Zentralbl. Mikrobiol. 145 (1990), 269-275VEB Gustav Fischer Verlag Jena

[Institut fiir Biotechnologie Potsdam der Akademie der Landwirtschaftswissenschaften der DDR]

Ergebnisse zur Aufbereitung von Schweinegiille als Substrat fiir biotech­nologische Stoffwandlungsprozesse

Results of theImprovement of LiquidSwineManureas a Substrate for the Biotechnolo­gical Conversion Process

R. M ARX, M. KOHL, J. KLEIN

Mit 5 Abbildungen

Key words: Biotechnological conversion process, liquid swine manure , cultures of clostridium species . batchfermentations , production of fatty acids

Summary

Pure and mixed cultures of Clostridium Spec. were tested in sterile and nonsterile batch fermentations in order toincrease the content of short chain fatty acid in different liquid swine manure substrates. Fatty acid concentrations of15 gil were reached by a thermochemical pretreatment of the substrates and the application of a mixed culture of Cl.acetobutylicum, Cl. butyricum and Cl. paraputrificum. The distributions of Cz-Cs fatty acids were determined .

The results represent the basis to intensify the process of the biotechnological conversion of liquid swine manure .

Zusammenfassung

Zur Anreicherung von niedermolekularen Fettsiiuren in unterschiedlichen Giillesubstraten wurden Rein- undMischkulturen von Clostridium spec. in sterilen und unsterilen Batchansiitzen getestet. Uber MaBnahmen einerchemisch-thermischen Substratvorbehandlung wurden mit einer Miscltkultur von Cl. acetobutylicum, Cl. butyricumund Ct. paraputrificum Fetlsiiureanreichcrungen bis 15 gil erreicht und die Vcrtcilung der Anteile von C2 bis C,bestimmt.

Die Ergebnisse sind Ausgangspunkt zur Intensivierung biotechnologischer Stoffwandlungsprozesse auf derSubstratbasis von Giille.

Zu einer Verwertung von Schweinegulle als organischer Dunger machen sich an Standorten vongroBeren industriemaBigen Tierproduktionsanlagen Aufbereitungsverfahren notwendig. Nebeneiner Geruchs- und Stickstoffentlastung der Giille konnen dabei Wertstoffe tiber biotechnologischeStoffwandlungsprozesse gewonnen werden. Mit Verfahren zur Biogasproduktion wurden bereitsgroBtechnische Anwendungen erreicht.

Der Prozef der Biogasbildung lauft in 2 Stufen abo Nach der Hydrolyse organischerInhaltsstoffe werden in der sauren Garung aus gelosten Substraten organische Sauren gebildet.Diese sind in der alkalischen Garung Substratgrundlage fur methanogene Mischpopulationen . Dadie Effektivitat des Biogasp rozesses maBgeblich durch die mikrobielle Verfiigbarkeit der Giille­inhaltsstoffe bestimmt wird , wurden die durchgefiihrten Arbeiten besonders auf die Hydrolyse- undSaurestufe konzentriert.

Die in der Schweinegiille vorliegenden Stoffgruppen sind im wesentlichen Cellulose , Hemi­cellulose, Lignin, Fette und Protein . Mit Ausnahme von Lignin konnte der Abbau allerStoffgruppen zur Bildung niederrnolekularer Fettsauren beobachtet werden. Diagnostische Arbe i­ten zur Mischpopulati on der Saurebildner im technischen ProzeB sind gegenwart ig nicht bekannt.

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Es wird davon ausgegangen, daB Spezies von Clostridium, die verschiedentlich aus Abwassernoder Giillen isoliert wurden (SHARMA und HOBSON 1985), maBgeblich an der Bildung niedermole­kularer Fettsauren beteiligt sind.

Die Isolate konnten den Clostridienarten Cl. butyricum, Cl. bifermentans, Cl. acetobutylicum,Cl. sporogenes u. a. zugeordnet werden. Bei den genannten, auf cellulosehaltigen Substratengepriiften Kulturen wurden in Langzeitversuchen cellulolytische Aktivitaten nachgewiesen (KHAN1977). IANOTTI et al. (1982) isolierte iiberwiegend Kokken und nur einen geringeren TeilClostridien mit jedoch proteolytischen Aktivitaten.

Bekannterweise bilden Spezies von Clostridium Fettsauren und Alkohole, in einigen Fallenauch Aceton und Propionat. Uber die Kultivierungsbedingungen konnen die Ausbeuten anGarprodukten gesteuert werden. In einer anaeroben Giilleautbereitung ist eine iiberwiegendeFettsaurebildung als konvertierbares Zwischenprodukt anzustreben. Uber Untersuchungen zurProduktbildung ausgewahlter Kulturen gibt die Zusammenstellung in Tab. 1 Auskunft.

Tabelle I. Ausgewahlte Angaben zur Produktbildung anaerober Kulturen.

Table I. Selected data regarding the production of anaerobic cultures.

Autor Kultur Substrat

(g)

Garprodukte

FeU­sauren

(g)

andere(Butanol,Aceton)(g)

Kulti­vierung

Cellulose

gulleirnmanente 2,5Mischkultur 5,0

11,525,3

GIRARD(1986)

MULLER(1980)

HEYNDRICKXu. a. (1986)YERUSHALMIU. VOLESKY(1986)

CI. buty­ricumCI. aceto­butylicumCI. buty­ricumCI. aceto­butylicum

Glucose

18,0

18,0

18,0

20,530,041,050,2

1,82 n. n.4,10 n. n.4,60 n. n.

11,10 n. n.

9,2 n. n.

1,2 5,4

9,5 n. n.

0,7 6,20,8 9,21,0 11,71,3 14

fed batch

nicht an­gegeben

kontinuier­lichbatch

n. n. nicht nachweisbar

Unter der Zielstellung einer Intensivierung der anaeroben Giilleautbereitung wurden mit denvorliegenden Untersuchungen ausgewahlte Kulturen auf geeignet erscheinenden Giillesubstratenzur Steigerung der Fettsaurebildung getestet.

Material nod Methode

Fiir die Untersuchungen wurden die Kulturen Clostridium acetobutylicum IMET 10869, Clostridium butyricumIMET 10890 und Clostridium paraputrificum IMET 10865 verwendet. Anziichtung, Anreicherung und Stammhal­tung erfolgten auf Leber-Bouillon nach TAROZZI. Zur Oberpriifung der Reinheit der Kulturen und der Fermentations­ansatze diente ein modifizierter Hefeextrakt-Glucose-Cystein-Blutagar bzw. Thioglykolatnahrboden. Die Kultivie­rung erfolgte in einem Begasungsbrutschrank, der nach Evakuierung mit CO2 begast wurde.

SchweinegiiJle als Substrat 271

Fiir Batch-Fermentationsansatze wurden StandgefaBe (8 ml) und der FermenterLFS 112Mytron (Nettovolumen9 I) bei Thermostatierungauf 37°C verwendet. Die Beirnpfung der Substrate mit der jeweiligen Kultur erfolgte imVerhaltnis I: 10. Die Clostridien-Mischkultur setzte sich zu gleichenVolumenanteilen aus den o.g. drei Reinkulturenzusammen. Ais Substrate wurden Leber-Bouillon als optimaies fliissiges Kulturmedium und im Vergleich dazuverschiedene feststoffreiche Medien aus der GiiJleaufbereitung (Tab. 2) verwendet. Fugat (Fu) ist das fliissigeTrennproduktnach der Zentrifugationvon eingedicktemGiiJleschlamm. Das UF-Retentat(UF-Re) ist der Riickstandvon ultrafiltrierter Giillefliissigkeit. Zur Unterstiitzung der Hydrolyse erfolgte bei Verwendung von eingedicktemGiiJleschlamm (Se), der durch Sedimentationaus Rohgiillegewonnen wird, eine chemisch-thermische Vorbehand­lung iiber Zugabe von konzentrierter Salzsaure und Autoklavieren. Ziel dieser Behandlung war eine Zeriegung dervergieichsweise grobdispersen und inhomogenen organischen Bestandteile in monomere Kohlenhydrate.

Die wasserdampffliichtigen Fettsauen(wFS)wurdensummarischdurch Wasserdampfdestillation (als Essigsaure­aquivalent ausgewiesen) und in speziellen Ansatzen gaschromatographisch analysiert. Die organische Trockensub­stanz wurde als Gliihveriust bestimmt. Dabei muB beriicksichtigtwerden, daBdurch Amrnoniakveriuste ein Fehlergegeniiber der exakten differenzierten Bestimmungorganischer Stoffgruppen auftreten kann. Zur Vergleichbarkeitder Produktbildungsleistung in unterschiedlichen Versuchsansatzen wurde ein relativer Produktbildungsfaktor alsQuotient von gebildeter Fettsaure (wFS) und abgebauter oTS definiert.

Tabelle 2. Chemische Charakterisierungder verwendetenGiillesubstrate (Angaben in g/kg Originalsubstanz).

Table 2. Chemical characteristic of the used liquid manure substrates (datas in g/kg originalsubstance).

Substrat n

Fu 20UF-Re 5Se (chem.-therm. 10Vorbehandlung)

TS

19,529,488,4

oTS

15,323,864,65

wFs

4,24,8

3,5

RP KH

6,7 1,0611,2 n. b.11,4 22,4

TS - Trockensubstanz, oTS - organische TS, RP - Rohprotein, KH ­Kohlenhydrate,wFS - wasserdampffliichtige Fettsauren, Fu - Fugat, UF-Re ­

Retentat der Ultrafiltration, Se - Giilleschlammn. b. - nieht bestimmtn - Anzahl der Wiederholungen

Tabelle 3. Abbau von Giillesubstrat(Fu) und Fettsaurebildung durch Clostridium spec. (batch, steril, 37°C, 10d).

Table 3. Degradation of liquid manure substrate (Fu) and production of fatty acids by clostridium species (batch,sterile, by 37°C, 10 days).

Kultur Substrat (Fu) Fermenterablauf relativer

pH oTS wFS pH oTS wFSProduktbildungs-faktor

-g/l- -g/l- -g wFS/g oTS-

CI. aceta- 7,65 13,6 5,48 6,74 11,6 7,21 0,86butylicum

CI. para- 7,49 12,2 5,18 6,71 8,7 7,48 0,66putrificum

CI. buty- 8,15 16,22 4,02 6,74 12,0 7,86 0,89ricum

CI.-Misch- 1S,.31 17,'1 4,20 0,92 15,0 0,59 0,78

kultur

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Ergebnisse und Diskussion

Die Eignung von Schweinegiille als Substrat fur Clostridien wurde am Beispiel von ct. aceto­butylicum und Fugat (steril, Nettovolumen 8 ml) getestet. Nach einer Garungszeit von 7 Tagenkonnte eine Erhohung der Fettsaurekonzentration von lediglich 0,52 gil nachgewiesen werden. ImParallelansatz in Leberbouillon wurde ein zehnfach hoherer Konzentrationsanstieg beobachtet(Abb. I). Aus Anstieg und Verlauf der zeitabhangigen Konzentrationsanderung ist auf eine zeitlich

6 FS [g/l I4r-----,-----r-----,

A

5 10 15Fermenlol ionsze il in d

2

21---+- - / -+----+---i

3

4 f---+----+--/ '-+------l

6 FS [g/l)6 r-----r- - - ---. - -l-- -,-- - ---,

3 1--- - -

5

7oL.....:::::'=::=.2.-_ l--i----.L_ .L..--.Jo 2 3 4 5 6

Fermenlol ionsze il in d

Niihrmed ien : CD • Torozzi - Bouillon(?) 0 Dekonlerfugol

CD 0 Cl. ocelobutyl icum@ . Cl. poropulr ificum@ A Cl. buly;icum@ 0 Mischkullur (Cl. ocelobulyl icum

Cl. poropulrif icum Cl. bulyricum I

Abb. I. Fettsiiureproduktion yon Clostridium acetobutylicum in Fugat und Tarozzi-BouiIlon (batch, 37°C, 6 d).

Fig. I. Production of fatty acids by clostridium acetobutylicum within liquid swine manure and Tarozzi-broth (batch,by 37°C, 6 days).

Abb. 2. Fettsiiureproduktion yon Clostridien species in Fugat (batch, steril, 37°C).

Fig. 2. Production of fatty acids within liquid swine manure by clostridium species (batch, sterile, by 37°C).

verzogerte Hydrolyse der organischen GiilIeinhaltsstoffe und ebenso auf eine langere Adaptions­phase der Saurebildner an GiilIesubstrate zu schlieBen.

Im vergleichenden Test der einzelnen Clostridienspezies und der daraus erhaltenen Mischkulturauf Giillesubstrat (Fu) wurde unter optimierten Fermentationsbedingungen im LFS 112 die hochsteZunahme an niedermolekularen Fettsauren wahrend der ersten 5 d erreicht (Abb. 2). DieKonzentrationsabnahme nach 10 d wird auf eine verstarkt einsetzende Produktion von organischenLosungsmitteln (Aceton, Butanol) zuruckgefuhrt. Die Ursache dafiir ist die mit zunehmenderSauerung einhergehende Bildung von Enzymen, wie Acetacetat-Decarboxylase. Mit der Decar­boxylierung eines Teils des Acetacetats geht ein potentieller H-Acceptor verloren, der zwangsweiseauf andere H-Acceptoren iibertragen wird, darunter auch auf die bereits ausgeschiedene Buttersaure(SCHLEGEL 1976). Mit dem erreichten Konzentrationszuwachs von 3,84 gil wFS zeigte sichct. butyricum den beiden anderen Ct. spec. und der Mischkultur (l,73 bzw. 2,31 gil wFS)iiberlegen. Aufgrund stark differenzierter Ausgangswerte der o'TS und wFS durch Versuchsansatzemit unterschiedlichen Giillesubstraten (Tab. 2) wurden vergleichende Betrachtungen tiber deneingangs definierten relativen Produktionsfaktor moglich. Uber die stochiometrischen Beziehun-

Schweinegiille a1s Substrat 273

gen konnen theoretisch zur Saurebildung aus einem Mol Gluco se drei bzw. vier Kohlenstoffatomegenutzt werden (KLASS 1984), was einem Produktionsfaktor von 0,5 bzw . 0,67 ents pricht. DieErgebnisse der Sauerungsversuche mit Giillesubstraten ergabe n zum Teil hohere Werte , womit aufeine effektive Subs tratverwertung geschluBfolgert werden kann, andererseits eine Verfalschung deroTS- Bestimmung durch einen erh6hten NH4-N-Gehalt im Substrat bestatigt wird. 1m Vergleichweist auch hier Cl. butyricum den hoch sten Stoffumsatz aus. Aus der Analy se der oTS-Bestandtei leReinprotein (RE) ,~-freies Rohprotein (RP) und Kohlenhydrate (KH) ergaben sich unterschied­liche Substratspezifizierungen. Obwo hl mit C/. butyricum die hochste Fettsaureproduktion erreichtwurde , lag der Kohlenhydratabbau lediglich bei 14 ,2 % (Abb. 3) . Protein wurde zu tiber 40 % des

t. FS [ gil l9,...-- - - ....-- - - -,-- - - --,

8~c

o

7 o

2015

CD 0 Fugal mil Mk (sl erill(i) . Fugal mil Mk (uns l erillQ).. Retental mil Mk (unsl eril, pH=6,0 I@ c chem.lherm. vorbehc ndettes Sub -

slrel (SEI mil Mk (unsl eril, pH=6.0 1

29.4 44.4 46,6RP RE KH

r--

f- - - . - f--- - 1-

- - .. - - - - 1-

- - .. - - - - I-...:.:

f- - -O- f- - - I-

"

- '- ~

10

42,1 47,7 14,2RP RE KH

o

30

40

Abbaurale [ % I50

CJ Cl. bulyricum ~ Mischkullur(Cl.acelobuly l icum,Cl.parapulr if icum,Cl.bulyricum )

Mk : (Cl. acelabulylicumCl. parapulr if icumCl. bulyr icum I

Abb. 3. Prozentualer Abbau der Komponenten NH4·freies Rohprotein (RP) , ReineiweiB (RE) und Kohlenhydrate(KH) durch Clostridi en species (batch , steril, 37 "C).

Fig. 3. Percentage degradation of ammonium nitrogen free raw and pure protein and carbohydrates by clostridiumspecies (batch. sterile. by 37 "C).

Abb. 4 . Fettsaureproduktion einer Clostridiell·Mischkultur auf unterschiedlichen Gullesubstraten.

Fig. 4 . Production of fatty acids within various liquid manure substrates by a mixed culture uf clostridium specie s.

Angebots verwertel , was auf eine iiberwiegend proteolytische Aktivitat, insgesamt aber auf eineungeniigende Subst ratverfiigbarkeit schliel3en 1aBt. Die Clostridienmischkultur zeichnete sichdurch eine verbesserte Kohlen hydratverwertung mit einem Abbaugrad von 46,6 % aus. DieProtcinverwertung ist dabei etwas geringer, insgesamt wird jedoch cin ausgewogenerer Substrat­abbau erreicht.

Ein Einsatz der Kulturen auf nativem Substrat ergab unler gleichcn Reaktionsbedingungen eingeringeres Maximum der Fettsaurekonzentr ation. Neben den hinsichtlich Struktur und Zusamrnen-

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setzung anderen Substratverhaltnissen muBgleichermaBen auf die Stoffwechseltatigkeit methano­gener Bakterien und auf eine Produktion organischer Losungsmittel durch andere, giilleimmanenteAnaerobier geschlossen werden.

Daraus ableitend wurden zur Intensivierung der Saurebildung mit der ClostridienmischkulturVersuchsvarianten mit statiertempH-Wert und veranderten Substratbedingungen getestet. Der pH­Wert wurde iiber CaCoJ-Zusiitze auf Werte urn 6,0 eingestellt als Giillesubstrate kamen UF­Retentat und chemisch-thermisch konditionierter Schlamm zum Einsatz. Ein Vergleich derFettsaurebildung aller Varianten zeigt Abb. 4. Die Saurebildung in Fugat erreicht ihr Maximumwiederum in den ersten 5 d mit einer relativen Konstanz der Endkonzentration (Abb. 1) bzw. einerFettsaureabnahme unter unsterilen Bedingungen (Abb. 2). Die bei der Substratsterilisation zu

Abb. 5. Entwicklung der prozentualen Verteilung nieder­molekularer Fettsauren in vorbehandeltem Substrat (Cl.­Mischkultur).

Fig. 5. Course of percentage distribution of law molecularfatty acids within pretreated substratum (mixed cultures ofclostridium species).

1510l d I

5

60f-----+---=~---_.;;;;;;:::___i

CFS[OfoI80r------,-------,---------,

erwartenden Strukturveranderungen der Giilleinhaltsstoffe ergaben keine Auswirkungen zu einemerhohten Substratumsatz. Eine wesentlich hohere Saurebildung innerhalb der ersten 3 d und einweiterer Konzentrationsanstieg bis zum 10. d konnte in UF-Retentat (Abb. 3) beobachtet werden.Die Ursache dafiir ist eine verbesserte Substrateignung durch die feindispersen oder kolloidenGiillepartikel mit einem erhohten Anteil an Protein. Eine ahnliche Substratverbesserung wird mitder chemisch-thermischen Vorbehandlung von Giilleschlamm (Abb. 4) erreieht. Es wurde wiebeim UF-Retentat eine hohe Saurebildung bereits in den ersten Tagen erreieht, die allerdings biszum 10. d anhielt. Hierbei werden als Substrat neben dem gleichfalls hohen Proteinanteil dasgroBere Potential an Kohlenhydraten in ihrer hydrolysierten Form wirksam. Es wurden damithohere Stoffumsatze erreicht, was in relativen Produktbildungsfaktoren von 0,7 -0,9 g wFS/g oTSzum Ausdruck kommt. Die pH-Statierung ermoglicht eine relativ stabile Endkonzentration derproduzierten Fettsauren, In der prozentualen Verteilung liegt der Essigsaureanteil (C2) inAbhangigkeit von der Fermentationsdauer mit 45-60 % am hochsten und fallt prozentual nach ca.7 d zugunsten von Propionsaure (CJ) und Buttersaure (C4) leicht ab (Abb. 5). Der Anteil vonValeriansaure (Cs) liegt unter 10 % und wird bis zum 7. Fermentationstag auf Null reduziert.

Die erzielten Ergebnisse stellen neue begriindete Ausgangspositionen zur Intensivierungbiologischer Stoffwandlungsprozesse auf der Substratbasis von Schweinegiille, besonders zurBiogasgewinnung, dar. Beim gegenwartigen Stand der Technik der zweistufigen ProzeBfiihrungvon Biogasanlagen liegen die Probleme im zeitlichen Verlauf der Sauerung, im SubstrataufschluBund der Riickhaltung der Saurebildner in der Sauerungsstufe. Da aus energetischer Sieht einchemisch-thermischer GiilleaufschluB nicht wirtschaftlich erscheint, sind alternative Moglich­keiten zur Hydrolyse von polymeren Substraten in Betracht zu ziehen. Denkbar ist die Suche nachadaptierten Organismen mit entsprechend geeigneten Enzymmustern oder ein AufschluB durch dieWirkung von Fremdenzymen. Zum ErhaIt der Saurebildner als definierte Mischkultur imkontinuierlichen ProzeB mit nativem Substrat in der erforderlichen Populationsdichte scheidenbekannte Methoden der Immobilisierung aufgrund der hohen Feststoffanteile weitgehend aus.Entsprechende Losungswege konnen jedoch aus neueren Entwicklungen von Anaerobreaktoren mitUrnlauffiihrung bei Beriicksichtigung geeigneter Trenntechniken abgeleitet werden und sindGegenstand weiterer Untersuchungen.

Schweinegulle als Substrat 275

Literatur

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Anschrift der Autoren: Dr.-Ing. R. MARX, Dipl.-Vet. med. M. KOHL, Pharm.-Ing. J. KLEIN, Institut furBiotechnologie Potsdam, Abt. Eberswalde, Lichterfelder Wassertorbriicke, Eberswalde-Finow, DDR - 1300.