2019.11.08.

1

A vér élettanaKarcsúné Dr. Kis Gyöngyi

SZTE ÁOK Élettani Intézet, Szeged

TT-ok 8-13., vastagon szedett PIROS színnel

� #8 Nevezze meg a vérplazma fehérjefrakcióit, vázolja mérésük módszertani elvét (elektroforézis). Minden fehérjefrakciót illusztráljon egy-két példával.

� #9 Írja le a vérsüllyedés mechanizmusát, mérési módszereit, jelentőségét és normálértékét.

� #10 Reticulocyta fogalma, számolásának módja és jelentősége. #Az erythropoetin(keletkezés helye, trigger, funkció).

� #11 Definiálja az indirekt és a direkt bilirubint. #(UBG) keletkezése, vizeletbelidetektálásának jelentősége.

� #12 (Fehérvérsejtek) Ismertesse az immunglobulinok szerkezetét, típusait és működését.� #13 Jellemezze a vércsoportok antigénjeit és a keringő antitesteket (Landsteiner-

szabályok).

� #14 Jellemezze a thrombocyták kitapadását, aggregatióját és aktiválódását.

� #15 Ismertesse az extrinsic utat. Ismertesse az intrinsic utat és a kontakt fázist.� #16 Ismertesse a plazminrendszer aktivációját és szabályozását.

2019.11.08.

2

#Plazmafehérjék#Plazmafehérjék� 60-80 g/l

� > 70 kDa

� Nem diffúzibilisek

� Leggyakrabban glikoproteinek (poliszacharid lánc, hexóz, frukóz), [kiv. albumin]!

� Funkciójuk:� Kolloid ozmotikus nyomás fenntartása (albumin)

� Transzport

� Pufferelés (pH szabályozás)

� Proteolitikus enzimrendszerek komponensei (pl. véralvadás, komplement rendszer)

� Antiproteolitikus hatású fehérjék és proteáz inhibitorok

� Enzimek

� Immunglobulinok

� Modulátor- és akut fázis fehérjék

� Tumor markerek

Plazma/szérum fehérjék mennyiségi meghatározása� Rutin laborgyakorlat: Biuret reakció

� Normál: 60-80 g/l, plazma esetén fibrinogén +2-6 g/l

� Hiperproteinaemia: oka lehet dehidratáció - renálisfolyadékvesztés; myeloma multiplex

� Hipoproteinaemia: fehérjevesztés - vérzés, égés; fehérjeszegény táplálkozás; malabszorpciós szindróma; májbetegség – csökkent fehérjetermelés; infekció – fokozott fehérje katabolizmus

� Diszproteinaemia: összetevők aránya változik

� Bizonyos betegségek jellemző változásokat idéznek elő a mennyiségi és/vagy minőségi összetételben

2019.11.08.

3

Vérplazma fehérjéi - elektroforézis

� Háttér:

� Fehérje lúgos közegben negatív (pH=8,6)

� Anód felé vándorolnak (Fehérjék mozgatása feszültségkülönbséggel)

� Sebesség a töltések számától, molekulatömegtől és mérettől függ

� Több savas As (glutaminsav, aszparaginsav), annál közelebb az anódhoz

� Különböző médiumok használhatók: papír, agaróz-gél, poliakrilamidgél – különböző felbontóképesség

Vérplazma fehérjéi - PAGE

Vizsgálat menete

SDS-PAGE

(www.bio-rad.com)

• Molekuláris szűrés is a gélszerkezetnek köszönhetően (20 frakció elkülöníthető)

• Festés:• Ezüstözés (kis mennyiségek)• Oil-Red, Sudan-black

(lipoprotein)• Perjódsav-Schiff (glikoprotein)• Specifikus szubsztrátok

(enzimek)• Denzitometriás értékelés

2019.11.08.

4

#Példák különböző fehérjefrakciókra#Példák különböző fehérjefrakciókraAlbumin

� 35-50 g/l

� Albumin/globulin diagnosztikus jelentőségű (1,5-2,5); csökkenés: májbetegségek, alultápláltság, égés, hasmenés

Antitripszin� α1- globulin

� 2-4 g/l

� Gyulladásos folyamatokban véd a proteolízis káros hatásától és lokalizálja

� Hiánya májkárosodást okoz

Haptoglobin� α2- globulin

� Szabad hemoglobin megkötése (RES kivonja)

� 0,5-2,2 g/l

� Akut fázis fehérjeként is viselkedik

Transferrin� Β-globulin

� Vaskötő fehérje

� 2-4 g/l

� Vashiányban növekedett szint

Egyéb módszerek 1.Radiális immundiffúzió (Mancini):Ag-At találkozás, specificitás, kvantitatívAgaróz lemezstandard fehérje oldatok �kalibrációs egyenes precipitációs gyűrű területe, illetve az átmérő négyzete és az antigén koncentráció között lineáris összefüggés van

Immunelektroforézis:AgarózSpecificitásSemikvantitatív

Rakéta elektroforézis:Mennyiségi meghatározás

2019.11.08.

5

Egyéb módszerek 2.

� RIA

� ELISA

� Turbidimetria, nefelometria

� Biológiai aktivitás mérésével

Specifikus plazmafehérjékCITOKINEK:-Kis molekulatömeg-Leukocyták kommunikációját segítik-Szolubilis, multifunkcionális mediátorok-Autokrin, parakrin, endokrin hatás-Pleiotropia, redundancia-Szinergista, gátló, moduláló jellegű1. Interleukinok (IL) 2. Interferonok (INF) (antivirális, tumorok és autoimmun betegségek kezelése)3. Tumor necrosis factor (TNF) 4. Transforming growth factor (TGF) (tumorok, szövetregeneráció) 5. Kolóniastimuláló faktorok (CSF) (csontvelő, sejtosztódás) 6. Adipokinek (zsírsejtek által szekretált!)

AKUT FÁZIS FEHÉRJÉKCRP (C-reaktív protein)-Név: Pneumococcus sejtfalban levő C poliszacharidot megköti-Máj-1-8 mg/l (akár 50x)-Mediátorai: citokinek-A baktériumok sejtfalát duzzasztja-Segíti a nekrotikus sejttörmelék – kromatin, snRNP – felvételét-Aktiválja a komplementrendszert (klasszikus út)-ImmunmodulátorSzérum-amyloid A (SAA) és P (SAP)-Több izotípusa ismert-Apolipoproteinként a lipidek szállításaProcalcitonin-Bakteriális gyulladás által indukált plazmaprotein

2019.11.08.

6

#Vérsejtek süllyedése#Vérsejtek süllyedése

� Alvadásgátolt vérben a nehézségi erő hatására lesüllyednek

� 3 szakasz:� Aggregációs: sebesség lassú, plazmafehérjék döntő szerepet játszanak az

aggregátumok (rouleaux formation) kialakulásában (hidat képeznek)

� Precipitációs: aggregátumok kicsapódása a plazmában, sebesség nő

� Tömörülési: szorosan együtt süllyedő aggregátumok miatt csökken a sebesség

� Normál értékek:� Ffi: 2-6 mm/h

� Nő: 8-10 mm/h

� Nem specifikus vizsgálat

Szedimentáció mérése (ERS)

� Westergren

� Na-citrát oldat, EDTA

� Befolyásolja:

a) Kor, anaemia, terhesség, makrocitózis, gyulladás, tumor

b) Hematokrit (ffi!), mikrocitózis, hipogammaglobulinaemia, spherocitózis

2019.11.08.

7

##ReticulocytaReticulocyta

� Vvt prekurzor

� Tartalmaz: (bazofil anyagok) RNS, hemoglobin (34%), Golgi maradványok, mitokondrium, (esetleg s.magmaradvány)

� Csontvelőből véráramba (0,1-0,2 % vvt) (diapedesis)

� 1-2 nap érés után a maradék bazofil anyagok is eltűnnek �érett erithrocyta

Retikulocyta-számlálás módjai

1. Brillantkrezilkék vagy új metilénkék festés után fénymikroszkópos számolás(gyakorlat!) (Hb, RNS kicsapódnak, jellegzetes „golf labda”)

(időigényes és pontatlan)

2. Automatizált metodikák:� nagyobb a vizsgált sejtek száma

� Gyorsabb

� Reprodukálható eredmény

� kisebb a statisztikai hibalehetőség

1. az elektromos ellenállás (impedancia) mérésének elvén alapuló Coulter- számlálók

� egy sejt áthalad, megváltozik az elektromos ellenállás, hiszen az apoláris membránnalkörbezárt sejtek sokkal rosszabb töltéshordozók, mint a körülöttük levő elektrolitoldat,tulajdonképpen nagy ellenállású szigetelőnek tekinthetők

� az ellenállás változása az áthaladó sejt méretével arányos, így az automaták az egyedisejtméret meghatározásán keresztül a sejttípus azonosítására is alkalmasak

2. áramlási citométerek

� Optikai elven (fényszórás) működnek

� sejtnyalábra bocsátott adott hullámhosszú, monokromatikus, fókuszált lézerfényt asejtek méretüktől és összetételüktől függően különböző törőszögekkel szórják

� jelölésére különböző fluoreszcens festékek alkalmasak, pl. auramin-O, tiazol narancs(TO), melynek molekulái 488 nm hullámhosszú lézerfénnyel gerjeszthetők

2019.11.08.

8

Retikulocyta számolás jelentősége

� > : fokozott vérképzés (oka lehet pl. vérvesztés, anémia vagy épp kezelése után)

� < : csökkent vérképzés (anémia (pernicious, aplasztikus, vashiány), sugárzás, fertőzés, csontvelő betegség)

� Az eredményt befolyásol(hat)ják:� gyógyszerek (Parkinson, rheumatoid arthritis, láz, malária, kemoterápia)

� Sugárterápia

� Antibiotikumok

� Terhesség

� Vérátömlesztés

##ErythropoetinErythropoetin

� Glikoprotein (citokin), 34 kDa

� 1977-ben izolálták

� Termelődés:

vese (85-90 %, peritubuláris fibroblaszt-szerű interstitialis

sejtek a kéregben és külső velőállományban – O2 fogyasztás!)

máj (10-15 %)

� Hypoxia (vesében) � szöveti HIF-2 transzkripciós faktor (hypoxia inducible factor-2) � EPO gén HRE (hypoxia response element) �� EPO

� Más stimulátorok: hipoxia nem-renálisszenzorai, adrenalin, noradrenalin, prostaglandinok, spherocytosis

Haase VH. Regulation of erythropoiesis by hypoxia-inducible factors, Blood Rev., 2013

2019.11.08.

9

HIF-EPO-VAS

Renal EPO-producing cells

Divalent metal transporter

du

od

enalcyto

chro

me

b

ferroportin

Transferrin complex

(hepcidin promotes ferroportin degradation)

Enterocyta, hepatocyta és RES � több vas

HIF-regulált gének

EPO receptor az erythroid progenitorsejten

2019.11.08.

10

EPO nem-erythroid hatásai

Wang et al., Erythropoietin, a Novel Versatile Player Regulating Energy Metabolism beyond the Erythroid System, Int J Biol Sci, 2014

EPO� 2. leggyakoribb PED (performance-

enhancing drug)

� Stroke, vérrög, infarktus

2019.11.08.

11

#Bilirubin#Bilirubin

Az orvosi élettan tankönyve, Digitális Tankönyvtár

1-2 mg

Epefesték jellemzői

� Hemoglobinból (80 %), szöveti hemoproteinekből (mioglobin, citokrómok, enzimek)

� Antioxidáns hatás

� Nem konjugált bilirubin: van den Bergh-reagenssel alkohol jelenlétében ad lila elszíneződést � indirekt reakció � indirekt bilirubin� Vesében nem filtrálódik, vizeletben nem jelenik meg (albumin)

� Fokozott vvt pusztulás, hemolízis, vérömlenyek felszívódása � glukuronidképzészavara � Hiperbilirubinamia: > 40 µmol/l (sclera, bőr sárga, icterus, Kernicterus – vér-agy gát!)

� Perifériás vérben csak nem konjugált bilirubin (5-17 µmol/l)

� Konjugált bilirubin: direkt bilirubin� májsejt vagy epeszekréció zavar (sinusoidalis vérbe visszajut a direkt bilirubin) �

vízoldékony, hiperbilirubinaemia esetén vesében filtrálódik � vizeletben megjelenik

2019.11.08.

12

Urobilinogén

� 80-90 % szterkobilinogénné oxidálódik, széklettel ürül

� 10-20 % keringéssel májba, vesébe

� Vesében: filtrálódik

Különböző eredetű icterusok jellemző laboratóriumi leletei

Típus Prehepatikus Hepatikus Posthepatikus

Jellemző ok Hemolízis ↑ Szövet károsodás Obstrukció (epeút)

Szérum indirekt bilirubin (3-17 µmol/l)

++ + Normál

Szérum direkt bilirubin (0) Normál + ++

Vizelet direkt bilirubin Nincs + ++

Vizelet Vizelet urobilinogénurobilinogén(2(2--16 µmol/l)16 µmol/l)

++ ++ Nincs

székletfesték +, pleichrom széklet halvány Nincs, acholiás

Prehepatikus: hemolízis, hematoma, szerzett vagy öröklött hematolitikusbetegségek

Intrahepaticus: Gilbert-kór (transzportzavar), csökkent bilirubin felvétel vagy konjugáció, májsejtek szétesése, gyulladása

Posthepaticus: epevezeték elzáródása(daganat, epekő, gyulladás)

A fehérvérsejtek (leukocyták)� Szám: 5-8 000 sejt/µl

� Lymphohaematopoeticus őssejtből (haematopoetic stem cell, HSC)

� Vörös csontvelő, vérkeringés, nyirokrendszer, szervek

� Kvantitatív vérkép:� leukocytosis(↑), leukopenia(↓)

� Kvalitatív vérkép:a fehérvérsejtek százalékos eloszlása

May-Grünwald-Giemsa festés

Flow-cytometria (felszíni markerek)

2019.11.08.

13

A leukocyták típusai� NEUTROPHIL - 50-70%

� átmérő: 10-12 μm

� mag: szegmentált (többlebenyű)

� granulum: kicsi, gyengén festődik

� élettartam: néhány óra (lépben, szövetekben napok)

� célpont: baktérium, gomba

� Phagocytosis (bekebelezés)

� EOSINOPHIL - 2-4% � átmérő: 10-12 μm

� mag: kétlebenyű� granulum: nagyobb, hematoxilin-eosinos festéssel rózsaszín

� élettartam: 1-2 hét (néhány óráig van a keringésben)

� célpont: nagyobb paraziták, allergiás reakció

� BASOPHIL - < 1% � átmérő: 12-15 μm

� mag: kettő vagy háromlebenyű

� granulum: erős basophil festődés (kék)

� élettartam: néhány óra-nap

� Hisztamin felszabadulása gyulladás és allergia során – anaphylaxia

� LYMPHOCYTA - 20-40%

� átmérő: 7-8 μm

� mag: nem lebenyezett, nagy, nem centrális

� élettartam: hetek-évek

� B sejt: antitestek termelése (plazmasejt) – humoralis immunitás

� T sejt: vírusokkal fertőzött és daganatos sejtek elpusztítása –cellularisimmunitás

� NK (Natural Killer) sejt: nagy granularis lymphocyta, cellularis immunitás

2019.11.08.

14

� MONOCYTA - 4-8%

� átmérő: 15-20 μm

� mag: bab alakú

� phagosoma a cytoplasmában

� élettartam: a keringésben néhány óra-nap, kilép a szövetekbe –macrophag(aktiváció nélkül a szövetekben hónapok-évek)

� phagocytosis (kórokozó, szöveti törmelék), antigének bemutatása

� Szöveti macrophag-vonal (reticuloendothelialis rendszer):� Dendritikus sejtek(bőr, nyálkahártya) – fő antigénbemutató

� Kupffer-sejtek(máj): elöregedett vörösvértestek kivonása

� Microglia(agy)

� Histiocyta(többféle szerv)

� Mastocyta (hízósejt) - basophil granulocytához hasonló – allergiás reakció, gyulladás, sebgyógyulás [a szöveti hízósejt nem igazi macrophag vagy basophil]

� Osteoclast(csontlebontás)

Az immunválasz csoportosítása

1. Természetes immunitás

• első kontaktus a kórokozóval

• nincs memória

• mechanizmus: phagocytosis, komplementfehérjék (phagocytosis serkentése [opsonizáció], chemotaxis, cytolysis)

2. Szerzett (adaptív) immunitás

• az antigén felismerésén alapul

• sejtes (cytolysis) és humoralis immunitás (antitestektermelése)

• memória (védőoltások)

A fehérvérsejtek kommunikációja és szabályozása: CYTOKINEK

A gyulladásos reakció kialakulása: Arachidonsav-származékok

2019.11.08.

15

Természetes immunitás� Patogénhez asszociált molekuláris mintázatok (PAMP)(pl. baktériumok

poliszacharid molekulái, vírus RNS): mikroorganizmus csoportokat, de nem specifikus kórokozókat jeleznek

� Mintázatfelismerő receptorok („Pattern recognition receptors [PRR]”): PAMP detekciója: � Toll-like receptors

� NOD-receptor[sejt belsejében, vírusok]

� mannózkötő lektin [idegen poliszacharid felismerése]

� Sejtek:� MACROPHAGOK

� DENDRITIKUS SEJT

� GRANULOCYTÁK

� NK sejtek (vírus)

� Kitapadás az endothelhez → „gördülés”, diapedesis (kilépés az endothel sejtek között a kapillárisban) → vándorlás a szövetekben

Természtes immunitás humorálistényezője – komplement rendszer

Proteolitikus enzimkaszkád

termelődés: máj- zymogén (=prekurzor) forma

3 úton aktiválódhat:

Klasszikus útLektin út

Alternatív út

Funkció: � Cytolysis (pórusképzés a membránban – C5-9)� Chemotaxis (C5a fragment) � Opsonizáció (C3b, C4b) � Kórokozók molekuláris szerkezetének megváltoztatása

2019.11.08.

16

Membrane attack complex(MAC)

Fagocitózis

� „Phago”=felfal-elpusztít, „cyto”=sejt, „sis”=folyamat

� Bekebelezése és megsemmisítése idegen anyagoknak

� Neutrofil granulocita, monocita

AutofágiaNobel-díj 2016, Oshumi

2019.11.08.

17

A szerzett immunitás

� Antigénbemutatás a membránban:

MHC (major histocompatibility complex) � az antigént kísérő bemutatófehérje (HLA –humán leukocyta antigén)

� MHC-I � minden sejten van

� nagy mértékű sokféleség, egyéni különbségek („az én sejtem”)

� része:TAP/tapasin antigénfeldolgozó molekula - cytotoxikus T-sejteknek prezentálnak antigént (vírusos sejt, daganatsejt)

� MHC- II � immunsejteken van (antigénbemutató sejtek)

� lysosomában feldolgozott antigénfragmentek (pl. baktérium)

� segítő T-sejteknek prezentál

Immunológiai „synapsis”: MHC/antigén – T-sejt receptora közöttikapcsolat

A sejtek kommunikációját specifikus cytokinek segítik

2019.11.08.

18

A szerzett immunitás – T-sejtek� Segítő T-sejt (T-helper, TH)

� CD4 membránmarkere van

� receptora MHC-II + antigén komplexet ismer fel

� 1-es típus: további phagocytosist serkent

� 2-es típus: B-sejtek serkentése

� specifikus antitesttermelés

� Cytotoxikus T-sejt (T-killer, T-effektor) � CD8 membránmarkere van

� MHC-I-et ismer fel - vírusos/daganatos sejt elpusztítása (apoptosis, membránperforáció)

NK-sejt: hasonló cytotoxicitás, de nem feltétlen antigénspecifikus (természetes immunitás)

CD = Cluster of Differentiation (sejtfelszíni markerek)

� Memória T-sejt � CD8/CD4 pozitív is lehet

� hosszú ideig (évek) őrzik az antigén nyomát, új expozíciókor aktiválódás és osztódás

� Regulátoros T-sejt (suppressor T-sejt) � immuntolerancia: saját és bizonyos idegen antigének esetén gátlás

� centrális: thymusban autorekatív immunsejtek elpusztulása

� perifériás: elkülönülés (pl. agy, szemlencse, izületek), gátló cytokin (TGF), negatív kostimuláció (CD-fehérjék)

� γδ T-sejt� a sejt receptora a gyakori αβalegységek helyett γδ-ból áll � nyálkahártya, intraepithelialis lymphocyta

� teljes fehérjéket ismer fel, nem MHC/antigénprezentáció függő

2019.11.08.

19

Szerzett immunitás – B-sejtek

� plazmasejtté alakulás és antitesttermelés

� antigénprezentáció� B-sejt receptor = a sejt

membránjában lévő antitest

#Immunglobulinok#Immunglobulinok

IgG: leggyakoribb, phagocytáló sejtek Fc receptorához kötődik, placentán átjutIgM: ősi, kezdetben szintetizálódik IgA: nyálkahártya-secretumbanIgE: cytophil antitest, basophil és hízósejt kapcsolódás IgD: B-sejt receptor antigénexpozíció előtt

2019.11.08.

20

Az immunválasz mediátoranyagai

ARACHIDONSAV TERMÉKEK :

AKUT FÁZIS PROTEINEK

CITOKINEK

(lsd. 10. dia)

#Vércsoportok#VércsoportokKb. 35 vércsoport rendszer

AB0 (és Rh): legjelentősebb

Hazai elterjedés: A: 42%,B: 9%, 0: 46%, AB: 3%

Antigének és antitestek (agglutininek) kialakulásának ideje:

antigén - foetális élet 6. hetétől

antitest - születés utáni 10. nap körül

Az AB agglutininek kialakulásának oka:

Baktériumfertőzés hatására (E. Coli - B; Strepptococcus - A)

2019.11.08.

21

#ABO vércsoport antigének#ABO vércsoport antigének

Bombay: H-antigénről hiányzik a fukóz � további cukor nem tud kapcsolódni (genotípusstól függetlenül) �vércsoport:0, de a genotípus más

Vércsoport meghatározása

� Csak apaság kizárására jó!

� Keresztreakció:� Major teszt

� Minor teszt

� Non-kompatibilis vér transzfúziója:� Antitest-antigén reakció � donor sejtek

szétesése (hemolízis)� hemoglobin felszabadulás, veseelégtelenség

agglutináció

2019.11.08.

22

#Landsteiner szabály#Landsteiner szabály

(Karl Landsteiner, 1900)

Rh (Rhesus vércsoport)

� Protein antigének, 3 allél: c/C, d/D, e/E

� D-antigén � Rh+ (85 %)

� Anti-D antitest � Ø Landsteiner szabály

� Rh profilaxis: erythroblastosis fetalis elkerülése

2. terhesség!!!

2019.11.08.

23

#14 thrombocyták kitapadása, aktiválódása és aggregatiója (elsődleges haemostasis)

#15 extrinsic és intrinsic útvonal + kontakt fázis (másodlagos haemostasis)

2019.11.08.

24

#16 plazminrendszer aktivációja és szabályozása