ค ำน ำ ISO/IEC - DLDqcontrol.dld.go.th/images/ejournal/ejournal 1-2560/images... · 2017. 9. 22. · 3.2 วิธีทดสอบทางเคมี 105 3.2.1 วิธีทดสอบหาปริมาณแคดเมียมในอาหารสัตว์

ค ำน ำ การตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ดานสารพษ สารตกคาง สารปนเปอน ตามมาตรฐาน ISO/IEC

17025 : 2005 นบเปนสงส าคญประการแรกเพอใหสตวไดรบคณภาพอาหารท ด ปลอดภย เพอปองกนไมใหมการตกคางไปยงเนอสตว และผลผลตจากสตว ทน าไปเปนอาหารของมนษย เนองจากการตรวจสอบมความยงยาก ซบซอน และใชเครองมอราคาแพง แตนบวามความจ าเปนทจะตองศกษา และพฒนาถายทอดเทคนควธการทดสอบพรอมทงการจดท าระบบคณภาพขนในหองปฏบตการ เพอใหมมาตรฐานเทยบเทาสากลตลอดจนเปนทยอมรบและไดรบการรบรองหองปฏบตการในรายการทดสอบตาง ๆ ตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025 : 2005

เอกสารฉบบนมวตถประสงคเพอรวบรวมการตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ดานสารพษ สารตกคาง สารปนเปอน ตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025 : 2005 การจดท าระบบคณภาพหองปฏบตการทดสอบคณภาพอาหารสตว การชก การเกบ การสง และการเตรยมตวอยางอาหารสตว การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ มาใชเพอประเมนประสทธภาพของวธทดสอบ ซงไดรวบรวมวธทดสอบและคาสมรรถนะตางๆ ของวธทดสอบ ตลอดจนขอควรระวงหรอขอเสนอแนะทส า คญทมผลตอการรายงานผลทดสอบวธทดสอบทางพษวทยาและชวเคม วธทดสอบทางเคม และวธทดสอบทางจลชววทยา เพอใหเจาหนาทในหองปฏบตการและเจาหนาทภาครฐ ใชเปนแนวทางในการก ากบดแลตรวจสอบคณภาพอาหารสตว รวมทงเจาหนาทภาคเอกชนทรบถายโอนงานภารกจ ผประกอบการผลตอาหารสตวและหองปฏบตการใหม ไดศกษารวมกน และชวยในการจดตงหองปฏบตการในระดบชมชนและทองถนรวมกบมหาวทยาลยหรอสถานศกษาใกลเคยงเพอรองรบการตรวจสอบความปลอดภย ของอาหารสตวและผลตภณฑทผลตเพอขายหรอสงออกในอนาคต

ผจดท าหว งเปนอยา งยงวา เอกสารฉบบนจะใหความรและ เปนประโยชน ตอเจ าหนาท ใ นหองปฏบตการและผทเกยวของดานคณภาพอาหารสตว ในการน าไปศกษาตามแนวทางของเอกสารเพอไปประกอบการปฏบตงาน และขอใหปรบใชหลกเกณฑตางๆของวธการทดสอบใหเปนไปตามเอกสารอางองทมการทบทวนใหเปนปจจบนดวยตลอดเวลา

สทธพร พรยายน

สำรบญ

บทท หนำ 1 การจดท าระบบคณภาพหองปฏบตการตามขอก าหนดทวไปวาดวยความสามารถ หองปฏบตการทดสอบหรอสอบเทยบ (ISO/IEC 17025:2005) 1. ระบบการจดการคณภาพ 1 2. ท าไมตองมระบบการจดการคณภาพ 1 3. หนาทของเจาหนาททดสอบทางหองปฏบตการ 1 4. แฟมประวตบคลากร 1 5. วตถประสงคของการประกนคณภาพ 1 6. องคกรหองปฏบตการและความรบผดชอบ 2 7. การฝกอบรมและคณสมบตของบคลากร 4 8. การเลอกวธทดสอบและการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ 4 9. วธปฏบตงาน วธทดสอบ : Standard Operating Procedures (SOPs) 5 10. การบ ารงรกษาเครองมอและการบรการ 5 11. การรายงานผลวเคราะห 6 12. ความถกตองและตวอยางอางอง 6 13. ความแมนและตวอยางท าซ า 7 14. การสอบกลบไดของการวด 8 15. การทดสอบความช านาญ (Proficiency Testing : PT) 8 16. แผนภมควบคม Control Charts และขนตอนการควบคมทางสถต 12 17. เอกสารและการควบคมเอกสาร 14 18. การตรวจตดตาม/การด าเนนการแกไข/การทบทวนการบรหารจดการ 14

(Audit/Corrective actions/Management review) 19. รายการเอกสารทบทวนทงหมดเพอเตรยมส าหรบด าเนนการตรวจตดตาม 15

ตวอยาง การตรวจสอบเอกสารเบองตนของระบบคณภาพหองปฏบตการ 22 ตามขอก าหนด ISO/IEC 17025:2005

2 การตรวจสอบคณภาพอาหารสตวดานสารพษ สารตกคางและสารปนเปอนในอาหารสตว 33 3 วธทดสอบ 3.1 วธทดสอบทางพษวทยาและชวเคม 39 3.1.1 วธทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวโดยวธ 39

LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass spectrometry 3.1.2 วธทดสอบสารกลม Tetracyclines ในอาหารสตวโดยวธ HPLC 55 3.1.3 วธทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS 70 3.1.4 วธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว ดวย IAC-Post Column 83

Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

3.1.5 วธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวยวธ IAC-Fluorometry 97 โดยใชเครอง Fluorometer

3.2 วธทดสอบทางเคม 105 3.2.1 วธทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตว 105

ดวยเครอง ICP-OES 3.3 วธทดสอบทางจลชววทยา 111

3.3.1 วธทดสอบเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว 111 3.3.2 วธทดสอบ Total Plate Count (ปรมาณแบคทเรยทงหมด)ในอาหารสตว127 3.3.3 วธทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว 135 3.3.4 วธทดสอบปรมาณ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว 144

4 ขนตอนการด าเนนงานทดสอบทส าคญ 156 4.1 การชก การเกบ การสง และการเตรยมตวอยางอาหารสตว 156 4.2 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบ 171 คณภาพอาหารสตว 4.3 การน าคาสมรรถนะของวธทดสอบมาใชงาน 177 4.4 ขอควรระวงและขอเสนอแนะทส าคญ 178

สรป 185 เอกสารอางอง 187 ภาคผนวก 189 ก นยามศพทเกยวกบอาหารสตว 189 ข เกณฑการพจารณาผลวเคราะหตามมาตรฐานคณภาพอาหารสตว 194 ค ตวอยาง การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบแคดเมยมในอาหารสตว 228 ดวยเครอง ICP-OES ง ตวอยาง การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบแคดเมยม 252 ในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES

สำรบญรป

รปท หนำ บทท 1

1.1 แผนผงการประกนคณภาพ 3 1.2 X-Bar chart 13 1.3 Range chart 13 1.4 แผนผงขนตอนการวเคราะหตวอยางทางหองปฏบตการ 30 1.5 แผนผงการก ากบดแลของผควบคม (Supervisory) 31 1.6 แผนผงการประกนคณภาพ 32

บทท 3 3.1 Flow chart ขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย LC-MS/MS 48 3.2 Flow chart แสดงขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย HPLC 64 3.3 Flow chart ขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย LC-MS/MS 77 3.4 โครงสรางทางเคมของสาร Aflatoxin B1, B2, G1 และ G2 84

3.5 แผนภาพแสดงวธวเคราะหสาร Aflatoxins 91 3.6 โครงสรางทางเคมของสารอะฟลาทอกซน B1, B2, G1 และ G2 98

3.7 ขนตอนการทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว 124 3.8 ขนตอนการทดสอบ Total Plate Count ในอาหารสตว 130 3.9 ขนตอนวธทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว 138 3.10 ขนตอนการทดสอบ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว 150

บทท 4 4.1 ขนตอนการชกตวอยาง 157 4.2 การเตรยมตวอยางทดสอบ 158 4.3 อปกรณทใชในการเกบตวอยาง 158

ภำคผนวก ค 1 แผนผงขนตอนการทดสอบแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 233

ภำคผนวก ง 1 การวเคราะหแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 255 2 แผนผง Ishikawa หรอแผนผงกางปลา (cause and effect diagram or fish bone 256 diagram) แสดงแหลงของความไมแนนอนของการวเคราะหหาปรมาณแคดเมยมโดย ICP-OES

สำรบญตำรำง

ตำรำงท หนำ บทท 1 1.1 Analytical Variations (AV) ในหนวย % ; x=analyte concentration 7 1.2 Acceptable Recovery Limits 8 1.3 สรปรายการทดสอบความช านาญดานสารพษ สารตกคางและสารปนเปอน 11 ทหองปฏบตการตรวจสอบคณภาพอาหารสตวเขารวมทดสอบ บทท 3 3.1 คา LOD และ LOQ ของวธทดสอบ 39 3.2 โครงสรางและ Parent / Daughter ion ของสารกลม Beta agonists 41 3.3 สตรอาหารสตวผสมส าเรจรปส าหรบสกรในการเตรยมตวอยาง Sample blank 47 3.4 ขอมลการเตรยม Standard Calibration matrix Solution 48 3.5 ขอก าหนดของการทดสอบประสทธภาพของเครอง LC-MS/MS 48 3.6 MS Parameter ของการวเคราะหดวยเครอง LC-MS/MS ยหอ shimadzu 49 3.7 ล าดบการ Inject ตวอยางของแตละชด 52 3.8 เกณฑการยอมรบ % Ion ratio (อางองจาก European commission Decision 2002) 52 3.9 คา LOD และ LOQ ของวธทดสอบ 55 3.10 ชอและโครงสรางสารกลม Tetracyclines 56 3.11 ขอมลการเตรยม Working mixed standard solution ปรมาตร 5 ml 60 3.12 สตรอาหารส าเรจส าหรบสตวในการเตรยมตวอยาง Sample Blank 62 3.13 ขอก าหนดของการทดสอบประสทธภาพของเครอง HPLC 63 3.14 ล าดบการ Inject ตวอยางของแตละชด 67 3.15 โครงสรางและ Parent / Daughter ion ของสาร Carbadox 71 3.16 สตรอาหารสตวผสมส าเรจรปส าหรบสกรในการเตรยมตวอยาง Blank 75 3.17 ขอมลการเตรยม Standard Calibration matrix Solution 76 3.18 ขอก าหนดของการทดสอบประสทธภาพของเครอง LC-MS/MS 77 3.19 ล าดบการ Inject ตวอยางของแตละชด 80 3.20 เกณฑการยอมรบ % Ion ratio (อางองจาก European commission Decision 2002 80 3.21 คา Working range, LOD และ LOQ ของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวย 83 IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

สำรบญตำรำง (ตอ)

ตำรำงท หนำ บทท 3 3.22 การเตรยมสารละลาย Working standard โดยประมาณ 88 3.23 Molecular weights (MW) และ molar absorptivities () ของ Solvent 89 3.24 การแปลผลทดสอบ Triple Sugar Iron agar (TSI) 122 3.25 การแปลผลทางชวเคม 123 3.26 การเจรญเตบโตของเชอมาตรฐานอางองทใชในการทดสอบประสทธภาพ 141 อาหารเลยงเชอ DG 18 3.27 การแปลผลทดสอบทางชวเคม 149 บทท 4 4.1 แนวทางการพจารณาสงวเคราะหอาหารสตวแตละชนด ซงแยกตวอยางสงทงหมด 169 4 หองปฏบตการ กจกรรมตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ.2525 4.2 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบทางเคม 171 4.3 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบทางจลชววทยา 176

ภำคผนวก ค 1 ผลการทดสอบสารมาตรฐานแคดเมยม 234 2 ความเขมขนของแคดเมยมของ Blank sample 236 3 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ทระดบความเขมขน LOQ 238 4 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในอาหารสกรทระดบความเขมขนตางๆ 240 5 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในอาหารไกทระดบความเขมขนตางๆ 241 6 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในอาหารโคทระดบความเขมขนตางๆ 242 7 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในกากถวเหลองทระดบความเขมขนตางๆ 243 8 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในขาวโพดทระดบความเขมขนตางๆ 244 9 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในร าทระดบความเขมขนตางๆ 245 10 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในปลาปนทระดบความเขมขนตางๆ 246 11 แสดงคา % recovery จากการทดสอบ 247 12 แสดง %RSD ของ Horwitz equation และจากการทดลอง 247 13 แสดง Slope ของแตละตวอยาง 248 14 ผลการทดสอบ CRM ชนดตวอยาง Dogfish Liver จ านวน 10 ซ า และประเมน Trueness 249

และ %Recovery

สำรบญตำรำง (ตอ)

ตำรำงท หนำ ภำคผนวก ง 1 ขอมลผลของการสรางกราฟมาตรฐาน (calibration curve) ผลการวดและ 254 ค านวณคาทไดจากการทดลอง 2 ผลของการวเคราะหตวอยาง unknown 2 ซ า 254 3 คา ค านวณจากคาในตารางท 1 โดยคา (slope) =237,272 (intercept) =62.3 257 4 ความเขมขนและเครองแกววดปรมาตรทใชในการเตรยมสารละลายมาตรฐาน 259 5 ขอมลของเครองแกววดปรมาตรและอณหภม 259 6 ผลการค านวณคา Standard Uncertainty ทเปนแหลงความไมแนนอนของ 260 เครองแกววดปรมาตร 7 ผลการค านวณคา Standard Uncertainty (SUv) และ Relative Standard Uncertainty (RSUv) 261 ของเครองวดปรมาตรทใช 8 ขอมลการเตรยมสารละลายมาตรฐาน 261 9 ผลการค านวณคา Relative Standard Uncertainty ของสารละลายมาตรฐานทความเขมขนตางๆ262 10 การค านวณคา Standard Uncertainty รวมของความเขมขน 262 11 สรปผลการหาปรมาณคาความไมแนนอนของผลการวเคราะหแคดเมยม 264 ดวยเครอง ICP-OES

jC 1B0B

1 BQCLP E-JOURNAL วารสารอเลกทรอนกส ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ปท 8 ฉบบท 1

บทท 1 การจดท าระบบคณภาพหองปฏบตการตามขอก าหนดทวไปวาดวยความสามารถ

หองปฏบตการทดสอบหรอสอบเทยบ (ISO/IEC 17025:2005)

‘คณภาพ’ ตามมาตรฐาน ISO (Quality Management Systems-Fundamental and Vocabulary) หมายถง การบรรลขอก าหนดของการตอบสนองความตองการ ซงเปนความตองการทอาจมาจากผใชผลทดสอบและบางกรณอาจมาจากผมอ านาจก ากบดแล คณภาพ คอ ความรบผดชอบของทกคนและจะตองท าใหคณภาพเกดขนในทกขนตอนของกระบวนการ โดยจดเรมตนของการท าใหเกดระบบคณภาพเกดจากการจ าแนกความตองการของผใชผลทดสอบ จากการระบความตองการของผใชผลทดสอบผานการวางแผนและการจดการทถกตองจนถงการรายงานผลวเคราะห บางกรณจะตองมการตรวจสอบคณภาพของสนคาหลงจากทไดสงมอบใหกบลกคาเรยบรอยแลว เนองจากความพงพอใจของผใชผลทดสอบสามารถสงผลกระทบโดยตรงตอคณภาพ นกวเคราะหจงตองมการประเมนการท างานอยางตอเนองใหสอดคลองกบวตถประสงคและมาตรฐาน เพอใหมนใจวาไดบรรลความตองการอยางมประสทธภาพ 1. ระบบการจดการคณภาพ ในระบบการจดการคณภาพตองมการจดท าเอกสารวธปฏบตงาน (Standard Operating Procedures (SOPs)) เพอใหทกคนท างานไดสอดคลองกบระบบ โดยมการตรวจตดตามภายในเปนวธการตรวจสอบปญหาและเปนโอกาสส าหรบการปรบปรงอยางตอเนอง เพอชวยลดการเกดผลทดสอบทไมนาเชอถอ 2. ท าไมตองมระบบการจดการคณภาพ ในระบบการจดการคณภาพ กจกรรมของเจาหนาททกคนจะจดเกบเปนระบบเอกสารเพอใหสามารถตรวจสอบยอนกลบได ท าใหเกดความนาเชอถอของผลการทดสอบและการบรการ และสรางความเชอมนใหกบผใชผลทดสอบ ตลอดจนระบบการจดการคณภาพทสอดคลองกบมาตรฐานสากลทไดรบการยอมรบทวโลก 3. หนาทของเจาหนาททดสอบทางหองปฏบตการ กอนเรมท างาน เจาหนาททดสอบใหมทกคนตองท าความเขาใจกบเอกสารระบบคณภาพผานการฝกอบรม และมการจดเกบบนทกการฝกอบรมไวเปนหลกฐาน เพอใชแสดงวาเจาหนาททดสอบมประสบการณและความสามารถตามขอก าหนดของระบบการจดการคณภาพ 4. แฟมประวตบคลากร แฟมประวตบคลากรทจดท าขนควรมเนอหาเกยวกบประสบการณและความสามารถในการท างาน ในการฝกอบรมใหมจะไดรบหลกฐานทอนมตโดยหวหนางาน และมการปรบปรงประวตการฝกอบรม ซงมเนอหาประกอบดวย ประวตสวนบคคล รายละเอยดงาน หลกฐานเกยวกบการฝกอบรมและวนทจบการศกษา 5. วตถประสงคของการประกนคณภาพ การบรหารจดการภายในหองปฏบตการตองอยภายใตแผนการประกนคณภาพทปฏบตตามคมอคณภาพของหองปฏบตการ มการพฒนาและยดมนในขนตอนทเปนมาตรฐาน และมความสมบรณของขอมลในหองปฏบตการ ดงแผนผงในรปท 1.1


6. องคกรหองปฏบตการและความรบผดชอบ ในองคกรหองปฏบตการควรระบหนาทความรบผดชอบของบคลากรใหชดเจน (Job Description) และมบนทกแผนการฝกอบรม รวมทงแผนภมองคกรระบไวในเอกสารคณภาพหองปฏบตการ หนาทความรบผดชอบของบคลากรในองคกร ประกอบดวย 6.1 ผจดการ/ผอ านวยการหองปฏบตการมความรบผดชอบสงสดในการจดการระบบคณภาพ 6.2 ผจดการคณภาพเปนผรายงานโดยตรงกบผจดการ/ผอ านวยการหองปฏบตการและมหนาทรบผดชอบในการรกษาและปรบปรงขนตอนคณภาพทใชในหองปฏบตการ 6.3 เจาหนาททดสอบมหนาทปฏบตตามทกขนตอนของระบบคณภาพและระบการปรบปรงแกไข


รปท 1.1 แผนผงการประกนคณภาพ

การฝกอบรมบคลากรและคณสมบต

การบ ารงรกษาอปกรณและบรการ

ขนตอนการวเคราะห- การเลอกและการยนยน

ความตองการลกคา

รบตวอยาง

เลอกวธ

หองปฏบตการ และหนาทความรบผดชอบ

ความปลอดภยในหองปฏบตการ

ความปลอดภยในหองปฏบตการ

การตรวจสอบความใชไดของวธใหม

น ายาและสารเคม

คณสมบต (การฝกอบรม) นกวเคราะหทางหองปฏบตการ

รบตวอยางตรวจเขาหองปฏบตการ

สวนของขนตอนคณภาพ: การใชเครองชง, pipettes

เปนตน

การจดการและการเตรยมตวอยางอาหารสตว

ระบอปกรณและสารเคม

ระบการฝกอบรมพนกงาน

การรายงานขอมลการวเคราะห

แผนภมควบคม-การควบคม

กระบวนการทางสถต

ด าเนนการวเคราะห

การรายงานผล

การทดสอบความช านาญ

การสอบกลบไดของผล

การเตรยมเอกสารและการควบคมเอกสาร

การทดสอบ outlier

รายการตรวจตดตามคณภาพทางหองปฏบตการ

ขนตอนการวเคราะห

การตรวจตดตามคณภาพ/การปฏบตการแกไข/การทบทวนการ

บรหาร

ยนยนผล

การทบทวน


7. การฝกอบรมและคณสมบตของบคลากร การฝกอบรมและคณสมบตของบคลากรในระบบคณภาพเปนสงจ าเปน เพอใหเกดการยอมรบใน

ผลการวเคราะห การบรหารจดการหองปฏบตการตองมนใจวาบคลากรในหองปฏบตการมความร ทกษะ และความสามารถในการท างาน โดยอาศยพนฐานดานการศกษา ประสบการณและการฝกอบรม

เจาหนาททดสอบตองเขารวมฝกอบรมตามแผนการฝกอบรมของหองปฏบตการ นอกจากนควรศกษาวธทดสอบจากเจาหนาททดสอบทมความช านาญกบวธทดสอบเปนอยางด และเจาหนาททดสอบตองมความเขาใจและความช านาญในเอกสารวธทดสอบกอนจะรายงานผลใหกบผใชผลทดสอบ ขนตอนแรกส าหรบเจาหนาททดสอบใหมตองเรมจากการอานวธปฏบตงาน (SOPs) และขอส าเนาเอกสารจากหวหนางาน/ผจดการวชาการ/ผอ านวยการหองปฏบตการ ผเขารบการอบรมทกคนตองอาน Material Safety Data Sheet (MSDS) เพอใชเปนขอมลเบองตนเกยวกบความเปนพษและวธก าจดของเสยเมอตองท างานรวมกบสารเคมทใชในการทดสอบ ในการทดสอบความสามารถของผทดสอบ ตวอยางและวธทใชในการทดสอบจะถกระบโดยผควบคม จากนนน าผลททดสอบไดมาเทยบกบผลทดสอบกอนหนาโดยใชวธทางสถต paired t-test หากผลทดสอบทไดไมมความแตกตางอยางมนยส าคญทางสถตทระดบความเชอมน 95% แสดงวาเจาหนาททดสอบมความสามารถและมคณสมบตเพอเปนเจาหนาททดสอบ อยางไรกตามเจาหนาททดสอบตองเขารวมการทดสอบความสามารถอยางตอเนองโดยการมสวนรวมในประกนคณภาพภายใน (Internal Quality Assurance (IQA)) หรอ การทดสอบรวมกนเปนประจ า (Ring trials at regular intervals) 8. การเลอกวธทดสอบและการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ หากผใชผลทดสอบไมระบวธทใชในการทดสอบ แนะน าใหใชวธมาตรฐานตางๆ เชน ISO, CEN, AOAC, FDA เปนตน หากยงไมพบวธมาตรฐานอาจใชวธทไมใชวธมาตรฐานหรอวธทดดแปลงขนซงไดรบความยนยอมรวมกนกบผใชผลทดสอบและตองมการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ อยางไรกตามหองปฏบตการตองแจงตอผใชผลทดสอบเมอวธการทเสนอโดยผใชผลทดสอบไมเหมาะสมกบวตถประสงคทตงไว วธมาตรฐานและวธทไมใชวธมาตรฐานหรอวธทดดแปลงตองไดรบการตรวจสอบโดยหองปฏบตการกอนน ามาใชและเมอมการพฒนาวธส าหรบใชในหองปฏบตการตองมการจดท าขนตอนการปฏบตงาน การตรวจสอบความใชไดของวธ (Validation) คอ การยนยนผลโดยการตรวจสอบตามวตถประสงคทก าหนดขนเฉพาะส าหรบใชกบงานทตงใจจะท าใหส าเรจ อยางไรกตาม การตรวจสอบความใชไดของวธ จะด าเนนการเพอใชยนยนวธวเคราะหทเหมาะสมส าหรบการใชงานทตงใจไว ซงการด าเนนการของทกวธจะถกตรวจสอบกอนจะน ามาใชงาน

การตรวจสอบความใชไดของวธ ประกอบดวยขนตอนตางๆ ดงน 8.1 ความแมน (Accuracy) 8.2 ความเทยง (Precision) 8.3 คาต าสดทตรวจวดได (Limit of detection (LOD)) 8.4 คาต าสดทรายงานผลได (Limit of quantification (LOQ)) 8.5 คาความเปนเสนตรง (Linearity)

ความเทยง สามารถค านวณไดจาก AOAC (Horwitz) ซง Precision หรอ repeatability จะถกค านวณเปน relative standard deviation (coefficient of variability) และ accuracy จะค านวณเปน percentage recovery


9. วธปฏบตงาน: Standard Operating Procedures (SOPs) วธปฏบตงาน คอ เอกสารทเขยนขนเฉพาะส าหรบใชงานในหองปฏบตการ อาจเขยนโดยเจาหนาททดสอบทมความช านาญในขนตอนการปฏบตงานของหองปฏบตการ และมการทบทวนเนอหาทไดรบอนญาตจากผควบคมหรอผจดการคณภาพหรอผจดการวชาการในขอบเขตทวธปฏบตงานถกใชงาน และตองไดรบการอนมตใชจากผจดการคณภาพ รปแบบของ วธปฏบตงาน ควรประกอบดวยหวขอตางๆ ดงน:

9.1 หลกการ 9.2 ขอบขาย 9.3 ความรบผดชอบ 9.4 เครองมอ 9.5 สารเคม 9.6 ขนตอน 9.7 การควบคมคณภาพ 9.8 การค านวณ 9.9 การแกไข 9.10 ขอคดเหน 9.11 เอกสารอางองและแบบฟอรม 9.12 ภาคผนวก ( เชน Flow, Charts, Tables, Reference เปนตน)

วธปฏบตงาน จดเปนเอกสารควบคมตองมชอผจดท าและผอนมต วนประกาศใช วนททบทวนและรหสเอกสาร หากมการจดท าวธปฏบตงานฉบบใหม ตองท าการบนทกการแกไขทเอกสารดงเดม และเมอมการประกาศใชเอกสารฉบบใหมตองยกเลกเอกสารฉบบเกาทนท 10. การบ ารงรกษาเครองมอและการบรการ การบ ารงรกษาและการวดประสทธภาพของเครองมอเปนสวนส าคญของแผนการควบคมคณภาพ เพอชวยเพมระดบความเชอมนในผลวเคราะห เครองมอทใชงานในหองปฏบตการจ าเปนตองม วธปฏบตงานของแตละเครองและมการบ ารงรกษาเครองมอประจ าวนพรอมทงมการบนทกการบ ารงรกษา การบ ารงรกษาเครองมอ เครองมอจะตองไดรบการตดตงอยางถกตองโดยผทมความเชยวชาญ และมคมอการใชงาน คมอชนสวนอะไหล คมอการบรการและการรบประกนหรอสญญาของแตละเครอง จดท าแผนการบ ารงรกษาเครองมอรวมถงแผนการสอบเทยบและมบนทกเกยวกบประวตการตรวจเชค และงานซอมบ ารงประจ า และมการประเมนผลเปนประจ าเพอใหมนใจวาเครองมอหรออปกรณยงคงท างานไดอยางมประสทธภาพ ซงขนตอนดงกลาวขางตนจะด าเนนการโดยเจาหนาททรบผดชอบเครองมอนน การบ ารงรกษาและการซอมบ ารงโดยเจาหนาททดสอบหรอตวแทนศนยบรการจะตองมการบนทกใน log sheet ของเครองมอ หากเครองมอผดปกตหรอไมสามารถใชงานได เจาหนาททรบผดชอบตองรายงานความผดปกตดงกลาวตอผรบผดชอบทนทและตดประกาศ “ยกเลกการใชงาน” ใหชดเจน การสอบเทยบ การสอบเทยบถอเปนสวนหนงของวธทดสอบ ความถกตองของผลวเคราะหเกยวของโดยตรงกบระดบการท างานของเครองมอทใชส าหรบการวเคราะห ขนตอนการสอบเทยบทเหมาะสมและผลการสอบ


เทยบตองบนทกไว เพอใชเปนขอมลเบองตนส าหรบประเมนประสทธภาพความตอเนองของเครองมอ นอกจากนยงตองสามารถตรวจสอบยอนกลบไปยงหนวยมาตรฐานสากลได รายการเครองมอ เอกสารบนทกรายการเครองมอทกชนดจะถกเกบไวกบผจดการ/ผอ านวยการหองปฏบตการ ซงมรายละเอยดดงน ชอเครองมอ เลขรน serial number โรงงานผผลต วนทรบ ราคาซอครงแรกและทตงปจจบน ชนสวนและผจดจ าหนาย เปนตน เจาหนาททดสอบตองเกบรายละเอยดของรายการชนสวนส ารองทส าคญไวและตองทบทวนรายการดงกลาวอยางนอยปละครง โดยจดเกบไวใน Log Book ของเครองมอ เจาหนาททรบผดชอบใหดแลเครองมอ เจาหนาททไดรบมอบหมายใหรบผดชอบดแลเครองมอจะด าเนนการตรวจสอบและการบ ารงรกษาเครองมอ ในขณะทผควบคมจะท าหนาทตรวจสอบการสอบเทยบ และบนทกขอมลแจงตอเจาหนาททรบผดชอบส าหรบความผดปกตใดๆ หนาทของผรบผดชอบ 1. เรยนรการใชงานเครองมอโดยตองผานฝกการอบรมและฝกปฏบตการ 2. จดท าศกษาคมอการใชงานเครองมอใหมความเหมาะสมกบการใชงานและมการปรบปรงอยเสมอ 3. เมอมการใชงานเครองมอตองกรอกขอมลการใชงานลงใน log sheet หรอ log book 4. จดท ารายการชนสวนส ารองทส าคญเกบไวส าหรบใชงานกบเครองมอ เพอใหมนใจวามชนสวนส ารองเพยงพอ และตดตอการใหบรการและการบ ารงรกษากบผรบเหมาทมความเหมาะสม 5. ด าเนนการตรวจสอบเครองมอตามคมอการใชงาน 6. ด าเนนการใหมการซอมบ ารงเปนประจ าตามคมอการใชเครอง 7. แนะน าและใหความชวยเหลอกบบคคลอนทตองการใชงานเครองมอ Log Book ของ เครองมอ วตถประสงคหลกของ Log book ของเครองมอ คอ การจดท าบนทกการใชงานเครองมอ เพอใชเปนขอมลพนฐานส าหรบตรวจสอบความถกตอง นอกจากนควรบนทกหมายเลขโทรศพทของศนยบรการ ใน Log Book ของเครองมอ และในการใชงานเครองมอแตละครงนกวเคราะหตองสามารถเขาถงขอมลทตองการใน Log Book ของเครองมอไดงาย 11. การรายงานผลวเคราะห แตละขนตอนการวเคราะหตองระบคาชวงทใชงานไดของการวเคราะหเพอน ามาใชกบขอจ ากดของการทดสอบ เจาหนาททดสอบตองรายงานคาตวเลขเปนเลขนยส าคญตามมาตรฐานการรายงานผลของหองปฏบตการ โดยใชหลกการปดเศษ ดงน ถาตวเลขถดไป (ทางขวา) ≥ 5 ใหเพมคาตวเลขทเลอกขนไป 1 (ปดขน) แตถาตวเลขสดทาย <5 ใหปดทงโดยคงตวเลขในหลกทเหลอสดทายไว และถาตวเลขดานขวาคอ 5 แลวตามดวยเลข 0 เทานนใหดตวเลขทอยกอนหนา 5 หากเปนเลขคใหปดขนหรอหากเปนเลขคใหปดลง หรอใหปฏบตตามคมอของวธทดสอบ 12. ความถกตองและตวอยางอางอง ขนตอนการวเคราะหตวอยางอางองควรท าควบคกบตวอยางในแตละ batch และประเมนผลโดยใชคาเฉลยของ control chart ซงวสดอางอง (Reference Material, RM) สามารถใชเปนสารบรสทธ การ


วเคราะหอาหารสตวสวนใหญจะใชวสดอางองรบรอง Certified Reference Material (CRM) หรอ ตวอยางอางองภายใน Home-made feed Reference Sample (HRM) วสดอางองรบรอง ทางอาหารสตวสามารถจดหาไดจากหนวยงานทดสอบความช านาญของอาหารสตว (ตารางท 1.3) ซงคาอางองถกวเคราะหโดยหลายหองปฏบตการทใชหลายวธ Validate ทเปนอสระตอกน อยางไรกตามหองปฏบตการสามารถท าตวอยางอางองขนเองได โดยวสดอาหารสตวทใชควรเลอกทเปนตวแทนกลมของตวอยางอาหารสตวทถกวเคราะหในหองปฏบตการ ส าหรบตวอยางอางองควรแบงตวอยางไวส าหรบวเคราะหอยางนอย 6 เดอนและตวอยางทแบงไวควรเกบในชองแชแขง นอกจากนควรใช Control chart ประมาณคาเพอดแนวโนมทอาจชใหเหนขอผดพลาดของคณภาพการแบงตวอยาง อางอง ซงอาจใชหลายวธเพอวเคราะหในหองปฏบตการ 13. ความแมนและตวอยางท าซ า ในการวเคราะหทกครงควรมการท าซ า เพอเพมความแมนของผลวเคราะห อยางไรกตามหากไมสามารถท าซ าไดทกครง แนะน าใหท าตวอยางอยางนอย 10% ของตวอยางใน batch นนและตวอยางทท าซ าควรเปนตวอยางทเจาหนาททดสอบไมทราบคา ความแมนของตวอยางทวเคราะห ชวงของการยอมรบผลจากการท าซ าทแตกตางกนจะขนอยกบวธทดสอบ ความตองการของผใชผลทดสอบ และชนดของตวอยาง The relative range หรอ relative percent difference สามารถค านวณไดดงน Relative Percent Difference = (X1-X2) x 100 / mean of replicate values ซง: X1 = the largest replicate value X2 = the smallest replicate value ตารางท 1.1 Analytical Variations (AV) ในหนวย % ; x=analyte concentration Analyte AV (%) Moisture (Dry Mass) 12 Protein 20/x + 2 Fat 10 Crude Fibre 30/x + 6 Ash 45/x + 3 Total sugars as invert 12 Calcium 10 Phosphorus 3/x + 8 Salt 7/x + 5 Vitamin A 30


ความถกตองหรอ % Recovery ของตวอยางควบคมคณภาพสามารถใช AOAC “International Guidelines for Single Laboratory ภาคผนวก F ในการพสจนความใชไดของวธทางเคม(ตารางท 1.2) ตารางท 1.2 Acceptable Recovery Limits Concentration Recovery Limits (%) 100 % 98-101 10% 95-102 1% 92-105 0.1% 90-108 0.01% 85-110 10 µg/g (ppm) 80-115 1 µg/g (ppm) 75-120 10 µg/kg (ppb) 70-125 การค านวณ % Recovery จากวสดอางอง (Reference material):% Recovery = (Xr/Xk) x 100 ซง: Xr = observed value of reference material Xk = certified or true value of reference material 14. การสอบกลบไดของการวด ทกครงทท าการวดตวอยางทางหองปฏบตการตองสามารถตรวจสอบยอนกลบไปยงระบบ Standard International (SI) unit ได 15. การทดสอบความช านาญ (Proficiency Testing: PT)

การทดสอบความช านาญหองปฏบตการ Proficiency Testing (PT) เปนการประเมนสมรรถนะของหองปฏบตการ โดยการเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการ เพอควบคมคณภาพการตรวจวเคราะหของหองปฏบตการ การเขารวมโปรแกรมการทดสอบความช านาญจะชวยประเมนความเทยงและความแมนของการวเคราะห ในการประเมนผลการท างานของหองปฏบตการจะเกยวของกบคา “Z” ซงเปนคาค านวณ ถาคา Z ≤ 2 แสดงวาผลการทดสอบความช านาญเปนทนาพอใจ ถาคาอยระหวาง 2 และ 3 แสดงวาผลการทดสอบมปญหาและถาคา Z ≥ 3 แสดงวาผลการทดสอบไมเปนทนาพอใจตองมการตรวจสอบและด าเนนการแกไข คา Z สามารถค านวณไดจากความแตกตางระหวางผลทดสอบของหองปฏบตการและผลของโปรแกรมการทดสอบหารดวยคาเบยงเบนมาตรฐานของโปรแกรมการทดสอบ ในความหมายอน คา Z คอ จ านวนของคาเบยงเบนของผลทดสอบทางหองปฏบตการทมาจากคาทสอดคลองกน หนวยงานทจดโปรแกรมทดสอบความช านาญ ไดแก The Association of American Feed Control Officials (AAFCO), The American Association of Cereal Chemists (AACC) และ The American Oil Chemists’ Society (AOCS) ในปจจบน The European PT Information System (EPTIS) ยงคงเปนหนวยงานทจดโปรแกรมการทดสอบความช านาญ และหองปฏบตการควรมขอมลหนวยงานทจดโปรแกรมการทดสอบความช านาญ (ตารางท 1.3)

หองปฏบตการตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตวไดเขารวมทดสอบความช านาญหองปฏบตการกบหนวยงานทเปนผจดการทดสอบความช านาญหองปฏบตการ กบหนวยงานทงภายในและภายนอกประเทศ เพอเปนการยนยนวา หองปฏบตการมการด าเนนการเปนไปตาม


มาตรฐานสากล ตามทก าหนดใน General requirement for the competence of testing and calibration laboratories ISO/IEC 17025 : 2005 ขอ 5.9 การประกนคณภาพผลการทดสอบและการสอบเทยบ กลาวถง การจดใหมการเขารวมในการเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการหรอด าเนนการเขารวมทดสอบความช านาญหองปฏบตการโดยไดมการเขารวมทดสอบความช านาญหองปฏบตการกบหนวยงานทเปนผจดการทดสอบความช านาญหองปฏบตการ กบหนวยงานทงภายในและภายนอกประเทศ เปนประจ าทกป ไดแก 15.1 หนวยงานภายในประเทศทส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ไดสมครเขารวมทดสอบความช านาญหองปฏบตการ คอ 15.1.1 ศนยบรหารจดการทดสอบความช านาญหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรบรการ สาขา อาหาร ไดแก Feeding stuffs, Starch, Flour, Rice powder, Fruit and Vegetable, Milk powder 15.1.2 ส านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข สาขา การตรวจวเคราะหอาหารทางจลชววทยา ไดแก Coliforms, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Bacillus cereus, Staphylococcus aureus 15.2 หนวยงานภายนอกประเทศ 15.2.1 LGC Standards Proficiency Testing และ Bipea ประเทศองกฤษ รายการ Quality in Meat and Fish Analysis Scheme รายการ Quality in Microbiology Scheme รายการ Quality in Dairy Chemistry Scheme รายการ Animal Feeds Proficiency Testing Scheme รายการ Quality in Food Chemistry Scheme รายการ Phamaceutical Analysis Proficiency Testing Scheme รายการ Quality in Water Analysis Scheme รายการ PCB และ Dioxins in Agri-Food Domain รายการ Mycotoxins : Aflatoxin และ Ochratoxin

15.2.2 Public Health England ประเทศ องกฤษ รายการ Food and Water Microbiology External Quality Assessment Schemes ไดแก Standard Scheme, Staphylococcus aureus Enterotoxin Scheme และ Drinking Water 15.2.3 The Food and Environent Research Agency (FERA) FAPAS Programme ประเทศองกฤษ รายการ Nutritional Components และ elements รายการ Melamine รายการ Nitrate และ Nitrite รายการ Veterinary Drug Residues รายการ Feeding Stuffs รายการ Mycotoxins รายการ Metallic Contaminants รายการ Pesticide Residues FEPAS Programme ประเทศองกฤษ รายการ Coagulase Positive Staphylococci, Clostridium perfringens, Enterobacteriaceae/Aerobic Plate Count, Coliforms, Escherichia coli, Bacillus cereus, Enterococci, Lactic Acid Bacteria, Yeasts and Moulds, Listeria monocytogenes, Salmonella spp., Campylobacter spp., Vibrio parahaemolyticus ซงหนวยงานทเปนผจดกจกรรมการทดสอบความช านาญหองปฏบตการ ทหองปฏบตการส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตวไดสมครเขารวมกจกรรมดวยนน เปนหนวยงานทด าเนนการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17043 และจากการเขารวมทดสอบความช านาญหองปฏบตการกบหนวยงานทงภายในและภายนอกประเทศ ผลการเขารวมทดสอบความช านาญหองปฏบตการ แสดงใหเหนวา หองปฏบตการ มขดความสามารถในการตรวจวเคราะห สรางความนาเชอถอในผลการตรวจวเคราะหวามความถกตอง มความมนใจในการน าผลการตรวจวเคราะหไปใช


หนวยงานทเปนผจดกจกรรมการทดสอบความช านาญหองปฏบตการ จะมการจดกจกรรมทดสอบความช านาญเปนประจ าทกป และรอบเวลาการสมครอาจไมตรงกน เราสามารถตดตามการสมครเขารวมการทดสอบความช านาญหองปฏบตการ จาก website ของหนวยงานดงกลาว ดงน 1. ศนยบรหารจดการทดสอบความช านาญหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรบรการ(http://www.dss.go.th) 2. ส านกคณภาพและความปลอดภยอาหาร กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข (http://www.dmsc.moph.go.th)

3. LGC Standards Proficiency Testing และ Bipea ประเทศองกฤษ (www.lgcpt.com) มโปรแกรมทดสอบความช านาญดานอาหารสตว Animal feed Scheme (AFPS) มตวครอบคลม ตงแตคณคาทางอาหารสตว trace element Salmonella spp. และ indicator ตวอยางอาหารสตว จะมทง อาหารสตว อาหารสนข สารผสมลวงหนา และกรดอะมโน จะมทง 13 ชนดของอาหารสตวและวตถดบ มอาหารสตวทง ไก กระตาย สนขและแมว สารผสมลวงหนา ปลาปน มรายการมากในทาง Premix 42 ชนด และอาหารสนขและแมว 67 ชนด มรายการพชและอน ๆ ไกปน ปลาปน โลหะหนก แรธาต วตามน และสารตกคางในตวอยาง ยาสตวตกคาง เชน Carbadox และอน ๆ มากกวา10 ชนดรายการกลม Coccidiostat คณคาทางอาหารทงหมด มชนดตวอยางหลากหลายเชนรายการ วตามน สารพษเชอรา กรดอะมโน Antioxidants โลหะหนก 4. Public Health England ประเทศ องกฤษ (www.hpa.org.uk/eqa) ท ากบตวอยางทเปน lyophilization ของเชอนยมท ากนมากเพราะไมม matrix มกใหผลถกตองสอดคลองผานการทดสอบเนองจากไมมอทธพลจากชนดตวอยาง 5. The Food and Environment Research Agency (FERA) (www.fapas.com) FAPAS โปรแกรมจะเนนดาน food chemistry และ FEPAS จะเนนดาน food microbiology เชน จะเนนเชอจลนทรย Salmonella spp. และอน ๆ ในอาหารสตว อาหารคน น า สงแวดลอม และสขภาพพช

6. AAFCO มตวอยาง Pet food อาหารสตว ดานสารอาหาร ยา ยาปฏชวนะ แรธาต วตามน ตามระดบทก าหนดใหใช เปน Regular check sample สารพษเชอรา โลหะหนก ยาในอาหารสตวทเรมตนใชในครงแรก ยาสตวตกคาง มตวอยางใชตรวจสอบการท างาน ในการผสมสตรอาหารตามสตรทขนทะเบยน

http://www.lgcpt.com/


ตารางท 1.3 สรปรายการทดสอบความช านาญดานสารพษ สารตกคางและสารปนเปอน ทหองปฏบตการกลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตวเขารวมทดสอบ

หนวยงานทจด (PT provider) ชนดตวอยาง รายการททดสอบความช านาญ FEPAS Flour Yeasts and Moulds in flour

Maize Aflatoxin

B1/Total,DON,ZON,OTA Maize Aflatoxin B&G/Total Animal Feed (cereal based) Aflatoxin B&G/Total Milk Powder Aflatoxin M1

FAPAS (www.fapas.com) Wheat Flour, Animal Feed Ochratoxin A Maize Flour, Animal Feed deoxynivalenol (DON)

Breakfast cereal, Animal

Feed Zearalenone (ZON)

Milk Powder, Animal Feed Melamine & Cyanuric acid Animal Feed Coccidiostats Animal Fats PCB

Bipea (www.bipea.org) Fish PCB & Dioxins email :

[email protected] Soybean cake PCB

Liver of Cattle PCB & Dioxins Public Health England

(www.phe_eqa.org.uk/.) email : [email protected]

Freeze dried Salmonella spp. Freeze dried Aerobic colony count Freeze dried Enterobacteriaceae

กรมวทยาศาสตรการแพทย (www.dmsc.moph.go.th/)

email : [email protected]

ขาวโพด Aflatoxin B&G/Total

ถวลสง Aflatoxin B&G/Total


16. แผนภมควบคม Control Charts และข นตอนการควบคมทางสถต วธทดสอบทางหองปฏบตการตองอยในการควบคมทางสถต ประสทธภาพการท างานของหองปฏบตการควรประเมนโดยใช control charts คาเฉลยหรอ X-bar charts ถกออกแบบมาเพอชใหเหนการเปลยนแปลงคาของคาเฉลยระยะยาวส าหรบตวอยางทถกวเคราะหโดยวธการเฉพาะ ชวง หรอ R charts ถกออกแบบมาเพอชใหเหนการเปลยนแปลงในการท าซ าของขนตอน ขอมลน ามา plot ตามขนตอนตอไปน สราง charts พนฐานโดยการค านวณคาเฉลยและชวงของคาเฉลยโดยเฉลยอยางนอย 6 กลมของรายการทท าซ าทไดมากกวา 3 วน สราง X-bar charts โดยการวาดเสนแนวนอนผานจดกงกลางของหนา และ label เปน Central line จากนนวาดเสนปะ เปนตวแทน warning limits ท 95% confidence วาด เสนเปนตวแทน control limits ท 99% confidence สราง R charts โดยวาดเสนแนวนอนทบผานดานลางของหนา label เปน Central line วาดเสนประ 1 เสนเปนตวแทน warning level ท 95% confidence และเสนทสองเปนตวแทน control limit ท 99% confidence แยกความแตกตางของสองตวอยางควบคมโดยคาเฉลยหลกของชวงการควบคมและ plot บน chart ตามแนวแกน Y กบ วนทตามแนวแกน X เมอแตละกลมตวอยางถกวเคราะหแลวควรมการประเมนและตรวจสอบ Control charts เพอใหมนใจวาการควบคมอยในขอก าหนดกอนผลวเคราะหจะถกรายงานใหกบผใชผลทดสอบ กระบวนการจะอยในการควบคมถาทกจดบน X-bar charts และ R charts อยภายใน control limits

กระบวนการทไมอยในการควบคม ถา: 1) คาเฉลย มคาเกน upper control limits หรอ lower control limits 2) คาเฉลยของเจดคาทตดกนโดยทงหมดจะอยบนดานหนงของเสน Central line


รปท 1.2 X-Bar charts (FAO and IFIF, 2010)

รปท 1.3 R charts (FAO and IFIF, 2010)


17. เอกสารและการควบคมเอกสาร เอกสารคณภาพเปนเอกสารในระบบคณภาพทตองมการควบคม เอกสารเหลานรวมถงเอกสารทจดท าโดยหองปฏบตการและเอกสารอางองจากภายนอก เอกสารจากภายนอกรวมถงกฎหมาย แนวปฏบต มาตรฐาน วธทดสอบ วธใชและคมอการใชเครองมอ เอกสารทประกาศใชจะน ามาใชกบเจาหนาททดสอบและบคลากรในหองปฏบตการตามสวนของระบบการบรหารจดการซงจะผานการทบทวนและเหนชอบกอนทจะอนมตการใชงานใหเปนไปตามระบบการควบคมเอกสารของหองปฏบตการและ master list เอกสารของหองปฏบตการ ตองมการระบการแกไขเอกสารใหเปนปจจบน เพอปองกนไมใหเจาหนาททดสอบและบคลากรใชเอกสารทลาสมย master list ของหองปฏบตการและการควบคมเอกสารและขนตอนการจดท าบนทกใหเปนไป ตามน : 17.1 เอกสารทไดรบอนญาตและเอกสารภายนอกจะถกน ามาใชงานในหองปฏบตการ 17.2 เอกสารจะถกทบทวนตามตารางเวลาและถกแกไขเพอใหมนใจวามความเหมาะสมอยางตอเนองและสอดคลองกบระบบบรหารจดการ และระบวนทแกไขเอกสาร 17.3 เอกสารยกเลกหรอลาสมยจะถกลบทนทจากทกจดของเอกสารทออกหรอเอกสารทใช 17.4 เอกสารทลาสมยจะเกบไวใชเพอวตถประสงคอยางใดอยางหนงอาจเปนทางกฎหมายหรอเกบไวเปนความร ซงจะตองท าเครองหมายบอกวาเปนเอกสารส าหรบเกบหรอลาสมย 17.5 หลกเลยงสงทอาจเกดขนจากขนตอนทแตกตางกนในการใชงานในเวลาเดยวกนทแกไขดวยมอในสถานททตางกน หรอส าเนาไมควบคมทไมควรจะไดรบอนญาต 17.6 สวนหวของเอกสารควบคมตามทอธบายในการควบคมเอกสารของหองปฏบตการและขนตอนการบรหารจดการ ระบเอกสารระบบการจดการทไมซ ากนซงจดท าขนโดยหองปฏบตการ การระบดงกลาวรวมถงวนทแกไข เลขทระบ อ านาจในการออกเอกสารและเลขหนา 17.7 เสนอใหมการเปลยนแปลงเอกสารทมการทบทวนและการอนมตใหเปนไปตามการควบคมเอกสารของหองปฏบตการและขนตอนการบรหารจดการ เวนแตจะก าหนดเปนอยางอน 17.8 ขอความทถกแกไขหรอขอความใหมอาจมการระบในเอกสาร บนหนาปก หรอในเอกสารแนบ และ log of update จะรวมอยในหนาแรกของเอกสารใหม 17.9 การควบคมเอกสารของหองปฏบตการและขนตอนการบรหารจดการจะถกจดเกบไวในเอกสารอเลกทรอนกส 18. การตรวจตดตาม/การด าเนนการแกไข/การทบทวนการบรหารจดการ (Audit/Corrective actions/Management review) การตรวจตดตาม (Internal audit) เปนการด าเนนการ (อยางนอยปละครง) ตรวจสอบวามการด าเนนการในระบบคณภาพอยางตอเนองเพอใหสอดคลองกบขอก าหนดในระบบการจดการคณภาพ มการจดตารางการตรวจตดตาม โดยผจดการคณภาพหองปฏบตการจะเปนผทมหนาทในการประสานงานเกยวกบการตรวจตดตาม เจาหนาททดสอบทผานการฝกอบรมและผานการรบรองจะมหนาทในการด าเนนการตรวจตดตาม อยางไรกตามผตรวจประเมน (Auditor) อาจท าการตรวจประเมนในพนทของตวเอง แตตองไมตรวจตดตามการท างานของตวเอง เมอการตรวจตดตามพบขอสงสยซงอาจมผลตอประสทธภาพการด าเนนการหรอความถกตองของผลวเคราะหทางหองปฏบตการ จะตองเรมด าเนนการแกไข


หากผลการตรวจตดตามมผลกระทบตองานทดสอบจะตองแจงตอผใชผลทดสอบเปนลายลกษณอกษร เพอระบความผดปกตทเกดขนกอนทจะมการตรวจพบ พนทในการด าเนนการตรวจตดตามและการด าเนนการแกไขและปองกน (corrective and preventive actions; CAPA) ทเกดขนตองท าการบนทกตามขนตอนการตรวจตดตามหองปฏบตการ การตดตามผลการตรวจสอบจะด าเนนการตรวจสอบ จดท าการบนทก และด าเนนการแกไข รวมทงทบทวนการบรหารจดการ ขนตอนและตารางการทบทวนการบรหารจดการหองปฏบตการจะด าเนนการโดยผบรหารหองปฏบตการ เพอใหมนใจวาเอกสารมความเหมาะสมส าหรบใชงาน การทบทวนการบรหารจดการในสวนของระบบการบรหารจดการ ครอบคลมถงสวนตางๆดงตอไปน: 18.1 ความเหมาะสมของนโยบายและขนตอน 18.2 รายงานจากผจดการและผควบคมในสวนของการบรหารจดการและการก ากบดแล

18.3 ผลของการตรวจตดตามลาสด 18.4 การด าเนนการแกไขและปองกน 18.5 การประเมนจากหนวยงานภายนอก (External bodies)

18.6 ผลการเปรยบเทยบ inter-laboratory (การทดสอบความช านาญ) 18.7 การเปลยนแปลงปรมาณและรปแบบของงาน 18.8 กระแสตอบรบจากผใชผลทดสอบ 18.9 ขอรองเรยน 18.10 ปจจยอนๆ เชน การด าเนนการควบคมคณภาพ แหลงทมา และการอบรมเจาหนาท 19. รายการเอกสารทบทวนท งหมดเพอเตรยมส าหรบด าเนนการตรวจตดตาม SOP’s (including version numbers): ___________________________________________ Documentation relating to analytical data _____________________________________ Worksheet Reports ________________________________________________________ Lab Notebook #(s) _________________________________________________________ Balance calibration records _________________________________________________ LIMS database ____________________________________________________________ Working Control data ______________________________________________________ Pipette Calibration Records _________________________________________________ Equipment monitoring Log (s) _______________________________________________ Other: ___________________________________________________________________ Other: ___________________________________________________________________ Other: ___________________________________________________________________ 19.1 การควบคมเอกสาร (Documentation)

19.1.1 มฉบบทไดรบการอนมตในขนตอนการด าเนนการตามมาตรฐานเพอตรวจสอบการวเคราะหทอยในจดของการใชงานส าหรบนกวเคราะหทอางถงในระหวางการวเคราะหหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน


19.1.2 เปนวธทเปนมาตรฐานและเปนทยอมรบ (หากมการเบยงเบนจากวธทเปนมาตรฐานอยางมากจะตองมการ validate กอนน าไปใชงาน) ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.1.3 ขอมลและเอกสารสนบสนนสามารถใชงานไดทนทและงายตอการเรยกคน เอกสาร ทกเอกสารทเกยวของโดยเฉพาะกบการวเคราะหควรจะงายตอการเรยกคนเอกสาร รวมทงขอมลทตองการ แตไมรวมถง analytical summary sheet, assignment worksheet reports sheets, lab notebook with solution preparation information, equipment maintenance and calibration logs, computer and instrument output, control charts เปนตน ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.1.4 เอกสารมขอมลเพยงพอพรอมค าอธบายและการแปลผลรายงานการวเคราะห โดยผทมความรทมหนาทรบผดชอบ ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.1.5 เอกสารมขอมลทเพยงพอ เชน ตองการอนญาต เมอเปนทนาพอใจ การวเคราะหซ าทเปนทนาพอใจภายใตเงอนไขเดม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.6 รายการเดมทงหมดทมอยในเอกสารมความเรยบรอย อานงายและถกบนทกโดยใชหมกกนน าสด าหรอสน าเงน ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.1.7 หากขนตอนทใชในการวเคราะหตวอยางไมเปนทยอมรบ ขนตอนดงกลาวผานการ validate หรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.1.8 หากขนตอนทใชในการวเคราะหตวอยางเปนขนตอนผานการ validate มเอกสารการ validate ทถกเกบไวและพรอมใชงานหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.9 หากมการแกไขใดๆ หรอมการเปลยนแปลงรายการในเอกสาร ตองท าการแกไขหรอเปลยนแปลงไดอยางถกตองหรอไม ซงการแกไขทถกตองจะตองปฏบตตามน: 19.1.9.1 ไมใชยางลบ สารเคมลบค าผดหรอเทปลบค าผด หากตองการแกไขเอกสารใดๆ 19.1.9.2 ขดเสนตรงเสนเดยวทบรายการทผด ไมลบขอความเดม และควรจะอานไดชดเจนแมผานการขดฆา


19.1.9.3 เขยนขอความทถกตองใหใกลเคยงกบขอความเดมเทาทจะเปนไปได 19.1.9.4 มลายเซนของนกวเคราะหก ากบไวใกลกบขอความทถกแกไข 19.1.9.5 วนทแกไขควรเขยนไวใกลกบขอความทถกแกไข (เวนแตวนทมการแกไขในกรณการแกไขวนทตวเอง) 19.1.9.6 ถาเหตผลของการแกไขไมชดเจน ควรอธบายยอๆวาท าไมจงมความจ าเปนตองมการเปลยนแปลงแกไข ถาเปนไปได ค าอธบายควรเขยนใกลกบขอความทถกแกไข หรอสามารถอางองไวทใดทหนงในกระดาษโดยใชสญลกษณ “*” ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.10 sheet สรปการวเคราะหส าหรบบนทกเวลาพก อณหภม เวลายอย อณหภมใน bath อนๆ ส าหรบทกขนตอนวกฤตจะถกก าหนดใหอยในขนตอนการด าเนนการใหเปนไปตามมาตรฐานหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.11 ทกน าหนกทต ากวา 1 กรมจะเขยนในรปแบบ 0.xxxx (รวมเลข 0 ดานหนา) หรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.12 ถามการแทรก (เชน chromatograms, printouts อนๆ) จะใชทปดผนก (staples, taped) หรอวางในซองแยกตางหาก ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.13 ในระหวางการวเคราะหเครองมอใด ๆ มผลวเคราะหเกดขน รายการทงหมดของเครองมอทใหผลวเคราะห ตองมการชบงอยางถกตอง (เชน calibration standard ID ของ working standard เลขก ากบตวอยาง ส าหรบการทดสอบแตละตว การ dilute ตวอยาง [หากมความแตกตางกวาทอธบายในขนตอนการด าเนนการตามมาตรฐาน] อนๆ) ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.14 ขอมลจากฐานขอมลคอมพวเตอรสอดคลองกบเอกสารหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.15 หากผลใดๆ สรางโดยใช external software (เชน spread sheet program) ตองมการ validate external program กอนใช และมเกบเอกสารการ validate และพรอมใชงานหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.16 มขอคดเหนใดๆ สามารถใหเหตผลได มความครบถวน และมการสนบสนนจากขอมลทไดจากการสงเกต ภายในกลมเอกสารชดนนๆ หรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน


19.1.17 มการทบทวนเอกสารอยางถกตองโดยผทบทวนหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.18 มการเตมขอความในชองวางและท าเครองหมายก ากบอยางถกตองครบถวนหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.19 เอกสารแตละหนามตวเลขทตอกนในรปแบบ “m/n” หรอ “m of n” ซง m คอ เทากบจ านวนหนาและ n คอ เทากบจ านวนหนาทงหมด (มความตอเนองไมแยกกน spread sheet ทพมพดวยคอมพวเตอรจะพมพเลขหนาดวยตนเองและทพมพจากเครองมอจะพจารณาเปนหนงหนา ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.20 กลมของจ านวนทมการชบงรวมอยในหนาทตองการทงหมดของเอกสารหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.1.21 แตละหนาของเอกสารทตองการมลายเซนและวนทของนกวเคราะหทรบผดชอบ หรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.2 สารเคมและการเตรยมสารละลาย 19.2.1 ปรมาตรทงหมดของสารละลายถกใชกอนวนหมดอายหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.2.2 มการชบงจ านวนและชนดสารเคมทกกลม ปรมาตรสารละลาย และสารละลายทใชในการทดสอบระหวางการวเคราะหรวมอยใน sheet สรปการวเคราะหหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.2.3 มการชบงจ านวนและชนดสารเคมทกกลม ปรมาตรสารละลาย และสารละลายทใชในการทดสอบในรปแบบทตองการและบนทกลงในสมดบนทกการปฏบตงานหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.2.4 สารเคมทกกลมทใชในการเตรยมสารละลายส าหรบตรวจสอบการวเคราะหถกใช กอนวนหมดอายหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.2.5 มวนทเตรยมสารละลายในสมดบนทกการปฏบตงานส าหรบแตละปรมาตรของสารละลายและการทดสอบสารละลายทสอดคลองกบวนทใชใน sheet สรปการวเคราะหหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน


19.2.6 มการชบงจ านวนและชนดของปรมาตรสารละลายลาสดสอดคลองกบทใชในการทดสอบ อธบายไวในการเตรยมสารละลายในสมดบนทกการปฏบตงานหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.2.7 ตวอยางทงหมด สารสกด สารเคม วสดอางอง และสารมาตรฐานถกเกบไวเพอรกษาลกษณะเฉพาะ ความเขมขน ความบรสทธ และความเสถยรหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.2.8 สารมาตรฐานทใชในการสอบเทยบทงหมดหรอวสดอางองมาตรฐานทใชในการวเคราะหสามารถสอบยอนกลบไปยงวสดอางองรบรอง เชน NIST หรอ USP หรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.3 การควบคมบนทกการปฏบตการ 19.3.1 มการบนทกการเตรยมสารละลายแตละชนดแยกจากกนและมการลงลายมอชอผวเคราะหและวนททเตรยมรวมถงค าอธบายเหลาน 19.3.1.1 ระบลกษณะเฉพาะส าหรบสารละลายทเตรยมแตละชนด 19.3.1.2 ชอ/ความเขมขนของปรมาตรสารละลายทจะเตรยม (เชน 0.15 N HCl ใน methanol) 19.3.1.3 ชอ (และสตรโมเลกลถามากกวา 1 form ทเปนไปได) ของกลมสารเคมทจะใชในการเตรยมสารละลาย 19.3.1.4 น าหนก [(gross, tare, net) หรอ (weight by difference)] หรอปรมาตร แสดงในรปของหนวยทเหมาะสม 19.3.1.5 ล าดบการเจอจาง (ถาจ าเปน) ทใชเพอเตรยมความเขมขนสดทายของสารละลายและปรมาตรสดทาย

19.3.1.6 การระบลกษณะเฉพาะของเครองชง ปเปต หรอ dispenser ทใช 19.3.1.7 วนหมดอายของสารละลายทเตรยม 19.3.1.8 การระบแหลงน า

ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.4 เครองมอและอปกรณ 19.4.1 ม sheet สรปรายการวเคราะหกบเครองมอหลกทใชและมการบงชเฉพาะเครองมอดงกลาว (เชน balance, oven, pipette, dispenser, thermometer, titrator, refrigerator และอนๆ) ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.4.2 รายการอปกรณทตองการ calibrate หรอ maintenance ไดรบการด าเนนการ อยางถกตองในแตละรายการ ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน


19.4.3 มการ calibrate เครองชงรายวนหรอรายสปดาหส าหรบเครองชงทใชงานในเอกสารตรวจสอบการวเคราะหส าหรบวนทวเคราะห เครองชงอยในสภาพปกต ผลการ calibration ทเกยวของทงหมดยงปกตหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.4.4 มการบนทกอณหภมรายวนทอยนอกเหนอเกณฑควบคมส าหรบรายการอปกรณใดๆ ทตองการตรวจสอบรายวนหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.5 Control charts 19.5.1 มขอมลควบคมการท างานส าหรบกลมทอยใน sheet สรปการวเคราะห และขอมลนอยในเกณฑควบคมจากการตรวจสอบ? หากมขอมลควบคมการท างานทผานมาเปนรายป ไดรบการบนทกในสมดบนทกของ control chart ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.5.2 มขอมลของ control chart ถงวนทวเคราะหทไดรบการตรวจสอบ ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.5.3 มสถตของ control chart ทไดรบการค านวณอยางถกตองเหมาะสมหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.6 สขภาพและความปลอดภย 19.6.1 ในระหวางการตรวจตดตาม พบเจาหนาททกคนสวมอปกรณปองกนภยสวนบคคลหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.6.2 มการจดเกบขอมลทพเศษทระบไวในเอกสารการวเคราะหหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.6.3 ตวอยางปจจบนทตองการวเคราะหเหมอนกนจะถกเกบไวอยางถกตองหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.6.4 นกวเคราะหทไดรบมอบหมายไดด าเนนการตรวจสอบการสวม ใสอปกรณปองกนภยทเหมาะสม (ดงน lab coat (เสอคลมปฏบตการ), ถงมอ (gloves), รองเทาทคลมนวเทา (reinforced toe shoes), อปกรณปองกนหนา (face shield), หนากากปองกนฝน (dust mask), หนากากปองกนไอระเหย (vapour mask) ผากนเปอนชนดยาง (rubber apron) เปนตน ตามความจ าเปนหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน


19.6.5 นกวเคราะหทราบต าแหนงทใกลทสดของฝกบวและอางลางตา ถงดบเพลง ผาคลมไฟ (fire blanket) ชด kit spill clean-up fire alarm emergency exit emergency phone emergency shower หรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.7 Miscellaneous 19.7.1 มการเบยงเบนใดๆ จาก protocol ทชดเจนจากเอกสารการตรวจตดตามหรอจากการสมภาษณนกวเคราะหหรอไม จงอธบาย ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน 19.7.2 หากมการเบยงเบนใดๆ จาก protocol ไดรบการอนมตจากผบงคบบญชาและมเอกสารชดเจนหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.7.3 คา Z-value ในตวอยางทตรวจสอบลาสดยงอยในเกณฑควบคมหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน

19.7.4 มแนวโนมของการตรวจสอบตวอยางใน control charts ของปทผานมาหรอไม ไม ใช ไมสามารถใชได ขอคดเหน


ตวอยาง การตรวจสอบเอกสารเบ องตนของระบบคณภาพหองปฏบตการ

ตามขอก าหนด ISO/IEC 17025:2005 1. ดานบรหารจดการ

รายการ ม ขอก าหนด ISO/IEC

17025:2005

อางองคมอ

คณภาพ

อางองเอกสารทเกยวของ

4.1 องคกร 4.1.1 หองปฏบตการหรอองคกรทหองปฏบตการเปน สวนหนงขององคกร ตองเปนนตบคลทมความรบผดชอบตามกฎหมาย

√ √

4.1 4.1.1

4.1 4.1.1

4.1.2 หองปฏบตการมความรบผดชอบในการด าเนนกจกรรมการทดสอบ สอบเทยบ ทเปนไปตามขอก าหนด ISO/IEC 17025 และสอดคลองกบความตองการของผใชผลทดสอบ หนวยงานทมอ านาจในการควบคม หรอองคกร ทใหการยอมรบ

√ 4.1.2 4.1.2

4.1.3 ระบบการบรหารตองครอบคลมงานทด าเนนการภายในหองปฏบตการทมสถานทถาวร

√ 4.1.3 4.1.3

4.1.4 ถาหองปฏบตการเปนสวนหนงขององคกรทด าเนนกจกรรมอน นอกเหนอจากการทดสอบ จะตองระบความรบผดชอบของบคลากรต าแหนง ส าคญในองคกร ทมสวนเกยวของหรออทธพลตอกจกรรมการทดสอบของ หองปฏบตการ เพอชบง การมสวนไดสวนเสยทอาจเปนไปได

√ 4.1.4 4.1.4

4.1.5 หองปฏบตการจะตอง 4.1.5(ก) มบคลากรดานการบรหารและดานวชาการ ทนอกเหนอจากความ รบผดชอบอน มอ านาจหนาทและทรพยากรทจ าเปนตอการด าเนนงานในการ น าระบบการบรหารไปปฏบต คงรกษาไว และปรบปรง และการชบงสงท เบยงเบนไปจากระบบการบรหารหรอจากขนตอนการด าเนนงานทดสอบและ/หรอสอบเทยบ รวมทงการเรมปฏบตการเพอปองกนหรอลดการเบยงเบนนนใหนอยลง

√ √

4.1.5 4.1.5(a)

4.1.5 4.1.5.1

4.1.5(ข) มการจดการเพอใหมนใจวาผบรหารและบคลากร มความเปนอสระจากความกดดนใด ๆ ดานการคา การเงนและอ านาจครอบง าทผดคลองธรรมทงจากภายนอกและภายในซงอาจมผลกระทบตอคณภาพของงาน

√ 4.1.5(b) 4.1.5.2

4.1.5(ง) มนโยบายและขนตอนด าเนนงานหลกเลยงการมสวนรวมในกจกรรมใดๆ ทจะลดความเชอถอความสามารถ ความเปนกลาง การตดสนใจ หรอการด าเนนการดวยความซอตรงตอวชาชพ

√ 4.1.5(d) 4.1.5.4



17025:2005


คณภาพ


4.1.5(จ) ก าหนดโครงสรางองคกรและการบรหารของหองปฏบตการ ต าแหนงของหองปฏบตการในองคกรใหญ และความสมพนธระหวางการบรหารดานคณภาพ การด าเนนการทางวชาการ และการบรการของหนวยสนบสนน

√ 4.1.5(e) 4.1.5.5

4.1.5(ฉ) ระบความรบผดชอบ อ านาจหนาท และความสมพนธระหวางกนของบคลากรทงหมดทท าหนาทบรหาร ปฏบตงาน หรอทวนสอบงาน ทมผลตอคณภาพของการทดสอบและ/หรอการสอบเทยบ

√ 4.1.5(f) 4.1.5.6

4.1.5(ช) จดใหมการควบคมงานทเพยงพอตอเจาหนาทผท าการทดสอบและ สอบเทยบรวมถงผฝกงาน โดยบคลากรทคนเคยกบขนตอนและวธทดสอบ วตถประสงคของแตละการทดสอบและ/หรอการสอบเทยบ รวมทงการ ประเมนผลการทดสอบหรอสอบเทยบ

√ 4.1.5(g) 4.1.5.7

4.1.5(ซ) มผบรหารดานวชาการ ทมหนาทรบผดชอบทงหมดส าหรบการ ด าเนนการดานวชาการ และการจดหาทรพยากรทจ าเปนเพอใหมนใจใน คณภาพทตองการส าหรบการด าเนนการตาง ๆ ของหองปฏบตการ

√ 4.1.5(h) 4.1.5.8

4.1.5(ฌ) แตงตงเจาหนาทคนหนงเปนผจดการดานคณภาพ(อาจเรยกชอเปน อยางอน) ทนอกเหนอจากหนาท และความรบผดชอบอนๆ ใหมอ านาจหนาท และความรบผดชอบ เพอใหมนใจวามการน าระบบการบรหารไปใชและปฏบตตามตลอดเวลา ผจดการดานคณภาพตองสามารถตดตอไดโดยตรงกบผบรหารระดบสงสดทท าหนาทตดสนใจในนโยบายหรอทรพยากรของหองปฏบตการ

√ 4.1.5(i)

4.1.5.9

4.1.5(ญ) แตงตงผปฏบตงานแทนส าหรบบคลากรดาน การบรหารทส าคญ

√ 4.1.5(j)

4.1.5.6.3 4.1.5.6.4 4.1.5.6.8

4.1.5(ฎ) มนใจวาบคลากรตระหนกในประเดนและความส าคญในกจกรรมของตนทจะท าใหสมฤทธผลในวตถประสงคของการบรหาร

√ 4.1.5(k) 4.1.5.11

4.2 ระบบการบรหาร 4.2.1 หองปฏบตการตองจดท าน าไปใช และรกษาไวซงระบบการบรหารท เหมาะสมกบขอบขายกจกรรมของหองปฏบตการ ตองจดท านโยบาย ระบบ โปรแกรม ขนตอนการด าเนนงาน และคมอการปฏบตตางๆตามความจ าเปน เพอความมนใจในคณภาพของผลการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ เอกสารในระบบการบรหารจะตองมไวใหใชงาน บคลากรทเกยวของตองไดรบแจง ท าความเขาใจ และน าไปใชปฏบต

√ 4.2 4.2.1

4.2 4.2.1



17025:2005


คณภาพ


4.2.2 ตองก าหนดนโยบายระบบการบรหารของหองปฏบตการทเกยวของกบ คณภาพ รวมถงถอยแถลงนโยบายคณภาพไวในคมอคณภาพ (หรอทเรยกชอ อยางอน) มการจดท าวตถประสงคโดยรวมและไดรบการทบทวนในการทบทวนการบรหาร ถอยแถลงนโยบายคณภาพตองประกาศใชภายใตอ านาจหนาทของผบรหารสงสดและตองประกอบดวยสงตอไปน

√ 4.2.2 4.2.2

4.2.2(ก) การปฏบตอยางมออาชพทด √ 4.2.2(a) 4.2.2 4.2.2(ข) มาตรฐานการใหบรการ √ 4.2.2(b) 4.2.2 4.2.2(ค) ความมงหมายของระบบการบรหารทเกยวกบคณภาพ √ 4.2.2(c) 4.2.2 4.2.2(ง) ขอก าหนดใหบคลากรทงหมดทเกยวของกบ กจกรรมการทดสอบ และสอบเทยบภายในหองปฏบตการตองท าความคนเคยกบเอกสารคณภาพ น านโยบายและขนตอนการด าเนนงานไปใชปฏบตในงานของตน

√ 4.2.2(d) 4.2.2

4.2.2(จ) ขอผกพนของผบรหารหองปฏบตการทจะปฏบตใหเปนไปตาม ISO/IEC17025 และปรบปรงประสทธผลของระบบการบรหารอยางตอเนอง

√ 4.2.2(e) 4.2.2

4.2.3 ผบรหารสงสดตองมหลกฐานแสดงถงขอผกพนในการทจะพฒนาและน าระบบการบรหารไปใช และปรบปรงประสทธผลอยางตอเนอง

√ 4.2.3 4.2.3

4.2.4 ผบรหารสงสดตองสอสารใหองคกรทราบถงความส าคญของการเปนไปตามความตองการของผใชผลทดสอบ เชนเดยวกบขอก าหนด กฎระเบยบตามกฎหมาย

√ 4.2.4 4.2.4

4.2.5 คมอคณภาพตองรวมหรออางองถงขนตอนการด าเนนงานสนบสนน ตางๆ รวมทงขนตอนการด าเนนงานทางดานวชาการดวย คมอคณภาพจะตอง แสดงโครงสรางของการจดท าเอกสารทใชในระบบ การบรหาร

√ 4.2.5 4.2.5

4.2.6 บทบาทและหนาทความรบผดชอบตางๆ ของผบรหารดานวชาการและ ผจดการดานคณภาพ รวมทงความรบผดชอบเพอใหมนใจในการเปนไปตาม ISO/IEC17025 จะตองระบไวในคมอคณภาพ

√ 4.2.6 4.2.6

4.2.7 ผบรหารสงสดตองมนใจวาเมอมการเปลยนแปลงระบบการบรหารซงไดมการวางแผนและไดน าไปปฏบตแลวระบบการบรหารยงคงไวซงความสมบรณ

√ 4.2.7 4.2.7

4.3 การควบคมเอกสาร 4.3.1 ทวไปหองปฏบตการตองจดท า และรกษาขนตอนการด าเนนงาน ในการ ควบคมเอกสารทงหมดของระบบการบรหาร

√ √

4.3 4.3.1

4.3 4.3.1



17025:2005


คณภาพ


4.3.2 การอนมตและออกเอกสาร 4.3.2.1 เอกสารทงหมดของระบบการบรหารทออกใหแกบคลากรใน หองปฏบตการตองไดรบการทบทวน และอนมตใหใชโดยผมอ านาจกอนน า ออกใชตองจดท าบญชรายชอเอกสาร หรอมขนตอนการด าเนนงานการควบคมเอกสารทเทยบเทา

√ √

4.3.2 4.3.2.1

4.3.2 4.3.2.1

4.3.3 การเปลยนแปลงเอกสาร 4.3.3.1 การเปลยนแปลงเอกสารตองทบทวนและอนมตโดยผมหนาทเดมซง เปนผทบทวนเอกสารครงแรก นอกจากไดมการมอบหมายไวเปนอยางอน โดยเฉพาะ ผทไดรบมอบหมายนนตองสามารถเขาถงเพอศกษาขอมลเดม เพอใชเปนพนฐานในการทบทวนและอนมต

√ √

4.3.3 4.3.3.1

4.3.3 4.3.3.1

4.4 การทบทวนค าขอ ขอเสนอการประมลและขอสญญา 4.4.1 หองปฏบตการตองจดท า และรกษาขนตอน การด าเนนงานในการทบทวนค าขอ ขอเสนอการประมลและขอสญญา นโยบายและขนตอนการด าเนนงานในการทบทวน ตางๆ เหลานน ทน าไปสการท าขอตกลง กนในการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ

√ √

4.4

4.4.1

4.4

4.4.1

4.6 การจดซ อสนคาและบรการ 4.6.1 มนโยบายและขนตอนการด าเนนงานในการคดเลอกและจดซอสนคา และบรการทมผลตอคณภาพของการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ มขนตอน การด าเนนงานในการจดซอ ตรวจรบ และจดเกบสารเคม และวสดสนเปลองทเกยวของในการทดสอบและสอบเทยบ

√ √

4.6 4.6.1

4.6 4.6.1

4.6.2 หองปฏบตการตองมนใจวา สนคา สารเคม และวสดสนเปลองตางๆ ทมผลตอคณภาพของการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ ทไดจดซอมาแลวจะยงไมน าไปใช จนกวาจะไดรบการตรวจสอบหรอทวนสอบวาเปนไปตามเกณฑ มาตรฐานหรอขอก าหนดทเกยวของ สนคาและบรการทใชเหลานตองเปนไป ตามขอก าหนดทระบไว บนทกของการปฏบตเพอตรวจสอบความเปนไปตาม ขอก าหนดตองเกบรกษาไว

√ 4.6.2 4.6.2

4.8 ขอรองเรยน หองปฏบตการตองมนโยบายและขนตอนการด าเนนงาน ในการแกไขปญหา เกยวกบขอรองเรยนทไดรบจากผใชผลทดสอบหรอหนวยงานอนๆ ตองเกบรกษาบนทกตางๆ ทงหมดทเกยวกบขอรองเรยนและการสอบสวน และ การปฏบตการแกไขตาง ๆ ทหองปฏบตการไดด าเนนการ

√ 4.7.2 4.7.2



17025:2005


คณภาพ


4.9 การควบคมงานทดสอบ และ/หรอสอบเทยบท ไมเปนไปตามทก าหนด 4.9.1 หองปฏบตการตองมนโยบายและขนตอนการด าเนนงานทจะน าไปใชเมอพบวามการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ หรอผลของงานทดสอบ/สอบเทยบไมเปนไปตามขนตอนการด าเนนงานของหองปฏบตการ หรอไมเปนไปตามความตองการของผใชผลทดสอบทไดตกลงกนไว

√ 4.8

4.8

4.9.2 หากพบวางานทบกพรองมโอกาสเกดขนซ าไดอก หรอมขอสงสยเกยวกบการด าเนนการใหเปนไปตามนโยบายและขนตอนการด าเนนงานของ หองปฏบตการ จะตองไดรบการปฏบตการแกไขโดยทนท

√ 4.9 4.9.1

4.9

4.10 การปรบปรง หองปฏบตการตองปรบปรงประสทธผลของระบบการบรหารอยางตอเนอง โดยใชนโยบายคณภาพ วตถประสงคดานคณภาพ ผลการตรวจตดตามคณภาพ การวเคราะหขอมล การปฏบตการแกไข การปฏบตการปองกน และการทบทวนการบรหาร

√ 4.9.2

4.9.2

4.11 การปฏบตการแกไข 4.11.1 หองปฏบตการตองจดท านโยบายและขนตอนการด าเนนงาน และมอบหมายผรบผดชอบทเหมาะสมในการปฏบตการแกไขเมอระบพบงานทบกพรอง หรอเบยงเบนไปจากนโยบายและขนตอนด าเนนการในระบบคณภาพ หรอการด าเนนการทางดานวชาการ

√ 4.10 4.10

4.12 การปฏบตการปองกน 4.12.1 ตองมการระบขอปรบปรงทจ าเปน และสงทอาจกอใหเกดสงทไมเปนไปตามทก าหนด ทงดานวชาการหรอทเกยวกบระบบบรหารงาน ถาจ าเปนตองมการปฏบตการปองกนตองมการจดเตรยมแผนปฏบตการ มการปฏบตตามแผนและเฝาระวง เพอลดโอกาสการเกดสงทไมเปนไปตามทก าหนด เชนนนอก และถอโอกาสในการปรบปรงไปดวย

√

4.11

4.11

4.12.2 ขนตอนการด าเนนงานส าหรบการปฏบตการปองกนตองรวมถงการรเรมการปฏบตการปองกน และการใชวธการควบคมตาง ๆ เพอใหมนใจวาการปฏบตการปองกนนนใชไดอยางมประสทธผล

√ √

4.12 4.12.1

4.12 1.12.1

4.13 การควบคมเอกสารบนทก 1.13.1 หองปฏบตการตองจดท า และรกษาขนตอนการด าเนนงานเพอการชบง การรวบรวม การจดท าดชน การเขาถงขอมล การจดเรยง การเกบรกษา การดแลรกษา และการท าลายบนทกคณภาพและ บนทกวชาการตาง ๆ

√ √

4.13

4.13.1.1

4.13

4.13.1.1


2. ดานวชาการ


17025:2005


คณภาพ


5.1 ทวไป 5.2 บคลากร 5.2.1 การบรหารของหองปฏบตการตองมนใจในความสามารถของบคลากรทใชเครองมอเฉพาะทด าเนนการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ ประเมนผลตางๆและลงนามในรายงานผลทดสอบ บคลากรตองมคณสมบตพนฐานทางดานการศกษา การฝกอบรมประสบการณ และ/หรอความช านาญตามทก าหนด

√ √

5.2 5.2.1

5.2 5.2.1

5.2.2 การบรหารหองปฏบตการตองก าหนดเปาหมายทค านงถงการศกษา การฝกอบรมและความช านาญของบคลากรของหองปฏบตการ หองปฏบตการตองมนโยบายและขนตอนด าเนนงานในการระบความตองการการฝกอบรม และจดใหมการฝกอบรมแกบคลากร โปรแกรมการฝกอบรมตองสมพนธกบงานในปจจบนและทคาดวาจะท าตอไปของหองปฏบตการ

√ 5.2.2 5.2.2

5.2.3 หองปฏบตการตองใชบคลากรทจางโดยหองปฏบตการ หรอภายใตสญญาจางกบหองปฏบตการ

√ 5.2.3 5.2.3

5.2.4 หองปฏบตการตองมค าบรรยายลกษณะงานทเปนปจจบน ส าหรบบคคลากรทส าคญดานการบรหาร ดานวชาการ และผท าหนาทสนบสนนทเกยวของกบงานทดสอบ และ/หรอการสอบเทยบ

√

5.2.4

5.2.4


17025:2005


คณภาพ


4.14 การตรวจตดตามคณภาพภายใน มขนตอนการด าเนนงานในการตรวจตดตามคณภาพภายในหองปฏบตการตองท าการตรวจตดตามคณภาพภายในกจกรรมของตนเปนระยะๆ ตามก าหนดการทก าหนดลวงหนา และตามขนตอนการด าเนนงาน

√ 4.14 4.14

4.15 การทบทวนการบรหาร 4.15.1 ผบรหารของหองปฏบตการ ตองมการทบทวนระบบคณภาพ และกจกรรมการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ ของหองปฏบตการเปน ระยะๆ และตามก าหนดการทก าหนดไวลวงหนา และตามขนตอนการด าเนนงาน

√ 4.15 4.15



17025:2005


คณภาพ


5.4 วธทดสอบสอบเทยบ และการตรวจสอบความใชไดของวธ 5.4.7 หองปฏบตการมการควบคมขอมลโดยมการตรวจสอบการค านวณ และการถายโอนขอมลอยางเหมาะสมในลกษณะทเปนระบบ หองปฏบตการตองมนใจวาซอฟทแวรคอมพวเตอรทพฒนาโดยผใช ตองจดท าเปนเอกสารทมรายละเอยดเพยงพอและไดรบการตรวจสอบความใชได มการจดท าขนตอนด าเนนงาน และน าไปปฏบตเพอปกปองขอมล

√ √

5.4.7.1

5.4.7.2

5.4.7.1

5.4.7.2

5.5 เครองมอ 5.5.2 เครองมอ และซอฟทแวรของเครองมอทใชส าหรบการทดสอบสอบเทยบ และการชกตวอยางตองสามารถใหผลทมคาความแมนตามทตองการและตองเปนไปตามเกณฑก าหนดทเกยวของในการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ และมการจดท าโปรแกรมสอบเทยบ

√ 5.5.2 5.5.2

5.5.3 เครองมอตองถกใชงานโดยบคลากรทไดรบมอบหมาย √ 5.5.3 5.5.3 5.5.4 เครองมอแตละเครองตองไดรบการชบงเฉพาะถาท าได √ 5.5.4 5.5.4 5.5.5 มการเกบรกษาบนทกเกยวกบเครองมอแตละเครองและซอฟทแวรของเครองมอทมความส าคญตอการด าเนนการทดสอบและ/หรอสอบเทยบ

√ 5.5.5 5.5.5

5.5.6 หองปฏบตการตองมขนตอนการด าเนนงานในการจดการ กาเคลอนยาย การเกบรกษา การใชและการบ ารงรกษาตามแผนงานของเครองมอวด

√ 5.5.6 5.5.6

5.6 ความสอบกลบไดของการวด 5.6.1 เครองมอทใชในการทดสอบ และ/หรอสอบเทยบ รวมถงอปกรณทใชสนบสนนการวดทมผลกระทบอยางส าคญตอคาความแมนหรอความใชไดของผลการทดสอบ สอบเทยบ หรอการชกตวอยาง ตองไดรบการสอบเทยบกอนน าไปใชงาน หองปฏบตการตองมการจดท าโปรแกรมและขนตอนการด ด าเนนงานในการสอบเทยบเครองมอตางๆ ของหองปฏบตการ

√ √

5.6 5.6.1

5.6 5.6.1

5.6.2 หองปฏบตการตองมโปรแกรมและขนตอนการด าเนนงาน ส าหรบการสอบเทยบมาตรฐานอางองของตน

√ 5.6.3.1 5.6.3.1

5.7 การชกตวอยาง 5.7.1 กรณทมการชกตวอยาง หองปฏบตการตองมแผนการและขนตอน การด าเนนงานในการชกตวอยาง

√ √

5.7 5.7.1

5.7 5.7

5.8 การจดการตวอยางทดสอบ 5.8.1 หองปฏบตการตองมขนตอนการด าเนนงานในการขนสง การรบ การจดการ การปองกน การเกบรกษา และ/หรอ การท าลายตวอยางทดสอบ

√ √

5.8 5.8.1

5.8 5.8.1

5.8.2 หองปฏบตการตองมระบบ ในการชบงตวอยางทดสอบเพอใหมนใจวา จะไมเกดความสบสนทางกายภาพของตวอยาง

√ 5.8.2 5.8.2



17025:2005


คณภาพ


5.8.3 หองปฏบตการตองมขนตอนด าเนนงาน และสงอ านวยความ สะดวกท เหมาะสมในการปองกนการเสอมสภาพ การสญหาย หรอการเสยหาย ทจะเกดแกตวอยางทดสอบ ระหวางการเกบรกษา การจดการและการเตรยมตวอยาง

√ 5.8.4 5.8.4

5.9 การประกนคณภาพผลการทดสอบและสอบเทยบ 5.9.2 ตองมการวเคราะหขอมลการควบคมคณภาพ และเมอพบการออกนอก เกณฑทก าหนด ตองมแผนการปฏบตเพอแกไขปญหาและปองกนการรายงานผลทไมถกตอง

√ 5.9.2 5.9.2

5.10 การรายงานผล 5.10.1 ผลการทดสอบทด าเนนการโดยหองปฏบตการ ตองมการ รายงานอยางถกตอง ชดเจน ไมคลมเครอ และตรงตามวตถประสงค และเปนไปตามค าแนะน าทระบในวธการทดสอบ

√ √

5.10 5.10.1

5.10 5.10.1

5.10.2 ในกรณทมการแสดงขอคดเหนและการแปลผลดวย หองปฏบตการจะตองจดท าเอกสารทใชเปนพนฐานในการแสดงเปนขอคดเหนและ การแปลผล

√ 5.10.5 5.10.5

5.10.3 ในกรณทรายงานผลการทดสอบรวมผลของการทดสอบท ด าเนนการโดยผรบเหมาชวงไวดวย ตองมการระบอยางชดเจน

√

5.10.6 5.10

5.10.4 การแกไขขอความในรายงานผลการทดสอบหรอใบรบรอง การสอบเทยบทไดออกไปแลว ตองท าโดยการออกเอกสารเพมเตมเทานน หรอโดยการถายโอนขอมล ในกรณทจ าเปนตองออกรายงานผลการทดสอบหรอใบรบรองการสอบเทยบฉบบทสมบรณใหม กรณนจะตองชบงเฉพาะและตองมการอางองถงเอกสารตนฉบบเดมทออกแทนดวย

√ 5.10.9 5.10.9

หมายเหต: ขอ 4.5 การจางเหมางานทดสอบ และขอ 4.7 การสมตวอยาง เปนขอก าหนดทไมไดจดท าในเอกสารฉบบน เนองจากขอก าหนดดงกลาวไมไดด าเนนการในหองปฏบตการ


ตวอยาง แผนผงข นตอนการวเคราะหตวอยางทางหองปฏบตการ

รปท 1.4 แผนผงข นตอนการวเคราะหตวอยางทางหองปฏบตการ

[ใช] ตดฉลากถกตอง? (ไม)

ตวอยางเขาและลงบนทก

มอบหมายใหนกวเคราะห

ท างานในรปแบบขนานกบตวอยางอน

ท าตวมาตรฐานและตวควบคมพรอมกบตวอยาง

[ใช] ตวมาตรฐานและตวควบคม O.K.? (ไม)

การทบทวนและตรวจสอบขอมล

[ใช] O.K.? (ไม)

ผลทยอมรบและออกรายงาน

รองขอสงตวอยางใหม

แกไขปญหา

แกไขปญหา


ตวอยาง แผนผงการก ากบดแลของผควบคม (Supervisory)

รปท 1.5 แผนผงการก ากบดแลของผควบคม (Supervisory)

การทบทวนภาระงานประจ าวน

ประสานงานลกคาเพอรบภาระงานประจ าวน

มอบหมายการท างาน

ตรวจสอบการ calibration ของเครองมอ

ตรวจสอบกจกรรมของทกหองปฏบตการ

ปญหาการพฒนา

การทบทวน การตรวจตดตาม และจดท าขอมล

ไม

กลบไปทชองทางการท างานอกครง แจงใหลกคาทราบ

ใช

กจกรรมรอบนอก (Peripheral activities)

ระเบยบการฝกอบรมประจ าสปดาห

On-the-Job training โดยการท างานรวมกนอยางตอเนองกบนกวเคราะห


ตวอยาง แผนผงการประกนคณภาพ

รปท 1.6 แผนผงการประกนคณภาพ

มการจดท า SOPs ส าหรบทกขนตอน

เครองมอทกชนดทส าคญไดรบการ calibrated และ checked

มวธวเคราะหทเปนปจจบนทไดรบการ validated

จ าเปนทจะตองมการจดฝกอบรม

เอกสารทกชนดมความสอดคลองกน

มมาตรฐานทเปนปจจบนทเหมาะสม

มตวอยางควบคมทเหมาะสม

มน ายาและสารละลายในการปฏบตทเหมาะสม

มตารางการควบคมในสถานทท างาน

มการเกบรกษาตวอยาง

มการตรวจสอบและทบทวนเพยงพอ

ด าเนนการกบการท างานวเคราะห แกไขขอบกพรอง

[ใช กบค าถามท งหมด]

[ไม กบบางขอ]


บทท 2 การตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ดานสารพษ สารตกคาง และสารปนเปอน

สารพษ สารตกคาง และสารปนเปอนในอาหารสตว เปนปญหาส าคญทางดานความปลอดภยทงตอปศสตว และผบรโภคเนอปศสตวเปนอาหาร ผบรโภคสวนใหญใหความสนใจและเปนกงวลวาสารพษ สารตกคาง และสารปนเปอนในหวงโซอาหารจะน าพษภยมาสผบรโภค เมอผบรโภคเนอปศสตวผลผลตจากสตวและเครองใน จะเกดการสะสมและตกคางอยภายในรางกายในระยะเวลายาวนาน อาหารสตวเปนสงจ าเปนส าหรบชวตและสขภาพสตว ชวยใหรางกายของสตวเจรญเตบโตใหผลผลตเนอ นม ไขทมคณภาพ อาหารสตวประกอบดวย พช ผลผลตจากการเกษตร ซงมทงสวนทเปนพชและสตว ดงนน จงอาจมสารทไมพงประสงค (Undesirable Substances) ปนเปอนในวตถดบอาหารสตว วตถทเตมในอาหารสตว สารผสมลวงหนาและอาหารเสรมชนดตางๆ สารเหลานมความจ าเปนตองตรวจวเคราะหชนดและปรมาณเพอควบคมคณภาพใหอยในระดบทไมเปนอนตราย หากไมมการเฝาระวงกจะสะสมในรางกายสตวและปนเปอนในเนอ นม ไข ตลอดจนผลตภณฑสตวตางๆ เปนสาเหตใหเกดโรคแกผบรโภคได สารตางๆ เหลาน ไดแก 1. เชอทกอใหเกดโรค (Pathogenic agents) เชน 1.1 เชอกอโรค Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) หรอเชอโรคววบา (Mad cow disease) เปนสาเหตท าใหเกดโรคววบา พบไดในโค แพะ แกะทกนอาหารทมเนอและกระดกปนโคทปวย ขณะนยงไมมยารกษาในสตว และมขอมลในป ค.ศ. 1990 เคยเกดการระบาดของโรคววบาในประเทศองกฤษ มรายงานพบวา มการน าเนอและกระดกปนของแพะ และ แกะทเปนโรคสเครพป (Scrapie) ไปผสมในอาหารสตว ซงโรคสเครพปเปนโรคทมผลตอระบบประสาทแบบเดยวกบโรคทท าใหเกดผลตอระบบประสาทสวนกลาง ท าใหเซลลสมองถกท าลายและมลกษณะพรนคลายฟองน า (Sponge) โรคนเปนโรคตดตอทเกดขนในสตวประเภทวว (Bovine) เปนอนตรายถงชวต สมมตฐานของการเกดโรคนคอ สมองถกท าลายดวยสารโปรตนทไมปกตทเรยกวาพรออน (Prion) โดยววทปวยเปนโรคนจะแสดงอาการทางระบบประสาท 1.2 เชอซลโมเนลลา (Salmonella spp.) เปนเชอแบคทเรยทพบวามมากกวา 2,500 สายพนธ บางชนดท าใหเกดโรคตดเชอในกระแสเลอด ไขสมองอกเสบ โรคอาหารเปนพษ โรคทองรวงรนแรงและยงท าใหผปวยทรางกายออนแอเกดภาวะแทรกซอนจากเชอโรคอนได เชอซลโมเนลลามกปนเปอนมาในวตถดบอาหารสตวหรอการเกบรกษาอาหารสตว นอกจากนสตวพาหะ เชน นก หน แมลงสาบ และแมลงวนยงเปนสาเหตทท าใหเชอดงกลาวแพรกระจายเขาสอาหารสตวผสมส าเรจรปทขาดกระบวนการผลตทดและการจดเกบทไมถกสขลกษณะ 2. สารก าจดศตรพช(Pesticides) ไดแก สารประกอบกลมออกาโนคลอรน(Organochlorine) ซงมกปนเปอนมาจากการใชสารนพนลงในระบบการผลตทางเกษตรกรรม หรอการจดเกบผลผลตทางการเกษตรระหวางการปลกหรอหลงการเกบเกยว สารพวกนเปนสารพษและคงตวอยไดนานในสงแวดลอม 3. สารพษจากเชอรา (Mycotoxins) พบไดในวตถดบอาหารสตว และอนๆ ทมความชนสงมกพบในพนททมการจดเกบไมถกตองไดแก อะฟลาทอกซน (Aflatoxin) ทสรางโดยเชอรา Aspergillus flavus, A. parasiticus, A. tamarii และ A. nomius พบมากในเมลดธญพช และพชน ามนชนดตางๆ เชน ขาวโพด ขาวสาล ถวลสง เปนตน สารอะฟลาทอกซนทพบตามธรรมชาตม 4 ชนดคอ Aflatoxin B1,


B2, G1 และ G2 โดย Aflatoxin B1 จะมความเปนพษสงสด รองลงมาไดแก AFB2, AFG1 และ AFG2 ตามล าดบ นอกจากนยงม Aflatoxin M1 และ M2 ซงเปนอนพนธของ B1 และ B2 ปนเปอนอยในน านมดวย ความเปนพษของอะฟลาทอกซนม ความรนแรง เนองจากเปนสารกอมะเรง (Carcinogen) และเปนสารกอกลายพนธ (Mutagen) ในปจจบน IARC (International Association Research Cancer) ไดจดสารอะฟลาทอกซนเปนสารกอมะเรง นอกจากน ออคราทอกซน (Ochratoxins) เปนสารพวก cyclic pentaketids, dihydroisocoumarin derivatives เชอมตอกบ L-phenylalanine สรางจากเชอรา Aspergillus spp. และ Penicillium spp. มพษตอไตและตบทงในคนและสตว ยงเปนสารกอมะเรงในระบบทางเดนปสสาวะดวย ยงพบอกวา ซราลโนน (Zearalenone) เปนสารพษทสรางจากเชอรา Fusarium graminearum พบปนเปอนอยในขาวโพด ขาวสาล ขาวฟาง และอาหารสตว มผลตอฮอรโมนเพศหญง ท าใหเกดอาการแทงลกไดในสตว ในมนษยมรายงานวาสารพษนมผลตอเดกผหญงเชนกน และฟโมนซน (Fumonisins) เปนสารพษทเกดจากเชอรา Fusarium moniliforme และ F. proliferatum พบในขาวโพด ขาวและขาวฟาง เปนสารกอมะเรงเชนกน นอกจากนนยงพบวา สารพษ Fumonisins ท าใหเกด apoptosis และเกดอาการเซลลตายได และไตรโคทซน (Trichothecenes) เปนสารพษจ าพวก sesquiterpenoid ทเกดจากเชอราหลายชนดในกลม Fusarium Trichothecium Gliocladium Myrothecium Stachybotrys และ Trichoderma สารพษในกลมนไดแก Deoxynivalinol Nevalenol diacetoxyscirpenol อยางไรกตาม ยงพบวา ท-ททอกซน (T-2 Toxin) สวนมากจะพบในขาวโพด ขาวบารเลย ขาวไรท และขาวสาล ซงเชอราทเปนตวการส าคญในการสรางสารพษกลมนไดแก Fusarium acuminatum F. culmorum F. graminearum F. poae F. solani และ F. sporotrichioides และพบวา เมลดธญพช ถวและวตถดบทน ามาผลตเปนอาหารของมนษยและสตว ซงจะพบอาการคลนไส ไมอยากรบประทานอาหาร เมดโลหตผดปกต และลดการสรางภมคมกนของรางกาย เปนตน 4. สารเภสชเคมภณฑในอาหารสตว (Chemical agents or Drugs in Feed) โดยปกตการใชสารเภสชเคมภณฑในอาหารสตวจะตองมการควบคมอยางมประสทธภาพถงขนาดการใช ระยะหยดใช ปฏกรยาของสารกบสวนประกอบอนๆ ในอาหารสตว หากมการใชสารเภสชเคมภณฑในอาหารสตวทไมถกตองจะท าใหเกดอนตรายตอสขภาพสตว ซงปรมาณทใชผสมในอาหารสตวใหเปนไปตามประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ 5. สารตองหามทประเทศไทยประกาศหามใชผสมในอาหารสตว ไดแก สารเรงเนอแดงหรอสารกลมเบตาอะโกนสต (Beta agonists) เนองจากท าใหเนอสกรมสแดงสด พนทหนาตดของกลามเนอเพมขน และท าใหไขมนบรเวณสนหลงบางลง เปนสารตกคางทเปนอนตรายตอผบรโภค ท าใหเกดอาการสนของกลามเนอลายทวรางกาย ปวดศรษะ กลามเนอเกรงเปนตะครว การเตนของหวใจผดปกตจนอาจถงหวใจวายได

6. โลหะหนก (Heavy Metals) มกพบในธรรมชาตโดยจะเจอปนอยในดน หน แมกระทงในหวงโซอาหารของสงมชวตบางชนด ไดแก ปลาทะเล เมอผานกระบวนการผลตเปนปลาปนกจะมการสะสมของโลหะหนก โดยสารประกอบโลหะหนกน เมอน ามาผสมอาหารสตว วตถทเตมในอาหารสตว สารผสมลวงหนา และอาหารเสรมแรธาต ยกตวอยางการสะสมของแคดเมยมจะท าใหเกดผลตอรางกาย เชน ความดนเลอดสงขน (high blood pressure) เหลกในเลอดต า (iron-poor blood) โรคตบ (liver disease) และประสาทและสมองถกท าลาย (nerve/brain damage) เปนตน ในขณะทในมนษยจะพบอาการปวดหว อาเจยน เปนตะครว ท าใหกลามเนอหดตว ไตขบโปรตนมากบปสสาวะ (Protein uria) ถง


ลมโปงพอง การรบรกลนแยลงและน าลายไหล นอกจากนยงพบวาพษของตะกว (Pb) จะท าใหสญเสยการรบรรสชาต เปนโรคโลหตจาง ผวซด ปวดหว ปวดตามขอและกลามเนอ มอสน แขนขาออนแรง ความดนโลหตสง ไตอกเสบ ยงพบอกวาพษของปรอท (Hg) เมอเขาสรางกายจะท าใหสตวมอาการน าลายไหล หายใจไมออก ไอ กระเพาะอาหารและล าไสอกเสบ พบอาการนวโมเนย ผวหนงเกดตมและเปนแผล สตวจะออนเพลย เบออาหาร ผอมแหง ไตอกเสบ ฯลฯ ในขณะทอาการพษของสารหนสวนใหญจะเปนชนดรนแรงตอผวหนง ท าใหผวหนงเกดการเปลยนส เสนประสาทเกดการอกเสบสมองสวนกลางและระบบรบรความรสกผดปกต เบออาหาร และตบอกเสบ เปนตน 7. ฮอรโมน (Hormones) ปจจบนกฎหมายทเกยวของกบอาหารสตวระบวา ผประกอบการผลตอาหารสตวหามใชฮอรโมนผสมในอาหารสตวเพอเรงการเจรญเตบโต 8. สารมลพษในสงแวดลอมปนเปอนในอาหารสตว (Persistent Organic pollutants) สวนใหญ จะเปนสารพษทเปนของเสยทเกดจากกระบวนการผลตในอตสาหกรรม บางชนดเกดในระหวางกระบวนการเผาไหม (Combustion) เปนสารประกอบทจบกบตะกอนในน าและสารอนทรยในสงแวดลอม สามารถสะสมในเนอเยอไขมนของสงมชวตทสมผสหรอบรโภค ไดแก สารไดออกซน (Dioxins และ Polychlorinated Biphenyls (PCBs) เปนตน ซงอาจปนเปอนมาในอาหารสตวจากสวนประกอบตางๆได ตวอยางกรณเกด Dioxins ปนเปอนในอาหารสตวจากการใชรถขนสงอาหารสตวทมน ามนเครองปนเปอนของประเทศเบลเยยมในป พ.ศ. 2542 สงผลใหเกดความเสยหายทางเศรษฐกจของประเทศอยางรนแรง เนองจากสารนไดปนเปอนในเนอไกและไขทผลตจากฟารมทไดรบอาหารสตวนไปจ านวน 1,934 ฟารม จงท าใหคณะกรรมาธการยโรปสงใหทางการเบลเยยมตรวจ Dioxins อยางเขมงวด การตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ดานสารพษ สารตกคาง สารปนเปอน ของประเทศไทย การตรวจสอบคณภาพอาหารสตวของกลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว แบงออกเปน 4 ดาน ไดแก 1. ดานกายภาพ : รายการตรวจวเคราะหดานกายภาพ ประกอบดวย 1.1 Screening Test 1.1.1 ชนดยาในอาหารสตว ไดแก Chlortetracycline (CTC) Oxytetracycline (OTC) Nitrofurazone (NFZ) Nitrofurantoin (NFT) Furazolidone (FZD) Furaltadone (FZD) Nitrovin (NIV) Zoalene (ZOA) Roxarzone (ROX) และ Carbadox (CBX) 1.1.2 วตามน ไดแก วตามน A B2 B6 และ C 1.1.3 แรธาต ไดแก เหลก (Fe) โคบอลต (Co) และ ทองแดง (Cu) 1.2 สวนประกอบ 1.3 การปลอมปน 2. ดานเคม : รายการวเคราะหดานเคม ประกอบดวย 2.1 คณคาทางโภชนาการไดแก โปรตน ไขมน กาก ความชน เถา เกลอ ทราย Pepsin Digestibility 2.2 แรธาต ไดแก แคลเซยม (Ca) ฟอสฟอรส (P) เหลก (Fe) สงกะส (Zn) คอปเปอร (Cu) แมกนเซยม (Mg) แมงกานส (Mn) โพแทสเซยม (K) โซเดยม (Na) และ ไอโอดน (I) 2.3 โลหะหนก ไดแก แคดเมยม (Cd) ตะกว (Pb) ปรอท (Hg) และสารหน (AS)


2.4 รายการอนๆ ไดแก วตามน B2 Urea Pepsin digestibility และ Urease activity 3. ดานจลชววทยา : รายการตรวจวเคราะหดานจลชววทยา ประกอบดวย 3.1 แบคทเรยกอโรค ไดแก Salmonella spp. Campylobacter spp. Listeria monocytogenes Stapylococcus aureus Escherichia coli Coliform และ Enterobacteriaceae 3.2 การนบปรมาณจลนทรย ไดแก Total plate count และ Total mold count

3.3 สารเสรมชวนะ (Probiotics) ไดแก Bacillus spp. Lactobacillus spp. และ Saccharomyces spp. 3.4 สารตานยบยงจลนทรย (Antibiotic Inhibitory microbiological assay) 3.5 DNA ชนดเนอสตวและ Genetic Modified Organisms (GMOs) 4. ดานพษวทยาและชวเคม : รายการตรวจวเคราะหดานพษวทยาและชวเคม ประกอบดวย 4.1 Beta agonists 4.2 Sulfonamides, Chloramphenicol, Carbadox, Fluoroquinolones, Nitroimidazoles, Nitrofurans, Tetracycline, Olaquindox, Macrolide ฯลฯ 4.3 Pesticides และ Organochlorine pesticides(OCPs) 4.4 Diethylstilbestrol 4.5 Melamine และ analogues 4.6 Dioxins และ Polychlorinated Biphenyls (PCBs)

4.7 สารพษจากเชอรา ไดแก Aflatoxins (Total) Aflatoxin (B1,B2,G1,G2) Ochratoxin Zearalenone Fumonisin T-2 toxin และ Deoxynivalenol (DON) การตรวจสอบคณภาพอาหารสตวเพอความปลอดภยนน มการวเคราะหหลายรายการทพฒนาขนจ านวนทงสน 58 รายการ เนองจากจ าเปนตองมหองปฏบตการทปฏบตงานมากกวา 1 หองปฏบตการ จงจะท าเปรยบเทยบผลทดสอบกนได เพอขอรบรองความสามารถหองปฏบตการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005 หากไมมตองท าการทดสอบโดยเทยบกบวธทดสอบอนหรอใชวธทดสอบเดมแตเปลยนยหอสารมาตรฐาน หรอหากไมมสารมาตรฐานหลายยหอกใหทดลองเปรยบเทยบกบรนการผลตใหม จากการตรวจสอบคณภาพอาหารสตวดานสารพษ สารตกคาง สารปนเปอน โดยกลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว กรมปศสตว ขอมลป 2553 -2556 พบตวอยางไมผานเกณฑมาตรฐานตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 และมาตรฐานของสหภาพยโรป (European Union EU) ดงน 1. มาตรฐานตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525

1.1 ดานกายภาพ 1.1.1 การปลอมปน พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 4.18 ในป

2556 รองลงมาคอรอยละ 0.93 0.71 และ 0.35 ในป 2553 2555 และ 2554 ตามล าดบ พบมาก คอ มการปลอมปนตวอยางวตถดบขนสตวปกปน


1.2 ดานเคม 1.2.1 ไขมน พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 2.72 ในป 2555

รองลงมาคอรอยละ 1.60 1.23 และ 0.98 ในป 2553 2554 และ 2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางวตถดบไดแก ขนสตวปกปน

1.2.2 โปรตน พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 0.70 ในป 2556 รองลงมาคอรอยละ 0.65 0.46 และ 0.38 ในป 2555 2554 และ 2553 ตามล าดบ พบมากในตวอยางวตถดบขาวโพดปน

1.2.3 ความชน พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 1.36 ในป 2554 รองลงมาคอรอยละ 1.33 0.77 และ 0.70 ในป 2555 2556 และ 2553 ตามล าดบ พบมากในตวอยางวตถดบปลาปน

1.2.4 เถา พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 6.00 ในป 2556 รองลงมาคอรอยละ 3.12 2.44 และ1.29 ป 2554 2555 และ 2553 ตามล าดบ พบมากในตวอยางวตถดบปลาปน

1.2.5 กาก พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 0.98 ในป 2555 รองลงมาคอรอยละ 0.15 0.13 และ 0.05 ในป 2554 2556 และ 2553 ตามล าดบ พบมากในตวอยางวตถดบกากถวเหลอง 1.3 ดานจลชววทยา

1.3.1 Salmonella spp. พบมากทสดรอยละ 2.34 ในป 2554 พบรองลงมาคอรอยละ 2.14 1.90 และ 1.81 ในป 2556 2555 และ 2553 ตามล าดบ พบมากในตวอยางวตถดบไดแก ปลาปน ขนสตวปกปน และกากถวเหลอง

1.3.2 ปรมาณแบคทเรย พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 2.98 ในป 2555 รองลงมาคอรอยละ 0.80 0.65 และ 0.25 ในป 2554 2556 และ 2553 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปชนดเมดและผงส าหรบโค

1.3.3 ปรมาณเชอรา พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 2.04 ในป 2555 รองลงมาคอรอยละ 0.89 0.31 และ 0.17 ในป 2554 2553 และ 2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปชนดเมดและผงส าหรบสกร

1.4 ดานพษวทยาและชวเคม 1.4.1 Carbadox พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 1.80 ในป 2555

รองลงมาคอรอยละ 1.26 0.69 และ 0.63 ในป 2553 2554 และ 2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปชนดผงส าหรบสกร

1.4.2 Chloramphenicol พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 0.15 ในป 2553 พบมากในตวอยางอาหารส าเรจรปชนดผงส าหรบสกร

1.4.3 Olaquindox พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 6.58 ในป 2555 รองลงมาคอรอยละ 0.22 ในป 2553 พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปชนดผงส าหรบสกร

1.4.4 Furazolidone พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 3.89 ในป 2555 รองลงมาคอรอยละ 1.72 1.06 และ 0.20 ในป 2553 2554 และ 2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารส าเรจรปชนดผงส าหรบสกร


1.4.5 Dimetridazole พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 2.72 ในป 2553 รองลงมาคอรอยละ 2.54 2.34 และ 0.45 ในป 2554 2555 และ 2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารส าเรจรปชนดผงส าหรบสกร

1.4.6 Ractopamine พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 1.56 ในป 2553 รองลงมาคอรอยละ 1.48 0.19 และ 0.12 ในป 2554 2556 และ 2555 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารส าเรจรปชนดผงส าหรบสกร

1.4.7 Salbutamol พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 12.38 ในป 2556 รองลงมาคอรอยละ 3.40 2.84 และ 1.66 ในป 2553 2554 และ 2555 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารส าเรจรปชนดผงส าหรบสกร

1.4.8 Aflatoxin (total) พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 2.30 ในป 2553 พบมากในตวอยางวตถดบ ขาวโพดปน 2. มาตรฐานของสหภาพยโรป (European Union = EU) 2.1 ดานเคม

2.1.1 Arsenic พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 5.46 ในป 2553 รองลงมาคอรอยละ 1.59 ในป 2556 พบมากในตวอยางอาหารเสรม

2.1.2 Cadmium พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 7.97 ในป 2555 รองลงมาคอรอยละ 7.17 4.53 และ 1.66 ในป 2554 2553 และ2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปส าหรบสกร

2.1.3 Lead พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 5.07 ในป 2554 รองลงมาคอ รอยละ 2.04 1.86 และ 1.16 ในป 2555 2553 และ2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปส าหรบสกร

2.2 ดานพษวทยาและชวเคม 2.2.1 Aflatoxin B1 พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 17.88

ในป 2553 รองลงมาคอรอยละ 12.09 5.34 และ 3.16 ในป 2555 2556 และ 2554 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปชนดเมดและผงส าหรบโค และในวตถดบขาวโพดปน

2.2.2 Aflatoxin M1 พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 20.14 ในป 2555 พบมากในน านมโครายฟารม

2.2.3 Zearalenone พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 3.00 ในป 2554 รองลงมาคอรอยละ 2.70 1.65 และ 0.39 ในป 2553 2555 และ2556 ตามล าดบ พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปชนดเมดส าหรบสกร

2.2.4 Deoxynivalinol พบไมผานเกณฑมาตรฐานมากทสดรอยละ 0.22 ในป 2553 รองลงมาคอรอยละ 0.16 ในป 2554 พบมากในตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรปชนดเมดส าหรบสกร


บทท 3 วธทดสอบ

วธทดสอบ เหลาน เป นตวอยางทน ามาเป นแนวทา งในการเขยนเอกสารเพอยน ขอรบรองความสามารถหองปฏบตการตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005 ขอใหผศกษารวบรวมและน าสงท ดทสดไปปรบใชเพอเขยนเปนแนวทางของหองปฏบตการตนเอง 3.1 วธทดสอบทางพษวทยาและชวเคม 3.1.1 วธทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass spectrometry 1. วตถประสงค เพอเปนวธปฏบตการทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry 2. ขอบขาย

เปนวธการทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวผสมส าเรจรปส าหรบสกร ดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry เปนวธ In house method – base on ตามวธทดสอบเรอง Determination of Ractopamine in animal tissues by Liquid Chromatography – fluorescence and Liquid Chromatography/tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 483(2003) หนา 137-145 วธทดสอบน ม working range ของสาร Salbutamol Clenbuterol และ Ractopamine ระหวาง 0.05 - 1 mg/kg และมคา Limit of Detection (LOD) และ Limit of Quantification (LOQ) ของวธทดสอบดงตารางท 3.1 ตารางท 3.1 คา LOD และ LOQ ของวธทดสอบ

Analyze LOD (mg/kg) LOQ (mg/kg)

Salbutamol 0.02 0.05 Clenbuterol 0.02 0.05 Ractopamine 0.02 0.05

3. เอกสารทเกยวของ

3.1 วธใชเครอง LC-MS/MS ยหอ Shimadzu รน LCMS-8030 3.2 วธใชเครองชง 5 ต าแหนง ยหอ Sartorius รน ME 215P) และ ยหอ Mettler Toledo รน XP 205 DR

3.3 วธใชเครองชง 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน MS1003S 3.4 วธใชเครองเขยาแนวราบ ยหอ Gerhardt 3.5 วธใชเครองเขยาแนวราบ ยหอ Edmund Buhler 3.6 วธใชเครอง Ultrasonic bath ยหอ BRANSON รน B-8200E3

3.7 วธใชเครองปนเหวยงตกตะกอน ยหอ KUBOTA รน 5500 3.8 วธใชเครองปนเหวยงตกตะกอน ยหอ Eppendorf รน 5810 R 3.9 วธใชเครอง Manifold 3.10 วธใชเครองระเหยแหง


3.11 วธใชเครอง Vortex mixer 3.12 วธใช Micropipette 3.13 วธใชตเยน ยหอ Sanyo รน MIR-553 3.14 วธใชเครอง Dispenser 3.15 วธปฎบตงานการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวดวยวธ LC- MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry ยหอ Shimadzu 3.16 วธปฏบตงานการจดการตวอยางอาหารสตว 3.17 วธการปฏบตงานการจดท าแผนภมควบคมในการควบคมคณภาพภายในผลทดสอบงานพษวทยาและชวเคม 3.18 วธปฏบตงานการประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry 3.19 วธการปฏบตงานการการจดการสารเคมและสารมาตรฐานงานพษวทยาและชวเคม( สารตกคาง) 4. นยาม 4.1 Calibration Matrix หมายถง สารละลายส าหรบเตรยม Standard calibration curve เตรยมไดจากการเตมสารมาตรฐาน Beta agonists ทระดบความเขมขนตางๆลงใน Sample blank แลวด าเนนการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยาง 4.2 Sample blank หมายถง ตวอยางทไดผานการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอน แลวไมพบสาร Beta agonists 4.3 Reagent blank หมายถง reagent ทใชในระหวางการทดสอบซงไมมสาร Beta agonists แลวน ามาทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอน 4.4 Fortified sample หมายถง Sample blank ทมการเตมสาร Beta agonists ในระดบความ เขมขนททราบแนนอน 4.5 Positive control หมายถง Fortified sample ทใชในการควบคมคณภาพผลทดสอบ ท าการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอนพรอมกบการทดสอบตวอยางใน batch เดยวกน เพอควบคมความแมน (accuracy) ของการทดสอบในแตละ batch 4.6 Negative control หมายถง Reagent blank และ Sample blank ทใชในการควบคมคณภาพผลทดสอบ ท าการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอนพรอมกบการทดสอบตวอยางใน batch เดยวกน เพอควบคมการปนเปอนขามขณะทดสอบหรอความผดพลาดอนๆ ของการทดสอบในแตละ batch 5. หลกการ การทดสอบสารกลม Beta agonists ดวยวธ LC-MS/MS มหลกการ คอ สกดตวอยางอาหารสตวดวยตวท าละลายwater : 1M HCl (45:5) น ามาเขยาแลวปนเหวยงใหตกตะกอน แลวน าสารละลายทสกดไดมาก าจดสงรบกวน (Clean up) ดวยวธ Solid Phase Extraction ชนด SCX น าสารละลายไประเหยแหงแลวเตม 0.10 % Formic acid วเคราะหสารละลายตวอยางทไดดวยเครอง LC-MS/MS


ตารางท 3.2 โครงสรางและ Parent /Product ion ของสารกลม Beta agonists No. Analyze Structure Parent ion Product ion

1. Salbutamol

240 148, 166, 222

2. Clenbuterol

277 203, 259

3. Ractopamine

302 107,121, 164, 284

6. ความปลอดภย

6.1 ในการเตรยมสารละลาย Hydrochloric acid และ Formic acid ซงมฤทธ กดกรอนเปนอนตรายตอผวหนง และระบบหายใจ ตองเตรยมในตดดควน (Hood) ดวยความระมดระวง

6.2 การเตรยมสารละลาย Trifluoroacetic acid (TFA) เมอเปดฝาจะมไอของสารระเหยขนมา ควรใสถงมอและหนากากปองกนไอสารเคม โดยตองเตรยมในตดดควน

6.3 การก าจดของเสยแยกตามชนดของเสยทตองการก าจด สารละลายทไดจากการสกดเมอสนสดการวเคราะหแลวก าจดโดยแยกของเหลวและกากอาหารสตวกอนเทลงในขวดส าหรบบรรจของเสย (Waste bottle) ระบชนดของเสยไวขางขวดดวยตวอกษรทมองเหนชดเจน

6.4 ตองแยกชนดของสารเคมทจะก าจด เนองจากสารเคมบางตวเขากนไมไดและอาจเกดอนตรายตอผวเคราะห เทสารเคมทตองการทงลงในขวดก าจดสารเคมและท าในตดดควน ระบชนดของสารเคมทตองการทงใหเหนชดเจนเพอปองกนการหยบผด หามตงไวใกลทอแกสและในทอณหภมสง 7. อปกรณและเครองมอ 7.1 เครองมอ 7.1.1 เครอง Liquid Chromatography Mass spectrometer – Mass spectrometer (Triple quadrupole) ยหอ Shimadzu รน LCMS-8030

7.1.2 เครองชงทศนยม 5 ต าแหนง ยหอ Sartorius รน ME215P 7.1.3 เครองชงทศนยม 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน MS1003S 7.1.4 เครองเขยาตวอยาง (Shaker) ยหอ Gerhardt 7.1.5 เครอง Ultrasonic bath ยหอ BRASON รน B-8200E3 7.1.6 เครอง Centrifuge ยหอ KUBOTA รน 5500 7.1.7 เครอง Manifold


7.1.8 เครองระเหยสารตวอยาง (Nitrogen Evaporator) ยหอ Caliper 7.1.9 เครอง Vortex mixer 7.1.10 Micropipette ขนาด 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl หรอ 1-10 ml 7.1.11 ชดกรองเฟสเคลอนท (Mobile phase) 7.1.12 ตเยน 2-8 °C ยหอ Sanyo รน MIR553 7.1.13 Dispenser ขนาด 50 ml 7.2 อปกรณ 7.2.1 คอลมน (Column) C18, ขนาด 5 cm x 3.0 mm, 2.7 µm

7.2.2 Solid phase extraction (SPE) ชนด SCX ขนาด 500 mg 3ml 7.2.3 Centrifuge tube ชนด polypropylene ขนาด 15 และ 50 ml 7.2.4 Disposable syringe ขนาด 3 ml 7.2.5 Syringe membrane filter ชนด Nylon ขนาด 0.2 µm, เสนผานศนยกลาง 13 mm

และขนาด 0.45 µm, เสนผานศนยกลาง 25 mm 7.2.6 Laboratory sealing film 7.2.7 Tip ขนาด 1-10 µl, 10-100 µl, 100-1,000 µl และ 1-10 ml

7.3 เครองแกว 7.3.1 Volumetric flask ขนาด 1000,100, 50, 25, 5 และ 1 ml 7.3.2 Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 7.3.3 Beaker ขนาด 250 และ 50 ml 7.3.4 Cylinder ขนาด 500,100 และ 50 ml 7.3.5 Glass vial สชา ขนาด 100, 25, 5 และ 2 ml 7.3.6 Volumetric pipette ขนาด 1 และ 10 ml

8. สารเคมและ/หรออาหารเลยงเชอ 8.1 สารเคม

8.1.1 ไตรฟลออโรอะซตก (Trifluoroacetic acid : C2HF3O2) AR grade 8.1.2 กรดไฮโดรคลอรก (Hydrochloric acid : HCl) AR grade 8.1.3 อะซโตไนไทรล (Acetonitrile : CH3CN) AR และ HPLC grade 8.1.4 กรดฟอรมก (Formic acid : HCOOH) 8.1.5 เมทานอล (Methanol : CH3OH) AR และ HPLC grade 8.1.6 น าปราศจากไอออน (Deionized water) ความตานทานไฟฟา ≥ 18.2 MΩ/CM

8.2 การเตรยมสารละลาย 8.2.1 การเตรยมสารละลาย Hydrochloric acid ความเขมขน 1 M

ค านวณปรมาตร Hydrochloric acid ทใชตามสตร

100

1, 000

M MW Vf

VHCL

D C


เมอ VHCL คอ ปรมาตร Hydrochloric acid ทตองใชในการเตรยม (ml) M คอ ความเขมขนของสารละลายทตองการเตรยม (molar) MW คอ มวลโมเลกลของ Hydrochloric acid (g/mol) V f

คอ ปรมาตรของสารละลายทตองการเตรยม (ml)

D คอ ความหนาแนนของ Hydrochloric acid (g/ml) C คอ ความเขมขนของ Hydrochloric acid (%) ทใชในการเตรยม ตวง Hydrochloric acid ตามปรมาตรทค านวณจากสตร ลงในขวดวดปรมาตร ทม Deionized water อยประมาณ 1/3 ของปรมาตรทงหมด ปรบปรมาตรดวย Deionized water จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน เกบไวทอณหภมหอง มอายการใชงาน 1 เดอน บนทกลงในแบบบนทกการเตรยมสารเคม 8.2.2 การเตรยมสารละลาย Mobile phase (0.10% Formic acid)

ค านวณปรมาตรการเตรยมตามสตร C1 X V1 = C2 X V2 เมอ C1 = ความเขมขนของสารทใชในการเตรยม

C2 = ความเขมขนของสารละลายทตองการเตรยม V1 = ปรมาตรของสารทใชในการเตรยม V2 = ปรมาตรของสารละลายทตองการเตรยม

ปเปต Formic acid ปรมาตรตามทค านวณได ลงในขวดวดปรมาตร ท ม Deionized water อยประมาณ 1/3 ของปรมาตรทงหมด ปรบปรมาตรดวย Deionized water จนถงขดบอกปรมาตร น าไปกรองผานแผนกรองชนด Nylon ขนาด 0.45 µm โดยใชชดกรองเฟสเคลอนท (Mobile phase) มอายการใชงานไมเกน 7 วน บนทกลงในแบบบนทกการเตรยมสารเคม

8.2.3 การเตรยมสารละลายส าหรบ Elute สารกลม Beta agonists (0.5% TFA ในสารละลายผสมระหวาง Methanol : Acetonitrile : Deionized water อตราสวน 60:30:10 ) ปเปต Trifluoroacetic acid ปรมาตร 5 ml ลงในขวดวดปรมาตรขนาด 1,000 ml ทม Methanol อยประมาณ 1/3 ของปรมาตรทงหมด เตม Acetonitrile 300 ml และเตม Deionized water 100 ml ปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร 1,000 ml มอายการใชงานไมเกน 1 เดอน บนทกลงในแบบบนทกการเตรยมสารเคม 9. สารมาตรฐาน สารมาตรฐานทใชไดแก Salbutamol, Clenbuterol และ Ractopamine (ความบรสทธไมนอยกวา 95%) 9.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน (Preparation of standard solution) 9.1.1 Stock standard solution Salbutamol (100 µg/ml) 9.1.1.1 การค านวณน าหนกสารมาตรฐานทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WC) = C x V 106


9.1.1.2 กรณทสารมาตรฐานอยในรป Free base ใหค านวณน าหนกทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WT) = Wc X 100 เมอความบรสทธของสารอยในรป %Purity % Purity หรอ น าหนกทตองชง(WT) = Wc X 1,000 เมอความบรสทธของสารอยในรป Potency Potency 9.1.1.3 กรณทสารมาตรฐานอยในรป Salt base ใหค านวณน าหนกทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WT) = Wc x MW(salt base)x100 เมอความบรสทธของสารอยในรป %Purity % Purity x MW (free base)

หรอ น าหนกทตองชง(WT) = Wc x MW(salt base) x 1,000 เมอความบรสทธของสารอยในรป Potency Potency x MW (free base)

9.1.1.4 การค านวณความเขมขนของสารมาตรฐานทเตรยมได ความเขมขนของสารมาตรฐานทเตรยมได Conc.(µg/ml) = WB x C

WT เมอ WT คอ น าหนกสารมาตรฐานทตองชง (g)

WC คอ น าหนกของสารมาตรฐานทค านวณไดจากความเขมขนท ตองการเตรยม (g)

C คอ ความเขมขนทตองการเตรยม (µg/ml) V คอ ปรมาตรทตองการเตรยม (ml) WB คอ น าหนกสารมาตรฐานทชงไดจรงขณะเตรยม (g) MW (salt base) คอ มวลโมเลกลของสารมาตรฐานทอยในรป salt base

MW (free base) คอ มวลโมเลกลของสารมาตรฐานทอยในรป free base

% Purity คอ ความบรสทธของสารมาตรฐาน (%) Potency คอ ความบรสทธของสารมาตรฐาน (µg/mg)

ชงสารมาตรฐาน Salbutamol ตามน าหนกทค านวณไดจากสตร ขอ 9.1.1.1 - 9.1.1.3 (น าหนกทชง ± 0.0005 g) ดวยเครองชง 5 ต าแหนง ละลายใสลงในขวดวดปรมาตรและปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชา ปดฝาใหสนท ค านวณความเขมขนทเตรยมไดจากสตรขอ 9.1.1.4 ตดปายบงชสถานะสารละลายมาตรฐานและเกบท อณหภม 2-8 ๐C มอายการใชงาน 6 เดอน 9.1.2 Stock standard solution Clenbuterol (100 µg/ml)

ชงสารมาตรฐาน Clenbuterol ตามน าหนกทค านวณไดจากสตร ขอ 9.1.1.1- 9.1.1.3 (น าหนกทชง ± 0.0005 g)ดวยเครองชง 5 ต าแหนง ละลายใสลงในขวดวดปรมาตรและปรบปรมาตรดวย


Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชา ปดฝาใหสนท ค านวณความเขมขนทเตรยมไดจากสตรขอ 9.1.1.4 ตดปายบงชสถานะสารละลายมาตรฐานและเกบท อณหภม 2-8 ๐C มอายการใชงาน 6 เดอน 9.1.3 Stock standard solution Ractopamine (100 µg/ml) ชงสารมาตรฐาน Ractopamine ตามน าหนกทค านวณไดจากสตร ขอ 9.1.1.1 - 9.1.1.3 (น าหนกทชง±0.0005g)ดวยเครองชง 5 ต าแหนง ละลายใสลงในขวดวดปรมาตรและปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชา ปดฝาใหสนท ค านวณความเขมขนทเตรยมไดจากสตรขอ 9.1.1.4 ตดปายบงชสถานะสารละลายมา ตรฐานและเกบทอณหภม 2-8 ๐C มอายการใชงาน 6 เดอน

9.1.4 Intermediate mixed standard solution I (10 µg/ml) ค านวณปรมาตรของ Stock standard solution จากความความเขมขนทเตรยมได

แลวปเปต Stock standard ลงในขวดวดปรมาตร ปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชา ปดฝาใหสนท มอายการใชงาน 2 เดอน และเกบท อณหภม 2-8 ๐C 9.1.5 Intermediate mixed standard solution II (1 µg/ml) ค านวณปรมาตรของ Intermediate mixed standard solution I แลวปเปต Intermediate mixed standard I ลงในขวดวดปรมาตร ปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชา ปดฝาใหสนท มอายการใชงาน 2 เดอน และเกบทอณหภม 2-8 ๐C 9.1.6 Working mixed standard solution (10 µg/L) ใชส าหรบทดสอบ System suitability ของเครอง LC-MS/MS

ค านวณปรมาตรของ Intermediate mixed standard solution II (1 µg/ml) แลว ปเปตใสลงในขวดวดปรมาตร ปรบปรมาตรดวย mobile phase จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน เตรยมใหมทกครงกอนการใชงาน 9.2 การเกบรกษาสารมาตรฐาน 9.2.1 การเกบรกษาสารมาตรฐานกลม Beta Agonists ในตควบคมอณหภมท อณหภมทเหมาะสม ดงทระบไวในใบ Certificate ของผผลต หรอตามทผผลตก าหนด หรอตามความเหมาะสม 9.2.2 เมอตองการใชงานตองน าสารมาตรฐานออกจากตควบคมอณหภมและตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 30-60 นาทกอนใชงาน เมอใชงานเสรจแลวใหใช sealing film พนและเกบเขาตควบคมอณหภมทนทเพอปองกนการเสอมสภาพ 10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 ขนตอนการเตรยมตวอยางทดสอบ การบดตวอยางทดสอบถกเตรยมโดยงานบดตวอยางตามวธปฏบตงานการจดการตวอยางอาหารสตว 10.2 ขนตอนการทดสอบ การเตรยมตวอยางทดสอบ ทกขนตอน 10.2.1 ชงตวอยาง 10.00 ± 0.05 g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.2.2 เตมน ากลน ปรมาตร 45 ml เขยาดวยมอ


10.2.3 เตม 1 M HCl ปรมาตร 5 ml ปดจกและใช Sealing film พนจกใหแนน 10.2.4 น าไปเขยาดวยเครอง Shaker ความเรว 200 รอบ/นาท นาน 30 นาท 10.2.5 เทสารละลายใสหลอดโพลโพรพลน ขนาด 50 ml และปดฝาใหแนน 10.2.6 น าไป Centrifuge ทอณหภม 25 ๐C ความเรว 3,500 รอบ/นาท นาน 15 นาท 10.2.7 กรองสารละลายทไดดวย Membrane filter ชนด Nylon ขนาด 0.45 µm ลงใน หลอดโพลโพรพลน ขนาด 50 ml 10.2.8 เตรยม Solid phase extraction (SPE) ชนด SCX ขนาด 500 mg ดวยการ Condition Column ดวย Methanol 2 ml และ Deionized water 2 ml เปด Vacuum pump flow rate ประมาณ 5 ml/min ไมควรปลอยให Packing ใน Column แหงกอน Load sample 10.2.9 น าสารละลายจากขอ 10.2.7 ปรมาตร 10 ml ผาน SPE เปด Vacuum pump flow rate ประมาณ 1 ml/min pressure ไมเกน 5 psi ปลอยใหสารละลายไหลทละหยด 10.2.10 ลาง (Wash) ดวย Deionized water 2 ml เปด Vacuum pump flow ประมาณ 1 ml/min ปลอยให สารละลายไหลทละหยดจนหมด และให Vacuum pump flow ตอไปอก 2-4 นาท 10.2.11 ชะ (Elute) ดวย 0.5 % Trifluoroacetic acid ในสารละลายผสม Methanol : Acetonitrile : Deionized water อตราสวน ( 60 : 30 : 10) จ านวน 3 ครงๆ ละ 1 ml เปด Vacuum pump flow rate 1 ml/min 10.2.12 น าไประเหยแหงดวยเครอง Turbovab ทอณหภม 40 ± 2 ๐C ความดนไมเกน 5 psi ใชเวลาประมาณ 45 นาท จนกระทงแหงพอด 10.2.13 น าสารละลายทระเหยแหง เตม 0.1% Formic acid ปรมาตร 0.5 ml และเขยาดวยเครอง Ultrasonic bath นาน 2-3 นาท 10.2.14 กรองสารละลายผาน Membrane filter ชนด Nylon ขนาด 0.2 µm ลงใน glass vial ขนาด 2 ml และน าไปวเคราะหดวยเครอง LC-MS/MS 10.2.15 ในกรณทตวอยางตรวจพบสารกลม Beta agonists มความเขมขนสงเกนชวง Working range (>1 mg/kg) ใหท าการลดปรมาณการชงตวอยางจาก 10 กรม เหลอ 5 ± 0.05 กรม จากนนปฏบตตามขนตอนการทดสอบขอ 10.2.2 -10.2.14 และหากยงพบวา Peak Area ไมอยในชวง Calibration Curve ใหท าการเจอจางสารละลายกอนฉดในอตราสวนทเหมาะสม ใหคา Peak Area อยในชวงของ Calibration Curve 10.3 ขนตอนการเตรยมตวอยาง Sample blank น าวตถดบอาหารสตวแตละชนดตามตารางท 3 หรออาหารสตวส าเรจรป มาบดใหละเอยด ท าการทดสอบตามขนตอนวธทดสอบขอ 10.2.1-10.2.14 ผลการทดสอบทไดตองไมพบ หรอพบสารกลม Beta agonists นอยกวาคา LOD น าวตถดบทผานการทดสอบแลวมาผสมกนในถงพลาสตกตามอตราสวนของสวนผสมอาหารสตวตามตารางท 3 ผสมใหเปนเนอเดยวกน เกบตวอยางใสในถง บนทกการเตรยมตวอยาง Sample blank และเกบรกษาทอณหภม 25±5 ๐C มอายการใชงาน 3 เดอน 10.4 ขนตอนการเตรยม Negative control 10.4.1 Reagent Blank 10.4.1.1 น า Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml เตมน ากลน ปรมาตร 45 ml 10.4.1.2 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.3-10.2.14 พรอมตวอยางทดสอบ 10.4.1.3 บนทกรายละเอยดทกขนตอน


10.4.2 Sample Blank 10.4.2.1 ชงตวอยาง Sample Blank ( จากขอ 10.3) 10.00 g ± 0.05 g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.4.1.2 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.2-10.2.14 พรอมตวอยางทดสอบ 10.4.1.3 บนทกรายละเอยดทกขนตอน ตารางท 3.3 สตรอาหารสตวผสมส าเรจรปส าหรบสกรในการเตรยมตวอยาง Sample blank

ล าดบท ชนดวตถดบอาหารสตว ปรมาณวตถดบตอการเตรยม 2 กโลกรม (กรม) 1 ขาวโพด 200 2 กากถวเหลอง 320 3 ร าขาว 800 4 ปลาปน 240 5 มนเสน 140 6 ปลายขาว 300

10.5 การเตรยมตวอยาง positive control ความเขมขน 0.1 mg/kg 10.5.1 เตรยมโดยชงตวอยาง Sample blank (จากขอ 10.3) จ านวน 10.00 ± 0.05 g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml จ านวน 2 flask

10.5.2 เตม Intermediate mixed standard solution II (1 µg/ml) ปรมาตร 1000 µl 10.5.3 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.2-10.2.14 พรอมตวอยางทดสอบ

10.5.4 บนทกรายละเอยดทกขนตอน 10.6 การเตรยม Standard Calibration matrix Solution

เตรยม Standard Calibration matrix Solution ทระดบความเขมขนตางกน 6 ระดบความเขมขน ความเขมขนละ 1 ซ า โดยใช Standard Calibration matrix Solution ทระดบความเขมขน 0.05 0.1 0.25 0.5 0.75 และ 1 mg/kg โดยเตรยมดงน 10.6.1 ชงตวอยาง Sample blank (จากขอ 10.3) จ านวน 10.00 ± 0.05 g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.6.2 เตม Intermediated Mixed Standard Solution I และ II ลงใน Erlenmeyer flask ตามตารางท 3.4 แลวน าไปทดสอบตามขอ 10.2.2-10.2.14 10.6.3 บนทกการเตรยมและผลทดสอบ 10.7 การทดสอบประสทธภาพของเครอง LC-MS/MS (System suitability test)

ตรวจสภาพความพรอมของเครองกอนการใชงานโดยท าการตรวจสอบดวยการฉดสารละลายมาตรฐาน Beta agonists ทความเขมขน 10 µg/L จากขอ 9.1.6 จ านวน 5 ซ า ภายใตสภาวะเดยวกน และ ค านวณหา S/N, %RSD of Peak area และ %RSD of RT แลวเปรยบเทยบผลการทดสอบกบขอก าหนดตามตารางท 3.5 ในกรณททดสอบแลว ผลทไดไมผานเกณฑทก าหนด ใหท าการแกไข วเคราะหหาสาเหต ถาไมสามารถแกไขไดใหแจงใหผควบคมทราบ


ตารางท 3.4 ขอมลการเตรยม Standard Calibration matrix Solution Concentration Standard

Calibration matrix Solution (mg/kg)

Concentration Intermediate mixed standard Solution

(µg/ml)

Volume of Intermediate mixed standard Solution

(ml)

0.05 0.1 0.25 0.5 0.75 1

1 1 10 10 10 10

0.50 1.00 0.25 0.50 0.75 1.00

ตารางท 3.5 ขอก าหนดของการทดสอบประสทธภาพของเครอง LC-MS/MS

Parameter ขอก าหนด 1. S/N 100* 2. %RSD of Peak area 2.5** 3. %RSD of RT 1**

*ขอก าหนดอางองจากผลการทดลอง **ขอก าหนดอางองตามมาตรฐาน USP

Flow chart ขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย LC-MS/MS Sample 10 g Extraction Water : 1M HCl ( 45 :5 ml) - Shake 30 min - Centrifuge 15 min, 3,500 rpm, 25 ๐C Clean up with SPE (SCX) Condition - 2 ml of Methanol - 2 ml of Water Supernatant 10 ml

- Wash 2 ml of water Elute with 1 ml 0. 5 % TFA in Methanol : ACN : Deionized water (60 : 30 : 10) (3 replicate) Evaporate Add 0.1 % Formic acid 0.5 ml LC- MS/MS

รปท 3.1 Flow chart ขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย LC-MS/MS


10.8 การวเคราะหดวยเครอง LC-MS/MS Triple Quadrupole ยหอ Shimadzu 10.8.1 สภาวะของเครอง HPLC

HPLC Condition Column : C18, ขนาด 5 cm x 3.0 mm, 2.7 µm

Solvent A : 0.1 % Formic acid Solvent B : Acetonitrile

Run time : 8 min Column temperature : 25 ๐C

Injection Volume : 10 µl LC Program : Time (min : sec) % A % B Flow (ml/min) 0.00 83 17 0.2 1.20 83 17 0.2 1.90 60 40 0.2 2.20 25 75 0.2 2.60 25 75 0.2 2.61 83 17 0.2 8.00 Stop

10.8.2 MS Parameters CID gas : 230 kPa DL Temperature : 300 ๐C Nebulizing Gas flow : 3 L/min Drying gas flow : 15 L/min ตารางท 3.6 MS Parameter ของการวเคราะหดวยเครอง LC-MS/MS ยหอ Shimadzu

Analyze

Precursor ion m/z

Product ion Dwell Time (msec)

Q1 Pre Bias(V)

CE Q3 Pre Bias(V)

Salbutamol

240 148* 222

30.0 30.0

-16.0 -16.0

-19.0 -11.0

-18.0 -17.0

Clenbuterol 277

203* 259

100.0 100.0

-19.0 -19.0

-17.0 -12.0

-15.0 -14.0

Ractopamine

302 107* 164 121

100.0 100.0 100.0

-21.0 -21.0 -21.0

-30.0 -17.0 -24.0

-21.0 -12.0 -14.0


11. การค านวณ 11.1 ปรมาณสารทสนใจทพบในตวอยาง ( X )

X = y – b x Sample dilution factor a

โดย X = ความเขมขนของสารทสนใจทมอยในตวอยาง (mg/kg) y = Peak Area ของ Product ion* (Primary ion)

a = ความชนของ calibration curve b = จดตดแกน Y ของ calibration curve เมอมการเจอจางตามขอ 10.2.15 ใหน าคาทค านวณไดมาคณ Factor ของการเจอจางตวอยาง 11.2 การค านวณ % Ion ratio % Ion ratio = Peak Area ของ Product ion ( Secondary ion ) x 100 Peak Area ของ Product ion ( Primary ion ) 11.3 ผลการทดลองและการค านวณผล 11.4 สรปผลการทดสอบ 12. การควบคมคณภาพ 12.1 ทดสอบตวอยาง Positive Control จ านวน 2 ตวอยาง ในทกชดการทดสอบ ทความเขมข น 0.10 mg/kg มหลกเกณฑพจารณา คอ % Recovery ตองอยในชวง 70-125 และ %RPD ไมเกน 15 (ตามเกณฑ AOAC) และถา % Recovery และ %RPD ทไดไมอยในเกณฑทก าหนด ตองน าตวอยางทดสอบกลบไปท าการทดสอบใหมทงชด

สตรการค านวณ % Recovery = 100C C

found blank

Cadd

เมอ foundC คอ ปรมาณเฉลยของสารกลม Beta agonists ทตรวจพบในตวอยาง Positive control

blankC คอ ปรมาณสารทตรวจพบใน Sample Blank

addC คอ ปรมาณสารกลม Beta agonists ทเตมลงในตวอยาง Positive control

และ % RPD = max min 100

mean

C C

C

เมอ maxC คอ ปรมาณสารกลม Beta agonists ทตรวจพบในตวอยาง Positive control คามาก

minC คอ ปรมาณสารกลม Beta agonists ทตรวจพบในตวอยาง Positive control คานอย

meanC คอ ปรมาณเฉลยของสารกลม Beta agonists ทตรวจพบในตวอยาง Positive control


ผลการทดสอบตวอยาง Positive Control น ามาควบคมคณภาพดวย Control chart เพอพจารณาแนวโนมของการทดสอบ(ปฏบตตามวธการปฏบตงาน การจดท าแผนภมควบคมในการควบคมคณภาพภายในผลทดสอบงานพษวทยาและชวเคม หากพบวาแผนภมมลกษณะทไมปรกตใหวเคราะหหาสาเหต และแจงใหผควบคมทราบเพอด าเนนการแกไขตอไป 12.2 ทดสอบ Negative Control (Reagent Blank และ Sample Blank) ของทกชดการทดสอบ 12.2.1 ทดสอบ Reagent Blank จ านวน 1 ตวอยาง ผลทไดตองไมพบ ถาผลเปน Positive จะตองน าตวอยางทดสอบในชดการทดสอบเดยวกนน กลบไปท าการทดสอบใหมทงชด 12.2.2 ทดสอบ Sample Blank จ านวน 1 ตวอยาง ผลทไดตองไมพบหรอพบสารกลม Beta agonists นอยกวาคา LOD หากพบปรมาณมากกวาหรอเทากบคา LOD จะตองน าตวอยางทดสอบชนดอาหารเดยวกนในชดการทดสอบน กลบไปท าการทดสอบใหม 12.3 ตวอยางทดสอบใหพจารณาดงน

12.3.1 ในกรณทตวอยางทดสอบไมไดผานการทดสอบเบองตนดวยเทคนค ELISA จะท าการทดสอบเบองตนดวยเทคนค LC-MS/MS โดยการทดสอบตวอยางทกๆ 10 ตวอยางจะตองท าซ าแบบ Duplicate อยางนอย 1 ตวอยาง โดยการเลอกตวอยางแบบสม จากผลการทดสอบเบองตนดวยเทคนค LC-MS/MS หากพบสารกลม Beta agonists ใหท าการยนยนผลทดสอบตวอยางอยางนอย 2 ซ า แลวค านวณคาเฉลยของผลการยนยนผลการทดสอบ เพอใชในการรายงานผล

12.3.2 ในกรณทตวอยางผานการทดสอบเบองตนดวยเทคนค ELISA แลว ใหผลทดสอบเปน Positive จะท าการยนยนผลดวยเทคนค LC-MS/MS โดยทดสอบตวอยางซ าแบบ Duplicate และใหท าการยนยนผลทดสอบตวอยางอยางนอย 2 ซ า แลวค านวณคาเฉลยของผลการยนยนผลการทดสอบเพอใชในการรายงานผล

12.3.3 หากพบปรมาณของสารกลม Beta agonists ในตวอยางทดสอบอยในชวงความเขมขน 0.05 mg/kg ถงไมเกน 0.1 mg/kg คา %RPD ตองไมเกน 30 ถาความเขมขนมากกวา 0.1 mg/kg ถง 2 mg/kg คา %RPD ตองไมเกน 20 หากเกนเกณฑก าหนด ผทดสอบตองขอเบกตวอยางใหม และท าการทดสอบตวอยางดงกลาวใหมอกครง 12.3.4 Retention time (RT) ของสาร Beta agonists ทพบในตวอยางทดสอบ ตองแตกตางจาก RT เฉลยของสารมาตรฐาน Beta agonists ใหอยในชวง ± 2.5% (อางองจาก European commission Decision 2002) 12.4 การฉดตวอยางเขาเครอง LC-MS/MS ก าหนดใหใน 1 ชดทดสอบอยางนอย ประกอบไปดวย สารละลายมาตรฐาน ส าหรบตรวจสอบ Peak area drift, Standard calibration matrix solution, Reagent blank, Sample blank, Positive control และ Test Sample เปนตน โดยมล าดบการ Inject ดงตารางท 7 หรอปรบตามความเหมาะสม ในกรณทมการเฝาระวง คา LOD และ LOQ ใหก าหนดล าดบการ Inject ตามความเหมาะสม


ตารางท 3.7 ล าดบการ Inject ตวอยางของแตละชด Sequence run Number of Inject

ACN 1 Std. 200 ppb ( PA drift ) 1 Standard calibration matrix solution 0.05 mg/kg 3 Standard calibration matrix solution 0.1 mg/kg 3 Standard calibration matrix solution 0.25 mg/kg 3 Standard calibration matrix solution 0.5 mg/kg 3 Standard calibration matrix solution 0.75 mg/kg 3 Standard calibration matrix solution 1 mg/kg 3 Reagent blank 1 Sample blank 1 Positive control- 1 1 Positive control- 2 1 Test Sample 1 1 Test Sample n 1 Std. 200 ppb ( PA drift ) 1

12.5 % Ion ratio ของ Peak ของสารกลม Beta agonists ในตวอยาง Positive Control และ Peak ทตรวจพบในตวอยางทดสอบ ตองอยในเกณฑการยอมรบเมอเทยบกบคาเฉลยของ % Ion ratio ของสารมาตรฐาน ดงตารางท 3.8 ตารางท 3.8 เกณฑการยอมรบ % Ion ratio (อางองจาก European commission Decision 2002)

คาเฉลย % Ion ratio ของสารมาตรฐาน เกณฑการยอมรบ >50% ±20% >20% to 50% ±25% >10% to 20% ±30% ≤10% ±50%

12.6 ทดสอบ Peak area drift ของ สารละลายมาตรฐานกลม Beta Agonists ทความเขมขน 200 µg/L (ppb) ตองมคา Peak area drift ไมเกน ± 30% สตรการค านวณ % Peak area drift = Peak area initial - Peak area final x 100 Peak area average 12.7 การเฝาระวงทระดบคา LOD และ LOQ อยางนอย 6 เดอนตอ 1 ครง ใหท าการทดสอบ Positive Control ทระดบ LOD และ LOQ ความเขมขนอยางละ 3 ซ า พรอมกบชดการทดสอบตวอยาง (batch) โดยการเฝาระวงคา LOD ใหพจารณาคา S/N ≥ 3 และ % Ion ratio ตองอยในเกณฑการยอมรบเมอเทยบกบคาเฉลย % Ion ratio ของสารมาตรฐาน ดงแสดงในตารางท 8 และการเฝาระวงคา LOQ ใหพจารณาคา % Recovery ตองอยในชวง 70 – 125 และ % RSD ตองไมเกน 15% หากผลการเฝาระวงไมผานตามเกณฑทก าหนดใหท าการ Verify หาคา LOD และ/หรอ LOQ ทเหมาะสมของวธทดสอบใหม


12.8 การควบคมคณภาพสารมาตรฐานพจารณาจาก Standard calibration curve ของสารกลม Beta agonists จะตองมคา Coefficient of determination ( R2 ) ไมนอยกวา 0.995 หากไมเปนไปตามเกณฑก าหนดใหเตรยม Standard calibration solution ส าหรบสราง Standard calibration curve ใหม 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช 13.1 บนทกการทดสอบสารกลม Beta agonists ดวยวธ LC-MS/MS 13.2 บนทกสรปผลการทดสอบ Beta agonists 13.3 บนทกการเตรยมสารมาตรฐาน Stock standard

13.4 บนทกการเตรยม Intermediate standard solution 13.5 บนทกการเตรยมสารเคม

13.6 บนทก System suitability test ของเครอง LC-MS/MS ส าหรบวเคราะหสาร Beta agonists

13.7 บนทกการเตรยมตวอยาง Blank 14. การรายงานผล การรายงานผลการทดสอบจะรายงานโดยอางองตามคา Limit Of Quantification (LOQ) ตามตารางท 1 ดงน 14.1 กรณผลการทดสอบไมพบสาร Beta agonists จะรายงานวา “ไมพบ”

14.2 กรณพบสาร Beta agonists ปรมาณต ากวา LOD คอนอยกวา 0.02 mg/kg จะรายงานวา “ไมพบ”

14.3 กรณพบสาร Beta agonists ปรมาณอยในชวงระหวาง LOD ถงนอยกวา LOQ รายงานวา พบนอยกวา LOQ ยกตวอยาง เชน พบสาร Ractopamine ในตวอยางอาหารสตวทระดบ 0.04 mg/kg แตคา LOQ อยท 0.05 mg/kg ดงนนจะรายงานวา “พบนอยกวา 0.05 mg/kg” เปนตน

14.4 กรณทพบสาร Beta agonists มปรมาณมากกวาหรอเทากบคา LOQ จะรายงานผลโดยใชคาเฉลยของการทดสอบทง 2 ซ า และรายงานผลเปนตวเลขทศนยม 2 ต าแหนง โดยมหนวยเปน mg/kg 14.5 ในกรณทผใชผลทดสอบรองขอการรายงานผลพรอมคาความไมแนนอนของการวด ใหด าเนนการค านวณคาความไมแนนอนตามเอกสารวธปฏบตงานการประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry โดยรายงานผลการทดสอบ ± คาUncertainty พรอมระบความเชอมน 15. รายละเอยดอนๆ 15.1 ควบคมอณหภมหองปฏบตการใหอยในชวง 25 ± 5 ๐C

15.2 การทดสอบประสทธภาพของ Solid phase extraction (SPE) ชนด SCX ใหปฏบตตามวธปฏบตงานการตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและวสดวทยาศาสตรงานพษวทยาและชวเคม 16. เอกสารอางอง 16.1 Eshaq (Isagc) Shishani,Sin Chii Chai,Sami Jamokha,Gere Aznar Michacl K.Hoffman. Determination of Ractopamine in animal tissues by Liquid Chromatography – fluorescence and Liquid Chromatography/tandem mass spectrometry. Analytica Chimica Acta. 483(2003) 137-145


16.2 European Commission Decision 2002/65/EC of 12 August 2002 Implementing council directive 96/23/EC concerning the performance of analytical method and the interpretation of results. Official journal of the European communities. 2002 L221/8 16.3 AOAC Guidelines for single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanical. 2002


3.1.2 วธทดสอบสารกลม Tetracyclines ในอาหารสตวโดยวธ HPLC 1. วตถประสงค เพอเปนวธทดสอบสารกลม Tetracyclines ในอาหารสตวดวยวธ HPLC 2. ขอบขาย เปนวธทดสอบสารกลม Tetracyclines ไดแก Chlortetracycline (CTC) Oxytetracycline (OTC) และ Doxycycline (DXC) ในอาหารสตว ชนดอาหารไกและอาหารสกรดวยวธ High Performance Liquid Chromatography (HPLC) เปนวธ In house method base on ตามวธทดสอบเรอง Analytical procedure for the determination of chlortetracycline and 4-epi- chlortetracycline in pig kidneys. จากวารสาร Journal of Chromatography A Volume 1088 Issues 1-2 2005 หนา 169-174 วธทดสอบนม working range ระหวาง 1–300 mg/kg มคา LOD และ LOQ ของวธทดสอบดงตารางท 3.9

ตารางท 3.9 คา LOD และ LOQ ของวธทดสอบ Analyte Limit of Detection

(LOD) Limit of Quantitation

(LOQ) Chlortetracycline 0.5 mg/kg 1 mg/kg Oxytetracycline 0.3 mg/kg 1 mg/kg Doxycycline 0.5 mg/kg 1 mg/kg

3.เอกสารทเกยวของ 3.1 วธปฏบตงานการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบสารกลม Tetracyclines ในอาหารไกโดยวธ

HPLC 3.2 วธปฏบตงานการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบสารกลม Tetracyclines ในอาหารสกรโดย

วธ HPLC 3.3 วธการปฏบตงานการประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสารกลม Tetracyclines

ในอาหารสตวดวยวธ HPLC 3.4 วธใชเครองชง 5 ต าแหนง ยหอ Sartorius รน ME 215P และ ยหอ Mettler Toledo รน XP 205 DR

3.5 วธใชเครองชง 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledoรน MS1003S 3.6 วธใชเครองเขยาแนวราบ ยหอ Gerhardt

3.7 วธใชเครองเขยาแนวราบ ยหอ Edmund Buhler 3.8 วธใชเครอง HPLC ยหอ Water รน 486

3.9 วธใชเครอง Ultrasonic bath ยหอ BRANSON รน B-8200E3 3.10 วธใชเครองปนเหวยงตกตะกอน ยหอ KUBOTA รน 5500

3.11 วธใชเครองปนเหวยงตกตะกอน ยหอ Eppendorf รน 5810R 3.12 วธใชเครอง Manifold 3.13 วธใชตแชแขงยหอ Domatic 3.14 วธใชเครอง Vortex mixer 3.15 วธใช Micropipette 3.16 วธใชตเยน ยหอ Sanyo รน MIR-553 3.17 วธใชเครอง Dispenser


3.18 วธปฏบตงานการจดการตวอยางอาหารสตว 3.19 วธการปฏบตงานการจดท าแผนภมควบคมในการควบคมคณภาพภายในผลทดสอบงานพษวทยาและชวเคม 3.20 วธใชเครองมอเครองชงไฟฟาแบบละเอยด 3.21 การตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและวสดวทยาศาสตรของงานพษวทยาและชวเคม 3.22 วธการปฏบตงานการการจดการสารเคมและสารมาตรฐานงานพษวทยาและชวเคม (สารตกคาง) 4. นยาม 4.1 Sample Blank หมายถง ตวอยางทไดผานการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยาง ทกขนตอน แลวไมพบสาร Chlortetracycline Oxytetracycline และ Doxycycline 4.2 Reagent Blank หมายถง reagent ทใชในระหวางการทดสอบซงไมมสาร Chlortetracycline Oxytetracycline และ Doxycycline แลวน ามาทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอน

4.3 Positive control หมายถง ตวอยางทใชในการควบคมคณภาพผลการทดสอบ โดยน า Sample Blank มาเตมสารมาตรฐาน Chlortetracycline Oxytetracycline และ Doxycycline ในระดบความเขมขนททราบแนนอน ท าการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอนพรอมกบการทดสอบตวอยางในชด (batch) เดยวกน

4.4 Negative Control หมายถง Reagent Blank และ Sample Blank ใชในการควบคมคณภาพผลทดสอบ เพอควบคมการปนเปอนขามขณะทดสอบ 5. หลกการ การทดสอบสารกลม Tetracyclines ในอาหารสตว มหลกการ คอ ชงตวอยางอาหารสตว น ามาสกดดวย 0.1 M Hydrochloric acid ใน Methanol เขยานาน 30 นาท แลวน าไป Centrifuge นาน 5 นาท ทความเรวรอบ 3,500 รอบ/นาท น าสวนใส 10 มลลลตร ผสมกบน า DI 10 มลลลตร กรองดวยกระดาษกรองชนด GF/A แลวน ามาก าจดสงรบกวน (Clean up) ดวย Solid Phase Extraction (SPE) ชนด SCX น าไปวเคราะหตอดวยเครอง HPLC

ตารางท 3.10 ชอและโครงสรางสารกลม Tetracyclines No. ชอสาร โครงสราง

1 Chlortetracycline

2 Oxytetracycline

3 Doxycycline

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Oxytetracycline-2D-skeletal.p

http://129.128.185.122/drugbank2/drugs/DB00254/structure_ima


6. ความปลอดภย 6.1 ในการเตรยมสารละลาย Hydrochloric acid และ oxalic acid ซงมฤทธกดกรอนเปนอนตราย

ตอผวหนงและระบบการหายใจตองเตรยมในตดดควน (Hood) ดวยความระมดระวง 6.2 การก าจดของเสยแยกตามชนดของเสยทตองการก าจด สารละลายทไดจากการสกดเมอสนสด

การทดสอบแลว ก าจดโดยแยกของเหลวและกากอาหารสตวกอนเทลงในขวดส าหรบบรรจของเสย (Waste bottle) ระบชนดของเสยไวขางขวดดวยตวอกษรทมองเหนชดเจน

6.3 สารเคมทเลกใชตองแยกชนดของสารเคมทจะก าจด เนองจากสารเคมบางตวเขากนไมไดและอาจเกดอนตรายตอผวเคราะห เทสารเคมทตองการทงลงในขวดก าจดสารเคมและท าในตดดควน (Hood) ระบชนดของสารเคมทตองการทงใหเหนชดเจนเพอปองกนการหยบผด ไมตงไวใกลทอแกสและในทอณหภมสง 7. อปกรณและเครองมอ 7.1 เครองมอ 7.1.1 เครอง High Performance Liquid Chromatography UV detector ยหอ Water รน 486 7.1.2 เครองชงทศนยม 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน MS1003S 7.1.3 เครองชงทศนยม 5 ต าแหนง ยหอ Sartorius รน ME215P หรอ ยหอ Mettler Toledo รน XP 205 DR 7.1.4 เครอง Shaker ยหอ Gerhardt หรอ ยหอ Edmund รน SM-30 7.1.5 เครอง Centrifuge ยหอ Kubotaรน 5500 และยหอ Eppendorf รน5810R 7.1.6 เครอง Ultrasonic bath ยหอ Bransonรน B- 8200E3 7.1.7 เครอง Manifold ยหอ Supelco หรอ ยหอ Vertical 7.1.8 ตแชแขงยหอ Domatic 7.1.9 ตเยน 2-8 C ยหอ Sanyo รน MIR 553 7.1.10 Vortex mixer 7.1.11 ชดกรองเฟสเคลอนท 7.1.12 Micropipette ขนาด 10-100 µl, 100-1000 µl และ 1-10 ml 7.1.13 Dispenser ขนาด 50 ml

7.2 อปกรณ 7.2.1 HPLC column ชนด C8 ขนาด 4.6 × 250 mm, 5 µm 7.2.2 Solid phase extraction (SPE) ชนด SCX ขนาด 500 mg /3 ml 7.2.3 Centrifuge tube ชนด polypropylene ขนาด 15 และ 50 ml 7.2.4 Syringe membrane filter ชนด Nylon ขนาด 0.2 µm,เสนผานศนยกลาง 13 mm 7.2.5 Laboratory sealing film 7.2.6 Tip ขนาด 10-100 µl, 100-1000 µl และ 1-10 ml 7.2.7 Disposable Syringe ขนาด 3 ml 7.2.8 กระดาษกรองชนด GF/A ขนาดเสนผานศนยกลาง 110 mm

7.2.9 Nylon filter membrane ส าหรบกรอง Mobile phase ขนาด 0.45 µm เสนผาน ศนยกลาง 47 mm


7.3 เครองแกว 7.3.1 Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 7.3.2 Volumetric flask ขนาด 5 10 50 100 และ 1000 ml 7.3.3 Beaker ขนาด 5, 10, 50 และ 250 ml 7.3.4 Cylinder ขนาด 50 และ 100 ml 7.3.5 ShellVial ขนาด 1.5-2 ml

7.3.6 Graduate pipette ขนาด 25 ml 8. สารเคมและ/หรออาหารเลยงเชอ 8.1 สารเคม 8.1.1 เมทานอล (Methanol) AR และ HPLC grade 8.1.2 อะซโตไนไทรล (Acetonitrile ) HPLC grade 8.1.3 กรดออกซาลก (Oxalic acid)ARgrade 8.1.4 กรดไฮโดรคลอรก (Hydrochloric acid) AR grade 8.1.5 น าปราศจากไอออน (Deionize water) ความตานทานไฟฟา≥ 18.2 M-cm

8.2 การเตรยมสารละลาย 8.2.1 การเตรยมสารละลาย Hydrochloric acid 8.2.1.1 สารละลาย 0.1 M Hydrochloric acid in Methanol ค านวณปรมาตร Hydrochloric acid ทใชตามสตร

100

1, 000

M MW Vf

VHCL

D C

เมอ คอปรมาตร Hydrochloric acid ทตองใชในการเตรยม (ml) คอ ความเขมขนของสารละลายทตองการเตรยม (molar) คอมวลโมเลกลของ Hydrochloric acid (g/mol)

คอปรมาตรของสารละลายทตองการเตรยม (ml)

คอความหนาแนนของ Hydrochloric acid (g/ml) คอ ความเขมขนของ Hydrochloric acid (%) ทใชในการเตรยม

ตวง Hydrochloric acid ปรมาตรตามทค านวณจากสตร ลงในขวดวดปรมาตรทม Methanol อยประมาณ 1/3 ของปรมาตรทงหมด ปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน เกบไวทอณหภมหอง มอายการใชงาน 2 เดอน บนทกการเตรยมลงในแบบบนทกการเตรยมสารเคม 8.2.1.2 สารละลาย 0.4 M Hydrochloric in Methanol ขนตอนการเตรยมสารละลาย เหมอน ขอ 8.2.1.1 8.2.1.3 สารละลาย 0.05 M Hydrochloric in Methanol ขนตอนการเตรยมสารละลาย เหมอน ขอ 8.2.1.1 8.2.2 การเตรยมสารละลาย Mobile phase (เตรยมใหมทกครงกอนการใชงาน)

VHCL

M

MW

Vf

D

C


8.2.2.1 เตรยมสารละลาย 0.01 M Oxalic acid โดยชงน าหนก Oxalic acid ตามสตร

น าหนกOxalic acid (g) =

เมอ คอ มวลโมเลกลของ Oxalic acid (g/mol) คอ ปรมาตรของสารละลาย Oxalic acid ทตองการเตรยม (ml)

Conc. คอ ความเขมขนของสารละลาย Oxalic acid ทตองการเตรยม (molar) น า Oxalic acid ทชงได ละลายดวย Deionize water ลงในขวดวดปรมาตรปรบปรมาตร

ดวย Deionize water จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน 8.2.2.2 เตรยมสารละลาย Mobile phase โดยผสมสารละลาย 0.01M Oxalic

acid : Acetonitrile : Methanol ในอตราสวน 6.5: 2.0:1.5 จากนนน าไปกรองดวยชดกรองเฟสเคลอนท ผานกระดาษกรองชนด Nylon 0.45 µm แลวน าไป Degas ดวยเครอง Ultrasonic bath เปนเวลาประมาณ 20 นาท

8.2.2.3 บนทกการเตรยมสารละลาย Mobile phase ลงในบนทกการเตรยมสารละลายเฟสเคลอนท (Mobile phase) ส าหรบวเคราะหสารกลม Tetracyclines ดวยวธ HPLC 9. สารมาตรฐาน สารมาตรฐานทใช ไดแก Chlortetracycline Oxytetracycline และ Doxycycline (ความบรสทธไมนอยกวา 90%) 9.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน (Preparation of standard solution) 9.1.1 การเตรยม Stock mix standard solution (100µg/ml) 9.1.1.1 การค านวณน าหนกสารมาตรฐานทตองชงตามสตร น าหนกทตองการชง(WC) = C x V 106 9.1.1.2 กรณทสารมาตรฐานอยในรป Free baseใหค านวณน าหนกทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WT) = Wc X 100 เมอความบรสทธของสารอยในรป %Purity %Purity หรอ น าหนกทตองชง(WT) = Wc X 1,000 เมอความบรสทธของสารอยในรป Potency Potency 9.1.1.3 กรณทสารมาตรฐานอยในรป Salt base ใหค านวณน าหนกทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WT) = Wc x MW(salt base)x100 เมอความบรสทธของสารอยในรป %Purity % Purity x MW (free base)

หรอ น าหนกทตองชง(WT) = Wc x MW(salt base)x1,000 เมอความบรสทธของสารอยในรป Potency PotencyxMW (free base)

9.1.1.4 การค านวณความเขมขนของสารมาตรฐานทเตรยมได ความเขมขนของสารมาตรฐานทเตรยมได Conc. (ppm) = WB x C


WC คอ น าหนกของสารมาตรฐานทค านวณไดจากความเขมขนทตองการเตรยม (g) C คอ ความเขมขนทตองการเตรยม (µg/ml) V คอ ปรมาตรทตองการเตรยม (ml)

.

1, 000

Conc MW Vf

MW

Vf


WB คอ น าหนกสารมาตรฐานทชงไดจรงขณะเตรยม (g) MW (salt base) คอ มวลโมเลกลของสารมาตรฐานทอยในรป Salt base

MW (free base) คอ มวลโมเลกลของสารมาตรฐานทอยในรป free base % Purity คอ ความบรสทธของสารมาตรฐาน (%) Potency คอ ความบรสทธของสารมาตรฐาน (g/mg)

เตรยมสารละลายมาตรฐานผสม Stock mix standard solution (100 µg/ml) โดยชงสารมาตรฐาน Chlortetracycline Oxytetracycline และ Doxycycline ตามน าหนกทค านวณไดจากสตร ขอ 9.1.1.1 - 9.1.1.3 (น าหนกทชง0.0005 g) ดวยเครองชง 5 ต าแหนง ละลายใสลงในขวดวดปรมาตรขวดเดยวกนและปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชาปดฝาใหสนทค านวณความเขมขนของสารละลายมาตรฐานทเตรยมไดจากสตร ขอ 9.1.1.4 ตดปายชบงสถานะสารละลายมาตรฐานเกบทอณหภมไมเกน -20C มอายการใชงาน 6 เดอน 9.1.2 การเตรยม Working mixed standard solutionใชส าหรบสราง Calibration curve เตรยมสารละลายมาตรฐาน ท 6 ระดบความเขมขน คอ 0.1, 0.5, 1, 5, 10 และ 30 µg/ml ใน volumetric flask โดยค านวณปรมาตรของ Stock mix standard solution จากความความเขมขนทเตรยมไดแลว ปเปต Stock mix standard solution ลงในขวดวดปรมาตรและปรบปรมาตรดวยสารละลาย Mobile phase จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ขนตอนการเจอจางสารละลายมาตรฐาน ดงรป (ความเขมขนของ Stock mix standard solution อาจเปลยนแปลงขนอยกบน าหนกสารมาตรฐานทชงไดจรงขณะเตรยม)

Stock standard solution 100 µg/ml (100 ml) Pipette 0.05 ml Pipette 0.25 ml Pipette 0.5 ml Pipette 1.5 ml Std. Conc. 1 µg/ml (5 ml) Std. Conc. 5 µg/ml (5ml) Std. Conc. 10 µg/ml (5ml) Std. Conc. 30 µg/ml (5ml) Pipette 0.25 ml Pipette 0.05 ml Std. Conc. 0.5 µg/ml (5ml) Std. Conc.0.1 µg/ml (5ml)

ตารางท 3.11 ขอมลการเตรยม Working mixed standard solution ปรมาตร 5 ml ความเขมขนของสารละลายมาตรฐานทตองการเตรยม

ความเขมขนของสารละลายมาตรฐานทใชในการเตรยม

ปรมาตรของสารละลายมาตรฐานทใชในการเตรยม

(µg/ml) (µg/ml) (ml)

0.1 10 0.05

0.5 10 0.25

1 100 0.05

5 100 0.25 10 30

100 100

0.50 1.50


9.2 การเกบรกษาสารมาตรฐาน 9.2.1 การเกบรกษาสารมาตรฐาน Oxytetracycline Chlortetracycline และ

Doxycycline ในตควบคมอณหภมทอณหภมทเหมาะสม ดงทระบไวในใบ Certificate ของผผลต หรอตามผผลตก าหนด หรอตามความเหมาะสม

9.2.2 การเกบรกษาสารมาตรฐาน Oxytetracycline Chlortetracycline และ Doxycycline กอนใชงานใหตงทงไวทอณหภมหองประมาณ 30-60 นาท เมอใชเสรจแลวใหพน sealing film ทฝาขวดและเกบเขาตเยนทนทเพอปองกนการเสอมสภาพ

9.2.3 สารละลายมาตรฐาน (Stock mix standard solution) เกบรกษาไวทอณหภมไมเกน -20C มอายการใชงานนานประมาณ 6 เดอนกอนใชงานใหตงทงไวทอณหภมหอง เมอใชเสรจแลวใหพน sealing film ทฝาขวดและเกบเขาตเยนทนทเพอปองกนการระเหยและปองกนการเสอมสภาพ

9.2.4 สารละลายมาตรฐาน (Working mix standard solution) ตองเตรยมใหมทกครงกอนการใชงาน 10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 ขนตอนการเตรยมตวอยางทดสอบ การบดตวอยางทดสอบถกเตรยมโดยงานบดตวอยางตามวธปฏบตงานการจดการตวอยางอาหารสตว 10.2 ขนตอนการทดสอบตวอยางทดสอบโดยตวอยางทดสอบท าการทดสอบแบบ Duplicate (2 ซ า) บนทกรายละเอยดทกขนตอนลงในแบบบนทกการทดสอบสารกลม Tetracyclines โดยเทคนค HPLC 10.2.1 ชงตวอยางอาหารสตว 10 ± 0.05กรม ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.2.2 เตม 0.1 M HCl in Methanol ปรมาตร 50 ml ปดจกและใช sealing film พนจกใหแนน

10.2.3 น าไปเขยาดวยเครองเขยา ความเรว 150 รอบ/นาท นาน 30 นาท 10.2.4 เทสารละลายใสหลอดโพลโพพลน ขนาด 50 ml ปดฝาใหแนนสนท

10.2.5 น าไป Centrifuge ทความเรว 3,500 รอบ/ นาท นานประมาณ 5 นาท ทอณหภม 25 0C 10.2.6 น าสวนใสทไดปรมาตร 10 ml ผสม Deionize water 10 ml เขยาใหเขากนดวยเครอง vortex กรองสารละลายดวยกระดาษกรองชนด GF/A ขนาดเสนผานศนยกลาง 110 mm

10.2.7 เตรยม Solid phase extraction (SPE) column ชนด SCX ขนาด 500 mg ดวยการ condition columnดวย Methanol 2.5 ml และ Deionize water 2.5 ml ตามล าดบเปด Vacuum pump flow rate ประมาณ 5 ml/min ไมควรปลอย packing ใน column แหงกอน Load sample

10.2.8 น าสารละลายจากขอ 10.2.6 ปรมาตร 5 ml ผาน SPE column เปด Vacuum pump flow rate ประมาณ 1 ml/minปลอยใหสารละลายไหลทละหยด

10.2.9 ลาง (Wash) ดวย 0.05 M HCl in Methanol 2.5 ml เปด Vacuum pump flow rate ประมาณ 1 ml/min ปลอยใหสารละลายไหลทละหยดจนหมด และให Vacuum pump flow ตอไปอก 2-4 นาท

10.2.10 Elute ดวย 0.4 M HCl in Methanol 2.5 ml และ Deionize water 2.5 ml 10.2.11 กรองผาน Membrane filter ชนด Nylonขนาด 0.2 µm ลงใน Shell Vial ขนาด

2 ml และน าไปวเคราะหดวยเครอง HPLC


10.2.12 ในกรณตวอยางอาหารไกตรวจพบสารกลม Tetracyclines ความเขมขนสงเกนชวง Working range ใหท าการลดปรมาณการชงตวอยางจาก 10 กรม เหลอ 5 กรม จากนนปฏบตตามขนตอนการทดสอบ ขอ 10.2.2 -10.2.11

10.2.13 ในกรณตวอยางอาหารสกรตรวจพบสารกลม Tetracyclines ความเขมขนสงเกนชวง Working range 1-300 mg/kg ใหท าการลดปรมาณการชงตวอยางจาก 10 กรม เปน 2 กรม และสกดดวย 0.1 M HCl in Methanol ปรมาตร 100 ml จากนนปฏบตตามขนตอนการทดสอบ ขอ 10.2.3-10.2.11

10.2.14 ในกรณทมการใชสารกลม Tetracyclines ชนด Feed grade ในอาหารสตว และตรวจพบปรมาณสาร >150 mg/kg ใหท าการยนยนผลซ าโดยใหท าการลดปรมาณการชงตวอยางจาก 10 กรม เปน 2 กรม และสกดดวย 0.1 M HCl in Methanol ปรมาตร 100 ml จากนนปฏบตตามขนตอนการทดสอบ ขอ 10.2.3-10.2.11 10.3 ขนตอนการเตรยม Sample Blank น าวตถดบอาหารสตวแตละชนดตามตารางท 4 หรออาหารส าเรจรป มาบดใหละเอยด แลวน ามาผสมกนในอตราสวนตามตารางท 4 ท าการทดสอบตามขนตอนวธทดสอบขอ 10.2.1-10.2.11 ผลการทดสอบทไดตองไมพบหรอพบสารกลม Tetracycline นอยกวา LOD เกบตวอยางใสในถงพลาสตกปดปากถงใหมดชดและเกบรกษาทอณหภม 25 + 5 C มอายการใชงาน 3 เดอน

ตารางท 3.12 สตรอาหารส าเรจส าหรบสตวในการเตรยมตวอยาง Sample Blank

10.4 ขนตอนการทดสอบ Negative control 10.4.1 ขนตอนการทดสอบ Reagent blank (1 ซ า/ชดการทดสอบ)

10.4.1.1 น า Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml เตม 0.1 M HCl in Methanol ปรมาตร 50 ml 10.4.1.2 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.2-10.2.11 พรอมตวอยางทดสอบ 10.4.1.3 บนทกรายละเอยดทกขนตอน 10.4.2 ขนตอนการทดสอบ Sample blank (ชนดอาหารสตวละ 1 ซ า/ชดการทดสอบ)

10.4.2.1 ชงตวอยาง Sample Blank (จากขอ 10.3) จ านวน 10 + 0.05 g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.4.2.2 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.2-10.2.11 พรอมตวอยางทดสอบ 10.4.2.3 บนทกรายละเอยดทกขนตอนลงใน work sheet

ล าดบท ชนดวตถดบอาหารสตว ปรมาณวตถดบตอการเตรยม 5 กโลกรม(กรม) อาหารไก อาหารสกร

1 ขาวโพด 3,000 500 2 กากถวเหลอง 1.000 800 3 ร าขาว 400 2,000 4 ปลาปน 200 600 5 ปลายขาว 400 750 6 มนเสน - 350


10.5 ขนตอนการทดสอบ positive control ความเขมขน 1 mg/kg (ชนดอาหารสตวละ 2 ซ า/ชดการทดสอบ) 10.5.1 ชงตวอยาง Sample Blank (จากขอ 10.3) จ านวน 10+ 0.05g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.5.2 เตม Stock mix standard solution ความเขมขน 100 µg/ml (ขอ 9.1.1) ปรมาตร 100 µl

10.5.3 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.2- 10.2.11 พรอมตวอยางทดสอบ 10.5.4 บนทกรายละเอยดทกขนตอน

10.6 การทดสอบประสทธภาพของเครอง HPLC (System suitability test) ตรวจสอบสภาพความพรอมของเครอง HPLC กอนใชงานโดย ท าการตรวจสอบดวยการฉดสารละลายมาตรฐาน Chlortetracycline Oxytetracycline และ Doxycycline ทความเขมขน 1 µg/ml จ านวน 5 ซ า ภายใตสภาวะเดยวกนทงหมด และค านวณหา %RSD of Peak area และ % RSD of RT แลวเปรยบเทยบผลการทดสอบกบขอก าหนดตามตารางท 3.13 บนทกการปฏบตงาน ในกรณททดสอบแลว ผลทไดไมผานเกณฑทก าหนด ใหพจารณาวาจะสงผลกระทบตอผลการทดสอบหรอไม หากพจารณาแลวพบวาสงผลกระทบใหท าการแกไข วเคราะหหาสาเหต ถาไมสามารถแกไขไดใหแจงให ผควบคมทราบ

ตารางท 3.13 ขอก าหนดของการทดสอบประสทธภาพของเครอง HPLC

Parameter ขอก าหนด

1. %RSD of Peak area < 2.5 *

2. %RSD of RT < 1 * * ขอก าหนดอางองตามมาตรฐาน USP


Flow chart แสดงขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย HPLC Sample 10g , (W)

Extraction 0.1 M HCl in Methanol 50 ml , (V ext)

Shake 30 min Centrifuge 5 min ,3,500 rpm/min Supernatant 10 ml , (V supernatant)

add DI 10 ml (VDI ) , total 20 ml (V dilution) - mix with vortex FilterGF/A

Clean up with SPE(SCX ) condition - 2.5 ml Methanol - 2.5 ml DI water Supernatant 5 ml (V clean up) - Wash 0.05 M HCl in Methanol 2.5 ml

Elute 0.4 M HCl in Methanol 2.5 ml and DI water 2.5 ml (V final) Nylon membrane Filter 0.2 µm

HPLC Analysis รปท 3.2 Flow chart แสดงขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย HPLC

10.7 การวเคราะหดวย เครอง HPLC สภาวะของเครอง HPLC

10.7.1 Column : C8ขนาด 4.6 × 250 mm, 5 µm 10.7.2 Mobile phase : 0.01 M Oxalic acid : Methanol : Acetonitrile ( 6.5 : 1.5 : 2.0) , Isocretic

10.7.3 Flow rate : 0.5 ml /min 10.7.4 Column temperature : 25 C

10.7.5 Inject volume : 30 µl 10.7.6 Runtime 30 min 10.7.7 Detector UV 365 nm


11. การค านวณ 11.1 สตรการค านวณปรมาณสารกลม Tetracyclines ทตรวจพบในตวอยางทดสอบ (Conc.) คอ Conc. (mg/kg)= V finalV dilutionV extraction V clean up V supernatantWsample หรอ Conc. (mg/kg) = Sample dilution factor เมอ W คอ น าหนกตวอยางทดสอบ(g) V extraction คอ ปรมาตรของสารละลายทใชในการสกดตวอยาง (ml) V supernatant คอ ปรมาตรสารสกดทจะน าไป dilute ดวย DI water (ml) V dilution คอ ปรมาตรของสารละลายรวม เมอ dilute ดวย DI water แลว (ml) V clean up คอ ปรมาตรสารละลายท Load ลง column SPE (ml) V final คอ ปรมาตรสดทายกอนฉดเครอง (ml) คอ ปรมาณของสารกลม Tetracyclines ทค านวณไดจากสมการของ Standard calibration curve 11.2 ปรมาณสารกลม Tetracycline ทตรวจพบในตวอยางทดสอบ จะถกค านวณโดยอตโนมตดวยโปรแกรมคอมพวเตอรของเครอง HPLC โดยเจาหนาททดสอบจะตองใสคา Sample dilution factor ลงในชอง Sample dilution ของตารางการสงฉดตวอยาง (Sequence)

11.3 เจาหนาททดสอบจะตองท าการทวนสอบผลวเคราะหทไดจากการค านวณจากโปรแกรมคอมพวเตอรของเครอง HPLC อกครงโดยการแทนคา Peak area ของสารกลม Tetracyclines ทพบในตวอยางทดสอบลงในสมการของ Standard calibration curve และคณดวย Sample dilution factor ดงสมการ

Conc. (mg/kg) = Sample dilution factor

เมอ y คอ Peak area ของสารกลม Tetracycline ทพบในตวอยางทดสอบ c คอ intercept ของ standard calibration curve m คอ Slope ของ standard calibration curve

น าคาทค านวณไดเปรยบเทยบกบคาทไดจากการค านวณจากโปรแกรมคอมพวเตอรของเครอง HPLC ซงจะตองไดคาเทากน หากแตกตางกนใหตรวจสอบหาความผดพลาด

11.4 บนทกผลการทดสอบและการค านวณลงใน แบบบนทกการทดสอบสารกลม Tetracycline โดยเทคนค HPLC แบบฟอรมการยนยนผลทดสอบ (Confirmation) และบนทกสรปผลการทดสอบสารกลม Tetracyclines ดวยเทคนค 12. การควบคมคณภาพ 12.1 การควบคมคณภาพผลการทดสอบ 12.1.1 ในทกชดการทดสอบ ประกอบดวย Positive Control จ านวน 2 ซ า/ชนดอาหารสตว ทระดบความเขมขน 1 mg/kg มเกณฑการพจารณาผลตามล าดบ ดงน 12.1.1.1 ตรวจสอบวาผลการทดสอบของ PositiveControl มคา %Recovery อยในชวง 75-120 และ %RPD ไมเกน 11 และถา % Recovery และ % RPD (ตามเกณฑ AOAC) ทไดไมอยในเกณฑทก าหนดตองน าตวอยางทดสอบในชดการทดสอบเดยวกนนกลบไปท าการทดสอบใหมทงชด

y c

m


สตรการค านวณ % Recovery =

เมอ คอ ปรมาณเฉลยของสารกลม Tetracyclines ทตรวจพบในตวอยาง Positive control

คอ ปรมาณสารทตรวจพบใน Sample Blank คอ ปรมาณสารกลม Tetracyclines ทเตมลงในตวอยาง Positive control

และ % RPD =

เมอ คอ ปรมาณสารกลม Tetracyclines ทตรวจพบในตวอยาง Positive control คามาก

คอ ปรมาณสารกลม Tetracyclines ทตรวจพบในตวอยาง Positive control คานอย

คอ ปรมาณเฉลยของสารกลม Tetracyclines ทตรวจพบในตวอยาง Positive control 12.1.1.2 น าขอมลการทดสอบ PositiveControl ของสารกลม Tetracyclines ทง 3 ชนด Plot ลงในแผนภมควบคม X-Chart (%Recovery) และ R-Chart (%RPD) พจารณาวาขอมลอยในชวงทก าหนดหรอไม หากไมอยในชวงทก าหนด ใหกลบไปพจารณาวาอยในเกณฑตามขอ 12.1.1.1 หรอไม (วธการจดท าแผนภมควบคมปฏบตตามวธการปฏบตงาน การจดท าแผนภมควบคม ในการควบคมคณภาพภายในผลทดสอบงานพษวทยาและชวเคม หากพบวาแผนภมมลกษณะทไมปรกตใหวเคราะหหาสาเหต และแจงใหผควบคมทราบเพอด าเนนการแกไขตอไป 12.1.2 ในทกชดการทดสอบ ประกอบดวย NegativeControl ไดแก Reagent Blank จ านวน 1 ซ า และ Sample Blank จ านวน 1 ซ า/ชนดอาหารสตว มเกณฑการพจารณาผล ดงน

12.1.2.1 Reagent Blank จะตองไมพบ Peak ของสารทม Retention time (RT) ตรงกบ Peak ของสารมาตรฐานกลม Tetracyclines หากพบวาม Peak ของสารซงม RT ตรงกบ Peak ของสารมาตรฐานกลม Tetracyclines จะตองน าตวอยางทดสอบในชดการทดสอบเดยวกนนกลบไปท าการทดสอบใหมทงชด

12.1.2.2 Sample Blank จะตองไมพบหรอพบสารกลม Tetracyclines นอยกวาคา LOD หากพบปรมาณมากกวาหรอเทากบคา LOD จะตองน าตวอยางทดสอบชนดอาหารเดยวกนในชดการทดสอบน กลบไปท าการทดสอบใหม 12.1.3 ตวอยางทดสอบใหพจารณาดงน 12.1.3.1 ตวอยางทดสอบ ท าการแปลผลการทดสอบจากโครมาโทแกรมโดยพจารณาวาPeak ของสารทพบในตวอยางทดสอบ ม RT ตรงกบ Peak ของสารมาตรฐานกลม Tetracyclines หรอไม โดย RT ของสารในตวอยางทดสอบ ตองแตกตางจาก RT ของสารมาตรฐานกลม Tetracyclines ไมเกน ±2.5% จงจะสรปวาPeak ดงกลาวเปน peak ของสารกลม Tetracyclines (อางองจาก European commission Decision 2002)

12.1.3.2 ตวอยางทดสอบจะท าการทดสอบแบบ Duplicate (2 ซ า) ทกตวอยาง โดยค านวณหาคาเฉลยของผลการทดสอบตวอยางทดสอบเพอใชในการรายงานผล และค านวณคา % RPD ตองไมเกน 20 หากเกน ผทดสอบตองขอเบกตวอยางใหมและท าการทดสอบตวอยางดงกลาวใหมอกครง

100C C

found blank

Cadd

foundC

blankC

addC

max min 100

mean

C C

C

maxC

minC

meanC


12.1.3.3 ในกรณทมการยนยนผลซ าใหทดสอบแบบ Duplicate (2 ซ า) และใชคาเฉลยของผลการทดสอบจากการยนยนผลซ าในการรายงานผล 12.2 การควบคมคณภาพของเครอง HPLC 12.2.1 ทดสอบประสทธภาพของเครอง HPLC (System suitability test) ตามขอ 10.6 12.2.2 การฉดตวอยางเขาเครอง HPLC ก าหนดใหใน 1 ชดทดสอบ อยางนอยประกอบไปดวย สารละลายมาตรฐานส าหรบตรวจสอบ peak area dift Calibration Standard solution Reagent blank Sample blank Positive control และ test sample เปนตน โดยมล าดบการ Inject ดงตารางท 3.14 หรอปรบตามความเหมาะสม ในกรณทมการเฝาระวง LOD ใหก าหนดล าดบการ Inject ตามความเหมาะสม

12.3 การควบคมคณภาพสารมาตรฐาน 12.3.1 Standard calibration curve ของสารกลม Tetracycline จะตองมคาcorrelation

coefficient ไมนอยกวา 0.995 หากไมเปนไปตามเกณฑทก าหนด ใหเตรยมสารละลายมาตรฐานส าหรบสราง Standard calibration curve ใหม

12.3.2 ตรวจสอบสารมาตรฐาน โดยการฉดสารละลายมาตรฐานทระดบความเขมขน 1 µg/ml จ านวน 5 ซ า หาคาเฉลยของ Peak area และ %RSD แลวน ามา Plot ลงใน แผนภมควบคม X-Chart (Peak area) และ R-Chart (%RSD of Peak area)พจารณาวาขอมลอยในชวงทก าหนดหรอไม ในกรณ R-Chart (%RSD of peak area) หากไมอยในชวงดงกลาวใหพจารณาวาอยในเกณฑตามขอก าหนดของการตรวจสอบประสทธภาพเครองมอดงตารางท 3.13 หากไมอยในเกณฑทก าหนดใหตรวจสอบหาสาเหต หากพบวาเกดจากสารมาตรฐานใหเตรยม standard solution ใหม (วธการจดท าแผนภมควบคม ปฏบตตามวธการปฏบตงาน การจดท าแผนภมควบคม ในการควบคมคณภาพภายในผลทดสอบงานพษวทยาและชวเคม

ตารางท 3.14 ล าดบการ Inject ตวอยางของแตละชด

Sequence run Number of Inject ACN 1

Std 1 µg/ml (PA drift) 1 Calibration Std 0.1 µg/ml 2 Calibration Std 0.5 µg/ml 2

Calibration Std 1 µg/ml 2 Calibration Std 5 µg/ml 2 Calibration Std 10 µg/ml 2 Calibration Std 30 µg/ml 2

Reagent blank 1 Sample blank 1

Positive control-1 1 Positive control-2 1

Test sample 1 1 : :

Test sample n 1 Std 1 µg/ml (PA drift) 1


12.4 ทดสอบ Peak area drift ของ Standard กลม Tetracycline ทความเขมขน 1 µg/ml (ppm) ตองมคา Peak area drift ไมเกน 10% สตรการค านวณ % Peak area drift = Peak area injectinital - Peak area injectfinal) x 100 Peak area Average 12.5 การเฝาระวงทระดบคา LOD ดงตารางท 1 ใหด าเนนการอยางนอย 6 เดอนตอ 1 ครง ใหท าการทดสอบ Positive Control ทระดบ LOD ความเขมขนละ 3 ซ า พรอมกบชดการทดสอบตวอยาง (batch) โดยการเฝาระวงคา LOD ใหพจารณา คา S/N ≥ 3 หากผลการเฝาระวงไมผานตามเกณฑทก าหนดใหท าการ Verify หาคา LOD ทเหมาะสมของวธทดสอบใหม 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช 13.1 แบบบนทกการทดสอบสารกลม Tetracycline โดยเทคนค HPLC 13.2 แบบบนทกสรปผลการทดสอบสารกลม Tetracycline ดวยเทคนค HPLC 13.3 บนทกการเตรยมสารมาตรฐาน (Stock standard) 13.4 บนทกการเตรยมสารเคม 13.5 บนทก System suitability ของเครอง HPLC) 13.6 แบบบนทกการค านวณการประเมนคาความไมแนนอนของสารกลม Tetracycline 13.7 บนทกการเตรยมตวอยาง Blank 13.8 แบบฟอรมการยนยนผลทดสอบ (Confirmation) 13.9 บนทกการเตรยมสารละลายเฟสเคลอนท (Mobile phase) ส าหรบวเคราะหสารกลม Tetracycline ดวยวธ HPLC 14. การรายงานผล การรายงานผลการทดสอบจะรายงานโดยอางองตามคา LOD และ LOQ ตามตารางท1ดงน

14.1 กรณผลการทดสอบไมพบสารกลม Tetracyclines จะรายงานวา “ไมพบ” 14.2 กรณพบสารกลม Tetracyclines ต ากวาคาLOD จะรายงานวา“ไมพบ” 14.3 กรณพบสารกลม Tetracyclines มปรมาณอยในชวงระหวางคา LOD ถงนอยกวาคา LOQ จะรายงานวาพบนอยกวา LOQ ยกตวอยางเชน พบ CTC ในตวอยางอาหารสตวเทากบ 0.7 mg/kg แตคา LOD และ LOQ อยท 0.5 และ 1 mg/kg ตามล าดบ จะรายงานวา“พบนอยกวา 1 mg/kg ”เปนตน

14.4 กรณพบสารกลม Tetracyclines ปรมาณมากกวาหรอเทากบคา LOQ จะรายงานผลโดยใชคาเฉลยของการทดสอบทง 2 ซ า และรายงานผลเปนตวเลขทศนยม 2 ต าแหนง โดยมหนวยเปน mg/kg

14.5 ในกรณทผใชผลทดสอบรองขอการรายงานผลพรอมคาความไมแนนอนของการวด ใหด าเนนการค านวณคาความไมแนนอนตามเอกสารวธปฏบตงานการประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสารกลม Tetracyclines ในอาหารสตวดวยวธ HPLC โดยใหรายงานผลทดสอบ ± คา Uncertaintyพรอมระบระดบความเชอมน เชน “1.02±0.25 mg/kg ทระดบความเชอมน 95% ” 15. รายละเอยดอนๆ 15.1 การทดสอบประสทธภาพของ Solid phase extraction (SPE) ชนด SCX ใหปฏบตตามวธปฏบตงาน การตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและวสดวทยาศาสตรงานพษวทยาและชวเคม 15.2 สภาวะแวดลอมของการทดสอบ เนองจากสารกลม Tetracyclines สามารถเสอมสลายไดงายเมอโดนแสงการปฏบตงานจงควรหลกเลยงบรเวณทมแสงสวางมากเครองแกวทใชในการเตรยมสารมาตรฐานควรเปนสชาหรอหมดวย Aluminium Foil เพอปองกนแสง


15.3 ควบคมอณหภมหองปฏบตการใหอยในชวง 25 ± 5 C 16. เอกสารอางอง 16.1 Andrzej Posyniak, Kamila Mitrowska , Jan Zmudzki and Jolanta Niedzielska. Analytical procedure for the determination of chlortetracycline and 4-epi- chlortetracycline in pig kidneys. Journal of Chromatography A, Volume 1088, Issues 1-2, 2005 page 169-174 16.2 AOAC Guidelines for single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanical, 2002


3.1.3 วธทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS 1. วตถประสงค เพอเปนวธทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสตวดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry 2. ขอบขาย เปนวธการทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสตวชนดอาหารสกร ดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry โดยเปนวธ In house method – base on Animal feeding stuffs – Determination of carbadox content Method using high-performance liquid chromatography,ISO14939 : 2001(E), p 1-13 วธทดสอบนม working range ระหวาง 0.04 – 1.00 mg/kg และมคา Limit of Detection = 0.012 mg/kg และ Limit of Quantification = 0.04 mg/kg 3. เอกสารทเกยวของ

3.1 วธปฏบตงานการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสกรดวยวธ LC- MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry โดยใชเครองยหอ Shimadzu

3.2 วธใชเครอง LC-MS/MS ยหอ Shimadzu รน LCMS-8030 3.3 วธใชเครองชง 5 ต าแหนง ยหอ Sartorius รน ME 215P และ ยหอ Mettler Toledo รน XP

205 DR 3.4 วธใชเครองชง 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน MS1003S 3.5 วธใชเครองเขยาแนวราบ ยหอ Gerhardt 3.6 วธใชเครองเขยาแนวราบ ยหอ Edmund Buhler 3.7 วธใชเครอง Ultrasonic bath ยหอ BRANSON รน B-8200E3

3.8 วธใชเครองปนเหวยงตกตะกอน ยหอ KUBOTA รน 5500 3.9 วธใชเครองปนเหวยงตกตะกอน ยหอ Eppendorf รน 5810R 3.10 วธใชเครองระเหยแหง 3.11 วธใชเครอง Vortex mixer 3.12 วธใช Micropipette 3.13 วธใชตเยน ยหอ Sanyo รน MIR-553 3.14 วธใชเครอง Dispenser 3.15 วธปฏบตงานการจดการตวอยางอาหารสตว 3.16 วธการปฏบตงานการจดท าแผนภมควบคมในการควบคมคณภาพภายในผลทดสอบงานพษวทยาและชวเคม 3.17 วธปฏบตงานการประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสตวดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry 3.18 วธการปฏบตงานการตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและวสดวทยาศาสตรของงานพษวทยาและชวเคม 3.19 วธการปฏบตงานการจดการสารเคมและสารมาตรฐานงานพษวทยาและชวเคม


4.นยาม 4.1 Calibration Matrix หมายถง สารสกดตวอยางส าหรบเตรยม Standard calibration curve เตรยมไดจากการเตมสารมาตรฐาน Carbadox ทระดบความเขมขนตางๆลงใน Sample blank แลวด าเนนการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอน 4.2 Sample Blank หมายถง ตวอยางทไดผานการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอนแลวไมพบสาร Carbadox 4.3 Reagent Blank หมายถง reagent ทใชในระหวางการทดสอบซงไมมสาร Carbadox แลวน ามาทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอน

4.4 Positive Control หมายถง ตวอยางทใชในการควบคมคณภาพผลทดสอบ ท าการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอนพรอมกบการทดสอบตวอยางในชดเดยวกน เพอควบคมความแมน (accuracy) ของการทดสอบในแตละชด 4.5 Negative Control หมายถง Reagent Blank และ Sample Blank ทใชในการควบคมคณภาพผลทดสอบ ท าการทดสอบเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกขนตอนพรอมกบการทดสอบตวอยางในชดเดยวกน เพอควบคมการปนเปอนขามขณะทดสอบหรอความผดพลาดอนๆของการทดสอบในแตละชด 5. หลกการ ในการทดสอบหาปรมาณสาร Carbadox ในอาหารสตว มหลกการคอสกดดวยตวท าละลาย Acetonitrile 25 ml และ Methanol 25 ml แลวน าไปเขยาดวยเครองเขยานาน 30 นาท หลงจากนนน าสวนใสปนเหวยงใหตกตะกอนความเรว 3,500 รอบ/นาท นาน 5 นาท แลวน าไปผาน Alumina column แลวน าสวนใสทไดไประเหยจนแหง น ามาเตม mobile phase และวเคราะหดวยเครอง LC-MS/MS

ตารางท 3.15 โครงสรางและ Parent / Product ion ของสาร Carbadox Structure Parent ion Product ion

263 130, 203, 231*

6. ความปลอดภย 6.1 ในการเตรยมสารละลาย Formic acid ซงมฤทธกดกรอนเปนอนตรายตอผวหนงและระบบการหายใจตองเตรยมในตดดควน (Hood) ดวยความระมดระวง 6.2 การก าจดของเสยแยกตามชนดของเสยทตองการก าจด สารละลายทไดจากการสกดเมอสนสดการวเคราะหแลว ก าจดโดยแยกของเหลวและกากอาหารสตวกอนเทลงในขวดส าหรบบรรจของเสย (Waste bottle) ระบชนดของเสยไวขางขวดดวยตวอกษรทมองเหนชดเจน 6.3 สารเคมทเลกใชตองแยกชนดของสารเคมทจะก าจด เนองจากสารเคมบางตวเขากนไมไดและอาจเกดอนตรายตอผวเคราะหเทสารเคมทตองการทงลงในขวดก าจดสารเคมและท าในตดดควน (Hood) ระบชนดของสารเคมทตองการทงใหเหนชดเจนเพอปองกนการหยบผด ไมตงไวใกลทอแกสและในทอณหภมสง

http://en.wikipedia.org/wiki/File:Carbadox.svg


7. อปกรณและเครองมอ 7.1 เครองมอ 7.1.1 เครอง Liquid Chromatography Mass spectrometer – Mass spectrometer (Triple quadrupole) ยหอ Shimadzu รน LCM-8030

7.1.2 เครองชงทศนยม 5 ต าแหนง ยหอ Sartorius รน ME215P หรอยหอ Mettler Toledo รน XP 205 DR 7.1.3 เครองชงทศนยม 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน MS1003S 7.1.4 เครองเขยาตวอยาง (Shaker) ยหอ Gerhardt หรอ Edmund รน SM-30 7.1.5 เครอง Ultrasonic bath 7.1.6 เครอง Centrifuge , KUBOTA รน5500 หรอยหอ Eppendorf รน 5810R 7.1.7 เครองระเหยสารตวอยาง (Nitrogen Evaporater) S/N TV0751N 7.1.8 เครอง Vortex mixer 7.1.9 Micropipette ขนาด 10-100 µl, 100-1,000 µl และ 1-10 ml 7.1.10 ชดกรองเฟสเคลอนท (Mobile phase) 7.1.11 ตเยน 2-8 °C ยหอ Sanyo รน MIR553 7.1.12 Dispenser ขนาด 50 ml 7.2 อปกรณ 7.2.1 คอลมน (Column) C18 ขนาด 5 cm x 3.0 mm , 2.7 µm

7.2.2 Solid phase extraction (SPE) ชนด Aluminium oxideขนาด 4 g /35 ml 7.2.3 Centrifuge tube ชนด polypropylene ขนาด 50 ml 7.2.4 Disposable syringe ขนาด 3 ml 7.2.5 Syringe membrane filter ชนด Nylon ขนาด 0.2 µm, เสนผานศนยกลาง 13 mm 7.2.6 Laboratory sealing film 7.2.7 Tip ขนาด 10-100 µl, 100-1,000 µl และ 1-10 ml

7.3 เครองแกว 7.3.1 Volumetric flask ขนาด 1000,100, 250 และ 50 ml 7.3.2 Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 7.3.3 Beaker ขนาด 10,50 และ 250 ml 7.3.4 Cylinder ขนาด 50 และ 100 ml 7.3.5 Glass vial สชา ขนาด 2 และ 50 ml 7.3.6 Glass vial สใส ขนาด 2 และ 50 ml 7.3.7 Volumetric pipette ขนาด 2 ml และ 25 ml


8.1.1 อะซโตไนไทรล (Acetonitrile : CH3CN) ชนด AR และ HPLC grade 8.1.2 กรดฟอรมก (Formic acid : HCOOH) 8.1.3 เมทานอล (Methanol : CH3OH) ชนด AR และ HPLC grade

8.1.4 น าปราศจากไอออน (Deionized water) ความตานทานไฟฟา ≥ 18.2 M/CM


8.2 การเตรยมสารละลาย 8.2.1 การเตรยมสารละลาย Mobile phase (0.1 % Formic acid)

ค านวณปรมาตรการเตรยมตามสตร C1 X V1 = C2 X V2 เมอ C1 = ความเขมขนของสารทใชในการเตรยม

C2 = ความเขมขนของสารละลายทตองการเตรยม V1 = ปรมาตรของสารทใชในการเตรยม V2 = ปรมาตรของสารละลายทตองการเตรยม

ปเปตกรด Formic ปรมาตรตามทค านวณได ลงในขวดวดปรมาตรทม Deionized water อยประมาณ 1/3 ของปรมาตรทงหมด ปรบปรมาตรดวย Deionized water จนถงขดบอกปรมาตร น าไปกรองผานแผนกรองชนด Nylon ขนาด 0.45 µm โดยใชชดกรองเฟสเคลอนท (Mobile phase) มอายการใชงานไมเกน 7 วนบนทกลงในแบบบนทกการเตรยมสารเคม 9. สารมาตรฐาน สารมาตรฐานทใช Carbadox (ความบรสทธไมนอยกวา 98%) 9.1 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน (Preparation of standard solution) 9.1.1 Stock Standard Solution (100 µg/ml) 9.1.1.1 การค านวณน าหนกสารมาตรฐานทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WC) = C x V 106 9.1.1.2 กรณทสารมาตรฐานอยในรป Free base ใหค านวณน าหนกทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WT) = Wc X 100 เมอความบรสทธของสารอยในรป %Purity % Purity หรอ น าหนกทตองชง(WT) = Wc X 1,000 เมอความบรสทธของสารอยในรป Potency Potency 9.1.1.3 กรณทสารมาตรฐานอยในรป Salt base ใหค านวณน าหนกทตองชงตามสตร น าหนกทตองชง(WT) = Wc x MW(salt base)x100 เมอความบรสทธของสารอยในรป %Purity % Purity x MW (free base)

หรอ น าหนกทตองชง(WT) = Wc x MW(salt base)x1,000 เมอความบรสทธของสารอยในรป Potency Potency x MW (free base)

9.1.1.4 การค านวณความเขมขนของสารมาตรฐานทเตรยมได ความเขมขนของสารมาตรฐานทเตรยมได Conc. (µg/ml) = WB x C


WC คอ น าหนกของสารมาตรฐานทค านวณไดจากความเขมขนทตองการเตรยม (g) C คอ ความเขมขนทตองการเตรยม (µg/ml)

V คอ ปรมาตรทตองการเตรยม (ml) WB คอ น าหนกสารมาตรฐานทชงไดจรงขณะเตรยม (g)


MW (salt base) คอ มวลโมเลกลของสารมาตรฐานทอยในรป Salt base MW (free base) คอ มวลโมเลกลของสารมาตรฐานทอยในรป free base

% Purity คอ ความบรสทธของสารมาตรฐาน (%) Potency คอ ความบรสทธของสารมาตรฐาน (µg/mg)

ชงสารมาตรฐานตามน าหนกทค านวณไดจากสตรขอ 9.1.1.1- 9.1.1.3 (น าหนกทชง ± 0.0005 g) ดวยเครองชง 5 ต าแหนง ละลายใสลงในขวดวดปรมาตรและปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชาปดฝาใหสนท ค านวณความเขมขนทเตรยมไดจากสตรขอ 9.1.1.4 ตดปายบงชสถานะสารละลายมาตรฐานและเกบทอณหภม 2-8˚C มอายการใชงาน 6 เดอน

9.1.2 Intermediate standard solution I (25 µg/ml) ค านวณปรมาตรของ Stock standard solution จากความความเขมขนทเตรยมได

แลวปเปต Stock standard ลงในขวดวดปรมาตรปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตรเขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชาปดฝาใหสนท มอายการใชงาน 2 เดอน และเกบทอณหภม 2-8 ˚C 9.1.3 Intermediate standard solution II (1 µg/ml) ค านวณปรมาตรของ Intermediate standard solution I แลวปเปต Intermediate standard I ลงในขวดวดปรมาตรปรบปรมาตรดวย Methanol จนถงขดบอกปรมาตรเขยาใหเขากน ถายใสขวดบรรจสารละลายสชาปดฝาใหสนท มอายการใชงาน 2 เดอน และเกบทอณหภม 2-8 ˚C 9.1.4 Working standard solution (10 ng/ml) ใชส าหรบทดสอบ System suitability ของเครอง LC-MS/MS ค านวณปรมาตรของ Intermediate standard solution II (1 µg/ml) แลวปเปตใสลงในขวดวดปรมาตรปรบปรมาตรดวย mobile phase จนถงขดบอกปรมาตร เขยาใหเขากนเตรยมใหมทกครงกอนการใชงาน

9.2 การเกบรกษาสารมาตรฐาน 9.2.1 การเกบรกษาสารมาตรฐาน Carbadox ในตควบคมอณหภมทอณหภมทเหมาะสม

ดงทระบไวในใบ certificated ของผผลต หรอตามทผผลตก าหนดหรอตามความเหมาะสม 9.2.2 เมอตองการใชงานตองน าสารมาตรฐานออกจากตควบคมอณหภมและตงทงไวท

อณหภมหองประมาณ 30-60 นาท กอนการใชงาน เมอใชงานเสรจแลวใหพน sealing film ทฝาขวด และเกบเขาตควบคมอณหภมทนทเพอปองกนการเสอมสภาพ 10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 ขนตอนการเตรยมตวอยางทดสอบ การบดตวอยางทดสอบถกเตรยมโดยงานบดตวอยางตามวธปฏบตงานการจดการตวอยางอาหารสตว

10.2 ขนตอนการทดสอบ การเตรยมตวอยางทดสอบ ทกขนตอนตองบนทกรายละเอยด 10.2.1 ชงตวอยาง 10.00 ± 0.05g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.2.2 เตม Methanol ปรมาตร 25 ml 10.2.3 เตม Acetonitrile ปรมาตร 25 ml ปดจกและใช Sealing film พนจกใหแนน 10.2.4 น าไปเขยาดวยเครอง Shaker ความเรว 150 รอบ/นาท นาน 30 นาท


10.2.5 เทสารละลายใสหลอดโพลโพรพลน ขนาด 50 ml และปดฝาใหแนน 10.2.6 น าไป Centrifuge ทความเรว 3,500 รอบ/ นาท นาน 5 นาทอณหภม 25˚C 10.2.7 น าสารละลายสวนใสทไดประมาณ 15 ml ผาน SPE (Aluminium oxide) โดยทง 2 ml แรกเกบสวนทเหลอ 10.2.8 น าสารละลาย 4 ml ไประเหยแหงดวยเครอง Turbovab ทอณหภม 40 ± 2oC ความดนไมเกน 5 psi ใชเวลาประมาณ 15 นาท จนกระทงแหงพอด 10.2.9 น าสารละลายทระเหยแหง เตม 0.1% Formic acid ปรมาตร 2 ml และเขยาดวยเครอง Ultrasonic bath นาน 2-3 นาท 10.2.10 กรองสารละลายผาน Membrane filter ชนด Nylon ขนาด 0.2 µm ลงใน glass vial ขนาด 2 ml และน าไปวเคราะหดวยเครอง LC-MS/MS 10.2.11 ในกรณทตวอยางตรวจพบสาร Carbadox มความเขมขนสงเกนชวง Working range คอมคามากกวา 1 ถง 20 mg/kg ใหท าการเจอจางสารละลายกอนฉดในอตราสวนทเหมาะสมใหคา peak area อยในชวงของ Calibration curve 10.3 ขนตอนการเตรยมตวอยาง Sample blank น าวตถดบอาหารสตวแตละชนดตามตารางท 3.16 มาบดใหละเอยดหรอใชอาหารสตวส าเรจรปมาบดใหละเอยด ท าการทดสอบตามขนตอนวธทดสอบขอ 10.2.1-10.2.10 ผลการทดสอบทไดตองไมพบหรอพบสาร Carbadox นอยกวา LOD น าวตถดบทผานการทดสอบแลวมาผสมกนในถงพลาสตกตามอตราสวนของสวนผสมอาหารสตวตามตารางท 2 ผสมใหเปนเนอเดยวกนเกบตวอยางใสในถง บนทกการเตรยมตวอยาง Sample blank และเกบรกษาทอณหภม 25 ± 5˚C มอายการใชงาน 3 เดอน

ตารางท 3.16 สตรอาหารสตวผสมส าเรจรปส าหรบสกรในการเตรยมตวอยาง Blank ล าดบท ชนดวตถดบอาหารสตว ปรมาณวตถดบตอการเตรยม 5 กโลกรม (กรม)

1 ขาวโพด 500 2 กากถวเหลอง 800 3 ร าขาว 2,000 4 ปลาปน 600 5 มนเสน 350 6 ปลายขาว 750

10.4 ขนตอนการเตรยม Negative control 10.4.1 Reagent blank 10.4.1.1 น า Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml เตม MeOH ปรมาตร 25 ml และ ACN ปรมาตร 25 ml 10.4.1.2 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.4-10.2.10 พรอมตวอยางทดสอบ 10.4.1.3 บนทกรายละเอยดทกขนตอน 10.4.2 Sample blank 10.4.2.1 ชงตวอยาง 10.00 ± 0.05g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.4.2.2 เตม MeOH ปรมาตร 25 ml และ ACN ปรมาตร 25 ml 10.4.2.3 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.4-10.2.10 พรอมตวอยางทดสอบ


10.4.2.4 บนทกรายละเอยดทกขนตอน 10.5 การเตรยมตวอยาง positive control ความเขมขน 0.04 mg/kg 10.5.1 เตรยมโดยชงตวอยาง Sample blank (จากขอ 10.3) จ านวน 10.00 ± 0.05 g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml จ านวน 2 flask

10.5.2 เตม Intermediated standard solution I (25 µg/ml) ปรมาตร 16µl 10.5.3 ด าเนนการทดสอบตามขอ 10.2.2-10.2.10 พรอมตวอยางทดสอบ

10.5.4 บนทกรายละเอยดทกขนตอน 10.6 การเตรยม Standard Calibration matrix Solution

เตรยม Standard Calibration matrix Solution ทระดบความเขมขนตางกน 6 ระดบความเขมขน ความเขมขนละ 1 ซ าโดยใช Standard Calibration matrix Solution ทระดบความเขมขน 0.04, 0.10, 0.20, 0.50, 0.75 และ 1.00 mg/kg โดยเตรยมดงน 10.6.1 ชงตวอยาง Sample blank (จากขอ 10.3) จ านวน 10.00 ± 0.05 g ใสใน Erlenmeyer flask ขนาด 250 ml 10.6.2 เตม Intermediated Standard Solution I (25 µg/ml) ลงใน Erlenmeyer flask ตามตารางท 3.17 แลวน าไปทดสอบตามขอ 10.2.2-10.2.10 10.6.3 บนทกการเตรยมและผลทดสอบ

ตารางท 3.17 ขอมลการเตรยม Standard Calibration matrix Solution Concentration

Standard Calibration matrix Solution

(mg/kg)

Concentration Intermediate

standard Solution (µg/ml)

Volume of Intermediate standard Solution

(µl)

0.04 0.10 0.20 0.50 0.75 1.00

25 25 25 25 25 25

16 40 80 200 300 400

10.7 การทดสอบประสทธภาพของเครอง LC-MS/MS (System suitability test)

ตรวจสภาพความพรอมของเครองกอนการใชงานโดย ท าการตรวจสอบดวยการฉดสารละลายมาตรฐาน Carbadox ทความเขมขน 10 ng/ml จ านวน 5 ซ า ภายใตสภาวะเดยวกน และ ค านวณหา S/N, %RSD of Peak area และ %RSD of RT แลวเปรยบเทยบผลการทดสอบกบขอก าหนดตามตารางท 3.18 ในกรณททดสอบแลวผลทไดไมผานเกณฑทก าหนด ใหท าการแกไขวเคราะหหาสาเหต ถาไมสามารถแกไขไดใหแจงใหผควบคมทราบ


ตารางท 3.18 ขอก าหนดของการทดสอบประสทธภาพของเครอง LC-MS/MS Parameter ขอก าหนด

1. S/N 50* 2. %RSD of Peak area 2.5** 3. %RSD of RT 1**

*ขอก าหนดอางองจากผลการทดลอง **ขอก าหนดอางองตามมาตรฐาน USP

Flow chart ขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย LC-MS/MS Sample 10 g

Methanol : Acetonitrile ( 25 : 25 ml)

- Shake 30 min - Centrifuge 5 min, 3,500 rpm, 25 ˚C

Clean up with SPE (Aluminium oxide)

Apply filtrate to SPE (Aluminium oxide) - Discard first 2 ml of eluate - Collect of eluate Pipette 4 ml in tube

- Evaporate to near dryness Dissolve residue with 2 ml 0.1 % Formic acid (MP)

LC- MS/MS Analysis

รปท 3.3 Flow chart ขนตอนการสกดตวอยางกอนวเคราะหดวย LC-MS/MS 10.8 การวเคราะหดวยเครอง LC-MS/MS Triple Quardrupole ยหอ Shimadzu 10.8.1 สภาวะของเครอง HPLC HPLC Condition Column : C18 ขนาด 5 cm x 3.0 mm , 2.7 µm

Solvent A : 0.1 % Formic acid Solvent B : Acetonitrile

Run time : 4 min Column temperature : 25˚C

Injection Volume : 10 µl


LC Program Time (min : sec) % A % B Flow (ml/min)

0.30 65 35 0.2 1.00 10 90 0.2 1.50 10 90 0.2 1.51 65 35 0.2 4.00 Stop 10.8.2 MS Parameters CID Gas : 230 kPa DL Temperature : 300˚C Nebulizing gas flow : 1.5 L/min Drying gas flow : 15 L/min Polarity : Positive mode Interface : ESI Precursor ion Daughter ion Dwell Time Q1 Pre Bias CE Q3 Pre Bias m/z m/z (msec) (v) (v) 263.20 231.10 90.0 -28.0 -10.5 -26.0 263.20 203.10 90.0 -29.0 -11.8 -31.0 263.20 130.00 90.0 -29.0 -27.6 -24.0 11. การค านวณ 11.1 ปรมาณสารทสนใจทพบในตวอยาง ( X ) X = y - b Sample dilution factor a

โดย X = ความเขมขนของสารทสนใจทมอยในตวอยาง(mg/kg) y = Peak Area ของ product ion* (Primary ion)

a = ความชนของ calibration curve b = จดตดแกน Y ของ calibration curve เมอมการเจอจางตามขอ 10.2.11 ใหน าคาทค านวณไดมาคณ factor ของการเจอจางตวอยาง 11.2 การค านวณ % Ion ratio % Ion ratio = Peak Area ของ product ion (secondary ion) 100 Peak Area ของ product ion (primary ion)


11.3 ผลการทดลองและการค านวณผล 11.4 สรปผลการทดสอบ 12. การควบคมคณภาพ

12.1 ทดสอบตวอยาง Positive Control จ านวน 2 ตวอยาง ในทกชดการทดสอบทความเขมขน 0.04 mg/kg มหลกเกณฑพจารณา คอ % Recovery ตองอยในชวง 70-125 และ %RPD ไมเกน 15 (ตามเกณฑ AOAC) และถา % Recovery และ %RPD ทไดไมอยในเกณฑทก าหนด ตองน าตวอยางทดสอบกลบไปท าการทดสอบใหมทงชด

สตรการค านวณ % Recovery = 100C C

found blank

Cadd

เมอ foundC คอ ปรมาณเฉลยของสาร Carbadox ทตรวจพบในตวอยาง Positive control

blankC คอ ปรมาณสาร Carbadox ทตรวจพบใน Sample Blank addC คอ ปรมาณสาร Carbadox ทเตมลงในตวอยาง Positive control

และ % RPD = max min 100

mean

C C

C

เมอ maxC คอ ปรมาณสาร Carbadox ทตรวจพบในตวอยาง Positive control คามาก minC คอ ปรมาณสาร Carbadox ทตรวจพบในตวอยาง Positive control คานอย meanC คอ ปรมาณเฉลยของสาร Carbadox ทตรวจพบในตวอยาง Positive control

ผลการทดสอบตวอยาง Positive Control น ามาควบคมคณภาพดวย Control chart เพอพจารณาแนวโนมของผลการทดสอบ (ปฏบตตามวธการปฏบตงานการจดท าแผนภมควบคมในการควบคมคณภาพภายในผลทดสอบงานพษวทยาและชวเคม หากพบวาแผนภมมลกษณะทไมปกตใหวเคราะหหาสาเหต และแจงใหผควบคมทราบเพอด าเนนการแกไขตอไป 12.2 ทดสอบ Negative Control (Reagent blank และ Sample blank) ทกชดการทดสอบ 12.2.1 ทดสอบ Reagent blank จ านวน 1 ตวอยาง ผลทไดตองไมพบ ถาผลเปน Positive จะตองน าตวอยางทดสอบในชดการทดสอบเดยวกนนกลบไปท าการทดสอบใหมทงชด

12.2.2 ทดสอบ Sample blank จ านวน 1 ตวอยาง ผลทไดตองไมพบหรอพบสาร Carbadox นอยกวาคา LOD หากพบปรมาณมากกวาหรอเทากบคา LOD จะตองน าตวอยางทดสอบชนดอาหารเดยวกนในชดการทดสอบนกลบไปท าการทดสอบใหม

12.3 ตวอยางทดสอบใหพจารณา ดงน 12.3.1 การทดสอบตวอยางทกๆ 10 ตวอยาง จะตองท าซ าแบบ Duplicate อยางนอย 1

ตวอยาง โดยการเลอกตวอยางแบบสม จากผลการทดสอบเบองตนน หากพบสาร Carbadox ใหท าการยนยนผลทดสอบตวอยางอกอยางนอย 2 ซ า แลวค านวณคาเฉลยของผลทดสอบจากการยนยนผลการทดสอบดวย LC-MS/MS เพอใชในการรายงานผล

12.3.2 การพจารณาผลหากปรมาณของสารอยในชวงความเขมขน 0.04 mg/kg ถงไมเกน 0.10 mg/kg คา % RPD ตองไมเกน 30 และความเขมขนมากกวา 0.10 mg/kg คา % RPD ตองไมเกน 20 หากเกนเกณฑก าหนด ผทดสอบตองขอเบกตวอยางใหมและท าการทดสอบตวอยางดงกลาวใหมอกครง


12.3.3 Retention time (RT) ของสาร Carbadox ทพบในตวอยางทดสอบ ตองแตกตางจาก RT เฉลยของสารมาตรฐาน Carbadox ใหอยในชวง ± 2.5 % (อางองจาก European commission Decision 2002) 12.4 การฉดตวอยางเขาเครอง LC-MS/MS ก าหนดใหใน 1 ชดทดสอบ อยางนอยประกอบไปดวย สารละลายมาตรฐาน ส าหรบตรวจสอบ peak area drift Standard calibration matrix solution Reagent blank Sample blank Positive control และ Test sample เปนตน โดยมล าดบการ Inject ดงตารางท 3.19 หรอปรบตามความเหมาะสม กรณทมการเฝาระวงคา LOD ใหก าหนดในล าดบการ inject ตามความเหมาะสม ตารางท 3.19 ล าดบการ Inject ตวอยางของแตละชด

Sequence run Number of Inject MeOH 1

Std 100 ng/ml (PA drift) 1 Standard Calibration matrix solution 0.04 mg/kg 3 Standard Calibration matrix solution 0.10 mg/kg 3 Standard Calibration matrix solution 0.20 mg/kg 3 Standard Calibration matrix solution 0.50 mg/kg 3 Standard Calibration matrix solution 0.75 mg/kg 3 Standard Calibration matrix solution 1.00 mg/kg 3

Reagent blank 1 Sample blank 1

Positive control-1 1 Positive control-2 1

Test sample-1 1

Test sample n 1 Std 100 ng/ml (PA drift) 1

12.5 % Ion ratio ของ peak ของสาร Carbadox ทพบในตวอยาง positive control และ peak ทตรวจพบในตวอยางทดสอบ ตองอยในเกณฑการยอมรบเมอเทยบกบคาเฉลยของ % Ion ratio ของสารมาตรฐาน ดงตารางท 3.20 ตารางท 3.20 เกณฑการยอมรบ % Ion ratio (อางองจาก European commission Decision 2002)

คาเฉลย % IR ของสารมาตรฐาน เกณฑการยอมรบ 50%

20% to 50% 10% to 20%

10%

20% 25% 30% 50%


12.6 ทดสอบ Peak area drift ของสารละลายมาตรฐาน Carbadox ทความเขมขน 100 ng/ml (ppb) ตองมคา Peak area drift ไมเกน ±30%

สตรการค านวณ % Peak area drift = Peak area initial- Peak area final x 100 Peak area average

12.7 การเฝาระวงทระดบคา LOD อยางนอย 6 เดอนตอ 1 ครง ใหท าการทดสอบ Positive Control ทระดบ LOD จ านวน 3 ซ า พรอมกบชดการทดสอบตวอยาง (batch) โดยการเฝาระวงคา LOD ใหพจารณาคา S/N ≥ 3 และ % Ion ratio ตองอยในเกณฑการยอมรบเมอเทยบกบคาเฉลย % Ion ratio ของสารมาตรฐาน ดงแสดงในตารางท 3.20 หากผลการเฝาระวงไมผานเกณฑทก าหนดใหท าการ verify หาคา LOD ทเหมาะสมของวธทดสอบใหม 12.8 การควบคมคณภาพสารมาตรฐานพจารณาจาก Standard calibration curve ของสาร Carbadox จะตองมคา Correlation coefficient (R2) ไมนอยกวา 0.995 หากไมเปนไปตามเกณฑทก าหนดใหเตรยม Standard Calibration matrix solution ส าหรบสราง Standard calibration curve ใหม 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช 13.1 บนทกการทดสอบสาร Carbadox ดวยวธ LC-MS/MS 13.2 บนทกสรปผลการทดสอบ Carbadox 13.3 บนทกการเตรยมสารมาตรฐาน Stock standard

13.4 บนทกการเตรยม Intermediate standard solution 13.5 บนทกการเตรยมสารเคม

13.6 บนทก System suitability test ของเครอง LC-MS/MS ส าหรบวเคราะหสาร Carbadox 13.7 บนทกการเตรยมตวอยาง Blank

14. การรายงานผล การรายงานผลการทดสอบจะรายงานโดยอางองตามคา Limit Of Detection (0.012 mg/kg) และ Limit Of Quantification (0.04 mg/kg) ดงน 14.1 กรณผลการทดสอบไมพบสาร Carbadox จะรายงานวา “ไมพบ”

14.2 กรณพบสาร Carbadox ปรมาณต ากวา LOD คอนอยกวา 0.012 mg/kg จะรายงานวา “ไมพบ”

14.3 กรณพบสาร Carbadox ปรมาณอยในชวงระหวาง LOD ถงนอยกวา LOQ รายงานวา พบนอยกวา LOQ ยกตวอยาง เชน พบสาร Carbadox ในตวอยางอาหารสตวทระดบ 0.03 mg/kg แตคา LOQ อยท 0.04 mg/kg ดงนนจะรายงานวา “พบนอยกวา 0.04 mg/kg” เปนตน

14.4 กรณทพบสาร Carbadox มปรมาณมากกวาหรอเทากบคา LOQ จะรายงานผลโดยใชคาเฉลยของการทดสอบทง 2 ซ า และรายงานผลเปนตวเลขทศนยม 2 ต าแหนง โดยมหนวยเปน mg/kg 14.5 ในกรณทผใชผลทดสอบรองขอการรายงานผลพรอมคาความไมแนนอนของการวด ใหด าเนนการค านวณคาความไมแนนอนตามเอกสารวธปฏบตงานการประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสาร Carbadox ในอาหารสตวดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass Spectrometry


โดยรายงานผลการทดสอบ ± คาUncertainty พรอมระบความเชอมน เชน 0.49 ± 0.13 mg/kg ทระดบความเชอมนท 95 % 15.รายละเอยดอนๆ 15.1 ควบคมอณหภมหองปฏบตการใหอยในชวง 25 ± 5 ˚C 15.2 การทดสอบประสทธภาพของ Solid phase extraction (SPE) ชนด Aluminium oxide ใหปฏบตตามวธปฏบตงานการตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและวสดวทยาศาสตรงานพษวทยาและชวเคม 16. เอกสารอางอง 16.1 ISO 14939:2001(E). 2001.Animal feeding stuffs Determination of carbadox content Method using high performance liquid chromatography. International Standard Switzerland. 16.2 AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 2002 16.3 European Commission Decision 2002/65/EC of 12 August 2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results. Official Journal of the European Communitie. 2002 L221/8


3.1.4 วธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection 1. วตถประสงค

เพอใชเปนคมอในการทดสอบสารกลม Aflatoxins ซงประกอบดวย AflatoxinB1, Aflatoxin B2, Aflatoxin G1 และAflatoxin G2 ในอาหารสตวดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection 2. ขอบขาย

ทดสอบหาชนดและปรมาณ AflatoxinB1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 และ AflatoxinG2 ในอาหารสตวดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดยใชเครอง HPLC-Fluorescence Detection เปนเครองตรวจวด โดยมคา Working range LOD และ LOQ ตามตารางท 3.21

ตารางท 3.21 คา Working range, LOD และ LOQ ของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว

ดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection Parameter AFG2 AFG1 AFB2 AFB1

1. Working range (g/Kg) 2. LOD Aflatoxin (g/Kg) 3. LOQ Aflatoxin (g/Kg)

1.5 - 25 0.7 1.5

2.5 - 50 1.0 2.5

1.0 – 25 0.4 1.0

1.5 - 50 0.7 1.5

3. เอกสารทเกยวของ

3.1 คมอการใชเครอง HPLC ยหอ Agilent รน HP 1100 3.2 คมอการใชเครองชงไฟฟาทศนยม 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน PG 603-S, 3.4 คมอการใช Shaker ยหอ Gerhardt 3.4 คมอการใช Vortex mixer ยหอ Genie รน Genie-2 3.5 คมอการใชตดดควนสารเคม ยหอ EASY LAB รน FUMECUPBOARD 3.6 คมอการใช Micro Pipette ขนาด 2 – 20 µL 3.7 คมอการใช Micro Pipette ขนาด 10 – 100 µL 3.8 คมอการใช Micro Pipette ขนาด 500 µL 3.9 คมอการใช Micro Pipette ขนาด 100 - 1,000 µL 3.10 คมอการใช Micro Pipette ขนาด 1,000 - 5,000 µL 3.11 คมอการใช Dispensor ขนาด 100 ml 3.12 คมอการใชเครองลดปรมาตรสารละลาย รน Organonation ยหอ OA-SYS 3.13 คมอการใชตแชเยน ยหอ CHILLED รน PT 203 3.14 คมอการใชเครอง Ultra sonic ยหอ Branson รน 8200 3.15 วธการใชเครอง UV Spectrophotometer ยหอ JASCO รน V-550และยหอ GBC รน

Cintra 404 3.16 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบโดย HPLC LC-MS และ LC-MS/MS 3.17 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว(ขาวโพด)ดวย IAC-Post

Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection


3.18 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (อาหารไก) ดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

3.19 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (อาหารโคและกระบอ) ดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

3.20 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว(อาหารสกร) ดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

3.21 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (ปลาปน) ดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

3.22 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสารพษจากเชอราโดย HPLC, LC-MS และ LC-MS/MS

3.23 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction 4. นยาม

4.1 Aflatoxin เปนสารพษทสรางจากเชอราแอสเปอรจลสฟลาวส (Aspergillus flavus) และแอสเปอรจลส พาราซตคส (Aspergillus parasiticus) มกพบปนเปอนในเมลดธญพช พชน ามนตางๆ อาหารสตวตาง ๆ และวตถดบอาหารสตว เชน ขาวโพด ปลายขาว ร าสด ร าสกดน ามน กากถวเหลอง กากถวลสง เปนตน สารพษในกลมอะฟลาทอกซน (Aflatoxins) ไดแก Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 และ Aflatoxin G2 ในธรรมชาตเชอราจะผลต Aflatoxin B1 ในปรมาณมากกวาชนดอนๆ โดยทระดบความเปนพษตอมนษยและสตวจากมากไปหานอยคอ AFB1>AFG1>AFB2>AFG2 สารพษเหลานมโครงสรางทางเคมดงน

AF B1 AFB2

AF G1 AFG2

รปท 3.4 โครงสรางทางเคมของสาร Aflatoxin B1, B2, G1 และ G2

4.2 อาหารสตว หมายถง วตถทมงหมายเพอใชเลยงสตว ทรฐมนตรโดยค าแนะน าของคณะกรรมการควบคมคณภาพอาหารสตว ประกาศเปนอาหารสตวทใชในราชกจจานเบกษา แบงเปน 5 ประเภท คอ วตถดบ วตถทผสมแลว ผลตภณฑนมส าหรบสตว อาหารเสรมส าหรบสตว และอาหารสตวผสมยา


4.3 IAC (Immunoaffinity column) หมายถง คอลมนทใชในการ clean up ตวอยางโดยภายในคอลมนบรรจดวยแอนตบอด (Antibody) ทมความจ าเพาะตอสารนน ๆ

4.4 Post Column Photochemical Reaction หมายถง การท าปฏกรยาของสารในทอผานหลอด UV ในการเปลยนรปใหสามารถตรวจวดไดโดย Fluorescence detector

4.5 Sample Blank หมายถง ตวอยางททดสอบแลวไมพบสารทสงสย 4.6 Fortified Sample หมายถง Sample Blank ทน ามาเตมสารมาตรฐาน ในระดบทผทดสอบ

ทราบ เพอใหผทดสอบใชในการควบคม % recovery ของการทดสอบ 4.7 Reagent blank หมายถง สารเคมทใชในการทดสอบ โดยท าเชนเดยวกบการทดสอบตวอยาง

ทกประการ 5. หลกการ

สกดตวอยางโดยใช Methanol และน า 80 + 20 (v/v) น าสารละลายทสกดไดไปผาน Immunoaffinity column ซงภายในคอลมนบรรจดวยแอนตบอดทมความจ าเพาะตอสาร Aflatoxins จากนนคอลมนลางดวยน าบรสทธ ท าการชะ Aflatoxins ออกจากคอลมนดวย Methanol แลวน าไปวเคราะหหาชนดและปรมาณดวยเครอง High Performance Liquid Chromatography Post Column Photochemical Reaction โดยม Fluorescence detector เปนตวตรวจวด 6. ความปลอดภย

6.1 Methanol และ Acetonitrile ควรท าการทดสอบในตดดควนสารเคม และสวมถงมอและผาปดจมก เพอปองกนสารพษไมใหถกผวหนงและปองกนการสดดมไอระเหยของสารเคม

6.2 สารมาตรฐาน Aflatoxins เปนสารทมความเปนพษสง การเตรยมสารมาตรฐาน Aflatoxins ใหเตรยมในตดดควนสารเคม และสวมถงมอและผาปดจมก เพอปองกนสารพษไมใหถกผวหนง 7. อปกรณและเครองมอ

7.1 เครองมอ 7.1.1 เครอง HPLC ยหอ Agilent รน HP 1100, USA ประกอบดวย Fluorescence

detector และ Photochemical reactor ยหอ Aura, USA 7.1.2 เครองชงไฟฟาทศนยม 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน PG 603-S 7.1.3 Shaker ยหอ Gerhardt 7.1.4 Vortex mixer ยหอ Genie รน Genie-2

7.1.5 Micro Pipette ขนาด 2 – 20 µL 7.1.6 Micro Pipette ขนาด 10 – 100 µL

7.1.7 Micro pipette ขนาด 500 µL 7.1.8 Micro Pipette ขนาด 100 - 1,000 µL 7.1.9 Micro Pipette ขนาด 500 - 5,000 µL

7.1.10 Dispensor ขนาด 100 ml 7.1.11 เครองลดปรมาณสารละลาย ยหอ Organomation รน OA-SYSTM 7.1.12 เครอง Ultra sonic ยหอ Branson รน 8200 7.1.13 ปมกรองสารละลาย ยหอ EYELA รน A-2S 7.1.14 เครอง UV Spectrophotometer ยหอ JASCO รน V-550 และยหอ GBC รน

Cintra 404


7.2 อปกรณ 7.2.1 Column HPLC C18 5 µm ขนาด 4.6 X 150 มลลเมตร, GL Science 7.2.2 Flask ขนาด 125 และ 250 ml 7.2.3 ชอนตกสาร

7.2.4 กรวยกรองสารละลาย 7.2.5 หลอดเซนตรฟวจชนด Polypropylene ขนาด 50 ml 7.2.6 กระดาษกรอง Whatman no. 4 หรอเทยบเทา ขนาดเสนผานศนยกลาง 18.5 cm. 7.2.7 Rack ส าหรบวางหลอดเซนตรฟวจ 7.2.8 Glass microfiber (GF/C) ขนาด 110 mm 7.2.9 Syringe พลาสตกขนาด 3 และ 10 มลลลตร ชนดไมมหวเขม 7.2.10 Syringe Filters ขนาด 0.45 µm 7.2.11 Clamp พรอมขาตง หรอชด hand pump 7.2.12 Aluminium foil 7.2.13 Immunoaffinity column AflaTest P (Cas no: 12022) ยหอ VICAM 7.2.14 Vial HPLC พรอมฝาและ Septum 7.2.15 กระบอกตวงขนาด 10, 50, 1000 ml 7.2.16 บกเกอรขนาด 50 ml 7.2.17 Volumetric Flask ขนาด 5, 10, 50, 100, 500 และ 1,000 ml 7.2.18 ขวด Duran พรอมฝาเกลยวส าหรบใส Mobile Phase 7.2.19 Disposable Cuvettes

7.2.20 Vial ชนดม Nylon filter ในตว ขนาด 0.45 µm 8. สารเคมและ/หรออาหารเลยงเชอ

8.1 สารเคม 8.1.1 Methanol AR หรอ GR grade ใชส าหรบสกดตวอยาง 8.1.2 Methanol HPLC grade ใชส าหรบเตรยม Mobile phase 8.1.3 Acetonitrile (CH3CN), HPLC grade ใชส าหรบเตรยม Mobile phase 8.1.4 Nitrogen gas purity 99.99 % 8.1.5 น าบรสทธทมความตานทานไมนอยกวา 18.2 M -cm 8.1.6 Sodium chloride (NaCl), AR หรอ GR grade 8.1.7 โซเดยมไฮโดรเจนคารบอเนต (NaHCO3), AR หรอ GR grade

8.1.8 สารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรต 5 % 8.1.9 Potassium dicromate (K2Cr2O7), AR หรอ GR grade 8.1.10 Sulfuric acid (H2SO4),AR หรอ GR grade 8.2 การเตรยมสารเคม

8.2.1 การเตรยม Extraction solution Methanol 80 % เตรยมโดยการผสม Methanol ในอตราสวน 80 มลลลตรตอน า DI 20 ml (v/v ) บนทกการเตรยมสารเคม

8.2.2 การเตรยม Acetonitrile 90 % เตรยมโดยการผสม Acetonitrile ในอตราสวน 90 ml ตอน า DI 10 ml (v/v ) บนทกการเตรยมสารเคม


8.2.3 การเตรยม Mobile phase เตรยมโดยใช อตราสวน ดงน Methanol HPLC grade ปรมาตร 450 ml น า DI (deionized water) ปรมาตร 550 ml Acetonitrile (CH3CN) HPLC grade ปรมาตร 50 ml

น าไปกรองดวยชดกรอง Mobile phase โดยใชแผนกรองขนาด 0.45 µm ชนด Nylon แลวน าไป Degas ดวยเครอง Ultrasonic bath 15 - 20 นาท บนทกการเตรยมสารเคม 8.2.4 การเตรยม Methanol 20 % เตรยมโดยการผสม Methanol ในอตราสวน 20 ml ตอน า DI 80 ml (v/v ) บนทกการเตรยมสารเคม

8.2.5 การเตรยม H2SO4 0.009 M เตรยมโดยดด H2SO4 ปรมาตร 1 ml และปรบปรมาตรเปน 2,000 ml ดวยน าบรสทธ

บนทกการเตรยมสารเคม 8.2.6 การเตรยม Potassium Dicromate 3 ความเขมขน

8.2.6.1 การเตรยมสารละลาย K2Cr2O7 0.25 mM ชง K2Cr2O7 78 mg แลวละลายดวย H2SO4 0.009 M ปรมาตร 1 L = 1,000 ml 8.2.6.2 การเตรยมสารละลาย K2Cr2O7 0.125 mM ดดสารละลาย K2Cr2O7 0.25 mM (จากขอ 8.2.6.1) ปรมาตร 25 ml แลวปรบปรมาตรใหครบ 50 ml ดวย H2SO4 0.009 M ใน Volumetric Flask 8.2.6.3 การเตรยมสารละลาย K2Cr2O7 0.0625 mM ดดสารละลาย K2Cr2O7 0.125 mM (จากขอ 8.2.6.2) ปรมาตร 25 ml แลวปรบปรมาตรใหครบ 50 ml ดวย H2SO4 0.009 M ใน Volumetric Flask 8.2.6.4 บนทกการเตรยมสารเคม 9. สารมาตรฐาน

9.1 สารมาตรฐานทใช เกบรกษาไวทอณหภม 2 - 8 OC 9.1.1 สารมาตรฐาน Aflatoxin B1 1 mg 9.1.2 สารมาตรฐาน Aflatoxin B2 1 mg 9.1.3 สารมาตรฐาน Aflatoxin G1 1 mg 9.1.4 สารมาตรฐาน Aflatoxin G2 1 mg 9.2 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน 9.2.1 การเตรยม Stock standard solution (ใชจนกวาจะหมด เนองจากตองน าไปวดดวยเครอง UV Spectrophotometer กอนการใชทกครง) 9.2.1.1 ละลายสารมาตรฐาน Aflatoxin B1 Aflatoxin B2 Aflatoxin G1 และ Aflatoxin G2 แตละขวด ดวย Methanol (HPLC grade) แลวปรบปรมาตรใหครบ 100 ml ใน volumetric flask 9.2.1.2 น าสารละลายมาตรฐาน Aflatoxin แตละตวทไดตามขอ 9.2.1.1 ไปท าใหละลายเปนเนอเดยวกนดวยเครอง Ultrasonic bath เปนเวลา 20 นาท 9.2.1.3 แบงสารละลายมาตรฐาน Aflatoxin แตละตว ปรมาตร 5 ml ลงใน vial สชา ขนาด 20 ml แตละ vial


9.2.1.4 ตดปายชบงสถานะสารละลายมาตรฐานและเกบรกษาไวทอณหภม 2 - 8 OC

9.2.2 การเตรยม Intermediate standard solution (อายการใชงาน เตรยมใหมทกครงกอนการใชงาน) 9.2.2.1 ใช micropipette ดดสารละลายมาตรฐาน Aflatoxin B1 ปรมาตร 80 µL Aflatoxin B2 ปรมาตร 40 µL Aflatoxin G1 ปรมาตร 80 µL และ Aflatoxin G2 ปรมาตร 40 µL ใสในขวดแกวสชา

9.2.2.2 เตม Acetonitrile 90 % ปรมาตร 1360 µL (จะไดความเขมขนของสารมาตรฐาน Aflatoxin B1 = 500 ng/ml Aflatoxin B2 = 250 ng/ml Aflatoxin G1 = 500 ng/ml และ Aflatoxin G2 = 250 ng/ml โดยประมาณ) จากนนผสมใหเขากนดวย vortex mixer

9.2.3 การเตรยม Working standard solution (อายการใชงาน เตรยมใหมทกครง กอนการใชงาน)

9.2.3.1 ดด Intermediate standard solution จากขอ 9.2.2.2 ปรมาตรตามตารางท 3.22

9.2.3.2 เตม Acetonitrile 90 % ปรมาตร 997.5 995 990 980 960 940 และ 900 µL ตามล าดบ ผสมใหเขากนดวย vortex mixer

9.2.3.3 น า Working standard solution ฉดเขาระบบ HPLC แลวน าผลทไดไปสรางกราฟมาตรฐาน ตารางท 3.22 การเตรยมสารละลาย Working standard โดยประมาณ

หมายเหต : ความเขมขนของ Working standard solution อาจเปลยนแปลงขนอยกบความเขมขนของ Stock standard solution ทอานไดจากเครอง UV Spectrophotometer

ระดบ Intermediated standard solution Taken (L)

ความเขมขน (ng/ml) AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

1 2.5 1.25 0.625 1.25 0.625 2 5 2.5 1.25 2.5 1.25 3 10 5 2.5 5 2.5 4 20 10 5 10 5 5 40 20 10 20 10 6 60 30 15 30 15 7 100 50 25 50 25


A×MW×1000

E(epsilon)

1000AxC

10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 การวดสารมาตรฐานดวยเครอง UV Spectrophotometer

10.1.1 การ Calibration เครอง UV Spectrophotometer วดคา Absorbance (A) ของสารละลาย K2Cr2O7 3 ความเขมขน (0.25 mM 0.125 mM และ 0.0625 mM) ทชวงความยาวคลน 200 – 400 nm แลวใชคา maximum absorbance ทความยาวคลนใกล 350 nm ใช 0.009 M H2SO4 เปน Blank แลวค านวณหาคา Molar Absorptivity () ในแตละความเขมขนดงน

= โดย A = คา Absorbance ทความยาวคลน 350 nm C = ความเขมขนของสารละลาย (mM)

จากนนน าคาเฉลยของ Molar Absorptivity () มาค านวณหาคา Correction Factor (CF) ของเครองและ Cell ทใช ดงน CF = 3160 / เฉลย

โดย 3160 = คา ของสารละลาย K2Cr2O7 เฉลย = คาเฉลยของ ทง 3 คาทค านวณได คา CF ตองอยในชวง 0.95 – 1.05

10.1.2 การวดสารมาตรฐานดวยเครอง UV Spectrophotometer วดคา Absorbance (A) ของสารละลายมาตรฐานแตละตว ทชวงความยาวคลน 300 –

400 nm แลวใชคา maximum absorbance ทความยาวคลนใกลคา absorbance ของสารละลายมาตรฐานแตละตวดงตารางท 3.23 แลวค านวณหาความเขมขนของสารมาตรฐาน Aflatoxin แตละตว ดงน

Aflatoxin (µg/ml) =

ตารางท 3.23 Molecular weights (MW) และ molar absorptivities () ของ Solvent

Aflatoxin MW λ (Max) Solvent B1 312 360 ±5 Methanol 21500 B2 314 362 ±5 Methanol 21400 G1 328 362 ±5 Methanol 17700 G2 330 362 ±5 Methanol 19200

10.1.3 บนทกคาทไดลงในแบบฟอรม

10.2 ขนตอนการเตรยมตวอยางทดสอบ ตวอยางทดสอบถกเตรยมโดยงานบดตวอยางตามวธปฏบตงาน


10.3 วธทดสอบ ขนตอนการทดสอบบนทกลงในแบบฟอรม

10.3.1 ชงตวอยาง 25 g และ NaCl 2.5 g ใส Flask ขนาด 250 ml 10.3.2 น าตวอยางทเตรยมจากขอ 10.3.1 เตมดวย 80% methanol ปรมาตร 100

ml แลวน าไปเขยาดวย Shaker นาน 30 นาท จากนนน าตวอยางมากรองดวยกระดาษกรองเบอร 4 ทนทใหไดปรมาตรประมาณ 50 ml แลวรบน าสารละลายตวอยางทกรองไดไปเจอจางทนท

10.3.3 น าสารละลายทผานการกรองตามขอ 10.3.2 ปรมาตร 5 ml ผสมดวยน าบรสทธ ปรมาตร 20 ml และน าสารละลายไปกรองดวย glass microfiber (GF/C)

10.3.4 เตรยมชด clean up ดวยการใช syringe ขนาด 10 ml ตอเขากบสวนปลายดานบนของคอลมน IAC (Immunoaffinity Column) 10.3.5 น าสารละลายตวอยางปรมาตร 10 ml จากขอ 10.3.3 ใสใน syringe ทอยสวนบน คอลมนและดน piston ใหสารละลายไหลผานคอลมน อตราการไหลไมเกน 2 หยด/วนาท จนกระทงสารละลายหมดจากคอลมน

10.3.6 ลางคอลมนดวยน าบรสทธครงละ 10 ml 2 ครง ใหอตราการไหลของสารไมเกน 2 หยด/วนาทปลอยจนไมมน าเหลอในคอลมน 10.3.7 ชะสาร Aflatoxins ออกจากคอลมน โดยใช methanol (HPLC grade) ปรมาตร 1 ml เกบสารทชะไดจากคอลมนในขวดแกว ขนาด 8 ml หรอ Disposable Cuvettes

10.3.8 น าสารทชะไดท าใหแหงโดยใชแกสไนโตรเจน 10.3.9 เตมดวย 90 % acetonitrile 500 µL ผสมใหเขากนดวย vortex mixer

10.3.10 กรองสารละลายทไดจากขอ 10.3.9 กรองดวย Syringe Filters ขนาด 0.45 µm น าไปตรวจวดดวยเครอง HPLC Fluorescence detector ทตอเขากบเครอง Photochemical reactor และตงสภาวะเครอง HPLC ดงน

10.3.10.1 ดวธการใชเครอง HPLC ในคมอการใชเครอง HPLC ยหอ Agilent รน 1100

10.3.10.2 ใช Column HPLC C18 ODS-3 5 µm ขนาด 4.6 X 150 mm 10.3.10.3 ใช Fluorescence detector ท excitation 360 nm emission

440 nm 10.3.10.4 Mobile phase = Water: Methanol: Acetonitrile = 55 : 45: 5

10.3.10.5 ตงคา Flow rate 1.0 ml/min 10.3.10.6 คา run time ประมาณ 18 นาท 10.3.10.7 Injection 10 µL

10.4 ขนตอนการเตรยม reagent blank ท าตามขนตอนตามวธทดสอบแตไมใสตวอยาง 10.5 ขนตอนการเตรยม sample blank

ชงตวอยาง Sample blank 25 g และ NaCl 2.5 g แลวท าตามขนตอนตามวธทดสอบ


10.6 ขนตอนการเตรยม fortified sample ชงตวอยาง Sample blank 25 g และ NaCl 2.5 g จ านวน 2 ชด เตม intermidiated standard จากขอ 9.3 ปรมาตร 500 L ลงในตวอยางทง 2 ตวอยาง (จะไดความเขมขน Aflatoxin B1 = 10 µg/kg Aflatoxin B2 = 5 µg/kg Aflatoxin G1 = 10 µg/kg และ Aflatoxin G2 = 5 µg/kg ) แลวท าตามขนตอนตามวธทดสอบ 11. การค านวณ 11.1 แผนภาพแสดงวธวเคราะหสาร Aflatoxins

รปท 3.5 แผนภาพแสดงวธวเคราะหสาร Aflatoxins

Inject 10 µL

Standard curve (HPLC)

Aflatoxin standard 1 mL B1 = 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 30 และ 50 ng/mL (7 ระดบ) B2 = 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 15 และ 25 ng/mL (7 ระดบ) G1 = 1.25, 2.5, 5, 10, 20, 30 และ 50 ng/mL (7 ระดบ) G2 = 0.625, 1.25, 2.5, 5, 10, 15 และ 25 ng/mL (7 ระดบ)

ตวอยาง 25 g + NaCl 2.5 g

สวนใส 5 mL + น า DI 20 mL (25 mL)

10 mL ผาน Immunoaffinity column

Elute 1 mL ดวย methanol

Methanol 80 % 100 mL

Dry N2

Acetonitrile 90 % 500 µL

Inject 10 µL Aflatoxins concentration X1 ng/mL (HPLC)

ลางดวยน า DI 10 mL 2 ครง

เขยาดวย Shaker นาน 30 นาท

กรองดวย GF/C


11.2 การค านวณปรมาณ Aflatoxins Aflatoxins ทวเคราะหไดจากเครอง HPLC = X1 ng/ml

inject 10 µl ม Aflatoxins = X1 x 10 ng 1,000

ในสารละลาย 500 µl ม Aflatoxins = X1 x 10 x 500 ng 1,000 x 10 ในสารละลาย 10 ml ม Aflatoxins = X1 x 10 x 500 ng 1,000 x 10

ในสารละลาย 25 ml ม Aflatoxins = X1 x 10 x 500 x 25 ng 1,000 x 10 x 10

สารละลาย 5 ml ม Aflatoxins = X1 x 10 x 500 x 25 ng 1,000 x 10 x 10

สารละลาย 100 ml ม Aflatoxins = X1 x10 x 500 x 25 x 100 ng 1,000 x 10 x 10 x 5 = X1 x 25 ng Aflatoxins ในตวอยาง = X1 x 25 ng/g 25 = X1 ng/g (ppb)

11.3. การค านวณ % Recovery

% Recovery = ( ปรมาณทตรวจวดได – ปรมาณทมอยเดม ) x 100 ปรมาณทเตม 11.4 การค านวณ Spike level

Spike level (ppb) = (Conc. x Volume) / Weight

โดยท Conc. = Stock standard solution (ppm) Volume = ปรมาณของสารมาตรฐานทตองเตมลงในตวอยาง (µL) Weight = น าหนกของตวอยาง (g) 12. การควบคมคณภาพ 12.1 การควบคมคณภาพของเครอง UV Spectrophotometer

วดคา Absorbance (A) ของสารละลาย K2Cr2O7 3 ความเขมขน (0.25 mM, 0.125 mM และ 0.0625 mM) ทความยาวคลน 350 nm ใช 0.009 M H2SO4 เปน Blank แลวค านวณหาคา Molar Absorptivity () ในแตละความเขมขน จากนนน าคาเฉลยของ Molar Absorptivity () มาค านวณหาคา Correction Factor (CF) ของเครอง โดยคา CF ทไดตองอยในชวง 0.95 – 1.05 (ท า 1 เดอนตอครง) กรณคา CF ทไดเกนเกณฑทยอมรบ ใหท าการเตรยมสารละลาย K2Cr2O7 3 ระดบความเขมขน (0.25 mM, 0.125 mM และ 0.0625 mM) ใหม แลวท าการวดซ าอกครง ถาไมผานเกณฑทก าหนดอก ใหวเคราะหหาสาเหตและท าการแกไข ถาไมสามารถแกไขเองได ใหแจงใหผควบคมทราบ 12.2 การควบคมคณภาพของเครอง HPLC 12.2.1 ท าการตรวจสอบสภาวะของเครองโดยฉด Mobile phase กอนการ Run ตวอยาง เพอเชคการปนเปอนของระบบ (ทกครงกอนการฉดตวอยาง) ผลทไดตองไมพบพคของสารตรงกบ


สารทสนใจ ในกรณทพบ ใหพจารณาวาจะสงผลกระทบตอผลการทดสอบหรอไม หากพจารณาแลวพบวาสงผลกระทบ ใหวเคราะหหาสาเหตและท าการแกไข ถาไมสามารถแกไขเองได ใหแจงใหผควบคมทราบ 12.2.2 ท า System suitability โดยใชสารละลายมาตรฐานความเขมขนระดบท 4 (Aflatoxin B1 = 10 ng/ml Aflatoxin B2 = 5 ng/ml Aflatoxin G1 = 10 ng/ml และ Aflatoxin G2 = 5 ng/ml โดยประมาณ) ฉดเขาเครอง HPLC จ านวน 5 ครง (inject) น าคา Area และคา Retention time ไปค านวณคาทางสถต Mean, SD และ % CV โดยคา % CV ของ Area ตองไมเกน 3 % และ % CV ของ Retention time ตองไมเกน 1 % (ทกครงกอนการฉดตวอยาง) กรณทฉดสารมาตรฐาน 5 ซ า แลว % CV ของ Area และ % CV ของ Retention time ไมผาน ใหฉดสารมาตรฐานซ าอก แตรวมทงหมดไมเกน 8 ซ า ถาไมผานเกณฑทก าหนด ใหพจารณาวาจะสงผลกระทบตอผลการทดสอบหรอไม หากพจารณาแลวพบวาสงผลกระทบใหวเคราะหหาสาเหตและท าการแกไข ถาไมสามารถแกไขเองได ใหแจงใหผควบคมทราบ 12.3 การควบคมคณภาพผลการทดสอบ 12.3.1 ฉดสารละลายมาตรฐาน B1 B2 G1 และ G2 7 ระดบความเขมขน โดย Calibration curve ของ สารละลายมาตรฐานทฉดในแตละครงตองมคา Correlation coefficient (r) ไมนอยกวา 0.995 กรณท Calibration curve มคา Correlation coefficient นอยกวา 0.995 ใหเตรยมสารละลายมาตรฐานและน าไปฉดเขาเครอง HPLC ใหม 12.3.2 จดตวอยางเปนชด 1 ชดประกอบดวย sample ประมาณ 20 ตวอยาง และท าตวอยางควบคมคณภาพผลการทดสอบ ดงน 12.3.2.1 ท าการทดสอบ reagent blank โดยผลการทดสอบตองไมพบพคของสารตรงกบสารทสนใจ กรณตรวจพบพคของสารทสนใจใน reagent blank ใหทดสอบใหมทงชดอกครง 12.3.2.2 ท าการทดสอบ sample blank โดยผลการทดสอบตองไมพบพคของสารตรงกบสารทสนใจ กรณหากตรวจพบพคของสารทสนใจใน sample blank ใหทดสอบใหมทงชดอกครง 12.3.2.3 ท าการทดสอบ fortified sample จ านวน 2 ตวอยาง โดยเตมสารมาตรฐานลงในตวอยางความเขมขน Aflatoxin B1 = 10 ppb Aflatoxin B2 = 5 ppb Aflatoxin G1 = 10 ppb และ Aflatoxin G2 = 5 ppb โดยคา % recovery ทไดตองอยในเกณฑ 60 - 120 % กรณผลทไดมคาต าหรอสงกวานตองท าการทดสอบใหมทงชด และน า % recovery ทไดมาหาคาความแตกตางกน (%RPD) ตองไมเกน 20% กรณความแตกตางเกน 20% ใหทดสอบใหมทงชดอกครง 12.3.2.4 ท า duplicate sample โดยเลอกตวอยางใดตวอยางหนงในชดนน ซงผลการทดสอบทไดตองมคาความแตกตางกน (%RPD) ไมเกน 20 % หากผลทไดมความแตกตางเกน 20 % ใหท าการทดสอบตวอยางนนใหมอกครง 12.3.2.5 ทดสอบ Peak area driff ของสารมาตรฐาน กลม Aflatoxins ทความเขมขน Aflatoxin B1 = 10 ppb Aflatoxin B2 = 5 ppb Aflatoxin G1 = 10 ppb และ Aflatoxin G2 = 5 ppb ตองมคา Peak area driff ไมเกน 10 %

สตรการค านวณ % Peak area driff = ( Peak area inject inital - Peak area inject final ) x 100 Peak area Average


12.3.2.6 ทวนสอบผลวเคราะหทค านวณจาก software ของเครองคอมพวเตอร โดยสมค านวณซ า 10 % ของตวอยางทตรวจพบ โดยใชสมการ y = mx + b ทไดจากการท า Calibration curve

12.3.2.7 เฝาระวงระดบคา LOD และ LOQ โดยการทวนสอบคา LOD และ LOQ 6 เดอน/ครง โดย ทดสอบ Positive Control ทระดบคา LOD และ LOQ จ านวน 3 ซ า คา LOD ตองมคา signal/noise ≥ 3 คา LOQ % recovery ตองอยในเกณฑ 60 - 120 % และ %RSD ตองนอยกวา 10 % บนทกผลลงในแบบฟอรม กรณทคา LOD และ LOQ เกนเกณฑทก าหนดใหท าการ Verified หาคา LOD และ LOQ ทเหมาะสมของวธทดสอบใหม 12.4 การเขารวมโครงการ Proficiency testing เขารวมโครงการ Proficiency testing อยางนอยปละ 1 ครงบนทกการเขารวมโครงการ Proficiency testing 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช 13.1 บนทกผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางพษวทยาและชวเคม(สารพษจากเชอรา) 13.2 บนทกขอมลการทดสอบสารพษจากเชอรา(Mycotoxins) ดวยวธ HPLC/LC-MS/LC-MS-MS 13.3 บนทกการทดสอบตวอยางทดสอบความช านาญ (Proficiency testing) 13.4 บนทกการท า Duplicate Sample 13.5 บนทกการท า System suitability 13.6 บนทกการท า Internal Quality Control 13.7 บนทกการเตรยมสารละลายมาตรฐาน 13.8 บนทกการเตรยมสารเคม 13.9 บนทกการใชงาน Column HPLC 13.10 บนทกการใชงานหลอด UV 13.11 บนทกการใชสารมาตรฐาน 14. การรายงานผล 14.1 การแปรผล

ในกรณทพบพคของสารทสนใจในตวอยาง Retention time (RT) ของสารทสนใจทพบ ตองแตกตางจาก RT ของสารมาตรฐานไมเกน 0.5 นาท

14.2 การรายงานผล 14.2.1 ในกรณทตรวจไมพบ ใหรายงานผลวา “ไมพบ”

14.2.2 ในกรณทผลการตรวจต ากวาคา LOD ใหรายงานผลวา“ไมพบ” 14.2.3 ในกรณทตรวจพบตงแตระดบ LOD เปนตนไปแตต ากวา LOQ ใหรายงานผลการทดสอบวาพบในปรมาณทต ากวาคา LOQ 14.2.4 ในกรณทตรวจพบตงแตระดบ LOQ เปนตนไปใหรายงานผลการทดสอบเปนตวเลข มทศนยม 2 ต าแหนงและรายงานผลการทดสอบเปนหนวย µg/kg 14.3 ตวอยางทมการท าซ า (duplicate sample) ใหใชคาเฉลยในการรายงานผล 14.4 กรณทตรวจพบในปรมาณทมากกวา range ของสารมาตรฐาน แตไมเกน 200 ug/kg ใหเจอจาง 10 เทา ถาคาเกน 200 ug/kg ขนไปใหเจอจางตามความเหมาะสม เพอใหคาอยในชวง standard calibration curve ท าการเจอจางตวอยาง 2 ซ า และตอบผลโดยใชคาเฉลยของการเจอจางทง 2 ซ า


14.5 การรายงานคาความไมแนนอนของการทดสอบ จะรายงานกรณเฉพาะลกคารองขอเทานน โดยจะรายงานคาทตรวจพบดงน ความเขมขนทตรวจพบ U µg/kg ทระดบความเชอมน 95 % โดยท U จะมเลขนยส าคญ 2 ต าแหนง 15. รายละเอยดอนๆ

15.1 การตรวจสอบประสทธภาพ AflaTest-P Column โดยท าการทดสอบ 2 ขนตอนดงน 15.1.1 ทดสอบการปนเปอน AflaTest-P Column โดยท าการทดสอบ reagent

blank ตามวธทดสอบแลวน าไปฉดเขาเครอง HPLC หากไมพบสญญาณพกตองสงสย แสดงวา AflaTest-P Column ไมมการปนเปอน

15.1.2 ทดสอบประสทธภาพการจบสาร Aflatoxins ของ AflaTest-P Column ทดสอบโดยการเตมสารมาตรฐานลงใน methanol 20 % ความเขมขน B1 10 ng/ml B2 5 ng/ml G1 10 ng/ml และ G2 5 ng/mlจากนนน าไปผาน Immunoaffinity column เพอด % recovery คา % recovery ทไดตองไมนอยกวาเกณฑทก าหนดไว ดงน B1 ≥ 90 % B2 ≥ 80 %, G1 ≥ 90 % และ G2 ≥ 60 %

15.2 สภาวะแวดลอมของการทดสอบ -

15.3 วธก าจดของเสย / สารเคม 15.3.1 สารละลายมาตรฐาน Aflatoxins ทใชแลวใหทงลงในสารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรตประมาณ 5 % แลวเทใสภาชนะทจดเตรยมไวส าหรบทงโดยเฉพาะ เพอรอก าจดตอไป

15.3.2 เครองแกวหรอภาชนะ ทปนเปอนสารละลายมาตรฐาน Aflatoxins ใหท าการแชเครองแกวหรอภาชนะในสารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรตประมาณ 5 % กอนลางหรอกอนทง 15.3.3 solvent ชนดอนๆ เทใสภาชนะทจดเตรยมไวโดยจ าแนกตามชนดของ solvent เพอรอทงรวมในถงใหญ เพอสงก าจดตอไป

15.3.4 ส าหรบกาก แยกกากออกจาก solvent ทงลงในถงด า เพอรอก าจดตอไป 15.4 ขอควรระวง

15.4.1 ขนตอนการกรองตวอยาง ไมควรทงตวอยางไวนานเกนไป เนองจาก Methanol เปนสารทระเหยงาย จงควรปดภาชนะทใสหรอท าการทดสอบทนท

15.4.2 ขนตอนการ clean up ตวอยางไมควรใชความดนมากจนเกนไป ควรปลอยให ตวอยางไหลผาน column เองประมาณ 1-2 หยด/วนาท เพอให column จบสารทตองการวเคราะห ไดดยงขน 16. เอกสารอางอง

16.1 Chan, D., Dunn, E., Humphries, J., Kandler, H.,Sizoo, E.and Wilson, D.2006.“Liquid Chromatographic Analysis of Aflatoxin Using Post-Column Photochemical Derivatization: Collaborative Study”. Journal of AOAC International. 89 (3): 678-692.

16.2 Official Journal of the European Communities. 2002. The Commission of The European Communities: 8-36. 16.3 Official Methods of Analysis, 18th Ed. 2012, AOAC INTERNATIONAL, Method 970.44, 971.22 and 991.31.


16.4 Vicam Aflatest Instruction Manual.2014. AFLATEST HPLC Procedure For Corn, Grains &Feeds: pp 11.


3.1.5 วธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer 1. วตถประสงค

เพอใชเปนคมอในการทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometerเปนเครองตรวจวด 2. ขอบขาย

ทดสอบหาปรมาณ Aflatoxins ในอาหารสตวดวยวธ IAC- Fluorometry โดยมคา Working range 2.00– 300 µg/kg คา LOD 1.00 µg/kg และ LOQ เทากบ 2.00 µg/kg 3. เอกสารทเกยวของ

3.1 คมอการใชเครอง Fluorometer ยหอ VICAM รน series 4 3.2 คมอการใชเครองชงไฟฟาทศนยม 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน PG 603-s 3.3 คมอการใชชดปนตวอยาง ยหอ WARING รน HGB2WT พรอมโถปน 3.4 คมอการใช Vortex mixer ยหอ Genie รน Genie-2 3.5 คมอการใชตดดควนสารเคม ยหอ EASY LAB รน FUMECUPBOARD 3.6 คมอการใช Micropipette ขนาด 10-100 ไมโครลตร 3.7 คมอการใช Micropipette ขนาด 500 ไมโครลตร 3.8 คมอการใช Micropipette ขนาด 100-1,000 ไมโครลตร 3.9 คมอการใช Micropipette ขนาด 1,000-5,000 ไมโครลตร 3.10 คมอการใช Dispensor ขนาด 100 มลลลตร 3.11 คมอการใชตแชเยน ยหอ CHILLED รน PT 203 3.12 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบสารพษจากเชอราดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใช

เครอง Fluorometer 3.13 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (ขาวโพด) ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer

3.14 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (สตวปก) ดวยวธ IAC- Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer

3.15 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (อาหารโคและกระบอ) ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer

3.16 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (อาหารสกร) ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer 3.17 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบสารพษจากเชอราดวยวธ IAC- Fluorometry โดยใชเครองFluorometry 3.18 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (ขาวโพด) ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer 3.19 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (สตวปก) ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer 3.20 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (อาหารโคและกระบอ) ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer


3.21 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตว (อาหารสกร) ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer 4. นยาม

4.1 Aflatoxins เปนสารพษทสรางจากเชอราแอสเปอรจลสฟลาวส ( Aspergillus flavus ) และ แอสเปอรจลส พาราซตคส (Aspergillus parasiticus) มกพบปนเปอนในเมลดธญพช พชน ามนตางๆ อาหารส าเรจรป อาหารสตวตาง ๆ และวตถดบอาหารสตว เชน ขาวโพด ปลายขาว ร าสด ร าสกดน ามน กากถวเหลอง กากถวลสง เปนตน สารพษในกลม Aflatoxins ไดแก Aflatoxin B1 , Aflatoxin B2 , Aflatoxin G1 และ Aflatoxin G2 ในธรรมชาตเชอราจะผลต Aflatoxin B1 ในปรมาณมากกวาชนดอนๆ โดยทระดบความเปนพษตอมนษยและสตวจากมากไปหานอย คอ AFB1>AFG1>AFB2>AFG2 สารพษเหลานมโครงสรางทางเคม ดงน AFB1 AFB2 AFG1 AFG2

รปท 3.6 โครงสรางทางเคมของ Aflatoxin B1, B2, G1 และ G2 4.2 อาหารสตว หมายถง วตถทมงหมายเพอใชเลยงสตว โดยค าแนะน าของคณะกรรมการควบคม

คณภาพอาหารสตว ประกาศเปนอาหารสตวใชในราชกจจานเบกษา แบงเปน 5 ประเภท คอ วตถดบ, วตถทผสมแลว, ผลตภณฑนมส าหรบสตว,อาหารเสรมส าหรบสตว และอาหารสตวผสมยา

4.3 Fluorometry เปนวธวเคราะหทเกยวของกบการวดคณสมบตการเรองแสงของสารการลดพลงงานในรปการเปลงแสงของโมเลกลทกระตนโดยการดดกลนพลงงานของแสง

4.4 IAC (Immunoaffinity column) หมายถง คอลมนทใชในการ clean up ตวอยางโดยภายในคอลมนบรรจดวยแอนตบอด (Antibody) ทมความจ าเพาะตอสารนนๆ

4.5 การวเคราะหเชงปรมาณ หมายถง การวเคราะหสารทไดคาออกมาเปนปรมาณความเขมขนรวมซงไมสามารถแยกชนดของสารได ใชในการวเคราะหเบองตน กอนน าไปยนยนผลกบเครองมอขนสง เชน HPLC, LC-MS, LC-MS/MS หรอ GC-MS เปนตน

4.6 Sample Blank หมายถง ตวอยางทใชในการทดสอบแลวไมพบสารทสงสย 4.7 Fortified Sample หมายถง Sample Blank ทน ามาเตมสารละลายมาตรฐาน ในระดบทผทดสอบทราบ เพอใหผทดสอบใชในการควบคม %Recovery ของการทดสอบ

4.8 Reagent blank หมายถง สารเคมทใชในการทดสอบ โดยท าเชนเดยวกบการทดสอบตวอยางทกประการ


5. หลกการ สกดตวอยางโดยใช Methanol และน า DI 80+20 (v/v) น าสารละลายทสกดไดไปผาน

Immuno affinity column ซงภายในคอลมนบรรจดวยแอนตบอดทมความจ าเพาะตอสาร Aflatoxins จากนนลาง Immunoaffinity column ดวยน าบรสทธ ท าการชะ Aflatoxins ออกจากคอลมนดวย Methanol และเตมดวย AflaTest developer แลวจงน าไปวดดวยเครอง Fluorometer 6. ความปลอดภย

6.1 ในขนตอนการเตรยมตวอยางทใช Methanol เปนตวสกด ควรท าในตดดควนสารเคม สวมถงมอและใชผาปดจมก เพอปองกนสารพษไมใหถกผวหนงและปองกนการสดดมไอระเหยของสารพษเขาสรางกาย

6.2 ควรตรวจสอบโถปนตวอยางกอนน ามาใชงานทกครงวาช ารดหรอไม ถาช ารดควรซอมแซมกอนน ามาใชงาน เพอความปลอดภย

6.3 สารละลายมาตรฐาน Aflatoxin Mix เปนสารทมความเปนพษสง การเตรยมสารละลายมาตรฐานใหเตรยมในตดดควนสารเคมสวมถงมอและผาปดจมกเพอปองกนสารพษไมใหถกผวหนง 7. อปกรณและเครองมอ

7.1 เครองมอ 7.1.1 เครอง Fluorometer ยหอ VICAM รน series 4 7.1.2 เครองชงไฟฟาทศนยม 3 ต าแหนง ยหอ Mettler Toledo รน PG 603-S 7.1.3 ชดปนตวอยาง ยหอ WARING รน HGB2WT พรอมโถ 7.1.4 Shaker ยหอ Gerhardt 7.1.5 Vortex mixer ยหอ Genie รน Genie-2 7.1.6 Micropipette ขนาด 10-100 ไมโครลตร 7.1.7 Micropipette ขนาด 500 ไมโครลตร 7.1.8 Micropipette ขนาด 100-1,000 ไมโครลตร 7.1.9 Micropipette ขนาด 1,000-5,000 ไมโครลตร 7.1.10 Dispensor ขนาด 100 มลลลตร

7.2 อปกรณ 7.2.1 จานรองส าหรบชงตวอยาง ชนด Polypropylene 7.2.2 Erlenmeyer flask ขนาด 125 และ 250 มลลลตร 7.2.3 ชอนตกสาร 7.2.4 กรวยกรองสารละลาย ชนด Polypropylene

7.2.5 หลอดเซนตรฟวจชนด Polypropylene ขนาด 50 มลลลตร 7.2.6 กระดาษกรอง Whatman no. 4 หรอเทยบเทา ขนาดเสนผานศนยกลาง 18.5

เซนตเมตร 7.2.7 Rack ส าหรบวางหลอดเซนตรฟวจ 7.2.8 Glass Micro fiber filter ชนด GF/C เสนผาศนยกลาง 11 เซนตเมตร ยหอ Whatman หรอเทยบเทา

7.2.9 Disposable syringe ชนดไมมหวเขม ขนาด 10 มลลลตร 7.2.10 Clamp พรอมขาตง หรอชด hand pump


7.2.11 Aluminium foil 7.2.12 Immunoaffinity column AflaTest , ยหอ VICAM 7.2.13 Cylinder ขนาด 10, 50, 1000 มลลลตร 7.2.14 Beaker ขนาด 250 มลลลตร 7.2.15 Volumetric Flask ขนาด 5, 10, 50,100 มลลลตร 7.2.16 Disposable Cuvettes

8. สารเคมและ/หรออาหารเลยงเชอ 8.1 สารเคมทใช

8.1.1 Methanol AR หรอ GR grade ใชส าหรบสกดตวอยาง 8.1.2 Methanol HPLC grade ใชส าหรบ elute Aflatoxins ออกจาก column 8.1.3 น าบรสทธทมความตานทานไมนอยกวา 18.2 M.cm 8.1.4 AflaTest Developer ยหอ VICAM 8.1.5 โซเดยมคลอไรด (NaCl), AR หรอ GR grade 8.1.6 โซเดยมไฮโปรคลอไรต ประมาณ 5-6%, Commercial grade

8.2 การเตรยมสารเคม 8.2.1 การเตรยม Extraction solution เตรยมโดยการผสม Methanol ในอตราสวน 80

มลลลตร ตอน า DI 20 มลลลตร (v/v) บนทกการเตรยมสารเคมลงในแบบบนทกการเตรยมสารเคม 8.2.2 การเตรยม Developer Aflatoxin เตรยมโดยใช AflaTest Developer 5 มลลลตร และน า DI 45 มลลลตร (v/v) ผสมใหเขากน บนทกการเตรยมสารเคมลงในแบบบนทกการเตรยมสารเคม 9. สารมาตรฐาน 9.1 Mycotoxin Calibration Standard ประกอบดวย สารควนนซลเฟต ใน Vial สแดง สเขยว และสเหลอง

9.2 สารละลายมาตรฐาน Aflatoxin Mix 3 ug/ml 9.3 การเตรยมสารละลายมาตรฐาน 9.3.1 Stock standard (อายการใชงานตามใบ certificate) 9.3.2 ดดสารละลาย Stock standard มา 1 มลลลตรแลวปรบปรมาตรดวย Methanol ใหครบ 10 มลลลตร จะไดความเขมขน 300 ng/ml เพอน าไปใชในการทดสอบ Fortified sample 10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 ขนตอนการเตรยมตวอยาง ตวอยางทดสอบถกเตรยมโดยงานบดตวอยางตามวธปฏบตงาน 10.2 วธทดสอบ 10.2.1 ชงตวอยาง 25 กรมและ NaCl 2.5 กรม ใสจานรองส าหรบชงน าหนกหรอ Erlenmeyer flask ขนาด 250 มลลลตร

10.2.2 น าตวอยางอาหารสตวทเตรยมจากขอ 10.2.1 ใสใน โถปนหรอ Erlenmeyer flask ขนาด 250 มลลลตรแลวเตม 80% Methanol ปรมาตร 100 มลลลตร ปนทความเรวรอบสงนาน ครงละ 1 นาท 3 ครง หรอเขยาดวย Shaker นาน 30 นาทจากนนน าตวอยางมากรองดวยกระดาษกรองเบอร 4 ทนท ใหไดปรมาตรประมาณ 50 มลลลตร แลวรบน าสารละลายตวอยางทกรองไดไปเจอจางทนท เพอปองกนการระเหยของสารละลาย


10.2.3 น าสารละลายทผานการกรองตามขอ 10.2.2 ปรมาตร 5 มลลลตร ผสมดวยน าบรสทธ ปรมาตร 20 มลลลตร น าสารละลายทได กรองดวย glass micro fiber filter (GF/C) ท าการกรองตวอยางไมเกน 20 นาท ตอ ปรมาตร 20 มลลลตร และสงเกตตวอยางถาชาเกน 1 วนาท ตอ 1 หยด ใหถายตวอยางลงในแผนกรองแผนใหม หรอ ถาตวอยางทกรองลงยากใหใชวธปนแยกตะกอนโดยใชเครองปนแยกตะกอนควบคมอณหภมท 4 องศาเซลเซยส ความเรวรอบไมนอยกวา 3500 rpm นาน 5 นาท

10.2.4 เตรยมชด clean up ดวยการใช syringe ขนาด 10 มลลลตร ตดตงทสวนปลายดานบนของคอลมน IAC (Immunoaffinity Column)

10.2.5 น าสารละลายตวอยางปรมาตร 4 มลลลตร (0.2 กรม) จากขอ 10.2.3 ใสใน syringe ทอยสวนบนคอลมนและกดไลสารละลายตวอยางไหลผานคอลมน โดยอตราการไหลไมเกน 2 หยด/วนาท จนกระทงสารละลายตวอยางหมดจากคอลมน

10.2.6 ลางคอลมนดวยน าบรสทธครงละ 10 มลลลตร 2 ครง โดยอตราการไหลไมเกน 2 หยด/วนาท ปลอยจนไมมน าเหลอในคอลมน

10.2.7 ชะ Aflatoxins ออกจากคอลมน โดยใช Methanol, HPLC grade ปรมาตร 1 มลลลตร เกบสารทชะไดจากคอลมนใสใน Disposable Cuvette

10.2.8 เตมดวย AflaTest developer 1 มลลลตร 10.2.9 เขยาผสมใหเขากนแลวรบน าไปวดดวยเครอง Fluorometer ตามคมอการใช

เครอง Fluorometer ยหอ VICAM รน series 4, โดยเครองจะอานผลภายในเวลา 60 วนาท และบนทกคาความเขมขนของ Aflatoxins ตามทอานไดจากเครอง

10.3 ขนตอนการเตรยม Reagent blank ท าตามขนตอนตามวธทดสอบขอ 10.2 โดยไมใสตวอยาง 10.4 ขนตอนการเตรยม Sample blank ชงตวอยาง Sample blank 25 กรม และโซเดยมคลอไรด 2.5 กรม ท าตามขนตอนตามวธ

ทดสอบขอ 10.2.2-10.2.9 10.5 ขนตอนการเตรยม fortified sample 10 ng/g ชงตวอยาง blank 25 กรม และโซเดยมคลอไรด 2.5 กรม ใสในจานรองส าหรบชงตวอยาง

จ านวน 2 ชด เตม standard solution 300 ng/ml ปรมาตร 920 µL ปรมาตรอาจเปลยนแปลงได ขนอยกบความเขมขนของ stock standard 11. การค านวณ

11.1 เครองจะอานคาความเขมขนออกมาเปนหนวยไมโครกรมตอกโลกรม (ppb) 11.2 การค านวณเปอรเซนต Recovery

เปอรเซนต Recovery = [(ปรมาณทตรวจวดได – ปรมาณทมอยเดม) / ปรมาณทเตม] x 100 11.3 การค านวณเปอรเซนต RPD

Average

x100 Data2Data1 %RPD

12. การควบคมคณภาพ 12.1 การควบคมคณภาพของเครอง Fluorometer วดสารควนน ซลเฟต กอนการใชงานทกครงโดยคาทวดไดจะอยในชวง 49-59 ppb ถาผลทไดไมผานเกณฑทก าหนดใหพจารณาวาจะสงผลกระทบตอการทดสอบหรอไม หากพจารณาแลวพบวา


สงผลกระทบใหท าการแกไขเบองตน และท าการตรวจสอบใหมอกครง วเคราะหหาสาเหต ถาไมสามารถแกไขไดใหแจงผควบคมทราบ

12.2 การควบคมคณภาพผลการทดสอบ จดตวอยางเปนชด ชดละประมาณ 10-20 ตวอยาง และท าตวอยางควบคมคณภาพผลการ

ทดสอบ ดงน 12.2.1 ท าการทดสอบ Reagent blank กอนท าการทดสอบทกชดการทดสอบ โดยผล

การทดสอบตองไมพบปรมาณของสารตรงกบสารทสนใจ กรณตรวจพบปรมาณของสารทสนใจใน Reagent blank ใหทดสอบใหมอกครง

12.2.2 ท าการทดสอบ Sample blank กอนท าการทดสอบทกชดการทดสอบ โดยผลการทดสอบตองไมพบปรมาณของสารตรงกบสารทสนใจ กรณตรวจพบปรมาณของสารทสนใจใน Sample blank ใหทดสอบใหมอกครง 12.2.3 ท าการทดสอบ DI water กอนท าการทดสอบทกชดการทดสอบ โดยผลการทดสอบตองไมพบปรมาณของสารตรงกบสารทสนใจ กรณตรวจพบปรมาณของสารทสนใจใน DI water ใหทดสอบใหมอกครง 12.2.4 ท าการทดสอบ Methanol HPLC grade กอนท าการทดสอบทกชดการทดสอบ โดยผลการทดสอบตองไมพบปรมาณของสารตรงกบสารทสนใจ กรณตรวจพบปรมาณของสารทสนใจใน Methanol HPLC grade ใหทดสอบใหมอกครง 12.2.5 ท าการทดสอบ AflaTest developer กอนท าการทดสอบทกชดการทดสอบ โดยผลการทดสอบตองไมพบปรมาณของสารตรงกบสารทสนใจ กรณตรวจพบปรมาณของสารทสนใจใน AflaTest developer ใหทดสอบใหมอกครง

12.2.6 ท าการทดสอบ Fortified sample (Spike Sample) จ านวน 2 ตวอยาง % Recovery ทไดตองอยในชวง 60 - 120 % กรณผลทไดมคาต ากวาหรอสงกวานใหทดสอบใหมทงชดอกครง และน า % Recovery ทไดมาหาคาความแตกตางกน (% RPD) ผลทไดตองแตกตางกนไมเกน 20 % กรณทคาแตกตางกนเกน 20 % ใหทดสอบใหมทงชดอกครง บนทกลงในแบบบนทกการท า Internal Quality Control Mycotoxins ดวยวธ Fluorometry

12.2.7 ท า Duplicate sample โดยเลอกตวอยางใดตวอยางหนงในชดนน ซงผลการทดสอบทไดตองมคาความแตกตางกน (% RPD) ไมเกน 20 % หากผลทไดมความแตกตางกนเกน 20 % ใหทดสอบใหมทงชดอกครง บนทกลงในแบบบนทกการท า Duplicate Sample 12.2.8 ทวนสอบคา LOD และ LOQ 4 เดอน/ครง โดยเตมสารละลายมาตรฐานลงไปในตวอยางระดบ LOD และ LOQ จ านวน 3 ซ า คา LOD ตองไมม false negative และคา HORRAT ทไดตองมคา ≤2 คา LOQ % recovery ตองอยในเกณฑ 60-120%และคา HORRAT ทไดตองมคา ≤2 คา บนทกผลลงในบนทกการทวนสอบคา LOD และ LOQ ดวยวธ Fluorometry กรณทคา LOD และ LOQ เกนเกณฑทก าหนดใหท าการ Verified หาคา LOD และ LOQ ทเหมาะสมของวธทดสอบใหม

12.3 การเขารวมโครงการ Proficiency testing เขารวมโครงการ Proficiency testing อยางนอยปละ 1 ครง บนทกการเขารวมโครงการ Proficiency testing


13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช 13.1 บนทกขอมลการทดสอบสารพษจากเชอรา (Mycotoxins) ดวยวธ Fluorometry

13.2 บนทกผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางพษวทยาและชวเคม 13.3 บนทกการเตรยมสารเคม 13.4 บนทกการท า Duplicate Sample 13.5 บนทกการท า Internal Quality Control Mycotoxins ดวยวธFluorometry 13.6 แบบบนทกการตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและรเอเจนต 13.7 แบบบนทกการทวนสอบคา LOD และ LOQ ดวยวธ Fluorometry 13.8 บนทกการเขารวมโครงการ Proficiency testing 14. การรายงานผล 14.1 การแปรผล รายงานผลตามทเครองอานคาได 14.2 การรายงานผล

14.2.1 ในกรณทเครองอานคาไดเปน 0 ใหรายงานผลวา ไมพบ 14.2.2 ในกรณทเครองอานคาไดต ากวาคา LOD ใหรายงานผลวา ไมพบ

14.2.3 ในกรณทตรวจพบตงแตระดบคา LOD เปนตนไปแตต ากวา LOQ ใหรายงานผลการทดสอบวาพบในปรมาณ ทต ากวาคา LOQ 14.2.4 ในกรณทตรวจพบตงแต LOQ เปนตนไปใหรายงานผลการทดสอบเปนตวเลขตามทอานไดจากเครอง 14.2.5 ตวอยางทมการท าซ า (Duplicate sample) ใหใชคาเฉลยในการรายงานผลมทศนยมไมเกน 2 ต าแหนง 14.2.6 การรายงานคาความไมแนนอนของการทดสอบ จะรายงานกรณเฉพาะลกคารองขอเทานน โดยจะรายงานคาทตรวจพบ ดงน ความเขมขนทตรวจพบ ±U µg/kg ทระดบความเชอมน 95% โดยท U จะมเลขนยส าคญ 2 ต าแหนง 15. รายละเอยดอนๆ 15.1 การทดสอบประสทธภาพสารเคมและรเอเจนต

15.1.1 การตรวจสอบประสทธภาพ AflaTest column ทก Lot. ของการจดซอ โดยท าการทดสอบ 2 ขนตอน ดงน

15.1.1.1 ทดสอบการปนเปอน AflaTest Column โดยท าการทดสอบ reagent blank ตามวธทดสอบแลวน าไปวดดวยเครอง Fluorometer หากไมพบปรมาณของสารตองสงสย แสดงวา AflaTest column ไมมการปนเปอน 15.1.1.2 ทดสอบประสทธภาพการจบสาร Aflatoxins ของ AflaTest column โดยการเตมสารละลายมาตรฐาน Aflatoxin Mix 10 ng/ml ลงใน 20 % Methanol จากนนน าไปผาน Immunoaffinity column เพอด % Recovery คา % Recovery ทไดตองไมนอยกวาเกณฑทก าหนดไว ≥ 60-120 %

15.1.2 การทดสอบ Methanol ทก Lot.ของการจดซอ โดยท าการทดสอบ ดงน 15.1.2.1 Methanol AR grade


น า Methanol AR grade ไปทดสอบดวยเครอง Fluorometer แลวปรากฏวาคาทไดเปน 0 แสดงวาสารไมมปฏกรยาตอฟลออเรสเซนซ บนทกในฟอรมแบบบนทกการตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและรเอเจนต ในกรณคาทไดไมเปน 0 ใหด าเนนการแกไขโดยการเปลยน Methanol AR grade ขวดใหม 15.1.2.2 Methanol HPLC grade น า Methanol HPLC grade ไปทดสอบดวยเครอง Fluorometer แลวปรากฏวาคาทไดเปน 0 แสดงวาสารไมมปฏกรยาตอฟลออเรสเซนซ บนทกในฟอรมแบบบนทกการตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและรเอเจนต ในกรณคาทไดไมเปน 0 ใหด าเนนการแกไขโดยการเปลยน Methanol HPLC grade ขวดใหม

15.1.3 การทดสอบ AflaTest developer ทก Lot.ของการจดซอ โดยท าการทดสอบ ดงน น า AflaTest developer ผสมกบ Methanol HPLC grade ไปทดสอบดวยเครอง Fluorometer แลวปรากฏวาคาทไดเปน 0 แสดงวาสารไมมปฏกรยาตอฟลออเรสเซนซ บนทกในฟอรมแบบบนทกการตรวจสอบประสทธภาพสารเคมและรเอเจนต ในกรณคาทไดไมเปน 0 ใหด าเนนการแกไขโดยการเตรยม Afla Test developer ใหม

15.2 สภาวะแวดลอมของการทดสอบ -

15.3 วธก าจดของเสย / สารเคม 15.3.1 สารละลายมาตรฐาน Aflatoxin Mix ใหเตมสารละลายโซเดยมไฮโปคลอไรต 5-6 % แลวเทใสภาชนะทเตรยมไวส าหรบทงโดยเฉพาะเพอรอก าจดตอไป 15.3.2 เครองแกวหรอภาชนะทปนเปอนสารละลายมาตรฐานอะฟลาทอกซนและทมาจากตวอยางใหท าการแชเครองแกวหรอภาชนะในสารโซเดยมไฮเปอรคลอไรต 5-6% นาน 30 นาทกอนลางหรอกอนทง 15.3.3 Solvent ชนดอน ๆ เทใสภาชนะทจดเตรยมไวโดยจ าแนกตามชนดของ Solvent เพอรอทงรวมในถงใหญเพอก าจดตอไป 15.3.4 ส าหรบกาก แยกกากออกจาก Solvent ทงลงในถงด า 15.4 ขอควรระวง 15.4.1 ขนตอนการปนและกรองตวอยาง ไมควรทงตวอยางไวนานเกนไป เนองจาก Methanol เปนสารทระเหยงาย จงควรปดภาชนะทใสหรอท าการทดสอบทนท 15.4.2 ขนตอนการ clean up ตวอยางไมควรใชความดนมากจนเกนไป ควรปลอยใหตวอยางไหลผาน column เองประมาณ 1-2 หยด/วนาท เพอให column จบสารทตองการวเคราะหไดดยงขน 16. เอกสารอางอง 16.1 RIVM report601516009. (2002). The Factsheets for the(eco)toxicological risk assessment strategy of the National Institute for Public Health and the Environment (RIVM),Part II : p56. 16.2 Vicam Aflatest Instruction Manual.2014. AFLATEST Fluorometer Procedure for Milo,Grains Grain Based Feeds: p36.


3.2 วธทดสอบทางเคม 3.2.1 วธทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 1. วตถประสงค เพอทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 2. ขอบขาย

ใชทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวส าเรจรปและวตถดบอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 3. เอกสารทเกยวของ

3.1 การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบแคดเมยม 3.2 การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบแคดเมยม 3.3 การใชเครองทดสอบแรธาต (ICP-OES)

4. นยาม 4.1 อาหารสตว หมายถง อาหารสตวส าเรจรปและวตถดบอาหารสตว 4.2 Performance check หมายถง การตรวจสอบความสามารถการใชงานของเครองมอ 4.3 Calibration curve หมายถง กราฟความสมพนธระหวางความเขมขนของสารละลาย

(Concentration; X) กบความเขมของแสง (Intensity; Y) 4.4 Calibration verification of standard (CVS) หมายถง สารละลายมาตรฐานจากแหลงทแตกตางจากแหลงทใชเตรยม Calibration curve เพอใชทวนสอบ Calibration curve 4.5 Continuing calibration standard (CCS) หมายถง สารละลายมาตรฐานทใชสราง Calibration curve เพอใชทวนสอบ Calibration curve

4.6 Reagent blank หมายถง ตวอยางน าขจดไอออน เพอใหแนใจวาสญญาณทงหมดเปนของสงทตองการทดสอบ ไมใชจาก Reagent หรอสงอนๆ ทใชในการทดสอบ

4.7 Sample blank หมายถง ตวอยางทมลกษณะเหมอนหรอคลายคลงกบตวอยางทตองการทดสอบ แตปราศจากสงทตองการทดสอบ

4.8 Duplicate analysis หมายถง การทดสอบซ าในตวอยางเดยวกน 4.9 Certified reference materials (CRMs) หมายถง วสดหรอสารอางองมาตรฐานทไดรบการ

รบรอง โดยการด าเนนการทถกตองทางวชาการ มใบรบรองและสามารถสอบกลบ (Traceable) ไปยงมาตรฐานระหวางประเทศ (International standard, SI unit) ได

4.10 Spiked sample หมายถง Sample blank ทเตมสารละลายมาตรฐานททราบความเขมขนทแนนอนลงไป เพอใชในการตรวจสอบสมรรถนะของวธทดสอบ

4.11 Relative percent difference (%RPD) หมายถง การค านวณความแตกตางสมพทธ 4.12 Percent Recovery (%Recovery) หมายถง การค านวณการคนกลบของสาร

5. หลกการ การตรวจวเคราะหปรมาณแคดเมยม เปนการดดแปลงจาก AOAC Official Methods 935.13 (2012) โดยน าตวอยางทผานการบดไปยอยดวยกรดเขมขน แลวตรวจวเคราะหปรมาณแคดเมยมดวยเครอง ICP–OES (Inductively Coupled Plasma–Optical Emission Spectrometer) หลกการคอ เผาสารละลายของตวอยางทเตรยมไดดวยพลาสมาจากกาซอารกอนทอณหภมสงประมาณ 6,000 องศาเซลเซยส อะตอมของแคดเมยมเมอไดรบพลงงานจากพลาสมา กจะเปลยนสภาวะจากสภาวะพน (Ground state) ไปอยในสภาวะกระตน (Excited state) ตามธรรมชาตของธาตจะพยายามกลบสสภาวะพนโดย


การคายพลงงานทไดรบจากการกระตน ซงธาตแตละชนดจะคายพลงงานออกมาในรปของแสงทมความยาวคลนเฉพาะตว ตวตรวจวดกจะสามารถตรวจวดชนดและปรมาณของธาตได โดยแคดเมยมจะตรวจวดทความยาวคลน 228.802 นาโนเมตร 6. ความปลอดภย

เตรยมตวอยางใน Hood สวมแวนตา ถงมอและหนากากกนกรด 7. อปกรณและเครองมอ

7.1 เครองชงไฟฟา ชงไดละเอยด 0.0001 g 7.2 แทนความรอน (Hot plate) 7.3 กระดาษกรองเบอร 5

7.4 Erlenmeyer flask ขนาด 50 ml 7.5 Volumetric flask class A ขนาด 50 ml และ 100 ml 7.6 Volumetric pipette Class A ขนาด 1 5 และ 10 ml 7.7 Beaker 7.8 กระบอกตวง 7.9 Dropper 7.10 แทงแกวคนสาร 7.11 หลอดใสตวอยาง (Tube) พรอมฝาปด 7.12 เครอง ICP-OES (Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectrometer) 8. สารเคมและ/หรออาหารเลยงเชอ 8.1 กรดไนตรกความเขมขนไมนอยกวา 65%

8.2 กรดไนตรก 1% (v/v) ตวงกรดไนตรกความเขมขนไมนอยกวา 65% จ านวน 10 ml แลวเทลงในภาชนะทมน า

ขจดไอออนจ านวน 990 ml ผสมใหเขากน 8.3 กรดเปอรคลอรกความเขมขนไมนอยกวา 65% 8.4 น าขจดไอออน (DI) ความตานทานไมนอยกวา 18 เมกะโอหม 9. สารมาตรฐานและการเตรยม

9.1 Stock cadmium standard solution ความเขมขน 1000 mg/l ตดปายบงชสถานะสารละลายมาตรฐานและเกบทอณหภมหอง มอายการใชงานตามเอกสาร Certificated of analysis

9.2. การเตรยม Intermediate cadmium standard solution ความเขมขน 10 mg/l ปเปต Stock cadmium standard solution ความเขมขน 1000 mg/l ปรมาตร 1 ml ใสลงใน

Volumetric flask ขนาด 100 ml แลวปรบปรมาตรดวยกรดไนตรก 1% สารละลายมาตรฐานทเตรยมไดใหถายเทใสหลอดใสตวอยาง ตดปายบงชสถานะสารละลายมาตรฐานและเกบทอณหภม 2-8 oC มอายการใชงาน 30 วน

9.3 การเตรยม Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.01, 0.05, 0.10, 0.50, และ 1.00 mg/l


9.3.1 Working cadmium standard solution ความเขมขน 1.00 mg/l ปเปต Intermediate cadmium standard solution เขมขน 10 mg/l

ปรมาตร 10 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1%





9.3.4 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.05 mg/l ปเปต Working cadmium standard solution ความเขมขน 1.00 mg/l


9.3.5 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.01 mg/l ปเปต Working cadmium standard solution ความเขมขน 1.00 mg/l


9.3.6 Working cadmium standard solution ทเตรยมในขอ 9.3.1-9.3.5 ใหถายเทใส หลอดใสตวอยาง ตดปายบงชสถานะสารละลายมาตรฐานและเกบทอณหภม 2-8 oC มอายการใชงาน 30 วน 10. ขนตอนปฏบตงาน

10.1 ชงตวอยาง 1-2 g ใสลงใน Erlenmeyer flask 10.2 เตมกรดไนตรกประมาณ 10 ml 10.3 เตมกรดเปอรคลอรกประมาณ 4 ml 10.4 น าไปยอยบนแทนความรอนจนหมดควนสแดง แลวเกดควนสขาว 10.5 ถายใส Volumetric flask ขนาด 50 ml ปรบปรมาตรดวยน าขจดไอออน ผสมใหเขากน 10.6 กรองดวยกระดาษกรองเบอร 5 10.7 ตรวจวดดวยเครอง ICP-OES ทความยาวคลน 228.802 นาโนเมตร ปฏบตตามวธใช

เครองมอ เรอง การใชเครองทดสอบแรธาต (ICP-OES) 11. การค านวณ

11.1 ผลทดสอบ ปรมาณแคดเมยม มหนวยเปน mg/l ไดจากเปรยบเทยบระหวาง Calibration curve

ของสารละลายมาตรฐานแคดเมยม ทมความเขมขน 0.01, 0.05, 0.10, 0.50 และ 1.00 mg/l กบคา Intensity โดยมคา Coefficient of Determination (R2) ไมนอยกวา 0.990 และค านวณเปรยบเทยบกบ น าหนกตวอยาง มหนวยเปน mg/kg


ปรมาณแคดเมยม (mg/kg) =

11.2 Relative percent difference (%RPD)

%RPD =

11.3 Percent Recovery (%Recovery) 11.3.1 Certified reference materials (CRMs)

%ความถกตอง =

11.3.2 Spiked sample

%Recovery =

12. การควบคมคณภาพ 12.1 Performance check

ใชการทดสอบสารละลายมาตรฐานแคดเมยมความเขมขน 1.00 mg/l ทกครงกอนเรม การทดสอบ เกณฑการยอมรบคอ คา Intensity ของ Performance check ตงแต 150000 cps ขนไป 12.2 Calibration curve

ใช Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.01, 0.05, 0.10, 0.50, และ 1.00 mg/l ท า Calibration curve ทกครงกอนเรมการทดสอบตวอยาง เกณฑการยอมรบคอคา Coefficient of Determination (R2) ไมนอยกวา 0.990 12.3 Calibration verification of standard (CVS) หรอ Continuing calibration standard (CCS) 12.3.1 Calibration verification of standard (CVS)

ใชการทดสอบสารละลายมาตรฐานแคดเมยมและความเขมขน 1.00 mg/l จาก แหลงทแตกตางจากแหลงทใชเตรยม Calibration curve ทกครงกอนเรมทดสอบตวอยาง เกณฑการยอมรบคอ ±10% ของคาจรงและ %Recovery ตงแต 90-110% 12.3.2 Continuing calibration standard (CCS)

ใชการทดสอบสารละลายมาตรฐานแคดเมยมทความเขมขน 1.00 mg/l จาก สารละลายมาตรฐานทใชสราง Calibration curve ทกครงระหวางการทดสอบตวอยางแตละชด เกณฑการยอมรบคอ ±5% ของคาจรงและ %Recovery ตงแต 95-105%

12.4 Reagent blank ใชน าขจดไอออนปรมาตร 1-2 ml แทนตวอยางทดสอบ แลวปฏบตตามขอ 10.2 - 10.4

ท า Reagent blank ทกๆ 10 ตวอยางหรอนอยกวา เกณฑการยอมรบคอ นอยกวา Limit of detection (LOD)

(g) อยางน าหนกตว(mL) ยมทายทเตรปรมาตรสด(mg/L) องไดจากเครคาทอาน

100รงอบทงสองคองผลการทดสคาเฉลยข

2 ครงทผลการทดสอบ1 ครงทผลการทดสอบ

100คาจรงากการทดสอบคาทไดจ

100 เตมลงไปายมาตรฐานทนของสารละลความเขมข

างเรมตนนของตวอยความเขมขsample Spiked นของความเขมข


12.5 Sample blank ใชตวอยางทมลกษณะเหมอนหรอคลายคลงกบตวอยางทตองการทดสอบ แลวปฏบตตาม

ขอ 10.1 – 10.4 ท า Sample blank ทกๆ 10 ตวอยางหรอนอยกวา เกณฑการยอมรบคอ นอยกวา Limit of detection (LOD)

12.6 Duplicate analysis ทดสอบตวอยางอก 1 ซ า ในตวอยางเดยวกนทกๆ 10 ตวอยางหรอนอยกวา เกณฑการ

ยอมรบคอ %RPD ไมเกน 10% 12.7 Certified reference materials (CRMs) หรอ Spiked Sample

12.7.1 Certified reference materials (CRMs) ใช Certified reference materials (CRMs) ทมลกษณะเหมอนหรอ

คลายคลงกบตวอยางทตองการทดสอบ แลวปฏบตตามขอ 10.1 - 10.4 ท า Certified reference materials (CRMs) ทกๆ 10 ตวอยางหรอนอยกวา เกณฑการยอมรบคอ % ความถกตอง ตงแต 80-110 % และอยในชวง Control chart

12.7.2 Spiked Sample ใชตวอยางทมลกษณะเหมอนหรอคลายคลงกบตวอยางทตองการทดสอบ

แลวน ามาเตมสารละลายมาตรฐาน แลวปฏบตตามขอ 10.1 - 10.4 ท า Spiked sample ทกๆ 10 ตวอยางหรอนอยกวา เกณฑการยอมรบคอ %Recovery ตงแต 80-110 % และอยในชวง Control chart

Control chart ท าไดโดยน า % ความถกตอง ของ Certified reference materials (CRMs) และหรอ %Recovery ของ Spiked Sample จ านวน 30 ครงทเวลาตางกน น าไปหาคา และ SD สราง Control chart โดยมเสน Center Line (CL) เทากบ เสน Upper Control Limit (UCL) เทากบ +3SD เสน Lower Control Limit (LCL) เทากบ -3SD เสน Upper Warning Limit (UWL) เทากบ +2SD และเสน Lower Warning Limit (LWL) เทากบ -2SD ถา %ความถกตอง ของ Certified reference materials (CRMs) และหรอ %Recovery ของ Spiked Sample อยในชวง Lower Warning Limit (LWL) และ Upper Warning Limit (UWL) ของ Control Chart ใหท าการรายงานผลการทดสอบ แตถา %ความถกตอง ของ Certified reference materials (CRMs) และหรอ %Recovery ของ Spiked Sample ไมอยในชวงดงกลาว ใหท าการทดสอบตวอยางชดนนพรอม Certified reference materials (CRMs) และหรอ Spiked Sample ใหม แตถา %ความถกตอง ของ Certified reference materials (CRMs) และหรอ %Recovery ของ Spiked Sample มขอมลตอเนองกน 7 คาหรอมากกวา อยดานใดดานหนงของ Center Line หรอมขอมลตอเนองกน 6 คา มแนวโนมเพมขนหรอลดลงหรอขอมลมลกษณะเปนวฏจกร ใหหยดท าการทดสอบ เพอหาสาเหตและด าเนนการแกไขซงอาจรวมถงการสราง Control chart ใหม แลวจงด าเนนการทดสอบตอไป

12.8 Proficiency test เขารวมการเปรยบเทยบผลทดสอบระหวางหองปฏบตการหรอโปรแกรมการทดสอบความ

ช านาญอยางนอยปละ 1 ครง 13. การบนทกขอมลและเอกสารทควรตองจดท า

13.1 บนทกขอมลการทดสอบโลหะหนก 13.2 แบบบนทกการใชเครองชง 13.3 แบบบนทกการใชงานเครองมอวทยาศาสตร

X XX X

X X


13.4 บนทกรายงานผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางเคม (แรธาตและโลหะหนก) 13.5 สมดบนทกการเบกตวอยาง (งานทดสอบเคม) 13.6 สมดบนทกการใชงาน ดแลและบ ารงรกษาเครองวเคราะหแรธาต (ICP-OES) 13.7 สมดบนทกการสงผลทดสอบโลหะหนก 13.8 สมดบนทกการเตรยมสารเคม (โลหะหนก)

14. การรายงานผล 14.1 การรายงานผลการทดสอบหาปรมาณแคดเมยมใหรายงานลงในบนทกรายงานผลทดสอบ

คณภาพอาหารสตวทางเคม (แรธาตและโลหะหนก) มหนวยเปน mg/kg 14.2 กรณทผลการทดสอบพบปรมาณแคดเมยมนอยกวาคา LOD จะรายงานวา “ไมพบ” 14.3 กรณทผลการทดสอบพบปรมาณแคดเมยมอยในชวงระหวางคา LOD ถงนอยกวาคา LOQ

จะรายงานวา “นอยกวา....... (คา LOQ)” เชน คา LOD เทากบ 0.03 mg/kg คา LOQ เทากบ 0.08 mg/kg ผลการทดสอบเทากบ 0.05 mg/kg จะรายงานวา “นอยกวา 0.08 mg/kg”

14.4 กรณทผลการทดสอบพบปรมาณแคดเมยมมากกวาหรอเทากบคา LOQ ใหรายงานเปนตวเลข โดยมทศนยม 2 ต าแหนง

14.5 กรณทผ ใชผลทดสอบรองขอการรายงานผลพรอมคาความไมแนนอนของการวด ใหด าเนนการค านวณคาความไมแนนอนตามเอกสารวธปฏบตงานเรอง การการประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES โดยรายงานผลการทดสอบ คา Uncertainty พรอมระบความเชอมน เชน 1.00 0.04 mg/kg ทระดบความเชอมน 95% 15. เอกสารอางอง

AOAC Official Method 935.13. 2012. Calcium in Animal Feed


3.3 วธทดสอบทางจลชววทยา 3.3.1 วธทดสอบเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว 1. วตถประสงค

เพอใหเจาหนาททราบถงวธการและสามารถทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว 2. ขอบขาย ทดสอบผลตภณฑทเปนอาหารสตวทกประเภท วตถดบ หวอาหารสตว อาหารสตวผสมส าเรจรป อาหารเสรมส าหรบสตว และสารผสมลวงหนา 3. เอกสารทเกยวของ

3.1 คมอคณภาพ 3.2 ขนตอนการปฏบตงาน

3.3 การสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา 4. นยาม 4.1 Salmonella spp. หมายถง เชอจลนทรยทมลกษณะ typical หรอ less typical colony บนอาหารเลยงเชอเฉพาะ (solid selective media) และใหผล biological และ serological ภายใตขอก าหนดทใชในวธทดสอบน

4.2 การตรวจหาเชอ Salmonella spp. หมายถง การตรวจวาพบหรอไมพบเชอ Salmonella spp. ในตวอยางภายใตขอก าหนดทใชในวธทดสอบน 5. หลกการ

เปนวธทดสอบเพอคดแยกเชอ Salmonella spp. จากเชอชนดอนๆ ในตวอยาง โดยแบงเปนขนตอนดงนคอ ขน Pre-enrichment ขน Selective-enrichment ขนเพาะแยกเชอในอาหารแขง (Selective plating media) และขนทดสอบยนยนชนดโดยคณสมบตทางชวเคมทส าคญและคณสมบตทางซรมวทยา ดวยการตกตะกอนกบแอนตซรมทจ าเพาะตอเชอ Salmonella spp. 6. ความปลอดภย 6.1 ท าการทดสอบในตปลอดเชอ (laminar flow) ชนดทออกแบบใหมกระแสลมสะอาดพนขนหรอลงในแนวหนาต หรอมลมพนออกจากภายในต 6.2 หองปฏบตการจลชววทยาเปนหองปรบอากาศซงจะปองกนและลดการปนเปอนของจลนทรยจากกระแสลม

6.4 ภายในหองปฏบตการตดหลอดแสงอลตราไวโอเลต (UV) เพอท าลายจลนทรยขณะทไมมการ ปฏบตงาน

6.4 ควบคมสภาพแวดลอมภายในหองปฏบตการ 7. อปกรณ และเครองมอ

7.1 อปกรณ เครองแกว 7.1.1 ถงพลาสตกปราศจากเชอ ขนาด 7 x 11 เซนตเมตร 7.1.2 หลอดทดลองพรอมฝาเกลยว ขนาด 16 x 150 มลลเมตร 7.1.3 หลอดทดลองพรอมจกยาง 7.1.4 จานเพาะเลยงเชอพลาสตก ขนาดเสนผานศนยกลาง 90 มลลเมตร 7.1.5 จานเพาะเลยงเชอพลาสตก แบบ 2 ชอง ขนาดเสนผานศนยกลาง 100 มลลเมตร 7.1.6 ชอนตกตวอยาง


7.1.7 ปเปต ขนาด 1 มลลลตร และ 10 มลลลตร 7.1.8 เขมเขยเชอ (needle) และลวดเขยเชอ (loop) ขนาดหวง 3 มลลเมตร หรอ 10

ไมโครลตร 7.1.9 Pasteur pipette 7.1.10 ตะแกรงใสหลอดทดลอง 7.1.11 กระบอกตวง 7.1.12 กระจกสไลด

7.2 เครองมอ 7.2.1 เครองชง 2 ต าแหนง

7.2.2 ตบมเชอ 37 1 องศาเซลเซยส 7.2.3 อางน าควบคมอณหภม 44 - 47 องศาเซลเซยส 7.2.4 อางน าควบคมอณหภมแบบเขยา 41.5 1 องศาเซลเซยส 7.2.5 เครองเขยาหลอดทดลอง 7.2.6 เครองวดคาความเปนกรด–ดาง 0.1 pH ทอณหภม 20 – 25 องศาเซลเซยส 7.2.7 เครองนงฆาเชอ 7.2.8 เครองอบฆาเชอ 7.2.9 ตปลอดเชอ 7.2.10 เตาอบไมโครเวฟ


8.1.1 Ethanol 70% และ 95% 8.1.2 2-Methylbutan-2-ol 8.1.3 4-Dimethylaminobenzaldehyde 8.1.4 Hydrochloric acid 8.1.5 Sterile distilled water 8.1.6 0.85% Sterile Normal saline solution (NSS) 8.1.7 Urea 8.1.8 Methyl red 8.1.9 Potassium hydroxide 8.1.10 Naphthol 8.1.11 ONPG disks

8.2 แอนตซรม 8.2.1 Salmonella agglutinating Antiserum OMA 8.2.2 Salmonella agglutinating Antiserum OMB 8.2.3 Salmonella agglutinating Antiserum OMC 8.2.4 Salmonella agglutinating Antiserum OMD 8.2.5 Salmonella agglutinating Antiserum OME 8.2.6 Salmonella agglutinating Antiserum OMF


8.2.7 Salmonella agglutinating Antiserum OMG 8.2.8 Antiserum Salmonella A 8.2.9 Antiserum Salmonella B 8.2.10 Antiserum Salmonella C 8.2.11 Antiserum Salmonella D 8.2.12 Antiserum Salmonella E 8.2.13 Antiserum Salmonella G 8.2.14 Antiserum Salmonella I 8.2.15 Antiserum Salmonella Vi

8.3 อาหารเลยงเชอ 8.3.1 Buffered Peptone Water (BPW) 8.3.2 Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn broth) with

2% Iodine-Iodide solution and 0.5% Novobiocin solution 8.3.3 Rappaport-Vassiliadis medium with Soya (RVS) broth 8.3.4 Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD agar) 8.3.5 Hektoen Enteric Agar (HE agar) 8.3.6 Triple Sugar Iron Agar (TSI agar) 8.3.7 Lysine Indole Motility (LIM) หรอ (MIL) 8.3.8 Urea agar (Christensen) 8.3.9 Methyl-red Voges-Proskauer broth (MR-VP broth) 8.3.10 Nutrient agar (NA)

การเตรยมอาหารเลยงเชอ 1. Buffered Peptone Water (BPW)

สวนประกอบ Enzymatic digest of casein 10.0 กรม Sodium chloride 5.0 กรม Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4.12H2O)

9.0 กรม

Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 1.5 กรม ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส

ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส สามารถเกบไดนาน 3 เดอน ทอณหภม 5±3 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ


2. Rappaport-Vasiliadis medium with Soya (RVS broth) 2.1 Solution A

สวนประกอบ Enzymatic digest of soya 5.0 กรม Sodium chloride 8.0 กรม Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 1.4 กรม Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 0.2 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร หากสวนประกอบไมละลายใหใชความรอน 70 องศาเซลเซยส ควรเตรยม Solution A ไวกอนทจะเตรยม Completed RVS medium 1 วน

2.2 Solution B สวนประกอบ Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2.6H2O) 400.0 กรม

ละลายในน า 1 ลตร เกบไวในขวดแกวสเขม สามารถเกบไวทอณหภมหองนาน 2 ป 2.3 Solution C

สวนประกอบ Malachite green oxalate 0.4 กรม น า 100 มลลลตร

ละลายน า เกบไวในขวดแกวสเขม สามารถเกบไวทอณหภมหองนาน 8 เดอน การเตรยม Completed RVS medium

สวนประกอบ Solution A 1000 มลลลตร Solution B 100 มลลลตร Solution C 10 มลลลตร

ผสมสวนประกอบทงหมดใหเขากน ดดใสหลอดทดลองฝาเกลยว หลอดละ 10 มลลลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 115 องศาเซลเซยส นาน 15 นาท pH 5.2 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส ควรใชวเคราะหภายในวนทเตรยม

หมายเหต (1) หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ ดดใสหลอดทดลองฝาเกลยว หลอดละ 10 มลลลตร น าไปนงฆาเชอตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ


3. Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn) with 2 % Iodine-Iodide solution and 0.5 % Novobiocin solution

สวนประกอบ Meat extract 4.3 กรม Enzymatic digest of casein 8.6 กรม Sodium chloride (NaCl) 2.6 กรม Calcium carbonate (CaCO3) 38.7 กรม Sodium thiosulfate pentahydrate (Na2S2O3.5H2O) 47.8 กรม Ox bile for bacteriological use 4.78 กรม Brilliant green 9.6 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน านงฆาเชอ 1 ลตร น าไปตมนาน 5 นาท pH 8.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส รอใหเยนเตม Iodine – Iodide solution 2:100 (มลลลตร/มลลลตร) และ Novobiocin 0.5 : 100 (มลลลตร/มลลลตร) เขยาใหสารละลายเขากน ดดใสหลอดทดลอง หลอดละ 10 มลลลตร และใชวเคราะหภายในวนทเตรยม หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตร ยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ

4. Xylose Lysine Deoxycholate Agar (XLD agar) สวนประกอบ Yeast extract powder 3.0 กรม Sodium chloride (NaCl) 5.0 กรม Xylose 3.75 กรม Lactose 7.5 กรม Sucrose 7.5 กรม L-Lysine hydrochloride 5.0 กรม Sodium thiosulfate 6.8 กรม Iron (III) ammonium citrate 0.8 กรม Phenol red 0.08 กรม Sodium deoxycholate 1.0 กรม Agar 9.0-18.0 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน านงฆาเชอ 1 ลตร น าไปตมใหละลาย pH 7.4 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ น าไปแชในอางน าควบคมอณหภมท 45 องศาเซลเซยส แลวเทใสเพลท เพลททเทไวแลวสามารถเกบไดนาน 5 วน ทอณหภม 3 2 องศาเซลเซยส กอนใชควรตากเพลทใหผวหนาแหง


5. Hektoen Enteric Agar (HE agar) สวนประกอบ Yeast extract 3.0 กรม Peptone 15.0 กรม Bromothymol blue 0.05 กรม Sodium chloride 5.0 กรม Sodium thiosulphate 5.0 กรม Lactose 14.0 กรม Salicin 2.0 กรม Sucrose 14.0 กรม Bile salt mixture 2.0 กรม Fuchsin acid 0.08 กรม Iron (III) ammonium citrate 1.5 กรม Agar 13.5 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน านงฆาเชอ 1 ลตร น าไปตมใหละลาย หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ น าไปแชในอางน าควบคมอณหภมท 45 องศาเซลเซยส แลวเทใสเพลท เพลททเทไวแลวสามารถเกบไดนาน 5 วน ทอณหภม 3 2 องศาเซลเซยส กอนใชควรตากเพลทใหผวหนาแหง

6. Nutrient agar (NA) สวนประกอบ Meat extract 3.0 กรม Peptone 5.0 กรม Agar 9.0-18.0 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ น าไปแชในอางน าควบคมอณหภมท 45 องศาเซลเซยส แลวเทใสเพลท เพลททเทไวแลวสามารถเกบไดนาน 5 วน ทอณหภม 3±2 องศาเซลเซยส กอนใชควรตากเพลทใหผวหนาแหง


7. Triple Sugar Iron agar (TSI agar) สวนประกอบ Meat extract 3.0 กรม Yeast extract 3.0 กรม Peptone 20.0 กรม Sodium chloride (NaCl) 5.0 กรม Lactose 10.0 กรม Sucrose 10.0 กรม Glucose 1.0 กรม Iron (III)citrate 0.3 กรม Sodium thiosulfate 0.3 กรม Phenol red 0.024 กรม Agar 9.0-18.0 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร pH 7.4 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ ดดใสหลอดทดลอง หลอดละ 10 มลลลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท น ามาวางเอยงใหเกด slant และ butt สามารถเกบไดนาน 3 เดอน ทอณหภม 5±3 องศาเซลเซยส 8. MIL (Motility Indole Lysine) หรอ LIM (Lysine Indole Motility)

สวนประกอบ Peptone 10.0 กรม Pancreatic digest of casein 10.0 กรม Yeast extract 3.0 กรม L-Lysine HCL 10.0 กรม Dextrose 1.0 กรม Ferric ammonium citrate 0.5 กรม Bromcresol purple 0.02 กรม Agar 2.0 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าของผลตภณฑขางขวด ดดใสหลอดทดลองหลอดละ 5 มลลลตร นงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท pH 6.8 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส ทงใหเยนในลกษณะหลอดตงตรง สามารถเกบไดนาน 3 เดอน ทอณหภม 5±3 องศาเซลเซยส


9. Urea agar (Christensen) สวนประกอบ Peptone 1.0 กรม Glucose 1.0 กรม Sodium chloride (NaCl) 5.0 กรม Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 2.0 กรม Phenol red 0.012 กรม Agar 9.0-18.0 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร นงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท pH 6.8 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส เตม Urea Solution (อตราสวน Urea agar 950 มลลลตร : Urea Solution 50 มลลลตร) หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑดดใสหลอดทฆาเชอแลว น ามาวางเอยงใหเกด slant และ butt สามารถเกบไดนาน 3 เดอน ทอณหภม 5 3 องศาเซลเซยส

10. Methyl-red Voges-Proskuer broth (MR-VP broth) สวนประกอบ Peptone 7.0 กรม Glucose 5.0 กรม Dipotassium hydrogen phosphate (K2HPO4) 5.0 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ ดดใสหลอดทดลองหลอดละ 3 มลลลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท pH 6.9 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส สามารถเกบไดนาน 3 เดอน ทอณหภม 5 3 องศาเซลเซยส การเตรยมสารเคม

1. Novobiocin solution สวนประกอบ Novobiocin sodium salt 0.04 กรม Sterile water 5 มลลลตร

ละลาย Novobiocin sodium salt ดวย Sterile water กรองดวยกระดาษกรอง สามารถเกบไวไดนาน 4 สปดาห ทอณหภม 3 2 องศาเซลเซยส

2. Iodine-iodide solution สวนประกอบ Iodine 20.0 กรม Potassium iodide (KI) 25.0 กรม Sterile water 100 มลลลตร

ละลาย Iodine และ Potassium iodide ดวย Sterile water 10 มลลลตร แลวเตม Sterile water ใหครบ 100 มลลลตร


3. Kovac’s reagent สวนประกอบ 4 – Dimethylaminobenzaldehyde 5.0 กรม Hydrochloric acid (HCl) 25 มลลลตร 2 – Methyl butan – 2 – ol 75 มลลลตร

ละลาย 4 – Dimethylaminobenzaldehyde ดวย 2 – methyl butan – 2 – ol แลวเตม HCl acid และคนใหสารทงหมดละลายเขากน เกบไวทอณหภม 4 องศาเซลเซยส

4. Urea solution สวนประกอบ Urea 400.0 กรม Water (final volume) 1000 มลลลตร

ละลาย Urea ดวยน าแลวปรบปรมาตรใหได 1000 มลลลตร กรองดวยกระดาษกรอง 5. Creatine solution (N-amidinosarcosine)

สวนประกอบ Creatine monohydrate 0.5 กรม Water 100 มลลลตร

เตรยมโดยละลาย Creatine monohydrate ในน า 6. 1-Naphthol ethanolic solution

สวนประกอบ 1-Naphthol 6.0 มลลลตร Absolute ethanol 100 มลลลตร

เตรยมโดยละลาย 1-Naphthol ใน Absolute ethanol 7. 40 % Potassium hydroxide solution

สวนประกอบ Potassium hydroxide 40.0 กรม Water 100 มลลลตร

เตรยมโดยละลาย Potassium hydroxide ในน า 8. -galactosidase reagent

สวนประกอบ ONPG disks 1 disk 0.88 % sodium chloride 0.1 มลลลตร

เตรยมโดยเตม ONPG disks ลงใน 0.88 % sodium chloride 9. สารมาตรฐาน

Salmonella Typhimurium ATCC 14028


10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 การเตรยมตวอยาง

10.1.1 การสมชกตวอยางเพอทดสอบ บนทกขอมลเกยวกบตวอยาง ตวอยางทไดรบควรอยในภาชนะบรรจทปดสนท ไมฉกขาด หรอเสยหายระหวางการขนสงหรอการเกบรกษา ผสมตวอยางใหทวถงในถงตวอยางจนเขากนดและสมตกตวอยางใหกระจายหลาย ๆ จดในการทดสอบแตละตวอยาง 10.1.2 การชงตวอยางส าหรบทดสอบ ชงตวอยางอาหารสตว 25 1.25 กรม ใสขวดหรอถงพลาสตก 10.2 ขนตอนการทดสอบ 10.2.1 ขน Pre – enrichment เปนระยะทชวยใหเชอทอยในภาวะเครยด บาดเจบ ฟนคนชพแขงแรงและสามารถเจรญเตบโตได

ชงตวอยาง 25 1.25 กรม ใสขวดหรอถงพลาสตกเตม Buffered Peptone water (BPW) 225 มลลลตรและบนทกลงใน บนทกขอมลการทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว ผสมใหเขากนโดยการเขยา น าไปบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 16- 20 ชวโมง

10.2.2 ขน Selective enrichment เปนระยะทชวยใหเชอเจรญเตบโต เพมจ านวนไดดและจะไปท าใหจ านวนเชออน ๆ ลดลง

10.2.2.1 ดด 0.1 มลลลตร จากขอ 10.2.1 ใสใน 10 มลลลตร ของ Rappaport-vasiliadis soya peptone (RVS) บมทอณหภม 41.5 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง ในอางน าควบคมอณหภมหรอตบมเพาะเชอ 10.2.2.2 ดด 1.0 มลลลตร จากขอ 10.2.1 ใสใน 10 มลลลตร ของ Muller Khuffman Tetrathionate เตม novobiocin และ Iodine – Iodide solution บมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง ในอางน าควบคมอณหภมหรอตบมเพาะเชอ 10.2.3 ขน Plating out เปนการแยกเชอโดยใชอาหารเลยงเชอชนดแขงทมความจ าเพาะ 10.2.3.1 ถายเชอจากอาหารเลยงเชอ RVS (ขอ 10.2.2.1) ลงบนอาหารเลยงเชอ Xylose Lysine deoxycholate agar (XLD) และ Hektoen Enteric agar (HE) หรออาหารเลยงเชอชนดอนทเหนวาเหมาะสมกบชนดตวอยางทท าการวเคราะห ขดเชอ (streak) ใช 1 loopful ตออาหารเลยงเชอแตละชนด โดยไมตองเผาลวดเขยเชอ (loop) 10.2.3.2 ถายเชอจากอาหารเลยงเชอ MKTTn (ขอ 10.2.2.2) ลงบนอาหารเลยงเชอ XLD และ HE หรออาหารเลยงเชอชนดอนทเหนวาเหมาะสมกบชนดตวอยางทท าการทดสอบ ขดเชอ (streak) ใช 1 loopful ตออาหารเลยงเชอแตละชนด โดยไมตองเผาลวดเขยเชอ (loop) 10.2.3.3 การบมเชอ ใหคว าเพลท บมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง 10.2.3.4 ตรวจดลกษณะโคโลนทมลกษณะเหมอนเชอ Salmonella spp. บนอาหารเลยงเชอแตละชนด ถามเชอเจรญเพยงเลกนอยหรอไมมเชอใหบมตออก 18-24 ชวโมง

ลกษณะโคโลนของเชอ Salmonella spp. บนอาหารเลยงเชอ XLD โคโลนสแดงใส ตรงกลางสด า (H2S positive)

โคโลนสชมพ ตรงกลางสชมพเขม S. Paratyphi (H2S negative) โคโลนสเหลองมหรอไมมสด าตรงกลาง (Lactose positive)


HE โคโลนสเขยวใส มหรอไมมสด าตรงกลาง โดยการบนทกผลลงใน บนทกผลทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว ดงน

“+” เมอตรวจพบลกษณะโคโลนทมลกษณะตรงตาม “ลกษณะโคโลนของเชอ Salmonella spp. บนอาหารเลยงเชอ”

“-” เมอตรวจไมพบลกษณะโคโลนทมลกษณะตรงตาม “ลกษณะโคโลนของเชอ Salmonella spp. บนอาหารเลยงเชอ”

10.1.4 เลอกโคโลน ทมลกษณะสงสยวาจะเปนเชอ Salmonella spp. อยางนอยเพลทละ 1 โคโลน (ขอ 10.2.3.4) เขยเชอลงบน Nutrient agar (NA) plate น าไปบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง

10.1.5 ขน Confirmation 10.1.5.1 ขน Biochemical test

10.1.5.1.1 ทดสอบ Lysine Indole Motility medium (LIM หรอ MIL) ใชเขมเขยเชอแตะโคโลนทเลอกไว 1 โคโลน จาก Nutrient agar plate (ขอ 10.2.4) แลวแทง (Stab) ลงในอาหารเลยงเชอ MIL โดยใหหางจากกนหลอดประมาณ 0.5 เซนตเมตร น าไปบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง

การแปลผล 1. Lysine decarboxylation

ผลบวก อาหารเลยงเชอมสมวง ผลลบ อาหารเลยงเชอมสเหลอง เชอ Salmonella spp. ใหผลบวก ยกเวน S. Paratyphi A

2. Motility ผลบวก อาหารเลยงเชอขน ผลลบ อาหารเลยงเชอใสขนเฉพาะบรเวณทเขมเขยเชอแทง (Stab) เชอ Salmonella spp. ใหผลบวกหรอลบ

3. Indole (เมอหยด Kovac’s reagent ลงใน LIM หลงจากอานผล Lysine decarboxylation และ Motility แลว)

ผลบวก เกดวงแหวนสแดง ผลลบ เกดวงแหวนสเหลองของ Kovac’s reagent เชอ Salmonella spp. ใหผลลบ

10.1.5.1.2 ทดสอบ Triple Sugar Iron agar (TSI) ใชเขมเขยเชอเดมทแทง (stab) ลงบน LIM (ขอ 10.1.5.1.1) ขดเชอ (streak) เชอลงบนผวเอยงของอาหารเลยงเชอ TSI slant และแทง (stab) สวนดานลางจนถงกนหลอด น าไปบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง

การแปลผล เปนการทดสอบความสามารถในการยอยสลายน าตาล 3 ชนด ไดแก น าตาลกลโคส แลคโตส และซโครส โดยมการแปลผลดงน


สวนกนหลอด เหลอง (A) ยอยสลายน าตาลกลโคส แดงหรอไมมการเปลยนแปลง(K) ไมยอยสลายน าตาลกลโคส ด า สรางไฮโดรเจนซลไฟด (H2S) มฟองอากาศหรอรอยแตก (G) เกดแกสจาการยอยสลายน าตาลกลโคส สวนผวเอยง

เหลอง (A) ยอยสลายน าตาลแลคโตสและ/หรอซโครส แดงหรอไมเปลยนแปลง (K) ไมยอยสลายน าตาลแลคโตสและซโครส ตารางท 3.24 การแปลผลทดสอบ Triple Sugar Iron agar (TSI)

10.1.5.1.3 การทดสอบยเรย (Urea) ใชเขมเขยเชอเดมทแทง (stab) ลงบนอาหารเลยงเชอ TSI (ขอ 11.1.5.1.2) ขดเชอ (streak) ลงบนผวเอยงของหลอดอาหารเลยงเชอยเรย บมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง

การแปลผล ผลบวก สชมพ

ผลลบ ไมเปลยนแปลง เชอ Salmonella spp. ใหผลลบ

10.1.5.1.4 การทดสอบ Voges-Proskauer (VP) ใชเขมเขยเชอเดม ทแทง(stab) ลงบน TSI (ขอ 10.2.5.1.2) มาแทง (stab) ลงในหลอดอาหารเลยงเชอ Methyl-red Voges-Proskauer broth บมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 21 – 27 ชวโมง การแปลผล เมอเตม 3 มลลลตร ของ Barrit’s solution และ 1 มลลลตร ของ 40% Potassium hydroxide solution เขยาและอานผลภายใน 15 นาท

ผลบวก สชมพถงแดง ผลลบ ไมเปลยนแปลง

เชอ Salmonella spp. ใหผลลบ 10.1.5.1.5 การทดสอบ -galactosidase ใชเขมเขยเชอ เขยโคโลน

เดยวกนกบททดสอบ TSI (ขอ 10.1.5.1.2) ลงในหลอดทม ONPG disks 1 ชนและ 0.85% Sodium chloride แลวบมทอณหภม 35 1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 6 ชวโมง หากใหผลลบ บมตออกจนครบ 24 ชวโมง จงอานผล

การแปลผล ผลบวก สเหลอง ผลลบ ไมมส เชอ Salmonella spp. ใหผลลบ ยกเวน S. enterica subspecies arizonae

ชนดเชอ Slant Bottom H2S แกส Salmonella spp.

K A +/- +/-


ตารางท 3.25 การแปลผลทางชวเคม TSI LIM Bacteria

K/A, H2S+, Gas+ + - + Salmonella spp. K/A, H2S+, Gas- + - + Salmonella Typhi K/A, H2S-, Gas+ - - + S. Paratyphi A K/A, H2S-, Gas-/+ + - + S. Choleraesuis K/A, H2S-, Gas- + - + S. Gallinarum, S.pullorum

บนทกผลการทดสอบทางชวเคม ลงในบนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว

10.1.5.2 ขนทดสอบทางซรมวทยา (slide agglutination test) เปนการยนยนชนดของเชอ Salmonella spp.

10.1.5.2.1 เชดสไลดขนาด 1 x 3 นวใหสะอาดดวย Alcohol 70% 10.1.5.2.2 หยด 0.85 % Normal saline 1 หยด ใชลปฆาเชอแลว

เขยเชอจาก TSI (ขอ 10.1.1.1.2) ผสมกนแลวดการตกตะกอน ถาตกตะกอนไมตองทดสอบตอ แลวสงตวอยางไปทดสอบทศนย Salmonella และ Shigella แหงชาต

10.1.5.2.3 ถาไมตกตะกอน ทดสอบตอดงน O- antigen ท าการทดสอบเหมอน 10.1.5.2.2 แตหยด O- antigen

แทน 0.85% Normal saline โดยหยด Salmonella agglutinating Antiserum OMA แลวดการตกตะกอน ลงในบนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว

10.1.5.2.4 หากไมตกตะกอนใหทดสอบตอ โดยหยด Salmonella agglutinating Antiserum OMB แทน Salmonella agglutinating Antiserum OMA และทดสอบตอไปโดยเปลยนเปน OMC, OMD, OME, OMF และ OMG แลวบนทกผล + และรายงาน P (positive) ลงในบนทกขอมลการทดสอบยนยนชดเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว

10.1.5.2.5 ท าการทดสอบเหมอน 10.1.5.2.2 แตหยด Antiserum Salmonella A - I หากเกดการตกตะกอนกบ Antiserum Salmonella group ใด ใหบนทกผลลงในบนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว

10.1.5.2.6 เขยเชอทไมตกตะกอนกบ Salmonella agglutinating Antiserum OMA-OMG (ขอ 10.1.5.2.5) มาท าการทดสอบเหมอนกบขอ 10.1.5.2.2 แตหยด Vi – antigen แทน 0.85 % Normal saline แลวดการตกตะกอน

10.1.5.2.7 หากในขอ 10.1.5.2.4 ถงขอ 10.1.5.2.6 ไมเกดการตกตะกอน ใหบนทกผล – และรายงาน N (negative) ลงในบนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว

10.1.5.2.8 จากขอ 10.1.5.2.4 และขอ 10.1.5.2.7 ใหบนทกผล + หรอ - ลงในบนทกขอมลการทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว


11. การค านวณ - 12. การควบคมคณภาพ

ในการทดสอบทกครงมการควบคม ดงน 12.1 Negative Control ใช Buffered Peptone Water 12.2 Positive Control ใช เตมเชอ Salmonella spp. ชนด Salmonella Typhimurium

ATCC 14028 ประมาณ 10 -100 cfu ลงใน Buffered Peptone Water 12.3 Control media ใชอาหารเลยงเชอทใชในการทดสอบทกชนด โดยไมมการเตมเชอ 12.4 ทดสอบ Sterility ของถงพลาสตกโดยใช BHI ปรมาตร 225 มลลลตร โดยสมทดสอบ

ถงพลาสตก รอยละ 2 ของจ านวนตวอยางทดสอบในแตละครง 12.5 บนทกลงในบนทกขอมลการทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว และบนทก

ขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว 12.6 ท าการทดสอบซ าในทกตวอยางท 15

Pre-enrichment

Selective-enrichment

Confirmation

Plating out

ดด 0.1 มลลลตร ใสใน 10 มลลลตรของ RVS broth บมทอณหภม 41.5 1 องศาเซลเซยส นาน 24 3 ชวโมง

ดด 1 .0 มลลลตรใสใน 10 มลลลตรของ MKTTn broth บมท 37 1 องศาเซลเซยส นาน 24 3 ชวโมง

1 ลป streak ลงบน XLD agar และอก 1 ลป streak ลงบนอาหารเลยงเชออกชนด ทเหมาะสม (เชน HE ) บมท 37 1องศาเซลเซยส นาน 24 3 ชวโมง

เลอกโคโลนทมลกษณะเหมอนเชอ Salmonella spp. อยางนอย 1 โคโลน ถาใหผลบวก และใหท าอก 4 โคโลน ถาใหผลลบ

Biochemical Confirmation TSI, LIM, Urea, VP reaction, -galactosidase test

Serological Confirmations OMA, OMB, OMC, OMD, OME, OMF, OMG Antiserum Salmonella A - I และ Vi

แปลผล

Nutrient agar (NA) plate บมท 37 1 องศาเซลเซยส นาน 24 3 ชวโมง

บมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 18 2 ชวโมง

อาหารสตว 25 1.25 กรม + BPW 225 มลลลตร

รปท 3.7 ขนตอนการทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว


12.7 ท า Control media อาหารเลยงเชอ Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin broth (MKTTn) และ Rappaport-Vasiliadis medium with Soya (RVS broth) โดยสมรอยละ 2 ของจ านวนตวอยางทดสอบในแตละครง

12.7.1 ดดอาหารเลยงเชอปรมาตร 1 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอ 12.7.2 เทอาหารลยงเชอ Plate Count Agar (PCA) ปรมาตร 15 – 18 มลลลตร ลงใน

จานเพาะเลยงเชอ เขยาแลวทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว น าไปบมทอณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24 3ชวโมง

หมายเหต 1. ผลขอ 12.1, 12.3 และ 12.4 ตรวจไมพบเชอเจรญ และ ขอ 12.2 พบเชอ Salmonella spp. จงจะรายงานผลการทดสอบ

2. หากในขอ 12.1, 12.3 และ 12.4 ตรวจพบเชอเจรญ ผทดสอบจะตองรายงานผควบคมและจะท าการทดสอบตวอยางทท าการทดสอบทงชดซ าทงหมด และทบทวนหาสาเหต

3. หากในขอ 12.2 ไมพบเชอ Salmonella spp. ผทดสอบจะตองรายงานผควบคมและจะท าการทดสอบตวอยางทท าการ ทดสอบทงชดซ าทงหมด และทบทวนหาสาเหต 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช

13.1 บนทกขอมลการทดสอบหาเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว 13.2 บนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Salmonella spp. ในอาหารสตว 13.3 แบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา 13.4 แบบบนทกสรปผลการทดสอบ

14. การรายงานผล รายงานผล “พบ” เมอตรวจพบเชอ Salmonella spp. รายงานผลทดสอบในแบบบนทก

ผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา รายงานผล “ไมพบ” เมอตรวจไมพบเชอ Salmonella spp. รายงานผลทดสอบในแบบบนทก

ผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา 15. รายละเอยดอนๆ

จากขอ 14 น าแบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา ทรายงานผลการทดสอบเรยบรอยแลวไปใหผควบคมทบทวนและลงนามก ากบ รายงานผลการทดสอบตามวธปฏบตการสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา และบนทกผลลงในแบบบนทกสรปผลการทดสอบ 16. เอกสารอางอง 16.1 ธวชชย รอดสม. 2545. อาหารสตวตามกฎหมายควบคมคณภาพอาหารสตว คมอเจาหนาท เรองการควบคมคณภาพอาหารสตว. กรงเทพฯ : ส านกพฒนาการปศสตวและถายทอดเทคโนโลยกรมปศสตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ 16.2 ธวชชย รอดสม, โกเมศ ตลงจตรและเอกพนธ น าวล. 2540. กฎหมาย ระเบยบ ขอบงคบตาง ๆ เกยวกบพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525. (พมพครงท 5). กรงเทพฯ: ส านกพฒนาระบบและรบรองมาตรฐานสนคาปศสตว กรมปศสตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ 16.3 The International Organization for Standardization ISO 6579 : 2002. Microbiology of food and animal feeding stuffs-horizontal method for the detection of Salmonella spp.(4th ed.). Switzerland: International Organization for Standardization


16.4 The International Organization for Standardization ISO 6579/Amd1 : 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs-Horizontal method for the detection of Salmonella spp. AMENDMENT 1 ANNEX D: Detection of Salmonella spp. in animal feces and in environmental samples from the primary production stage. Switzerland: International Organization for Standardization 16.5 The International Organization for Standardization ISO 7218 : 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules for microbiological examinations 16.6 The International Organization for Standardization ISO 6887-1 : 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs –Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions 16.7 The International Organization for Standardization ISO 6887-2 : 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs –Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 2: Specific rules for the preparation of meat and meat products 16.8 The International Organization for Standardization ISO 6887-3 : 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs –Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 3: Specific rules for the preparation of fish and fishery products 16.9 The International Organization for Standardization ISO 6887-4 : 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs –Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products 16.10 The International Organization for Standardization ISO 11133 : 2014 (E). Microbiology of food, animal feed and water – Preparation, production,storage and performance testing of culture media


3.3.2 วธทดสอบ Total Plate Count (ปรมาณแบคทเรยทงหมด) ในอาหารสตว 1. วตถประสงค เพอใหเจาหนาททราบถงวธการและสามารถทดสอบ Total plate count (ปรมาณแบคทเรยทงหมด) ในอาหารสตว 2. ขอบขาย

ทดสอบผลตภณฑอาหารสตวชนดแหง เชน วตถดบอาหารสตว หวอาหารสตว อาหารสตวผสมส าเรจรป อาหารเสรมส าหรบสตว 3. เอกสารทเกยวของ

3.1 คมอคณภาพหองปฏบตการ 3.2 ขนตอนด าเนนงาน 3.3 การสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา

4. นยาม 4.1 Total Plate Count หมายถง การนบจ านวนโคโลนของแบคทเรยทงหมดทนบไดในอาหาร

เลยงเชอทท าการทดสอบตวอยาง รายงานเปน โคโลนตอกรม (cfu/g) 4.2 แบคทเรย หมายถง จลนทรยทมเซลลตางจากราและยสต เซลลแบบโปรคารโอต มรปราง

หลายแบบและขนาดเลก ท าใหมองไมเหนดวยตาเปลาตองดดวยกลองจลทรรศน ก าลงขยาย 1000 เทา จงจะเหนไดชด

4.3 cfu หมายถง colony forming units 5. หลกการ

5.1 เพาะเชอโดยเทคนคเทเพลท (poured plate) 5.2 นบจ านวนโคโลนของแบคทเรยทสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอชนดแขง Plate Count

Agar (PCA) หลงการบมทอณหภม 30 1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 72 3 ชวโมง 5.3 ค านวณปรมาณแบคทเรยตอตวอยาง 1 กรม

6. ความปลอดภย 6.1 ท าการทดสอบในตปลอดเชอ (laminar flow) ชนดทออกแบบใหมกระแสลมสะอาดพนขนหรอลงในแนวหนาต หรอมลมพนออกจากภายในต 6.2 หองปฏบตการจลชววทยาเปนหองปรบอากาศซงจะปองกนและลดการปนเปอนของจลนทรยจากกระแสลมภายนอก 6.3 ภายในหองปฏบตการตดหลอดแสงอลตราไวโอเลต (UV) เพอท าลายจลนทรย 6.4 ควบคมสภาวะแวดลอมภายในหองปฏบตการ 7. อปกรณ และเครองมอ 7.1 อปกรณ เครองแกว

7.1.1 ถงพลาสตกปราศจากเชอ ขนาด 7 x 11 เซนตเมตร 7.1.2 หลอดทดลองพรอมฝาเกลยว ขนาด 20 x 150 มลลเมตร 7.1.3 จานเพาะเลยงเชอพลาสตก ขนาดเสนผานศนยกลาง 90 มลลเมตร 7.1.4 ชอนตกตวอยาง 7.1.5 ปเปต ขนาด 1 มลลลตร และ 10 มลลลตร 7.1.6 ตะแกรงใสหลอดทดลอง


7.1.7 ขวด Duran ขนาด 500 มลลลตร 7.1.8 กระบอกตวง ขนาด 100 มลลลตร และ 500 มลลลตร

7.2 เครองมอ 7.2.1 เครองชง 2 ต าแหนง 7.2.2 ตบมเชอ 30 1 องศาเซลเซยส 7.2.3 อางน าควบคมอณหภม 44 - 47 องศาเซลเซยส 7.2.4 เครองตผสมตวอยาง 7.2.5 เครองเขยาหลอดทดลอง 7.2.6 เครองวดคาความเปนกรด–ดาง 0.05 pH ทอณหภม 20 – 25 องศาเซลเซยส 7.2.7 เครองนงฆาเชอ 7.2.8 เครองอบฆาเชอ 7.2.9 ตปลอดเชอ 7.2.10 เตาอบไมโครเวฟ 7.2.11 เครองดดจายสารละลาย


8.1.1 2 3 5-Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) 8.2 อาหารเลยงเชอ

8.2.1 Peptone salt solution (PSS) 8.2.2 Plate Count Agar (PCA) 8.2.3 Buffered Peptone water (BPW)

การเตรยมอาหารเลยงเชอ 1. Peptone salt solution

สวนประกอบ Enzymatic digest of casein 1.0 กรม Sodium chloride 8.5 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส

2. Plate Count Agar (PCA) สวนประกอบ Enzymatic digestion of casein 5.0 กรม Yeast extract 2.5 กรม Glucose, anhydrous (C6H12O6) 1.0 กรม Agar 9-18 กรม


ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร ตมใหละลาย น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ แชใน อางน าควบคมอณหภมท 44 - 47 องศาเซลเซยส

หมายเหต ตวอยางทเปนผลตภณฑนมใหเตม Skimmed milk powder 1.0 กรม ตอ อาหารเลยงเชอ PCA 1 ลตร เพอชวยใหปรมาณเชอแบคทเรยเรมตน มปรมาณเชอคงท

3. Buffered Peptone water (BPW) สวนประกอบ Enzymatic digestion of animal tissues 10.0 กรม Sodium chlorine 5.0 กรม Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 .12H2O)

9.0 กรม

Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)

1.5 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร ตมใหละลาย น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส

การเตรยมสารเคม 1. 2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) ชง 2,3,5-Triphenyl Tetrazolium Chloride (TTC) 0.5 กรม ใสในขวดปลอด

เชอแลวเตมน าปลอดเชอ 100 มลลลตร กรองดวยกระดาษกรองขนาด 0.45 m ปดขวดดวยกระดาษอลมเนยมฟอยดปองกนการถกแสงหรอใชขวดสชาและเกบในตเยน อณหภม 2 - 8 องศาเซลเซยส ไมเกน 1 เดอน เมอตองการใชควรตงทงไวทอณหภมหองกอน โดยเตม TTC 1 มลลลตรตออาหารเลยงเชอ 100 มลลลตร ดวยเทคนคปลอดเชอ 9. สารมาตรฐาน - 10. ขนตอนการปฏบตงาน 10.1 การเตรยมตวอยาง 10.1.1 การสมชกตวอยางเพอทดสอบ บนทกขอมลเกยวกบตวอยาง ตวอยางทไดรบควรอยในภาชนะบรรจทปดสนท ไมฉกขาด หรอเสยหายระหวางการขนสงหรอการเกบรกษา ผสมตวอยางใหทวถงในถงตวอยางจนเขากนด 10.1.2 การชงตวอยางส าหรบทดสอบ ชงตวอยางอาหารสตว 50 2.5 กรม บนทกน าหนกตวอยางในบนทกขอมลการทดสอบปรมาณแบคทเรยทงหมดในอาหารสตว 10.2 ขนตอนการทดสอบ

10.2.1 เตม Peptone salt solution หรอ Buffered Peptone water ปรมาตร 450 มลลลตร ลงในตวอยางทชงจากขอ 10.1.2 แชตวอยางทงไวนาน 20 นาท โดยขณะแชตวอยางตงไวทอณหภม 18 – 27 องศาเซลเซยส กอนน าไปเขาเครองตผสมตวอยางทความเรวระดบต า (Low) นาน 60 วนาท ยกเวนตวอยางทมลกษณะแขงมาก เชน มนส าปะหลง อาหารขบเคยวส าหรบสนข ( Dog chew) เตม Peptone salt solution หรอ Buffered Peptone water ปรมาตร 450 มลลลตร แชตวอยางทงไว


นาน 30 นาท โดยขณะแชตวอยางตงไวทอณหภม 18 - 27 องศาเซลเซยส กอนน าไปเขาเครองตผสมตวอยางทความเรวระดบต า (Low) นาน 60 วนาท ในขนตอนนจะได dilution 10- 1 10.2.2 เจอจางตามล าดบโดยใชปเปตขนาด 1 มลลลตร ดด dilution 10- 1 (ขอ 10.2.1) ปรมาตร 1 มลลลตรแลวปลอยลงใน 9 มลลลตร ของ Peptone salt solution หรอ Buffered Peptone water (dilution 10- 2) และเจอจางจนถง dilution 10- 4 หรอมากกวา ใชปเปตดด 1 มลลลตร แตละ dilution ลงในจานเพาะเลยงเชอ (1 จานเพาะเลยงเชอ ตอ dilution) 10.2.3 เทอาหารเลยงเชอ PCA ประมาณ 12 - 15 มลลลตร ทอณหภมประมาณ 44 - 47 องศาเซลเซยส เขยาจานเพาะเลยงเชอ เพอใหตวอยางกระจายตวเขากบอาหารเลยงเชอ ตงทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว 10.2.4 การบมเพาะเชอ บมในตบมเชอทอณหภม 30 + 1 องศาเซลเซยส นาน 72 + 3 ชวโมง คว าจานเพาะเลยงเชอและไมควรซอนกนเกน 6 จานเพาะเลยงเชอ 10.2.5 การอานผล เลอกนบโคโลนของแบคทเรยจากจานเพาะเลยงเชอทมจ านวนโคโลนอยระหวาง 10 - 300 โคโลน บนทกผลลงในบนทกขอมลการทดสอบปรมาณแบคทเรยทงหมดในอาหารสตว

รปท 3.8 ขนตอนการทดสอบ Total Plate Count ในอาหารสตว หมายเหต PSS : Peptone salt solution BPW : Buffered Peptone water PCA : Plate count agar

ดด 1 มลลลตร จากแตละ dilution ลงในจานเพาะเลยงเชอ (1 จานเพาะเลยงเชอ /dilution)

เทอาหารเลยงเชอ PCA ประมาณ 12 - 15 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอ

บมทอณหภม 30 1 องศาเซลเซยส 72 3 ชวโมง

นบปรมาณแบคทเรยทงหมด

รายงานผลเปน โคโลน /กรม (cfu /g )

ตวอยาง 50 กรม + PSS หรอ BPW 450 มลลลตร แชตวอยางทงไวนาน 20 – 30 นาท โดยขณะแชตวอยางตงไวทอณหภม

18 - 27 องศาเซลเซยส (dilution 10 -1)

เจอจางตามล าดบจนถง dilution 10- 4 หรอมากกวา


11. การค านวณ 11.1 ค านวณจาก 2 dilutions และมจ านวนโคโลนไมนอยกวา 10 โคโลน ใชสตร

สตรท 1 N = dV

C

1.1

ความหมาย C = ผลรวมของจ านวนโคโลนทนบไดจาก 2 dilutions

V = ปรมาตรของตวอยางทดดลงจานเพาะเลยงเชอ (มลลลตร) d = ระดบความเจอจางแรกทนบโคโลนได (d = 1 เมอนบท undiluted liquid

product) ตวอยางท 1 จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 2 เทากบ 168 โคโลน จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 3 เทากบ 14 โคโลน แทนคาลงในสตร

N = dV

C

1.1

= 2101.11

14168

= 011.0

182 = 16545 = 1700 = 1.7 x 104

11.2 ค านวณจาก 1 dilution และมจ านวนโคโลนไมนอยกวา 10 โคโลน ใชสตร


C

ความหมาย C = จ านวนโคโลนทนบไดจาก 1 dilutions

V = ปรมาตรของตวอยางทดดลงจานเพาะเลยงเชอ (มลลลตร) d = ระดบความเจอจางแรกทนบโคโลนได (d = 1 เมอนบท undiluted

liquid product) ตวอยางท 2 จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 1 มากกวา 300 โคโลน จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 2 เทากบ 14 โคโลน แทนคาลงในสตร

N = dV

C

=

2101

14

= 01.0

14 = 1400 = 1.4 x 103

11.3 ค านวณปรมาณ low count กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 10 โคโลน แตไมนอยกวา 4 โคโลน โดยใชสตรท 1 และรายงานผลเปนคาประมาณการ (estimated) แตถานอยกวา 4 โคโลน รายงานผล total plate count นอยกวา d4 โคโลนตอกรม (< 40 โคโลนตอกรม) เมอ d = คา dilution factor

ตวอยางท 3 จ านวนโคโลนทนบไดใน initial suspension หรอ first dilution เทากบ 4

โคโลน

แทนคาลงในสตร N = dV

C

1.1

= 1101.11

4

= 11.0

4 36

จะรายงานผลเปน estimated 36


11.4 กรณท initial suspension หรอ first dilution ไมมโคโลนแบคทเรย รายงานผล total plate count นอยกวา 1/d โคโลนตอกรม (< 10 โคโลนตอกรม) เมอ d = คา dilution factor ของ initial suspension หรอ first dilution d = 100 = 1

11.5 กรณทนบจ านวนโคโลนตอจานเพาะเลยงเชอในทก dilution มากกวา 300 โคโลน ใหท าการทดสอบซ าโดยเจอจางเพมขน

11.6 ผลการค านวณทไดใหมเลขนยส าคญ 2 หรอทศนยม 1 ต าแหนง จะได 1.7 x 104 โคโลนตอกรม การปดเศษใหดเลขนยส าคญต าแหนงท 3 ถานอยกวา 5 ใหปดลง เชน ค านวณได 16445 จะได 16000 แตถามากกวาหรอเทากบ 5 ใหปดเพม เชน ค านวณได 16545 จะได 17000 12. การควบคมคณภาพ 12.1 Control เปนการควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอ โดยเทอาหารเลยงเชอ PCA ประมาณ 12-15 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอปลอดเชอทไมไดใสตวอยาง ทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว

12.2 Blank เปนการควบคมคณภาพ Peptone salt solution (PSS) หรอ Buffered Peptone water ( BPW )โดยดด PSS หรอ BPW ปรมาตร 1 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอปลอดเชอ แลวเทอาหารเลยงเชอ PCA ประมาณ 12 - 15 มลลลตร เขยาจานเพาะเลยงเชอ ทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว

12.3 Air test เปนการทดสอบสภาวะแวดลอมทางอากาศ โดยเทอาหารเลยงเชอ PCA ประมาณ 12 - 15 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอปลอดเชอทไมไดใสตวอยาง ทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว หลงจากการทดสอบเสรจสนใหเปดจานเพาะเลยงเชอทงไวในตปลอดเชอ นาน 30 นาท

12.4 Control ถงพลาสตกปราศจากเชอ โดยเท PSS หรอ BPW ปรมาตร 450 มลลลตร 12.5 จากนนน าจานเพาะเลยงเชอและถงพลาสตกปราศจากเชอ ในขอ 12.1 12.2 12.3 และ

12.4 คว าจานเพาะเลยงเชอ แลวน าเขาตบมเชอทอณหภม 30 + 1 องศาเซลเซยส นาน 72 + 3 ชวโมง 12.6 บนทกผลลงในบนทกขอมลการทดสอบปรมาณแบคทเรยทงหมดในอาหารสตว ผลทดสอบ

ขอ 12.1 12.2 12.3 และ12.4 ตองตรวจไมพบเชอจลนทรย จงจะรายงานผลการทดสอบ หากในขอ 12.1 12.2 12.3 และ 12.4 ไมเปนตามเกณฑทก าหนด ผทดสอบจะตองรายงานผควบคมหรอหวหนางาน เพอทบทวนหาสาเหต และท าการทดสอบซ าทกตวอยางของการทดสอบชดนน

12.7 การทดสอบซ า 12.7.1 การทดสอบแตละครงจะท าการทดสอบซ ารอยละ 10 ของจ านวนตวอยางทท า

การทดสอบในชดนน และผลตางของการทดสอบซ าตองไมเกนคา Precision Criterion เทากบ 0.08 log10 บนทกผลลงในบนทกขอมล Precision of Duplicate Analyses และหากผลการทดสอบซ าเกนคา Precision Criterion ผทดสอบจะตองรายงานผควบคมหรอหวหนางาน เพอทบทวนหาสาเหต และจะท าการทดสอบซ าทกตวอยางของการทดสอบชดนน

12.7.2 กรณทตวอยางผดเกณฑมาตรฐานตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ.2525 รายงาน ผควบคมหรอหวหนางาน และแจงผรบตวอยางงานจลชววทยาทราบเพอด าเนนการตอ 12.8 การควบคมการนบโคโลน ผทดสอบสมจานเพาะเลยงเชอจากตวอยางทท าการทดสอบปกต อยางนอย 3 ตวอยาง/เดอน มานบโคโลน โดยจบคผทดสอบ 1 คตอ 1 ตวอยาง บนทกผลลงในแบบบนทกขอมลผล Duplicate Count แลวน าคาทไดมาคดเปนรอยละ และผลตางตองไมเกนรอยละ 10 บนทกผลลงในบนทกขอมล Duplicate Count


12.9 การตรวจวดอณหภมอาหารเลยงเชอกอนใชโดยชง agar 15 กรมตอน า 1 ลตร หรอเตรยม agar ตามปรมาตรสงสดทเตรยมอาหารเลยงเชอในชดนน ตมใหละลาย น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท แชในอางน าควบคมอณหภมท 44 - 47 องศาเซลเซยส แลวน าเทอรโมมเตอรจมลงในขวดทเตรยม เพอวดอณหภม และอณหภมทวดไดตองอยระหวาง 44 - 47 องศาเซลเซยส จงจะน าอาหารเลยงเชอ PCA ไปใชทดสอบ 12.10 การทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอ Plate count Agar (PCA)

12.10.1 การทดสอบ Productivity จะใชเชอมาตรฐานอางอง E. coli ATCC 25922 หรอ S. aureus ATCC 6538 หรอ B. subtilis ATCC 6633 โดยใชอาหารเลยงเชอ TSA (Typtone Soy Agar) เปนอาหารเลยงเชออางอง แลวท าการทดสอบตามวธการทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแบบแขงดานการหาปรมาณ โดยการหาปรมาณของเชอจะตองมคา productivity ratio (PR) มากกวาหรอเทากบ 0.7 บนทกผลลงในบนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอเหลวและอาหารเลยงเชอแขงแบบการหาปรมาณเชอ และบนทกขอมลผลการตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช

13.1 บนทกขอมลการทดสอบปรมาณแบคทเรยทงหมดในอาหารสตว 13.2 บนทกขอมล Precision of Duplicate Analyses 13.3 บนทกขอมล Duplicate Count 13.4 แบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา 13.5 แบบบนทกสรปผลการทดสอบ 13.6 แบบบนทกตวอยางททดสอบซ า 13.7 การควบคมสภาพแวดลอมภายในหองปฏบตการ 13.8 บนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอเหลวและอาหารเลยงเชอแขงแบบการหา

ปรมาณเชอ 13.9 การทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแบบแขงดานการหาปรมาณ 13.10 บนทกขอมลผลการตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน 13.11 แบบบนทกขอมลผล Duplicate Count

14. การรายงานผล 14.1 รายงานผลทดสอบปรมาณแบคทเรยทงหมดในแบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตว

ทางจลชววทยา โดยรายงานผลเปนเลขทศนยม 1 ต าแหนง เชน 1.4 x 104 โคโลนตอกรม 14.2 กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 10 โคโลน แตไมนอยกวา 4

โคโลน รายงานผลเปนคาประมาณการ (estimated) เชน estimated 40 โคโลนตอกรม 14.3 กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 4 โคโลน รายงานผลปรมาณ

แบคทเรยนอยกวา 40 โคโลนตอกรม (< 40 โคโลนตอกรม) 14.4 กรณท initial suspension หรอ first dilution ไมมโคโลนแบคทเรย รายงานผลปรมาณ

แบคทเรยนอยกวา 10 โคโลนตอกรม (< 10 โคโลนตอกรม) 14.5 กรณทพบจ านวนโคโลนมากกวา 300 โคโลน รายงานผลปรมาณแบคทเรยเปน TNTC (too

numerous to count)


15. รายละเอยดอน ๆ จากขอ 14 น าแบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา ทรายงานผลการทดสอบ

เรยบรอยแลวไปใหผควบคมทบทวนและหวหนางานลงนามก ากบ รายงานผลการทดสอบตามวธปฏบตการสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา และบนทกผลลงในแบบบนทกสรปผลการทดสอบ 16. เอกสารอางอง 16.1 ประเชญ นาคพนธ. 2552. “การประกนคณภาพส าหรบหองปฏบตการทางจลชววทยา” ในเอกสารประกอบการฝกอบรม นกวเคราะหมออาชพสาขาจลชววทยา (อาหาร) รนท 5 Module 3. หนา 6. กรงเทพ : ส านกพฒนาศกยภาพนกวทยาศาสตรหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรบรการ 16.2 ส านกพฒนาระบบและรบรองมาตรฐานสนคาปศสตว กรมปศสตว. 2540. กฏหมาย ระเบยบ ขอบงคบตางๆ เกยวกบพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ.2525.พมพครงท 5.กรงเทพฯ : ชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย จ ากด 16.3 ISO 4833 : 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the enumeration of microorganisms-colony count technique at 30 o C 16.4 ISO 7218 : 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations 16.5 ISO 6887-1 : 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination- Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions 16.6 ISO 6887-4 : 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products 16.7 ISO 11133-1: 2009. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1 : General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media the laboratory 16.8 ISO 11133-2 : 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules on preparation and production of culture media - Part 2 : Practical guidelines on performance testing of culture media 16.9 Standard methods for the examination of water and wastewater. : 2012. Microbiological examination - 9020 Quality assurance/Quality control, 22nd Edition


3.3.3 วธทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว 1. วตถประสงค เพอใหเจาหนาททราบถงวธการและสามารถทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว 2. ขอบขาย

ทดสอบผลตภณฑอาหารสตวชนดแหง เชน วตถดบอาหารสตว หวอาหารสตว อาหารสตวผสมส าเรจรป อาหารเสรมส าหรบสตว 3. เอกสารทเกยวของ 3.1 คมอคณภาพหองปฏบตการ 3.2 ขนตอนด าเนนงาน 3.3 การสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา 4. นยาม 4.1 เชอรา หมายถง จลนทรยทมลกษณะเปนเสนสายประกอบดวยเซลลหลายเซลล เมอเจรญบนอาหารเลยงเชอจะมลกษณะคลายปยฝาย โคโลนจะมสตางๆ ตามสของสปอรหรอเสนใย 4.2 การทดสอบปรมาณเชอรา หมายถง จ านวนโคโลนของเชอราทนบไดในอาหารเลยงเชอทท าการทดสอบในตวอยาง รายงานเปน โคโลนตอกรม (cfu /g)


5.1 เพาะเชอโดยเทคนค spread plate บนอาหารเลยงเชอชนดแขง Dichloran18 % glycerol Agar (DG18)

5.2 นบจ านวนโคโลนของเชอราทเจรญ หลงการบมทอณหภม 25 1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 5 -7 วน

5.3 ค านวณปรมาณเชอราตอตวอยาง 1 กรม 6. ความปลอดภย 6.1 ท าการทดสอบในตปลอดเชอ (laminar flow) ชนดทออกแบบใหมกระแสลมสะอาดพนขนหรอลงในแนวหนาต หรอมลมพนออกจากภายในต

6.2 หองปฏบตการจลชววทยาเปนหองปรบอากาศซงจะปองกนและลดการปนเปอนของจลนทรยจากกระแสลมภายนอก

6.3 ภายในหองปฏบตการตดหลอดแสงอลตราไวโอเลต (UV) เพอท าลายจลนทรย 6.4 ควบคมสภาวะแวดลอมภายในหองปฏบตการ

7. อปกรณและเครองมอ 7.1 อปกรณ เครองแกว

7.1.1 ถงพลาสตกปราศจากเชอ ขนาด 7 x 11 นว 7.1.2 หลอดทดลองพรอมฝาเกลยว ขนาด 20 x 150 มลลเมตร 7.1.3 จานเพาะเลยงเชอ แบบแกวหรอพลาสตกทมขนาดเสนผานศนยกลาง 90 – 100

มลลเมตร 7.1.4 ปเปต ขนาด 1 มลลลตร และ 10 มลลลตร 7.1.5 แทงแกวเกลยเชอ (spreader) แบบแกวหรอพลาสตกทมขนาดเสนผานศนยกลาง

ไมเกน 2 มลลเมตร และยาว 80 มลลเมตร


7.1.6 ขวด Duran ขนาด 500 มลลลตร และ 1000 มลลลตร 7.2 เครองมอ

7.2.1 เครองชง 2 ต าแหนง 7.2.2 อางน าควบคมอณหภม 44 - 47 องศาเซลเซยส 7.2.3 เครองนงฆาเชอ 7.2.4 เครองอบฆาเชอ 7.2.5 ตบมเชอ 25 1 องศาเซลเซยส 7.2.6 เครองตผสมตวอยาง 7.2.7 เครองวดคาความเปนกรด–ดาง 0.05 pH ทอณหภม 20 – 25 องศา

เซลเซยส 7.2.8 เครองนงฆาเชอ 7.2.9 ตปลอดเชอ 7.2.10 เครองเขยาหลอดทดลอง 7.2.11 ตอบไมโครเวฟ 7.2.12 ปเปต ขนาด 1 มลลลตร และ 10 มลลลตร 7.2.13 กลองจลทรรศน 7.2.14 เครองดดจายสารละลาย


8.1.1 Chloramphenicol 8.1.2 Glycerol

8.2 อาหารเลยงเชอ 8.2.1 Dichloran 18% glycerol Agar (DG 18)

8.2.2 0.1% peptone water broth การเตรยมอาหารเลยงเชอ 1. Dichloran 18% glycerol Agar (DG 18)

สวนประกอบ Casein enzymatic digest 5.0 กรม D – Glucose(C6H12O6) 10.0 กรม

Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4) 1.0 กรม

Magnessium sulphate (MgSO4.7H2O) 0.5 กรม

Dichloran (2,6-dichloro – 4 – nitroaniline) 0.002 กรม

Agar 12 – 15 กรม

Water,distilled or deionized 1000 มลลลตร


ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร ตมใหวนละลาย เตม glycerol 220 กรม เขยา ใหเขากน จากนนเตม สารละลาย chloramphenicol 10 มลลลตร เขยาใหเขากน น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 5.6 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ หลงจากนงฆาเชอแลวน าไปแชในอางน าควบคมอณหภมท 44 - 47 องศาเซลเซยส กอนเทลงจานเพาะเลยงเชอ

2. 0.1 % peptone water broth สวนประกอบ Enzymatic digest of animal or vegetal tissues 1.0 กรม Water 1000 มลลลตร

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร เขยาใหเขากน น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส

การเตรยมสารเคม 1. Chloramphenicol

การเตรยมสารละลาย chloramphenicol โดยชง chloramphenicol 0.1 กรม ละลายดวย ethanol 10 มลลลตร ใชทนท 9. สารมาตรฐาน - 10. ขนตอนการปฏบตงาน

10.1 การเตรยมตวอยาง 10.1.1 การสมชกตวอยางเพอทดสอบ บนทกขอมลเกยวกบตวอยาง ตวอยางทไดรบควร

อยในภาชนะบรรจทปดสนท ไมฉกขาด หรอเสยหายระหวางการขนสงหรอการเกบรกษา ผสมตวอยางใหทวถงในถงตวอยางจนเขากนด

10.1.2 การชงตวอยางส าหรบทดสอบ ชงตวอยางอาหารสตว 50 2.5 กรม บนทก น าหนกตวอยางในบนทกขอมลการทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว

10.2 การเตรยมจานเพาะเชออาหารเลยงเชอ DG 18 เทอาหารเลยงเชอ DG18 ประมาณ 15 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอ ตงทงไวให

อาหารเลยงเชอแขงตว กอนใชควรตากจานเพาะเลยงเชอใหผวหนาแหง หมายเหต อาหารเลยงเชอทเตรยมควรใชทนท หรอเกบไวในทมด เพราะการถกแสงจะท า

ใหเกด cytotoxic ซงจะมผลตอ mycoflora ในตวอยาง 10.3 ขนตอนการทดสอบ

10.3.1 เตม 0.1 % Peptone water broth ปรมาตร 450 มลลลตร ลงในตวอยางทชง จากขอ 10.1.2 แชตวอยางทงไวนาน 20 นาท โดยขณะแชตวอยางตงไวทอณหภม 18 - 27 องศา เซลเซยส กอนน าไปเขาเครอง ตผสมตวอยางทความเรวระดบต า (Low) นาน 60 วนาท ยกเวนตวอยางทม ลกษณะแขงมาก เชน มนส าปะหลง แชตวอยางใน 0.1 % peptone water broth นาน 30 นาท โดย ขณะแชตวอยางตงไวทอณหภม 18 - 27 องศาเซลเซยส กอนน าไปเขาเครองตผสมตวอยาง ทความเรว ระดบต า (Low) นาน 60 วนาท ในขนตอนนจะได dilution 10- 1


10.3.2 เจอจางตามล าดบ โดยใชปเปตขนาด 1 มลลลตร ดด dilution 10- 1 (ขอ 10.3.1) ในแนวตงปรมาตร 1 มลลลตร แลวปลอยลงใน 9 มลลลตร ของ 0.1% peptone water broth ควรใหปเปตอยในแนวราบ เพอปองกนการตกตะกอนของสปอรเชอราและเจอจางจนถง dilution 10- 4 หรอมากกวา

10.3.3 ใชไมโครปเปตดด 0.1 มลลลตร แตละ dilution ลงในจานเพาะเลยงเชออาหาร เลยงเชอ DG18 ใชแทงแกวเกลยเชอ (spreader) เกลยจนของเหลวซมลงไปในอาหารเลยงเชอ กรณ ยสตและเชอรามปรมาณนอยใชปเปตดดจาก dilution10 -1 ปรมาตร 0.3 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยง เชออาหารเลยงเชอ จ านวน 3 จานเพาะเลยงเชอ

10.3.4 การบมเพาะเชอ บมในตบมเชอทอณหภม 25 + 1 องศาเซลเซยส นาน 5–7 วน ไมคว าจานเพาะเลยงเชอและควรใสในถงพลาสตกทเปดปากถงเพอปองกนการปนเปอน บนทกการบมเพาะ เชอลงในแบบบนทกการใชเครองควบคมอณหภม

10.3.5 การอานผล นบโคโลนของเชอราภายหลงการบม 5 -7 วน โดยเลอกนบโคโลนของ เชอราจากจานเพาะเลยงเชอทมจ านวนโคโลนไมเกน 150 โคโลน มานบดวยสายตา หากพบเชอราทเจรญ เรว (fast-growing) ใหนบจ านวนโคโลนเชอรา หลงการบม 2 วน และนบอกครงหลงการบม 5 - 7 วน โดยนบจ านวนแยกกนระหวางยสตกบรา

หมายเหต การนบจ านวนโคโลนของเชอราอาจไมเปน 10 – fold dilution เพราะการ เจรญของเชอราจะมเสนใยและสปอร ระหวางการนบโคโลนเชอราควรใชความระมดระวง เพราะสปอรของ

เชอราสามารถแพรกระจายในอากาศไดและหามเปดจานเพาะเลยงเชอขณะนบโคโลน

ดด 0.1 มลลลตร จากแตละ dilution ลงบนอาหารเลยงเชอ DG18 เกลยเชอใหกระจายทวผวหนาอาหารเลยงเชอ

บมทอณหภม 25 + 1 องศาเซลเซยส นาน 5 – 7 วน

นบปรมาณเชอรา

รายงานผล เปน โคโลน/กรม (cfu/g)

ตวอยาง 50 กรม + 0.1% peptone water broth 450 มลลลตร แชตวอยางทงไวนาน 20 - 30 นาท โดยขณะแชตวอยางตงไวทอณหภม

18 - 27 องศาเซลเซยส (dilution 10 -1)

เจอจางตามล าดบจนถง dilution 10 - 4

รปท 3.9 ขนตอนวธทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว หมายเหต PWB : 0.1% peptone water broth DG18 : Dichloran18 % glycerol Agar


11. การค านวณ 11.1 ค านวณจาก 2 dilutions และมจ านวนโคโลนไมนอยกวา 10 โคโลน ใชสตร


C

1.1

ความหมาย C = ผลรวมของจ านวนโคโลนทนบไดจาก 2 dilutions


product) ตวอยาง จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 2 เทากบ 148 โคโลน จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 3 เทากบ 14 โคโลน แทนคาลงในสตร

N = dV

C

1.1

= 2101.11.0

14148

= 0011.0

162 = 147272 = 150000

= 1.5 x 105 11.2 ค านวณจาก 1 dilution และมจ านวนโคโลนไมนอยกวา 10 โคโลน ใชสตร


C

ความหมาย C = จ านวนโคโลนทนบได จาก 1 dilution


product) ตวอยาง จ านวนโคโลนใน dilution 10- 1 มากกวา 150 โคโลน จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 2 เทากบ 14 โคโลน แทนคาลงในสตร

N = dV

C

=

2101.0

14

= 001.0

14 = 14000 = 1.4 x 104

11.3 ค านวณปรมาณ low count กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 10 โคโลน แตไมนอยกวา 4 โคโลน โดยใชสตรท 1 และรายงานผลเปนคาประมาณการ (estimated) แตถานอยกวา 4 โคโลน รายงานผลปรมาณเชอรานอยกวา d4 cfu/g (< 40 cfu/g) เมอ d = คา dilution factor


ตวอยาง จ านวนโคโลนทนบไดใน initial suspension หรอ first dilution เทากบ 4

โคโลน


C

1.1

= 1101.11.0

4

= 011.0

4 3.6 x 102

จะรายงานผลเปน estimated 3.6 x 10 2 11.4 กรณท initial suspension หรอ first dilution ไมมโคโลนเชอรา รายงานผลปรมาณเชอรา

นอยกวา 1/d โคโลน/กรม (10 cfu/g ) เมอ d = คา dilution factor ของ initial suspension หรอ first dilution, d = 100 = 1

11.5 กรณทนบจ านวนโคโลนตอจานเพาะเลยงเชอ ในทก dilution มากกวา 150 โคโลน ใหท าการทดสอบซ าโดยเจอจางเพมขน

11.6 ผลการค านวณทไดใหมเลขนยส าคญ 2 หรอทศนยม 1 ต าแหนง เชน รายงานผล 1.7 x 104 โคโลน/กรม จากการปดเศษ โดยการดเลขนยส าคญต าแหนงท 3 ถานอยกวา 5 ใหปดลง เชน ค านวณได 16445 จะได 16000 เทากบ 1.6 x 104 โคโลน/กรม แตถามากกวาหรอเทากบ 5 ใหปดเพม เชน ค านวณได 16545 จะได 17000 เทากบ 1.7 x 104 โคโลน /กรม 12. การควบคมคณภาพ

ในการทดสอบทกครงมการควบคม ดงน 12.1 Control เปนการควบคมคณภาพอาหารเลยงเชอ โดยเทอาหารเลยงเชอ DG18 ประมาณ

15 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอทไมไดใสตวอยาง ทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว 12.2 Blank เปนการควบคมคณภาพ 0.1% peptone water broth โดยดดปรมาตร 0.1

มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชออาหารเลยงเชอ DG18 แลวใชแทงแกวเกลยเชอ(spreader) เกลยใหกระจายทวผวหนาอาหารเลยงเชอ

12.3 Air test เปนการทดสอบสภาวะแวดลอมทางอากาศ โดยเทอาหารเลยงเชอ DG18 ประมาณ 15 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอ ทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว หลงจากททดสอบตวอยางเสรจ แลวใหเปดจานเพาะเชอทงไวในตปลอดเชอ นาน 30 นาท

12.4 Control Spreader เปนการควบคมคณภาพแทงแกวเกลยเชอ (spreader) โดยใชแทงแกวเกลยเชอ (spreader) ทผานการฆาเชอเกลยใหทวผวหนาอาหารเลยงเชอ DG18

12.5 Control ถงพลาสตกปราศจากเชอ โดยเท 0.1% peptone water broth (PWB)ปรมาตร 450 มลลลตร

12.6 จากนนน าจานเพาะเลยงเชอและถงพลาสตกปราศจากเชอ ในขอ 12.1 12.2 12.3 12.4 และ 12.5 ไมคว าจานเพาะเลยงเชอ แลวน าไปบมทอณหภม 25 + 1 องศาเซลเซยส นาน 5 – 7 วน

12.7 บนทกผลลงในบนทกขอมลการทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว ผลทดสอบ ขอ 12.1 12.2 12.4 และ 12.5 ตองตรวจไมพบเชอจลลนทรย และ 12.3 ตรวจพบเชอในสภาวะอากาศไดไมเกน 15 โคโลน ตอ 30 นาท ตอจานเพาะเลยงเชอ จงจะรายงานผลการทดสอบ หากในขอ 12.1 12.2 12.3 12.4 และ12.5 ไมเปนตามเกณฑทก าหนด ผทดสอบจะตองรายงานผควบคมเพอทบทวนหาสาเหต และท าการทดสอบใหม



การทดสอบในครงนน และผลตางของการทดสอบซ าตองไมเกนคา Precision Criterion เทากบ 0.03 log10 บนทกผลลงในบนทกขอมล Precision of Duplicate Analyses และหากผลการทดสอบซ าเกนคา Precision Criterion ผทดสอบจะตองรายงานผควบคมหรอหวหนางานเพอทบทวนหาสาเหต และจะท าการทดสอบตวอยางซ าใหมทกตวอยางของการทดสอบครงนน

12.8.2 กรณทตวอยางผดเกณฑมาตรฐานตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ.2525 รายงานผควบคมหรอหวหนางาน และแจงผรบตวอยางงานจลชววทยาทราบเพอด าเนนการตอ

12.9 การควบคมการนบโคโลน ผทดสอบสมจานเพาะเลยงเชอจากตวอยางทท าการทดสอบปกต อยางนอย 3 ตวอยาง/เดอน มานบโคโลน โดยจบคผทดสอบ 1 คตอ 1 ตวอยาง บนทกผลลงในแบบบนทกขอมลผล Duplicate Count แลวน าคาทไดมาคดเปนรอยละผลตางตองไมเกนรอยละ 10 บนทกผลลงในบนทกขอมล Duplicate Count 12.10 การทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอ Dichloran 18% glycerol Agar (DG 18)

12.10.1 การทดสอบ Productivity จะใชเชอมาตรฐานอางอง Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 และ Aspergillus niger ATCC 9642 โดยใชอาหารเลยงเชอ SDA (Sabouraud D – glucose agar) เปนอาหารเลยงเชออางอง แลวท าการทดสอบตามวธการทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแบบแขงดานการหาปรมาณ โดยการหาปรมาณของเชอจะตองมคา productivity ratio (PR) มากกวาหรอเทากบ 0.5 บนทกผลลงในบนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอเหลวและอาหารเลยงเชอแขงแบบการหาปรมาณเชอ และบนทกขอมลผลการตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน 12.10.2 การทดสอบ Selectivity จะใชเชอมาตรฐานอางอง Escherichia coli ATCC 25922 และ Bacillus subtilis ATCC 6633 แลวท าการทดสอบตามวธการทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแบบแขงดานการหาปรมาณ และเปรยบเทยบการเจรญเตบโตโดยจะใชเชออางองและเชอแขงขน โดยการรายงานผล ผาน หมายถง เชออางองมการเจรญมาก ( 2 คะแนน) และเชอแขงขนไมมการเจรญหรอเจรญนอย (0-1 คะแนน) และรายงานผล ไมผาน หมายถง เชออางองมการเจรญนอยหรอไมเจรญ (0 – 1 คะแนน) บนทกผลลงในบนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอแขงแบบคณภาพทดสอบ ตารางท 3.26 การเจรญเตบโตของเชอมาตรฐานอางองทใชในการทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอ DG 18

Positive control ผลลพธ Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763

มการเจรญเตบโตไดดและโคโลนมสครม

Aspergillus niger ATCC 9642 เสนใยของโคโลน (Mycelium) มสขาวหรอสเหลองและสปอรมสด า Negative control ผลลพธ

Escherichia coli ATCC 25922 ไมมการเจรญเตบโต Bacillus subtilis ATCC 6633 ไมมการเจรญเตบโต


13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช 13.1 บนทกขอมลการทดสอบปรมาณเชอราในอาหารสตว 13.2 บนทกขอมล Precision of Duplicate Analyses 13.3 บนทกขอมล Duplicate Count 13.4 แบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา 13.5 แบบบนทกสรปผลการทดสอบ 13.6 แบบบนทกตวอยางททดสอบซ า บนทกขอมลผลการทดสอบ 13.7 อาหารเลยงเชอเหลวและอาหารเลยงเชอแขงแบบการหาปรมาณเชอ 13.8 บนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอแขงแบบคณภาพทดสอบ 13.9 บนทกขอมลผลการตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน 13.10 การทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแบบแขงดานการหาปรมาณ 13.11 การควบคมสภาพแวดลอมภายในหองปฏบตการ 13.12 แบบบนทกขอมลผล Duplicate Count

14. การรายงานผล 14.1 รายงานผลทดสอบในแบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา โดยรายงานผลเปนเลขทศนยม 1 ต าแหนง เชน 1.4 x 104 โคโลน/กรม

14.2 กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 10 โคโลน แตไมนอยกวา 4 โคโลน รายงานผลเปนคาประมาณการ (estimated) เชน estimated 4.0 x 102 โคโลน/กรม

14.3 กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 4 โคโลน รายงานผลปรมาณเชอรา นอยกวา 40 โคโลนตอกรม (< 40 cfu/g )

14.4 กรณท initial suspension หรอ first dilution ไมมโคโลนเชอรา รายงานผลปรมาณเชอรา นอยกวา 10 โคโลนตอกรม (< 10 cfu/g )

14.5 กรณทพบจ านวนโคโลนมากกวา 150 โคโลน รายงานผลปรมาณเชอราเปน TNTC (too numerous to count) 15. รายละเอยดอน ๆ

จากขอ 14 น าแบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา ทรายงานผลการทดสอบเรยบรอยแลวไปใหผควบคมทบทวนและหวหนางานลงนามก ากบ รายงานผลการทดสอบตามวธปฏบตการสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา และบนทกผลลงในแบบบนทกสรปผลการทดสอบ 16. เอกสารอางอง 16.1 ประเชญ นาคพนธ. 2552. “การประกนคณภาพส าหรบหองปฏบตการทางจลชววทยา” ในเอกสารประกอบการฝกอบรม นกวเคราะหมออาชพสาขาจลชววทยา (อาหาร) รนท 5 Module 3. หนา6. กรงเทพ : ส านกพฒนาศกยภาพนกวทยาศาสตรหองปฏบตการ กรมวทยาศาสตรบรการ 16.2 ส านกพฒนาระบบและรบรองมาตรฐานสนคาปศสตว กรมปศสตว. 2540. กฏหมาย ระเบยบ ขอบงคบตางๆ เกยวกบพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ.2525.พมพครงท 5.กรงเทพ ฯ : ชมนมสหกรณการเกษตรแหงประเทศไทย จ ากด 16.3 ISO 21527-2 :2008. Microbiology of food and animal feeding stuffs –Horizontal method for the enumeration of yeasts and moulds - Part 2: Colony count technique in products with water activity less than or equal to 0.95


16.4 ISO 6887-1 :1999.Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination- Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions 16.5 ISO 6887-4 :2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products 16.6 ISO 7218 :2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations. Standard methods for the examination of water and wastewater. : 2012 . Microbiological examination- 9020 Quality assurance/Quality control, 22nd Edition


3.3.4 วธทดสอบปรมาณ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว 1. วตถประสงค เพอใหเจาหนาททราบถงวธการและสามารถทดสอบ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว 2. ขอบขาย

ทดสอบผลตภณฑอาหารสตวชนดแหง เชน วตถดบอาหารสตว หวอาหารสตว อาหารสตวผสมส าเรจรป อาหารเสรมส าหรบสตว และ อาหารขบเคยวส าหรบสนข (Dog chew) 3. เอกสารทเกยวของ 3.1 คมอคณภาพหองปฏบตการ

3.2 ขนตอนด าเนนงาน 3.3 การสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา

4. นยาม 4.1 Enterobacteriaceae หมายถง แบคทเรยทสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอชนดแขง Violet

red bile glucose agar (VRBG) หลงการบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 2 ชวโมง โดยการหมกของกลโคสใหผลบวกและการทดสอบ Oxidase ใหผลลบ รายงานเปน โคโลนตอกรม (cfu/g)


5.1 เพาะเชอโดยเทคนคเทเพลท (poured plate) 5.2 นบจ านวนโคโลนของแบคทเรยทสามารถเจรญในอาหารเลยงเชอชนดแขง Violet red bile glucose agar (VRBG) หลงการบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส เปนเวลา 24 2 ชวโมง

5.3 ค านวณปรมาณแบคทเรยตอตวอยาง 1 กรม 6. ความปลอดภย 6.1 ท าการทดสอบในตปลอดเชอ (laminar flow) ชนดทออกแบบใหมกระแสลมสะอาดพนขนหรอลงในแนวหนาต หรอมลมพนออกจากภายในต 6.2 หองปฏบตการจลชววทยาเปนหองปรบอากาศซงจะปองกนและลดการปนเปอนของจลนทรยจากกระแสลมภายนอก

6.3 ภายในหองปฏบตการตดหลอดแสงอลตราไวโอเลต (UV) เพอท าลายจลนทรย 6.4 ควบคมสภาวะแวดลอมภายในหองปฏบตการ

7. อปกรณ และเครองมอ 7.1 อปกรณ เครองแกว

7.1.1 ถงพลาสตกปราศจากเชอ ขนาด 7 x 11 เซนตเมตร 7.1.2 หลอดทดลองพรอมฝาเกลยว ขนาด 16 x 160 มลลเมตร และขนาด 20 x 200

มลลเมตร 7.1.3 จานเพาะเลยงเชอพลาสตก ขนาดเสนผานศนยกลาง 90 - 100 มลลเมตร 7.1.4 ชอนตกตวอยาง 7.1.5 ปเปต ขนาด 1 มลลลตร และ 10 มลลลตร 7.1.6 ตะแกรงใสหลอดทดลอง 7.1.7 ขวด Duran ขนาด 500 มลลลตร และ 1000 มลลลตร 7.1.8 หวงเขยเชอ (loop)


7.1.9 กระบอกตวง ขนาด 100 มลลลตร และ 500 มลลลตร 7.2 เครองมอ 7.2.1 เครองชง 2 ต าแหนง 7.2.2 ตบมเชอ 37 1 องศาเซลเซยส

7.2.3 อางน าควบคมอณหภม 44 - 47 องศาเซลเซยส 7.2.4 เครองตผสมตวอยาง 7.2.5 เครองเขยาหลอดทดลอง 7.2.6 เครองวดคาความเปนกรด –ดาง 0.05 pH ทอณหภม 20 – 25 องศาเซลเซยส 7.2.7 เครองนงฆาเชอ 7.2.8 เครองอบฆาเชอ 7.2.9 ตปลอดเชอ 7.2.10 เตาอบไมโครเวฟ 7.2.11 เครองดดจายสารละลาย

8. สารเคมและ/หรออาหารเลยงเชอ 8.1 สารเคม 8.1.1 Oxidase reagent 8.2 อาหารเลยงเชอ 8.2.1 Peptone salt solution (PSS) 8.2.2 Violet red bile glucose agar (VRBG) 8.2.3 Nutrient agar (NA) 8.2.4 Glucose agar (GA) 8.2.5 Buffered Peptone water (BPW)

การเตรยมอาหารเลยงเชอ 1. Peptone salt solution

สวนประกอบ Enzymatic digest of casein 1.0 กรม Sodium chloride 8.5 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน

15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ


2. Violet red bile glucose agar (VRBG) สวนประกอบ Enzymatic digestion of animal tissues 7.0 กรม

Yeast extract 3.0 กรม

Bile salts No.3 1.5 กรม

Glucose 10.0 กรม

Sodium chloride 5.0 กรม

Neutral red 0.03 กรม

Crystal violet 0.002 กรม

Agar 9-18 กรม

Water 1000 มลลลตร ละลายสวนประกอบทงหมดในน าทปลอดเชอ 1 ลตร ตมใหละลาย แลวน ามาวดคา pH

จะตองมคา pH 7.4 0.2 ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส แบงถายใสหลอดหรอขวดทผานการฆาเชอแลว ปรมาตรไมเกน 500 มลลลตร ไมตองน าไปนงฆาเชอ แลวน าไปแชในอางน าควบคมอณหภมทอณหภม 44 - 47 องศาเซลเซยส และตองใชอาหารเลยงเชอภายใน 4 ชวโมง หลงจากทเตรยม หากเปนอาหารเลยงเชอ ส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ

3. Nutrient agar สวนประกอบ Meat extract 3.0 กรม Enzymatic digestion of animal tissues 5.0 กรม Sodium chloride 5.0 กรม Agar 9-18 กรม Water 1000 มลลลตร

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร ตมใหละลาย น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 5.6 0.2 ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหารเลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ น าไปแชในอางน าควบคมอณหภมท 44 - 47 องศาเซลเซยส

การเตรยมจานเพาะเลยงเชออาหารเลยงเชอ Nutrient agar เทอาหารเลยงเชอ Nutrient agar ประมาณ 15 มลลลตร ทอณหภม 44 - 47 องศาเซลเซยส ลงในจานเพาะเลยงเชอ ตงทงไว ใหอาหารเลยงเชอแขงตว กอนใชควรตากจานเพาะเลยงเชอใหผวหนาแหง และจานเพาะเลยงเชออาหาร เลยงเชอ Nutrient agar ทเตรยมแลว สามารถเกบไดนาน 2 สปดาห ทอณหภม 5 3 องศาเซลเซยส


4. Glucose agar สวนประกอบ Enzymatic digestion of casein 10.0 กรม

Yeast extract 1.5 กรม

Glucose 10.0 กรม

Sodium chloride 5.0 กรม

Bromocresol purple 0.015 กรม

Agar 9-18 กรม

Water 1000 มลลลตร ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร ตมใหละลาย แลวดดใสหลอดหรอขวดละ

ประมาณ 5 มลลลตร น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท คา pH หลงการนงฆาเชอมคา pH 7.0 0.2 ทอณหภม 25 องศาเซลเซยส หากเปนอาหาร เลยงเชอส าเรจรปเตรยมตามค าแนะน าขางขวดของผลตภณฑ

หมายเหต อาหารเลยงเชอ Glucose agar สามารถเกบไดไมเกน 1 สปดาห ทอณหภม 5 3 องศาเซลเซยส กอนน าใชควรใหความรอนในน าเดอดหรออบไอน านาน 15 นาท จากนนท าใหเยนลง อยางรวดเรวทอณหภมทใชในการบม

5. Buffered Peptone water (BPW) สวนประกอบ Enzymatic digestion of animal tissues 10.0 กรม

Sodium chlorine 5.0 กรม

Disodium hydrogen phosphate dodecahydrate (Na2HPO4 .12H2O)

9.0 กรม

Potassium dihydrogen phosphate (KH2PO4)

1.5 กรม

ละลายสวนประกอบทงหมดในน า 1 ลตร ตมใหละลาย น าไปนงฆาเชอทอณหภม 121 องศาเซลเซยส ความดน 15 ปอนดตอตารางนว นาน 15 นาท หลงการนงฆาเชอจะมคา pH 7.0 0.2 ท 25 องศาเซลเซยส

การเตรยมสารเคม 1. Oxidase reagent

สวนประกอบ N,N,N’,N’- Tetramethyl –p-phenylenediamine dihydrochloride

1.0 กรม

Water 100 มลลลตร ละลายสวนประกอบในน าเยน ปรมาตร 100 มลลลตร ควรเตรยมแลวใชทนท 9. สารมาตรฐาน -


10. ขนตอนการปฏบตงาน 10.1 การเตรยมตวอยาง 10.1.1 การสมชกตวอยางเพอทดสอบ บนทกขอมลเกยวกบตวอยาง ตวอยางทไดรบควรอยในภาชนะบรรจทปดสนท ไมฉกขาด หรอเสยหายระหวางการขนสงหรอการเกบรกษา ผสมตวอยางใหทวถงในถงตวอยางจนเขากนด

10.1.2 การชงตวอยางส าหรบทดสอบ ชงตวอยางอาหารสตว 50 2.5 กรม บนทก น าหนกตวอยางในบนทกขอมลการทดสอบหาเชอ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว

10.2 ขนตอนการทดสอบ 10.2.1 เตม Peptone salt solution หรอ Buffered Peptone water ปรมาตร 450

มลลลตร ลงในตวอยางทชงจากขอ 10.1.2 ตวอยางทมลกษณะแขงมาก เชน มนส าปะหลง อาหารขบ เคยวส าหรบสนข (Dog chew) แชตวอยางทงไวนาน 30 นาท โดยขณะแชตวอยางตงไวทอณหภม 18 – 27 องศาเซลเซยส กอนน าไปเขาเครองตผสมตวอยางทความเรวระดบต า (Low) นาน 60 วนาท ใน ขนตอนนจะได dilution 10- 1

10.2.2 เจอจางตามล าดบโดยใชปเปตขนาด 1 มลลลตร ดด dilution 10- 1 (ขอ 10.2.1) ปรมาตรท 1 มลลลตรแลวปลอยลงใน 9 มลลลตร ของ Peptone salt solution หรอ Buffered Peptone water (dilution 10- 2) และเจอจางจนถง dilution 10- 4 หรอมากกวา 10.2.3 ใชปเปตดด 1 มลลลตร แตละ dilution ลงในจานเพาะเลยงเชอ (2 จานเพาะเลยงเชอตอ dilution) 10.2.4 เทอาหารเลยงเชอ VRBG ประมาณ 10 มลลลตร ทอณหภมประมาณ 44 - 47 องศาเซลเซยส เขยาจานเพาะเลยงเชอ เพอใหตวอยางกระจายตวเขากบอาหารเลยงเชอ ตงทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว แลวเทอาหารเลยงเชอ VRBG ทบอกประมาณ 15 มลลลตร ตงทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว เพอปองกนการเจรญเตบโตมากเกนไปและลดปรมาณออกซเจน 10.2.5 การบมเพาะเชอ บมในตบมเชอทอณหภม 37 + 1 องศาเซลเซยส นาน 24 + 2 ชวโมงคว าจานเพาะเลยงเชอและไมควรซอนกนเกน 6 จานเพาะเลยงเชอ

10.2.6 การอานผล เลอกนบโคโลนของ Enterobacteriaceae จากจานเพาะเชอทม โคโลนสชมพถงสแดงหรอสมวง ในจานเพาะเลยงเชอทมจ านวนโคโลนไมเกน 150 โคโลน โดยพจารณาวา มเชอเจรญบนจานเพาะเลยงเชอครงหรอมากกวาครงของพนทบนจานเพาะเลยงเชอ ไมจ าเปนตองนบ โคโลน ยกเวนถามการเจรญนอยกวาครงใหนบโคโลนทมลกษณะเฉพาะของเชอ Enterobacteriaceae และนบจ านวนโคโลนทงหมดทเจรญในจานเพาะเลยงเชอ บนทกผลลงในบนทกขอมลการทดสอบ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว

10.2.7 จากนนเลอกโคโลนทมลกษณะสงสยวาจะเปนเชอ Enterobacteriaceae มา 5 โคโลน แลวเขยเชอลงบนจานเพาะเลยงเชออาหารเลยงเชอ Nutrient agar และน าไปบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 24 2 ชวโมง แลวน าไปทดสอบทาง Biochemical หรอทดสอบโดยใชชดทดสอบ API 20 E

10.2.8 การทดสอบ Biochemical 10.2.8.1 การทดสอบ Oxidase

ใชหวงเขยเชอ (loop) แตะโคโลนจาก Nutrient agar (ขอ 10.2.7) เกลยลง


บนกระดาษกรอง แลวหยด Oxidase reagent หากกระดาษกรองไมเปลยนเปนสด าภายใน 10 วนาท แสดงวาใหผลลบ แตถากระดาษกรองเปลยนสด าแสดงวาใหผลบวก บนทกผลในบนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว โดยเชอ Enterobacteriaceae จะใหผลลบ 10.2.8.2 การทดสอบการหมกกลโคส

ใชหวงเขยเชอ (loop) แตะโคโลนทมลกษณะสงสยวาจะเปนเชอ Enterobacteriaceae จาก Nutrient agar (ขอ 10.2.7) และใหผลการทดสอบ Oxidase เปนผลลบ แลวแทง (stab) เชอลงในหลอด Glucose agar แลวน าไปบมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยสนาน 24 2 ชวโมง ถาเกดสเหลองในหลอด Glucose agar แสดงวาใหผลบวกแตถาไมเกดสเหลองในหลอด Glucose agar แสดงวาใหผลลบบนทกผลในบนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว โดยเชอ Enterobacteriaceae จะใหผลบวก

10.2.8.3 การแปลผลทดสอบ Biochemical ตารางท 3.27 การแปลผลทดสอบทางชวเคม

10.2.9 การทดสอบชดทดสอบ API 20 E ตามคมอปฏบตของชดทดสอบ API 20 E

เชอ การทดสอบ Biochemical

ปฏกรยา Oxidase การหมกกลโคส

Enterobacteriaceae กระดาษกรองไมเปลยนเปนสด า (-)

เกดสเหลองในหลอด Glucose agar (+)


รปท 3.10 ขนตอนการทดสอบ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว หมายเหต PSS : Peptone salt solution NA : Nutrient agar

VRBG : Violet red bile glucose agar GA : Glucose agar BPW : Buffered Peptone water

ดด 1 มลลลตร จากแตละ dilution ลงในจานเพาะเลยงเชอ (2 จานเพาะเลยงเชอ / dilution)

เทอาหารเลยงเชอ VRBG ประมาณ 10 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอ ตงทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว

บมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 24 2 ชวโมง

นบปรมาณ Enterobacteriaceae

ทดสอบทางชวเคม การทดสอบ Oxidase เปนผลลบ และการหมกกลโคสเปนผลบวกหรอใชชดทดสอบAPI 20 E

เจอจางตามล าดบจนถง dilution 10- 4 หรอมากกวา

เลอกโคโลนมา 5 โคโลน เขยลงในอาหารเลยงเชอ NA บมทอณหภม 37 1 องศาเซลเซยส นาน 24 2 ชวโมง

รายงานผลเปนโคโลน/กรม

ตวอยาง 50 กรม + PSS หรอ BPW 450 มลลลตร แชตวอยางทงไวนาน 30 นาท แชตวอยางตงไวทอณหภม 18 - 27 องศาเซลเซยส (dilution 10 -1)

เทอาหารเลยงเชอ VRBG ทบอกประมาณ 15 มลลลตร ตงทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว

151 BQCLP E-JOURNAL วารสารอเลกทรอนกส ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ปท 8 ฉบบท 1 11. การค านวณ

11.1 การค านวณหลง identified เพอค านวณหาคา a ดงน เลอกโคโลนทเลอกมา identified เลอกมาอยางนอย 5 โคโลน จะไดคา A เทากบ 5

สตรท 1

a = Cb

(ตอ 1 จานเพาะเลยงเชอ)

ความหมาย b = จ านวนโคโลนทยนยนวาเปนเชอ Enterobacteriaceae

A = จ านวนโคโลนทเลอกมาทดสอบ C = จ านวนโคโลนทคาดวาจะเปนเชอ Enterobacteriaceae บนจาน เพาะเลยงเชอ ตวอยางท 1 จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10-3 เทากบ 66 โคโลน เลอกมา identified 8 โคโลน ยนยนวาใชเชอ Enterobacteriaceae 6 โคโลน จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 4 เทากบ 4 โคโลน เลอกมา identified 4 โคโลน ยนยนวาใชเชอ Enterobacteriaceae 4 โคโลน

แทนคาลงในสตร

a = CA

b (ตอ 1 จานเพาะเลยงเชอ)

a = 668

6

a = 50 ดงนน คา a ทค านวณได ใน dilution10-3 เทากบ 50 โคโลน คา a ทค านวณได ใน dilution10-4 เทากบ 4 โคโลน

11.2 จากนนค านวณหาคา N ใชสตรท 2


a

1.1

ความหมาย a = ผลรวมของจ านวนโคโลนทยนยนวาใชเชอ Enterobacteriaceae จาก จานเพาะเลยงเชอ 2 dilution


liquid product

โดยน าคา a ทค านวณไดจากทง 2 dilution แทนลงในสตรท 2

N = dV

a

1.1

= 3101.11

450

= 0011.0

54 = 49000 = 4.9 x 104

152 BQCLP E-JOURNAL วารสารอเลกทรอนกส ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ปท 8 ฉบบท 1 11.3 ค านวณจาก 1 dilution และมจ านวนโคโลนไมนอยกวา 10 โคโลน ใชสตร


a

ความหมาย a = จ านวนโคโลนทนบได จาก 1 dilution


liquid product) ตวอยางท 2

จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 1 มากกวา 300 โคโลน จ านวนโคโลนทนบไดใน dilution 10- 2 เทากบ 14 โคโลน แทนคาลงในสตร

N = dV

a

=

2101

14

= 01.0

14 = 1400 = 1.4 x 103

11.4 ค านวณปรมาณ low count กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 10

โคโลน แตไมนอยกวา 4 โคโลน โดยใชสตรท 1 และรายงานผลเปนคาประมาณการ (estimated) แตถานอยกวา 4 โคโลน รายงานผล Enterobacteriaceae นอยกวา 4 X d โคโลนตอกรม (< 40 โคโลนตอกรม) เมอ d = คา dilution factor ตวอยางท 3

จ านวนโคโลนทนบไดใน initial suspension หรอ first dilution เทากบ 4 โคโลน


a

=

1101

4

= 1.0

4 40

จะรายงานผลเปน estimated 40

11.5 กรณท initial suspension หรอ first dilution ไมมโคโลนของ Enterobacteriaceae รายงานผล Enterobacteriaceae นอยกวา 1/d โคโลนตอกรม (< 10 โคโลนตอกรม) เมอ d = คา dilution factor ของ initial suspension หรอ first dilution, d = 100 = 1

11.6 กรณทนบจ านวนโคโลนตอจานเพาะเลยงเชอในทก dilution มากกวา 150 โคโลน ให ท าการทดสอบซ า โดยเจอจางเพมขน

11.7 ผลการค านวณทไดใหมเลขนยส าคญ 2 หรอทศนยม 1 ต าแหนง จะได 1.7 x 104 โคโลนตอกรม การปดเศษใหดเลขนยส าคญต าแหนงท 3 ถานอยกวา 5 ใหปดลง เชน ค านวณได 16445 จะได 16000 แตถามากกวาหรอเทากบ 5 ใหปดเพม เชน ค านวณได 16545 จะได 17000 12. การควบคมคณภาพ 12.1 Control เปนการควบคมคณภาพอาหารเล ยงเชอ โดยเตมเช อมาตรฐานอางอง Escherichia coli ATCC 25922 หรอ Escherichia coli ATCC 8739b ทรปรมาณเชอเตมลงในอาหารเลยงเชอ VRBG ประมาณ 10 - 15 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอปลอดเชอทไมไดใส

153 BQCLP E-JOURNAL วารสารอเลกทรอนกส ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ปท 8 ฉบบท 1 ตวอยาง ทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว แลวเทอาหารเลยงเชอ VRBG ทบอกประมาณ 15 มลลลตร ตงทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว 12.2 Blank เปนการควบคมคณภาพ Peptone salt solution หรอ Buffered Peptone water โดยดด PSS หรอ BPW ปรมาตร 1 มลลลตร ลงในจานเพาะเลยงเชอปลอดเชอ แลวเทอาหารเลยงเชอ VRBG ประมาณ 10 - 15 มลลลตร เขยาจานเพาะเลยงเชอ ทงไวใหอาหารเลยงเชอแขงตว 12.3 Control ถงพลาสตกปราศจากเชอ โดยเท PSS หรอ BPW ปรมาตร 450 มลลลตร 12.4 น าจานเพาะเลยงเชอและถงพลาสตกปราศจากเชอในขอ12.1 12.2 และ12.3 เขาตบมเชอทอณหภม 37±1 องศาเซลเซยส นาน 24 ± 2 ชวโมง

12.5 บนทกผลลงในบนทกขอมลการทดสอบหาเชอ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว ผลทดสอบขอ 12.1 ผาน คอน าคาปรมาณเชอท เตมเปรยบเทยบกบผลท ไดจากการทดสอบ โดยพจารณาจากคา Z ดงน | Z | 2 และผลทดสอบขอ 12..2 และ 12.3 ตองตรวจไมพบเชอจลนทรยและหากไมเปนตามเกณฑทก าหนด ผทดสอบจะตองรายงานผควบคมเพอทบทวนหาสาเหต และท าการทดสอบซ าทกตวอยางของการทดสอบครงนน 12.6 การทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอ Violet red bile glucose agar (VRBG)

12.6.1 การทดสอบ Productivity จะใชเชอมาตรฐานอางอง Escherichia coli ATCC 25922 หรอ Escherichia coli ATCC 8739b และ S. typhimurium ATCC 14028 โดยใชอาหารเลยงเชอ TSA (Typtone Soy Agar ) เปนอาหารเลยงเชออางอง แลวท าการทดสอบตามวธการทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแบบแขงดานหาปรมาณ โดยการหาปรมาณของเชอจะตองมคา productivity ratio (PR) มากกวาหรอเทากบ 0.5 บนทกผลลงในบนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอเหลวและอาหารเลยงเชอแขงแบบการหาปรมาณเชอ และบนทกขอมลผลการตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน

12.6.2 การทดสอบ Selectivity จะใชเชอมาตรฐานอางอง E. faecalis ATCC 29212 และ E. faecalis ATCC 19433 แลวท าการทดสอบตามวธการทดสอบประสทธภาพอาหารเลยงเชอแบบแขงดานหาปรมาณ และเปรยบเทยบการเจรญเตบโตโดยจะใชเชออางองและเชอแขงขน โดยการรายงานผลผาน หมายถง เชออางองมการเจรญมาก ( 2 คะแนน) และเชอแขงขนไมมการเจรญหรอเจรญนอย (0-1 คะแนน ) และรายงานผล ไมผาน หมายถง เชออางองมการเจรญนอยหรอไมเจรญ (0 –1 คะแนน) บนทกผลลงในบนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอแขงแบบคณภาพทดสอบ และบนทกขอมลผลการตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน


การทดสอบใน ชดนน และผลตางของการทดสอบซ าตองไมเกนคา Precision Criterion เทากบ 0.18 log10 บนทกผลลงในบนทกขอมล Precision of Duplicate Analyses และหากผลการทดสอบซ าเกนคา Precision Criterion ผทดสอบจะตองรายงาน ผควบคมหรอหวหนางาน เพอทบทวนหาสาเหต และจะท าการทดสอบซ าทกตวอยางของการทดสอบชดนน 12.7.2 การควบคมการนบโคโลน ผทดสอบสมจานเพาะเลยงเชอจากตวอยางทท าการทดสอบปกต อยางนอย 3 ตวอยาง/เดอน มานบโคโลน โดยจบคผทดสอบ 1 คตอ 1 ตวอยาง บนทกผลลงในแบบบนทกขอมลผล Duplicate Count แลวน าคาทไดมาคดเปนรอยละ และผลตางตองไมเกนรอยละ 10 บนทกผลลงในบนทกขอมล Duplicate Count

154 BQCLP E-JOURNAL วารสารอเลกทรอนกส ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ปท 8 ฉบบท 1 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช

13.1 บนทกขอมลการทดสอบหาเชอ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว 13.2 แบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา 13.3 บนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอเหลวและอาหารเลยงเชอแขงแบบการหาปรมาณ

เชอ 13.4 บนทกผลลงในบนทกขอมลผลการทดสอบอาหารเลยงเชอแขงแบบคณภาพทดสอบ 13.5 แบบบนทกสรปผลการทดสอบ 13.6 แบบบนทกตวอยางททดสอบซ า 13.7 การควบคมสภาพแวดลอมภายในหองปฏบตการ 13.8 บนทกขอมลผลการตรวจนบปรมาณเชอจลนทรยมาตรฐาน 13.9 บนทกขอมลการทดสอบยนยนชนดเชอ Enterobacteriaceae ในอาหารสตว 13.10 บนทกผลลงในแบบบนทกขอมลผล Duplicate Count

14. การรายงานผล 14.1 รายงานผลทดสอบ Enterobacteriaceae ในแบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา โดยรายงานผลเปนเลขทศนยม 1 ต าแหนง เชน 1.4 x 104 โคโลนตอกรม 14.2 กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 10 โคโลน แตไมนอยกวา 4 โคโลน รายงานผลเปนคาประมาณการ (estimated) เชน estimated 40 โคโลนตอกรม 14.3 กรณท initial suspension หรอ first dilution มนอยกวา 4 โคโลน รายงานผลปรมาณแบคทเรยนอยกวา 40 โคโลนตอกรม (< 40 โคโลนตอกรม) 14.4 กรณท initial suspension หรอ first dilution ไมมโคโลนแบคทเรย รายงานผลปรมาณแบคทเรยนอยกวา 10 โคโลนตอกรม (< 10 โคโลนตอกรม) 14.5 กรณทพบจ านวนโคโลนมากกวา 150 โคโลน รายงานผลปรมาณแบคทเรยเปน TNTC (too numerous to count) 15. รายละเอยดอน ๆ

จากขอ 14 น าแบบบนทกผลทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา ทรายงานผลการทดสอบเรยบรอยแลวไปใหผควบคมทบทวนและหวหนางานลงนามก ากบ รายงานผลการทดสอบตามวธปฏบตการสงผลการทดสอบคณภาพอาหารสตวทางจลชววทยา และบนทกผลลงในแบบบนทกสรปผลการทดสอบ 16. เอกสารอางอง 16.1 ISO 21528 - 2 : 2004. Microbiology of food and animal feeding stuffs- Horizontal method for the detection and Enumeration of Enterobacteriaceae 16.2 ISO 7218 : 2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations 16.3 ISO 6887-1 : 1999. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination- Part 1: General rules for the preparation of the initial suspension and decimal dilutions

155 BQCLP E-JOURNAL วารสารอเลกทรอนกส ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ปท 8 ฉบบท 1 16.4 ISO 6887-4 : 2003. Microbiology of food and animal feeding stuffs- Preparation of test samples, initial suspension and decimal dilutions for microbiological examination-Part 4: Specific rules for the preparation of products other than milk and milk products, meat and meat products, and fish and fishery products 16.5 ISO 11133-1: 2009. Microbiology of food and animal feeding stuffs – Guidelines on preparation and production of culture media - Part 1 : General guidelines on quality assurance for the preparation of culture media the laboratory 16.6 ISO 11133-2 : 2003 . Microbiology of food and animal feeding stuffs – General rules on preparation and production of culture media - Part 2 : Practical guidelines on performance testing of culture media 16.7 Standard methods for the examination of water and wastewater : 2012. Microbiological examination- 9020 Quality assurance/Quality control, 22nd Edition


บทท 4 ขนตอนการด าเนนงานทดสอบทส าคญ

4.1 การชก การเกบ การสง และการเตรยมตวอยางอาหารสตว 4.1.1 ตวอยางอาหารสตว ตวอยางอาหารสตวทดควรจดเกบในสภาวะแวดลอมหรอพนททสะอาด เพอลดความเสยงตอการปนเปอน (Contamination) และการปนเปอนขาม (Cross contamination) นอกจากน ผเกบตวอยางหรอผทเกยวของควรไดรบการฝกอบรมเกยวของกบวธการรวมถงขนตอนการเกบตวอยาง เครองมอทใชในการเกบตวอยาง และภาชนะบรรจส าหรบการเกบตวอยางตองท าความสะอาดทกครงทจะจดเกบ เพอใหไดตวอยางอาหารสตวทมคณภาพลดความปนเปอนจากสงปลอมปนทงจากภายในภาชนะบรรจ และจากภายนอกภาชนะบรรจจากตวอยางอาหารสตวทถกจดเกบภายในชวงเวลาใกลเคยงกน และเพอใหเหมาะสมในการสงตรวจวเคราะหทางหองปฏบตการ 4.1.2 ระเบยบกรมปศสตววาดวยวธการเกบตวอยางอาหารสตว 4.1.2.1 ประเภทวตถทผสมแลว

อาหารสตวผสมส าเรจรปและหวอาหารสตว ควรเกบไมนอยกวารอยละ 2 ของจ านวนภาชนะบรรจ น ามารวมกนเปน 1 ตวอยาง 3 กโลกรม

สารผสมลวงหนา ควรเกบชนดละ 3 ตวอยางๆ ละ 200 กรม 4.1.2.2 ประเภทวตถดบอาหารสตว ไดแก

วตถดบอาหารสตวทถกจดเกบในสภาพทเปนกองควรจดเกบในสถานททสามารถปองกนปญหาจากสตวพาหะได ใหเกบรอบๆ กองอยางนอย 5 จด และเกบลกในกองอยางนอย 1 เมตร 3 จด รวมเปน 1 ตวอยางประมาณ 3 กก.

ควรมภาชนะบรรจทสะอาด สามารถเกบวตถดบอาหารสตว ไดไมนอยกวา รอยละ 5 แลวน ามารวมเปน 1 ตวอยาง ประมาณ 3 กโลกรม 4.1.3 ตวอยางทเกบ ในขอ 4.1.1 และ 4.1.2 น ามาแบงเปน 3 สวนๆ ละ 0.5 กโลกรม แลวใหผจดเกบตวอยางระบรายละเอยดดงตอไปน

4.1.3.1 ชอ ประเภท ชนด ของอาหารสตว 4.1.3.2 วน เดอน ป ทผลต และเกบตวอยางอาหารสตว 4.1.3.3 สถานทเกบตวอยางอาหารสตว

4.1.3.4 ลงลายมอชอผเกบตวอยาง และผประกอบการหรอผแทน 4.1.3.5 พนกงานเจาหนาทท าบนทกการเกบตวอยาง และมอบส าเนาใหผประกอบการหรอผแทน

4.1.4 ขนตอนการชกตวอยางอาหารสตว ผลวเคราะหจะออกมานาเชอถอ การชกสมตวอยางมสวนส าคญมากเพอใหเปนตวแทนส าหรบอาหารสตวอตสาหกรรม จะใชปฏบตตาม ISO 6497 ซงอยในเรองการชกตวอยางเมลดธญพช ถว และอาหารเมด และเรองการชกตวอยางทเปนผงและปน ส าหรบ lot ไมเกน 2.5 ตน อยางนอย 7 จด increment lot 2.5 ตน ถง 80 ตน จ านวน increment เทากบ √(20 m) สงสดคอ 100 m หมายถงน าหนกในแตละ lot มหนวยเปนตน หากเกน 80 ตน ยงคงใชไดแตจ านวนตวอยางจะมากใหตกลงกน ระหวางหนวยงานทเกยวของ


กรณการชกตวอยางอาหารสตวเปนผง (meals และ powders) ไดแก 4.1.4.1 เมลดพชและจมกพช ผลพลอยไดจากการผลตน ามน หญาแหง บด โปรตน เขมขนจากพช แปง ยสต 4.1.4.2 ปลาปน เนอและกระดกปน กระดก นม และอาหารสตวแทนนม 4.1.4.3 สารผสมลวงหนา 4.1.4.4 อาหารเสรมตางๆ 4.1.4.5 อาหารสตวผสมส าเรจรป 4.1.4.6 วตถทเตมในอาหารสตว 4.1.4.7 สารประกอบอนทรย เชน วตามน ยา สารกนหน กรดอะมโน และสารปรง กลนและรส 4.1.4.8 สารอนนทรย Lot มขนาดไมเกน 100 ตน ใหสมเชนเดยวกบการสมขางตน ตวอยางพวกแรธาตแบบ licks blocks และ cakes Lot ไมเกน 10 ตน n= 25 ตน/lot เกบ 4 จด n= 26 ตน/lot เกบ 7 จด n ≥100 โดยคา √n และมากสด 40 increments โดยใหได 4 กโลกรม/bulk sample ลดลงเปน Reduced sample 2 กโลกรม และปรมาณตวอยาง(Laboratory sample) =0.5 กโลกรม (ปรมาณนอยสด) รายละเอยดการชกตวอยางใหศกษารายละเอยดเพมเตมไดจากเอกสาร ISO 6497 Animal feeding stuffs: Sampling เนองจากเปนขนตอนส าคญทสงผลใหผลทดสอบมความถกตอง แมน เทยง ดวยเมอรายงานผลกลบใหลกคา จะไดลดคาความไมแนนอนของการวดเนองจากการชกตวอยาง ลดขอโตแยงเรองผลทดสอบคลาดเคลอนไมตรงกน จนอาจท าใหผลตภณฑไมไดคณภาพหรอปลอดภยตามมาตรฐานก าหนดได

รปท 4.1 ขนตอนการชกตวอยาง

สนคาเกษตร (Consignment)

รนทผลต (Lot)

ผลผลต (Increment)

ตวอยางจากผลผลต (Bulk sample)

ตวอยางจากผลผลตทยงไมไดจ าหนาย (Reduced sample)

ตวอยางทางหองปฏบตการ (Laboratory sample)


รปท 4.2 การเตรยมตวอยางทดสอบ ปกตหากจะท าการชกตวอยาง พนกงานเจาหนาทจะตองเกบตวอยาง (Laboratory samples)จ านวนอยางนอย 3-4 ตวอยาง โดย 1 ตวอยางสงส าหรบวเคราะห (Testing) และ เกบไวเปนตวอยางอางองอก 1 ตวอยาง เกบไวทโรงงานอก 1ตวอยาง หากตองการมากกวา 4 ตวอยางตองตกลงกน การชกตวอยางทใชกบตวอยาง ขาวโพด ขาวสาล บาเลย ขาว ถว เมลดน ามนพชตางๆ ส าหรบอยในภาชนะบรรจถงขนาด <1 kg รนหนง (Lot) ม 1-6 ถง สมทกถง, 7 ถง ถง 24 ถง ชก 6, มากกวา 24 ถง ใช √2n ถง 100 ถง การสมทเปน ตวแทนจรงหรอตามรายละเอยดการตรวจ เพอใหเหลอตวอยางอาหารสตว (Laboratory sample) 500 กรม ซงเปนปรมาณนอยสดทหองปฏบตการตองการรบตวอยางเพอตรวจวเคราะห 4.1.5 ขนตอนการเกบตวอยาง มดงน 4.1.5.1 ตองสวมถงมอแลวฉดพนดวย Alcohol 70% รอจนแหง 4.1.5.2 ฉกถงบรรจชอนตกตวอยางทบรเวณดามชอน 4.1.5.3 สมตกตวอยางจากกองตวอยางใสถงพลาสตกทผานการฆาเชอแลวอยางนอย 500 กรม และเฉพาะตวอยางสารผสมลวงหนา (Premix) ควรเกบไมนอยกวา 200 กรม 4.1.5.4 ตองปดถงพลาสตกดวยลวดเยบกระดาษระวงไมใหมรสมผสตวอยาง แลวบรรจถงตวอยางนนลงในถงกระดาษสน าตาล

รปท 4.3 อปกรณทใชในการเกบตวอยาง

ชอนตกตวอยาง ถงพลาสตกหรอถงซบ ถงมอ Alcohol 70%

Alcohol 95 % ไมขดไฟและตะเกยง ทเยบกระดาษและเทปกาว ถงกระดาษสน าตาล

ตวอยางทางหองปฏบตการ (Laboratory sample)

ตวอยางทดสอบ (Test sample)

สวนทดสอบ (Test portion)


4.1.5.5 วธเกบอาหารกระปอง 4.1.5.5.1 สภาพกระปองไมบบ ไมบวม ไมมสนม ไมมรอยเปด 4.1.5.5.2 ฉลากบรรจตองชดเจน ไมมรอยฉกขาด และระบวนหมดอาย 4.1.5.5.3 จ านวนทตองจดเกบตวอยางจ านวน 3 กระปอง นบเปน 1 ตวอยาง

4.1.5.6 วธการเกบตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรป สารผสมลวงหนา สารเสรมตางๆ เพอทดสอบดานพษวทยาและชวเคม

4.1.5.6.1 ตวอยางตองถกตกดวยชอนสะอาด และบรรจตวอยางในถงพลาสตกปดสนท

4.1.5.6.2 ปรมาณตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรป ตองใชไมนอยกวา 500 กรม

4.1.5.6.3 ปรมาณตวอยางสารผสมลวงหนา สารเสรม ตองใชไมนอยกวา 200 กรม 4.1.5.6.4 วธการเกบรกษาตวอยางอาหารสตวเพอน าสงหองปฏบตการ ตองเกบในภาชนะรกษาความเยน ใหตวอยางมอณหภม 0-4 องศาเซลเซยส 4.1.5.7 การเกบตวอยางเพอวเคราะหทางจลชววทยา ควรเกบแยกถงเพมขนอก 1 ถง ถาตองวเคราะหรวมกบรายการอน และเกบรกษาตวอยางทอณหภม 18 – 27 องศาเซลเซยส 4.1.5.8 กรณทไมมถงมอ และชอนตกตวอยางทปลอดเชอ ใหด าเนนการโดยฉดพนมอดวย Alcohol 70% ปลอยใหแหง หรอใชมอสะอาดสวมพลกถงดานในออกมาน าไปจบตวอยางแลวพลกถงกลบพรอมตวอยางเขาไปดานใน 4.1.6 ขนตอนการตรวจสอบตวอยางกอนสงตวอยางอาหารสตวผสมส าเรจรป/หวอาหารสตว/วตถดบอาหารสตว 4.1.6.1 ตวอยางน าหนกไมควรนอยกวา 500 กรม/ ตวอยาง 4.1.6.2 บรรจใสถงพลาสตกทแหง และสะอาด ปดสนท ชนนอกเปนถงสน าตาลทบแสง ปดสนท 4.1.6.3 ซองตวอยางอาหารอยในสภาพด ไมมรอยฉกขาด 4.1.6.4 รายละเอยดตวอยางหนาถงกระดาษระบชนด และรหสตวอยางดวยตวบรรจงชดเจนครบถวน หลกเลยงการเกบและขนสงตวอยางอาหารสตวในททมอณหภมสงกวาอณหภมหอง หลกเลยงแสงแดด และอบชน เพอท าใหคณภาพอาหารสตวไมเปลยนแปลง และไมเสอมคณภาพได 4.1.7 ขนตอนในการสงตวอยางอาหารสตวตรวจวเคราะหเพอใหไดผลวเคราะหแบบรวดเรว 4.1.7.1 การสงตวอยางตอตนเรอง 1 ฉบบ ควรแยกกจกรรม และชนดอาหารสตวใหชดเจน เพราะจะสงวเคราะหไมเหมอนกน เชน วตถดบ 1 ฉบบ อาหารสตว และหวอาหารสตว 1 ฉบบ และสารผสมลวงหนาอนๆ อก 1 ฉบบ 4.1.7.2 ควรสงรายการวเคราะหใหชดเจน จะไดสงวเคราะหไดทนท 4.1.7.3 ควรแยกสงเรองตามชนดรายการวเคราะหทเหมอนกน เปน 1 ฉบบ จะไดไมตองรอผล หากตองใชเครองมอในการวเคราะหชนดเดยวกน


4.1.7.4 ทวนสอบ ยนยนดานชนด และปรมาณ เกบซ า ด าเนนคด ยดอายด ชดเฉพาะกจ ควรแยกเรอง และเสนอดวนทสด และตนเรอง 1 ฉบบ ควรมจ านวนตวอยางไมเกน 20 ตวอยาง เพราะจะไดรายงานผลไดเปนชดๆ ภายใน 3-5 วนท าการ หากมากกวา 50 ตวอยาง การรายงานผลตองเกน 7 วน ท าการ เพราะในการยนยนชนด และปรมาณท าไดไมเกน 6 ตวอยาง/วน/1ชนดรายการ 4.1.7.5 การตรวจเฝาระวงสารตกคาง และตรวจตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว หากไมเจาะจงรายการวเคราะห และรายการวเคราะหมหลายรายการ การรายงานผลวเคราะหจะตองลาชากวาปกตอยางนอย 20-30 วน เพราะตองวเคราะหหลายหองปฏบตการ เชน คณคาทางเคม จลชววทยา สารพษจากเชอรา การปลอมปนทางกายภาพ ตองใชเวลาตรวจนานประมาณ 5-7 วน ท าการ 4.1.7.6 หากตองการผลดวน เพอด าเนนการกรณเรงดวน ใหเสนอเรองแบบดวนทสด และใหโทรศพทหรอโทรสารบอกลวงหนา ตวอยางเขาวน เวลา ประมาณเทาใด เพอเตรยมเจาหนาทรอและรบตวอยางด าเนนการเรงดวน 4.1.7.7 ในการสงตวอยางใหเขยนบอกหมายเลข 1,2,3,…ลงบนมมขวามอบนของถงตวอยาง ดวยปากกาเมจก หรอหมกทเหนชด เพอสะดวกในการเรยงตวอยางใหตรงกบล าดบทในใบประวต หากมขอผดพลาดจะไดตรวจสอบตามล าดบทได นอกจากนยงสะดวกในการเรยงตวอยางและนบจ านวนตวอยางวาครบ หรอมตวอยางขาดหายหรอไม และชวยยนยนสอบยอนกลบไดหากมการสลบถงตวอยางหรอพมพประวตผดพลาด 4.1.7.8 รายการวเคราะหใหม หรอพบสารชนดใหมทไมไดด าเนนการเปนงานประจ า ตองใชเวลาในการพฒนา และทดลองวเคราะหอยางนอยประมาณ 3-4 สปดาห หรอมากกวาจงท าใหตองตอบผลลาชา 4.1.7.9 การตามผลวเคราะหเรงดวนใหใชโทรศพท และสงโทรสารเขยนแจงรายละเอยด เชน ตวอยางจากทใด ชนดใดรหสใด รหสตวอยาง และผลการตรวจทตองการทราบดวน หรอสงโทรสารหนงสอตนเรองเดม หรอ Sample code ของส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว และใหตดตอกลบทใด พรอมเบอรโทรศพทและโทรสาร ตดตอทเบอร 0-2967-9751 และโทรสาร 0-2967-9751 4.1.8 ขนตอนการรบตวอยางอาหารสตว 4.1.8.1 ตรวจสอบสภาพซองตวอยางอาหารสตววา อยในสภาพด ไมมรอยฉกขาด 4.1.8.2 ตรวจสอบรายละเอยดซองตวอยางอาหารสตววา ระบใจความส าคญทถกตอง ตรงตามบนทกการน าสงตวอยาง แลวน าสงใหหองบดตวอยาง เพอแจกจายใหหองปฏบตการวเคราะหตวอยางตอไป 4.1.8.3 บนถงพลาสตกบรรจตวอยาง ระบรหสกจกรรม รหสตวอยาง พรอมจ านวนตวอยางดวยปากกาเคมชนดตดทนถาวร (Permanent pen) 4.1.9 ขนตอนการเตรยมตวอยางทดสอบ ตามวธ ISO 6498 (Animal feeding stuffs-Preparation of test samples) 4.1.9.1 ขอบขาย (Scope) ระบวธส าหรบเตรยมตวอยางทดสอบจากตวอยางทางหองปฏบตการอาหารสตวรวมทงอาหารสนขและแมว


4.1.9.2 หลกการ (Principle) กรณของอาหารสตวชนดแขง ตวอยางทางหองปฏบตการจะมการผสมใหเขากน และแบงอยางตอเนอง โดยใชขนตอนทระบจนกวาจะไดตวอยางทดสอบทมขนาดเหมาะสม ซงจะใชกระบวนการตางๆ ทเหมาะสม เชน crushing, grinding, mincing หรอ homogenizing เพอใหมนใจวาตวอยางทดสอบจากสวนการทดสอบจะเปนตวแทนจรงของตวอยาง ในกรณของอาหารสตวชนดเหลว จะใชเครองมอในการผสมตวอยาง และจะไดตวแทนของตวอยางทดสอบในขณะทของเหลวถกกวน 4.1.9.3 เครองมอ (Apparatus) 4.1.9.3.1 เครองบด งายตอการท าความสะอาด และสามารถบดอาหารสตวโดยไมท าใหเกดความรอนมากเกนไป และไมท าใหความชนเปลยนแปลง จนกวาตวอยางจะผานตะแกรงทมขนาดรทเหมาะสมอยางสมบรณ 4.1.9.3.2 เครองกวนหรอเครอง homogenizer 4.1.9.3.3 เครอง Mincer เหมาะส าหรบ plate ขนาด 4 มลลเมตร 4.1.9.3.4 เครอง crushing เชน สาก และครก 4.1.9.3.5 ตะแกรงรอน ขนาดร 1.00 มลลเมตร 2.80 มลลเมตรและ 4.00 มลลเมตร ทท าจากลวดโลหะสานทอ 4.1.9.3.6 เครองแบง หรอเครองแบงสสวน (Dividing or quartering apparatus) เชน conical divider multiple-slot divider with a sorting system หรอ dividing apparatus เพอจะไดมนใจวาองคประกอบของตวอยางทางหองปฏบตการในตวอยางทดสอบมการกระจายตวแบบเดยวกน 4.1.9.3.7 ภาชนะบรรจ เหมาะส าหรบปองกนตวอยางทดสอบจากการเปลยนแปลงองคประกอบตางๆ และอทธพลจากแสง 4.1.9.4 ขนตอน (Procedure) 4.1.9.4.1 การบด (Grinding) 4.1.9.4.1.1 ทวไป บางตวอยางทท าการบดอาจเกดการสญเสยหรอเกดความชน หากเกดกรณเชนนควรท าตามขนตอน 4.1.9.4.2 และขอ 4.1.9.5 การบดควรท าอยางรวดเรวเทาทจะท าไดและควรสมผสกบอากาศนอยทสด ถาจ าเปนควรหกหรอบดตวอยางใหเปนชนทมขนาดเหมาะสมส าหรบบด และจ าเปนอยางยงทตวอยางจะตองผสมเขากนใหดกอนน าไปวเคราะหตอในขนตอนอน 4.1.9.4.1.2 ตวอยางละเอยด (Fine samples) หากตวอยางทางหองปฏบตการสามารถลอดผานตะแกรงรอนขนาด 1.00 มลลเมตรไดทงหมด ผสมตวอยางใหเขากน จากนนแบงสวนผสมอยางตอเนองโดยใช dividing or quartering apparatus จนกวาจะไดขนาดทเหมาะสม (ดขอ 4.1.9.4.9) 4.1.9.4.1.3 ตวอยางหยาบ (Coarse samples) 4.1.9.4.1.3.1 หากตวอยางทางหองปฏบตการไมสามารถลอดผานตะแกรงรอนขนาด 1.00 มลลเมตรไดทงหมด ใหน าไปผานตะแกรงรอนขนาด 2.80 มลลเมตร จากนนผสมตวอยางใหเขากน และเตรยมตวอยางใหมขนาดทเหมาะสม (ดขอ 4.1.9.4.9) ดงขนตอน 4.1.9.4.1.2 4.1.9.4.1.3.2 บดตวอยางอยางระมดระวงในเครองบดทสะอาดดงขอ 4.1.9.4.1.1 จนกวาตวอยางจะลอดผานตะแกรงขนาด 1.00 มลลเมตรไดทงหมด


4.1.9.4.1.4 ตวอยางหยาบมาก (Coarser samples) 4.1.9.4.1.4.1 หากตวอยางทางหองปฏบตการไมสามารถลอดผานตะแกรงรอนขนาด 2.80 มลลเมตร ใหน าตวอยางไปบดในเครองบดทสะอาด จนกวาตวอยางจะสามารถลอดผานตะแกรงรอนขนาด 2.80 มลลเมตรไดทงหมด จากนนผสมตวอยางใหเขากนกอนน าไปทดสอบ 4.1.9.4.1.4.2 แบงตวอยางทางหองปฏบตการอยางตอเนองโดยใช dividing apparatus จนกวาตวอยางทดสอบจะไดขนาดทเหมาะสม (ดขอ 4.1.9.4.9) ส าหรบการวเคราะหทตองการ น าตวอยางไปบดในเครองบดทสะอาดจนกวาตวอยางจะสามารถลอดผานตะแกรงรอนขนาด 1.00 มลลเมตรไดทงหมด 4.1.9.4.2 ตวอยางทมแนวโนมจะสญเสยหรอเกดความชน (Sample likely to lose or gain moisture) ถาการบดตวอยางมแนวโนมทจะท าใหเกดการสญเสยหรอเกดความชน ใหท าการวเคราะหความชนตามวธ ISO 6496 วธนใชกบตวอยางทางหองปฏบตการทผสมเขากนด และตวอยางทดสอบทเตรยมไว ดงนนผลการวเคราะหอาจไดรบการแกไขใหสมพนธกบตวอยางในสภาพเดมส าหรบการวเคราะหความชน (ดขอ 4.1.9.5) 4.1.9.4.3 ตวอยางทยากตอการบด (Samples difficult to grind) หากตวอยางทางหองปฏบตการไมสามารถลอดผานตะแกรงรอนขนาด 1.00 มลลเมตร จะท าใหการบดท าไดยาก ใหใชสวนหลงการผสมเบองตนทอธบายในขอ 4.1.9.4.1.3.1 หรอหลงขนตอนการบดเบองตนทอธบายในขอ 4.1.9.4.1.4.1 วเคราะหปรมาณความชนโดยวธ ISO 6496 ท าตวอยางใหแหงหลงการบดดวยสาก และครก หรอใชเครองมออน น าตวอยางไปผานตะแกรงรอนขนาด 1.00 มลลเมตร จากนนวเคราะหปรมาณความชนอกครง ดงนนผลการวเคราะหอาจไดรบการแกไขใหสมพนธกบตวอยางในสภาพเดมส าหรบการวเคราะหความชน (ดขอ 4.1.9.5) 4.1.9.4.4 อาหารสตวทมความชน เชน อาหารกระปอง หรออาหารแชเยนส าหรบสนขและแมว (Moist feeding stuffs such as canned or chilled pet foods) การท าใหตวอยางทางหองปฏบตการเปนเนอเดยวกน (ซงอาจจะเปนปรมาณทงหมดของกระปองหรอ package อนๆ) โดยใชเครองกวนหรอเครอง homogenizer ผสมตวอยางใหเขากนจนเปนเนอเดยวกน บรรจในภาชนะทสะอาด แหง และปดใหสนท เกบตวอยางทดสอบไวทอณหภมระหวาง 0 °C และ 4 °C 4.1.9.4.5 อาหารสตวแชแขง (Frozen feeding stuffs) ตดหรอ break ตวอยางทางหองปฏบตการใหเปนชนเลกดวยเครองมอทเหมาะสม จากนนน าไปผานเครอง mincer ผสม minced sample จนกวาของเหลวจะถกแยกออก บรรจในภาชนะทสะอาด แหง และปดใหสนท เกบตวอยางทดสอบไวทอณหภมระหวาง 0°C และ 4 °C 4.1.9.4.6 อาหารสตวทมปรมาณความชนระดบปานกลาง (Feeding stuffs of intermediate moisture content) คอยๆผานตวอยางทางหองปฏบตการเขาไปในเครอง mincer ผสม minced sample ใหเขากน และน าไปผานตะแกรงรอนขนาด 4.00 มลลเมตร บรรจในภาชนะทสะอาด แหง และ


ปดใหสนท ถาโดยธรรมชาตของตวอยางทางหองปฏบตการไมสามารถสบได ใหผสม และบดดวยมอใหละเอยดเทาทจะท าได 4.1.9.4.7 ตวอยางหมกและตวอยางของเหลว (Silage and liquid samples) 4.1.9.4.7.1 หญา หรอธญพช น าตวอยางทางหองปฏบตการทงหมดเขาเครองบด ถาเปนไปไดหรอสบใหละเอยดเทาทจะท าได ผสมตวอยางใหเขากน และน าตวอยางอยางนอย 100 กรมใสในภาชนะบรรจตวอยาง หากตวอยางทางหองปฏบตการไมสามารถผานเครองบดหรอสบใหละเอยดได ใหผสมตวอยางใหเขากนเทาทจะท าได และวเคราะหปรมาณความชนตามวธ ISO 6496 กรณตวอยางแหง (ส าหรบตวอยางทอบขามคนในเตาอบความรอนไฟฟาทอณหภมระหวาง 60 °C และ 70 °C) หลงจากนนน าไปผานเครองบด ผสมตวอยางใหเขากน และน าตวอยางอยางนอย 100 กรมใสในภาชนะบรรจตวอยาง น ามาวเคราะหหาปรมาณความชนตามวธ ISO 6496 และใชเปนคาแกกบผลทดสอบทงหมด (ดขอ 4.1.9.5) 4.1.9.4.7.2 ตวอยางของเหลวรวมทงปลาหมก (Liquid samples including fish silage) ผสมตวอย างทางหองปฏบตการโดยใช เคร องกวนหรอเคร อง homogenizer จากนนวสดตางๆ เชน ground bone oil และอนๆ จะถกแยกออกมา ระหวางการกวน transfer ตวอยาง 50 ml ไปยง 100 ml ในภาชนะบรรจตวอยาง โดยใช ladle beaker หรอ wide-bore pipette 4.1.9.4.8 ตวอยางทมความตองการพเศษ (Samples for which there are special requirements) การวเคราะหตวอยางทตองการความละเอยดเปนพเศษ การบดตวอยางอาจมความจ าเปน ในกรณ การเตรยมตวอยางทดสอบอนทอธบายในขอ 4.1.9.4.1, 4.1.9.4.2 และ 4.1.9.4.3 แตมความตองการความละเอยด ในบางกรณอาจจ าเปนตองหลกเลยงการ breaking หรอ damaging ตวอยางทางหองปฏบตการ เชน การวเคราะห pellet hardness ถาตวอยางมไขมน ตวอยางทดสอบอาจตองเตรยมโดยการ warming และ mixing ในบางกรณอาจจ าเปนตองมการสกดไขมนเบองตน ซงจะด าเนนการใหสอดคลองกบ ISO 6492 ถาตองมการทดสอบทางจลชววทยา การทดสอบตวอยางควรจะท าภายใตสภาวะปลอดเชอและไมท าใหสภาพของจลนทรยเปลยนแปลง 4.1.9.4.9 ขนาดตวอยาง และการเกบรกษาตวอยางทดสอบ เตรยมตวอยางทดสอบทเพยงพอส าหรบทกการวเคราะห ซงตวอยางไมนอยกวา 100 กรม เกบในภาชนะทนท และปดใหสนท เกบรกษาตวอยางทดสอบภายใตสภาวะทมการเปลยนแปลงนอยทสด เพอหลกเลยงแสง และผลจากอณหภม 4.1.9.5 Correction factor 4.1.9.5.1 ทวไป ถามแนวโนมวาจะสญเสยหรอเกดความชนระหวางการบด และการผสมตวอยาง จ าเปนอยางยงทจะตองใช correction factor ทเกยวของกบผลการวเคราะหตวอยางในสภาวะเดม เพอปองกนความชน


4.1.9.5.2 การค านวณ การค านวณ correction factor (ƒ) โดยใชสมการ:

ƒ =

ƒ คอ correction factor w0 คอ mass fraction ของความชน อธบายในหนวย % ของตวอยางทางหองปฏบตการทวเคราะหโดยใช วธ ISO 6496 w1 คอ mass fraction ของความชน อธบายในหนวย % ของตวอยางทเตรยมทดสอบทวเคราะหโดยใชวธ ISO 6496 4.1.9.5.3 การแกไขผลวเคราะห (Correction of results) โดยคณผลวเคราะหดวยคา correction factor ƒ

ตวอยางการจดการตวอยางทดสอบในหองปฏบตการจลชววทยา ตามระบบประกนคณภาพหองปฏบตการ

1. วตถประสงค 1.1 เพอใชเปนวธในการรบ การสม การเบก-คน การแจงตวอยางผดเกณฑมาตรฐาน การจดเกบ

และการจ าหนายตวอยางทดสอบ 1.2 เพอใหผปฏบตสามารถปฏบตงานในการจดการตวอยางทดสอบไดอยางถกตอง และไมสงผล

กระทบตอการทดสอบ 2. ขอบขาย

2.1 ใชจดการตวอยางทดสอบภายในหองปฏบตการจลชววทยา กลมตรวจสอบคณภาพ อาหารสตว 3. เอกสารทเกยวของ 3.1 คมอคณภาพหองปฏบตการ หมวด 5.8

3.2 ขนตอนการด าเนนงาน 4. นยาม

เจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยา หมายถง เจาหนาททดสอบทไดรบมอบหมายจากหวหนางานทดสอบ ใหท าหนาทจดการตวอยางทดสอบในหองปฏบตการจลชววทยา 5. หลกการ - 6. ความปลอดภย 6.1 หองปฏบตการจลชววทยาเปนหองปรบอากาศ ซงจะปองกน และลดการปนเปอนของจลนทรยจากกระแสลม 6.2 ภายในหองปฏบตการตดหลอดแสงอลตราไวโอเลต (UV) เพอท าลายจลนทรยขณะทไมมการปฏบตงาน 6.3 ควบคมสภาพแวดลอมภายในหองปฏบตการ


7. อปกรณและเครองมอ 7.1 อปกรณ

7.1.1 ชอน Sterile 7.1.2 ถงซบเกบตวอยาง 7.1.3 ถงเกบชดตวอยาง 7.1.4 ตะกรา 7.1.5 ผากอต

8. สารเคมและอาหารเลยงเชอ 8.1 สารเคม 8.1.1 แอลกอฮอล 70%

8.1.2 น ายาฆาเชอ 9. สารมาตรฐาน - 10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 การรบตวอยางอาหารสตว

10.1.1 เจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยา รบตวอยางอาหารสตว และเอกสารแนบจากเจาหนาทรบตวอยางอาหารสตว กลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตวดงน

10.1.1.1 ใบแจงการสงทดสอบคณภาพตวอยางอาหารสตว 10.1.1.2 ใบแจงสงตวอยางอาหารสตวส าหรบทดสอบ

10.1.1.3 แบบค าขอสงตวอยางอาหารสตวเพอทดสอบคณภาพ หรอแบบค าขอความอนเคราะหตรวจวเคราะหคณภาพสนคาปศสตว

10.1.2 เจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยา ตรวจสอบรายละเอยดตวอยางอาหารสตว โดยตรวจรหสตวอยาง จ านวนตวอยาง กจกรรม กบเอกสารแนบ (ขอ 10.1.1) พรอมตรวจสภาพภาชนะบรรจวาอยในสภาพปกต ถงไมฉกขาด

ตวอยางปกต : รบตวอยางอาหารสตว โดยลงชอรบในใบแจงสงตวอยางอาหารสตว ส าหรบทดสอบ กบเจาหนาทรบตวอยางอาหารสตว กลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว

ตวอยางไมปกต : ไมรบตวอยาง สงคนเจาหนาทรบตวอยางอาหารสตว กลมตรวจสอบ คณภาพอาหารสตว

10.1.3 น าเอกสารแนบ (ขอ 10.1.1) ใหหวหนางานทดสอบพจารณาสงรายการทดสอบ 10.1.4 บนทกรายละเอยดลงในสมดลงทะเบยนการรบ–สงตวอยางอาหารสตว หมายเหต : กรณทไดรบตวอยางกอน และไมไดแนบเอกสารแนบ (ขอ 10.1.1) มาพรอมตวอยาง เจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยา แจงหวหนางานพจารณาสงรายการทดสอบกอน

10.2 แบงตวอยางอาหารสตว 10.2.1 ท าความสะอาดพนโตะ และตะกรา ฉดพนดวยแอลกอฮอล 70% แลวเชดใหแหง

10.2.2 เขยนถงเกบตวอยาง 10.2.2.1 ถงซบเกบตวอยาง เขยนรหสตวอยาง (Sample Code) เชน A00120-

0153 เปนตน 10.2.2.2 ถงเกบชดตวอยาง เขยนกจกรรม รหสตวอยาง จ านวนตวอยาง และ

รายการทดสอบ


10.2.3 น าตวอยางอาหารสตวจดเรยงในตะกราตามรหสตวอยาง (Sample Code) และเปดซองตวอยาง 10.2.4 ใชชอนทผานการฆาเชอคนตวอยางใหเขากนแลวสมตก ตามรายการทดสอบดงน 10.2.4.1 ตวอยางส าหรบทดสอบเชอ Salmonella spp. ปรมาณแบคทเรย ปรมาณและชนดเชอรา ประมาณ 250 กรม 10.2.4.2 ตวอยางส าหรบทดสอบสารตานจลชพ GMOS และDNA ประมาณ 10 กรม 10.2.4.3 อาหารกระปอง จ านวน 1 กระปอง 10.2.4.4 กรณตวอยางไมพอส าหรบการทดสอบ แจงหวหนางานทดสอบทราบ 10.2.5 ซอนถงซบอกหนงชน เกบในถงเกบชดตวอยาง ยกเวน ตวอยางทดสอบสารตานจลชพ GMOS และ DNA 10.2.6 น าตวอยางทดสอบเกบในตตวอยางทดสอบ โดยแยกตามกจกรรม (18 – 27 องศาเซลเซยส)

10.2.7 ตวอยางอาหารสตวทเหลอจากการแบงน าสงหองบดตวอยาง พรอมใหเจาหนาทหองบดลงชอรบในสมดทะเบยนการรบ – สงตวอยางอาหารสตว

10.2.8 แจงรายการทดสอบใหเจาหนาททดสอบทราบ เพอด าเนนการทดสอบ 10.3 การเบก – คน ตวอยางทดสอบ 10.3.1 การเบกตวอยางทดสอบ เจาหนาททดสอบบนทกรายละเอยดการขอเบกตวอยางทดสอบในสมดทะเบยนการเบก – คน ตวอยางทดสอบ กบเจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยา

10.3.2 การคนตวอยางทดสอบ เจาหนาททดสอบลงเวลาการสงคนตวอยางทดสอบลงสมดทะเบยนการเบก – คน ตวอยางทดสอบ พรอมกบตวอยางใหเจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยา 10.4 การแจงตวอยางทดสอบผดเกณฑมาตรฐาน

10.4.1 เจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยาแจงตวอยางทดสอบผดเกณฑมาตรฐานลงในบนทกตวอยางอาหารสตวผดเกณฑมาตรฐานประจ าเดอน (วนสนเดอน) พรอมลงชอผแจง และใหเจาหนาทงานบดตวอยางลงชอผรบเพอด าเนนการตอไป

10.5 การเกบ และแทงจ าหนายตวอยางทดสอบ 10.5.1 ตวอยางทดสอบทรอผลการทดสอบใหเกบในตตวอยางทดสอบรอรายงานผล แยกตามกจกรรม (18 – 27 องศาเซลเซยส) 10.5.2 ตวอยางทดสอบทผานเกณฑมาตรฐาน เกบไวไมนอยกวา 3 เดอน นบจากวนทรบตวอยาง เกบในตตวอยางทดสอบรอแทงจ าหนาย เกบแยกตามกจกรรม ส าหรบอาหารกระปองหลงจากเปดฝาแลวเกบในตเยน (3 2 องศาเซลเซยส) เมอครบก าหนดการแทงจ าหนายเจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจลชววทยา ท าการแทงจ าหนายตวอยางทก 3 เดอน (วนสนเดอน) โดยบนทกรายละเอยดลงแบบบนทกแจงการแทงจ าหนายตวอยางอาหารสตว ประจ าเดอน...ป พ.ศ... พรอมลงชอผแจง และใหหวหนางานลงนามผตรวจสอบสงใหเจาหนาทหองบดลงชอผรบพรอมตวอยางทดสอบ เพอด าเนนการตอไป 10.5.3 ตวอยางทดสอบทผดเกณฑมาตรฐาน เกบไวไมนอยกวา1 ป นบจากวนทรบตวอยางหรอเกบไวจนกวาจะมค าสงใหแทงจ าหนายจากหวหนางานทดสอบ หรอหวหนากลมตรวจสอบ


คณภาพอาหารสตว เกบไวในตตวอยางผดเกณฑมาตรฐาน (18 – 27 องศาเซลเซยส) ส าหรบอาหารกระปอง เกบในตเยน (3 2 องศาเซลเซยส) เมอครบก าหนด หรอมค าสงใหแทงจ าหนายจากหวหนางานทดสอบ หรอหวหนากลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว เจาหนาทจดการตวอยางทดสอบงานจ ลชววทยา บนทกรายละเอยดลงบนทกการแทงจ าหนายตวอยางอาหารสตวทผดเกณฑมาตรฐานประจ าเดอน...ถงเดอน.....ป พ.ศ... พรอมลงชอผแจง และใหหวหนางานลงนามผตรวจสอบ สงใหเจาหนาทหองบดลงชอผรบพรอมตวอยางทดสอบ เพอด าเนนการตอไป 11. การค านวณ - 12. การควบคมคณภาพ - 13. การบนทกขอมล และเอกสารทใช

13.1 สมดลงทะเบยนการรบ – สงตวอยางอาหารสตว 13.2 สมดทะเบยนการเบก – คน ตวอยางทดสอบ 13.3 ใบแจงการสงทดสอบคณภาพตวอยางอาหารสตว 13.4 ใบแจงสงตวอยางอาหารสตวส าหรบทดสอบ

13.5 แบบค าขอสงตวอยางอาหารสตว เพอทดสอบคณภาพ หรอแบบค าขอความอนเคราะหตรวจวเคราะหคณภาพสนคาปศสตว 13.6 บนทกตวอยางอาหารสตวผดเกณฑมาตรฐานประจ าเดอน

13.7 แบบบนทกแจงการแทงจ าหนายตวอยางอาหารสตวประจ าดอน... ป พ.ศ.. 13.8 บนทกการแทงจ าหนายตวอยางอาหารสตวทผดเกณฑมาตรฐาน ประจ าเดอน....ถงเดอน.....

ป พ.ศ......... 14. การรายงานผล - 15. รายละเอยดอนๆ - 16. เอกสารอางอง 16.1 ISO 6496:1999. Animal feeding stuffs-Determination of moisture and other volatile matter content 16.2 ISO 6497: 2002. Animal feeding stuffs-Sampling 16.3 ISO 6498:1998. Animal feeding stuffs-Preparation of test samples 16.4 ISO 7218:2007. Microbiology of food and animal feeding stuffs – General requirements and guidance for microbiological examinations


กรณการตรวจวเคราะหตวอยางอาหารสตวดวยเทคนคพเศษส าหรบรายการวเคราะหทจ าเพาะ 1. ดานจลชววทยา เชน เชอซลโมเนลลา ปรมาณแบคทเรยและรา ตองเกบแบบเทคนคปลอดเชอ

แลวหอดวยถงกระดาษทบแสงอก 1 ชน ใชถงพลาสตกใหม และตองฆาเชอทภาชนะ และมอของผปฏบตงานดวย 70% Alcohol และภาชนะตองไมมรอยทะลใหอากาศภายนอกเขาสมผสได หากเปนไปไดควรเกบแยกถงเพมขนอก 1 ตวอยาง หากตองวเคราะหรวมกบรายการอน

2. ดานพษวทยา การเกบตวอยางเขาหองปฏบตการตองไมนอยกวา 500 กรม โดยตองสมตวอยาง ใหกระจายเปนตวแทนอยางทวถง และน ามาคลกเคลาใหเขากนด และแบงเปน 3 สวน เพอจะไดผลวเคราะหทเปนตวแทนตวอยางทงหมด หากตวอยางนอยกวา 500 กรม จะไมเพยงพอในการวเคราะหและการตรวจจนไดคาปรมาณหากเกดตรวจพบ เพราะตองท าการตรวจเบองตน และหาปรมาณดวยเครอง High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

3. วตามนและยา ตองท าการเกบตวอยางโดยระมดระวงการปนเปอนขามระหวางตวอยาง และตองใชถงพลาสตกใหม และหอดวยถงกระดาษทบแสง อก1 ชน เพอปองกนถกยาและวตามนเสอมคณภาพจากแสง

4. รายการวเคราะหในกจกรรมรองเรยน ด าเนนคด ยด อายด ยนยนผลดานปรมาณ หรอทดสอบประสทธภาพการวเคราะหทกรายการ ใหแยกเรองแยกกจกรรม และเขยนในหนงสอตนเรองใหชดเจนวาตองการใหวเคราะหในรายการอะไร และไมควรรวมไวกบเรองการเกบตวอยางสมตรวจตามปกต เพราะจะท าใหเรองมจ านวนตวอยางมาก และวเคราะหหลายรายการท าใหการตอบผลตองรอกนลาชาได หมายเหต: ตวอยางอาหารสตวทกชนดตองเกบในทมด หามถกแสงความรอนและความชน เพราะจะท าใหคาปรมาณสารเปลยนแปลง และเสอมลงได หากมตเยนควรเกบทอณหภม 4oC จะเกบไดนานขน ยกเวน ตวอยาง Aflatoxin ควรเกบทอณหภม -20oC ขอเสนอแนะการสงรายการวเคราะห เพอทดสอบคณภาพและความปลอดภยในหองปฏบตการ

การเกบตวอยางสงวเคราะหผเกบตวอยางทเปนพนกงานเจาหนาทของรฐ และเจาหนาททไดรบมอบหมายจ าเปนตองมความรและเขาใจในชนดตวอยางและสารทอาจจะปนเปอนอยในตวอยาง เพอทจะไดปฏบตงานและเตรยมตวใหไดตวอยางทถกตองปลอดภยไมปนเปอนขาม สงวเคราะหไดถกตองตรงตามความเสยงและจดเสยงทตองเกบนอกเหนอจากการเกบแบบสมใหเปนตวแทน ควรหมนเวยนสงวเคราะหรายการทยงไมไดวเคราะหใหมขอมลครบในชวง 1 ป และตองเกบรกษาผลวเคราะหไวอยางนอย 3 ป เพอไวตดตามเฝาระวงหาแนวโนมความไมปลอดภย


ตารางท 4.1 แนวทางการพจารณาสงวเคราะหอาหารสตวแตละชนด ซงแยกตวอยางสงทงหมด 4 หองปฏบตการ กจกรรมตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ.2525 (พ.ศ. 2558 ใหม) ชนดอาหารสตว หองปฏบตการ

กายภาพ หองปฏบตการเคม หองปฏบตการ

จลชววทยา หองปฏบตการพษวทยาและชวเคมดานสารพษสาร

ตกคาง

หองปฏบตการพษวทยาและชวเคมดาน

สารพษ จากเชอรา

วตถดบ - ปลาปน - ถวเหลอง - ร า -อาหารสตวแทนนม -กาก DDGS - อน ๆ - Dicalcium

ดการปลอมปนจากวตถดบอน เชน ขนไกปนใน

ปลาปน สวนประกอบ สวนประกอบ

โปรตน, อน ๆ โปรตน, อน ๆ สวนประกอบ สวนประกอบ สวนประกอบ โลหะหนก โลหะหนก

Salmonella spp. Salmonella spp. Salmonella spp. Salmonella spp. Salmonella spp.

Total count, Micro assay (MA)

Total count (รา แบคทเรย)

Melamine Melamine

Melamine สารปฏชวนะ

ตกคาง

Aflatoxin, อนๆ Aflatoxin, อน ๆ Aflatoxin, อน ๆ Aflatoxin M1 อนๆ Aflatoxin, อนๆ

สารเสรมตาง ๆ ชนดยา/สารตองหาม

วตามน แรธาต โปรตน

Salmonella spp. สม สม

สารผสมลวงหนา ชนดยา/สารตองหาม

วตามน แรธาต โลหะหนก

สม ปรมาณยาและ สารตกคาง

สม

อาหารสตวผสมส าเรจรป ไก เปด

ชนดยา/สารตองหาม โปรตนอน ๆ

(ไขมน กาก ความชน)

Salmonella spp. Total count Total count (รา แบคทเรย) Micro assay

(MA ยาปฏชวนะ) DNA เนอสตวใน

อาหารโค

ปรมาณยาและ สารตกคาง

สารพษเชอรา Aflatoxin

อาหารสตวผสมส าเรจรปสกร

ชนดยา/สารตองหาม


สารพษเชอราอน Zeralenone

อาหารสตวผสมส าเรจรปโค

ชนดยา/เนอและกระดกปนโค

โปรตน อน ๆ (ยเรยในอาหารโค)


สารพษเชอรา Aflatoxin B1

อาหารสตวผสมส าเรจรป สนข, แมว

สวนประกอบ คณคาอาหารตามทขนทะเบยน


สารพษเชอรา

อน ๆ พจารณาตามสถานการณ


ขอเสนอแนะการชกตวอยางและการเตรยมตวอยาง ตวอยางทมยาและสารพษเชอราตองบดตวอยางทสงเขาหองปฏบตการทงหมด การสมชกตวอยางจาก test sample เปน test portion ตองตกหลาย ๆ จด ถงแมจะชงสารปรมาณนอยไมถง 1 กรมเพอใหไดตามน าหนก อยางนอยสมตงแต 5 ถง 10 จด กระจายใหทวถง เพอไมใหมผลกระทบตอคาผลวเคราะหและในกรณการด าเนนการทางกฎหมายขอโตแยง หรอการยนยนผลทตองการ ตองใชการวเคราะหจาก 3 test portion การบดตวอยางทละเอยดและเปนเนอเดยวกนไดดจะลดความผดพลาดของผลทดสอบและตองระมดระวง ไมใหเกดความรอนสงเกนไป จนเกดความชนกอนทตวอยางจะผานตะแกรงขนาด 1 mm ได ซงมความส าคญทหองปฏบตการ ตองไดตวอยางทเปนตวแทนอยางแทจรง ตลอดจนตวอยางตองไมเสยหายหรอเปลยนสภาพไประหวางขนสงหรอจดเกบโดยตองจดเกบในสภาพทเกดการเปลยนแปลงองคประกอบนอยทสด ตวอยางทไมเปนเนอเดยวกน (Homogeneity) ตองผสมใหเปนเนอเดยวกนกอน จงแบงเปน test sample และ test portion ตองระมดระวงหลกเลยงการถกแสง และอทธพลจากอณหภม ส าหรบตวอยางทบดแลวมผลความชนลดลง หรอมไขมนสงตองมเทคนคการใชคา Correction factor f จากการวดคาความชนของ Laboratory sample (W0) กอนกบคาความชนของ test sample (W1)

คา f =

จะคณคา f กบ คาผลวเคราะห

แตปจจบนในหองปฏบตการของกลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตวจะควบคมการบดตวอยางโดยบดทละนอยและบดใหละเอยดอยางเรว เพอปองกนไมใหความชนในตวอยางเปลยนแปลงเนองจากเกดความรอน


4.2 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบคณภาพอาหารสตว ตารางท 4.2 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของการวธทดสอบทางเคม

รายการ ชนดวตถดบ Method validation Uncertainty (ทระดบความเชอมน

95%) Linearity range ของ Calibration

curve

Working/ Linearity range

ของวธทดสอบ

LOD LOQ Accuracy %Recovery

Precision (Repeatability)

%RSD

Precision (reproducibility)

%RSD

การทดสอบสารกลม Tetracylines ในอาหารสตว ดวยวธ HPLC

Oxytetracycline (OTC)

อาหารไก R2

= 0.9999 (0.1 – 40 µg/ml)

R2

= 0.9981 (1 – 300 mg/kg

0.3 mg/kg

1 mg/kg

82.45 - 102.83 %

1.33 - 4.59%

1.93 - 11.55 %

-

Chlortetracycline (CTC)

R2

= 0.9999 (0.1 – 40 µg/ml)

R2

= 0.9997 (1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

82.08 - 102.91 %

1.64 - 3.76 %

2.07 - 12.50%

-

Doxycycline (DXC)

R2

= 0.9994 (0.1 – 40 µg/ml)

R2

= 0.9985 (1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

83.39 - 103.61 %

1.67 - 5.31%

1.74 - 12.04%

-

Oxytetracycline (OTC)

อาหารสกร

R2

= 1 (0.1 – 40 µg/ml)

R2

= 0.9986 (1 – 300 mg/kg)

0.3 mg/kg

1 mg/kg

86.23 - 96.81 %

1.26 - 3.92 %

2.69 - 6.76%

41.4 ±9.5 mg/kg

Chlortetracycline (CTC)

R2

= 0.9995 (0.1 – 40 µg/ml)

R2

= 0.9998 (1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

100.15 - 107.97 %

1.07 - 3.16 %

3.22 - 8.67 %

55 ±13 mg/kg

Doxycycline (DXC)

R2

= 0.9998 (0.1 – 40 µg/ml)

R2

= 0.9994 (1 – 300 mg/kg)

0.5 mg/kg

1 mg/kg

95.68 - 103.78 %

1.87 - 4.36 %

3.27 - 7.72%

53 ±12 mg/kg

การทดสอบสารกลม Olaquindox ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS

Olaquindox อาหารสตว - R2

= 0.9993 0.05 - 1.00 mg/kg

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

80 - 99 % 6.97 – 8.26 % 7.03 – 10.91 % 2.00 ±0.46 mg/kg


ตารางท 4.2 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของการวธทดสอบทางเคม (ตอ) รายการ ชนดวตถดบ Method validation Uncertainty

(ทระดบความเชอมน 95%) Linearity range

ของ Calibration curve




Precision (Repeatability) %RSD


%RSD

การทดสอบสารกลม Beta agonists ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS

Salbutamol อาหารสตว R2

= 0.9976 (0.05 – 1.00 mg/kg)

R2

= 0.9976 (0.05 – 1.00 mg/kg)

0.02 mg/kg

0.05 mg/kg

95.33 – 101.86 % 0.87 – 2.83 % 0.52 – 4.21 % 0.73±0.11 mg/kg

Clenbuterol - R2 = 0.994 (0.05 – 1.00 mg/kg)

0.02 mg/kg

0.05 mg/kg

96.48 – 103.44 % 0.84 – 1.74 % 0.79 – 3.93 % 0.73±0.10 mg/kg

Ractopamine - R2

= 0.9983 (0.05 – 1.00 mg/kg)

0.02 mg/kg

0.05 mg/kg

94.11 – 104.28 % 0.55 – 2.08 % 1.05 – 2.21 % 0.72±0.10 mg/kg

การทดสอบสารกลม Nitroimidazole ในอาหาสตวดวยวธ LC-MS/MS

Dimetridazole อาหารสตว - R2

= 0.9951 0.05 - 1.00 mg/kg

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

83 - 101 % 7.15 – 11.82 % 7.07 – 10.62 % 1.87 ±0.42 mg/kg

Metronidazole - R2

= 0.9990 0.05 - 1.00 mg/kg

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

103 - 108 % 4.09 – 7.73 % 4.37 – 7.02 % 1.86 ±0.30 mg/kg

Ronidazole - R2

= 0.9980 0.05 - 1.00 mg/kg

0.020 mg/kg

0.050 mg/kg

99 - 110 % 3.82 – 8.04 % 3.59 – 8.33 % 1.97 ±0.35 mg/kg


ตารางท 4.2 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของการวธทดสอบทางเคม (ตอ) รายการ ชนดวตถดบ Method validation Uncertainty


ของ Calibration curve






%RSD

การทดสอบสารกลม Carbadox ในอาหารสตวโดยวธ LC-MS/MS

Carbadox อาหารสกร - R2

= 0.9966 (0.04 – 1.00 mg/kg)

0.012 mg/kg

0.040 mg/kg

90.00 – 94.48 % 6.11 – 10.79 % 7.11 – 11.47 % 0.49 ±0.13 mg/kg

การทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer

Aflatoxins (total)

ขาวโพด - 2 – 300 µg/kg 1 µg/kg 2 µg/kg 77.6 – 98.2 % 0.41 – 0.67 g/kg 5.96 – 14.4 1.68 ±0.42 µg/kg

Aflatoxins (total)

อาหารสตวปก - 2 – 300 µg/kg 1 µg/kg 2 µg/kg 83.2 – 92.5 % 0.34 – 0.71 g/kg 5.70 – 12.81 1.77 ±0.32 µg/kg

Aflatoxins (total)

อาหารโคและกระบอ

- 2 – 300 µg/kg 1 µg/kg 2 µg/kg 79.33 – 93.1 % 0.34 – 0.68 g/kg 9.05 – 9.67 1.78 ±0.78 µg/kg

Aflatoxins (total)

อาหารสกร - 2 – 300 µg/kg 1 µg/kg 2 µg/kg 84.4 – 101.2 % 0.38 – 1.09 g/kg 7.96 – 12.47 1.9 ±0.90 µg/kg


ตารางท 4.2 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบทางเคม (ตอ) รายการ ชนดวตถดบ Method validation Uncertainty


ของ Calibration curve Working/

Linearity range ของวธทดสอบ




%RSD

การทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

Aflatoxins (B1) ขาวโพด R

2

= 0.9996 (1.20 – 24.08 ng/ml)

R2

= 0.9975 (1.5 – 50 µg/kg)

0.7 µg/kg

1.5 µg/kg 69.92 – 86.33 % HORRAT อยในชวง 0.12 – 0.49

10.70 – 12.46 7.77 ±0.34 µg/kg

Aflatoxins (B2) R

2

= 0.9998 (0.67 – 6.71 ng/ml)

R2

= 0.9980 (1 – 25 µg/kg)

0.4 µg/kg 1 µg/kg 92.38 – 107.33 % HORRAT อยในชวง 0.13 – 0.51

12.45 – 14.60 4.62 ±0.17 µg/kg

Aflatoxins (G1) R

2

= 0.997 (1.42 – 14.19 ng/ml)

R2

= 0.9953 (2.5 – 50 µg/kg)

1 µg/kg 2.5 µg/kg 65.28 – 81.33 % HORRAT อยในชวง 0.19 – 0.69

7.91 – 12.45 6.53 ±0.41 µg/kg

Aflatoxins (G2) R

2

= 0.997 (0.67 – 6.69 ng/ml)

R2

= 0.9951 (1.5 – 25 µg/kg)

0.7 µg/kg 1.5 µg/kg 70.92 – 79-78 % HORRAT อยในชวง 0.22 – 0.69

6.95 – 15.52 3.72 ±0.25 µg/kg

Aflatoxins (B1) อาหารสตวปก R

2

= 0.9996 (1.20 – 24.08 ng/ml)

R2

= 0.9975 (1.5 – 50 µg/kg)

0.7 µg/kg 1.5 µg/kg 73.99 – 94.86 % HORRAT อยในชวง 0.34 – 0.85

8.27 – 11.71 8.05 ±0.45 µg/kg

Aflatoxins (B2) R

2

= 0.9998 (0.67 – 6.71 ng/ml)

R2

= 0.9980 (1 – 25 µg/kg)

0.4 µg/kg 1 µg/kg 68.87 – 101.5 % HORRAT อยในชวง 0.24 – 0.68

2.50 – 8.91 4.64 ±0.26 µg/kg

Aflatoxins (G1) R

2

= 0.997 (1.42 – 14.19 ng/ml)

R2

= 0.9953 (2.5 – 50 µg/kg)

1 µg/kg 2.5 µg/kg 76.56 – 90.62 % HORRAT อยในชวง 0.40 – 1.11

9.03 – 9.47 9.06 ±0.61 µg/kg

Aflatoxins (G2) R

2

= 0.997 (0.67 – 6.69 ng/ml)

R2

= 0.9951 (1.5 – 25 µg/kg)


2.50 – 13.39 4.23 ±0.26 µg/kg









%RSD

การทดสอบ Aflatoxins ในอาหารสตวดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection

Aflatoxins (B1) อาหารโคและ

กระบอ R

2

= 0.9996 (1.20 – 24.08 ng/ml)

R2

= 0.9975 (1.5 – 50 µg/kg)


7.19 – 17.91 7.06 ±0.41 µg/kg

Aflatoxins (B2) R

2

= 0.9998 (0.67 – 6.71 ng/ml)

R2

= 0.9980 (1 – 25 µg/kg)

0.4 µg/kg 1.0 µg/kg 70.28 – 87 % HORRAT อยในชวง 0.19 – 0.31

4.51 – 18.14 3.51 ±0.20 µg/kg

Aflatoxins (G1) R

2

= 0.997 (1.42 – 14.19 ng/ml)

R2

= 0.9953 (2.5 – 50 µg/kg)


13.47 – 19.35 7.51 ±0.71 µg/kg

Aflatoxins (G2) R

2

= 0.997 (0.67 – 6.69 ng/ml)

R2

= 0.9951 (1.5 – 25 µg/kg)


11.05 – 17.91 3.69 ±0.24 µg/kg

Aflatoxins (B1) อาหารสกร R

2

= 0.9996 (1.20 – 24.08 ng/ml)

R2

= 0.9975 (1.5 – 50 µg/kg)


6.04 – 13.63 7.50 ±0.30 µg/kg

Aflatoxins (B2) R

2

= 0.9998 (0.67 – 6.71 ng/ml)

R2

= 0.9980 (1 – 25 µg/kg)

0.4 µg/kg 1.0 µg/kg 84.34 – 99.93 % HORRAT อยในชวง 0.10 – 0.25 (1 – 25 g/kg)

4.70 – 23.53 4.44 ±0.19 µg/kg

Aflatoxins (G1) R

2

= 0.997 (1.42 – 14.19 ng/ml)

R2

= 0.9953 (2.5 – 50 µg/kg)


9.29 – 14-72 7.97 ±0.43 µg/kg

Aflatoxins (G2) R

2

= 0.997 (0.67 – 6.69 ng/ml)

R2

= 0.9951 (1.5 – 25 µg/kg)


13.07 – 18.79 4.47 ±0.21 µg/kg









%RSD

แคดเมยม ขาวโพด R2

= 1.0000 0.002 – 1.000 µg/L

0.20 – 10.00 mg/kg

0.06 mg/kg

0.20 mg/kg

92.77 - 101.05 % - 4.93 – 5.35 % 1.00 ±0.22 mg/kg

กากถวเหลอง R2 = 1.0000 0.002 – 1.000 µg/L

0.20 – 10.00 mg/kg

0.07 mg/kg

0.20 mg/kg

96.65 - 101.75 % - 4.03 – 5.94 %

อาหารสตว (สกร)

R2 = 1.0000 0.002 – 1.000 µg/L

0.20 – 10.00 mg/kg

0.08 mg/kg

0.20 mg/kg

89.40 – 95.40 % - 0.03 – 5.50 % 0.47 ±0.11 mg/kg

ตารางท 4.3 การตรวจสอบความใชไดและคาความไมแนนอนของวธทดสอบทางจลชววทยา รายการ ชนดวตถดบ Method validation

Relative accuracy (AC)

Relative specificity (SP)

Relative sensitivity (SE)

Critical level Standard deviation of reproducibility (S

R)

Precision criterion

Salmonella spp. อาหารสตว 96.61% 100% 95.48% 1 cfu/ 25 g - -

ปรมาณแบคทเรยทงหมด - - - - 0.077 log10 cfu/g 0.4 log10 cfu/g

ปรมาณเชอรา - - - - 0.042 log10 cfu/g 0.2 log10 cfu/g

Enterobacteriaceae - - - - 0.026 log10 cfu/g 0.09 log10 cfu/g


4.3 การน าคาสมรรถนะของวธทดสอบมาใชงาน คาสมรรถนะของวธทดสอบทไดจากการตรวจสอบความใชของวธทดสอบทพฒนาหรอการทวน

สอบความใชไดของการน าวธมาตรฐานมาใชงานจะมคาตางๆ ซงมความส าคญและน าไปใชงานประกอบการพจารณาเพอการควบคมคณภาพอาหารสตว และการน าคาความไมแนนอนของการวดไปใชรายงานผลทดสอบไดอยางถกตอง ดงน 1. พจารณาตรวจตวอยางทมปรมาณสารในชวงทถกตองและเหมาะสมตองพจารณาคาชวงการทดสอบ (Range) ทวธทใชทดสอบมชวงระดบทวเคราะหเมอใชงานแลวใหคาผลทดสอบทนาเชอถอ มความคลาดเคลอนนอยทสด หากการปนเปอนไมอยในระดบชวงดงกลาว อาจไดผลทดสอบทไมมความแมน เทยงและถกตองเพยงพอ 2. เมอน าผลทดสอบไปใชงานในกรณตรวจไมพบสาร ตองพจารณาคา Limit of Detection (LOD) คอ คาต าสดทวเคราะหได เพราะจะบอกใหทราบวาตวอยางอาจมสารอย แตในระดบทตรวจไมพบ ซงแตละหองปฏบตการจะมความสามารถตรวจพบสารต าสดไดไมเทากน กรณสารปนเปอนนอย ๆ จะใหผลทดสอบตรงขามกนได เชนหองปฏบตการท 1 มคา LOD 0.3 mg/kg และหองปฏบตการท 2 มคา LOD 0.5 mg/kg หากตรวจพบสาร 0.4 mg/kg หองปฏบตการท 2 กจะรายงานวาตรวจไมพบสารแตหองปฏบตการท 1 จะรายงานวา พบสารท 0.4 mg/kg 3. คาการคนกลบของสาร (%Recovery) จะพจารณาเมอสารทตรวจพบมคาใกลเคยงกบเกณฑมาตรฐานทยอมใหมเมอน าคานมาค านวณเพมรวมหรอหกออกจากผลทดสอบ ในกรณคาคนกลบของสารอยนอกชวง 90-110% จะไดผลทดสอบทมปรมาณสารนนอยจรง 4. การน าคาความไมแนนอนของการวดมาพจารณา เพอบอกชวงของรายงานผลทดสอบวาอาจมคาผานหรอไมผานเกณฑมาตรฐานได เพอก าหนดเปนคาแจงเตอนทปลอดภยมากยงขน โดยน าผลทดสอบมาบวกเพมคาความไมแนนอน ในการพจารณาปลอยผานสนคา เพอคมครองผบรโภค หากพจารณาด าเนนคดตองใหโอกาสผประกอบการโดยหกคาความไมแนนอนออกจากผลทดสอบเพราะอาจมคาไมเกนเกณฑมาตรฐาน เชน คาผลทดสอบพบสาร 10.5 mg/kg ±2 mg/kg คาความไมแนนอนการวด แสดงวาตวอยางน จะสามารถมสารตงแต 8.5 ถง 12.5 mg/kg หากคามาตรฐานอยท 12 mg/kg ตวอยางนจะผดมาตรฐานไดในเรองความปลอดภย แตตวอยางนอาจมคาสาร 8.5 mg/kg ได แสดงวาตวอยางนยงไมผดมาตรฐาน

5. ความเทยง (Precision : Repeatability : %RSD) ของวธทดสอบมความส าคญ ในการพฒนาวธทดสอบผปฏบตงานตองพฒนาวธทดสอบโดยจดเตรยมอปกรณ เครองมอใหอยในระบบประกนคณภาพและไดรบการสอบเทยบและสอบยอนกลบไปยงระดบนานาชาตได โดยสมรรถนะเรองความเทยงตองอยในเกณฑของวธทดสอบมาตรฐานทก าหนดไวในวธทดสอบ ในชนดตวอยางทก าหนดหรอเปนคาใหมในกรณทเปนชนดตวอยางใหม ซงตองอยในเกณฑทก าหนดของวธเชนกน ดงนน ในกรณทผลทดสอบไมตรงกนในแตละหองปฏบตการควรรายงานคาเหลานในแบบรายงานผลทดสอบดวยเพอประกอบการพจารณาคณภาพและความปลอดภยจากสารพษ สารตกคาง สารปนเปอน แตในกรณผลทดสอบต ากวาเกณฑมาตรฐาน 50% ไมจ าเปนตองน ามาพจารณาและถาคา %Recovery อยในชวง 90-110 % นอกนนควรน าคาตาง ๆ ในการทดสอบความใชไดของวธมาประกอบการพจารณาในการควบคม ก ากบดแล คณภาพและความปลอดภยอาหารสตว การตรวจปลอยสนคา สงคนกลบและท าลายสนคา เปนตน รายละเอยดตามตารางท 4.2 และ 4.3


4.4 ขอควรระวงและขอเสนอแนะทส ำคญ 4.4.1 ขอควรระวงเกยวกบเทคนคขนตอนการวเคราะห 4.4.1.1 ดานเคม

การวเคราะหสารกลม Beta agonists เจาหนาททดสอบตองมความช านาญในการใชเครองมอทดสอบ และควบคมใหเครองมอทดสอบทใชงานเกดประสทธผลสงสด ท าใหผลการทดสอบมความเทยงและความแมน ในการปฏบตงานควรระวงความผดพลาดทจะเกดขนในขนตอนส าคญๆ เชน การชงสารมาตรฐาน การสกดตวอยาง การตวงปรมาณสารในขนตอนตางๆ เปนตน หวหนางานทดสอบควรจดท าแผนการฝกอบรมประจ าป หรอสงเจาหนาททดสอบเขารวมโปรแกรมทดสอบความช านาญและควบคม ตลอดจนตรวจตดตามการปฏบตงานในขนตอนทส าคญ นอกจากนยงพบปญหา เรองความปลอดภยของสขภาพเจาหนาททดสอบ เนองจากในการท างานจะตองใชสารเคม และสารมาตรฐานอนตรายหลายชนดส าหรบตรวจวเคราะห ถงแมจะมการจดเตรยมอปกรณปองกนสวนบคคลใหแกเจาหนาททดสอบ แตกไมสามารถปองกนอนตรายได 100 % ดงนน เจาหนาททดสอบควรไดรบการตรวจสขภาพประจ าป

การวเคราะหสาร Beta agonists ในอาหารสตวควรตรวจสอบตวอยางเบองตนดวยเทคนค ELISA ในการช งตวอยางอาหารสตวแตละคร งตองช ง ไม เกน ± 0.05 กรม และการใช Micropipette ตองดปรมาณใหถกตอง เทาๆ กน มฉะนนอาจท าใหผลวเคราะหผดพลาดได การเตรยม Conjugate เปนขนตอนทอนตราย เนองจากสามารถสะสมในรางกายกอใหเกดโรคมะเรงได จงตองอานคมอในการเตรยมใหถกตอง และขณะใชงานตองสวมถงมอทกครง เนองจากชดทดสอบมหลายยหอ อาจจะท าใหเกดการสบสนได ในการวเคราะหควรมความระมดระวงในการปฏบตงาน เพอไดผลวเคราะหทด หากจ าเปนตองวเคราะหตวอยางทตองการผลทดสอบทมใหความแมนย า และเทยงตรงสง ควรตรวจยนยนดวยวธ LC-MS/MS Triple Quadrupole Mass spectrometry ตามมาตรฐาน ISO/IEC 17025:2005 การวเคราะหสารกลม Tetracyclines พบวา หากมการใสยาในปรมาณมากเกนชวงในการวเคราะห เจาหนาทในทองทควรแจงประวตตวอยางใหชดเจนส าหรบอาหารสตวผสมยาในระดบการรกษา เพราะตองชงตวอยางนอยลงใหสามารถสกดยาออกจากตวอยางไดหมด เพอใหผลวเคราะหออกมาถกตองมากทสดเพราะวธทพฒนาขนใชไดดในชวงทมยาในระดบ 1 ถง 300 mg/kg ในการวเคราะหสารกลม Tetracyclines มสารบางชนดสามารถสลายตวไดงาย เชน Chlortetracycline ซงมความไวตอแสง จงควรเกบใหพนแสง และควรวเคราะหสารในระยะเวลาไมนานเกน เนองจากจะท าใหคาของผลวเคราะหลดลงและนอยกวาความเปนจรง อยางไรกตามยงพบวาการขนสงตวอยางทไมถกตองมายงหองปฏบตการเปนอกสาเหตหนงทท าใหสารเกดการสลายตวไดเชนกน นอกจากนการเกบตวอยางไวนานหลายวนจงท าการวเคราะห เนองจากการสะสมตวอยางทสงตรวจวเคราะหมาก จะท าใหคาของผลวเคราะหลดลง

อาหารสกรมกจะพบใสยากลม Tetracyclines มากกวาอาหารสตวชนดอน จงควรเพมเทคนคการตรวจคดกรองตวอยางกอนการทดสอบเพอลดปรมาณตวอยางทฉดเขาเครอง HPLC และสามารถประมาณการระดบการปนเปอนเบองตนดวยชดทดสอบส าเรจรป หรอ การตรวจสอบเบองตนทางจลชววทยาดวยเชอ Bacillus cereus ATCC 11778 หรอวธการเกดสภายใตกลองจลทรรศน เพอชงตวอยางใหเหมาะสมกบวธการสกด การวเคราะห สาร Carbadox พบวา ควรระวงขนตอนการชงสารมาตรฐานและการสกดตวอยาง เพราะเปนขนตอนทสงผลตอความแมนและความเทยงของผลทดสอบเนองจากเปนสารตองหามและกอมะเรง ในการทดสอบเจาหนาทจะตองท าการทดสอบดวยความระมดระวง และใสอปกรณปองกน


สวนบคคลในขณะท างาน และควรใชเทคนคคดกรองตวอยางดวยการตรวจสอบเบองตนโดยดการเกดสภายใตกลองจลทรรศน

การวเคราะห Aflatoxins ดวย IAC-Post Column Photochemical Reaction โดย HPLC-Fluorescence Detection Aflatoxins เปนสารอนตรายกอมะเรงควรวเคราะหทนททไดรบตวอยาง หรอถายงไมไดวเคราะหควรเกบในตแชเยนเพราะมผลตอการเจรญเตบโตของเชอรา เพอปองกนการเพมจ านวนของสารพษ ขนตอนการ Clean up ตวอยางอตราการไหลของตวอยางประมาณ 1-2 หยด/วนาท เพอให column จบสารทวเคราะหไดดยงขน เจาหนาทควรท า daily check เครองมอดวยตนเองทกครงกอนการใชงานโดยเฉพาะ Micropipetter ควรใชเทคนคคดกรองตวอยางกอนการวเคราะห ดวยชดทดสอบ ELISA หรอ Lateral flow strip กอนน าไปตรวจยนยนดวยเครอง HPLC ควรมการตรวจสขภาพทมากกวาการตรวจแบบมาตรฐานทวไป เพราะเจาหนาทท างานเกยวของกบสารเคมซงมความเสยงตอการเกดมะเรงมากกวาปกตทวไป

การวเคราะห Aflatoxins ดวยวธ IAC-Fluorometry โดยใชเครอง Fluorometer พบวาควรเกบรกษาตวอยางในทเยน เพราะมผลตอการเจรญเตบโตของเชอรา การเกบรกษาสารมาตรฐาน ควรแยกเกบในตเฉพาะสารมาตรฐาน เพราะอาจเกดการปนเปอนได การเกบสารเคม ควรแยกชนด เพอปองกนความผดพลาดในการน ามาใชงาน ตวอยางทขน หรอตวอยางมสเขมมากๆ จะมผลตอการอานคา ดงนนควรใช buffer ลาง column ในขนตอนการ clean up ตวอยาง ท าใหผลการทดสอบทไดมความเทยงและความแมน ควรวเคราะหทนททไดรบตวอยาง หรอถายงไมไดวเคราะหควรเกบในตแชเยน ขนตอนการ Clean up ตวอยางอตราการไหลของตวอยางประมาณ 1-2 หยด/วนาท เพอให column จบสารทวเคราะหไดดยงขน ควรท า daily check เครองมอทกครงกอนการใชงาน เจาหนาททดสอบควรไดรบการตรวจสขภาพทมากกวาแบบมาตรฐานทวไป เพราะตองท างานเกยวของกบสารเคมซงมความเสยงสงกวาปกตทวไป

การวเคราะหแคดเมยม พบวา ตวอยางทมปรมาณเกลอสงๆ จะท าใหเกดประกายไฟ สงผลตอคา Emission ทเพมขนและท าให Plasma ดบ เนองจากไมเสถยร วธแกไขใหเจอจางสารละลายตวอยางหรอลดปรมาณน าหนกตวอยางลง ในขนตอนการยอยตวอยางตองระวงอยาใหฟองของตวอยางลนออกมานอกภาชนะ ใหยกลงจากเตาไฟฟา หรอเมอเตมกรดแลวใหตงทงไวขามคนเพอลดปฏกรยาทรนแรง เพราะจะท าใหโลหะหนกสญหายไปบางสวน หากเจาหนาททดสอบปรบใชอณหภมใหพอเหมาะกบตวอยาง ถาตวอยางเดอดใหเขยาเบาๆ แบบหมนวน (Swirl) เพอปองกนตวอยางเดอดรนแรงเกนไป และในการลางเครองแกวครงสดทายใหใชน าปราศจากไอออนลางเครองแกวหลายๆ ครงเพอใหแนใจวาไมมโลหะหนกตดอยกบเครองแกวทใชยอย เพราะเครองแกวสามารถดดซบโลหะหนกไดด เจาหนาททดสอบตองหมนตรวจสอบอยาใหสายยางและ Injector ตนกอนการทดสอบทกครง Quartz torch และกระจก View ตองสะอาดไมมคราบ เพราะจะไปบง Optic ท าใหเหนการ Emission ของธาตนอยลง เนองจากคราบเกลอทเกดจากตวอยาง เพราะจะท าใหตวอยาง Flow ไมปกต และถา Injector ตน ใหน าไปแชใน 20% Nitric acid หากเกดคราบท Quartz torch และกระจก View ใหน าไปแชใน 20% Nitric acid 4.4.1.2 ดานจลชววทยา

การวเคราะหเชอ Salmonella spp. พบวา ขนตอนการเตรยมอาหารเลยงเชอ ควรตรวจสอบ วนหมดอายของผลตภณฑ เพอปองกนความผดพลาดในการเพมจ านวนของเชอ ซงจะใหผลทดสอบทคลาดเคลอนตอการรายงานผลออกทางหองปฏบตการ มขนตอนการชกตวอยางและกอนท าการตรวจวเคราะหควรตรวจสภาพตวอยางทดสอบใหอยในสภาพปกต ไมมการช ารด หรอสงปลอมปนอนๆ


เพอปองกนการปนเปอนเชออนๆ จากสภาพแวดลอม ทท าใหผลรายงานทางหองปฏบตการผดพลาด และ เชออางองทใชในหองปฏบตการ ควรมการตรวจเชคทางสณฐานวทยา เปนระยะๆ เพอใหเชอมคณสมบตทถกตอง และสามารถน ามาใชทดสอบในหองปฏบตการได กอนน าอาหารเลยงเชอมาใชในหองปฏบตการควรท าการทดสอบประสทธภาพ และเปรยบเทยบอาหาร รนการผลตปจจบนกบรนการผลตใหม เนองจากสอนดเคเตอรทใสในอาหารทดสอบของแตละผลตภณฑ มการใชสอนดเคเตอรทมความชดเจนแตกตางกน ซงจะมผลตอการคดแยกเชอทถกตองในหองปฏบตการ และการบมจานเพาะเชอ ไมควรหงายจานเพาะเชอ ขณะบมเชอ เนองจากไอน าทเกดขนบนฝาจานเพาะเชอจะท าใหเชอเกดการปนเปอนจากเชออน นอกจากเชอเปาหมาย และระยะเวลาการบมเชอแตละขนตอน ควรปฏบตตาม วธทดสอบอยางเครงครด เพอปองกนการลด และเพม จ านวนของเชอในกรณทการตรวจหาเชอเชงปรมาณ การวเคราะห Total Plate Count (ปรมาณแบคทเรยทงหมด) พบวา ขนตอนการเตรยมสารเคม 2,3,5 – triphenyltetrazolium chloride ตองใชอปกรณทผานการฆาเชอภายในวนทเตรยม ไดแก ขวด ชอน และน า ควรเกบใหพนแสง และเมอใชเสรจเกบในตเยน อณหภม 2-8 องศาเซลเซยส และในขนตอนการเตรยม diluent ควรตรวจสอบเปอรเซนตการสญเสยกอนและหลงการฆาเชอ ชวง serial dilution ไมเกน ± 2 % ชวง Initial dilution ไมเกน ± 5 % และในขนตอนการแชตวอยางเมอเท serial dilution ตองเขยาใหทวมตวอยางทงหมดกอนจบเวลา 20 นาท ในการเตรยมตวอยางกอนเจอจางตวอยาง ตองเขยาถงตวอยางใหเปนเนอเดยวกน ในการปฏบตงาน ตงแตเรมตนวเคราะห จนจบกระบวนการวเคราะห ควรใชระยะเวลาภายใน 45 นาท ภายใตอณหภม 18-27 องศาเซลเซยส การวเคราะหปรมาณเชอรา พบวา ขนตอนการเตรยม diluent ควรตรวจสอบ เปอรเซนตการสญเสยกอนและหลงการฆาเชอ ชวง serial dilution ไมเกน ± 2 % และชวง Initial dilution ไมเกน ± 5 % โดยเฉพาะในขนตอนการเตรยมอาหารเลยงเชอ DG18 ควรเกบใหพนแสง เนองจาก แสงท าใหเกด cytotoxic ซงมผลตอ microflora ในตวอยาง และในขนตอนการเจอจางตวอยาง ควรใชปเปตในแนวตง และในขณะปลอยลงจานเพาะเชอ ควรใชปเปตในแนวเอยงลาด เพอปองกนการตกตะกอนของสปอรเชอรา และในขนตอนการแชตวอยางเมอเท serial dilution ตองเขยาใหทวมตวอยางทงหมดกอนจบเวลา 20 นาท ในการเตรยมตวอยางกอนเจอจางตวอยาง ตองเขยาถงตวอยางใหเปนเนอเดยวกน ผ วจยยงพบอกวา ในการปฏบตงาน ตงแตเรมตนวเคราะห จนจบกระบวนการวเคราะห ควรใชระยะเวลาภายใน 45 นาท ภายใตอณหภม 18-27 องศาเซลเซยส นอกจากนตองสงเกตและศกษาชนดเชอราทขนเพอเลอกชนดอาหารเลยงเชอราทเหมาะสมในแตละชนดตวอยางอาหารสตวซงมความหลากหลาย ขณะนคณะท างาน ISO ก าลงพจารณารางมาตรฐานใหมเพอศกษาหาชนดอาหารเลยงเชอทเหมาะสม การวเคราะหปรมาณ Enterobacteriaceae พบวา ในขนตอนการเตรยม diluent ควรตรวจสอบเปอรเซนตการสญเสยกอนและหลงการฆาเชอ ชวง serial dilution ไมเกน ± 2 % ชวง Initial dilution ไมเกน ± 5 % และในขนตอนการแชตวอยางเมอเท serial dilution ตองเขยาใหทวมตวอยางทงหมดกอนจบเวลา 20 นาท ในการเตรยมตวอยางกอนเจอจางตวอยาง ตองเขยาถงตวอยางใหเปนเนอเดยวกน ผปฏบตงานตองควบคมเวลา ตงแตเรมตนวเคราะห จนจบกระบวนการวเคราะห ควรปฏบตใหเสรจภายใน 45 นาท ภายใตอณหภม 18-27 องศาเซลเซยส เพอควบคมปรมาณจ านวนเชอ เชนเดยวกบการวเคราะหปรมาณเชอราและ Total Plate Count


ขอเสนอแนะในกำรทดสอบเชอซลโมเนลลำ การตรวจหาเชอซลโมเนลลา ท าไมจงใหผลไมตรงกน เชอซลโมเนลลาจดเปนแบคทเรยทมกพบใน

อาหารและอาหารสตว ทกประเทศก าหนดเปนกฎหมายใหตองปลอดเชอซลโมเนลลา แตในวตถดบหรออาหารสด มกมขอหามเปนบางซโรวา สาเหตหลายประการทท าใหการตรวจพบเชอมผลทแตกตางกนได นอกเหนอจากปจจยของการตรวจชนดของเชอหรอการปนเปอนไมไดมลกษณะทวถง การบาดเจบหรอการปรบตวของเชอหรอการปนเปอนระดบนอยมากในระยะเรมตนการสมตวอยางไมเปนตวแทนจรงของการผลตทงหมด เชน สมนอยเกนไป ไมไดสมในจดเสยง จดวกฤต หรอ Lot ทมความเสยง เปนตน แตอกปจจยหนงทส าคญคอ วธการทดสอบทเลอกใชกบอปกรณ เครองมอ และบคลากรททดสอบนบเปนปจจยส าคญทท าใหไมพบเชอ 1. วธทดสอบ ก าหนดใหตองมการตรวจสอบความใชไดของวธ โดยปกตหากใชเชอทเตมลงในตวอยางซงเปนเชอทแขงแรง จะตรวจพบไดไมแตกตางกนในแตละวธ ตองเพมทดสอบกบเชอทมลกษณะบาดเจบตามลกษณะกระบวนการผลต เชน ความเยน หรอความรอน ความเปน กรด ดาง ของตวอยาง และทดสอบเพมเตมดวย และปรมาณเชอทเตมมความส าคญตองนบจ านวนใหมปรมาณทเตมทแทจรง เพอใหทราบคาต าสดทวเคราะหไดถกตอง หากตรวจไมพบเชอในผลตภณฑตองท าหลายๆวธเปรยบเทยบกนวาไมพบเชอแนนอน เนองจากบางครงมอทธพลจากสวนประกอบของผลตภณฑหรอกระบวนการผลตมายบยงการเจรญของเชอชวคราวในตอนแรกจงตรวจไมพบ

2. เครองมอ การบมเชอทระยะ Pre-enrichment กบ Selective enrichment broth หากมการเขยาหรอบมใน water bath จะท าใหมการเพมจ านวนของเชอซลโมเนลลา ไดปรมาณมากกวาการตงไวเฉย ๆ ในตบมเชอ 3. มการแบงครงจานเพาะเชอเพอ Streak เชอ เปนการประหยดจานเพาะเชอในการ Streak ในกรณอาหารดบหรอวตถดบ ทไมไดผานความรอนไมควรแบงครงจานเพาะเชอในการ Streak เพอใหไดโคโลนเดยว

4. เทคนคการ Streak เชอ หากมเชอนอยการ Streak ตองทดลองดวาอาจตองใชปรมาณของเหลวมากกวา 1 Loop เชน ใช swab หรอ Cotton bud จมแลวน ามาขดลากตองดงเชอออกใหหมดทกจดทมหยดน าอยเสนแรกของการขดเชอ 4.1 การดงโคโลนเชอไมออกจากเชอแกงแยงทขนคลมซลโมเนลลาอยจะเหนเปนคราบเมอกกระจายแพรไปทวในบรเวณเสนแรกของการ Streak เชอ 4.2 เทคนคการ Streak ทมจ านวนเสนนอยเกนไป ท าใหการแยกตวของเชอมนอยจงไมเหนโคโลนเดยวของซลโมเนลลา 4.3 การขดและทบเสนแรกนอยแค 1 หรอ 2 เสนหรอมการเผา Loop เพอจะ Streak ในโซนท 2 หรอถดไป 4.4 การเรงรบหรอมจ านวนตวอยางมาก การยก Loop ขนจากการจมของเหลวจาก Selective enrichment broth เรวเกนไปจนไมมสารละลายน าไป Streak ท าใหมสารละลายจบอยนอยไมเตม Loop

4.5 Loop ทช ารดในการจบน าเนองจากการเผาฆาเชอ ท าใหมลกษณะผ กรอน ไมมแรงตงผวเพยงพอทจะจบสารละลายทบมเชอแลว เมอน าไปเขยเชอ หรอ Loop รอนเกนไปขณะใชงาน ใหใชแบบนงฆาเชอแทน Loop จะใชไดนานและอมสารละลายทบมเชอแลวไปขดลากเชอไดดกวา


ปญหาเหลานจะไมมผลกระทบในการทดสอบหรอการเบยดบงเชอซลโมเนลลาหรอการตรวจไมพบเชอในบางชนดตวอยาง (Matrix) ทงนขนอยกบชนดของตวอยางและลกษณะของการปนเปอนมเชอแขงขนมากหรอนอยดวย 5. การอานแปลผลของเชอซลโมเนลลาทผดปกต เชน ไมม H2S จดสด า กลางโคโลนหรอแมแตตองสมลกษณะทผดปกตหากมการขนโคโลนทแตกตางไปจากปกตไปทดสอบทางชวเคมดวยอยางสม าเสมอเพราะยงมหลายซโรวา เชน S. Typhi S. Paratyphi จะใหผลทางชวเคมทไมเหมอนปกตจงไมไดน ามาทดสอบยนยนบวก และบางครงกระบวนการผลตอาหารสตวหรอการปรบตวของซลโมเนลลา จะท าใหเปลยนแปลงคณลกษณะไปจากเดมได หรอควรมการใชเทคนค DNA หรอชดทดสอบชวเคมส าเรจรปอนๆ มายนยนผลลบบางอาจจะทก 6 เดอนหรอทกครงท เหนโคโลนมลกษณะแตกตางจากทเคยเกดขน ซงอาจจะท าใหพบเชอซลโมเนลลาทใหผลทางชวเคมทผดปกตได 6. ระยะเวลาทตรวจในชวงทแตกตางกน การเกบรกษาตวอยางไวนานกวาจะหมดอายผลตภณฑควรน ามาตรวจสอบเปนระยะจะไดมนใจวาไมมเชอซลโมเนลลาปนเปอนอยในผลตภณฑจรง เพราะบางครงกระบวนการผลตอาจมการยบยงการเจรญของเชอไประยะหนง หรอแบงตวชา จงตรวจไมพบในระยะแรกและตรวจพบไดเมอสงออกหรอหลงจากการเกบรกษาจงมปรมาณเชอเพมจ านวนขนเพยงพอในการ Streak และเหนลกษณะโคโลนขนได ปจจบนมการใชเทคนคการ Pooling ตวอยาง โดยใชตวอยางในการตรวจมากขนหากตรวจไมพบท 25 กรม ท าวเคราะหเพมเปนอก 9 ตวอยาง เปน 250 กรม และใชเทคนค magnetic bead มาจบเชอ ซลโมเนลลา รวบรวมเชอแบคทเรยไดมากขนจงตรวจพบตวบวกมากขน เพอเพมจ านวนปรมาณการสมตวอยางใหมากขนนอกจากนการสมตวอยางผสมตองรจดวกฤตทเสยงตอการปนเปอนเชอ นอกจากจะสมแบบปกตแลวตองสมเพมจ านวนและสมในจดทวกฤตดวย จงจะท าใหยงควบคมคณภาพวาปลอดเชอ ซลโมเนลลาจรงในผลตภณฑ


ขอเสนอแนะทส ำคญในกำรทดสอบสำรพษเชอรำ Aflatoxin B1 1. การกรองดวย filter Disposable filter 0.45 um ตองทดสอบวาไมม Aflatoxin B1 สญ

หายไประหวางการกรองโดยกอนใชตองทดลอง ทวนสอบเพราะมทกรองหลายชนดสามารถจบ Aflatoxin B1 ใหตรวจ % Recovery ของตวอยางควบคม (spiked sample) ใหไดคาอยระหวาง 60 -120% โดยเปรยบเทยบกบคา control charts การ spiked ตวอยางทดใหเตมสารไมใหมากกวา 2 ml แลวน าไประเหยในทมดประมาณ 0.5 – 2 ชวโมง ตรวจดความเทยงโดยฉดสารมาตรฐานตรงความเขมขนกลางทก 5 ตวอยาง สงเกตด peak area ไมควรเปลยนเกน 10% จากมาตรฐานท Calibrate ไวเดม

2. ระมดระวงปรมาณการเท (Load) สารละลายลงใน immune affinity columns ตามทผผลตก าหนดและควบคมความเรวในการไหลประมาณ 1-2 หยดตอวนาท เปนขนตอนส าคญทจบสาร Aflatoxin B1ไดด หากปลอยเรวเกนไปกจะจบไดนอย ในการรายงานผลควรบอก % recovery ของตวอยางควบคมดวย และจดส าคญเฉพาะทสงเกตพบระหวางการปฏบตงาน ซงอาจมผลตอผลทดสอบเชน สของตวอยาง หรอไขมนจากกากปาลมและกากมะพราว จะท าใหการตรวจพบ Aflatoxin B1 สงเกน โดยเฉพาะอาหารโค ขนตอนการสกดตองไดคาตามทระบใหในชวงทก าหนดในการยอมรบวธทดสอบ การ Clean–up มวธใหมกอนใช ตองพสจนแลววาไดคาเทยบเทากบทระบในแตละวธทดสอบทก าหนดไว

3. ควรมการตรวจคดกรอง Aflatoxin B1 ดวยชดตรวจสอบ ตาง ๆ เชน ชด ELISA สามารถคดกรองและบอกปรมาณไดคราวๆโดยผทดสอบตองมความช านาญในการใช Micropipetter และ Multichannel Micropipetter ซงเปนเรองส าคญทท าใหไดปรมาตรการดดปลอยสารในแตละขนตอนถกตองผลทดสอบทไดจะมคาความแมนและเทยงทกครงและจะไมเกดการปนเปอนขามในแตละตวอยางดวย ตวอยางทใชทดสอบตองมการตรวจวดวามสภาพเปนกลาง pH 7 ± 0.5 จงจะเหมาะสมในการตรวจวด การคดกรองตวอยางโดยการใชเทคนค Lateral flow strip ตรวจวด Aflatoxin B1 ตองดคาต าสด LOD ทวดไดของชดทดสอบแตละชนดซงตองทวนสอบกอนกบตวอยางควบคมวามประสทธภาพเพราะโดยปกตจะมคาสงกวาวธ ELISA ควรเลอกใชวธทดสอบทไดรบการรบรองจากหนวยงานทเปนทยอมรบเชน AFNOR AOAC เปนตนแตอยางไรกตามตองมการตรวจสอบความใชไดกบชนดตวอยางในประเทศเพราะมลกษณะแตกตางกนกบตวอยางในตางประเทศเพราะชดทดสอบอาจไดรบรองเฉพาะตวอยางบางชนดเทานน 4. การใช Spectrophotometer การใช Spectrophotometer ในการวดการดดกลนแสง หากมการใชเครองเปนเวลานานจะเกดการ Drift ได ให recalibrate โดยใช re-blank ในการปฏบตงานประจ าวนในกรณทมจ านวนตวอยางเขาวดเปนจ านวนมากตอเนองกน ตองตรวจสอบโดยวดคา blank เปนระยะโดยตองมขอมลการเฝาระวงวาตองท าทกกตวอยาง การเปลยน Wavelengths ตองตงคาท 0 ใหม และตองท า Calibrate ความยาวคลนแตละชวง เปนประจ า เพอความแมน และเทยง ของผลทดสอบ ขอเสนอแนะกำรใชเครองมอทส ำคญ 1. เครองชง ลกน ามกเคลอนทกอนใชงานเครองชงถงแมจะปรบแตงแลวแตระหวางใชงานใหตรวจสอบใหอยตรงกลางเสมอผใชงานอาจสมผสจนท าใหต าแหนงลกน าเปลยนไป ท าใหน าหนกทชงไดคลาดเคลอนจากความจรง อณหภมความชนของหองทตงเครองชงตองอยในคาทก าหนดตามคมอการใชงาน ควรปองกนแรงสนสะเทอนตอเครองชงโดยตงเครองชงบนโตะหนออน ไมเปดประตหองชงขณะใชงาน ท าการตรวจสอบประจ าวน (Daily check) โดยตองบนทกและตดตามเฝาระวงโดยใช control charts กอนการใชงานประจ าวน


2. การใช Micropipetter และ Multichannel Micropipetter ซงเปนเรองส าคญทท าใหไดปรมาตรการดดปลอยสารในแตละขนตอนถกตองเนองจากใชปรมาตรนอย จงตองท าการทวนสอบปเปตกอนการใชงานทกครงดวยผใชเอง โดยอปกรณและน ากลนและสารละลายทใช ตองตงทงไวในหองใหเปนอณหภมเดยวกนอยางนอย 1 ชวโมงกอนการใชงาน เพราะถงแมอปกรณผานการสอบเทยบผใชงานตองตรวจทวนสอบเทคนคการดดปลอย และการใส Tip ของตนองดวยวายงไดปรมาตรอยในคาทยอมรบได ขอเสนอแนะวธทดสอบทใชในกำรตรวจสอบคณภำพอำหำรสตว วธทดสอบทควรเลอกใช เชน ISO (International Organization for Standardization )หรอ AOAC (Association of Official Analytical Chemists) เพราะวธเหลานจะมการทบทวนและปรบปรงเปนระยะตามเทคโนโลยทเปลยนไป หากยงไมมวธมาตรฐาน ใหพสจนความใชไดของวธ กอนน ามาใชงาน

ความไมแนนอนของการวดจะเปนตามขอก าหนดขอ 5.4.6 ของมาตรฐาน ISO/IEC 17025: 2005 คอ หองปฏบตการตองมหรอตองประยกตใชขนตอนในการประเมนคาความไมแนนอนในการวด ระดบความเขมงวดทจ าเปนตองเปนตามขอก าหนดของวธทดสอบความตองการของลกคา และขดจ ากดในการตดสนใจทเปนไปตามเกณฑการยอมรบมชวงแคบการวดทงหมดจะประกอบดวย ความผดพลาดทไมสามารถรไดอยางสมบรณ ความผดพลาดทงหมดจะเกดจากสงตาง ๆ ดงน บคลากรผท าการวด วธการ เครองมอวด การอาน การค านวณ สภาวะแวดลอม และการสอบเทยบเครองมอทใช ความผดพลาดเนองจากบคลากรผท าการวด เชน การโนมเอยงของผท าการวด ทจะอานเครองมอผด เชนมกอานคาสงไป หรอต าไป ระดบการฝกฝนและทกษะ การปรบเครองมอกอนการใชงาน การเสอมสภาพของเครองมอ เชน แรงแมเหลกออนลง แกนเขมชหลวม หรออานตวเลขผด อานมองผดมม เครองมอทดจะมกระจกสะทอนใหเหนมมทอานถกตองเสมอ การค านวณดวยโปรแกรมตองระวงอยางมาก ตองมการตรวจสอบการท างานกอนใชงาน และสภาวะแวดลอม เชน อณหภม เปลยนไปอานไดคาตางออกไป เครองมอตองสอบเทยบ และบ ารงรกษาตามแผนตองมการระวงการใชงาน เชน ไมตกกระแทก หรอใชงานจนเกด Overload ตองสงสอบเทยบกอนระยะเวลาทวางแผนไว จงตองมการประกนคณภาพผลทดสอบตามขอก าหนด 5.9 มขนตอนการด าเนนงานในการควบคมคณภาพเพอเฝาระวงผลทดสอบ ขอมลตองบนทกและตรวจสอบแนวโนมเฝาระวง ตองมการวางแผนและทบทวน มการวเคราะหขอมลผลการควบคมคณภาพและเมอพบอยนอกเกณฑควบคมทก าหนดไวกด าเนนการตามแผน เพอแกไขปญหาและปองกนไมใหรายงานผลทดสอบทไมถกตองโดยบคลากรตองมการใชวสดอางองประจ า หรอควบคมคณภาพภายใน โดยใชวสดอางองทตยภมเขารวมในการเปรยบเทยบผลระหวางหองปฏบตการ หรอโปรแกรมทดสอบความช านาญ การทดสอบซ าโดยวธการเดมหรอตางวธ การทดสอบซ าอกโดยใชตวอยางทเกบไว การหาสหสมพนธของผลทไดส าหรบคณลกษณะทแตกตางกนของตวอยาง ดงนน หองปฏบตการทมผวเคราะหมากกวา 2 คน จงตองมการทดสอบความแตกตางกนของผวเคราะหดวยสถต F-test เพอทดสอบความแปรปรวนของทง 2 คน วาไมมความแตกตางกนอยางมนยส าคญ และ t-test ส าหรบการทดสอบความช านาญมากกวา 2 Lab หรอมากกวา 2 คน


สรป การตรวจสอบคณภาพอาหารสตวดานสารพษ สารตกคาง สารปนเปอน ในอาหารสตว นบเปนปจจยส าคญในการเฝาระวง เพอปองกนไมใหมการตกคางไปสผบรโภค แตการควบคมโดยภาครฐในระยะทผลผลตออกสตลาดแลวไมสามารถท าไดทวถงและตองใชงบประมาณสมตรวจจ านวนมาก และตองใชหองปฏบตการจากสวนกลางตรวจสอบเทานน ท าใหเสยเวลาไมสามารถก ากบดแลไดทนสถานการณ ดงนนการเตรยมความพรอมและสรางหองปฏบตการดานนใหมศกยภาพ และสามารถด าเนนการไดครอบคลมในทกภาคของประเทศ จะท าใหผบรโภคไดรบเนอสตว สนคาปศสตวและผลผลตจากสตวทปลอดภยมคณภาพปราศจากสารพษ สารตกคาง สารปนเปอนดงกลาว เอกสารฉบบนจะใชเปนแนวทางในการจดต งและด าเนนการ เพอเตรยมความพรอมใหหองปฏบตการ เพอยนขอรบรอง ISO/IEC 17025 ท าใหเปนทนาเชอถอและยอมรบของนานาประเทศในการซอสนคาทงอาหารสตวและสนคาปศสตวของประเทศไทย นอกจากน การมหองปฏบตการดานนจะท าใหผประกอบการสามารถท างานวจยผลตภณฑ หรอประกอบสตรอาหารสตว ไดตรวจสอบหลงการเลยงสตววาเนอสตวและผลผลตมคณภาพอยางไร การเลยงตองปรบสตรอาหารสตว เพอลดสารหรอเวนระยะลดยาจ านวนกวน จงจะไดผลการตกคางไมเกนระดบทยอมรบใหมตกคางไดหรอหามตรวจพบ ซงจะเปนประโยชนในการใชเปนแนวทางในการวางแผนการเลยงสตวและการก ากบดแลเฝาระวงการตรวจสอบ และใชเปนเอกสารงานวจยสนบสนนการขนทะเบยนอาหารสตวในการพฒนาสตรใหม ตลอดจนใชตรวจสอบผลตภณฑอาหารสตวทจะน าเขาไปใชในชมชน ในแตละทองทไดอยางมประสทธภาพ และมความเขมแขงขน อยางไรกตาม เทคนคการวเคราะหดานนไมเคยหยดนง จงตองมการตดตามและประยกตใช เอกสารฉบบนกบเอกสารวธทดสอบทยอมรบในระดบนานาชาต ทมคณะกรรมการทบทวนวธทดสอบตลอดเวลา เชน ISO AOAC เปนตน ส าหรบการเฝาระวงและควบคม ก ากบ ดแลการใชสารตางๆ ทผสมในอาหารสตว เทคนคการสมตวอยางใหถกจดวกฤตนบเปนเรองส าคญ เจาหนาทตองทราบจดวกฤตในการสมตวอยาง ตองมการน าเทคนคการคดกรองตวอยาง เชน การตรวจโดยชดทดสอบ การดภายใตกลองจลทรรศน ดปฏกรยาการเกดส การใชเทคนคทางจลชววทยาคดกรองตวอยางปนเปอนยาปฏชวนะ Microbiological assay เทคนค ELISA หรอ Lateral flow หรอเครองอตโนมตตางๆ มาชวยคดกรองตวอยางกอนสงยนยนผลดวยเครองมอตามวธทดสอบตามเอกสารฉบบน เพอใหไดครอบคลมทวประเทศ ชวยประหยดเวลาและคาใชจายในการตรวจสอบในหองปฏบตการอางองจากสวนกลาง การยนยนชนดสารหรอเชอจลนทรยจ าเปนตองมการศกษาโดยใชเครองมอแบบใหม ทมประสทธภาพการตรวจพบไดในระดบต าและรวดเรวถกตอง เชน เทคนคการวดชวโมเลกล Polymerase chain reaction (PCR) เทคนค Sequencing ซงบงบอกไดถงแหลงทมาของเชอและทมการระบาดวาเปนสายพนธเดยวกนหรอไมมาใชควบคกบการวดมวลสาร Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-TOF MS) ในการตรวจสอบและวางระบบคดกรองตวอยางทด ตงแตในทองท ดาน เขต จงหวด ต าบล และชมชน จะชวยท าใหปลอดสารพษ สารตกคาง สารปนเปอนไดมากยงขน สงผลตอการมสขภาพทแขงแรง สมบรณ อายยน ของประชากร และชวยสงเสรมการสงออกสนคาปศสตวไมใหถกตกลบ สรางรายไดเพมมลคาทางเศรษฐกจของประเทศไทยแบบยงยน


กตตกรรมประกำศ ขอขอบคณ นาย ไพโรจน ธ ารงโอภาส ผอ านวยการส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ทใหการ

สนบสนนเครองมอและพฒนาบคลากรของหองปฏบตการในการตรวจวเคราะหอยางยงยน ตลอดจนเปนศนยกลางถายทอดเทคนคการทดสอบทใหมและทนสมย ขอขอบคณนายกตพงศ ศรสทธานนท นางสาวภรมภรณ เถอนถ าแกว นางสาววนทนา จนทรมงคล นางสาวรฐกานต ศรศร นางสาวจนทรา ชยวงค นางสาวโสภา ถ าแกว และเจาหนาทกลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว ส านกตรวจสอบคณภาพสนคาปศสตว ทใหความรวมมอและปฏบตตามในการจดตงระบบคณภาพและไดรบรอง ISO/IEC 17025 ทกรายการทดสอบในเอกสารฉบบน และใหความส าคญในการรกษาระบบคณภาพพรอมทงมงมนรวมกนในการทจะบกเบกและเปนผน าในการตรวจสอบดานสารพษ สารตกคาง และสารปนเปอนในอาหารสตว


เอกสารอางอง

เพญศร รอดมา. 2554. แนวปฏบตการตรวจสอบความถกตองของวธทดสอบทางจลชววทยา. กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข. กรงเทพฯ. เพญศร รอดมา อรารตน วฒกรภณฑ อชฌา สจจปาละ และจ าเรยง ปญญะประสทธ. 2554. หลกเกณฑการประกนคณภาพในหองปฏบตการทางจลชววทยา. กรมวทยาศาสตรการแพทย กระทรวงสาธารณสข. กรงเทพฯ. สพตรา พชย เจรญ พชย และปนนร ชนวรรธนวงศ. 2548. การตกคางของสารเรงเนอแดง กลมเบตา-อะโกนสตในเนอสกร ในเขตภาคเหนอตอนบนของไทย. วารสารวชาการสาธารณสข. 14(2): 384-388. Abramovic, B. Jaksic S. M. and Masic, Z. S. 2005. Liquid chromatographic determination of fumonisins B1 and B2 in corn samples after reusable immunoaffinity column clean-up. J. Serb. Chem. Soc. 70 (6): 899 -910. Al-Hazmi, N. A. 2010. Determination of zearalenone (ZEA) in wheat samples collected from Jeddah market, Saudi Arabia. African Journal of Microbiology Research. 4(23): 2513-2519. Balthrop, J., Brand, B., Cowie, R. A., Danier, J., De Boever, J., De Jonge, L., Jackson, F., Makkar, H. P.S. and Piotrowski, C. 2011. Quality Assurance for Animal Feed Analysis Laboratories. FAO Animal Production and Health Manual No.14. Rome. Caprita, A., Caprita, R., Cozmiuc, C., Maranescu, B. and Sarandan, H. 2007. Simultaneous determination of mycotoxins (Ochratoxin A and Deoxynivalenol) in biological samples. Journal of Agroalimentary Processes and Technologies. 8 (2): 353-358. Cowie, R. A. 2013. Quality assurance for microbiology in feed analysis laboratories. FAO Animal Production and Health Manual No.16. Rome.

European Commision. Regulation (EC) No 178/2002 of the European Parliament and of the Council of 28 January 2002 laying down the general principles and requirements of food law, establishing the European Food Safety Authority and laying down procedures in matters of food safety. 2002. Official Journal of the European Communities. L31, 1. European Commision. Regulation (EC) No. 767/2009 of the European Parliament and of the Council of 13 July 2009 on the placing on the market and use of feed, amending European Parliament and Council Regulation (EC) No 1831/2003 and repealing Council Directive 79/373/EEC, Commission Directive 80/511/EEC, Council Directives 82/471/EEC, 83/228/EEC, 93/74/EEC, 93/113/EC and 96/25/EC and Commission Decision 2004/217/EC. 2009. Official Journal of the European Union, L229, 1.


European Commision. Regulation (EC) No. 1831/2003 of the European Parliament and of the Council of 22 September 2003 on additives for use in animal nutrition. 2003. Official Journal of the European Union, L268, 29. FAO and IFIF. 2010. Good practice for the feed industry. Implementing the Codex Alimentarius Code of Practice on Good Animal Feeding. FAO Animal Production and Health Manual No.9. Rome. Garrido, NS., Iha, MH., Santos, O. MR. and Duarte, F. RM. 2003. Occurrence of aflatoxins M(1) and M(2) in milk commercialized in Ribeirão Preto-SP, Brazil. Food Addit Contam. 20(1): 70-3. Kapaj, S., Peterson, Hans, K. L. and Bhattacharya, P. 2006. Human Health Effects From Chronic Arsenic Poisoning–A Review. Journal of Environmental Science and Health Part A, 41: 2399-2428. Levit, S. M. 2010, A Literature Revie w of Effects of Cadmium on Fish [Online], Available:http://www.nature.org/idc/groups/webcontent/@web/@alaska/documents/document/prd_026321.pdf [14 February 2013]. Lino, C. M., Silva, L. J. G., Pena, A. L. S. and Silveira, M. I. 2006. Determination of fumonisins B1 and B2 in Portuguese maize and maize-based samples by HPLC with fluorescence detection. Anal Bioanal Chem. 384: 1214-1220 Lyn Patrick, ND. 2002. Mercury Toxicity and Antioxidants: Part I: Role of Glutathione and alpha-Lipoic Acid in the Treatment of Mercury Toxicity. Alternative Medicine Review. 7 (6): 456-471. Meneely J. P., Ricci, F., Egmond H. P.V. and Elliott, C. T. 2011. Current methods of analysis for the determination of trichothecene mycotoxins in food. Trends in Analytical Chemistry. 30 (2): 192-203. Rick, C. A., Daleymple, R. H., Baker, P. and Ingle, D. L. 1984. Use of beta-agonists to alter fat and muscle deposition in steers. Science. 59: 1247-1249. Turcotte, A. M., Scott, P. M. and Tague, B. 2013. Analysis of cocoa products for ochratoxin A and aflatoxins. Mycotoxin Res. DOI 10.1007/s12550-013-0167-x. Yerneni, S. G., Hari, S. S., Jaganathan, R., Senthamarai, M., Vasanthi, N. S. and Kannan, K. P. 2012. World Journal of Science and Technology. 2 (12): 31-34.

http://www.nature.org/idc/groups/webcontent/@web/@alaska/documents/document/prd_026321.pdf

http://www.nature.org/idc/groups/webcontent/@web/@alaska/documents/document/prd_026321.pdf


ภาคผนวก ก นยามศพทเกยวกบอาหารสตว

1. นยามศพท ตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 “อาหารสตว” หมายถง วตถทมงหมายเพอใชเลยงสตวทรฐมนตรโดยค าแนะน าของคณะกรรมการควบคมคณภาพอาหารสตวประกาศเปนอาหารสตวในราชกจจานเบกษา 2. นยามศพท อนๆ “ผลต” หมายถง ท าผสม แปรสภาพ ปรงแตง เปลยนรป หรอแบงบรรจ “ขาย” หมายถง จ าหนาย จาย แจก แลกเปลยน ทงนเพอเปนประโยชนในทางการคาและใหหมายความรวมถงการมไวเพอขายดวย “น าเขา” หมายถง น าหรอสงเขามาในราชอาณาจกร “ภาชนะบรรจ” หมายถง วตถใดๆทใชบรรจหรอหมหออาหารสตวโดยเฉพาะ “ฉลาก” หมายถง รป รอยประดษฐ หรอขอความใดๆทแสดงไวทภาชนะบรรจอาหารสตว “ผรบใบอนญาต” หมายถง ผไดรบใบอนญาตตามพระราชบญญตน ในกรณทนตบคคลเปนผรบใบอนญาต ใหหมายความรวมถงผซงนตบคคลแตงตงใหเปนผด าเนนกจการดวย “ผอนญาต” หมายถง อธบดหรอผซงอธบดมอบหมาย “คณะกรรมการ” หมายถง คณะกรรมการควบคมคณอาหารสตว “พนกงานเจาหนาท” หมายถง ผซงรฐมนตรแตงตงใหปฏบตการตามพระราชบญญตน “อธบด” หมายถง อธบดกรมปศสตว “รฐมนตร” หมายถง รฐมนตรผรกษาการตามพระราชบญญต 3. ประเภทอาหารสตว แบงออกเปน 5 ประเภท ดงน 3.1 วตถดบอาหารสตว หมายถง วตถดบทประกาศในราชกจจานเบกษา ม 25 ชนด ดงน 3.1.1 กากถวเหลอง 3.1.2 กากถวลสง 3.1.3 ปลาปน ชนคณภาพท 1 3.1.4 ปลาปน ชนคณภาพท 2 3.1.5 ปลาปน ชนคณภาพท 3 3.1.6 ร าละเอยด 3.1.7 ร าหยาบ 3.1.8 ร าสกดน ามน 3.1.9 ขาวโพดเมลดเกรด 1 3.1.10 ขาวโพดเมลดเกรด 2 3.1.11 ขาวโพดปนเกรด 1 3.1.12 ขาวโพดปนเกรด 2 3.1.13 ถวเหลองอบ 3.1.14 ปลาและกระดกปลาปน 3.1.15 ขนสตวปกปน 3.1.16 เนอสตวปกปน


3.1.17 ผลพลอยไดจากสตวปกปน 3.1.18 เนอปน 3.1.19 เนอปนสกดไขมน 3.1.20 เนอและกระดกปน (โปรตน 50%) 3.1.21 เนอและกระดกปน (โปรตน 45%) 3.1.22 กากเรปซด หรอ กากคาโนลา 3.1.23 กากเมลดทานตะวน 3.1.24 กลเทนขาวโพด หรอ โปรตนขาวโพด 3.1.25 กากดดจเอส 3.2 วตถทผสมแลว ทประกาศในราชกจจานเบกษา ม 3 ชนด ดงน 3.2.1 อาหารสตวผสมส าเรจรป 3.2.2 หวอาหารสตว 3.2.3 สารผสมลวงหนา (พรมกซ) 3.3 ผลตภณฑนมส าหรบสตว หมายถง ผลตภณฑนมทใชส าหรบสตวทกชนด ทประกาศในราชกจจานเบกษา ไดแก 3.3.1 นมผงส าหรบสตว 3.3.2 หางนมผงขาดมนเนยส าหรบสตว 3.3.3 หางนมผงพรองมนเนยส าหรบสตว 3.3.4 หางนมผงดดแปลงส าหรบสตว 3.3.5 หางเนยผงส าหรบสตว 3.3.6 อาหารแทนนมส าหรบสตว 3.3.7 หางเนยผงดดแปลงส าหรบสตว 3.3.8 หางเนยผงผานกระบวนการส าหรบสตว 3.4 อาหารเสรมส าหรบสตว หมายความวา วตถดบ วตถทผสมแลว และวตถทเตมในอาหารสตว เพอใชเพมคณคาทางโภชนาการแกสตว โดยใหสตวกนโดยตรง และหรอท าใหเจอจางกอนใชเลยงสตวและหรอใชผสมอาหารสตวอนเพอใชเลยงสตว ไดแก 3.4.1 อาหารเสรมโปรตน 3.4.2 อาหารเสรมแรธาต 3.4.3 อาหารเสรมวตามน 3.4.4 อาหารเสรมไขมน 3.5 อาหารสตวผสมยา หมายความวา อาหารสตวผสมส าเรจรป หวอาหารสตวและสารผสมลวงหนาทมสวนผสมของยา หรอเภสชเคมภณฑ หรอวตถทเตมในอาหารสตว ในปรมาณทจ ากดตามขนาดการใชของยาหรอเภสชเคมภณฑหรอวตถทเตมในอาหารสตวแตละชนด เพอเสรมสขภาพในการปองกนและก าจดโรคสตว 4. ชนดสตวตามกฎหมาย หมายถง ชนดสตวทประกาศใหอาหารสตวทใชกบสตวตอไปน เปนอาหารสตวตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 ไดแก ไก เปด นกกระทา สกร โค กระบอ สนข แมว กระตาย กบ ตะพาบน า กงทะเล กงน าจด ปลาดก ปลาน าจดกนพช ปลาน าจดกนเนอ และปลาทะเลกนเนอ


5. อาหารสตวทหามผลตเพอขายหรอน าเขาเพอขายหรอขาย ซงผฝาฝนมความผดตามกฎหมาย ไดแก 5.1 อาหารสตวปลอมปน 5.2 อาหารสตวผดมาตรฐาน 5.3 อาหารสตวเสอมคณภาพ 5.4 อาหารสตวทมไดขนทะเบยน 5.5 อาหารสตวทอธบดสงเพกถอนทะเบยน 5.6 อาหารสตวอนทรฐมนตรก าหนด 6. อาหารสตวปลอมปน ไดแก อาหารสตวทใชวตถอนเปนสวนผสมไมตรงกบทขนทะเบยนไวยกเวนวตถซงอาจมไดโดยธรรมชาต ตามทรฐมนตรประกาศก าหนด 7. อาหารสตวผดมาตรฐาน ไดแก อาหารสตวทมคณภาพไมถกตองตามมาตรฐานทรฐมนตรประกาศก าหนดมาตรา 6(2) 8. อาหารสตวเสอมคณภาพ ไดแก อาหารสตวทมลกษณะตอไปน 8.1 อาหารสตวทลวงอายไปจากทแสดงไวในสลาก 8.2 อาหารสตวทเปน รา บด เนา หรอมวตถมพษเจอปนอาจเปนอนตรายแกสตวตามลกษณะ หรอปรมาณทรฐมนตรประกาศก าหนด 8.3 อาหารสตวทบรรจในภาชนะทตองหามตามมาตรฐาน 6(7) 9. อาหารสตวทเสอมคณภาพตามมาตรฐาน 34(2) มลกษณะดงตอไปน 9.1 มเชอซลโมแนลลา (Salmonella spp.) 9.2 มเชอแบคทเรยปรมาณมากกวา 8 x 106 โคโลนตอหนงกรมตอน าหนกอาหารสตว ประเภทวตถดบ วตถผสมแลว ชนดอาหารสตวผสมส าเรจรปและหวอาหารสตว อาหารสตวทมสารเสรมชวนะผสมอย 9.3 มเชอราประมาณมากกวา 1 x 105 โคโลนตอหนงกรมตอน าหนกอาหารสตว ขาวโพดปนมากกวา 5 x 105 โคโลนตอหนงกรมตอน าหนกอาหารสตว ประเภทวตถดบผสมแลวชนดอาหารสตวผสมส าเรจรปและหวอาหารสตว ยกเวนอาหารสตวทมสารเสรมผสมอย 9.4 มปรมาณอะฟลาทอกซนในประเภทดงตอไปน 9.4.1 ประเภทวตถดบ กากถวเหลอง มากกวา 50 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม กากถวลสง มากกวา 500 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม ปลาปน มากกวา 40 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม ร าขาว ร าละเอยด ร าหยาบ ร าสกดน ามน มากกวา 50 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม ขาวโพดปน มากกวา 100 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม ขาวโพดเมลด มากกวา 100 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม 9.4.2 ประเภทวตถดบ 9.4.2.1 หวอาหาร หวอาหารไก มากกวา 50 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม หวอาหารเปด มากกวา 40 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม


หวอาหารโค-กระบอ มากกวา 50 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม หวอาหารสกร มากกวา 50 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม 9.4.2.2 อาหารส าเรจรป อาหารส าเรจรปไกไข มากกวา 100 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม อาหารส าเรจรปไกเนอ มากกวา 100 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม อาหารส าเรจรปเปด มากกวา 30 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม อาหารส าเรจรปสกรแรกเกดถงน าหนก 15 กโลกรม มากกวา 50 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม อาหารส าเรจรปสกร น าหนก 15 กโลกรมขนไป มากกวา 100 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม อาหารส าเรจรปโคอายไมเกน 1 ป มากกวา 100 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม อาหารส าเรจรปโคอายตงแต 1 ปขนไป มากกวา 200 ไมโครกรมตอหนงกโลกรม 10. นยามศพท ตาม Regulation of European Union 10.1 อาหารสตว (Feed หรอ Feedingstuff) หมายถง สารใดๆ หรอผลตภณฑรวมทงสารเตมแตงทไมวาจะผานกระบวนการผลตทงหมด ผานบางสวนของกระบวนการผลต หรอไมผานกระบวนการผลต โดยมจดมงหมายเพอใหสตวกน (Regulation No. 178/2002 on Food Law-Article 34) 10.2 วตถดบอาหารสตว (Feed materials) หมายถง ผลตภณฑจากพชหรอมาจากสตวทมวตถประสงคเพอใหสตว ความตองการสารอาหาร สภาพตามธรรมชาต ความสดใหมหรอการถนอมอาหาร และผลตภณฑทไดกระบวนการทางอตสาหกรรมและสารอนทรยหรอสารอนนทรยทมหรอไมมสารเตมแตงในอาหารสตว ซงมจดมงหมายเพอใหสตวกนโดยตรงหรอหลงผานกระบวนการผลต หรอในการเตรยม compound feed หรอ premixtures (Regulation No. 767/2009 on placing on the market and use of feed Article 3(2)(g)) 10.3 สวนประกอบอาหารสตว (Compound feed) หมายถง การผสมวตถดบอาหารสตวอยางนอย 2 ชนดทมการเตมหรอไมเตมสารเตมแตงอาหารสตว เพอใหสตวกนในรปแบบของอาหารสตวส าเรจรปหรอสารเสรมส าหรบสตว (Regulation No. 767/2009 on placing on the market and use of feed Article 3(2)(h)) 10.4 อาหารสตวส าเรจรป (Complete feed) หมายถง สวนประกอบอาหารสตวซงโดยองคประกอบแลวเพยงพอส าหรบสดสวนการบรโภคในแตละวน (Regulation No. 767/2009 on placing on the market and use of feed Article 3(2)(i)) 10.5 อาหารเสรมส าหรบสตว (Complementary feed) หมายถง สวนประกอบอาหารสตวทมปรมาณสารบางชนดในปรมาณสงแตโดยองคประกอบแลวเพยงพอส าหรบสดสวนการบรโภคในแตละวนเทานนถาใชรวมกบอาหารสตวชนดอน (Regulation No. 767/2009 on placing on the market and use of feed Article 3(2)(j)) 10.6 อาหารสตวเสรมแรธาต (Mineral feed) หมายถง อาหารเสรมส าหรบสตวทประกอบดวยเถาอยางนอย 40% (Regulation No. 767/2009 on placing on the market and use of feed Article 3(2)(k))


10.7 สารเตมแตงในอาหารสตว (Feed additives) หมายถง สาร-จลนทรยหรอการเตรยมอาหารสตวทใชขนตอนการเตรยมมากกวาในวตถดบอาหารสตวและ premixtures ซงมจดมงหมายเพอใชเตมในอาหารสตวหรอน า มหนาทดงตอไปน (Regulation No. 1831/2003 on Feed additive-Article 2(2)(a)) 10.7.1 มอทธพลตอลกษณะของอาหารสตว 10.7.2 มอทธพลตอลกษณะของผลตภณฑอาหารสตว 10.7.3 มอทธพลตอสของปลาสวยงามและนก ความตองการสารอาหารของสตว 10.7.4 มอทธพลตอสงแวดลอมซงเปนผลมาจากการผลตสตว 10.7.5 มอทธพลตอการผลตสตว สวสดภาพของสตว โดยเฉพาะอยางยงอทธพลของจลนทรยในระบบทางเดนอาหารหรอความสามารถในการยอยอาหารสตว 10.7.6 ผลของ coccidiostatic หรอ histomonostatic เอกสารอางอง กรมปศสตว กระทรวงเกษตรและสหกรณ. 2545. ประกาศกระทรวงเกษตรและสหกรณ เรองก าหนดชอ ประเภท ชนด หรอลกษณะของอาหารสตวทไมอนญาตใหน าเขาเพอขาย ก าหนดชอประเภท ชนด ลกษณะคณสมบตและสวนประกอบของวตถทเตมในอาหารสตวทหามใชเปนสวนผสมในการผลตอาหารสตว European Commision. Regulation (EC) No. 767/2009 of the European Parliament and of the Council of 13 July 2009 on the placing on the market and use of feed, amending European Parliament and Council Regulation (EC) No 1831/2003 and repealing Council Directive 79/373/EEC, Commission


ภาคผนวก ข เกณฑการพจารณาผลวเคราะหตามมาตรฐานคณภาพอาหารสตว

การผานเกณฑมาตรฐานของอาหารสตว หมายถง การมคาคณภาพอาหารสตวทไดจากการ

วเคราะหเปนไปตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 และ พ.ศ. 2545 ฉบบปรบปรงแกไข(ฉบบเดม) และพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ฉบบใหม) และคาตามประกาศของสหภาพยโรปหรอของประเทศคคา มรายละเอยด ดงน 1. สารพษจากเชอรา การพจารณาผานเกณฑมาตรฐานตองพจารณาคาผลพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 และ พ.ศ. 2545 ฉบบปรบปรงแกไข(ฉบบเดม) และพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ฉบบใหม) คาตามประกาศของสหภาพยโรปหรอของประเทศคคารายละเอยดตามตาราง แนบทาย 2. สารเรงเนอแดง (Beta-agonists)

ตองตรวจไมพบเนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตวตาม พรบ.ควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 และ พ.ศ. 2545 ฉบบปรบปรงแกไข(ฉบบเดม) และพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ฉบบใหม) รายละเอยดตามตารางแนบทาย

3. คณคาทางโภชนาการ ไดแก โปรตน ไขมน กาก ความชน เถา และเกลอ รายละเอยดตามตาราง แนบทาย

การพจารณาผานเกณฑมาตรฐาน ตองพจารณาคาผลวเคราะห พรบ .ควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 และพ.ศ.2545 ฉบบปรบปรงแกไข(ฉบบเดม) และพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ฉบบใหม) และเทยบกบคาทขออนญาตจดทะเบยนอาหารสตว รายละเอยดตามตารางแนบทาย

4. การตรวจหาสวนประกอบของอาหารสตว ตองตรวจไมพบการปลอมปนสงทไมไดขอจดทะเบยนไวในการผสมในอาหารสตว รายละเอยดตาม

ตารางแนบทาย

5. การพจารณาอาหารสตวเสอมคณภาพ มรายละเอยด ดงน ไมพบเชอแบคทเรย ชนด Salmonella spp. ในตวอยางอาหารสตว 25 กรม มปรมาณแบคทเรยไมเกน 8.0x106 โคโลน/กรม ยกเวน สารเสรมชวนะผสมอย มปรมาณราไมเกน 1.0x105 โคโลน/กรม ยกเวนในขาวโพดปนตองไมเกน 5.0x106 โคโลน/กรม

และยกเวนสารเสรมชวนะผสมอย DNA หามพบเนอและกระดกปนโคในอาหารสตวเคยวเออง

รายละเอยดตามตารางแนบทาย


6. การตรวจสอบชนดยาเบองตนดวยวธเกดสทางเคม (Screening test) ตองตรวจไมพบดวยวธ Screening test ยาในอาหารสตวทง 8 ชนด ดงน คอ Nitrofurazone

Nitrofurantoin Furazolidone Furaltadone Nitrovin Chlortetracycline Oxytetracycline และCarbadox หากพบสารดงกลาว ตองยนยนดวยการวเคราะหทางปรมาณดวยเครองมอชนสง เชน HPLC LC-MS และ LC-MS/MS กรณตรวจไมพบ ตองมการตรวจยนยนประมาณ 10% ดวยเครองมอชนสง รายละเอยดตามตารางแนบทาย

7. การตรวจหาชนดและปรมาณสารตองหามตองไมพบ 10 กลมของสหภาพยโรป และ 11 กลมของสหรฐอเมรกา ชนดยาเภสชเคมภณฑตองหามใชในอาหารสตว ตามพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2525 และ พ.ศ. 2545 ฉบบปรบปรงแกไข(ฉบบเดม) และพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ฉบบใหม) 1. กลม Nitrofurans 2. กลม Beta-agonists 3. กลม Nitroimidazoles 4. Olaquindox 5. Carbadox 6. Deoxynivalenol 7. Chloramphenicol 8. Melamine รายละเอยดตามตารางแนบทาย 8. การตรวจสอบหาสารปฏชวนะหรอสารยบยงจลนทรยดวยเทคนคทางจลชววทยากบเชอแบคทเรย 4 ชนด หากเกดโซนใสแสดงวา มสารทเปนยาปฏชวนะหรอเภสชเคมภณฑปนเปอนอย ตองเฝาระวง และเพมความเขมงวดในการตรวจสอบ โดยเฉพาะอาหารสตวผสมส าเรจรป แตสารเสรมแรธาต สารผสมลวงหนา และวตามนทมความเขมขนสง อาจเกดโซนใสได


เกณฑมาตรฐานพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 ชนดวตถดบอาหารสตว คามาตรฐาน หมายเหต

ดานจลชววทยา - ปรมาณเชอแบคทเรย ไมเกน 8.0 x 106 CFU/g ยกเวนสารเสรมชวนะผสมอย - ปรมาณเชอรา ไมเกน 1.0 x 105 CFU/g ยกเวนในขาวโพดปนตองไมเกน 5.0 x 105

CFU/g และยกเวนสารเสรมชวนะผสมอย - Salmonella spp. หามพบ Salmonella spp.

ในตวอยางอาหารสตว 25 กรม

- DNA หามพบเนอและกระดกปนในอาหารสตวเคยวเออง

ดานกายภาพ Screening test - ไมพจารณาเกณฑมาตรฐาน - Oxytetracyclinc (OTC) - ไมพจารณาเกณฑมาตรฐาน - Chlortetracyclinc (CTC) - ไมพจารณาเกณฑมาตรฐาน - Furazolidone (FZD) หามพบ เปนสารตองหามทหามใชผสมในอาหารสตว - Nitrofurazone (NFZ) หามพบ เปนสารตองหามทหามใชผสมในอาหารสตว - Furaltadone (FTD) หามพบ เปนสารตองหามทหามใชผสมในอาหารสตว - Nitrofurantoin (NFT) หามพบ เปนสารตองหามทหามใชผสมในอาหารสตว

- Nitrovin (NIV) หามพบ เปนสารตองหามทหามใชผสมในอาหารสตว - Roxarzone (ROX) - ไมพจารณาเกณฑมาตรฐาน - Zoalene (ZOA) - ไมพจารณาเกณฑมาตรฐาน - วตามน A,B2,B6,C - พจารณาตามการจดทะเบยน - แรธาต Fe,Co,Cu - พจารณาตามการจดทะเบยน - สวนประกอบ - พจารณาตามการจดทะเบยน - ปลอมปนวตถดบอาหารสตว หามพบ เพอคณภาพอาหารสตวและสงทอาจกอใหเกด

อนตรายหรอเปนพษกบสตว -ปลอมปนเนอและกระดกปนในอาหารโค

หามพบ เพอปองกนโรคววบา


เกณฑมาตรฐานพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ตอ) ชนดวตถดบอาหารสตว คามาตรฐาน หมายเหต

งานพษวทยาและชวเคม (สารตกคาง) Beta-agonists - Salbutamol (Sal) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว - Clenbuterol (Clen) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว - Ractopamine (Rac) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Nitroimidazoles - Dimetridazole (DMZ) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว - Ronidazole (RIZ) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว - Metronidazole (MTZ) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Nitrofurans - Nitrofurazone (NFZ) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว - Nitrofurantoin (NFT) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว - Furazolidone (FZD) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว - Furaltadone (FTD) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Carbadox (CBX) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Olaquindox (OLQ) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Chloramphenicol (CAP) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Diethylstibestrol (DES) หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Melamine หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว Avopacin หามพบ เนองจากเปนสารตองหามใชในอาหารสตว ดานพษวทยาและชวเคม (สารพษเชอรา) Aflatoxins (total) - อาหารส าเรจรปส าหรบเปด <30 ppb - - ปลาปน, หวอาหารเปด <40 ppb - - กากถวเหลอง, ร าขาว, ร าละเอยด, ร าหยาบ, ร าสกดน ามน, หวอาหารไก, หวอาหารสกร, อาหารส าเรจรปสกรแรกเกดถง 15 กก.

<50 ppb -

- ขาวโพดปน,เมลดขาวโพด, หวอาหารโค-กระบอ, อาหารส าเรจรปไกไข-ไกเนอ, อาหารส าเรจรปสกรน าหนก 15 กก. ขนไป, อาหารส าเรจรปโคอายไมเกน 1 ป

<100 ppb -

- อาหารส าเรจรปโคอายเกน 1 ป <200 ppb - - กากถวลสง <500 ppb -


เกณฑมาตรฐานพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ตอ)

ชนดวตถดบอาหารสตว มาตรฐานวตถดบอาหารสตว

โปรตน ไขมน กาก ความชน เถา เกลอ - กากถวเหลอง ไมนอยกวา

42% ไมเกน 7%

ไมเกน 8%

ไมเกน 13%

ไมเกน 8%

-

- ถวเหลองอบ ไมนอยกวา 36%

ไมนอยกวา15%

ไมเกน 7%

ไมเกน 11%

ไมเกน 6%

-

- กากถวลสง ไมนอยกวา 42%

ไมเกน 10%

ไมเกน 8%

ไมเกน 12%

ไมเกน 13%

-

- ปลาปน ชนคณภาพท 1 ไมนอยกวา 60%

- ไมเกน 2%

ไมเกน 10%

ไมเกน 26%

ไมเกน 3%



ไมเกน 10%

ไมเกน 28%

ไมเกน 3%



ไมเกน 10%

ไมเกน 30%

ไมเกน 3%

- ปลาและกระดกปลาปน ไมนอยกวา 40%

ไมเกน 8%

ไมเกน 2%

ไมเกน 10%

ไมเกน 33%

ไมเกน 3%

- ขนสตวปกปน ไมนอยกวา 80%

ไมเกน 5%

ไมเกน 1.5%

ไมเกน 11%

ไมเกน 4%

-

- ร าละเอยด ไมนอยกวา 12%

ไมนอยกวา 15%

ไมเกน 8%

ไมเกน 11%

ไมเกน 10%

-

- ร าหยาบ ไมนอยกวา 5%


ไมเกน 28%

ไมเกน 11%

ไมเกน 18%

-

- ร าสกดน ามน ไมนอยกวา 14.5%

ไมเกน 3%

ไมเกน 15%

ไมเกน 13%

ไมเกน 14%

-

- ขาวโพดปน เกรด 1 ไมนอยกวา 8%


ไมเกน 3%

ไมเกน 13%

ไมเกน 2%

-

- ขาวโพดปน เกรด 2 ไมนอยกวา 7.5%


ไมเกน 3%

ไมเกน 13%

ไมเกน 2%

-

- ขาวโพดเมลด เกรด 1 ไมนอยกวา 8%


ไมเกน 3%


ไมเกน 2%

-

- ขาวโพดเมลด เกรด 2 ไมนอยกวา 7.5%


ไมเกน 3%


ไมเกน 2%

-

- เนอปน ไมนอยกวา 54%

ไมเกน 15%

ไมเกน 4%

ไมเกน 10%

ไมเกน 29%

-

- เนอปนสกดไขมน ไมนอยกวา 60%

ไมเกน 5%

ไมเกน 4%

ไมเกน 10%

ไมเกน 29%

-

- เนอและกระดกปน (โปรตน 50%)


ไมเกน 15%

ไมเกน 4%

ไมเกน 10%

ไมเกน 32%

-

- เนอและกระดกปน (โปรตน 45%)


ไมเกน 15%

ไมเกน 4%

ไมเกน 10%

ไมเกน 35%

-


เกณฑมาตรฐานพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ. 2558 (ตอ)

ชนดวตถดบอาหารสตว มาตรฐานวตถดบอาหารสตว

โปรตน ไขมน กาก ความชน เถา เกลอ - เนอสตวปกปน ไมนอยกวา

55% ไมเกน 15%

ไมเกน 4%

ไมเกน 10%

ไมเกน 25%

-

- ผลพลอยไดจากสตวปกปน ไมนอยกวา 40%

ไมเกน 18%

ไมเกน 4%

ไมเกน 10%

ไมเกน 30%

-

- กากเรปซดหรอกากคาโนลา ไมนอยกวา 32%


ไมเกน 13%

- -

- กากเมลดทานตะวน ไมนอยกวา 27%



- -

- กากดดจเอส ไมนอยกวา 24%



- -

- โปรตนขาวโพดหรอกลเทนขาวโพด



ไมเกน 12%

- -

- นมผงส าหรบสตว (Whole Milk Powder Feed Grade)




- -

- หางนมผงขาดมนเนยส าหรบสตว (Skimmed Milk Powder Feed Grade)




- -

- หางนมผงพรองมนเนยส าหรบสตว (Partly Skimmed Milk Powder Feed Grade)


ไมเกน 26% (แตมากกวา

1.5%)


- -

- หางนมผงดดแปลงส าหรบสตว (Denatured Skimmed Milk Powder)


-


- -

- หางเนยผงส าหรบสตว (Whey Powder)


- - ไมเกน 7%

- -

- อาหารแทนนมส าหรบสตว (Milk Replacer)



- -

- หางเนยผงดดแปลงส าหรบสตว (Denatured Whey Powder)



- -

- หางเนยผงผานกระบวนการส าหรบสตว (Processed Whey Powder )



- -


เกณฑมาตรฐานสหภาพยโรป ชนดวตถดบอาหารสตว คามาตรฐาน หมายเหต

งานพษวทยาและชวเคม (สารตกคาง) Melamine - น านม ไมเกน 1 ppm Commission Regulation (EU)

No 574/2011 of 16 June 2011 หนา L159/12

- อาหารสตวผสมส าเรจรป/วตถดบอาหารสตว ไมเกน 2.5 ppm

Maximmins Labels - Sum dioxins (WHO-PCDD/F-TEQ) - ไขมนหม ไมเกน 1.0 pg/g fat Commission Regulation (EU)

No 1259/2011 of 2 December 2011 หนา L302/18 ถง 320/23

- ไขมนไก ไมเกน 1.75 pg/g fat

- Sum of dioxins and dioxinlike PCBs (WHO-PCDD/F-TEQ) - ไขมนหม ไมเกน 1.25 pg/g fat Commission Regulation (EU)


- ไขมนไก ไมเกน 3.0 pg/g fat

- Sum of PCB28, PCB52, PCB101, PCB138, PCB153 and PCB180 - ไขมนหม ไมเกน 40 ng/g fat Commission Regulation (EU)


- ไขมนไก ไมเกน 40 ng/g fat

Dioxins (SUM PCDDs)/PCDFs - อาหารสตว (ส าเรจรป) ไมเกน 0.75 ng/g fat

Commission Regulation (EU) No 277/2012 of 28 March 2012 หนา L91/1 ถง 91/6

- อาหารสตวเลยง ไมเกน 1.75 ng/g fat - วตถดบอาหารสตว (พช/น ามน) ไมเกน 0.75 ng/g fat - วตถดบอาหารสตว (สตว-ปลา/สตวน าอนๆ) ไมเกน 1.25 ng/g fat Sum of dioxins and dioxin-like PCBs - อาหารสตว (ส าเรจรป) ไมเกน 1.5 ng/g fat

Commission Regulation (EU) No 277/2012 of 28 March 2012 หนา L91/1 ถง 91/6

- อาหารสตวเลยง ไมเกน 5.5 ng/g fat - วตถดบอาหารสตว (พช) ไมเกน 1.25 ng/g fat - วตถดบอาหารสตว (สตว-ปลา/สตวน าอนๆ) ไมเกน 4.0 ng/g fat - วตถดบอาหารสตว (พชน ามน) ไมเกน 1.5 ng/g fat Organochlorine pesticide (OCPs) - อาหารสตวผสมส าเรจรป/วตถดบอาหารสตว ไมเกน 0.02 ppm Commission Regulation (EU)

No 547/2011 of 16 June 2011 หนา L155/14 ถง 159/15

Polychlorinate biphenyls (PCBs) - อาหารสตวเลยง ไมเกน 10 ppb Commission Regulation (EU)

No 547/2011 of 16 June 201หนา L159/17

- วตถดบอาหารสตว (สตว-ปลา/สตวน าอนๆ) ไมเกน 30 ppb

- ไขมนทไดจากสตว ไมเกน 10 ppb Commission Regulation (EU) No 277/2012 of 28 March 2012 หนา L91/1 ถง 91/6

- น ามนปลา ไมเกน 175 ppb

- ผลตภณฑจากน านม ไมเกน 10 ppb - ไข ไมเกน 10 ppb



งานพษวทยาและชวเคม (สารพษจากเชอรา) - Aflatoxin B1 - วตถดบส าหรบผลตอาหารสตว, เนอมะพราวแหง, เนอปาลม, เมลดฝาย

<20 ppb

Official Journal of the European Union (2006) หนา L285/36

- หวอาหารและอาหารส าเรจรป โค กระบอ แกะ แพะ สกร สตวปก

<20 ppb

- หวอาหารและอาหารส าเรจรปส าหรบสตวใหนม (โค กระบอ แพะ)

<5 ppb

- หวอาหารและอาหารส าหรบลกแพะ ลกแพะ ลกวว ลกแกะ ลกสกร ลกสตวปก อาหารส าเรจรปสตวอน

<10 ppb

- หวอาหารสตวอน <5 ppb Aflatoxin (M1) - นมและผลตภณฑจากนม <0.05 ppb Official Journal of the

European Union (2006) หนา L326/15

Ochratoxin A - ธญพชและผลตภณฑ <0.25 ppb Official Journal of the


- หวอาหารและอาหารส าเรจรปส าหรบสกร <0.05 ppb - หวอาหารและอาหารส าเรจรปสตวปก <0.1 ppb 4. Zearalenone - ธญญพชและผลตภณฑ <2 ppm


- ขาวโพดและผลตภณฑ <3 ppm - หวอาหารและอาหารส าเรจรปส าหรบลกสกร, สกรรน, สกรสาว

<0.1 ppm

- หวอาหารและอาหารส าเรจรปลกสกรตวเมย, แมพนธเลยงลกและ สกรขน

<0.25 ppm

- หวอาหารและอาหารส าเรจรปส าหรบลกวว, โคนม,กระบอนม, แพะ, ลกแพะ แกะ, ลกแกะ

<0.5 ppm

- Deoxynivalenol - ธญญพชและผลตภณฑ <8 ppm


- ขาวโพดและผลตภณฑ <12 ppm - หวอาหารสตวและอาหารส าเรจรป <5 ppm - หวอาหารและอาหารส าเรจรปส าหรบสกร <0.9 ppm - หวอาหารและอาหารส าเรจรปส าหรบลกวว < 4 เดอน, แกะ, ลกแกะ

<2 ppm



งานพษวทยาและชวเคม (สารพษจากเชอรา) (ตอ) Fumonisin (B1+B2) Official Journal of the


- ขาวโพดและผลตภณฑจากขาวโพด <60 ppm - หวอาหารและอาหารส าเรจรปส าหรบสกร, มา, กระตาย, สตวเลยง

<5 ppm

- หวอาหารและอาหารส าเรจรปปลา <10 ppm - หวอาหารและอาหารส าเรจรปสตวปก, ลกวว < 4 เดอน,แกะ, ลกแกะ

<20 ppm

- หวอาหารและอาหารส าเรจรปสตวเคยวเอองอาย > 4 เดอน

<50 ppm

T2+HT2 - ขาวโอตปน <2000 µg/kg - ผลตภณฑจากธญพช <500 µg/kg - อาหารส าเรจรป ยกเวนอาหารแมว <250 µg/kg - อาหารส าเรจรปส าหรบแมว <50 µg/kg ดานเคม Lead (Pb) - กากถวเหลอง ไมเกน 10 mg/kg - ขาวโพด ไมเกน 10 mg/kg - วตถดบอาหารสตว ไมเกน 10 mg/kg ยกเวน green fodder ไมเกน 40

mg/kg เกลอฟอสเฟต ไมเกน 30 mg/kg ยสต ไมเกน 5 mg/kg

- อาหารส าเรจรปส าหรบสตว ไมเกน 5 mg/kg - อาหารเสรมส าหรบสตว ไมเกน 10 mg/kg - อาหารแรธาตส าหรบสตว ไมเกน 30 mg/kg Cadmium (Cd) - วตถดบอาหารสตวทมาจากพช ไมเกน 1 mg/kg - วตถดบอาหารสตวทมาจากสตว ไมเกน 2 mg/kg - เกลอฟอสเฟต ไมเกน 10 mg/kg - อาหารส าเรจรปส าหรบโค กระบอ แกะ แพะ ไมเกน 1 mg/kg ยกเวนลกโค ลกกระบอ ลกแกะ ลก

แพะและสตวอน ๆ ไมเกน 0.5 mg/kg

- อาหารเสรมแรธาตสตว ไมเกน 5 mg/kg - อาหารเสรมอน ๆ ส าหรบโค กระบอ แกะแพะ ไมเกน 0.5 mg/kg



ดานเคม (ตอ) Mercury (Hg) - วตถดบอาหารสตว ไมเกน 0.1 mg/kg - อาหารสตวทผลตจากผลพลอยไดของปลา หรอสตวทะเลอน ๆ

ไมเกน 0.5 mg/kg

- อาหารส าเรจรปส าหรบสตว ไมเกน 0.1 mg/kg ยกเวน อาหารสตวส าเรจรปส าหรบสนขและแมว ไมเกน 0.4 mg/kg

- อาหารเสรมส าหรบสตว ไมเกน 0.2 mg/kg ยกเวน อาหารเสรมส าหรบสนขและแมว

Arsenic (As) - วตถดบอาหารสตว ไมเกน 2 mg/kg ยกเวนวตถดบทไดจากหญา

lucerne แหง, clover แหง, dried sugar beet pulp และ dried molasses sugar beet pulp ไมเกน 4 mg/kg

- เกลอฟอสเฟตและอาหารสตวทไดจากกระบวนการแปรรปของปลาหรอสตวทะเลอน ๆ

ไมเกน 10 mg/kg

- อาหารส าเรจรปส าหรบสตว ไมเกน 2 mg/kg ยกเวนอาหารสตวส าเรจรปส าหรบปลา ไมเกน 4 mg/kg

- อาหารเสรมส าหรบสตว ไมเกน 4 mg/kg ยกเวนอาหารเสรมแรธาตส าหรบสตว ไมเกน 12 mg/kg


ผลวเคราะหคณภาพอาหารสตวทมการแจงเตอนความไมปลอดภย รายงานแจงเตอนผลทดสอบตวอยางอาหารสตวทไมผานเกณฑมาตรฐานพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว

(อางองตาม พ.ศ. 2525) (Rapid Alert System for feed safety) ปงบประมาณ 2553 รายการผลทดสอบ จ านวน

ตย.ทงหมด

จ านวนตวอยาง (%) ชนด จ านวนทผดเกณฑ

พรบ.

คาต าสด คาสงสด หนวยงานตนเรอง ทตรวจ ทผด

เกณฑ Salmonella spp. 1,800 2,594 47* -วตถดบ (ขนสตวปกปน) 38 - - ดานกรงเทพฯ

ทางน า <144.11%> <1.81%> -อาหารผงไก (การถวเหลอง,ร า,ขาวโพด,ปลาปน)

2

-อาหารผงโค 1 -อาหารเมดไก 3 -อาหารเสรม 1 -อาหารส าเรจรปสกร 1 -อาหารส าเรจรปไก 1

แบคทเรย 1,216 1,216 3* -อาหารโคส าเรจรปชนดผง 1 1.7x107 8.9x106 ลพบร,นครราชสมา <100%> <0.25%> -อาหารส าเรจรปสกร 1

-วตถดบอน ๆ 1 ปรมาณเช อรา 1,271 1,271 4* -อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 2 1.8x105 5.8x105 พะเยา

<100%> <0.31%> -วตถดบอน ๆ 2 ไขมน 2,245 2,245

<100%> 36*

<1.60%> - วตถดบ ปลาปน 1 ตย. 36 3.62 24.26 สมทรสาคร

- วตถดบขนสตวปกปน 27 ตย.

- วตถดบปลาและกระดกปลาปน 7 ตย.

- วตถดบเน อไกปน 1 ตย. โปรตน 2,916 2,916

<100%> 11*

<0.38%> - วตถดบปลาปน 2 ตย. 11 6.96 76.46 ลพบร

- วตถดบขนสตวปกปน 2 ตย. - วตถดบขาวโพดปน 4 ตย.

ความช น 2,892 2,892 <100%>

20* <0.70%>

-วตถดบปลาปน 20 ตย. 20 11.44 17.73 ตราด,ปตตาน

เถา 777 777 <100%>

10* <1.29%>

-วตถดบปลาปน 10 ตย. 10 6.48 42.36 ประจวบครขนธ,ปตตาน

กาก 1,881 1,881 <100%>

1* <0.05%>

-ร าสกดน ามน 1 16.53 16.53 นนทบร

การปลอมปน 411 429 <104.38%>

4* <0.93%>

-อาหารผงโคนมระยะอมทองและใหนม

4 - - สระบร

Carbadox 554 554 <100%>

7* <0.26%>

-อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 2 62.29 214.41 สพส. -อาหารผงสกร 5 112.26 36,956.06

Chloramphenicol 660 660 <100%>

1* <0.15%>

-อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 390.99 390.99 นครปฐม

Olaquindox 451 451 <100%>

1* <0.22%>

-อน ๆ 1 7,548.951.91

7,548.951.91

สพส.

Furazolidone 1,049 1,049 <100%>

18* <1.72%>

-อน ๆ 5 1,009,89 16,330,9 สพส. -อาหารผงสกร (Mixer) 7 6.42 53.49 -อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 3 40.03 1,841.09

-สารผสมลวงหนา 1 117.93 1,249.75

-อาหารส าเรจรปสกร 2 5,727.25 5,927.25


รายงานแจงเตอนผลทดสอบตวอยางอาหารสตวทไมผานเกณฑมาตรฐานพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว(อางองตาม พ.ศ. 2525) (Rapid Alert System for feed safety) ปงบประมาณ 2553 (ตอ)

รายการผลทดสอบ จ านวนตย.

ทงหมด


พรบ.


เกณฑ Dimetridazole 551 551

<100%> 15*

<2.72%> -อาหารผงสกร 4 1.49 19.74 สพส. - Mixer 5 8.7 23.4 -อน ๆ 4 473.51 119,116.93 -สารผสมลวงหนา (Mixer) 1 15.47 15.47 -อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 16.67 16.67

Ractopamine 1,276 1276 <100%>

20* <1.56%>

-อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 3 82.95 117,564.78 ชลบร,ตรง - Mixer 5 996.13 7,504.18 -อาหารผงสกร 10 82.95 9,415.48 -อาหารส าเรจรปชนดเมด 1 3,378.97 3,378.97 -สารผสมลวงหนา 1 11,564 117,567.78

Salbutamol (Sal)

1,264 1,264 <100%>

43* <3.40%>

-อาหารผงสกร 22 136.36 7,398.25 ปราจนบร,นครปฐม - Mixer 13

-อาหารส าเรจรปชนดเมด 3 135.95 1,580.79 -สารผสมลวงหนา 2 62,016.14 2,915,152.

30 Aflatoxins (total) 300 652

<217.33%> 15*

<2.30%> -ไกไขระยะไข(อาหารส าเรจรป)

2 100.42 127.24 สพส.,ลพบร

-ขาวโพดปน 8 105.42 327.25 -อาหารเมดโค 3 207.08 472.38 -อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 2 318.44 327.82

Aflatoxin (B1) 1,244 2,120 <170.42%>

15* <0.71%>

-อาหารส าเรจรปไก 1 102.46 356.3 นครปฐม,ลพบร,สระบร -วตถดบ 10

-อาหารเมดไก 2 -อาหารเมดโค 1 -อาหารส าเรจรปไก 1


รายงานแจงเตอนผลทดสอบตวอยางอาหารสตวทไมผานเกณฑมาตรฐานพระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว(อางองตาม พ.ศ. 2525) (Rapid Alert System for feed safety) ปงบประมาณ 2554


ทงหมด


พรบ.


เกณฑ Salmonella spp. 1,800 2,002

<111.55%> 47*

<2.34%> วตถดบ (ขนสตวปกปน) 5 - - ดานกรงเทพฯ

ทางน า,ชมพร วตถดบ (ปลาปน) 20 - - วตถดบ (กากถวเหลอง) 9 - - วตถดบ (น ามนพช) 1 - - วตถดบ (เน อสตวปกปน) 2 - - วตถดบ (เน อสตวและ กระดกปน)

5 - -

วตถดบอาหารสตว 1 - - อาหารส าเรจรปสกร 1 - - อาหารส าเรจรปไก 1 - - อาหารผงไก 1 - - อาหารส าเรจรปชนดผง (ปลา) 1 - -

แบคทเรย 1,000 1,120 <112%>

9* <0.9%>

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 1 4.9 x 107 4.9 x 107 นครราชสมา อาหารส าเรจรปโค 4 2.4 x 107 8.8 x 106 อาหารเมดไก 1 2.4 x 107 2.4 x 107 อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 1 9.1 x 106 9.1 x 106 วตถดบ (ฟางแหง) 2 8.9 x 106 1.9 x 107

ปรมาณเช อรา 1,000 1,127 <112.7%>

10* <0.89%>

อาหารสกร 5 1.4 x 105 1.9 x 105 พะเยา,ปศจ.สพรรณบร วตถดบ (ปลาปน) 1 4.1 x 106 4.1 x 106

วตถดบ (ขาวโพด) 1 6.1 x 105 6.1 x 105 วตถดบ (ฟางแหง) 2 5.3 x 105 6.1 x 105 วตถดบ (ร า) 1 3.3 x 105 3.3 x 105

ไขมน 1,500 1,455 <97%>

18* <1.23%>

วตถดบ (ขนสตวปกปน) 14 5.64 9.89 ชลบร วตถดบ (ปลาและกระดกปลาปน)

4 19.34 24.36

โปรตน 1,500 1,947 <129%>

9* <.0.46%>

วตถดบ (ปลาปน) 4 42.86 53.46 นครศรธรรมราช วตถดบ (กากถวเหลอง) 3 32.04 39.75 วตถดบ (ขาวโพดปน) 1 7.11 7.11 วตถดบ (เน อสตวและ กระดกปน)

1 41.95 41.95

ความช น 1,800 1,833 <101.83%>

25* <1.36%>

วตถดบ (ปลาปน) 25 11 17.09 นครศรธรรมราช

เถา 500 544 <108.8%>

17* <1.83%>

วตถดบ (ปลาปน) 15 31.67 42.36 นครปฐม วตถดบ (ขาวโพดปน) 1 3.02 3.02 วตถดบ (ร าละเอยด) 1 12.16 12.16

กาก 1,200 1,291 <107.58%>

2* <0.15%>

วตถดบ (ปลาปน) 1 10.16 10.16 นครศรธรรมราช วตถดบ (กากถวเหลอง) 1 3.62 3.62 นนทบร

การปลอมปน 400 564 <141%>

2* <0.35%>

วตถดบ (กากคาโนลา) 1 - - ดานฯ ชลบรขอนแกน วตถดบ (ขาวโพดบด) 1 - -

Carbadox 1,000 1,454 <145.4%>

10* <1%>

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 1 17,990.88 17,990.88 สพส. Mixer 3 18,64.3 16,812.52 อาหารผงสกร 10 840.25 24,542.66

Furazolidone 1,000 1,501 <150.1%>

16* <1.06%>

Mixer 2 2,678.63 3,006.44 สพส. อาหารผงสกร 11 187.96 6,194.16 อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 2 2,598.41 4,259.75 อาหารสกร 1 1,400.02 1,400.02




ทงหมด


พรบ.


เกณฑ ไขมน 1,500 1,455

<97%> 18*

<1.23%> วตถดบ (ขนสตวปกปน) 14 5.64 9.89 ชลบร วตถดบ (ปลาและกระดก ปลาปน)

4 19.34 24.36

Dimetridazole 500 551 <110.2%>

14* <2.72%>

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 7 0.27 88.18 สพส. อาหารผงสกร 3 0.54 72.06 Mixer 2 33.19 139.76 อน ๆ (ยาแกทองเสย) 1 99,353.48 99,353.48 อาหารสกร 1 1.2 1.2

Ractopamine 1,000 1,276 <127.6%>

19* <1.48%>

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 5,070.67 5,070.67 สพส. Mixer 7 119.28 5,605.93 อาหารผงสกร 9 196.14 10,391.72 อาหารสกร 1 803.78 803.78 สารผสมลวงหนา (พรมกซ) 1 10,317,083 10,317,083

Salbutamol 1,000 1,264 <126.4%>

36* <2.84%>

อาหารผงสกร 26 71.99 53,844.05 สพส. อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 4 73.33 6,081.50 Mixer 6 102.64 8,799.34

Aflatoxin (B1) 1,000 726 <72.60%>

3* <72.60%>

วตถดบ (ขาวโพดปน) 3 113.16 492.34 สพรรณบร


14* <2.72%>

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 7 0.27 88.18 สพส. อาหารผงสกร 3 0.54 72.06 Mixer 2 33.19 139.76 อน ๆ (ยาแกทองเสย) 1 99,353.48 99,353.48 อาหารสกร 1 1.2 1.2

Ractopamine 1,000 1,276 <127.6%>

19* <1.48%>

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 5,070.67 5,070.67 สพส. Mixer 7 119.28 5,605.93




ทงหมด


พรบ.



(99.17%) 34*

(1.90%) อาหารโคส าเรจรปชนดผง 9 - - ลพบร, สระแกว,

สงขลา, พระนครศรอยธยา, สพส., สระบร, นครราชสมา,ศรษะเกษ,

อบลราชธาน, ประจวบครขนธ, ราชบร, ชมพร, สมทรสาคร, นครปฐม

อาหารส าเรจรปโค 2 - - อาหารโคส าเรจรปชนดเมด 1 - - อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 - - อาหารส าเรจรปสกร 5 - - ขนสตวปกปน 3 - - กากถวเหลอง 2 - - ปลาปน 10 เน อไกปน 1

แบคทเรย 1,000 504 (50.40%)

15* (2.98%)

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 5 1.1 x 107CFU/g

3.0 x 107CFU/g

ประจวบครขนธ, สระบร, ราชบร, นครราชสมา,

อดรธาน, ลพบร อาหารส าเรจรปโค 2 1.0 x

107CFU/g 1.1 x

107CFU/g อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 1 1.4 x

107CFU/g 1.4 x

107CFU/g อาหารส าเรจรปสกร 2 1.1 x

105CFU/g 4.5 x

105CFU/g ขนสตวปกปน 1 2.1 x

107CFU/g 2.1 x

107CFU/g ปลาปน 2 8.6 x

106CFU/g 2.5 x

108CFU/g วตถดบอาหารสตว 2 8.1 x

106CFU/g 1.6 x

107CFU/g ปรมาณเช อรา 1,000 343

(34.30%) 7*

(2.04%) อาหารส าเรจรปสกร 4 1.1 x

105CFU/g 4.5 x

105CFU/g สระบร,

หนองคาย, ชลบร,

ศรษะเกษ, เพชรบร

วตถดบอาหารสตว 3 1.3 x 105CFU/g

7.3 x 105CFU/g

ไขมน 1,500 1,395 (93.00%)

38* (2.72%)

ขนสตวปกปน 32 5.53% 13.02% สระบร, ชลบร, สพส., นครปฐม, นครราชสมา, อบลราชธาน,

ลพบร, สมทรสาคร, เชยงราย, ปทมธาน

ปลาและกระดกปลาปน 4 20.42% 23.17% ขาวโพดปน 2 0.41% 1.16%

โปรตน 2,000 1,222 (61.10%)

8* (0.65%)

ขาวโพดปน 5 6.87% 7.32% เชยงราย, ปทมธาน,

ชลบร, สโขทย, อดรธาน

กากถวเหลองอบ 2 33.28% 34.90% ขนสตวปกปน 1 76.71% 76.71%

ความช น 2,000 1,580 (62.90%)

21* (1.33%)

ปลาปน 20 11.55% 19.68% นครศรธรรมราช, ประจวบครขนธ, ระนอง, ตราด, จนทบร, ตรง, สมทรสงคราม, ชมพร, ปตตาน

ขาวโพดปน 1 15.03% 15.03%




ทงหมด


พรบ.


เกณฑ เถา 500 164

(32.80%) 4*

(2.44%) ปลาปน 2 31.90% 35.38% นครปฐม, สงขลา

, สมทรสาคร เน อปน 1 30.65% 30.65% ขนสตวปกปน 1 12.50% 12.50%

กาก 1,200 307 (25.58%)

3* (0.98%)

ขาวโพดปน 1 0.41% 0.41% เชยงราย, สมทรสาคร ปลาและกระดกปลาปน 2 2.49% 2.49%

การปลอมปน 400 141 (35.25%)

1* (0.71%)

ขาวโพดปน 1 - - เชยงราย

Carbadox 150 278 (185.33%)

5* (1.80%)

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 4 252.69 µg/kg

11211.10 µg/kg

สงหบร, สพส., นครปฐม

อาหารส าเรจรปสกร 1 280.59 µg/kg

3693.62 µg/kg

Olaquindox 150 76 (50.67%)

5* (6.58%)

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 4 0.83 mg/kg

2.09 mg/kg

สพส.

ยาสตว(สกร) 1 14565.82 mg/kg

14565.82 mg/kg

Salbutamol 1,000 1,505 (150.50%)

25* (1.66%)


90066.81 µg/kg

นครนายก, สพส.,

ฉะเชงเทรา, ชลบร, ลพบร,

นครปฐม

ยาสตว(สกร) 1 90,009,887.70 µg/kg

90,009,887.70 µg/kg

Mixer 1 59,556.30 µg/kg

59,556.30 µg/kg

Dimetridazole 1,000 256 (25.60%)

6* (2.34%)


45.75 mg/kg

ชลบร, สพส.

Ractopamine 1,000 825 (82.50%)

1* (0.12%)


2071.76 µg/kg

สพรรณบร

Furazolidone 1,281 360 (28.10%)

14* (3.89%)


3,777.54 µg/kg

สพส., ชลบร, นครนายก,

ราชบร อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 1 145.75 µg/kg

145.75 µg/kg

ยาสตว(สกร) 1 9,0009.48 µg/kg

9,0009.48 µg/kg

Aflatoxin (B1) 1,200 595 (49.58%)

8* (1.34%)

ขาวโพดปน 4 102.35ppb 174.12ppb ปศจ.สพรรณบร

ชลบร, สระบร, สระแกว, อดรธาน,

สมทรสาคร, ปทมธาน,

ลพบร

อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 2 103.50ppb 109.06ppb อาหารส าเรจรปไก 1 286.33ppb 286.33ppb อาหารส าเรจรปเปด 1 84.00ppb 84.00ppb

Aflatoxin (B2) 1,200 108 (9.00%)

2* (1.85%)

ขาวโพดปน 1 102.35ppb 10.235ppb สระบร, สระแกว อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 1 10.9.06ppb 109.06ppb




ทงหมด


พรบ.



<127.11%> 49*

<2.14%> วตถดบ (ปลาปน) 15 - - ดานกรงเทพฯ

ทางน า, ดานฯลาดกระบง, ชมพร, สพส., นครราชสมา,

ล าพน, สงขลา, จนทบร,

ประจวบครขนธ, นครปฐม

วตถดบ (กากถวเหลอง) 1 - - วตถดบ (ถวเหลองอบ) 1 - - วตถดบ (เน อหมปน) 1 - - วตถดบ (เน อสตวปกปน) 1 - - วตถดบ (เน อสตวและกระดกปน) 6 - - วตถดบ (แปงขาวสาล) 1 - - วตถดบ (กากทเหลอจากแปงขาวโพด)

1 - -

กากคาโนลา 1 - - ผลพลอยไดจากสตวปกปน 17 - - อาหารส าเรจรปสกร 1 - - อาหารส าเรจรปสกรชนดดผง 1 - - อาหารส าเรจรปไก 2 - -

ปรมาณแบคทเรย 1,000 1,821 <182.10%>

12* <0.65%>

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 3 4.9 x 107 CFU/g

4.9 x 107

CFU/g นครราชสมา,

ราชบร, นครปฐม,

สระบร, ล าพน, ลพบร

อาหารส าเรจรปโค 2 8.9 x 106 CFU/g

1.1 x 107 CFU/g

วตถดบ (ขนสตวปกปน) 1 9.5 x 106 CFU/g

9.5 x 106 CFU/g

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 8.3 x 106 CFU/g

2.7 x 107 CFU/g

วตถดบ (กากมนส าปะหลง) 1 1.1 x 108 CFU/g

1.1 x 108 CFU/g

อาหารเสรมโปรตน 2 1.0 x 107 CFU/g

1.0 x 107 CFU/g

ปรมาณเช อรา 1,000 1,159 <115.90%>

2* <0.17%>

วตถดบ(กากเอทานอล) 1 6.3 x 106 CFU/g

6.3 x 106 CFU/g

นครราชสมา, นครปฐม

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 1.3 x 105 CFU/g

1.3 x 105 CFU/g

ไขมน 1,500 1,624 <108.26%>

16* <0.98%>

วตถดบ (ขนสตวปกปน) 14 5.81% 9.50% นครราชสมา, ปทมธาน,

สพส., ชลบร, สระบร,

นครปฐม, อบลราชธาน, สมทรสาคร

วตถดบ (ปลาและกระดกปลาปน)

1 25.92% 25.92%

วตถดบ (ร าละเอยด) 1 0.02% 0.02%

โปรตน 1,500 1,845 <123.00%>

13* <.0.70%>

วตถดบ (ปลาและกระดก ปลาปน)

1 30.56% 30.56% สพส., ดานฯลาดกระบง, สพรรณบร,

สระบร, นครปฐม

วตถดบ (ร าละเอยด) 1 5.11% 5.11% วตถดบ (ขาวโพดปน) 1 6.76% 6.76% วตถดบ (เน อสตวและกระดกปน) 5 46.78% 48.43% วตถดบ (ขนสตวปกปน) 1 78.16% 78.16% วตถดบ (เน อสตวและกระดกปน)

2 49.98% 57.33%

โปรตนขาวโพด 2 48.90% 52.53%




ทงหมด


พรบ.


เกณฑ ความช น 1,800 2,076

<115.33%> 16*

<0.77%> วตถดบ (ปลาปน) 8 11.75% 14.85% ประจวบครขนธ

, นครราชสมา, สพส., ตรง,

สงขลา, เชยงราย,

ดานกกสตว,กรงเทพฯทางน า,

ปตตาน

วตถดบ (ปลาและกระดกปลาปน)

2 12.52% 12.53%

วตถดบ (ขนสตวปกปน) 2 12.63% 14.17% วตถดบ (ร าละเอยด) 1 12.82% 12.82% วตถดบ (ขาวโพดปน) 3 6.98% 7.03%

เถา 500 350 <70.00%>

21* <6.00%>

วตถดบ (ร าละเอยด) 15 15.08% 15.08% นครปฐม, ประจวบครขนธ, สพส., กกสตวกรงเทพฯทางน า

วตถดบ (กากถวเหลอง) 1 10.32% 10.32% วตถดบ (ปลาปน) 3 32.28% 33.26% วตถดบ (ผลพลอยไดจากสตวปกปน) 2 37.33% 40.15%

กาก 1,200 1,526 <127.16>

2* <0.13%>

วตถดบ (ร าละเอยด) 1 35.95% 35.95% นครปฐม, สพส. วตถดบ (กากถวเหลอง) 1 8.86% 8.86%

การปลอมปน 400 1,194 <298.50%>

50* <4.18%>

วตถดบ (ขาวโพดปน) 3 - - เชยงราย, ลพบร, ดานฯลาดกระบง,

นครปฐม, ดานฯกกสตว

กรงเทพฯทางน า

วตถดบ (ผลพลอยไดจากสตวปกปน) 23 - - วตถดบ (ขนสตวปกปน) 2 - - วตถดบ (กากถวเหลอง) 4 - - อาหารผงโค 2 - - อาหารโคส าเรจรปชนดเมด 1 - - เน อและกระดกปน 14 - - เน อหมปน 1 - -

Carbadox 1,000 634 <63.40%>

4* <0.63%>

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 144.20 µg/kg

16228.50 µg/kg

สพส., ปทมธาน


35262.29 µg/kg

Furazolidone 1,000 1,000 <100.00%>

2* <0.20%>

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 2 624.76 µg/kg

16,457.36 µg/kg

สพส., กองสารวตรและกกกน


4* <0.45%>


0.75 mg/kg

สพส., กองสารวตรและ

กกกน อาหารโคส าเรจรปชนดผง 1 6.53 mg/kg

6.53 mg/kg

Ractopamine 1,000 1,001 <100.10%>

2* <0.19%>


4172.60 µg/kg

สพส., พจตร


135948.72 µg/kg

Salbutamol 1,000 1,001 <100.10%>

124* <12.38%

>


30542.19 µg/kg

สพส., ชลบร, กาญจนบร, รอยเอด, นครปฐม,

ประจวบครขนธ, เชยงใหม,

ฉะเชงเทรา, พจตร, ชยภม


19058.75 µg/kg


8515.90 µg/kg

อาหารส าเรจรปโค 1 13246.78 µg/kg

13246.78 µg/kg


39092.74 µg/kg




ทงหมด


พรบ.


เกณฑ Aflatoxin (B1) 1,000 1,403

<140.30%> 2*

<0.14%> วตถดบ (ขาวโพดปน) 2 125.99

ppb 157.64 ppb

เชยงใหม

Salbutamol 1,000 1,001 <100.10%>

124* <12.38%>


30542.19 µg/kg


ประจวบครขนธ, เชยงใหม,

ฉะเชงเทรา, พจตร, ชยภม


19058.75 µg/kg




ทงหมด


พรบ.



<127.11%> 49*

<2.14%> วตถดบ (ปลาปน) 15 - - ดานกรงเทพฯ

ทางน า, ดานฯลาดกระบง, ชมพร, สพส., นครราชสมา,

ล าพน, สงขลา, จนทบร,

ประจวบครขนธ, นครปฐม

วตถดบ (กากถวเหลอง) 1 - - วตถดบ (ถวเหลองอบ) 1 - - วตถดบ (เน อหมปน) 1 - - วตถดบ (เน อสตวปกปน) 1 - - วตถดบ (เน อสตวและกระดกปน)

6 - -

วตถดบ (แปงขาวสาล) 1 - - วตถดบ (กากทเหลอจากแปงขาวโพด)

1 - -

กากคาโนลา 1 - - ผลพลอยไดจากสตวปกปน 17 - - อาหารส าเรจรปสกร 1 - - อาหารส าเรจรปสกรชนดดผง 1 - - อาหารส าเรจรปไก 2 - -

ปรมาณแบคทเรย 1,000 1,821 <182.10%>

12* <0.65%>

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 3 4.9 x 107 CFU/g

4.9 x 107

CFU/g นครราชสมา,

ราชบร, นครปฐม, สระบร, ล าพน,

ลพบร อาหารส าเรจรปโค 2 8.9 x 106

CFU/g 1.1 x 107 CFU/g

วตถดบ (ขนสตวปกปน) 1 9.5 x 106 CFU/g

9.5 x 106 CFU/g


2.7 x 107 CFU/g

วตถดบ (กากมนส าปะหลง) 1 1.1 x 108 CFU/g

1.1 x 108 CFU/g

อาหารเสรมโปรตน 2 1.0 x 107 CFU/g

1.0 x 107 CFU/g

ปรมาณเช อรา 1,000 1,159 <115.90%>

2* <0.17%>

วตถดบ(กากเอทานอล) 1 6.3 x 106 CFU/g

6.3 x 106 CFU/g

นครราชสมา, นครปฐม

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 1.3 x 105 CFU/g

1.3 x 105 CFU/g

ไขมน 1,500 1,624 <108.26%>

16* <0.98%>

วตถดบ (ขนสตวปกปน) 14 5.81% 9.50% นครราชสมา, ปทมธาน, สพส., ชลบร, สระบร,

นครปฐม, อบลราชธาน, สมทรสาคร


1 25.92% 25.92%

วตถดบ (ร าละเอยด) 1 0.02% 0.02%

โปรตน 1,500 1,845 <123.00%>

13* <.0.70%>


1 30.56% 30.56% สพส., ดานฯลาดกระบง, สพรรณบร,

สระบร, นครปฐม วตถดบ (ร าละเอยด) 1 5.11% 5.11% วตถดบ (ขาวโพดปน) 1 6.76% 6.76% วตถดบ (เน อสตวและกระดกปน) 5 46.78% 48.43% วตถดบ (ขนสตวปกปน) 1 78.16% 78.16% วตถดบ (เน อสตวและกระดกปน)

2 49.98% 57.33%

โปรตนขาวโพด 2 48.90% 52.53%




ทงหมด


พรบ.



<115.33%> 16*

<0.77%> วตถดบ (ปลาปน) 8 11.75% 14.85% ประจวบครขนธ,

นครราชสมา,สพส., ตรง, สงขลา,

เชยงราย, ปตตาน,ดานกกสตว,

กรงเทพฯทางน า,

วตถดบ (ปลาและกระดกปลาปน) 2 12.52% 12.53% วตถดบ (ขนสตวปกปน) 2 12.63% 14.17% วตถดบ (ร าละเอยด) 1 12.82% 12.82% วตถดบ (ขาวโพดปน) 3 6.98% 7.03%

เถา 500 350 <70.00%>

21* <6.00%>

วตถดบ (ร าละเอยด) 15 15.08% 15.08% นครปฐม, ประจวบครขนธ, สพส., กกสตว

กรงเทพฯ ทางน า

วตถดบ (กากถวเหลอง) 1 10.32% 10.32% วตถดบ (ปลาปน) 3 32.28% 33.26% วตถดบ (ผลพลอยไดจากสตวปกปน) 2 37.33% 40.15%

กาก 1,200 1,526 <127.16>

2* <0.13%>

วตถดบ (ร าละเอยด) 1 35.95% 35.95% นครปฐม, สพส. วตถดบ (กากถวเหลอง) 1 8.86% 8.86%

การปลอมปน 400 1,194 <298.50%>

50* <4.18%>

วตถดบ (ขาวโพดปน) 3 - - เชยงราย, ลพบร, ดานฯลาดกระบง, นครปฐม, ดาน

ฯกกสตว กรงเทพฯทางน า

วตถดบ (ผลพลอยไดจากสตวปกปน) 23 - - วตถดบ (ขนสตวปกปน) 2 - - วตถดบ (กากถวเหลอง) 4 - - อาหารผงโค 2 - - อาหารโคส าเรจรปชนดเมด 1 - - เน อและกระดกปน 14 - - เน อหมปน 1 - -

Carbadox 1,000 634 <63.40%>

4* <0.63%>


16228.50 µg/kg

สพส., ปทมธาน


35262.29 µg/kg

Furazolidone 1,000 1,000 <100.00%>

2* <0.20%>


16,457.36 µg/kg

สพส., กองสารวตรและกกกน


4* <0.45%>


0.75 mg/kg

สพส., กองสารวตรและ

กกกน อาหารโคส าเรจรปชนดผง 1 6.53 mg/kg

6.53 mg/kg

Ractopamine 1,000 1,001 <100.10%>

2* <0.19%>


4172.60 µg/kg

สพส., พจตร


135948.72 µg/kg

Salbutamol 1,000 1,001 <100.10%>

124* <12.38%>


30542.19 µg/kg


ประจวบครขนธ, เชยงใหม, ฉะเชงเทรา,

พจตร, ชยภม


19058.75 µg/kg


8515.90 µg/kg

อาหารส าเรจรปโค 1 13246.78 µg/kg

13246.78 µg/kg


39092.74 µg/kg

Aflatoxin (B1) 1,000 1,403 <140.30%>

2* <0.14%>

วตถดบ (ขาวโพดปน) 2 125.99 ppb

157.64 ppb

เชยงใหม




ทงหมด


พรบ.



(133.20%) 60*

(3.00%) ของขบเค ยวสตวเล ยงสนข 5 - - กองควบคม

อาหารและยาสตว, ดานฯลาดกระบง,

พจตร,นครปฐม, ระยอง,

สมทรปราการ,ชยนาท,

ปตตาน,ดานกรงเทพฯทาง

น า

ขนสตวปกปน 18 - - เน อสตวและกระดกปน (โปรตน 50%)

4 - -

เน อหมปน 1 - - ปลาปน 4 - - อาหารส าเรจรปสกร 16 - - อาหารส าเรจรปโค 2 - - อาหารส าเรจรปเปด 3 - - ผลพลอยไดจากสตวปกปน 5 - - วตถทผสมแลวชนดพรมกซ 1 - - อาหารผสมส าเรจรปชนดผงไมโครเอนแคปซเลทส าหรบกงกลาด า

1 - -

ปรมาณแบคทเรย 600 532 (88.67%)

8* (1.50%)

กากมนส าปะหลง 1 2.4 x 107 CFU/g

2.4 x 107

CFU/g กองควบคม

อาหารและยาสตว, สระบร,

นครปฐม, ระยอง

กากแปงมน 1 1.7 x 107 CFU/g

1.7 x 107 CFU/g


9.7 x 106 CFU/g

ขนสตวปกปน 1 1.1 x 107 CFU/g

1.1 x 107 CFU/g

อาหารส าเรจรปโค 1 1.7 x 107 CFU/g

1.7 x 107 CFU/g

อาหารส าเรจรปสกร 1 1.1 x 107 CFU/g

1.1 x 107 CFU/g

วถดบทผสมแลวชนดพรมกซ 1 1.5 x 108 CFU/g

1.5 x 108 CFU/g

มนเสน 1 1.8 x 107 CFU/g

1.8 x 107 CFU/g

ปรมาณเช อรา 600 519 (86.50%)

1* (0.19%)

วตถทผสมแลวชนดพรมกซ โค กระบอ ไก

1 2.8 x 105 CFU/g

2.8 x 105 CFU/g

ระยอง

ไขมน 1,500 1,819 (121.27%)

56* (3.08%)

ขนสตวปกปน 57 5.71% 13.10% ลพบร, กองควบคมอาหารและยาสตว,

สระบร, ปทมธาน,

ชลบร โปรตน 1,500 1,875

(125.00%) 9*

(0.48%) ขนสตวปกปน 2 72.72% 77.61% กองควบคม

อาหารและยาสตว, นครปฐม

, ชลบร, อดรธาน

ขาวโพดปน 4 5.19% 7.28% กากถวเหลอง 1 37.86% 37.86% ปลาปน 2 6.43% 6.59%




ทงหมด


พรบ.



(100.83%) 8*

(0.44%) ปลาปน 8 11.32% 17.30% ระนอง,

นครศรธรรมราช, จนทบร, ระยอง, ตรง, กองควบคมอาหารและยา

สตว เถา 500 515

(103.00%) 4*

(0.78%) ปลาปน 3 29.85% 34.95% ตรง, ปตตาน,

นครปฐม เน อและกระดกปน โปรตน 50%

1 35.84% 35.84%

กาก 1,200 1,773 (147.75%)

3* (0.17%)

-กากเรปซดหรอกากคาโนลาผสมอาหารสตว

1 14.41% 14.41% ดานฯลาดกระบง, กองควบคมอาหารและยา

สตว ปลาปน 2 23.49% 23.64%

เกลอ 300 367 (122.33%)

17* (4.63%)

ปลาปน 14 3.06% 5.42% ตรง, ระยอง, ปตตาน,

นครศรธรรมราช, กองควบคม

อาหารและยาสตว

ปลาและกระดกปลาปน 3 3.66% 3.70%

การปลอมปน 70 210 (300.00%)

4* (1.90%)

เน อและกระดกปนพบการปลอมปนขนไกปน

1 - - กองควบคมอาหารและยา

สตว กากาถวเหลองพบการปลอมปนขาวโพดปน

1 - -

ปลาปนพบการปลอมปนกากปาลมแกลบและกากขาวบารเลย

1 - -

ปลาปนพบการปลอมปนกากถวเขยวกากปาลม กากขาวบารเลย และร าขาว

1 - -

Aflatoxin B1 1,000 1,681 (168.10%)

1* (0.06%)

อาหารส าเรจรปไก 1 130.00 µg/kg

130.00 µg/kg

นครราชสมา

Salbutamol 1,000 956 (95.60%)

22* (2.30%)

อาหารผสมเองใชส าหรบเล ยงสกรขน

1 313.85 mg/kg

313.85 mg/kg

กองสารวตรและกกกน, ยะลา,

ปศข.7, นครปฐม, ฉะเชงเทรา,

ราชบร, สพรรณบร,

ประจวบครขนธ

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 12 5.27 mg/kg

753,951.50

mg/kg ผงสเทาไมทราบชนด 1 2,329.49

mg/kg 2,329.49 mg/kg

อาหารส าเรจรปโค 3 0.2 mg/kg

5.13 mg/kg


186.42 mg/kg

พรมกซส าหรบสกร 1 360.50 mg/kg

360.50 mg/kg




ทงหมด


พรบ.



(118.54) 36

(2.03) วตถดบ 25 - - อยส. อาหารเปดส าเรจรปชนดเมด 4 - - สมทรปราการ อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 2 - - ฉะเชงเทรา อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 2 - - ฉะเชงเทรา Dog Chews 1 - - อยส. อาหารโคส าเรจรปชนดผง 1 - - สระบร หวอาหารไก 1 - - อยส.

ปรมาณแบคทเรย 600 971 (161.84)

30 (3.09)

วตถดบ 18 1.1x107* CFU/g

4.5x107* CFU/g

อยส.

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 8 1.2x107* CFU/g

8.9x106* CFU/g


อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 3 2.2x107* CFU/g

9.9x106* CFU/g

ชลบร

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 1.7x107* CFU/g

1.7x107* CFU/g

บรรมย

ปรมาณเช อรา 600 963 (160.5)

8 (0.83)

วตถดบ 7 1.1x105* CFU/g

3.6x105* CFU/g


อาหารโคส าเรจรปชนดผง 1 1.6x105* CFU/g

1.6x105* CFU/g

สมทรสาคร

ไขมน 1,500 1,709 (113.94)

36 (2.11)

วตถดบ 36 0.88%* 17.1%* อยส.

โปรตน 1,500 1,776 (118.4)

12 (0.68)

วตถดบ 12 3.45%* 75.57%* อยส.

ความช น 1,800 1,646 (91.45)

6 (0.37)

วตถดบ 6 11.6%* 15.93%* นครศรธรรมราช

เถา 500 1,594 (318.8)

6 (0.38)

วตถดบ 6 2.64%* 30.49%* อยส.

กาก 1,200 1,601 (133.42)

17 (1.07)

วตถดบ 17 3.74%* 39.56%* อยส.

เกลอ 300 256 (85.34)

46 (17.97)

วตถดบ 46 3.08%* 5.56%* นครศรธรรมราช

Salbutamol 1,000 1612 (161.2)

82 (5.09)

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 67 0.06* µg/kg

694.54* µg/kg

กสก.

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 12 นอยกวา 0.05* µg/kg

119.24* µg/kg

ราชบร

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 1 0.94(a)* µg/kg

0.94(a)* µg/kg


วตถดบ 1 0.10* µg/kg

0.10* µg/kg

ปศข.6

สารผสมลวงหนา 1 11.88* µg/kg

11.88* µg/kg

อยส.


รายงานแจงเตอนผลทดสอบตวอยางอาหารสตวทไมผานเกณฑ EUROPEAN UNION (EU) ปงบประมาณ 2553 รายการผลทดสอบ จ านวน



พรบ.



<170.42%> 379**

<17.88%> -อาหารเมดโค 53 5.07 154.92 นครปฐม,

ลพบร,สระบร -อาหารผงโค 208 -อาหารส าเรจรปไก 10 -อาหารส าเรจรปโค 90 -วตถดบ 10 -อาหารเมดไก 4 -อาหารผงสกร 4 -อาหารส าเรจรป 1

Arsenic 751 751 <100%>

41** <5.46%>

-วตถดบ 9 7.882 12.59 สพส. -อาหารส าเรจรป 2 12.075 12.26 -อาหารส าเรจรปไก 1 2.46 2.46 -อาหารเสรม 21 2.699 14.1 -อาหารเมดไก 3 2.066 2.277 -อาหารส าเรจรปสกร 2

Cadmium 751 751 <100%>

34** <4.53%>

-อาหารเสรม 13 5.04 24.97 ระยอง -วตถดบ 8 2.03 3.81 - อน ๆ 5 19.79 41.08 -อาหารส าเรจรป 4 0.62 2.02 -อาหารเมดสกร 4 0.72 1.4

Lead 969 969 <100%>

18** <1.86%>

-อาหารส าเรจรปสกร 5 5.77 1,566.50 เชยงใหม -อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 5 5.06 22.49 -อาหารส าเรจรปไก 1 7.08 818.8 -วตถดบ 1 35.66 35.66 -อาหารโคส าเรจรปชนดผง 2 9.13 10.9 -อาหารส าเรจรป 3 1,566.50 1,566.50

Zearalenone 600 1,000 <166.66>

27** <2.70>

-หวอาหารสตว 5 0.11 0.59 สมทรปราการ -อาหารส าเรจรปสกร 11 -อาหารเมดสกร 9 -อาหารส าเรจรปชนดเมด 2

Deoxynivalinol 300 1,334 <444.67%>

3** <0.22>

-อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 925.7 984.1 สพส.


รายงานแจงเตอนผลทดสอบตวอยางอาหารสตวทไมผานเกณฑ EUROPEAN UNION (EU ปงบประมาณ 2554 รายการผลทดสอบ จ านวน



พรบ.


เกณฑ Aflatoxin (B1) 1,000 726

<72.6%> 23**

<3.16%> อาหารเมดโค 5 5.12 13.94 ลพบร, นคร

ราชศรมา อาหารผงโค 4 5.03 34.88 อาหารส าเรจรปโค 6 7.05 16.04 วตถดบ (ขาวโพดปน) 4 25.31 113.16 อน ๆ 4 5.2 61.9

Cadmium 500 307 <61.40%>

22 ** <7.16%>

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 2.64 2.6 สมทรสงคราม อาหารผงสกร 1 0.86 0.86 อาหารเมดโค 2 1.06 1.41 อาหารส าเรจรปสกร 4 0.62 2.02 อาหารเมดสกร 4 0.72 1.4

Lead 500 315 <63%>

16** <5.07%>

อาหารส าเรจรปสกร 5 45.08 197.70 ปทมธาน อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 4 7.03 16.49 อาหารส าเรจรปสกร 7 4.22 3.02 วตถดบ (ปลาปน) 5 2.29 4.42 อน ๆ 1 0.82 0.82

Zearalenone 600 1,000 <166.66%>

30** <3%>

อาหารผงสกร 3 0.27 0.45 นครปฐม อาหารส าเรจรปโค 4 0.56 0.84 อาหารเมดโค 5 0.58 0.87 อาหารส าเรจรปชนดเมด 12 0.14 0.56 อาหารส าเรจรปสกร 6 0.14 0.43

Deoxynivalinol 600 624 <104.00%>

1** <0.16%>

อาหารส าเรจรปสกรชนดเมด 1 915.00 915.00 พษณโลก





พรบ.



(95.83%) 139**

(12.09%) อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 35 10.35ppb 10.35ppb พระนครศรอยธ

ยา, ชลบร, สระบร, สระแกว,

ระยอง, ลพบร, สพรรณบร,

ราชบร, ปทมธาน, อางทอง,

สมทรสาคร, ขอนแกน,

นครราชสมา, ศรษะเกษ,

สมทรปราการ, ฉะเชงเทรา,

อดรธาน

อาหารส าเรจรปโค 6 5.12ppb 24.11ppb ขาวโพดปน 12 20.74ppb 174.12pp

b อาหารส าเรจรปสกร 2 22.23ppb 30.41ppb อาหารส าเรจรปไก 9 21.28ppb 286.33pp

b อาหารส าเรจรปเปด 1 84.00ppb 84.00ppb อาหารโคส าเรจรปชนดเมด 7 13.07ppb 113.07pp

b อาหารโคส าเรจรปชนดผง 43 5.22ppb 113.40pp

b อาหารไกส าเรจรปชนดผง 6 27.83ppb 73.95ppb อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 15.68ppb 24.65ppb อาหารส าเรจรป 2 26.60ppb 28.22ppb อน ๆ 13 10.41ppb 51.90ppb

Aflatoxin (M1) 250 278 (111.20%)

56** (20.14%)

น านมโครายฟารม 42 0.051ppb 2.230ppb สระบร, ลพบร, นครราชสมา น านมโครวมฟารม 11 0.058ppb 0.490ppb

น านมโครวมสหกรณ 1 0.059ppb 0.059ppb น านม 2 0.51ppb 1.01ppb

Cadmium 500 590 (118.00%)

47 ** (7.97%)

ปลาปน 7 2.06 mg/kg

4.00 mg/kg

ปทมธาน, สงขลา, ตรง,

สมทรสงคราม, สมทรสาคร,

ปตตาน, ระนอง,

ชยนาท, ลพบร, สระบร

อาหารส าเรจรปสกร 10 1.34 mg/kg

97.30 mg/kg

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 30 3.42 mg/kg

22.15 mg/kg

Lead 500 489 (97.80%)

10** (2.04%)


33.84 mg/kg

ปทมธาน, มหาสารคราม, สงขลา, ปตตาน,

สมทรสงคราม

ปลาปน 2 17.40mg/kg

17.64mg/kg

Zearalenone 600 544 (90.67%)

9** (1.65%)

อาหารโคส าเรจรปชนดเมด 1 780.00ppb

780.00ppb

ฉะเชงเทรา, ลพบร, ราชบร,

สพรรณบร, เพชรบร, ปทมธาน, ศรษะเกษ

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 8 130.00ppb

130.00ppb





พรบ.


เกณฑ Aflatoxin B1 1,000 1,403

<140.30%> 75**

<5.34%> อาหารเมดโค 30 5.07

ppb 29.78 ppb

สระบร, สพส., ลพบร,

นครราชสมา, สระแกว, ชยนาท

, กรงเทพมหานคร

, นนทบร, เชยงราย,

ฉะเชงเทรา, ชลบร,

สพรรณบร, พษณโลก, นครปฐม, สงหบร,

พระนครศรอยธยา,บรรมย

อาหารผงโค 11 5.37 ppb

49.56 ppb

อาหารส าเรจรปโค 5 8.52 ppb

10.67 ppb

อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 12 10.18 ppb

65.56 ppb

อาหารส าเรจรปไก 5 20.30 ppb

49.97 ppb


146.05 ppb

วตถดบ (ร าสกดน ามน) 1 20.28 ppb

20.28 ppb

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 11.62 ppb

11.62 ppb

อาหารสนขชนดเมด 3 13.62 ppb

20.23 ppb

อาหารแมวชนดเมด 1 17.96 ppb

17.96 ppb

อาหารแพะส าเรจรป 2 8.22 ppb

8.48 ppb

Zearalenone 600 1,015 <169.16%>

4** <0.39%>

อาหารส าเรจรปสกร 1 140.00 ppb

140.00 ppb

สมทรปราการ, ปศสตวเขต 7, บรรมย, ล าพน อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 210.00

ppb 210.00 ppb

Cadmium 500 600 <120.00%>

10** <1.66%>

วตถดบ (ปลาปน) 6 2.11 ppb

3.13 ppb สมทรสงคราม, พงงา, ตรง, สพส.


8.91 ppb

Lead 500 431 <86.20%>

5** <1.16%>


47.35 mg/kg

นครราชสมา, สมทรสงคราม

พรมกซ 1 85.31 mg/kg

85.31 mg/kg

Arsenic 751 63 <8.38%>

1** <17.46%

>

ไดแคลเซยม 1 15.23 mg/kg

15.23 mg/kg






พรบ.



<140.30%> 75**

<5.34%> อาหารเมดโค 30 5.07

ppb 29.78 ppb

สระบร, สพส., ลพบร,

นครราชสมา, สระแกว, ชยนาท

, กรงเทพมหานคร

, นนทบร, เชยงราย,

ฉะเชงเทรา, ชลบร,

สพรรณบร, พษณโลก, นครปฐม, สงหบร,

พระนครศรอยธยา,บรรมย

อาหารผงโค 11 5.37 ppb

49.56 ppb

อาหารส าเรจรปโค 5 8.52 ppb

10.67 ppb

อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 12 10.18 ppb

65.56 ppb

อาหารส าเรจรปไก 5 20.30 ppb

49.97 ppb


146.05 ppb

วตถดบ (ร าสกดน ามน) 1 20.28 ppb

20.28 ppb

อาหารสกรส าเรจรปชนดผง 1 11.62 ppb

11.62 ppb

อาหารสนขชนดเมด 3 13.62 ppb

20.23 ppb

อาหารแมวชนดเมด 1 17.96 ppb

17.96 ppb

อาหารแพะส าเรจรป 2 8.22 ppb

8.48 ppb

Zearalenone 600 1,015 <169.16%>

4** <0.39%>


140.00 ppb

สมทรปราการ, ปศสตวเขต 7, บรรมย, ล าพน อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 210.00

ppb 210.00 ppb

Cadmium 500 600 <120.00%>

10** <1.66%>

วตถดบ (ปลาปน) 6 2.11 ppb

3.13 ppb สมทรสงคราม, พงงา, ตรง,

สพส. อาหารส าเรจรปสกร 4 0.52

ppb 8.91 ppb

Lead 500 431 <86.20%>

5** <1.16%>


47.35 mg/kg

นครราชสมา, สมทรสงคราม

พรมกซ 1 85.31 mg/kg

85.31 mg/kg

Arsenic 751 63 <8.38%>

1** <17.46%

>

ไดแคลเซยม 1 15.23 mg/kg

15.23 mg/kg






พรบ.



(168.10%) 40**

(2.38%) กากเมลดมะมวงหมพานต 4 22.72

µg/kg 49.68 µg/kg

ดานกกสตวกรงเทพฯทางน า, ปศข.7, อดรธาน,

สพรรณบร, ชลบร,

พระนครศรอยธยา, สระบร, กาญจนบร, เพชรบร,

สมทรปราการ, ลพบร, อธบดกรมปศสตวจากประเทศภฎาน,

สถานวจยทดสอบพนธสตว

ปากชอง, นครราชสมา

อาหารส าเรจรปโค 10 5.43 µg/kg 46.67 µg/kg

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 6 5.45 µg/kg 12.89 µg/kg

อาหารโคส าเรจรปชนดเมด 1 39.61 µg/kg

39.61 µg/kg

อาหารส าเรจรปไก 5 10.81 µg/kg

130.00 µg/kg

อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 6 10.18 µg/kg

123.20 µg/kg

อาหารนกส าเรจรปชนดเมด 1 28.53 µg/kg

28.53 µg/kg

ขาวโพดปน 7 30.80 µg/kg

476.40 µg/kg

Zearalenone 600 860 (143.33%)

8** (0.93%)


390.00 µg/kg

สพรรณบร, นครปฐม,

สมทรสาคร Cadmium 500 546

(109.20%) 5**

(0.92%) อาหารสตวส าเรจรปส าหรบสตว

3 1.02 mg/kg

1.37 mg/kg นครปฐม, สงขลา, สมทรปราการ


0.67 mg/kg


2.38 mg/kg

Lead 300 301 (103.33%)

2** (0.66%)

อาหารส าเรจรปส าหรบสตว 1 31.50 mg/kg

31.50 mg/kg

สมทรสงคราม, สมทรปราการ


17.60 mg/kg





พรบ.



(105.6) 85

(5.37) อาหารโคส าเรจรปชนดเมด 55 5.02**

ppb 31.98**

ppb สระบร

อาหารโคส าเรจรปชนดผง 17 5.11** ppb

38.16** ppb

ลพบร

วตถดบ 10 16.24** ppb

303.7** ppb

อยส.

อาหารไกส าเรจรปชนดเมด 2 20.93** ppb

62.35** ppb


อาหารไกส าเรจรปชนดผง 1 25.51** ppb

25.51** ppb

หนองคาย

Aflatoxin M1 180 219 (121.67)

13 (5.94)

น านมดบ 13 0.05** ppb

0.217** ppb


Zearalenone 600 655 (109.17)

4 (0.61)

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 4 140** ppm

470** ppm

สพรรณบร

Cadmium 500 350 (70)

40 (11.43)

อาหารเสรม 30 1.01** mg/kg

37.99** mg/kg

ดานฯลาดกระบง

วตถดบ 7 17.54** mg/kg

54.48** mg/kg

ดานฯลาดกระบง

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 3 0.52** mg/kg

0.62** mg/kg

สวนสงแวดลอม กรมปศสตว

Lead 300 261 (87)

2 (0.77)

อาหารสกรส าเรจรปชนดเมด 2 5.38** mg/kg

11.38** mg/kg

สวนสงแวดลอม กรมปศสตว

หมายเหต : อยส คอ กองควบคมอาหารและยาสตว สพส คอ ส านกพฒนาระบบและรบรองมาตรฐานสนคาปศสตว กสก คอ กองสารวตรและกกกนสตว ปศข. คอ ปศสตวเขต * คอ ไมผานเกณฑมาตรฐาน พระราชบญญตควบคมคณภาพอาหารสตว พ.ศ.2525 ** คอ ไมผานเกณฑมาตรฐาน EU


รายงานผลการตรวจสอบคณภาพอาหารสตวดานความปลอดภยในปงบประมาณ พ.ศ. 2551 – 2559 กลมตรวจสอบคณภาพอาหารสตว รายการวเคราะห 2551 2552 2553 2554 2555 2556 2557 2558 2559

1. Nitrofurans (ปรมาณ) 1,029/41(3.98) 656/37(5.64) 1,071/30(2.80) - 179/6(3.35) - - - - Nitrofurazone (ปรมาณ) 1,029/0(0) 626/0(0) 1,071/0(0) 934/0 179/0 1,090/0 397/0 174/0 228/0 Nitrofurans (ชนด ) 11,670/11(0.09) 10,965/14(0.13) 19,830/0 18,055/23(0.13) 20,065/15(0.07) 14,915/0 8,565/0 4,840/0 8,825/0 Nitrofurazone (ชนด ) 2,334/0(0) 2,193/0(0) 3,966/0 3,611/0 4013/0 2,983/0 1,713/0 968/0 1,765/0 Nitrofurantoin (ปรมาณ ) 1,029/0(0) 650/0(0) 1,071/0 - 179 1,090/0 397/0 174/0 228/0 Furazolidone (ปรมาณ ) 1,029/41(3.98) 650/37(5.64) 1,071/22(2.54) 937/1/(1.92) 179/6(3.35) 1,090/9(0.83) 397/0(2.01) 174/0 228/0 Nitrofurantoin (ชนด) 2,334/0(0) 2,193/0(0) 3,966/0(0) 3,611/0 4013/0 2,983/0 1,713/0 968/0 1,765/0 Furazolidone ( ชนด ) 2,334/11(0.47) 2,193/14(0.64) 3,966/0(0) 3,611/23(0.63) 4,013/15(0.37) 2,983/0 1,713/0 968/0 1,765/0 Furaltadone (ปรมาณ) 1,029/0(0) 650/0(0) 1,071/22(2.54) 934/0 179 1,090/0 397/0 174/0 228/0 Nitrovin (ปรมาณ) - - - - - - - - - Furaltadone (ชนด) 2,334/0(0) 2,193/0(0) 3,966/0 6611/0 4013/0 2,983/0 1,713/0 - 1,765/0 Nitrovin (ชนด) 2,334/0(0) 2,193/0(0) 3,966/0 6,611/0 4013/0 2,983/0 1,713/0 - 1,765/0

2. Tetracycline (ปรมาณ) 804/241(29.98) - - - 8,026/245(3.05) - - - - Chlortetracycline (ปรมาณ) 1,009/336(33.30) 570/187(32.80) 3,966/0 770/351(45.58) 125/188(70.4) 424/80(18.87) 454/34(7.49) 176/26(17.35) 257/41(15.95) Tetracycline (ชนด) 4,668/202(4.33) 4,386/134(3.05) 7,932/78(1.05) 7,22/305(4.26) 4,013/240(5.98) 5,966/48(1.60) 3,426/10(0.58) 1,936/12(0.61) 3,530/10(0.33) Chlortetracycline (ชนด) 2,334/197(8.44) 2,193/132(6.01) 3,966/75(0.95) 3,611/289(8.00) 1,324/74(5.58) 5,966/52(0.87) 1,713/8(0.46) 968/11(1.13) 1,765/10(0.55) Oxytetracycline (ชนด) 2,334/5(0.21) 2,193/2(0.09) 3,966/3(0.07) 3,611/16(0.44) 4,013/5(0.12) 2,983/44(1.47) 1,713/8(0.11) 968/1(0.10) 1,765/0 Oxytetracycline (ปรมาณ) 1,009/2(0.19) 507/5(0.87) 750/14(1.87) 770/23(2.98) 125/10(8.0) 2,983/8(0.26) 454/8(1.76) 179/12(6.82) 257/3(1.17)

3. Nitroimdazoles 628/49(7.80) 704/52(7.38) 572/14 - 221 - - - - Dimetridazone 628/49(7.80) 704/52(7.38) 572/21(3.67) 725/14(1.93) 221 976/9(0.92) 313/0 140/0 192/8(4.7) Ronidazone 628/0(0) 704/0(0) 576/0 725/0 221 976/0 313/0 140/0 192/0 Metronidazone 628/0(0) 704/0(0) 576/0 725/0 221 976/0 313/0 140/0 192/0

4. Sulphonamides 104/0(0) 104/0(0) 111/1(0.09) - 2 - - - - Sulfamethazine 0 104/2(1.92) 111/1(0.09) 106/1(0.94) 2 211/1(0.47) 238/0 40/0 121/0

5. Chloramphenicol 666/0(0) 403/0(0) 666/1(0.15) - 327 547/0 459/0 236/0 243/0



6. Nicabazin - - - 9/4(44.44) 54/12(22.22) 164/23(14.02) 133/27(20.3) 25/3(12.0) 46/23(50.0) Salinomycin - - - - - - 133/2 25/0 46/23(50.0) Narasin - - - - - - - - 46/3(6.52) Monensin - - - - - - - - 46/1 Lasalocid - - - - - - - - 46/0

7. Olaquindox 563/1(0.17) 515/3(0.58) 452/1(0.22) 624/0 155/4(2.58) 806/2(0.25) 181/0 151/0 82/0 8. Tylosin 72/9(2.50) 48/1(2.08) - 45/2(4.44) - 80/3(3.75) 45/1(9.75) 2/2(100) 52/7 9. Spiramycin - - - - - - - - -

Carbadox (ปรมาณ) 614/4(0.65) 511/11(2.15) 563/9 714/11(1.54) 110/2(1.81) 866/6(0.69) 213/1(0.47) 105/0 90/0 Carbadox (ชนด) 676/1(0.15) 524/0(0) - 1,454/7(0.48) 1390/1(0.07) 38/1(2.63) - - -

10. การปลอมปนของเน อและกระดกปน

149/6(4.03) 132/0(0) 424/5(1.17) 135 455/4(0.87) 575/1(0.17) 258/1(0.38) 278/0 526/0

11. การปลอมปนในวตถดบอาหารสตว

593/16(2.70) 281/(0.71) 687 - 419/2(0.47) 839/49(5.84) 313/5(1.59) 61/1(1.63) 282/5(1.77)

12. Diethystilbestrol 100/0(0) 110/0(0) - 99/0 54 48/0 99/0 9/0 100/0 13. Organochlorine pcsticides (ppb0)

56/0(0) 52/0(0) - - 51 62/0 60/0 48/0 118/0

14. Other 4,668/10(0.21) - - - 8026/0 5966/0 3,426/0 1,936/0 Roxarzone 2,334/10(0.42) 2,193/3(0.14) 3,966 - 4013/0 2983/0 1,713/0 968/0 Zoalene 2,334/0(0) 2,193/0(0) 3,966 - 4013/0 2983/0 1,713/0 968/0

15. Adulteration 2,116/106(5.01) - - - - - - -

16. Beta - agonists 1,59/16(1.10) 936/6(0.64) 1,301/60 2,444/72(2.94) 452/11(2.43) - - - Salbutamol 1,984/38(1.91) 1,627/25(1.53) 1,301/43 2,444/72(2.25) 452/11(2.43) 1,104/174(15.76) 1,719/12(0.69) 567/20(3.53) 1,638/84(5.13) Ractopamin 1,883/17(0.90) 1,627/15(0.92) 1,301/21 2,444/21(0.85) 452 1,104/0 1,719/0 567/0 1,638/18(1.10) Clenbuterol 1,984/0(1.90) 1,627/15(0.92) 1,301/0 2,444/0 452 1,104/2 1,719/1(0.05) 567/0 1,638/6(0.37)

17. Polychlorinated biphenyls 56/0(0) 52/0(0) - - - - - - - 18. Beta - lactam - - - - - - - - -

penicillin G - - - - - - - - - 19. Roxaxon 61/0(0) 960/0(0) 105/0 - - - - - -



20. Avilamysin - - - - - - - - - 21. Fluoroquinolone 15/0(0) - - - 67 - - - -

Enoxacin - - - - 67 74/0 73/0 24/0 90/0 Ciprofloxacin - - - 1/1(100) 74/0 73/0 24/0 90/0

22. Melamine group 604/0(0) 693/0(0) - - 77 184/0 - - - Melamine - - 993/3(0.30) 557/0 77 - 205/0 - 14/0 Melamine - - 993/2(0.20) 557/0 - - - - -

23. Cyanuric - - 65/0(0) 557/0 - - - - - 24. Dioxin - - - - - - - - 183/0 25. PCB - - - - - - - - 129/0 26. OCP - - - - - - - - 129/0 27. Aflatoxin ( total) 126/112/0(0) 88/74/0(0) 697/40(5.6) 366/342/2(93.44) 218/73/3(33.48) 701/312/0(43.68) 464/375/0(80.81) 101/56/0(55.44) 174/87/0(49.99)

Aflatoxin (B1) - 857/341/53 (6.18)

2,465/1,158 (46.32)

605/233/49 (38.51)

520/189/65 (36.34)

1,788/692/104 (38.70)

1,1818/224/45 (18.96)

1,075/354 (32.93)

660/182/47 (27.75)

Aflatoxin (M1) 144/3/0(0) 10/6/0(0) 355/186(52.08) 137/55/23(40.14) 82/31/19(37.80) 359/64/26(17.82) 190/12/5(6.31) 212/13/0(6.13) 86/48/9(55.8) Ochratoxin (A) 189/27/0(0) 325/59/0(0) 1,212/1,134(90.72) 422/12/1(2.80) 223/96/0(43.05) 998/642/0(64.2) 616/56/0(9.09) 503/57/0(11.33) 370/21/0(5.68) Fumonisin 6/2/0(0) 374/366/0(0) 826/55(6.6) 483/460/0(95.20) 92/70/0(76.09) 712/422/0(59.08) 432/404/0(93.51) 180/166/0(92.22) 384/345/0(89.84) Zearalenone 110/108/0(0) 341/341/0(0) 1,149/2(0.18) 472/260/0(55.10) 237/76/0(32.07) 943/407/0(44.77) 693/255/0(36.75) 248/47/0(18.95) 293/123/0(41.97) DON 152/38/0(0) 186/171/0(0) 1,588/158(9.48) 536/237/0(44.20) 536/237/0(44.20) 1,302/578/0(46.24) 947/907/0(95.77) 539/539/0(100) 283/187/0(60.07) T2-toxin 95/87/0(0) 380/350/0(0) 921/91(0) 288/138/0(47.90) 288/138/0(47.90) 770/311/0(40.43) 359/148/0(41.22) 12/12/0(100) 309/109/0(35.27)

28. Salmonella spp. 1,396/38(2.72) 601/14(2.33) 2,594/54(2.08) 2,008/47(2.34) 639/10 2304/68 1,906/45(2.36) 1,430/63(4.40) 1,841/38(2.07) 29. Totoal Count Bacteria 377/1(0.27) 228/4(1.75) 1,216/3(0.25) 1,120/9(0.80) 186/10 1082/12 446/4(0.90) 260/14(0.38) 969/29(3.00) 30. Fungi 348/4(1.15) 265/3(1.13) 1,271/4(1.10) 1,126/10(0.89) 206/0 1165/3 570/3(0.52) 249/1(0.40) 983/10(1.02) 31. การปนเปอนเน อและ กระดกปนโค (Real time PCR )

156/12(7.69) 289/0(0) 30/0(0) - 20/12 52/40 186/33 150/150 62/0

32. Lead - - 397/4(1.01) 298/16(5.40) 600/10(1.67) 431/5(1.16) 304/148(48.68) 275/67(24.36) 206/105(60.97) 33. Cadmium 18/9(50.00) 11/0(0) 396/10(2.52) 540/20(3.70) 601/47(7.82) 600/12(2.00) 274/132(48.18) 434/127(29.26) 293/183(62.46)

หมายเหต : จ านวนตวอยางทตรวจ / จ านวนทพบ (รอยละ)


ภาคผนวก ค ตวอยาง การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES

การทดสอบหาปรมาณแคดเมยมดวยเครอง ICP-OES ทความยาวคลน () ของแคดเมยม 228.802 นาโนเมตร ตามวธของ AOAC (2012) มความเหมาะสมส าหรบตวอยางอาหารสตว เนองจากผานเกณฑการยอมรบจากการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ ดงน

Parameters Criteria for acceptance

Sample Swine feed Poultry feed Bovine feed Soy bean meal Corn meal Rice bran Fish meal

Standard - Linearity 0.990 1 1 1 1 1 1 1 - Accuracy (%) 80-110% 87.98-98.52 87.98-98.52 87.98-98.52 87.98-98.52 87.98-98.52 87.98-98.52 87.98-98.52 - Precision (%) ≤2 0.01-0.17 0.01-0.17 0.01-0.17 0.01-0.17 0.01-0.17 0.01-0.17 0.01-0.17 Ranges - LOD (mg/kg) - 0.08 0.06 0.08 0.06 0.07 0.09 0.06 - LOQ (mg/kg) - 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 - Accuracy (%Recovery)

80-110 83.72-103.50 85.00-107.40 80.50-106.00 85.51-107.50 81.02-107.00 81.90-107.00 84.15-104.50

- Precision (%RSD) 0.20 mg/kg 1.00 mg/kg 5.00 mg/kg 10.00 mg/kg 50.00 mg/kg

13.45 10.56 8.29 7.46 5.86

5.496 0.025 0.030 0.031

-

7.870 6.649 4.036 3.811

-

9.254 4.023 5.404 3.775

-

4.027 5.261 5.932 5.929

-

4.934 4.872 5.352 5.135

-

4.276 7.031 4.742 4.996

-

6.616 3.553

- 3.383 1.144

Matrix effect - t-test (95%) 12.71 -4.33 -0.43 -0.66 -8.00 -0.93 -1.21 -0.82


X

1. วตถประสงค เพอตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 2. ขอบขาย

ตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 3. เอกสารทเกยวของ 3.1 การทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 3.2 การใชเครองทดสอบแรธาต (ICP-OES) 4. นยาม

4.1 ความสมพนธเชงเสน (Linearity) หมายถง ความสามารถของวธทดสอบทใหคาสญญาณของเครองมอวดทแปรสดสวนโดยตรงกบความเขมขนของสารทตองการทดสอบ 4.2 Limit of detection (LOD) หมายถงปรมาณต าสดทเครองสามารถตรวจพบได โดยทวไปจะเปนระดบความเขมขนของสารทใหสญญาณเปน 3 เทาของสวนเบยงเบนมาตรฐานของ Blank เหนอคาเฉลยสญญาณของ Blank 4.3 Limit of quantitation (LOQ) หมายถงปรมาณต าสดทเครองสามารถตรวจพบโดยมความแมนและความเทยงสามารถรายงานคาได โดยทวไปจะเปนระดบความเขมขนของสารทใหสญญาณเปน 10 เทาของสวนเบยงเบนมาตรฐานของ Blank เหนอคาเฉลยสญญาณของ Blank

4.4 ความแมน (Accuracy) หมายถงความถกตองของวธทดสอบทไดคาใกลเคยงกบคาทแทจรง 4.5 ความเทยง (Precision) หมายถงความแมนย าของวธทดสอบซ ากนหลายๆ ครง ซงการวดทไดคาใกลเคยงกนไมไดหมายความวาคาทวดไดจะเปนคาทถกตองเสมอไป 4.6 Range หมายถงชวงการใชงานทครอบคลมระดบความเขมขนของสารทตองการศกษา (Lower levels และ Upper levels) โดยสามารถแสดงระดบของความเทยง ความแมนและความสมพนธเชงเสนตามทก าหนดไวในวธทดสอบ 4.7 Recovery หมายถงการคนกลบได โดยการเตมความเขมขนนอยๆ ของสารมาตรฐานทรคาแนนอนลงไปในตวอยางเพอดคาคนกลบของสารมาตรฐานนนๆ 4.8 Repeatability หมายถงการทดสอบซ าๆ ภายใตสภาวะคงท ซงการทดสอบจะตองท าโดยหองปฏบตการเดยวกน ตวอยางเดยวกน ภาวะแวดลอมเดยวกน ผทดสอบคนเดยวกนและภายใตเวลาใกลเคยงกน

4.9 Reproducibility หมายถงการทดสอบซ า ซงอาจมความแตกตางกนดงน - Intra-lab หมายถงการทดสอบซ าโดยอาจจะขยายเวลาในการทดสอบมากขน มการเปลยนแปลงเจาหนาท ทดสอบ เปลยนเครองมอ วนทท าการทดสอบตางกน แตหองปฏบตการทใชทดสอบเปนหองปฏบตการเดยวกน - Inter-lab หมายถงการทดสอบซ าโดยดคาความแปรปรวนทมผลตอความแมนย าของวธเมอมการเปลยนผทดสอบ เปลยนเครองมอ แตไมไดท าการทดสอบโดยหองปฏบตการเดยวกน 4.10 คาเฉลย (Average, Mean ; ) หมายถงการหารผลรวมของขอมลทงหมดดวยจ านวนขอมลทงหมด คาเฉลยเลขคณตเปนคากลางหรอเปนตวแทนของขอมลทดทสด เนองจากเปนคาทไมเอนเอยง เปนคาทมความคงเสนคงวา เปนคาทมความแปรปรวนต าทสด และเปนคาทมประสทธภาพสงสด แตคาเฉลยเลขคณตกมขอจ ากดในการใช เชน ถาขอมลมการกระจายมาก หรอขอมลบางตวมคามากหรอนอย


จนผดปกต หรอขอมลมการเพมขนเปนเทาตว คาเฉลยเลขคณตจะไมสามารถเปนคากลางหรอเปนตวแทนทดของขอมลได 4.11 สวนเบยงเบนมาตรฐาน (Standard Deviations ; SD) หมายถงการวดคาการกระจายทางสถต เพราะเปนคาทใชบอกถงการกระจายของขอมลไดดกวาคาพสย และคาสวนเบยงเบนเฉลย เม อน าคาสวนเบยงเบนมาตรฐานมายกก าลงสองจะเรยกวา คาความแปรปรวน

5. หลกการ การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ (Method Validation) เปนกระบวนการยนยนความใชไดของวธทดสอบทหองปฏบตการอาจก าหนดขนมา โดยการตรวจสอบและจดท าหลกฐาน ทเปนรปธรรมเพอแสดงวาขอก าหนดพเศษตางๆ ส าหรบการใชตามทตงใจไวโดยเฉพาะ สามารถบรรลผลไดครบถวนและเปนไปตามขอก าหนด การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบจงมความส าคญส าหรบผปฏบตงานในหองปฏบตการ

5.1 หลกการและความจ าเปนของการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ 5.1.1 ความจ าเปนตองมการตรวจสอบความใชไดของวธ - วธทดสอบทใช ไมเปนวธมาตรฐาน ไมมการยอมรบในระดบนานาชา ต หองปฏบตการจ าเปนตองท าการตรวจสอบความใชไดของวธ เพอใหแนใจวาวธทดสอบสามารถใหผลทถกตองแมนย าตรงตามวตถประสงคการใชงาน

- เปนวธทดสอบทหองปฏบตการพฒนาหรอออกแบบขนเอง โดยหองปฏบตการไมอางองตามวธทเปนวธมาตรฐานซงเปนทยอมรบในระดบนานาชาต

- เปนวธมาตรฐานทใชนอกขอบขายทก าหนด - มการขยายและดดแปลงวธมาตรฐาน เชน หองปฏบตการอาจอางองตามวธมาตรฐานแตอาจมบางขนตอนในวธทดสอบทไมปฏบตตามวธมาตรฐานทกประการ ซงวธทดสอบนจะตองมการตรวจสอบความใชไดของวธกอนน ามาใชงานเพอใหแนใจวาหากมการเปลยนแปลงวธทดสอบจากว ธมาตรฐานไปบางสวนผลการทดสอบทไดจะยงคงความนาเชอถอ 5.1.2 หลกการส าหรบท าการตรวจสอบความใชไดของวธ - ครอบคลมการประยกตของชวงทใชงาน - มบนทกวธการและผลทไดจากการตรวจสอบความใชไดของวธ

- มขอสรปบงชวาวธนนเหมาะสมกบวตถประสงคการใชงาน 5.2 ประเภทของวธทดสอบ 5.2.1 แบงตามความสมบรณของการตรวจสอบความใชไดของวธ - ว ธ ท ผ านการตรวจสอบโดยการศ กษาจากหลายๆ ห องปฏบ ต ก า ร (Collaboratory study) ซงอาจเปนวธการทดสอบทเปนไปตามกระบวนการทแตละหนวยงานก าหนด แตการทดสอบนนๆ เปนวธทนานาชาตยอมรบ - วธทผานการตรวจสอบโดยหองปฏบตการตงแต 2 แหงขนไป อาจท าโดยใหหองปฏบตการตงแต 2 หองปฏบตการท าการทดสอบโดยใชวธการทดสอบสอบเดยวกน แตวธดงกลาวนยงไมสมบรณเหมอนกบวธการท า Collaboratory study เนองจากยงไมเปนวธทไดรบการยอมรบในระดบนานาชาต


- วธทผานการตรวจสอบโดยหองปฏบตการเดยว เชน การตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบในแตละหองปฏบตการวาวธทดสอบทใชมความนาเชอถอ แมไมสามารถยอมรบไดในระดบนานาชาต - วธทผานคณลกษณะบางรายการ เชน มการตรวจสอบความใชไดของวธแตไมไดท าการตรวจสอบความใชไดของวธในทกตวแปรทจ าเปนตองตรวจสอบความใชไดของวธ - วธทไมมขอมลการตรวจสอบ เปนวธทไมไดท าการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบ 5.2.2 แบงตามลกษณะของวธ - Empirical method หมายถงวธทดสอบขนกบวธทก าหนดไว มกเปนวธทก าหนดขนเพอใหผทเกยวของใชตาม การใชวธนจะตองสอบกลบไปถง Method นนได - Non empirical method หมายถงวธทผลการทดสอบไมขนอยกบวธ การใชวธทแตกตางกน (แตผานการตรวจสอบความใชไดของวธแลว) จะใหผลทไมแตกตางกน ผลการทดสอบของวธเหลานจะสอบกลบไปท SI unit หรอโดยผาน CRM 5.2.3 แบงตามระดบความเขมขนของสารทตองการศกษา - วธทดสอบส าหรบสารทมความเขมขนระดบต าๆ เชน การทดสอบการปนเปอน สารตกคาง เปนตน - วธทดสอบส าหรบสารทมความเขมขนสงๆ เชน การทดสอบสารประกอบหลกในผลตภณฑ เปนตน 6. ความปลอดภย เตรยมตวอยางใน Hood สวมแวนตา ถงมอและหนากากกนกรด 7. อปกรณและเครองมอ 7.1 เครองชงไฟฟา ชงไดละเอยด 0.0001 g 7.2 แทนความรอน (Hot plate) 7.3 กระดาษกรองเบอร 5 7.4 Erlenmeyer flask ขนาด 50 ml 7.5 Volumetric flask class A ขนาด 50 ml และ 100 ml 7.6 Volumetric pipette Class A ขนาด 1, 2, 5, และ 10 ml 7.7 Beaker 7.8 กระบอกตวง 7.9 Dropper 7.10 แทงแกวคนสาร 7.11 หลอดใสตวอยาง (Tube) พรอมฝาปด 7.12 เครอง ICP-OES (Inductively Coupled Plasma – Optical Emission Spectrometer) 8. สารเคมและ/หรออาหารเลยงเชอ 8.1 กรดไนตรกความเขมขนไมนอยกวา 65% 8.2 กรดไนตรก 1% (v/v) ตวงกรดไนตรกความเขมขนไมนอยกวา 65% จ านวน 10 ml แลวเทลงในภาชนะทมน าขจดไอออนจ านวน 990 ml ผสมใหเขากน


8.3 กรดเปอรคลอรกความเขมขนไมนอยกวา 65% 8.4 น าขจดไอออนความตานทานไมนอยกวา 18 เมกะโอหม 9. สารมาตรฐานและการเตรยม 9.1 Stock cadmium standard solution ความเขมขน 1000 mg/L 9.2. การเตรยม Intermediate cadmium standard solution ความเขมขน 10 mg/L ปเปต Stock cadmium standard solution ความเขมขน 1000 mg/L ปรมาตร 1 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml แลวปรบปรมาตรดวยกรดไนตรก 1% 9.3 การเตรยม Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.002, 0.005, 0.01, 0.05, 0.10, 0.50, และ 1.00 mg/L 9.3.1 Working cadmium standard solution ความเขมขน 1.00 mg/L ปเปต Intermediate cadmium standard solution เขมขน 10 mg/L ปรมาตร 10 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1% 9.3.2 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.50 mg/L ปเปต Intermediate cadmium standard solution เขมขน 10 mg/L ปรมาตร 5 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1% 9.3.3 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.10 mg/L ปเปต Intermediate cadmium standard solution เขมขน 10 mg/L ปรมาตร 1 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1% 9.3.4 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.05 mg/L ปเปต Working cadmium standard solution ความเขมขน 1.00 mg/L ปรมาตร 5 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1% 9.3.5 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.01 mg/L ปเปต Working cadmium standard solution ความเขมขน 1.00 mg/L ปรมาตร 1 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1% 9.3.6 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.005 mg/L ปเปต Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.10 mg/L ปรมาตร 5 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1% 9.3.7 Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.002 mg/L ปเปต Working cadmium standard solution ความเขมขน 0.10 mg/L ปรมาตร 2 ml ใสลงใน Volumetric flask ขนาด 100 ml และปรบปรมาตรดวยกรดไนตรกความเขมขน 1%


10. ขนตอนปฏบตงาน ชงตวอยาง 1-2 g ใสลงใน Erlenmeyer flask

เตมกรดไนตรกประมาณ 10 ml

เตมกรดเปอรคลอรกประมาณ 4 ml

น าไปยอยบนแทนความรอน จนหมดควนสแดงและเกดควนสขาว

ถายใส Volumetric flask ขนาด 50 ml ปรบปรมาตรดวยน าขจดไอออน ผสมใหเขากน

กรองดวยกระดาษกรองเบอร 5

ตรวจวดดวยเครอง ICP-OES ทความยาวคลน 228.802 นาโนเมตร

รปท 1 แผนผงขนตอนการทดสอบแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES

10.1 ความเปนเสนตรง (Linearity) 10.1.1 เตรยมสารมาตรฐานแคดเมยม 7 ระดบความเขมขน ไดแก 2,5,10,50,100,500 และ1000 ug/L 10.1.2 ตรวจวดสารละลายมาตรฐานแคดเมยมดวยเครอง ICP-OES ทความยาวคลน 228.802 นาโนเมตร 10.1.3 สรางกราฟสารละลายมาตรฐานแคดเมยมทวดไดเพอหา Linearity 10.1.4 ค านวณผลการทดสอบเพอหาความแมนและความเทยงของสารละลายมาตรฐานแคดเมยม


ตารางท 1 ผลการทดสอบสารมาตรฐานแคดเมยม

Cd (ug/l)

Intensity (cps) Conc. (µg/l) RSD (%)

RSD (Predicated Horwitz;ug/l)

Precision (HORRAT)

Recovery (%)

(1) (2) (3) ( ) (1) (2) (3) ( ) 2 273.1 219.9 184.5 225.8 2.291 1.904 1.711 1.969 0.295 26.90 0.01 98.45 5 583.0 576.1 626.7 595.3 4.319 4.274 4.605 4.399 0.180 23.44 0.01 87.98 10 1375.9 1375.0 1397.2 1382.7 9.507 9.502 9.647 9.552 0.082 21.11 0.00 95.52 50 7375.3 7354.2 7367.5 7365.7 48.77 48.63 48.71 48.70 0.070 16.57 0.00 97.40 100 14874.4 14961.0 14974.7 14936.7 97.84 98.40 98.49 98.24 0.352 14.93 0.02 98.24 500 74843.4 75293.0 75449.6 75195.3 490.3 493.2 494.2 492.6 2.026 11.72 0.17 98.52 1000 150464.5 150629.1 150332.8 150475.5 985.1 986.2 984.2 985.2 1.002 10.56 0.09 98.52

X X


ผลการทดสอบ Linearity ของสารละลายมาตรฐานแคดเมยมพบวา Relative of determination (R2) เทากบ 1 เกณฑการยอมรบคอ >0.99 ความแมนประเมนจาก %Recovery อยในชวง 87.98-98.52% ซงอยในชวงเกณฑการยอมรบคอ 75-120% และความเทยงประเมนจาก HORRAT = RSDr (found,%)/RSDr (calculated,%) อยในชวง 0.00-0.17% ซงเกณฑการยอมรบคอ <8%

10.2 Limit of detection (LOD) และ Limit of quantitation (LOQ) 10.2.1 ชงตวอยาง 0.9 - 2 g ใสลงใน Erlenmeyer flask จ านวน 10 ซ า

10.2.2 เตมกรดไนตรกประมาณ 10 ml 10.2.3 เตมกรดเปอรคลอรกประมาณ 4 ml 10.2.4 น าไปยอยบนแทนความรอนจนหมดควนสแดง แลวเกดควนสขาว 10.2.5 ถายใส Volumetric flask ขนาด 50 ml ปรบปรมาตรดวยน าขจดไอออน

ผสมใหเขากน 10.2.6 กรองดวยกระดาษกรองเบอร 5 10.2.7 ตรวจวดดวยเครอง ICP-OES ทความยาวคลน 228.802 นาโนเมตร

10.2.8 ค านวณหา SD เพอประมาณคา LOD ( +3SD) และประมาณคา LOQ ( +10SD หรอมากกวา LOD หรอมากกวา +10SD แตตองมความแมนและความเทยง)


ตารางท 2 ความเขมขนของแคดเมยมของ Blank sample

Rep. Cd (mg/kg)

Swine Poultry Bovine Soy bean meal Corn meal Rice bran meal Fish meal 1 0.045 0.037 0.063 0.038 0.041 0.071 0.695 2 0.015 0.031 0.054 0.034 0.043 0.073 0.708 3 0.024 0.031 0.054 0.033 0.041 0.063 0.648 4 0.014 0.031 0.053 0.033 0.033 0.066 0.736 5 0.042 0.029 0.047 0.028 0.034 0.065 0.691 6 0.051 0.055 0.064 0.055 0.062 0.089 0.830 7 0.049 0.042 0.054 0.046 0.048 0.075 0.806 8 0.019 0.039 0.044 0.040 0.052 0.068 0.736 9 0.032 0.034 0.040 0.038 0.052 0.071 0.807 10 0.034 0.033 0.038 0.039 0.048 0.069 0.720

mean 0.03 0.04 0.05 0.04 0.04 0.07 0.738 SD 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 0.06

LOD 0.08 0.06 0.08 0.06 0.07 0.09 0.06 LOQ 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20


10.3 การยนยน LOQ ของการทดสอบ 10.3.1 ชงตวอยาง 0.9 - 2 g ใสลงใน Erlenmeyer flask จ านวน 10 ซ า 10.3.2 เตมสารมาตรฐานใหมความเขมขนเทากบ LOQ ทค านวณได

10.3.3 เตมกรดไนตรกประมาณ 10 ml 10.3.4 เตมกรดเปอรคลอรกประมาณ 4 ml 10.3.5 น าไปยอยบนแทนความรอนจนหมดควนสแดง แลวเกดควนสขาว 10.3.6 ถายใส Volumetric flask ขนาด 50 ml ปรบปรมาตรดวยน าขจดไอออน ผสม

ใหเขากน 10.3.7 กรองดวยกระดาษกรองเบอร 5 10.3.8 ตรวจวดดวยเครอง ICP-OES ทความยาวคลน 228.802 นาโนเมตร ใหทดสอบวนละ 1

ซ า จนครบ 10 ซ า 10.3.9 ค านวณหา X SD %RSD และ %Recovery ในกรณท LOQ ทค านวณ

ได %Recovery ไมอยในเกณฑทยอมรบ ใหเพมความเขมขนขนเรอยๆ จนคาทไดอยในเกณฑทยอมรบ จากนนใหทดสอบวนละ 1 ซ า จนครบ 10 ซ า


ตารางท 3 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ทระดบความเขมขน LOQ

Rep.

Cd (mg/kg)

Swine Poultry Bovine Soy meal Corn meal Rice bran

meal Fish meal

Conc. %Rec. Conc. %Rec. Conc. %Rec. Conc. %Rec. Conc. %Rec. Conc. %Rec. sample Spiked Sample

Conc. %Rec.

1 0.203 101.50 0.205 102.50 0.212 106.00 0.197 98.50 0.202 101.00 0.182 91.00 0.738 0.922 0.184 92.00 2 0.181 90.50 0.182 91.00 0.190 95.00 0.211 105.50 0.211 105.50 0.202 101.00 0.738 0.910 0.172 86.00 3 0.186 93.00 0.170 85.00 0.198 99.00 0.190 95.00 0.184 92.00 0.197 98.50 0.738 0.937 0.199 99.50 4 0.187 93.50 0.197 98.50 0.162 81.00 0.212 106.00 0.204 102.00 0.190 95.00 0.738 0.927 0.189 94.50 5 0.183 91.50 0.185 92.50 0.167 83.50 0.201 100.50 0.196 98.00 0.180 90.00 0.738 0.947 0.209 104.50 6 0.207 103.50 0.209 104.50 0.168 84.00 0.209 104.50 0.189 94.50 0.188 94.00 0.738 0.945 0.207 103.50 7 0.207 103.50 0.214 107.00 0.183 91.50 0.199 99.50 0.214 107.00 0.191 95.50 0.738 0.943 0.205 102.50 8 0.187 93.50 0.213 106.50 0.178 89.00 0.195 97.50 0.212 106.00 0.204 102.00 0.738 0.917 0.179 89.50 9 0.184 92.00 0.186 93.00 0.175 87.50 0.214 107.00 0.208 104.00 0.184 92.00 0.738 0.923 0.185 92.50 10 0.183 91.50 0.211 105.50 0.161 80.50 0.207 103.50 0.201 100.50 0.195 97.50 0.738 0.925 0.187 93.50

mean 0.191 95.40 0.197 98.60 0.179 89.70 0.204 101.75 0.202 101.05 0.191 95.65 - - 0.192 95.80 SD 0.010 5.243 0.016 7.760 0.017 8.301 0.008 4.098 0.010 4.986 0.008 4.090 - - 0.013 6.339

RSD(%) 5.496 5.496 7.870 7.870 9.254 9.254 4.027 4.027 4.934 4.934 4.276 4.276 - - 6.616 6.616


10.4 Linear range 10.4.1 ชงตวอยาง 0.9 - 2 g ใสลงใน Erlenmeyer flask เตมสารมาตรฐานแคดเมยมให

ไดความเขมขนอยในชวง Linear range โดยใหครอบคลมคาต า กลางและสง 10.4.2 เตมกรดไนตรกประมาณ 10 ml 10.4.3 เตมกรดเปอรคลอรกประมาณ 4 ml 10.4.4 น าไปยอยบนแทนความรอนจนหมดควนสแดง แลวเกดควนสขาว 10.4.5 ถายใส Volumetric flask ขนาด 50 ml ปรบปรมาตรดวยน าขจดไอออน

ผสมใหเขากน 10.4.6 กรองดวยกระดาษกรองเบอร 5

10.4.7 น าไปตรวจวดดวยเครอง ICP-OES ทความยาวคลน 282.802 นาโนเมตร ใหทดสอบวนละ 1 ซ า ทกความเขมขน จนครบ 10 ซ า ค านวณหา X SD %RSD และ %Recovery


ตารางท 4 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในอาหารสกรทระดบความเขมขนตางๆ

Rep. Swine

0.20 mg/kg 1.00 mg/kg 5.00 mg/kg 10.00 mg/kg Conc. %Recovery Conc. %Recovery Conc. %Recovery Conc. %Recovery

1 0.203 101.50 0.928 92.80 4.421 88.42 8.849 88.49 2 0.181 90.50 0.888 88.80 4.416 88.32 8.836 88.36 3 0.186 93.00 0.902 90.20 4.335 86.70 8.765 87.65 4 0.187 93.50 0.922 92.20 4.510 90.20 9.050 90.50 5 0.183 91.50 0.875 87.50 4.206 84.12 8.372 83.72 6 0.207 103.50 0.916 91.60 4.421 88.42 8.755 87.55 7 0.207 103.50 0.956 95.60 4.614 92.28 9.200 92.00 8 0.187 93.50 0.926 92.60 4.634 92.68 9.163 91.63 9 0.184 92.00 0.921 92.10 4.556 91.12 9.218 92.18 10 0.183 91.50 0.922 92.20 4.587 91.74 9.198 91.98

mean 0.191 95.40 0.916 91.56 4.470 89.40 8.941 89.41 SD 0.010 5.243 0.023 2.261 0.136 2.716 0.275 2.748

RSD (%) 5.496 5.496 0.025 0.025 0.030 0.030 0.031 0.031


ตารางท 5 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในอาหารไกทระดบความเขมขนตางๆ

Rep. Poultry


1 0.205 102.50 0.948 94.80 4.822 96.44 9.407 94.07 2 0.182 91.00 0.952 95.20 4.486 89.72 9.066 90.66 3 0.170 85.00 0.856 85.60 4.298 85.96 8.559 85.59 4 0.197 98.50 0.983 98.30 4.513 90.26 9.126 91.26 5 0.185 92.50 0.895 89.50 4.542 90.84 9.212 92.12 6 0.209 104.50 1.032 103.20 4.441 88.82 9.096 90.96 7 0.214 107.00 1.006 100.60 4.760 95.20 9.589 95.89 8 0.213 106.50 1.074 107.40 4.812 96.24 9.745 97.45 9 0.186 93.00 1.003 100.30 4.533 90.66 9.145 91.45 10 0.211 105.50 1.010 101.00 4.814 96.28 9.668 96.68

mean 0.197 98.60 0.976 97.590 4.602 92.042 9.261 92.613 SD 0.016 7.760 0.065 6.489 0.186 3.715 0.353 3.529

RSD (%) 7.870 7.870 6.649 6.649 4.036 4.036 3.811 3.811


ตารางท 6 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในอาหารโคทระดบความเขมขนตางๆ

Rep. Bovine


1 0.212 106.00 1.036 103.60 4.481 89.62 8.090 80.90 2 0.190 95.00 0.965 96.50 4.984 99.68 9.312 93.12 3 0.198 99.00 1.018 101.80 4.409 88.18 8.993 89.93 4 0.162 81.00 0.936 93.60 4.827 96.54 8.903 89.03 5 0.167 83.50 0.945 94.50 4.690 93.80 8.665 86.65 6 0.168 84.00 0.922 92.20 4.720 94.40 8.735 87.35 7 0.183 91.50 0.955 95.50 4.251 85.02 8.542 85.42 8 0.178 89.00 1.005 100.50 4.392 87.84 8.986 89.86 9 0.175 87.50 0.975 97.50 4.842 96.84 8.923 89.23 10 0.161 80.50 0.932 93.20 4.356 87.12 9.016 90.16

mean 0.179 89.70 0.969 96.89 4.595 91.90 8.817 88.17 SD 0.017 8.301 0.039 3.898 0.248 4.967 0.333 3.328

RSD (%) 9.254 9.254 4.023 4.023 5.404 5.404 3.775 3.775


ตารางท 7 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในกากถวเหลองทระดบความเขมขนตางๆ

Rep. Soy bean meal


1 0.197 98.50 0.907 90.70 4.325 86.50 8.551 85.51 2 0.211 105.50 0.957 95.70 4.524 90.48 8.829 88.29 3 0.190 95.00 1.002 100.20 4.913 98.26 9.675 96.75 4 0.212 106.00 0.988 98.80 4.843 96.86 9.450 94.50 5 0.201 100.50 1.035 103.50 5.115 102.30 10.050 100.50 6 0.209 104.50 1.054 105.40 5.093 101.86 9.900 99.00 7 0.199 99.50 1.013 101.30 4.617 92.34 9.736 97.36 8 0.195 97.50 1.046 104.60 4.918 98.36 10.180 101.80 9 0.214 107.00 1.072 107.20 5.262 105.24 10.290 102.90 10 0.207 103.50 1.075 107.50 4.845 96.90 9.989 99.89

mean 0.204 101.75 1.015 101.49 4.846 96.91 9.665 96.65 SD 0.008 4.098 0.053 5.340 0.287 5.749 0.573 5.731

RSD (%) 4.027 4.027 5.261 5.261 5.932 5.932 5.929 5.929


ตารางท 8 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในขาวโพดทระดบความเขมขนตางๆ

Rep. Corn meal


1 0.202 101.00 0.900 90.00 4.051 81.02 8.160 81.60 2 0.211 105.50 0.955 95.50 4.595 91.90 9.249 92.49 3 0.184 92.00 0.902 90.20 4.452 89.04 8.932 89.32 4 0.204 102.00 1.015 101.50 4.697 93.94 9.400 94.00 5 0.196 98.00 0.950 95.00 4.571 91.42 9.344 93.44 6 0.189 94.50 0.948 94.80 4.754 95.08 9.540 95.40 7 0.214 107.00 0.981 98.10 4.702 94.04 9.419 94.19 8 0.212 106.00 1.021 102.10 4.872 97.44 9.687 96.87 9 0.208 104.00 1.013 101.30 4.908 98.16 9.800 98.00 10 0.201 100.50 1.024 102.40 4.781 95.62 9.681 96.81

mean 0.202 101.05 0.971 97.09 4.638 92.77 9.321 93.21 SD 0.010 4.986 0.047 4.730 0.248 4.965 0.479 4.786

RSD (%) 4.934 4.934 4.872 4.872 5.352 5.352 5.135 5.135


ตารางท 9 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในร าทระดบความเขมขนตางๆ

Rep.

Rice bran meal

0.20 mg/kg 1.00 mg/kg 5.00 mg/kg 10.00 mg/kg

Conc. %Recovery Conc. %Recovery Conc. %Recovery Conc. %Recovery

1 0.182 91.00 0.819 81.90 4.757 95.14 8.292 82.92

2 0.202 101.00 1.060 106.00 4.827 96.54 9.764 97.64

3 0.197 98.50 1.011 101.10 4.897 97.94 10.040 100.40

4 0.190 95.00 1.070 107.00 5.143 102.86 9.633 96.33

5 0.180 90.00 1.005 100.50 4.585 91.70 9.407 94.07

6 0.188 94.00 1.017 101.70 5.005 100.10 9.230 92.30

7 0.191 95.50 1.009 100.90 4.671 93.42 9.500 95.00

8 0.204 102.00 1.053 105.30 5.144 102.88 9.553 95.53

9 0.184 92.00 1.015 101.50 4.706 94.12 9.672 96.72

10 0.195 97.50 1.039 103.90 5.276 105.52 9.767 97.67

mean 0.191 95.65 1.010 100.98 4.901 98.02 9.486 94.86

SD 0.008 4.090 0.071 7.100 0.232 4.648 0.474 4.739

RSD (%) 4.276 4.276 7.031 7.031 4.742 4.742 4.996 4.996


ตารางท 10 ความเขมขนแคดเมยมของ Spiked sample ในปลาปนทระดบความเขมขนตางๆ

Rep. Sam Fish meal

0.20 mg/kg 1.00 mg/kg 10.00 mg/kg 50.00 mg/kg Spiked Conc. %Re Spiked Conc. %Re Spiked Conc. %Re Spiked Conc. %Re

1 0.738 0.922 0.184 92.00 1.696 0.958 95.80 9.857 9.119 91.19 44.32 43.582 87.16 2 0.738 0.910 0.172 86.00 1.667 0.929 92.90 9.235 8.497 84.97 44.09 43.352 86.70 3 0.738 0.937 0.199 99.50 1.725 0.987 98.70 10.100 9.362 93.62 44.78 44.042 88.08 4 0.738 0.927 0.189 94.50 1.695 0.957 95.70 9.617 8.879 88.79 44.09 43.352 86.70 5 0.738 0.947 0.209 104.50 1.752 1.014 101.40 9.477 8.739 87.39 44.36 43.622 87.24 6 0.738 0.945 0.207 103.50 1.690 0.952 95.20 9.153 8.415 84.15 44.78 44.042 88.08 7 0.738 0.943 0.205 102.50 1.759 1.021 102.10 9.848 9.110 91.10 44.03 43.292 86.58 8 0.738 0.917 0.179 89.50 1.676 0.938 93.80 9.528 8.790 87.90 43.41 42.672 85.34 9 0.738 0.923 0.185 92.50 1.750 1.012 101.20 9.908 9.170 91.70 44.56 43.822 87.64 10 0.738 0.925 0.187 93.50 1.747 1.009 100.90 9.685 8.947 89.47 45.19 44.452 88.90

mean - - 0.192 95.80 - 0.978 97.77 - 8.903 89.03 - 43.623 87.25 SD - - 0.013 6.339 - 0.035 3.474 - 0.301 3.012 - 0.499 0.998

RSD (%) - - 6.616 6.616 - 3.553 3.553 - 3.383 3.383 - 1.144 1.144


10.4.8 ความแมนประเมนไดจาก %Recovery ของ Linear range ซงเกณฑการยอมรบอยในชวง 80-115% ผลการทดสอบความแมน ดงตารางท 11

ตารางท 11 แสดงคา % recovery จากการทดสอบ

Swine feed Poultry feed Bovine feed Soy meal Corn meal Rice bran meal Fish meal 83.72-103.50 85.00-107.40 80.50-106.00 85.51-107.50 81.02-107.00 81.90-107.00 84.15-104.50

10.4.9 ความเทยงประเมนจาก %RSD (Relative standard deviation) จาก Linear range แลวเปรยบเทยบกบ Horwitz equation โดยใชสตร %RSDR = 2(1-0.5 log C) (แบบ Reproducibility) ผลการทดสอบความเทยง ดงตารางท 12 ตารางท 12 แสดง %RSD ของ Horwitz equation และจากการทดลอง

Conc. RSD; Horwitz equation (%)

RSD; Experimental (%) Swine feed Poultry feed Bovine feed Soy bean meal Corn meal Rice bran Fish meal

0.20 mg/kg 1.00 mg/kg 5.00 mg/kg 10.00 mg/kg 50.00 mg/kg

13.45 10.56 8.29 7.46 5.86

5.496 0.025 0.030 0.031

-

7.870 6.649 4.036 3.811

-

9.254 4.023 5.404 3.775

-

4.027 5.261 5.932 5.929

-

4.934 4.872 5.352 5.135

-

4.276 7.031 4.742 4.996

-

6.616 3.553

- 3.383 1.144


10.5 Matrix effect หาความแตกตางระหวางปรมาณแคดเมยมในสารละลายมาตรฐานและปรมารณแคดเมยมในตวอยางอาหารสตวโดยใช Pair t-test

t = nSD/

d

โดยคา t ทค านวณไดนอยกวาคา tcritical value (tC = 3.18 ท df = 3) แสดงวาไมมความแตกตางกนอยางมนยส าคญทระดบความเชอมน 95%

ตารางท 13 แสดง Slope ของแตละตวอยาง

Matrix Slope mean ( ) SD STD (µ) t Soy meal 0.9757 0.9779 0.9768 0.002 0.9856 -8.00 Corn meal 0.9860 0.9747 0.9804 0.008 0.9856 -0.93

Rice bran meal 0.9846 0.9750 0.9798 0.007 0.9856 -1.21 Fish meal 0.9737 0.9868 0.9803 0.009 0.9856 -0.82

Swine 0.9841 0.9832 0.9837 0.001 0.9856 -4.33 Bovine 0.9798 0.9868 0.9833 0.005 0.9856 -0.66 Poultry 0.9896 0.9756 0.9826 0.010 0.9856 -0.43

10.6 การประเมนความแมน (Accuracy) โดยใช CRM (Certified Reference Material) 10.6.1 ทดสอบ Reagent bank และ CRM อยางละ 10 ซ า 10.6.2 ค านวณ คาเฉลยของ Reagent bank และลบออก จากคา CRM ทไดจากการทดสอบในแตละคา 10.6.3 ประเมน Trueness โดยใชสถต t-test จากสตร

X

Conc. of Cd in Sample Conc. of Cd in Sample


t =

เมอ = คาเฉลยของผลทดสอบ CRM µ = True value หรอ Certified value S = คาเบยงเบนมาตรฐาน n = จ านวนซ า

หาคา tc จากตาราง โดย df=n-1 และ p=0.05 เปรยบเทยบคา t จากการค านวณ (ไมคดเครองหมาย) กบคา tc จากตาราง หากพบวา t<tc แสดงวาวธทดสอบม Trueness 10.6.4 ประเมนคา %Recovery จากสตร %Recovery =

ตารางท14 ผลการทดสอบ CRM ชนดตวอยาง Dogfish Liver จ านวน 10 ซ า และประเมน Trueness และ %Recovery

ซ าท ผลการทดสอบแคดเมยมใน Dogfish Liver (mg/kg) 1 14.35 2 14.71 3 14.55 4 14.95 5 14.65 6 14.50 7 14.90 8 14.19 9 14.95 10 14.89

คาเฉลย ( ) 14.66 คาเบยงเบนมาตรฐาน (S) 0.27 จ านวนซ า (n=10) 10 True value or Certified value ( ) 14.50 t 1.87 tc 2.26 t< tc ผาน %Recovery (เกณฑการยอมรบ 85-110) 100.69

สรป การใช CRM ชนดตวอยาง Dogfish Liver เปนตวอยางทดสอบประเมนคา Trueness โดยใชสถต t-test และประเมน %Recovery ซงอยในเกณฑยอมรบ แสดงวาวธทดสอบมความแมน (Accuracy)

ns

x

/

X

100

x

X


11. การค านวณ 11.1 คาเฉลย (Mean; X )

X =

11.2 สวนเบยงเบนมาตรฐาน (Standard deviation; SD)

SD =

11.3 Relative standard deviation (%RSD)

%RSD =

11.4 Horwitz equation 11.4.1 Reproducibility

(%RSDR) = 2(1-0.5 log C) เมอ C = Concentration ratio 11.4.2 Repeatability

(%RSDr) = 0.66x2c (1-0.5 log C) เมอ C = Concentration ratio 11.5 Horwitz’s ratio (HORRAT)

HORRAT =

11.6 Percent recovery (%Recovery)

%Recovery =

11.7 Limit of detection (LOD) LOD = X +3SD 11.8 Limit of quantitation (LOQ) LOQ = X +10SD หรอมากกวา LOD หรอมากกวา X +10SD และตองมความแมนและ

ความเทยง 11.9 t-test

t =

12.เอกสารอางอง 12.1 วธใชเครองมอ การใชเครองทดสอบแรธาต (ICP-OES) 12.2 วธทดสอบ การทดสอบหาปรมาณแคดเมยมและตะกวในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 12.3 เอกสารการฝกอบรมเชงปฏบตการหลกสตรการตรวจยนยนวธทดสอบ (Method Validation) กรมวทยาศาสตรการแพทย 2546

n

Xn

1ii

1n

)x(xn

1i

2i

100X

SD

quation Horwitze

%RSD

100 เตมลงไปายมาตรฐานทนของสารละลความเขมข

)างเรมตนนของตวอยความเขมขsample Spiked นของความเขมข

ns

x

/


12.4 เอกสารประกอบการฝกอบรม หลกสตร Method validation ส าหรบงานวธวเคราะหอาหารทางเคม กรมวทยาศาสตรบรการ 12.5 AOAC Guidelines for Single Laboratory Validation of Chemical Methods for Dietary Supplements and Botanicals. 2002-12-19. 12.6 AOAC Guideline for Standard Method Performance Requirements (2012). 12.7 Rosie Shier. Statistics 1.1 Paired t-tests, Mathematics Learning Support Centre. 2004. Available on [http://www.statstutor.ac.uk/resources/uploaded/paired-t-test.pdf]


ภาคผนวก ง ตวอยาง การประมาณคาความไมแนนอนของการทดสอบแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 1. วตถประสงค

เพอใชเปนวธปฏบตงานในการประมาณคาความไมแนนอนของผลทดสอบแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES

2. ขอบขาย

ใชในการประมาณคาความไมแนนอนของผลทดสอบของวธทดสอบหาปรมาณแคดเมยมใน อาหารสตว เมอตองการใชคาความไมแนนอนในการรายงานผลวเคราะห 3. เอกสารทเกยวของ

3.1 วธปฏบตงาน เรอง วธทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 3.2 วธปฏบตงาน เรอง การใชเครองทดสอบแรธาต (ICP-OES) 3.3 วธปฏบตงาน เรองการตรวจสอบความใชไดของวธทดสอบหาปรมาณแคดเมยมใน

อาหารสตว 4. นยาม

4.1 Uncertainty ความไมแนนอนของการวด หมายถง พารามเตอรทมสวนรวมอยในผลวเคราะหทบอกลกษณะการกระจายของคาทถกพจารณาอยางสมเหตสมผลวาเปนของคานน 4.2 Standard uncertainty ความไมแนนอนมาตรฐาน หมายถง คาความไมแนนอนของผลการวดแสดงอยในรปสวนเบยงเบนมาตรฐาน (standard deviation)

4.3 Combined standard uncertainty ความไมแนนอนมาตรฐานรวม หมายถงความไมแนนอนมาตรฐานรวมของผลของการวดทไดจากความไมแนนอนหลายคา

4.4 Sample blank หมายถง ตวอยางอาหารสตวทไมพบแคดเมยม 4.5 Spiked sample หมายถง Sample blank ทเตมสารมาตรฐานททราบความเขมขนท

แนนอน ลงไป เพอใชในการควบคมการวเคราะห โดยการค านวณเปอรเซนตการคนกลบของสาร (% Recovery) 5. หลกการ ตามหลกการจาก Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM) และEURACHEM/CITAC Guide CG4 Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement (QUAM 2012.P1) ซงมขนตอนอย 6 ขนตอน คอ (1) ระบรายละเอยดของการวเคราะห (2) บงชและวเคราะหแหลงทมาของความไมแนนอน (3) หาปรมาณของแตละสวนประกอบของความไมแนนอน (4) ค านวณคาความไมแนนอนมาตรฐานรวม (5) หาคาความไมแนนอนขยาย และ (6) รายงานคาความไมแนนอนของการวด 6. ความปลอดภย

ในการเตรยมตวอยางใหเตรยมในตดดควน (Hood) สวมแวนตา และ สวมหนากากกนกรด


7. อปกรณและเครองมอ ตามวธการทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 8. สารเคมและอาหารเลยงเชอ ตามวธการทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 9. สารมาตรฐานและการเตรยม ตามวธการทดสอบหาปรมาณแคดเมยมในในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES 10. ขนตอนปฏบตงาน 10.1 สรางกราฟมาตรฐาน (calibration curve) ทใชสารละลายมาตรฐานของแคดเมยม 5 ระดบความ เขมขน คอ 0.01 0.05 0.10 0.50 และ 1.00 มลลกรมตอลตร ความเขมขนละ 3 ครง ใชตวอยาง spiked sample ทความเขมขน 1.0 มลลกรม/กโลกรมเปนตวอยางส าหรบ Internal quality control หาคา recovery และท าการวเคราะหตวอยางอาหารสตวทตองการหาปรมาณแคดเมยมและคาความไมแนนอนของผลวเคราะห โดยการวเคราะหซ า 10.2 หาคาความไมแนนอนของการวดโดยใชหลกการตาม Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM) และ EURACHEM/CITAC Guide CG4 Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement QUAM 2012.P1 ซงมขนตอนการหาคาความไมแนนอน ดงน 10.2.1 ระบรายละเอยดของการวเคราะห ผงขนตอนการค านวณผลวเคราะห (Specify measurand) 10.2.2 บงชและวเคราะหแหลงทมาของความไมแนนอน (Identify uncertainty sources) 10.2.3 หาปรมาณของแตละสวนประกอบของความไมแนนอน (Quantify uncertainty components) 10.2.4 ค านวณคาความไมแนนอนมาตรฐานรวม (Calculate combined uncertainty) 10.2.5 หาคาความไมแนนอนขยาย (Expanded uncertainty) 10.2.6 รายงานคาความไมแนนอนของการวด (Report uncertainty) 11. การค านวณ

ค านวณคาความไมแนนอนของผลทดสอบแคดเมยมในในอาหารสตวตามวธดงน 11.1 บนทกขอมลผลของการสรางกราฟมาตรฐาน (calibration curve) ทใชสารละลาย

มาตรฐานของแคดเมยม 5 ระดบความ เขมขน คอ 0.01 0.05 0.10 0.50 และ 1.00 มลลกรมตอลตร ความเขมขนละ 3 ครง แสดงคา intensity จ านวนคาทใชสราง calibration curve, slope, intercept และ Correlation of Coefficient ในตารางท 1 และบนทกผลของการวเคราะหตวอยาง unknown ท าซ า 2 ซ า (duplicate) แสดงคาน าหนกตวอยาง และคาความเขมขนทค านวณได ในตารางท 2


ตารางท 1 ขอมลผลของการสรางกราฟมาตรฐาน (calibration curve) ผลการวดและค านวณคาทไดจากการทดลอง

ความเขมขน,Ci คาทวดได, jA mg/l 1 2 3 0.01 3107.5 3059.6 3034.6 0.05 15254.5 15342.3 15351.6 0.10 30896.3 30971.1 30944.4 0.50 153514.2 153760.0 154051.4 1.00 305288.8 307880.0 308694.3

จ านวนคาทใชท า calibration curve = 15 คา Slope = 307272 Intercept = 62.3 Correlation of Coefficient = 1.00

ตารางท 2 ผลของการวเคราะหตวอยาง unknown 2 ซ า

ซ า 1 2 เฉลย น าหนกตวอยาง (g) 2.0028 2.0132 2.0080 คาความเขมขนของตวอยางทค านวณไดจาก calibration curve หนวยเปน mg/l ผลการวเคราะหหนวยเปน mg/kg

0.020

0.500

0.018

0.446

0.019

0.473 11.2 ผลการหาคาความไมแนนอนของการวด 11.2.1 ระบรายละเอยดของการวเคราะห ผงขนตอนการค านวณผลวเคราะห (Specify measurand) ชงตวอยางประมาณ 1-2 กรม ดวยเครองชงน าหนกทแนนอน 0.0001 กรม เตมกรดไนตรก 10 มลลลตร กรดเปอรคลอรก 4 มลลลตร วางบนแทนความรอน จนเกดควนสขาว ถายใส Volumetric flask ขนาด 50 มลลลตร ทงใหเยน เตมน าขจดไออนใหไดปรมาตร 50 มลลลตร กรองดวยกระดาษกรองเบอร 5 วดคาดวยเครอง ICP-OES Perkin Elmer รน Optima 2100 DV โดยใช ความยาวคลน 228.802 นาโนเมตร Flow rate pump 1.5 ml/min Flow rate gas ของ plasma 15 L/min, Nebulizer 0.8 L/min , Auxillary 0.2 L/min ใช plasma view แบบ Axial ก าลงไฟฟาของ RF 1300 watt แสดงผงการวเคราะหในรปท 1


รปท 1 การวเคราะหแคดเมยมในอาหารสตวดวยเครอง ICP-OES

สตรการค านวณ W

VCCCd

0

เมอ CdC หมายถง ปรมาณของแคดเมยมในตวอยาง (มลลกรมตอกโลกรม mg/kg) 0C หมายถง ความเขมขนของแคดเมยมในตวอยางทค านวณไดจาก calibration

curve (มลลกรมตอลตร mg/l) V หมายถง ปรมาตรของตวอยาง (มลลลตร ml) W หมายถง น าหนกของตวอยาง (กรม g) 11.2.2 บงชและวเคราะหแหลงทมาของความไมแนนอน แหลงของความไมแนนอนพจารณาได 5 แหลง คอ ความไมแนนอนของความเขมขน

ของแคดเมยมทไดจาก Calibration curve U(C0) ความไมแนนอนทเกดจากการวดปรมาตรของตวอยางทเตรยม U(V) ความไมแนนอนทเกดจากการชงน าหนกตวอยาง U(W) ความไมแนนอนทเกดจากการเตรยมสารมาตรฐานทความเขมขนตางๆ U(Calstd) และความไมแนนอนจากการท าซ า (Precision) U(Pre) แสดงแหลงของความไมแนนอนโดยแผนผงกางปลา ดงแสดงในรปท 2

บดตวอยาง ใหมขนาด 1 มลลเมตร

ชงตวอยาง 1-2 กรม ลงใน Erlenmeyer flask 50 มลลลตร

ตมบน hot plate จนเกดควนสขาว

ถายใส Volumetric flask 50 มลลลตร ทงใหเยน เตมน าขจดไอออนใหได ปรมาตร 50 มลลลตร

กรองดวยกระดาษกรอง Whatman เบอร 5

รายงานผลวเคราะห

วดคาจากตวอยางทวเคราะห ดวยเครอง ICP-OES

ฉดสารละลายเขาเครอง ICP-OES

เตรยม Working standard solution 0.01 0.05 0.10 0.50 1.00 mg/l

เตรยม Intermediate standard solution 10 mg/l จาก Stock standard solution 1000 mg/l

ปรบเทยบเครองมอ ICP-OES


รปท 2 แผนผง Ishikawa หรอแผนผงกางปลา (cause and effect diagram or fishbone diagram) แสดงแหลงของความไมแนนอนของการวเคราะหหาปรมาณแคดเมยมโดย ICP-OES 11.2.3 หาปรมาณของแตละสวนประกอบของความไมแนนอนค านวณหาความไมแนนอน จากแหลงตางๆ ดงน 11.2.3.1 หาคาความไมแนนอนของความเขมขนของแคดเมยมทมาจาก linear least square Calibration : U(C0)

ค านวณความไมแนนอนจาก Calibration data

สตรการค านวณ

U (C0 ) = 2

1

)(11

xxS

CCo

npB

S

โดยท S =

xxS =

2

1

)(

n

j

j CC

Ccd

V(sample) C0

Precision

Calibration

Calibration Calibration

Temperature

m (tare) m (gross)

Dilution

(Calstd)

Purity (std)

Repeatability Repeatability

Least square

linear Calibration

W (sample)

Repeatability

2

)]([ 2

1

10

n

CBBA j

n

j

j


เมอ jA = คา Intensity ทวดไดในล าดบท j ของความเขมขนสารมาตรฐานในล าดบท ic 0B = Intercept

1B = Slope iC = ความเขมขนเของแคดเมยมในสารละลายมาตรฐานทเตรยม

jC = ความเขมขนของแคดเมยมในสารละลายมาตรฐานทก าหนดใน calibration curve

n = จ านวนของการวด ในการท า calibration p = จ านวนของการวดในการหาคาตวอยาง unknown C0 = คาความเขมขนของตวอยาง unknown ค านวณจาก calibration curve (mg/l) C = คาเฉลยความเขมขนของสารมาตรฐานแคดเมยมทใชท า calibration curve i = ตวเลขแสดงล าดบทของสารละลายมาตรฐาน j = ตวเลขแสดงล าดบทของคาทวดเพอใหได calibration curve ทล าดบ i มขนตอนการค านวณ เปนล าดบ ดงน

(1) ค านวณคา jC จาก jA โดยท jC = 1

0

B

BA j

ตารางท 3 คา jC ค านวณจากคาในตารางท 1 โดยคา 1B (slope) =237,272 0B (intercept)= 62.3

ความเขมขนทเตรยม ความเขมขนทอานได (Aj)

[ mg/l ] (Ci) 1 2 3 0.01 3107.5 3059.6 3034.6 0.05 15254.5 15342.3 15351.9 0.10 30896.3 30971.1 30944.4 0.50 153514.2 153760.0 154051.4 1.00 305288.8 307880.0 308694.3

(2) หาคาเฉลย

C = 4.98 /15 = 0.332


(3) หาคา 2)( CC j 15 คา

(4) หาคา Sxx = 2

1

)(

n

j

j CC = 2.13451

(5) หาคา = 36195150.76 (6) หาคา S = = 1668.604916

(7) หาคา U (C0 ) = 2

0

1

)(11

xxS

CC

npB

S

=

= 0.004250171...........mg/l RSU (C0 ) = 0.004250171/0.019 = 0.2236894 11.2.3.2 ความไมแนนอนทเกดจากการท า dilution จาก stock solution มแหลงความไมแนนอนมาจาก purity ของสารมาตรฐานและการท า dilution มการค านวณดงน

Purity Stock Cadmium standard solution [Catalog no. 140-001 485 lot no.

SC4044032 tracible to NIST standard reference material 3108] 1000 mg/l, 4% nitric acid มคา uncertainty ± 0.5 % คดเปน ± 5 mg/l ในใบรบรองมไดระบระดบความเชอมน จงคดการกระจายแบบ rectangular ดงนน คาความไมแนนอนของ ความเขมขนของ Stock Cadmium standard solution หรอ UCstock = 35 = 2.886751 mg/l คดเปน relative standard uncertainty RSUCstock=2.886751/1000 = 0.00288675 Dilution ค านวณหาความไมแนนอนของสารละลายมาตรฐานทความเขมขน 0.01 0.05 0.10 0.50 และ 1.00 mg/l ตามขนตอนดงน

0.103741943 0.103842388 0.103894831 0.079839143 0.079677748 0.079660111 0.053663031 0.053550307 0.05359053 0.028022913 0.028291375 0.028611298 0.437374077 0.44859929 0.45215625

2

134515.2

)332.0019.0(

15

1

2

1

307272

61668.60491

2

1

10 )]([ j

n

j

j CBBA

2

)]([ 2

1

10

n

CBBA j

n

j

j


1. รวบรวมขอมลเพอการค านวณคาความไมแนนอน - intermediate standard solution ความเขมขน 10.00 mg/l เตรยมจาก stock standard solution 1000 mg/l ทมคาความไมแนนอน(RSU) = 0.002887 โดยใช Pipette 1 ml และ Volumetric flask 100 ml ดงตารางท 4

ตารางท 4 ความเขมขนและเครองแกววดปรมาตรทใชในการเตรยมสารละลายมาตรฐาน

- เครองแกววดปรมาตรทใชมคา tolerance และ repeatability และคาอณหภม

เปลยนแปลงของหองปฏบตการ คา tolerance ไดจาก specification ของเครองมอ คา repeatability ไดจากการท าซ าของงผวเคราะห 10 ซ า คาอณหภมเปลยนแปลงไดจากประวตบนทกอณหภมของหองปฏบตการ แสดงในตารางท 5 ซงใชขอมลในการค านวณความไมแนนอนตอไป ตารางท 5 ขอมลของเครองแกววดปรมาตรและอณหภม

ชนด Tolerance

Repeatability

Temperature

100 ml flask 0.06 0.036 3 10 ml pipette 0.02 0.0012 3 5 ml pipette 0.01 0.0011 3 1 ml pipette 0.006 0.0019 3 2. ค านวณหาความไมแนนอนของความเขมขนสารละลายมาตรฐาน ตามล าดบดงน (1) หาความไมแนนอนของเครองแกววดปรมาตรทใชในการเตรยมสารละลาย มาตรฐานแหลงของความไมแนนอนของเครองแกวมาจาก 3 แหลงคอ จากเครองแกว ใชคา tolerance หรอ calibration จากการใชเครองแกว ใชคา repeatability และจากการเปลยนแปลงอณหภม โดยมหลกการค านวณ ดงน - ค านวณคาความไมแนนอนมาตรฐานจากคา tolerance เปนคาทไดมาจาก Specification ของเครองมอ ไมมการระบคาความเชอมน คดการกระจายแบบ triangular

Standard Utol = 6tolerance

สารละลายมาตรฐาน ความเขมขนของ stock Pipette Volumetric flask

mg/l mg/l ml ml 10.00 1000 1 100 1.00 10 10 100 0.50 10 5 100 0.10 10 1 100 0.05 1 5 100 0.01 1 1 100


- ค านวณคาความไมแนนอนมาตรฐานจากการใชเครองแกว ใชคา repeatability เปนคา SD ทไดจากการท าซ า ไดจากการทดลองท าซ าของผปฏบตงาน 10 ซ า ขอมลจากรายงานผลการท าซ าการวดปรมาตรขององเครองแกววดปรมาตรส าหรบงานทดสอบปรมาณแคดเมยมในกากถวเหลองและขาวโพด

Standard Urep = SD - ความไมแนนอนมาตรฐานจากอณหภมทเปลยนแปลง ±3°C คดการกระจายแบบ rectangular และคาสมประสทธการขยายตวของปรมาตรของน า = 2.1 x 10-4/°C Standard Utemp =

โดย V หมายถง ปรมาตรของเครองแกววดปรมาตร tempdif หมายถง คาชวงอณหภมทแตกตางจาก 25 °C ค านวณคาตางๆ ลงในตาราง ไดขอมลการค านวณตามตารางท 6

ตารางท 6 ผลการค านวณคา standard uncertainty ทเปนแหลงความไมแนนอนของเครองแกววดปรมาตร เครองแกว SUtolerance (ml) SUrep (ml) SUtemp (ml)

วดปรมาตร = 6tolerance = SD =

100 ml flask 0.02449490 0.036 0.036373067 10 ml pipette 0.00816497 0.0012 0.003637307 5 ml pipette 0.00408248 0.0011 0.001818653 1 ml pipette 0.0024494 0.0019 0.0003637

หลงจากนน ใหค านวณหาคา standard uncertainty ของเครองแกววดปรมาตรชนดตางๆ ดวยสตรค านวณ

คาทค านวณไดแสดงในตารางท 7 และค านวณคา relative standard uncertainty (RSUv) = SUv/volume คาทไดใชในการค านวณหาความไมแนนอนของสารละลายมาตรฐานความเขมขนตางๆ ตอๆ ไป

3

101.2 4 tempdifV

3

101.2 4 tempdifV

222 )()()( tempreptolV SUSUSUSU


ตารางท 7 ผลการค านวณคา Standard Uncertainty SUv และ Relative Standard Uncertainty (RSUv) ของเครองวดปรมาตรทใช ชนดเครองวดปรมาตร SUv (ml) RSUv 100 ml flask 0.049989999 0.0004999 10 ml pipette 0.027517812 0.00275178 5 ml pipette 0.009644385 0.00192886 1 ml pipette 0.002478366 0.00247837

(1) การค านวณหาคาความไมแนนอนของสารละลายมาตรฐานทระดบความเขมขน 1.0 0.50 0.10 0.05 และ 0.01 mg/l ตารางท 8 ขอมลการเตรยมสารละลายมาตรฐาน

ใสคาความไมแนนอนทมาจาก pipette และ volumetric flask ทค านวณไดในขอ (1) ตามขอมล ในตาราง พรอมทงค านวณหาคาความไมแนนอนของสารละลายมาตรฐานท 10.00 mg/l โดยใชคาความไมแนนอนของสารละลายมาตรฐานทความเขมขน 1000 mg/l ทค านวณดวยสตร

ใสคาในตาราง ตอจากนนใชคาทไดในการค านวณคาความไมแนนอนของสารละลาย มาตรฐานทความเขมขน 10.00 mg/l ตอไปใชคาทไดค านวณความไมแนนอนของสารละลายมาตรฐานทความเขมขน 1.00 mg/l ดวยวธการค านวณท านองเดยวกน คาทค านวณไดแสดงในตารางท 9

สารละลายมาตรฐาน ความเขมขนของ stock Pipette Volumetric flask

mg/l 10.00 1000 mg/l 1 ml 100 ml 1.00 10 mg/l 10 ml 100 ml 0.50 10 mg/l 5 ml 100 ml 0.10 10 mg/l 1 ml 100 ml 0.05 1 mg/l 5 ml 100 ml 0.01 1 mg/l 1 ml 100 ml

222 )()()( VolFlaskpipetteCstockC RSURSURSURSU


ตารางท 9 ผลการค านวณคา Relative Standard Uncertainty ของสารละลายมาตรฐานทความเขมขนตางๆ

แลวค านวณคาความไมแนนอนจากสารละลายมาตรฐาน ดวยสตร

ดงแสดงในตารางท 10 ตารางท 10 การค านวณคา Standard Uncertainty รวมของความเขมขน RSUC (RSUC)

2 RSUC1 0.004748445 0.000022547 RSUC0.5 0.004323887 0.000018695 RSUC0.1 0.005510892 0.000030370 RSU C0.05 0.005149583 0.000026517 RSU C0.01 0.006063178 0.000036761 2)( CRSU 0.000337661

RSUCalstd 0.0183755

11.2.3.3 หาคาความไมแนนอนจากปรมาตรของตวอยางทเตรยม : U(V ) (ก) ความไมแนนอนของเครองแกวจากการสอบเทยบ (Calibration) ใชคา uncertainty จากการสอบเทยบ หรอใชคา tolerance limit ของเครองแกว ในกรณน ใชคา tolerance limit ของเครองแกว เครองแกวทใชคอ Volumetric Flask 50 ml Class A มคา torelance limit ± 0.06 ml มการกระจาย แบบ triangular ดงนน

UVtol = 6

tolerance = 6

06.0 = 4494897.2

06.0 = 0.0245 ml

(ข) ความไมแนนอนของการใชเครองแกว ใชคา repeatability (คา SD) จากการท าซ าของผวเคราะห

UVrep = SD = 0.00605 ml.

สารละลายมาตรฐาน mg/l

RSUCstock RSUpipette RSUFlask RSUC

10.00 0.00288675 0.00247837 0.000499900 0.003837386 1.00 0.003837386 0.00275178 0.000499900 0.004748445 0.50 0.004748445 0.00192888 0.000499900 0.004323887 0.10 0.004323887 0.00247837 0.000499900 0.005510892 0.05 0.005510892 0.00192888 0.000499900 0.005149583 0.01 0.005149583 0.00247837 0.000499900 0.006063178

2

01.0

2

05.0

2

1.0

2

5.0

2

1 )()()()()( CCCCCCalstd RSURSURSURSURSURSU


(ค) ความไมแนนอนจากอณหภม อณหภมหองปฏบตการ 25 ± 3 °C

UVtemp = 3

350101.2 4

= 7320508.1

350101.2 4

= 0.018187 ml รวมความไมแนนนอนของปรมาตรของตวอยาง

U(V) = 222

VtempVrepVtol UUU = 222 )018187.0()0060.0()0245.0( = 0.03105 ml

11.2.3.4 หาคาความไมแนนอนจากการชงตวอยาง : U(W) (ก) ความไมแนนอนจากการสอบเทยบเครองชงใชคาความไมแนนอนทไดจากการสอบเทยบ เครองชง

UWcal = ± 3/000095.0 =0.0000548 g (ข) ความไมแนนอนของการชงใชคา SD ทผวเคราะหทดลองชงน าหนก 2 g ซ ากน 10 ซ า

UWrep = 0.000013 g ดงนน คาความไมแนนอนของการชงทมการ tare , m(tare) และ m(gross) คอ U(W) = 22 )(2)(2 WrepWcal UU

= 22 )000013.0(2)0000548.0(2 = 0.00008 g 11.2.3.5 ความไมแนนอนจากการท าซ า : U(pre)

ความไมแนนอนจากคา precision ใชคา SD ของ recovery จากขอมลการท า method validation

U(pre) = rsdpooled = 0.0457654 11.2.4 การค านวณคาความไมแนนอนมาตรฐานรวม(Calculating the combined standard uncertainty) ความไมแนนอนของผลวเคราะหแคดเมยม ทมาจากแหลงความไมแนนอน 5 แหลง คอ ความไมแนนอนจากความเขมขนทวดไดจากสมการ least square linear calibration curve จากเครองแกววดปรมาตรจากเครองชงน าหนก ความไมแนนอนทเกดจากการเตรยมสารมาตรฐานทความเขมขนตางๆ และจากการท าซ า ตามทค านวณคาความไมแนนอนไดในขอ 11.2.3 น าคามาค านวณหาความไมแนนอนมาตรฐานรวม โดยใชสตรการรวมคาความไมแนนอนดงน


ตารางท 11 สรปผลการหาปรมาณคาความไมแนนอนของผลการวเคราะหแคดเมยมดวยเครอง ICP-OES แหลงของความไมแนนอน คา SU(x) RSU(x)

= SU(x)/x 3.1 C0 : ความเขมขนทวดได 0.2236894 3.2 การท า dilution 0.0183755 3.2 V sample : ปรมาตรตวอยาง 50 ml 0.03105 ml 0.0006210 3.3 W sample: น าหนกตวอยาง 2.0080 g 0.00008 g 0.0000398 3.4 Precision: การท าซ า 1 0.0457654 0.0457654

ค านวณคา combined standard uncertainty ไดดงน RSUCcd = √ (RSUCo)

2 + (RSUstd)2+(RSUv)

2+(RSUw)2+(RSUpre)2

RSUCcd = √ (0.2236894)2+(0.0183755)2+(0.0006210)2+(0.0000398)2+(0.0457654)2 RSUCcd = 0.22444 ถา C = ปรมาณแคดเมยมทมในตวอยางไดจากการทดสอบ=0.473 mg/kg UCcd = C*0.22444 = 0.473*0.22444 mg/kg = 0.10616 mg/kg 11.2.5 การหาคาความไมแนนอนขยาย

ค านวณคา expanded uncertainty, UE โดยคณคา combined standard uncertainty ดวย coverage factor k ซงเทากบ 2 ทระดบความเชอมน 95 % UE = 2 UCcd = 2*0.10616 = 0.21232 mg/kg

11.2.6 การรายงานคาความไมแนนอนของการวด การรายงานคาความไมแนนอนของการวด รายงานตามรปแบบดงน - ส าหรบภาษาไทย แคดเมยม : (0.47 ± 0.22) mg/kg* *คาความไมแนนอนทรายงานเปนคาความไมแนนอนขยาย ค านวณโดยใชคา coverage factor = 2 ซงใหระดบความเชอมน 95 % - ส าหรบภาษาองกฤษ

Cadmium: (0.47 ± 0.22) mg/kg* *The reported uncertainty is an expanded uncertainty calculated

using coverage factor of 2 which gives a level of confidence of 95 %.

12. การควบคมคณภาพ - 13. การบนทกขอมลและเอกสารทใช - 14. การรายงานผล รายงานคาความไมแนนอนของการวดในกรณทลกคารองขอ


15. รายละเอยดอนๆ - 16. เอกสารอางอง 16.1 BIPM/IEC/IFCC/ISO/ OIML/IUPAC/IUPAP. 1995. Guide to the Expression of Uncertainty in Measurement 16.2 (GUM) 1st Edition. ISBN 92-97-10188-9. 1995. International Organization for Standardization (ISO), Geneva, Switzerland 16.3 EURACHEM/CITAC. 2012. EURACHEM/CITAC GUIDE CG4 : Quantifying Uncertainty in Analytical Measurement 3rd Edition, available at www.eurachem.info

http://www.eurachem.info/

Documents

ค ำน ำ ISO/IEC - DLDqcontrol.dld.go.th/images/ejournal/ejournal 1-2560/images... · 2017. 9. 22. · 3.2 วิธีทดสอบทางเคมี 105 3.2.1 วิธีทดสอบหาปริมาณแคดเมียมในอาหารสัตว์