján

feltételezhető, hogy a mutáció de novo alakult ki.

A 14. ábrán illusztrált családban a proband hyperparathyreosisa évek óta ismert

volt, és a mellékpajzsmirigy műtétet követően recidiváló gyomorfekély irányította a

figyelmet MEN 1 szindróma irányába. Hasi ultrahang vizsgálattal később mellékvese

adenomát is felfedeztek. A proband fiánál szintén hyperparathyreosist diagnosztizáltak,

unokája klinikailag tünetmentes volt. A genetikai vizsgálat során egy nonsense MEN1

gén mutációt találtam, amely a 3-as exon területén egy glutamin cserél STOP kodonra

(Q209X) és ezáltal a 3-as exonnak megfelelően csonkolt fehérje képződését okozza.

Feltehető, hogy a rövid fehérje nem rendelkezik azokkal a szerkezeti egységekkel,

amelyek nélkülözhetetlenek a normális működéséhez. A probandban a D418D

polimorfizmus is jelen volt heterozigóta formában. Mind a mutációt, mind a

polimorfizmust a proband fiában is ki lehetett mutatni. A proband unokája nem örökölte

a mutációt, ezért mentesülhet az élethossziglan tartó követéses vizsgálatok alól.

15. ábra. MEN1 gén nt317ins5bp mutációjának szekvenálási képe és a mutáció

által okozott kereteltolódás szekvenciális alapja

1. allél: Normál A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C-C-C-G-C-C

2. allél: Mutáns A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C5 bázispár inzerciója

A G C C C C G C C C C C/G G/C A/C C/C C/C C/G G/G C/A C/C

317.

1. allél: Normál A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C-C-C-G-C-C

2. allél: Mutáns A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C5 bázispár inzerciója

A G C C C C G C C C C C/G G/C A/C C/C C/C C/G G/G C/A C/C

317.

1. allél: Normál A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C-C-C-G-C-C

2. allél: Mutáns A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C5 bázispár inzerciója

A G C C C C G C C C C C/G G/C A/C C/C C/C C/G G/G C/A C/C

317.

1. allél: Normál A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C-C-C-G-C-C

2. allél: Mutáns A-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-G-C-C-C-C-C-G-A-C5 bázispár inzerciója

A G C C C C G C C C C C/G G/C A/C C/C C/C C/G G/G C/A C/C

317.

59

A 15. ábrán bemutatott mutációt egy fiatal fiúban mutattuk ki, aki kompressziós

tüneteket (fejfájás, látótérkiesés) okozó LH/FSH és GH termelő hypophysis

adenomában szenvedett, kezelése során ismételt hypophysis műtétekre és

sugárkezelésre volt szükség. Később primer hyperparathyreosis, vesekövesség és súlyos

osteoporosis is kialakult. A genetikai vizsgálat egy ismert inzerciós mutációt mutatott

ki, amely a 2-es exon területén egy repetitív szakasz ismétlődése miatt 5 bázis

beékelődésével járt (nt317ins5bp). A mutáció ebben az esetben is kereteltolódáshoz és

kóros fehérjeszerkezet és korai STOP kodon kialakulásához vezet. A betegben

heterozigóta D418D polimorfizmus is jelen volt. A beteg 8 testvére klinikailag

tünetmentes volt és klinikailag szintén tünetmentes szülők genetikai vizsgálata során

nem találtunk mutációt. Ennek alapján a betegben de novo kialakult mutációt lehetett

megállapítani és a 8 testvér genetikai vizsgálatára nem volt szükség.

16. ábra: A MEN1 gén A91V mutációját hordozó beteg családfája és az új mutáció

szekvenálási képe

+

+?

-

T C T A T G C C C G C T T C

T

GCC → GTC csere a 91-es kodonbanA91V

+

+?

-

+

+?

-

T C T A T G C C C G C T T C

T

GCC → GTC csere a 91-es kodonbanA91V

A 16. ábrán illusztrált típusos MEN 1 szindrómás családban a proband évtizedek

óta ismert primer hyperparathyreosisban és hypophysis adenomában szenvedett. A

proband fia, akinek hyperparathyreosisa szintén ismert volt gyomorvérzésben elhunyt, a

proband unokája klinikailag tünetmentes volt. A proband genetikai vizsgálata során a

MEN1 gén 2-es exonja területén egy missense mutációt találtam, amely egy alaninnak

valinra cserélődését (A91V) okozza. Ezt a mutációt korábban még nem írták le a

nemzetközi irodalomban, de a MEN1 gén más területén ugyanezt az aminosavcserét a

60

nemzetközi irodalomban betegségokozó mutációként tartják számon (pl. A535V,

A242V) [Zhuang és mtsai 1997]. A probandban a 9-es exonon D418D heterozigóta

polimorfizmus is jelen volt. A proband unokája nem örökölte a mutációt.

17. ábra. A MEN1 gén G28A mutációját hordozó beteg családfája és a mutáció

szekvenálási képe

- -

+

C T G G G C C G A

C

G28A GGC → GCC csere a 28-as kodonban

- -

+

- -

+

C T G G G C C G A

C

G28A GGC → GCC csere a 28-as kodonban

A 17. ábrán szemléltetett családban a MEN1 gén mutáció de novo alakult ki. A

fiatal nőbeteg recidíváló primer hyperparathyreosisban szenvedett, édesanyja és

édesapja klinikailag tünetmentes volt. A proband genetikai vizsgálata során a 2-es exon

területén egy glicint alaninra cserélő missense mutációt (G28A) találtam, melyet a

nemzetközi irodalomban eddig még nem írtak le. A mutáció egyik szülőben sem volt

jelen. A MEN1 gén területén glicin-alanin cserét eredményező mutációt még nem írtak

le a nemzetközi irodalomban és a két aminosav szerkezete is hasonló, ezért a mutáció

biztosan betegség-okozó szerepét egyelőre nem tekinthetjük egyértelműen bizonyosnak.

A probandban a 3-as exon területén egy aminosav cserével járó gyakori polimorfizmust

is találtam (R171Q).

A 18. ábrán szemléltetett családban a proband FSH/LH termelő hypophysis

adenomában és primer hyperparathyreosisban szenvedett. A proband két

leánytestvérénél szintén hyperparathyreosist, valamint recidíváló gyomorfekélyt

állapítottak meg. Mindkét szülő elhunyt (az édesapa fiatal korban), betegségeikről

orvosi dokumentáció nem állt rendelkezésre. A proband két leánya közül az egyiknél

hyperparathyreosist és hyperprolactinaemiát állapítottak meg, a másik leány klinikailag

tünetmentes volt. A genetikai vizsgálatok során a MEN1 gén 6-ös exonjának területén

lizin - arginin cserét okozó missense mutációt (L301R) mutattam ki. Ezt a mutációt

korábban még nem közölték a nemzetközi irodalomban, de a MEN1 gén más területén

61

ugyanezen aminosavcserével járó mutációt betegség-okozó mutációnak tekintik (pl.

L22R [Agarwal és mtsai 1997], L89R [Hessmann és mtsai 1998]). A család szűrésével

nyert eredmények a L301R mutáció oki szerepét támasztották alá; a MEN1 szindróma

klinikai tünetei a genetikai eltérést hordozó összes családtagban jelen voltak, míg a

klinikailag tünetmentes családtagokban a genetikai eltérést nem lehetett kimutatni.

18. ábra. A MEN1 gén L301R mutációját hordozó beteg családfája és a mutáció

szekvenálási képe

?

+ + +

+ - -

?

L301R

A C C C T C T A C

G

CTC → CGC csere a 301-es kodonban

?

+ + +

+ - -

? ?

+ + +

+ - -

?

L301R

A C C C T C T A C

G

A C C C T C T A C

G

CTC → CGC csere a 301-es kodonban

A 19. ábra egy primer hyperparathyreosisban és hypophysis adenomában

szenvedő fiatal férfibetegben a MEN1 gén 2-es exonjának területén 4 bázispár

deléciójával járó mutációt (nt359del4bp) szemléltet. A mutáció kereteltolódás révén

kóros fehérjeszerkezet és korai STOP kodon kialakulásához vezet. A beteg klinikailag

tünetmentes édesanyjánál a mutációt nem lehetett kimutatni, a család többi tagjánál a

klinikai adatok gyűjtése és a genetikai szűrés még folyamatban van.

62

19. ábra. A MEN1 gén nt359del4bp mutációjának szekvenálási képe, a mutáció

által okozott kereteltolódás mechanizmusa

A C C T G/A T/T C/C T/A A/T T/C C/G A/A T/C

359.

1. allél: Normál: A C C T G T C T A T C A T

2. allél: Mutáns: A C C T A T C A T C G A C

Négy bázis deléciója

A C C T G/A T/T C/C T/A A/T T/C C/G A/A T/C

359.

1. allél: Normál: A C C T G T C T A T C A T

2. allél: Mutáns: A C C T A T C A T C G A C

Négy bázis deléciója

Az utolsóként felfedezett mutációhordozó családban a családszűrés jelenleg

folyamatban van: a proband a 2-es exon területén az E26X nonsense mutációt hordozza,

mely korábban a nemzetközi irodalomban nem szerpelt. A mutáció a 26-os kodon

területén egy GAG>TAG nukelotid cserét okoz, amely az amionosav sorrendben a 26-

os helyen található glutaminsav helyett kialakuló STOP kodon révén korai terminációt

eredményez. Így ezen esetben egy igen rövid, mindössze 25 aminosavból álló csonkolt

fehérje keletkezik, így a mutáció betegség-okozó szerepe nem kétséges. A fiatal nőbeteg

hyperparathyreosisban szenved, emellett prolactinomát is leírtak nála. Szintén hasonló

manifesztációkkal rendelkező édesapja is mutációhordozónak bizonyult. A többi

családtag szűrése jelenleg folyamatban van.

63

VI. MEGBESZÉLÉS

A MEN 1 szindróma hátterében álló MEN1 gén mutációk vizsgálata igen nagy

kihívás a gén nagy mérete, a lehetséges csírasejtes mutációk nagy száma, a mutációs

”hot spot” hiánya, továbbá a genotípus-fenotípus összefüggések hiánya miatt. A

genetikai eltéréseket tartalmazó gén-szakaszok kimutatására többféle szűrőmódszert

dolgoztak ki, melyek közül munkámban a TGGE módszert használtam. A TGGE

módszerrel kimutatott heterozigóta vagy homozigóta genetikai eltérések

(polimorfizmusok és mutációk) pontos meghatározására direkt DNS szekvenálást

végeztem. A TGGE szűrőmódszerrel szerzett tapasztalatokat az alábbiakban foglalom

össze:

� A módszer érzékenységének növeléséhez az oligonukleotid primerek

tervezésekor a rendelkezésre álló számítógépes szoftver programok

használata ajánlott, melyekkel a melting domének pontosan

megítélhetők.

� Az elektroforézis paramétereinek optimalizálásához viszont egy

experimentális módszer, a perpendiculáris elektroforézis bizonyult a

leghatékonyabbnak.

� Megfigyelések szerint MEN 1 szindrómában szenvedő betegekben a

perifériás vérből származó DNS instabilabb és törékenyebb, mint

egészségesekben. Vizsgálataim során egy beteg DNS mintájában az első

alkalommal sikeres próbálkozást követően a 2-es exon PCR

amplifikálását nem sikerült elvégezni. A betegtől később levett

vérmintából frissen izolált DNS-ből végzett vizsgálat problémamentes

volt.

� A MEN1 gén 10-es exon területén konzekvensen észlelt álnegatív

eredmény miatt ennek az exonnal TGGE módszerrel való vizsgálata nem

ajánlott.

� A 9-es exon területén kétféle gyakori polimorfizmus fordult elő

heterozigóta vagy homozigóta formában (D418D, L432L). A különböző

polimorfizmusok elektroforetikus képe egymástól jól elkülöníthető, ezért

64

ennek az exonnak a vizsgálata során belső kontrollként – a

polimorfizmusokat nem tartalmazó negatív kontroll mintán kívül -

D418D és L432L heterozigóta DNS minták használata is ajánlott.

� A TGGE módszerre alapozott szűréssel nyert eredmények

megerősítéséhez a megfelelő DNS szakasz nukleotid szekvenciájának

meghatározása szükséges.

Megállapítottam, hogy a MEN1 gén leggyakoribb polimorfizmusai a magyar

populációban a nemzetközi adatokhoz hasonló gyakorisággal fordulnak elő. A MEN 1

szindrómás betegekben kimutatott polimorfizmusok betegség-okozó szerepe kizárható,

hiszen nemzetközi irodalmi adatok szerint ezek az egészséges populációban is nagy

gyakorisággal mutathatók ki, aminosavat a menin protein-szekvenciájában nem

cserélnek. Az általunk vizsgált betegek és egészséges hozzátartozóik vizsgálata során

számos esetben találkoztunk polimorfizmusokkal nemcsak heterozigóta, de homozigóta

formában is, és a betegség manifesztációjával semmilyen formában nem korreláltak. A

betegekben kimutatott mutációk oki szerepének értékelésekor többféle szempontot

vettem figyelembe. A hazai MEN 1 szindrómás betegekben kimutatott 10 különböző

mutáció közül 5 mutációt a nemzetközi irodalomban betegség-okozó mutációként

tartottak számon, ezért ezeket a mutációkat – a nemzetközi tapasztalatokat megerősítve

– ennek megfelelően értékeltem: a 2 deléciós és 2 inzerciós mutáció kereteltolódáshoz,

így megváltozott fehérje aminosavsorrendhez és korai STOP kodon kialakulásához

vezet, a nonsense mutáció pedig egy aminosavat STOP kodonra vált, így csonkolt

fehérje kialakulásához vezet. A hazai MEN 1 szindrómás betegekben észlelt további 5

mutáció azonban új, a nemzetközi irodalomban korábban még nem ismertetett

mutációnak felelt meg, ezért ezek értékelésekor nem állt rendelkezésre korábbi

ismeretanyag. A menin fehérje röntgenkrisztallográfiás szerkezete még nem ismert,

ezért a mutációknak a háromdimenziós fehérjeszerkezetre gyakorolt hatásának

számítógépes elemzése jelenleg még nem lehetséges. Továbbá nehézséget jelent, hogy a

sejtosztódásban, genom stabilitásban és sejtciklus szabályozásában betöltött szerepe

[Stalberg és mtsai 2004] ellenére a menin funkciója még nem teljesen ismert. Antimenin

fehérje (ellenanyag) segítségével Cavallari és mtsai már végeztek in situ vizsgálatokat a

65

menin expressziójának meghatározására [Cavallari és mtsai 2003], és a menin GTPáz

aktivitása alapján a GTPáz consensus szekvenciákat érintő mutációk hatása is

meghatározható. A menin karboxi-terminális részének csonkolásával járó mutációk a

nukleoláris szignálok elvesztése miatt a fehérje cytosolban történő felhalmozódásához

vezetnek, ami laboratóriumi módszerekkel szintén kimutatható. Mindezek azonban csak

részben fedik le a mutációk teljes spektrumát, ezért jelenleg még nem áll rendelkezésre

megfelelő módszer, amellyel az összes mutáns fehérje funkciója meghatározhatóvá

válna. Mindezek miatt munkámban a nemzetközi irodalomban még nem közölt új

mutációk betegség-okozó szerepét a mutáció típusának és az érintett egyének

családfájának elemzésére alapoztam. Nonsense mutációk (valamely aminosav STOP

kodonra cserélődése), vagy kereteltolódással járó új mutációk esetében az oki szerep

nyilvánvalónak tekinthető, hiszen a csonkolt fehérje kötőhelyeinek, aktivitási

doménjének és nukleoláris szignáljának elvesztése a fehérje működésének sérülését

okozza. Nehezebben ítélhető meg a missense mutációk szerepe, ugyanis egy aminosav

másikra cserélődése nem feltétlenül jár együtt a fehérje funkció károsodásával. Ilyen

esetekben a mutáció oki szerepének megítélését leginkább a mutáció családon belüli

öröklődésének elemzése segítheti. Ha a klinikai kép egyértelműen követi a családban a

mutáció öröklődésének menetét, az oki szerep nagy valószínűséggel megállapítható.

A MEN1 gén missense és deléciós mutációinak vizsgálata során Yaguchi és

mtsai kimutatták, hogy a MEN 1 szindrómához társuló különböző mutációk a fehérje

stabilitásának csökkenését és ubiquitináció révén a sejt proteosomáiban való gyors

degradálódását okozzák. Ugyanakkor a MEN 1 szindrómás betegekben kimutatott

polimorfizmusokra a gyors degradálódás nem jellemző. Ez a megfigyelés magyarázatot

adhat arra is, hogy noha a missense mutációk a MEN1 génen belül bárhol

kialakulhatnak, genotípus-fenotípus összefüggéseket MEN 1 szindrómában eddig még

nem találtak [Yaguchi és mtsai 2004].

A hazai betegekben talált új mutációk az alábbi doméneken változtatják meg a

menin fehérjeszerkezetét: a G28A mutáció a JunD és nm23 kötőhelyeket kialakító

fehérje doméneket érinti és az első leucin zip szerkezetét is átformálhatja. Az érintett

családban a mutáció és a klinikai fenotípus közötti összefüggés vizsgálatára nem volt

lehetőség, ugyanis a mutáció a probandban de novo alakult ki, akinek leszármazottja

nem volt. A két aminosav szerkezeti hasonlósága ellenére az alaninnak glicinre

66

cserélődését más fehérjék esetében a nemzetközi irodalomban affinitást befolyásoló

tényezőként írták le, azonban a G28A mutáció betegség-okozó szerepét nem

tekinthetjük kétséget kizáróan igazoltnak. Az A91V mutáció a Smad3 és nm23 kötő

doméneket változtatja meg; ebben az esetben a családfa vizsgálat alátámasztotta a

genetikai vizsgálat eredményeit: csak azon családtagokban (és minden ilyen

családtagban) volt megtalálható, akik klinikailag is MEN 1 szindrómások voltak. A

családfa elemzése az L301R mutáció esetében is oki kapcsolatra utalt; ez a mutáció a

GTPáz konszenzus szekvenciát érinti és a menin-PEM és menin-nm23 kapcsolódást

befolyásolhatja. Az E26X és C354X mutációk csonkolt fehérje képződését okozzák; az

első esetben a fehérje mindössze 26 aminosavból áll, míg a második esetben a nukleáris

lokalizációs szignálok és a prolin gazdag régió elvesztése mellett a fehérje szinte

minden kötési tulajdonsága megváltozhat, ezért oki szerepük kétségtelennek tűnik (20.

ábra), és azt a családfa-elemzés is alátámasztotta.

20. ábra: Az általunk talált új mutációk lokalizációja és feltételezett szerepe a

menin szerkezetén belül

G28A

Leucin Zippek

Nukleárislokalizációsszekvenciák

aminosavak

Prolin gazdag régióGTPáz konszenzus

A91V L301R C354X új mutációkE26X

G28A

Leucin Zippek

Nukleárislokalizációsszekvenciák

aminosavak

Prolin gazdag régióGTPáz konszenzus

A91V L301R C354X új mutációkE26X

Nemzetközi adatok alapján nem egyértelmű, hogy a klinikai kritériumok alapján

definiált MEN 1 szindrómás családokban milyen gyakorisággal mutatható ki mutáció a

67

MEN1 gén kódoló régiójában. Egyes vizsgálatok a családok mindössze 5-20%-ában

[Thakker 1998], míg más vizsgálatok ennél lényegesen nagyobb gyakorisággal találtak

mutációt. Egy 2005-ben közzétett brit felmérés összesen 186, a nemzetközi

kritériumrendszer alapján MEN1 genetikai szűrésre ajánlott család-reprezentáló beteg

adatait elemezve megállapította, hogy a betegség-okozó mutációt az esetek 37%-ában

lehetett azonosítani. A vizsgált betegek sporadikus és familiáris csoportokba sorolását

követően kiderült, hogy a familiáris esetekben a 3, 2 és 1 MEN 1-asszociált tumorral

rendelkezők körében kimutatott mutációk gyakorisága 91%, 69% és 29% volt (ebben a

sorrendben), míg a sporadikus esetekben ugyanebben a sorrendben a mutációk

előfordulása 69%, 23% és 0% volt [Ellard és mtsai 2005]. A MEN 1-asszociált léziók

nagy száma tehát növelheti annak a valószínűségét, hogy a vizsgált betegben a MEN1

gén kódoló régiójában mutáció igazolható. Familiáris esetekben a sporadikus esetekhez

képest a MEN1 gén mutációk nagyobb gyakorisággal való kimutathatóságát mások is

megfigyelték [Ohye és mtsai 1999]. Ezeknek az új megfigyeléseknek a tükrében a MEN

1 szindróma genetikai szűrésének definíciói újabb szempontokkal egészülhetnek ki,

amelyek figyelembe veszik a tünetek familiáris vagy sporadikus megjelenését és a MEN

1-asszociált léziók számát.

Összehasonlítva a klinikai adatokat a genetikai eredményekkel elmondhatjuk,

hogy mind a 6, familiáris MEN 1 szindrómás betegben kimutattuk a betegségokozó

mutációt (100%) és a 13 sporadikus MEN 1 szindrómás betegből pedig összesen 3

esetben (13%) volt sikeres a genetikai vizsgálat. A 13 MEN 1-szerű állapotban

szenvedő esetek közül összesen 1 rekurrens izolált primer hyperparathyreosisos

betegben találtunk MEN1 gén mutációt. Továbbá az általunk vizsgált 32 beteg

tekintetében elmondható, hogy a MEN 1-asszociált tumorok száma és a családi

anamnaesis nagy mértékben korrelál a mutációanalízis hetékonyságával. Az általunk

vizsgált 32 beteg közül 10 betegben (31,25%) sikerült a MEN1 gén kódoló régiójában

betegség-okozó mutációt kimutatni. A familiáris csoportban a 2 és 1 MEN 1-asszociált

daganatban szenvedő betegek 100%, és 0%-a, míg a sporadikus esetek körében a 3, 2 és

1 MEN 1-asszociált daganatban szenvedő betegek 50%, 18% és 9%-a volt MEN1 gén

mutáció hordozó (11. táblázat).

Megfigyelhető továbbá, hogy a mellékvesekéreg adenomák igen magy arányban

fordulnak elő MEN 1-szerű állapotban szenvedő esetekben, akár agyalapi mirigy

68

daganattal, vagy primer hyperparathyreosissal, de igen ritka ezen társult tünetek

esetében a MEN1 gén mutáció, ami azt mutathatja, hogy a mellékvese adenomák

prediktív értéke elhanyagolható MEN1 mutációk szempontjából.

11. táblázat: A MEN1 gén mutációk előfordulása és a MEN 1-asszociált daganatok

száma közötti összefüggés az általunk vizsgált betegekben

Familiáris esetek száma Sporadikus esetek száma MEN 1-asszociált

fő tumorok száma N Mutációt hordozó

esetek száma (%) N

Mutációt hordozó

esetek száma (%)

3 - - 2 1 (50)

2 6 6 (100) 11 2 (18)

1 2 0 (0) 11 1 (9)

Összesen 8 6 (75) 23 4 (17%)

Azokban a családokban, amelyekben nem sikerült a betegség hátterében álló

mutációt kimutatni, a genetikai eltérés a szabályozó vagy nem-kódoló régiókban lehet,

de az 5’-szakasz GC-gazdag területének hypermetilációjának oki szerepe sem zárható ki

[Agarwal és mtsai 1997, Bassett és mtsai 1998]. Ezeken kívül a MEN1 gén nagyméretű

deléciója, esetleg más gén hibája is szóba jön [Nahimira és mtsai 1999]. Az elmúlt

évben a 4-es kromoszóma területén egy új gént (MENX) írtak le, amely a ”multiple

endocrine neoplasia-like” szindróma elnevezésű betegséget okozza. Ez az öröklődő

daganatos szindróma a neuroendokrin rendszert érintő, patkányokban az első életévben

kialakuló multiplex tumoros betegséget okozza, melyben az érintett szervek spektruma

a MEN 1- és MEN 2 szindrómák közötti átmenetnek felel meg [Piotrowska és mtsai

2004].

69

VII. KÖVETKEZTETÉSEK

Munkám során összesen 32 MEN 1 szindrómás vagy MEN 1-szerű

szindrómában szenvedő betegben végeztem el a MEN1 gén teljes kódoló régiójának

vizsgálatát. A MEN1 gén nagy mérete, a lehetséges csírasejtes mutációk nagy száma,

illetve a mutációs ”hot spot” hiánya miatt a genetikai eltéréseket tartalmazó gén-

szakaszok kimutatására TGGE szűrőmódszert használtam és a genetikai eltérések

pontos meghatározására direkt DNS szekvenálást végeztem.

(1) Megállapítottam, hogy a rendelkezésre álló számítógépes szoftver programok az

oligonukleotid primerek tervezésekor növelik a TGGE szűrőmódszer

érzékenységét. Ugyanakkor elektroforézis paraméterek optimalizálásához egy

experimentális módszer, a perpendiculáris elektroforézis bizonyult a

leghatékonyabbnak.

(2) Megállapítottam, hogy a TGGE szűrőmódszer a MEN1 gén 10-es exon nt1657ins

mutációja esetében álnegatív eredményt ad, ezért ezzel a módszerrel a 10-es exon

vizsgálata nem ajánlott.

(3) Kimutattam, hogy a MEN1 gén 9-es exon területén előforduló kétféle gyakori

polimorfizmus (D418D, L432L) elektroforetikus képe egymástól jól

elkülöníthető, ezért ennek az exonnak a vizsgálata során belső kontrollként – a

polimorfizmusokat nem tartalmazó mintán kívül - D418D és L432L heterozigóta

DNS minták használata is ajánlott.

(4) A vizsgált betegekben a MEN1 gén kódoló szakaszainak direkt DNS

szekvenálásával megállapítottam, hogy a MEN1 gén leggyakoribb

polimorfizmusai a nemzetközi adatokhoz hasonló gyakorisággal fordulnak elő.

(5) Megállapítottam, hogy a vizsgált 32 MEN 1 szindrómás vagy MEN 1-szerű

állapotban szenvedő beteg közül 10 betegben (31.25%) fordult elő a MEN1 gén

kódoló szakaszán betegség-okozó mutáció, melyek közül 5 mutációt még nem

írtak le a nemzetközi irodalomban (A91V, G28A, E26X, L301R és C354X).

(6) Megállapítottam, hogy MEN 1 szindrómás és MEN 1-szerű állapotban szenvedő

betegekben a MEN1 gén kódoló szakaszán a betegség-okozó mutációk

70

előfordulásának gyakorisága familiáris esetekben nagyobb, mint sporadikus

esetekben. A MEN 1 szindrómára jellemző két, vagy három különböző daganat

társulásával járó esetekben a mutációk nagyobb gyakorisággal mutathatók ki

azokhoz az esetekhez képest, amelyekben csak egyféle MEN 1 szindrómára

jellemző daganat fordul elő.

71

Magyar nyelvű összefoglaló

PhD dolgozatomban a multiplex endokrin neoplasia 1-es típusának (MEN 1)

klinikai és genetikai vizsgálata során összegyűlt eredményeket foglalom össze. A MEN

1 szindróma autoszomális dominánsan öröklődő betegség, amely az agyalapi mirigy, a

mellékpajzsmirigyek és a hasnyálmirigy endokrin tumoraival és egyéb endokrin vagy

nem endokrin daganatokkal jár. Munkám során összesen 32 MEN 1 szindrómás vagy

klinikailag MEN 1 szindrómára gyanús betegben végeztem el a MEN1 gén teljes kódoló

régiójának vizsgálatát. A perifériás vérből izolált genomiális DNS mintákban a MEN1

gén teljes kódoló szakaszán előforduló genetikai eltérések kimutatására

hőmérsékletgrádiens gélelektroforézis (TGGE) szűrőmódszert használtam és a genetikai

eltérések pontos meghatározására direkt DNS szekvenálást végeztem. Megállapítottam,

hogy a rendelkezésre álló számítógépes szoftver programok az oligonukleotid primerek

tervezésekor növelik a TGGE szűrőmódszer érzékenységét, míg az elektroforézis

paraméterek optimalizásához egy experimentális módszer, a perpendiculáris

elektroforézis bizonyult a leghatékonyabbnak. Megállapítottam, hogy a TGGE

szűrőmódszer a MEN1 gén 10-es exon nt1657insC mutációja esetében álnegatív

eredményt ad, ezért ezzel a módszerrel a 10-es exon vizsgálata nem ajánlott.

Kimutattam, hogy a MEN1 gén 9-es exon területén előforduló kétféle gyakori

polimorfizmus (D418D, L432L) elektroforetikus képe egymástól jól elkülöníthető, ezért

ennek az exonnak a szűrővizsgálata során belső kontrollként – a polimorfizmusokat

nem tartalmazó mintán kívül - D418D és L432L heterozigóta DNS minták használata is

ajánlott. A vizsgált betegekben a MEN1 gén kódoló szakaszainak direkt DNS

szekvenálásával megállapítottam, hogy a MEN1 gén leggyakoribb polimorfizmusai a

nemzetközi adatokhoz hasonló gyakorisággal fordulnak elő. Megállapítottam, hogy a

vizsgált 32 beteg közül 10 betegben (31.25%) fordult elő a MEN1 gén kódoló szakaszán

betegség-okozó mutáció, melyek közül 5 mutációt még nem írtak le a nemzetközi

irodalomban (A91V, G28A, E26X, L301R és C354X). Megállapítottam, hogy a vizsgált

betegekben a MEN1 gén kódoló szakaszán a betegség-okozó mutációk előfordulásának

gyakorisága familiáris esetekben nagyobb, mint sporadikus esetekben. A MEN 1

szindrómára jellemző két vagy három különböző daganat társulásával járó esetekben a

mutációk nagyobb gyakorisággal mutathatók ki azokhoz az esetekhez képest,

amelyekben csak egyféle MEN 1 szindrómára jellemző daganat fordul elő.

72

Angol nyelvű összefoglaló

In my PhD thesis I summarized the results of clinical and genetic investigations

of multiple endocrine neoplasia type 1. The MEN 1 syndrome is an autosomal dominant

disorder characterized by endocrinopathies involving the anterior pituitary gland,

parathyroid glands, endocrine pancreas, and other endocrine or non-endocrine tumors. I

have examined the entire coding region of the MEN1 gene in 33 MEN 1 patients and

suspicious cases. Genomic DNA was extracted from peripheral blood for pre-screening

with temporal temperature gradient gel electrophoresis (TGGE); the identification of the

localized genetic alterations was performed by direct DNA sequencing. I have

established, that using the melting behavior-calculating softwares for primer-design

increases the sensitivity of TGGE, while optimizing the electrophoretic parameters

during TGGE has been shown to be the most efficient by perpendicular electrophoresis.

I have found that screening exon 10 of the MEN1 gene is not recommended by TGGE,

because the electrophoresis was false negative in the case of nt1657insC mutation. I

have shown that the electrophoretic bands of two common benign polymorphisms

(D418D and L432L) could be distinguished clearly by TGGE in exon 9, thus, it is

recommended to use not just a negative, but two, D418D and L432L, heterozygous

controls during the electrophoresis of this exon. The most common polymorphisms of

the MEN1 gene, identified by direct DNA sequencing, were found to appear with the

same prevalence as mentioned in the international literature. I have found MEN1

disease-causing mutation in ten cases among the 32 patients with MEN 1 or MEN 1-like

state (31.25%), and five of them were not known in the international literature (A91V,

G28A, E26X, L301R, C354X). I have also established that the presence of a disease-

causing mutation is more frequent in familial cases than in sporadic cases. Furthermore,

in cases with two or three MEN 1-associated lesions the disease-causing mutations are

more frequent than in patients only with one MEN 1-associated tumor.

73

Irodalomjegyzék:

Agarwal SK, Burns AL, Sukhodolets KE, Kennedy PA, Obungu VH, Hickman AB,

Mullendore ME, Whitten I, Skarulis MC, Simonds WF, Mateo C, Crabtree JS, Scacheri

PC, Ji Y, Novotny EA, Garrett-Beal L, Ward JM, Libutti SK, Alexander HR, Cerrato A,

Parisi MJ, Anna-A SS, Oliver B, Chandrasekharappa S, Collins FS, Spiegel AM, Marx

SJ: Molecular Pathology of the MEN1 gene. Ann NY Acad Sci 2004, 1014, 189-198.

Agarwal SK, Kennedy PA, Scacheri PC, Novotny EA, Hickman AB, Cerrato A, Rice

TS, Moore JB, Rao S, Ji Y, Mateo C, Libutti SK, Oliver B, Chandrasekharappa SC,

Burns AL, Collins FS, Spiegel AM, Marx SJ: Menin molecular interactions: Insights

into normal functions and tumorigenesis. Horm Metab Res 2005, 37, 369-374.

Agarwal SK, Kester MB, Debelenko LV, Heppner C, Emmert-Buck MR, Skarulis MC,

Doppman JL, Kim YS, Lubensky IA, Zhuang Z, Green JS, Guru SC, Manickham P,

Olufemi S-E, Liotta LA, Chandrasekhappara SC, Collins FS, Spiegel AM, Burns AL,

Marx SJ: Germline mutations of the MEN1 gene in familial multiple endocrine

neoplasia type 1 and related states. Hum Mol Genet 1997, 6, 1169-1175.

Anlauf M, Perren A, Meyer CL, Schmid S, Saremaslani P, Kruse ML, Weihe E,

Komminoth P, Heitz PU, Kloppel G: Precursor lesions in patients with multiple

endocrine neoplasia type 1-associated duodenal gastrinomas. Gastroenterology 2005,

128(5), 1187-98.

Arnold A: Approach to therapy in multiple endocrine type 1. Endocrinology UpToDate,

Copyright 1999. www.uptodate.com electronic textbook, Szerk: Rose BB, UpToDate

inc, Wellesley, Ma, USA

Arnold A: Clinical manifestations and diagnosis of multiple endocrine neoplasia type 1.

Endocrinology UpToDate, Copyright 1999. www.uptodate.com electronic textbook,

Szerk: Rose BB, UpToDate inc, Wellesley, Ma, USA

74

Asgharian B, Turner ML, Gibril F, Entsuah LK, Serrano J, Jensen RT: Cutaneus tumors

in patients with multiple endocrine neoplasm type 1 (MEN1) and gastrinomas:

Prospective study of frequency and development of criteria with high sensitivity and

specificity for MEN1. J Clin Endocrinol Metab, 2004, 89(11), 5328-5336.

Balogh K, Patócs A, Majnik J és mtsai: Genetic screening for the detection of mutations

responsible for multiple endocrine neoplasia type 1. Mol Genet Metab 2004, 83, 74-81.

Bartsch DK, Fendrich V, Langer P, Celik I, Kann PH, Rothmund M: Outcome of

duodenopancreatic resections in patients with mutiple endocrine neoplasia type 1. Ann

surg 2005, 242(6), 757-766.

Bassett JHD, Forbes SA, Pannett AAJ, Lloyd SE, Christie PT, Wooding C, Harding B,

Besser GM, Edwards CR, Monson JP, Sampson J, Wass JAH, Wheeler MH, Thakker

RV, Characterization of mutations in patients with multiple endocrine neoplasia type 1.

Am J Hum Genet 1998, 62, 232-244.

Baudin E, Bidart J-M, Rougier P, Lazar V, Ruffié P, Ropers J, Ducreux M, Troalen F,

Sabourin J-C, Comoy E, Lasser P, DeBaere T, Schlumberger M: Screening for multiple

endocrine neoplasia type 1 and hormonal production in apparently sporadic

neuroendocrine tumors. J Clin Endocinol Metab 1999, 84(1), 69-75.

Beckers A, Betea D, Valdes Socin H, Stevenaert A: The treatment of sporadic versus

MEN1-related pituitary adenomas. J Int Med 2003, 253, 599-605.

Benito M, Asa SL, LiVolsi VA, West VA, Snyder PJ: Gonadotroph tumor associated

with multiple endocrine neoplasia type 1. J Clin Endocrinol Metab, 2005, 90(1), 570-

574.

Bhuiyan M M R, Sato M, Murao K és mtsai: Differential expression of menin in various

adrenal tumors. Cancer 2001, 92, 1393-1401.

75

Brandi ML, Gagel RF, Angeli A, Bilezikian JP, Beck-Peccoz P, Bordi C, Conte-Devolx

B, Falchetti A, Gheri RG, Libroia A, Lips CJM, Lombardi G, Mannelli M, Pacini F,

Ponder BAJ, Raue F, Skogseid B, Tamburrano G, Thakker RV, Thompson NW,

Tomassetti P, Tonelli F, Wells SA, Marx SJ: Guidelines for diagnosis and therapy of

MEN type 1 and type 2. J Clin Endocrinol Metab 2001, 86, 5658-5671.

Burgess JR, Greenaway TM, Sheperd JJ: Expression of the MEN-1 gene in a large

kindred with multiple endocrine neoplasia type 1. J Int Med 1998, 243, 465-470.

Burgess JR, Nord B, David R, Greenaway TM, Paramenswaran V, Larsson C, Sephern

JJ, Teh BT: Phenotype and phenocopy: the relationship between genotype and clinical

phenotype in a asingle large family with mulitple endocrine neoplasia type 1 (MEN1).

Clin Endocrinol 2000, 53, 205-211.

Burgess JR, Shepherd JJ, Parameswaran V, Hoffman L, Greenaway TM: Spectrum of

pituitary disease in multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1): clinical, biochemical,

and radiological features of pituitary disease in a large MEN 1 kindred. J Clin

Endocrinol Metab 1996, 81(7), 2642-6.

Cavaco BM, Domingues R, Bacelar MC, Cardoso H, Barros L, Gomes L, Ruas MMA,

Agapito A, Garrao A, Pannett AAJ, Silva JL, Sobrinho LG, Thakker RV, Leite V:

Mutational analysis of Portugese families with multiple endocrine neoplasia type 1

reveals large deletions. 2002, 56, 465-473.

Cavallari I, D’Agostino DM, Ferro T, Rosato A, Barzon L, Pasquali C, Fogar P,

Theodoropoulou M, Esposito G, Boscaro M, Pagotto U, Tebaldi E, Fallo F, Chieco-

Bianchi L, Ciminale V: In situ analysis of human menin in normal and neoplastic

pancreatic tissues: evidence for differential expression in exocrine and endocrine cells. J

Clin Endoc Metab 2003, 88(8), 3893-3901.

Cebrián A, Ruíz-Llorente S, Cascón A, Osorio A, Martínez-Delgado B, Benítez J,

Robledo M: A rapid and easy method for multiple endocrine neoplasia type 1 mutation

76

detection using conformational-sensitive gel electrophoresis. J Hum Genet 2002, 47,

190-195.

Cebrián A, Ruíz-Llorente S, Cascón A, Pollan M, Diez JJ, Pico A, Telleria D, Benítez J,

Robledo M: Mutational and gross deletion study of the MEN1 gene and correlation with

clinical features in Spanish Patients. J Med Genet 2003, 40e72 Online Mutation Report,

www.jmedgenet.com/cgi/content/full/40/5/e72.

Cetani F, Pardi E, Giovanetti A, Carrai P, Borsari S, Vignali E, Picone A, Cianferotti L,

Miccoli P, Pinchera A, Marcocci C: Six novel MEN1 gene mutations in sporadic

parathyroid tumors. Hum Mut 2000, 16(5), 445-448.

Chandrasekkharappa SC, Guru SC, Manickham P, Olufemi S-E, Collins FS, Emmert-

Buck MR, Debelenko LV, Zhuang Z, Lubensky IA, Liotta LA, Crabtree JS, Wang Y,

Roe BA, Weisemann J, Boguski MS, Agarwal SK, Kester MB, Kim YS, Heppner C,

Dong Q, Spiegel AM, Burns AL, Marx SJ: Positional cloning of the gene for multiple

endocrine neoplasia type 1. Science 1997, 276, 404-407.

Corbetta S, Vincentini L, Ferrero S, Lania A, Mantovani G, Cordella D, Beck-Peccoz P,

Spada A: Activity and function of the nuclear factor kappaB pathway in human

parathyroid tumors. Endocr Relat Cancer 2005, 12(4), 929-37.

Costa SC, Nascimento LS, Ferriera FJ, Mattos PS, Camara-Lopes LH, Ward LS: Lack

of mutations of exon 2 of the MEN1 gene in endocrine and nonendocrnine sporadic

tumors. Braz J Med Biol Res 2001, 34, 861-865.

Crabtree JS, Scacheri PC, Ward JM, Garrett-Beal L, Emmert-Buck MR, Edgemon KA,

Lorang D, Libutti SK, Chandrasekharappa SC, Marx SJ, Spiegel AM, Collins FS: A

mouse modell of multiple endocrine neoplasia, type 1, develops multiple endocrine

tumors. Proc Natl Acad Sci USA 2001, 98, 1118-1123.

77

Dean PG, van Heerden JA, Farley DR, Thompson GB, Grant CS, Harmsen WS, Ilstrup

DM: Are patients with multiple endocrine neoplasia type I prone to premature death?

World J Surg 2000, 24, 1437.

Dilley WG, Kalyanamaran S, Verma S, Cobb JP, Laramie JM, Lairmore TC: Global

gene expression in neuroendocrine tumors from patients with the MEN1 syndrome. Mol

Cancer 2005, 4(9), doi:10.1186=476-4598-4-9.

Doherty GM: Multiple endocrine neoplasia type 1. J Surg Oncol 2005, 89, 143-150.

Dreijerink KM, van Beek AP, Lentjes EGWM, Post JG, van der Luijt RB, Canninga-

van Dijk M, Lipd CJM: Acromegaly in a multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1)

family with low penetrance of the disease. Eur J Endocrinol 2005, 153, 741-746.

Ellard S, Hattersley AT, Brewer CM, Vaidya B: Detection of an MEN1 gene mutation

depends on clinical features and supports current referral criteria for diagnostic

molecular genetic testing. Clin Endocrinol 2005, 62, 169-175.

Fahsold R, Hoffmeyer S, Mischung C, Gille C, Ehlers C, Kücükceylan N, Abdel-Nour

M, Gewies A, Peters H, Kaufmann D, Buske A, Tinschert S, Nürnberg P: Minor lesion

mutational spectrum of the entire NF1 gene does not explain its high mutability but

points to a functional domain upstream of the GAP-related domain. Am J Hum Genet

2000, 66, 790-818.

Ferolla P, Falchetti A, Filosso P, Tomassetti P, Tamburrano G, Avenia N, Daddi G,

Puma F, Ribacchi R, Santeusanio F, Angeletti G, Brandi ML: Thymic Neuroendocrine

Carcinoma (carcinoid) in MEN1 syndrome: the Italian series. J Clin Endocrinol Metab

2005, 91, 2603-2609.

Forsberg L, Björck E, Hashemi J, Zedenius J, Höög A, Farnebo L-O, Reimers M,

Larsson C: Distinction in gene expression profiles demonstrated in parathyroid

adenomas by high-density oligoarray technology. Eur J Endocrinol 2005, 152, 459-470.

78

Frank-Raue K, Rondot S, Hoeppner W, Goretzki P, Raue F, Meng W: Coincidence of

multiple endocrine neoplasia types 1 and 2: mutations in the RET protooncogene and

MEN1 tumor suppressor gene in a family presenting with recurrent primary

hyperparathyroidism. J Clin Endocrinol Metab 2005, 90(7), 4063-4067.

Gille C, Gille A: TGGE-STAR: primer design for melting analysis using PCR gradient

gel electrophoresis. Biotechniques 2002, 32(2), 264-268.

Glascock M, Carty SE: Multiple endocrine neoplasia type 1: fresh perspective on

clinical features and penetrance. Surg Oncol 2002, 11, 143-150.

Goebel SU, Heppner C, Burns AL, Marx SJ, Spiegel AM, Zhuang Z, Lubensky IA,

Gibril F, Jensen RT, Serrano J: Genotype/phenotype correlation of multiple endocrine

neoplasia type 1 gene mutations in sporadic gastrinomas. J Clin Endocrinol Metab

2000, 85(1), 116-123.

Görtz B, Roth J, Krahenmann A, Krijger RR, Muletta-Feurer S, Rütimann K,

Saremaslani P, Speel EJM, Hitz PU, Komminoth P: Mutations and allelic deletions of

the MEN1 gene are associated with a subset of sporadic endocrine pancreatic and

neuroendocrine tumors and not restricted to foregut neoplasms. Am J Pathol 1999, 154,

429-436.

Guo SS, Sawicki MP: Molecular and genetic mechanisms of tumorigenesis in multiple

endocrine neoplasia type 1. Mol Endocrinol 2001, 15, 1653-1664.

Guru SC, Agarwal SK, Manickam P, Olufemi S-E, Crabtree JS, Weisemann JM, Kester

MB, Kim YS, Wang AM, Emmert-Buck MR, Liotta LA, Spiegel AM, Boguski MS,

Roe BA, Collins FS, Marx SJ, Burns L, Chandrasekharappa SC: A transcript for the

2.8-Mb region containing the multiple endocrine neoplasia type 1 locus. Genome Res

1997, 7, 725-735.

79

Guru SC, Goldsmith PK, Burns AL: Menin, the product of the MEN1 gene, is nuclear

protein. Proc Natl Acad Sci 1998, 95, 1630-1634.

Guru SC, Manickam P, Crabtree JS: Identification and characterization of the multiple

endocrine neoplasia type 1 (MEN1) gene. J Int Med 1998, 243, 433-439.

Hao W, Skarulis MC, Simonds WF, Weinstein LS, Agarwal SK, Mateo C, James-

Newton L, Hobbs GR, Gibril F, Jensen RT, Marx SJ: Multiple endocrine neoplasia type

1 variant with frequent prolactinoma and rare gastrinoma. J Clin Endocrinol Metab.

2004, 89(8), 3776-3784.

Haven CJ, Howell VM, Eilers PHC, Dunne R, Takahashi M, van Puijenbroek M, Furge

K, Kievit J, Tan M-H, Fleuren GJ, Robinson BG, Delbridge LW, Philips J, Nelson AE,

Krause U, Dralle H, Hoang-Vu C, Gimm O, Morresu H, Marsh DJ, Teh BT: Gene

expression of parathyrois tumors: molecular subclassification and identification of the

potential malignant phenotype. Cancer Res, 2004, 64, 7405-7411.

Hellman P, Hennings J, Akerstrom G, Skogseid B: Endoscopic ultrasonography for

evaluation of pancreatic tumours in multiple endocrine neoplasia type 1. Br J Surg

2005, 92(12), 1508-12.

Hendy GN, Kaji H, Sowa H, Lebrun J-J, Canaff L: Menin and TGF-ß superfamily

member signaling via the Smad pathway in pituitary, parathyroid and osteoblast. Horm

Metab Res 2005, 37, 375-379.

Heppner C, Reincke M, Agarwal SK, Mora P, Allolio B, Burns AL, Spiegel AM, Marx

SJ: MEN1 gene analysis in sporadic adrenocortical neoplasms. J Clin Endocrinol Metab

1999, 84, 216-219.

Hessmann O, Lindberg D, Skogseid B, Carling T, Hellmann P, Rastad J, Akerstrom G&

Westin G: Mutation of the multiple endocrine neoplasia type 1 gene in nonfamilial,

malignant tumors of the endocrine pancreas. Cancer Res 1998, 58, 377-379.

80

Hoff AO, Cote GJ, Gagel RF: Multiple endocrine neoplasias, Ann Rev Physiol 2000,

62, 377-411.

Hoffmann KM, Gibril F, Entsuah LK, Serrano J, Jensen RT: Patients with MEN1 with

gastrinomas have an increased risk of severe esophageal disease including stricture, and

the premalignant condition, Barett esophagus. J Clin Endocrinol Metab 2005 oct. 25. in

press.

Howell VM, Haven CJ, Kahnoski K, Khoo SK, Petillo D, Chen J, Fleuren GJ, Robinson

BG, Delbridge LW, Philips J, Nelson AE, Krause U, Hammje K, Dralle H, Hoang-Vu

C, Gimm O, Marsh DJ, Morreau H, The BT: HRPT2 mutations are associated with

malignancy in sporadic parathyroid tumours. J Med Genet 2003, 40, 657-663.

Huang SC, Zhuang Z, Weil RJ, Pack S, Wang C, Krutzsch HC, Pham TA, Lubensky

IA: Nuclear/cytoplasmic localization of the multiple endocrine neoplasia type 1 gene

product, menin. Lab Invest 1999, 79, 301-310.

Ikeo Y, Yumita W, Sakurai A, Hashizume K: JunD-Menin interaction regulates c-Jun-

mediated AP-1 transactivation. Endocrine J 2004, 51(3): 333-342.

Ikota H, Tanimoto A, Kometsu H, Ozawa Y, Matsushita H: Ureteral leiomyoma causing

hydronephrosis in type a multiple endocrine neoplasia. Pathol Int 2004, 54(6), 457-9.

Jin S, Mao H, Schnepp R, Sykes SM, Silva AC, D’Andrea AD, Hua X: Menin

associates with FancD2, a protein involved in repair of DNA damage. Cancer Res 2003,

63, 4204-4210.

Johnson SJ, Sheffield EA, McNicol AM: Examination of parathyroid gland specimens.

J Clin Pathol 2005, 58, 338-342.

81

Kaji H, Canaff L, Lebrun JJ, Goltzman D, Hendy GN: Inactivation of menin, a Smad-3

interaction protein, blocks transforming growth factor type beta signalling. Proc Natl

Acad Sci 2001, 98, 3837-3842.

Karges W, Jostarndt K, Maier S, Flemming A, Weitz M, Wissmann A, Feldmann B,

Dralle H, Wagner P, Boehm BO: Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) gene

mutations in a subset of patients with sporadic and familial primary

hyperparathyroidism target the coding sequence but spare the promoter region. J

Endocrinol 2000, 166, 1-9.

Karges W, Ludwig L, Kessler H, Wissmann A, Wagner PK, Boehm BO: Menin

mutations in the diagnosis and prediction of mutliple endocrine neoplasia type 1. Arch

Surg 1998, 383, 183-186.

Karnik SK, Hughes CM, Gu X, Rozenblatt-Rosen O, Mclean GW, Xiong Y, Meyerson

M, Kim SK: Menin regulates pancreatic islet growth by promoting histone methylation

and expression of genes encoding p27Kip1 and p18INK4c. PNAS 2005, 102(41),

14659-64.

Kawamura J, Shimada Y, Komoto I, Okamoto H, Itami A, Doi R, Fujimoto K, Kosugi

S, Imamura M: Multiple endocrine neoplasia type 1 gene mutations in sporadic

gastrinomas in Japan. Oncol Rep 2005, 14(1), 47-52.

Kouvaraki MA, Lee JE, Saphiro SE, Gagel RF, Sherman SI, Sellin RV, Cote GJ, Evans

DB: Genotype-phenotype analysis in multiple endocrine neoplasia type 1. Arch Surg

2002, 137, 641-647.

La P, Silva AC, Hou Z, Wang H, Schnepp RW, Yan N, Shi Y, Hua X: Direct binding of

DNA by tumor suppressor menin. J Biol Chem. 2004, 279, 49045-49054.

82

Lairmore TC, Chen VY, DeBenedetti MK, Gillanders WE, Norton JA, Doherty GM:

Duodenopancreatic resections in patients with multiple endocrine neoplasia type 1. Ann

Surg 1999, 231(6), 909-918.

Lambert LA, Shapiro SE, Lee JE, Perrier ND, Truong M, Wallace MJ, Hoff AO, Gagel

RF, Evans DB: Surgical treatment of hyperparathyroidism in patients with multiple

endocrine neoplasia type 1. Arch Surg 2005, 140, 374-382.

Lee C-H, Tseng L-M, Chen J-Y, Hsiao H-Y, Yang A-H: Primary hyperparathyroidism

in multiple endocrine neoplasia type 1: individual management with low recurrence

rates. Ann Surg Oncol, 2006. jan. 1. in press.

Lemmens IH, Forsberg L, Pannett AA, Meyen E, Piehl F, Turner JJ, van de Ven WJ,

Thakker RV, Larsson C, Kas K: Menin interacts directly with the homeobox-containing

protein Pem. Biochem Biophys Res Commun 2001, 286, 426-431.

Libé R, Bertherat J: Molecular genetics of adrenocortical tumours, from familial to

sporadic diseases. Eur J Endocrinol 2005, 153, 477-487.

Lopez Egido I, Cunningham J, Berg M, Oberg K, Bongcam-Rudloff E, Gobl A:

Menin’s interaction with Glial Fibrillary Acidic Protein and Vimentin suggests a role

for the intermediate filament network in regulating menin activity. Exp Cell Res 2002,

278, 175.

Miedlich S, Krohn K, Lamesch P Müller A, Paschke R: Frequency of somatic MEN1

gene mutations in monoclonal parathyroid tumours of patients with primary

hyperparathyroidism. Eur J Endocrinol 2000, 143, 47-54.

Milne TA, Hughes CM, Lloyd R, Yang Z, Rozenblatt-Rosen O, Dou Y, Schnepp RW,

Krankel C, LiVolsi VA, Gibbs D, Hua X, Roeder RG, Meyerson M, Hess JL: Menin

and MLL cooperatively regulate expression of cyclin-dependent kinase inhibitors.

PNAS 2005, 102(3), 749-754.

83

Mogensen J, Bahl A, Kubo T, Elanko N, Taylor R, McKenna WJ, Comparison of

fluorescent SSCP and denaturing HPLC analysis with direct sequencing for mutation

screening in hypertrophic cardiomyopathy. J Med Genet 2003, 40, e59.

Moon S-D, Park J-H, Kim E-M, Kim J-H, Han J-H, Yoo S-J, Yoon K-H, Kang M-I,

Lee K-W, Son H-Y, Kang S-K, Oh S-J, Kim K-M, Yoon S-J K, Park J-G, Kim I-J,

Kang HC, Hong S-W, Kim K-R, Cha B-Y: A novel IVS2-1G>A mutation causes

aberrant splicing of the HRPT2 gene in a family with Hyperparathyroidism-Jaw tumor

syndrome. J Clin Endocrinol Metab, 2005, 90(2), 878-883.

Morelli A, Falchetti A, Martineti V, Mark M, Friedman E, Brandi ML: MEN1 gene

mutation analysis in Italian patients with multiple endocrine neoplasia type 1. Eur J

Endocrinol 2000, 142, 131-137.

Multiple endocrine neoplasia, type 1; MEN1. OMIM Entry 131100

Mutch MG, Dilley WG, Sanjurjo F, DeBenedetti MK, Doherty GM, Wells Jr. SA,

Goodfellow PJ, Lairmore TC: Germline mutations in the multiple endocrine neoplasia

type 1 gene: Evidence for frequent splicing defects. Hum Mut 1999, 13, 175-185.

Namihira H, Sato M, Matsubara S, Ohye H, Bhuiyan M, Murao K, Takahara J: No

evidence of germline mutation or somatic deletion of the MEN1 gene in a case of

familial multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1). Endocr J 1999, 46(6), 811-6.

Nollau P, Wagener C: Methods for detection of point mutations: performance and

quality assessment. Clin Chem 1997, 43, 1114-1128.

Ohye H, Sato M, Matsubara S, Miyauchi A, Kishi-Imai K, Murao K, Takahara J: A

novel germline mutation of multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) gene in a

Japanese MEN1 patient and her daughter. Endocr J 1999, 46(2), 325-9.

84

Olufemi SE, Green JS, Manickam P, Guru SC, Agarwal SK, Kester MB, Dong Q,

Burns AL, Spiegel AM, Marx SJ, Collins FS, Chandrasekharappa SC: Common

ancestral mutation in the MEN1 gene is likely responsible for the prolactinoma variant

of MEN1 (MEN1Burin) in four kindreds from Newfoundland. Hum Mut 1998, 11(4),

264-9.

Orita M, Iwahana H, Kanazawa H, Hayashi K, Sekiya T: Detection of polymorphisms

of human DNA by gel electrophoresis as single-strand conformation polymorphisms.

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86, 2766-2770.

Pannett AAJ, Kennedy AM, Turner JJO, Forbes SA, Cavaco BM, Bassett JHD,

Cianferotti L, Harding B, Shine B, Flinter F, Maidmetn CGH, Trembath R, Thakker

RV: Multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1) germline mutations in familial

isolated primary hyperparathyroidism. Clin Endocrinol 2003, 58, 639-646.

Pannett, AAJ, Thakker, RV: Multiple endocrine neoplasia type 1. Endocrin-Related

Cancer 1999, 6, 449-473.

Park J-H, Kim I-J, Kang H-C, Lee S-H, Shin Y, Kim K-H, Lim S-B, Kang S-B, Lee K-

U, Kim S-Y, Lee M-S, Lee M-K, Park J-H, Moon S-D, Park J-G, Germline mutations

of the MEN1 gene in Korean families with multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1)

or MEN1-related disorders. Clin Genet 2003, 64, 48-53.

Perrier ND, Villablanca A, Larsson C, Wong M, Ituarte P, Teh BT, Clark OH, Genetic

screening for MEN1 mutations in families presenting with familial primary

hyperparathyroidism, World J Surg 2002, 26, 907-913.

Petty EM, Green JS, Marx SJ, Taggart RT, Farid N, Bale AE: Mapping the gene for

hereditary hyperparathyroidism and prolactinoma (MEN1Burin) to chromosome 11q:

evidence for a founder effect in patients from Newfoundland. Am J Hum Genet 1994,

54(6), 1060-6.

85

Piotrowska K, Pellegata NS, Rosemann M, Fritz A, Graw J, Atkinson MJ: Mapping of a

novel MEN-like syndroma locus to rat cheomosome 4. Mamm Genome, 2004, 15(2),

135-41.

Poisson A, Zablewska B, Gaudray P: Menin interacting proteins as clues toward the

understanding of multiple endocrine neoplasia type 1. Cancer Lett 2003, 189, 1-10.

Ratineau C, Bernard C, Poncet G, Blanc M, Josso C, Fontaniere S, Calender A,

Chayvialle JA, Zhang CX, Roche C: Reduction of menin expression enhances cell

proliferation and tumorigenic in intestinal epithelial cells. J Biol Chem, 2004,

279(23):24477-84.

Roijers JFM, de Wit MJ, van der Luijt RB, Ploos van Amstel HK, Höppener JWM, Lips

CJM: Criteria for mutation analysis in MEN I-suspected patients: MEN I case-finding.

Eur J Clinical Invest 2000, 30, 487-492.

Rubin MR, Silverberg SJ: Editorial: HRPT sin parathyroid cancer: A piece of the

puzzle. J Clin Endocrinol Metab 2005, 90(9), 5505-5507.

Schnepp RW, Hou Z, Wang H, Petersen C, Silva A, Masai H, Hua X: Functional

interaction between tumor supressor menin and activatior of S-Phase Kinase. Cancer

Res, 2004, 64, 6791-6796.

Schussheim DH, Skarulis MC, Agarwal SK, Simonds WF, Burns AL, Spiegel AM,

Marx SJ: Multiple endocrine neoplasia type 1: new clinical and basic findings. Trends

Endocrinol Metab 2001, 12, 173-178.

Snabboon T, Plengpanich W, Siriwong S, Wisedopas N, Suwanalaikorn S,

Khovidhunkit W, Shotelersuk V: A novel germline mutation, 1793delG, of the MEN1

gene underlying multiple endocrine neoplasia type 1. Jap J Clin Oncol 2005, 35(5), 280-

282.

86

Sowa H, Kaji H, Canaff L, Hendy GN, Tsukamoto T, Yamaguchi T, Miyazono K,

Sugimoto T, Chihara K: Inactivation of menin, the product of the multiple endocrine

neoplasia type 1 gene, inhibits the commitment of multipotential mesenchymal stem

cells into the osteoblast lineage. J Biol Chem 2003, 278(23): 21058-21069.

Stalberg P, Grimfjard P, Santesson M, Zhou Y, Lindberg D, Gobl A, Öberg K, Westin

G, Rastad J, Wang S, Skogseid B: Transfection of the multiple endocrine neoplasia type

1 gene to a human endocrine pancreatic tumor cell line inhibits cell growth and affects

expression of JunD, δ-loke protein 1/preadipocyte factor-a, proliferating cell nuclear

antigen, and QM/Jif-1. J Clin Endocrinol Metab 2004, 89(5), 2326-2337.

Steger G: Thermal denaturation of double-stranded nucleic acids: prediction of

temperatures critical for gradient gel electrophoresis and polymerase chain reaction,

Nucl Acid Res 1994, 22, 2760-2768.

Stratakis CA, Ball DW: A concise genetic and clinical guide to multiple endocrine

neoplasias and related syndromes. J Pediatr Endocrinol Metab, 2000, 13, 457-465.

Sukhodolets KE, Hickman AB, Agarwal SK, Sukhodolets MV, Obungu VH, Novotny

EA, Crabtree JS, Chandrasekharappa SC, Collins FS, Spiegel AM, Burns AL, Marx SJ:

The 32-kilodalton subunit of Replication Protein A interacts with menin, the product of

the MEN1 tumor supressor gene. Mol Cell Biol. 2003, 23(2), 493-509.

Teh BT, Kyötola S, Farnebo F, Bergman L, Wong FK, Weber G, Haymard N, Larsson

C: Mutation analysis fo the MEN1 gene in multiple endocrine neoplasia type 1, familial

acromegaly and familial isolated hyperparathyroidism. J Clin Endocrinol Metab 1998,

83(8), 2621-2626.

Thakker RV: Editorial: Multiple endocrine neoplasia – syndromes of twentieth century.

J Clin Endocrinol Metab 1998, 83, 2617-2620.

87

Thakker RV: The molecular genetics of the multiple endocrine neoplasia syndromes.

Clin Endocrinol 1993, 38, 1-14.

The European Consortium on MEN1: Identification of the multiple endocrine neoplasia

type 1 (MEN1) gene. Hum Mol Genet 1997, 6, 1177-1183.

Tóth M, Rácz K, Jakab Cs, Gláz E: Multiplex endocrin neoplasiák. Orv Hetil 134(40),

2187-2192.

Tsukada T, Yamaguchi K, Kameya T: The MEN1 gene and associated diseases: An

update. Edocr Pathol 2001, 12(3), 259-274.

Verges B, Boureille F, Goudet P, Murat A, Beckers A, Sassolas G, Cougard P, Chambe

B, Montvernay C, Calneder A: Pituitary disease in MEN type 1 (MEN1): data from the

France-Belgium MEN1 multicenter study. J Clin Endocrinol Metab 2002, 87, 457-465.

Villablanca A, Wassif WS, Smith T, Höog A, Vierimaa O, Kassem M, Dwight T,

Forsberg L, Du Q, Learoyd D, Jones K, Stranks S, Juhlin C, Teh BT, Carling T,

Robinson B, Larsson C: Involvement of the MEN1 gene locus in familial isolated

hyperparathyroidism. Eur J Endocrinol 2002, 147, 313-322.

Wautot V, Khodaei S, Frappart L, Buisson N, Baro E, Lenoir GM, Calender A, Zhang

CX, Weber G: expression analysis of endogenous menin, the product of the multiple

endocrine neoplasia type 1 gene, in cell lines and human tissues. Int J Cancer 2000, 85,

877-881.

Wilhelmsson LM, Nordén B, Mukherjee K, Dulay MT, Zare RN: Genetic screening

using the colour change of a PNA-DNA hybrid-binding cyanine dye. Nucl Acid Res

2002, 30, e3.

Wrocklage C, Gold H, Kackl W, Buchfelder M, Fahlbusch R, Paulus W, Increased

menin expression in sporadic pituitary adenomas. Clin Endocrinol 2002, 56, 589-594.

88

Yaguchi H, Ohkura N, Takahashi M, Nagamura Y, Kitabayashi I, Tsukada T: Menin

missense mutants associated with multiple endocrine neoplasia type 1 are rapidly

degraded via the ubiquitin-proteasome pathway. Mol Cell Biol 2004, 24, 6569-6580.

Yaguchi H, Ohkura N, Tsukada T, Yamaguchi K: Menin, the multiple endocrine

neoplasia type 1 gene product, exhibits GTP-hydrolysing activity in the presence of the

tumor metastasis suppressor nm23. J Biol Chem 2002, 277, 38197-38204.

Yano M, Fukai I, Kobayashi Y, Mizuno K, Konishi A, Haneda H, Suzuki E, Endo K,

Fujii Y: ACTH secreting thymic carcinoid associated with multiple endocrine neoplasia

type 1. Ann Thorac Surg 2006, 81, 366-368.

Yazgan O, Pfarr CM: Differential binding of the Menin tumor suppressor protein to

JunD isoforms. Cancer Res 2001,61, 916-920.

Zhuang Z, Vortmeyer AO, Pack S, Hunag S, Pham TA, Wang C, Park W-S, Agarwal

SK, Debelenko LV, Kester MB, Guru SC, Manickam P, Olufemi S-E, Yu F, Heppner

C, Crabtree JS, Skarulis MC, Venzon DJ, Emmert-Buck MR, Spiegel AM,

Chandrasekharappa SC, Collins FS, Burns AL, Marx SJ, Jensen RT, Liotta LA,

Lubensky IA: Somatic mutations of the MEN1 tumor supressor gene in sporadic

gastrinomas and insulinomas. Cancer Res 1997, 57, 4682-4686.

89

SAJÁT KÖZLEMÉNYEK LISTÁJA

A disszertációhoz kapcsolódó közlemények:

K Balogh, A. Patócs, J Majnik, F Varga, Gy Illyés, L Hunyady, K Rácz. Unusual

presentation of multiple endocrine neoplasia type 1 in a young woman with novel

mutation of the MEN1 gene. J Hum Genet (2004) 49(7): 380-6.

K Balogh, A Patócs, J Majnik, K Rácz, L Hunyady. Genetic methods in the detection of

mutations responsible for multiple endocrine neoplasia type 1 (MEN1). Mol Gen Metab

(2004) 83(1-2): 75-82.

K Balogh, L Hunyady, A Patócs, Z Valkusz, R Bertalan, P Gergics, J Majnik, J Tőke,

M Tóth, N Szűcs, E Gláz, L Fűtő, J Horányi, K Rácz, Z Tulassay. Az 1-es típusú

multiplex endokrin neoplasia klinikai tünetei, diagnózisa és kezelése. A genetikai

vizsgálatok hazai tapasztalatai. Orv Hetil (2005) 146(43): 2191-7.

K Balogh, K Rácz, A Patócs, L Hunyady. Menin interacting proteins: elucidation of

menin function. Trends in Endocrinol & Metab (2006) 17(9): 357-64.

K Balogh, L Hunyady, A Patócs, P Gergics, K Rácz. High prevalence of novel

mutations of the MEN1 gene in Hungarian patients with multiple endocrine neoplasia

type 1. Clin Endocrinol (2006) Közlésre beküldve.

A disszertációtól független közlemények:

M Bor, K Balogh, Á Pusztai, G Tasnádi, L Hunyady. Identification of acute

intermittent porphyria carriers by molecular biologic methods. Acta Pysiol Hung (1999)

86: 147-53.

90

A Patócs, Z Valkusz, P Igaz, K Balogh, M Tóth, I Varga, K Rácz. Segregation of the

V804L mutation and S836S polymorphism of exon 14 of the RET gene in an extended

kindred with familial medullary thyroid cancer. Clin Genet (2003) 63: 219-23.

J Majnik, N Szücs, A Patócs, M Tóth, K Balogh, I Varga, E Gláz, K Rácz. Effect of

Single Doses of Dexamethason and Adrenocorticotrop Hormone Serum Bone Markers

in Healthy Subjects and in Patients with Adrenal Incidentalomas and Cushing’s

Syndrome. J Endocrinol Invest (2004) 27(8): 747-53.

A Patócs, É Karádi, M Tóth, I Varga, N Szücs, K Balogh, J Majnik, E Gláz, K Rácz.

Clinical and biochemical features of sporadic and hereditary pheochromocytomas: an

analysis of 41 cases investigated in a single endocrine center Eur J of Cancer Prev

(2004) 13(5): 403-9.

J Majnik, A Patócs, K Balogh, M Tóth, K Rácz. A rapid and simple method for

detection of Asn363Ser polymorphism of the human glucocorticoid receptor gene. J

Steroid Biochem Mol Biol (2004) 92(5):465-8.

P Gergics, A Patocs, J Majnik, K Balogh, A Szappanos, M Toth, K Racz. Detection of

the Bcl I polymorphism of the glucocoricoid receptor gene by single-tube allele-specific

polymerase chain reaction. J Steroid Biochem Mol Biol (2006) 100(4-5): 161-6.

J Majnik, A Patocs, K Balogh, M Toth, P Gergics, A Szappanos, A Mondok, G

Borgulya, P Panczel, Z Prohaszka, K Racz. Overrepresentation of the N363S variant of

the glucocorticoid receptor gene in patients with bilateral adrenal incidentalomas. J Clin

Endocrinol Metab (2006) 91(7): 2796-9.

V Szabo, K Balogh, I Suveges, K Racz, L Hunyady, ZZ Nagy. The role of lumican and

keratocan genes in persistent subepithelial corneal haze following excimer laser

photorefractive keratectomy. Mol Vis (2006) 12: 597-605.

91

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Munkám nem lehetett volna eredményes, ha nem segített volna éveken át a II.

Belklinikán és az Élettani Intézetben sok-sok ember, akiknek ezúton szeretnék

köszönetet mondani.

Prof. Dr. Tulassay Zsoltnak, aki programvezetőként lehetővé tette, hogy a II-es

Belklinikán dolgozhassak.

Témavezetőmnek, Prof. Dr. Rácz Károlynak, hogy mindvégig támogatott,

útmutatást adott munkám során, segítette és irányította szakmai fejlődésemet, és mindig

új lendületre sarkallt a nehezebb időszakokban is.

Prof. Dr. Hunyady Lászlónak, az Élettani Intézet igazgatójának, aki már egyetemista

éveim alatt, TDK témavezetőmként mindig állhatatosan, kitartóan mellettem állt, majd

PhD munkám során mindvégig lehetővé tette a molekuláris genetikai vizsgálatok egy

részének elvégzését az Élettani Intézetben.

Prof. Dr. Gláz Editnek, aki tapasztalatát velem megosztva figyelmemet számos

lényegi dologra felhívta, betegei révén számos érdekes, hasznos eset tanúja lehettem.

Mindazon klinikusoknak, akik azzal is segítették munkámat, hogy az általuk

diagnosztizált MEN 1 szindrómás betegeket a genetikai vizsgálatokra a

laboratóriumunkba irányították, és akikkel a közös munka mindvégig örömöt jelentett:

Dr. Fűtő László, Dr. Horányi János, Dr. Kiss Róbert, Dr. Szűcs Nikolette, Dr. Tóth

Miklós, Dr. Valkusz Zsuzsa.

Dr. Patócs Attilának, aki PhD éveim elején segített áthidalni a kezdeti nehézségeket,

közös munkánk során mindvégig szakmai és baráti segítséget nyújtott számomra.

A II. sz. Belgyógyászati Klinika molekuláris biológiai laboratóriumában dolgozó

PhD hallgatóknak: dr. Majnik Juditnak, dr. Gergics Péternek, Dr. Tőke Juditnak, Dr.

Bertalan Ritának, dr. Mondok Ágnesnek és a molekuláris biológiai laboratóriumban

dolgozó laborasszisztensünknek Krauszné Vaczula Máriának szakmai és baráti

támogatásukért.

A II. sz. Belgyógyászati Klinika endokrin munkacsoportja minden dolgozójának a

mindennapok közös munkájáért.

92

Köszönöm az Élettani Intézet laboratóriumában dolgozó PhD hallgatóknak és

asszisztenseknek, hogy már a kezdetektől segítették szakmai fejlődésemet,

megtanítottak a molekuláris biológia alapjaira és sok éven át mindig mindenben lehetett

számítani rájuk.

Végül köszönöm családomnak a legmesszebbekig menő támogatást, kitartásukat és

türelmüket.