7.Pemeriksaan Lab Diagnosis Cepat TB

5/14/2012

1

On the Move Against Tuberculosis, Transforming the Fight Toward Elimination of Tuberculosis


Pemeriksaan Laboratrium Diagnosis Cepat TB

Dalima Ari Wahono Astrawinata Divisi Mikrobiologi dan Infeksi

Departemen Patologi Klinik FKUI Laboratorium Klinik Pusat RSCM


DalimaAW/PatKlin/TBDay/Aprl12 2

Pendahuluan • Diagnosis TB ditegakkan atas dasar :

– Keluhan dan anamnesis – Klinis – Radiologik dan Laboratorium

• Pemeriksaan Laboratorium : – Sputum – Cairan tubuh lain : cairan otak, cairan pleura – Darah, urin, feses

• Masalah timbul tidak ditemukan dari sediaan hapus • Lanjut dengan biakan perlu 4-6 minggu • Alternatif pemeriksaan lebih cepat yang tersedia ??

5/14/2012

2



Alur pemeriksaan Lab

Biakan

PCR MTb Positip Negatip

Rapid Test Ag MTb Positip Negatip

Pemeriksaan Sediaan Langsung BTA 3x (ZN) Positip Negatip



Persyaratan PraAnalitik

• Kualitas sputum memenuhi syarat :

– Bukan saliva / ludah

– Tidak terkontaminasi saliva / ludah

– Dibatukkan dengan tekanan dari dalam

• Edukasi pasien cara penampungan :

– Kumur air matang dengan seksama 3x

– Tarik napas dalam 3x

– Tahan napas pada tarikan ke 3 sesaat

– Batukkan dengan tekanan

5/14/2012

3



• Waktu penampungan 3x : – Sewaktu ( ketika di Poli ) – Pagi ( bangun tidur, ditampung saat esok hari ) – Sewaktu ( waktu kembali ke Poli esok hari )

• Wadah penampungan : – Bersih, kering, mulut lebar, tutup ulir – Sebaiknya standar dari Lab

• Lokasi penampungan : – Di tempat terbuka, ada sinar matahari, udara bebas – Tidak boleh di WC / toilet / kamar mandi / kamar

tidur ruang periksa / ruang tertutup

Persyaratan PraAnalitik (lanjutan)



Tahapan Perwarnaan Manual Ziehl Neelsen

Sumber : Penuntun Pemeriksaan BTA, Lab RSPersahabatan

5/14/2012

4



Pelayanan Lab Klinik Pusat RSCM utk pemeriksaan sediaan hapus

• Jam buka loket rawat jalan untuk pengambilan hasil s/d jam 18.00

• Loket pelayanan Cito Lab Klinik Pusat 24 jam untuk penerimaan bahan dan pengambilan hasil

• Sediaan hapus BTA tidak termasuk pemeriksaan cito

• Waktu pemeriksaan 1 hari , hasil keesokan hari



Pemeriksaan Rapid Ag MTb Prinsip : imunokromatografi (ICT) :

Anti-MTb berlapis emas melekat pd membran selulosa

Sumber : JD Biotech

5/14/2012

5



Antibodi terhadap protein RD1, RD2, RD3

RD5 (mpt40)Rv 2345

plcC plcB plcA PPE PPE

IS 61102625 2626 2627 2628 2629 2630 2631 2632 2633 2634 2635 26362624 kb

Rv 2346/47/48

ephA Rv3618 lpqG

Rv3616 Rv3619/20 PPE PE

RD8

4061 4062 406340604059405840574056 kb

RD10Rv0221 echA1

Rv0223

0265 0266 0267 02680264

Rv0224

kb

RD9

Rv2075/76

Rv2074

Rv2073cobLcobM

2330 23332329 23322331 kb

RD12

3483 3484 3485 3486 3487 3488 3489moeB

3490 kbcys3A

sseCmoaE

Rv3120/21/22/23 Rv3124RD13

1401 1402 1403 1404 1405 1406deaD

1407 kbRv1254

Rv1255

Rv1256 Rv1257 Rv1258RD11 (phiRv2)

Rv2645/46/47 IS 6110

Rv2650/51 Rv2652/53/54 Rv2655/56/57/58/59/60/61

glyT cysT valU

valTRv2644

2970 2971 2972 2973 2974 2675 2976 2977 2978 2979 2980 2981 kb2969

RD3 (phiRv1)

REPÊÕ

Rv1573/74/75

Rv1576/77/78 Rv1579/80/81 Rv1582/83/84/85 / 86 REP

bioB17801779 1781 1782 1783 1784 1785 1786 1787 1788 1789 1790 kb

bioD 1778

Rv1571

oriC

Mycobacterium bovis BCG Pasteur 1173 P2

PPEPPEPPE

Rv3424alr IS 1532

RD6

3841 38443842 3843 3845 3846 3847 3848 kb

Rv3430

RD1PE/PPE

4359 4360 4361 kb4351 43544352 4353 4355 4356 4357 43584349 4350Rv3871 Rv3874 esat6 Rv3876 Rv3878

Rv3879 Rv3880/81

Rv3877

Rv1771200019991998 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 kb

Rv1766/67

IS9ÕRv1765

Rv1770Rv1769PE_PGRS

Rv1772 Rv1774

Rv1773

RD14

RD4

gmdA epiA Rv1513

Rv1514/15 Rv1516

Rv1517

Rv1508

Rv1509 Rv151017001699169816971696 1701 1702 1703 1704 1705 1706 1707 1708 1709 kb

Rv1505/06/07

kb

RD7 RD2

Rv1965Rv1964 mce3 Rv1967 Rv1968 Rv1969 lprM Rv1971/72/73/74/75

Rv1976

Rv1977 Rv1978

Rv1979 mpt64 nrdF Rv1982

PE-PGRS

Rv1984 Rv1985

Rv1986 Rv1987/882208 22092207 22202219221822172216221522142213221222112210 2221 2222 2223 2224 2225 2226 2227 2228 2229 2230 2231 2232

Rv1963 Rv1989

Sumber : JD Biotech



• Tidak bereaksi terhadap vaksinasi BCG

• Tidak bereaksi terhadap NTM

(Non-Tuberculosis Mycobacteria)

• Menggunakan antibodi terhdp protein spesifik MTb

RD1,RD2,RD3 (Region of Difference) yang tidak ditemukan dlm BCG

• RD 1 (early secretory antigen target 6 / ESAT-6) dan culture filtrate protein 10 /CFP10)

• RD2 (segmen 10.7-kb DNA dan gen MPT-64)

• RD3 (genom segmen 9.3-kb kuman laboratorium M. bovis dan M. tuberculosis) Sumber : JD Biotech

5/14/2012

6



• Bahan : sputum, cairan otak, cairan pleura, darah, urin

• Sensitivitas dan spesifisitas ( > 96%)

• Cepat, pengerjaan sekitar 15 menit

• Mudah dan sederhana

CATATAN :

• Tidak dianjurkan untuk pasien yang sudah mendapat terapi OAT ( tidak untuk monitoring hasil terapi )

• Harus sputum segar, tidak boleh sputum yang sudah diproses dg NaOH pH alkali merusak reagen

Sumber : JD Biotech



Model strip

5/14/2012

7



Model kaset



Hasil Trial MTb Ag Rapid Tes Lab Klinik Pusat RSCM

Hasil BTA Rapid TbAg

PCR

+ 6 6 6

- 11 11 11

Total 17 17 17 Kesesuaian ~ 74 %

Frida. Penelitian pendahuluan Rapid TbAg pada pasien tersangka TB, Dep Patologi Klinik FKUI/RSCM, 2011

5/14/2012

8



Hasil Trial MTb Ag Rapid Tes Lab Klinik Pusat RSCM Hasil BTA Rapid

TbAg PCR

+ 3 1 5

- 3 5 1

Total 6 6 6 Ketidaksesuaian ~ 26 % Sudah mendapat OAT ?

Frida. Penelitian pendahuluan Rapid TbAg pada pasien tersangka TB, Dep Patologi Klinik FKUI/RSCM, 2011



Polymerase Chain Reaction (PCR) RealTime

Spesimen

(sputum,bilasan bronkial, c.otak, urin, feses,darah,c,pleura)

DNA

Analisis

Isolasi asam nukleat

Amplifikasi DNA

5/14/2012

9



• PCR-RT multipleks amplifikasi NTM, MTB

• Tidak membedakan MTB kompleks yg terdiri

atas M.tuberculosis, M.bovis, M.bovis BCG,

M.africanum, M.microti, M.canetti, M pinnipedii

Prinsip MTB/NTM PCR-RT

Sumber : Seegene Anyplex R MTB/NTM



Prinsip MTB/NTM PCR-RT • Amplifikasi DNA menggunakan prinsip dual priming

oligonucleotide (DPO) susunan primer lebih leluasa, primer non-spesifik di blok

• PCR-RT berdasarkan 2 proses utama :

– Isolasi asam nukleat (DNA)

– Amplifikasi asam nukleat (DNA) sasaran memakai primer DPO dg alat PCR real time (RT)

• Kontrol internal (DNA plasmid) utk deteksi kemungkinan proses amplifikasi PCR terganggu

• 8-metoksipsoralen (8-MOP) menghentikan aktivitas template DNA kontaminan

Sumber : Seegene Anyplex R MTB/NTM

5/14/2012

10



TB/MDR PCR-RT Spesimen

(sputum, darah,urin, c.otak,c.pleura dll)

Asam nukleat (DNA)

Produk PCR

Deteksi dgn alat PCR-RT

Ekstraksi asam nukleat, 1 jam

Amplifikasi, Multipleks PCR 2,5jam

Deteksi RT amplikon, 40menit

Sumber : Seegene Magicplex R TB/MDR-RT



• PCR-RT multipleks amplifikasi simultan MTB,

Resisten - Isoniazid dan Resisten - Rifampicin

TB/MDR PCR-RT

Sumber : Seegene Magicplex R TB/MDR-RT

5/14/2012

11



• Amplifikasi DNA menggunakan prinsip dual priming oligonucleotide (DPO) susunan primer lebih leluasa, primer non-spesifik di blok

• Teknologi READ (REal Amplicon Detection) proses PCR multipleks memakai primer DPO (alat PCR konvensional) dan deteksi amplikon (hasil amplifikasi) langsung selama proses cycling (alat PCR-RealTime)

• PCR-RT berdasarkan 3 proses utama : – Ekstraksi asam nukleat – Amplifikasi asam nukleat sasaran memakai primer

DPO dgn alat thermal cycler – Deteksi produk amplikon memakai alat PCR real time

Prinsip TB/MDR PCR-RT



Hasil Penelitian PCR-RT dg BTA pasien tersangka TB

Hasil BTA PCR-RT

MTB 11

MTB/NTM 2

Positip 9

Negatip 16 12

Frida. Pemeriksaan PCR-RT sputum pasien tersangka TB. Dep PK,2011

5/14/2012

12



Penutup

• Beberapa pemeriksaan cepat untuk membantu diagnosis TB telah tersedia

• Kegunaan dan keterbatasan masing-masing perlu dipahami dengan benar



Documents

7.Pemeriksaan Lab Diagnosis Cepat TB