MEDIOS DE AISLAMIENTO Y ENRIQUECIMIENTO Si se desea recuperar determinados m.o. de sus ecosistemas naturales (agua, tierra, alimentos, etc.) puede recrearse en el laboratorio un medio ambiente artificial que favorezca el crecimiento de ellos frente a otros m.o. que los acompaen en ese ecosistema. Se puede emplear un medio de cultivo y condiciones de incubacin (atmsfera, temperatura, pH) considerando las caractersticas fisiolgicas del m.o. buscado, para otorgarle ventajas frente al resto de m.o. de ese ecosistema. Pretendemos inhibir la mayor cantidad posible de m.o. no deseados, de manera que estos no interfieran durante el aislamiento de los que s interesan. Un esquema general para el enriquecimiento, aislamiento e identificacin de m.o. es el siguiente:

Fuente de inculo

Caldo de enriquecimiento

Aislamiento

Identificacin

Debemos realizar las siguientes consideraciones si deseamos detectar y aislar un determinado tipo de m.o. y simultneamente minimizar la interferencia de otros: Muestra Elegir la muestra adecuadamente. El m.o. que se est buscando debe ser factible de estar presente, ya sea si lo estamos buscando per se, o como contaminante. Debemos considerar si es til someter la muestra a un tratamiento previo. Cuanto mayor seleccin se realice en este paso inicial, menos selectivos debern ser los medios de cultivo a utilizar. Debemos comenzar con un enriquecimiento o aislar la muestra directamente? Si el m.o. que deseamos aislar est en un bajo nmero, se siembra la muestra en un caldo de cultivo que favorezca su multiplicacin (enriquecimiento). Cuando un enriquecimiento se realiza en un medio formulado para frenar el desarrollo de m.o. acompaantes no deseados, se denomina enriquecimiento selectivo. Cuando el m.o. deseado est en alto nmero, no se necesita realizar un enriquecimiento, y se puede sembrar la muestra en un medio slido adecuado directamente. Medio de cultivo Debemos realizar una formulacin adecuada de los medios de cultivo empleados. En general en las primeras etapas se utilizan medios de cultivo selectivos. Dicha selectividad se puede determinar ya sea, a) agregando un inhibidor de la flora acompaante, o b) haciendo el medio restrictivo al incluir un nutriente que slo el m.o. deseado sea capaz de utilizar. Debemos utilizar las condiciones de incubacin adecuadas: temperatura, luz, atmsfera (aerobia o anaerobia, atmsfera con concentracin de CO2, etc.). Los componentes del medio de cultivo que se pueden manejar son: Fuente de carbono. A modo de ejemplo, se podran quitar todos los compuestos orgnicos para permitir el crecimiento de m.o. auttrofos que son capaces de obtener su fuente de carbono del CO2 (que difunde de la atmsfera al medio o por agregado de bicarbonato). O incluir exclusivamente una fuente de carbono particular, por ej, fenol si queremos aislar degradadores de ese compuesto. Fuente de nitrgeno. Se puede omitir el agregado de fuente nitrogenada (orgnica u inorgnica) para permitir el crecimiento de fijadores libres de nitrgeno, que son capaces de obtener su fuente de nitrgeno del N2 atmosfrico. Fuente de energa. Si no se agrega ningn compuesto capaz de ser utilizado como fuente de energa y se incuba a la luz, slo crecern los m.o. fotosintticos que usan la luz como fuente de energa. Se pueden agregar o no compuestos que sean utilizados como factores de crecimiento (vitaminas, aminocidos, cidos nucleicos, cidos grasos, etc.) segn se necesiten o no.

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PRUEBAS BIOQUMICASINDOL Introduccin El indol es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptofano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptofano con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de m.o. Principio La prueba de indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehdo del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de Kovacs descrito ms adelante. El medio de cultivo utilizado debe ser rico en triptofano. Medios y reactivos Caldo triptofano Peptona o digerido pancretico de casena Cloruro de sodio Agua destilada Reactivo de Kovacs Alcohol amlico o isoamlico p-dimetilaminobenzaldehdo HCl conc. 150 ml 10 g 50 ml

2g 0,5 g 100 ml

Procedimiento Inocular el caldo triptofano con el m.o. en estudio e incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Al finalizar este perodo, aadir 5 gotas de reactivo por la pared interior del tubo. Interpretacin El desarrollo de un color rojo intenso en la interfase del reactivo y el caldo, segundos despus de aadir el reactivo indica la presencia de indol y un resultado de la prueba positiva. Controles Escherichia coli: positivo Klebsiella pneumoniae: negativo (mayora de las cepas)

ROJO DE METILO - VOGES-PROSKAUER (RM VP) Principio Una de las caractersticas taxonmicas que se utilizan para identificar los diferentes gneros de enterobacterias lo constituyen el tipo y la proporcin de productos de fermentacin que se originan por la fermentacin de la glucosa. Se conocen dos tipos generales: la fermentacin cido-mixta y la fermentacin del 2,3 butanodiol. En la fermentacin cido mixta se forman fundamentalmente lctico, actico y succnico, adems de etanol, H2 y CO2. En la va del butanodiol se forman cantidades menores de cido (acetato y succinato) y los principales productos son el butanodiol, etanol, H2 y CO2. El rojo de metilo es un indicador de pH con un intervalo de viraje entre 6,0 (amarillo) y 4,4 (rojo), que se utiliza para visualizar la produccin de cidos por la va de fermentacin cido mixta. El acetil-metil-carbinol (o acetona) es un producto intermediario en la produccin de butanodiol. En medio alcalino y en presencia de oxgeno la acetona es oxidada a diacetilo. Este se revela en presencia de alfa-naftol dando un color rojo-fucsiaPg. 29

Medios y reactivos Caldo RM/VP Peptona Glucosa Fosfato dipotsico Agua destilada pH = 6,9 0,1

7g 5g 5g 1L

Indicador de pH rojo de metilo Rojo de metilo 0,1 g en 300 mL de etanol 95 Agua destilada 200 ml Revelador VP alfa-naftol (solucin al 5% en etanol 95) Solucin de KOH al 40% en agua destilada Procedimiento Inocular el caldo RMVP con un cultivo puro de no ms de 24 horas del m.o. en estudio. Incubar a 35C durante 48 horas. Luego de finalizado el tiempo de incubacin transferir 1 mL del caldo a un tubo limpio para VP. En el caldo restante revelar RM agregando unas 4 - 8 gotas del indicador rojo de metilo. Para revelar VP agregar 0,6 ml (10 gotas) de alfa-naftol al 5% y 1 gota de KOH al 40%. Agitar cuidadosamente para exponer el medio al oxgeno atmosfrico y dejarlo reposar durante 10 a 15 minutos. Interpretacin La prueba RM es positiva si se desarrolla un color rojo estable. Esto indica que la produccin de cido es suficiente para producir el viraje del indicador y el m.o. ferment la glucosa por la va de cido mixta. Un color anaranjado, intermedio entre el rojo y el amarillo no es considerado como positivo. La prueba VP es positiva si se desarrolla un color rojo-fucsia luego de 15 minutos, que indica la presencia de diacetilo, producto de oxidacin de la acetona. Controles RM positivo, VP negativo: Escherichia coli RM negativo, VP positivo: Enterobacter aerogenes UTILIZACIN DE CITRATO Introduccin La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono es una prueba til en la identificacin de enterobacterias. Principio La utilizacin de citrato como nica fuente de carbono se detecta en un medio de cultivo con citrato como nica fuente de carbono mediante el crecimiento y la alcalinizacin del medio. Este aumento de pH se visualiza con el indicador azul de bromotimol que vira al alcalino a pH 7,6.

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Medios y reactivos Medio de Simmons Fosfato dicido de amonio Fosfato dipotsico Cloruro de sodio Citrato de sodio Sulfato de magnesio Agar Azul de bromotimol Agua destilada c.s.p. pH = 6,9

1g 1g 5g 2g 0,2 g 15 g 0,08 g 1L

Procedimiento Se inocula la superficie del agar inclinado con una sola estra en el pico. Utilizar un cultivo de 24 horas en un medio slido y cuidando no arrastrar medio de cultivo, ya que se pueden producir falsos positivos por crecimiento a partir del medio de cultivo del inculo. Incubar a 35C durante 4 das. Interpretacin El ensayo es positivo cuando se observa crecimiento a lo largo de la estra, acompaado o no de un viraje del indicador al azul. Controles Positivo: Klebsiella spp. Negativo: E.coli DESCARBOXILACIN DE LISINA Y ORNITINA Introduccin La descarboxilacin de aminocidos es llevada a cabo por descarboxilasas y se forman aminas y CO2. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido y la reaccin es completa e irreversible. Los aminocidos ensayados habitualmente para la identificacin son lisina, ornitina y arginina. Principio El caldo descarboxilasa de Moeller es el medio base ms comnmente usado para la determinacin de las descarboxilasas en enterobacterias. Se prepara un tubo con el medio conteniendo el aminocido a ensayar y un tubo control con medio base sin aminocido. Se cubren con una capa de aceite mineral (vaselina lquida) para hacer el medio anaerobio de manera que ocurra la fermentacin de la glucosa que contiene. Durante las primeras etapas de la incubacin en ambos tubos se observar viraje del indicador de pH del medio al cido, por la fermentacin de la glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas que provocan un retorno al color original del medio o un viraje al alcalino. Medios y reactivos Base de Moeller Peptona Extracto de carne Glucosa Piridoxal Prpura de Bromocresol Rojo de cresol Agua destilada c.s.p.

5g 5g 0,5 g 0,005 g 0,01 g 0,005 g 1L

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pH final = 6,0 Caldo Lisina o Ornitina de Moeller: Preparar igual al medio base y agregar 10 g del aminocido (1% de concentracin final de la forma levo, utilizar el doble si se usa la forma dl del aminocido ya que solo la levo es activa). Agregar aceite mineral para formar una capa de 1 cm de espesor. Procedimiento Inocular con un cultivo puro de 24 horas un tubo de base de Moeller con el aminocido a estudiar (lisina u ornitina) y un tubo de la base (control sin aminocido). Incubar a 35C durante 18 a 24 horas. Interpretacin El ensayo puede ser ledo si en el tubo control se observa crecimiento y viraje del indicador al amarillo indicando que se dio la fermentacin de la glucosa y un descenso de pH que permite la activacin de las descarboxilasas. El retorno al color azul-violeta en el tubo que contiene el aminocido indica una reaccin positiva debida a la liberacin de aminas por descarboxilacin. Controles Descarboxilacin de lisina positiva: Enterobacter aerogenes Descarboxilacin de lisina negativa: Enterobacter cloacae Descarboxilacin de ornitina positiva: Serratia spp Descarboxilacin de ornitina negativa: Klebsiella spp.

FENILALANINA DESAMINASA Introduccin La fenilalanina es un aminocido que por desaminacin oxidativa forma un cetocido, el cido fenilpirvico. Slo los gneros Proteus y Providencia poseen la fenilalanina desaminasa, lo que permite diferenciarlas del resto de las Enterobacterias. Principio La prueba de la fenilalanina se basa en la deteccin del cido fenilpirvico luego del desarrollo del m.o. en un medio que contiene fenilalanina. Para eso se agrega cloruro frrico que forma un complejo de color verde con el cido fenilpirvico. El medio de cultivo no puede contener extractos de carne o peptonas por su contenido variable en fenilalanina. Medios y reactivos Agar fenilalanina DL fenilalanina Extracto de levadura Cloruro de sodio Fosfato de sodio Agar Agua destilada c.s.p. pH = 7,3 Cloruro frrico Cloruro frrico HCl concetrado Agua destilada c.s.p. 10 g 2,5 g 100 ml

2g 3g 5g 1g 12 g 1L

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Procedimiento Inocular el agar en pico de flauta con un cultivo puro de 24 horas e incubar a 35C durante 18-24 horas. Luego de transcurrido el perodo de incubacin, agregar 4 o 5 gotas de reactivo de cloruro frrico, directamente sobre la superficie del agar. Interpretacin La aparicin inmediata de un color verde intenso indica la presencia de cido fenilpirvico y una prueba positiva. Controles Positivo: Proteus Negativo: Escherichia coli

TSI (TRIPLE SUGAR IRON) Introduccin El agar triple azcar hierro es un medio nutriente y diferencial que permite estudiar la capacidad de produccin de cido y gas a partir de glucosa, sacarosa y lactosa en un nico medio. Tambin permite la deteccin de la produccin de H2S. Es un medio til para la identificacin de enterobacterias. Principio El agar se prepara en forma de pico de flauta. Esto determina que existan dos cmaras de reaccin dentro del mismo tubo. La porcin inclinada (pico) expuesta en toda su superficie al oxgeno es aerobia y la porcin inferior (fondo) est protegida del aire y es relativamente anaerobia. Al crecer un m.o. en el TSI, el pico tiende a virar al pH alcalino (color rojo por el rojo fenol) por la produccin de aminas, debido a la utilizacin aerobia de las peptonas. En el fondo del tubo -donde no hay oxgeno- la degradacin de peptonas es menor y no se generan aminas, de manera que se pueden detectar la produccin de pequeas cantidades de cido (color amarillo por el rojo fenol). Si se inoculan m.o. no fermentadores no se formarn cidos, pero por la produccin de aminas en el pico, todo el medio quedar rojo. La glucosa en el TSI est en una proporcin 10 veces menor que la lactosa y la sacarosa. Si el TSI es inoculado con una bacteria fermentadora de glucosa pero no de lactosa ni de sacarosa, la cantidad de cido producida por fermentacin ser baja (porque la cantidad de glucosa inicial es baja). En las primeras horas (10 a 16 hs) de incubacin se producir viraje del indicador al amarillo en todo el tubo (pico y fondo), pero al continuar la incubacin, el pico del tubo retornar al rojo por la produccin de aminas debida a la degradacin aerobia de las peptonas antes descrita. Si el m.o. fermenta la lactosa y/o la sacarosa, como las concentraciones de estos azcares son 10 veces mayores a la glucosa, se producir gran cantidad de cido (que no puede ser neutralizado por la produccin de aminas en la superficie), por lo tanto todo el tubo (pico y fondo) virar al color amarillo (cido). La produccin de H2S a partir de tiosulfato se pone en evidencia por precipitacin del sulfuro ferroso (negro). Como esta reaccin se da preferencialmente en medio cido, un ennegrecimiento del fondo del tubo (que puede cubrir todo el fondo del tubo y enmascarar el color amarillo) se lee como fermentacin de algunos de los azcares del medio. Adems puede observarse la produccin de gas (H2 y CO2), ya sea como burbujas en el fondo del tubo, por ruptura del agar o desplazamiento del mismo hacia la superficie.

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Medios y reactivos TSI Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Proteosa peptona Lactosa Sacarosa Glucosa Cloruro de sodio Sulfato ferroso Tiosulfato de sodio Agar Rojo fenol Agua destilada pH = 7,4 0,2

3g 3g 15 g 5g 10 g 10 g 1g 5g 0,2 g 0,3 g 12 g 0,024 g 1L

Procedimiento Inocular los tubos de TSI con punta (alambre recto). Para eso introducir la punta hasta 3 a 5 mm del fondo del tubo. Tras retirar la punta del fondo, estriar el pico con un movimiento hacia uno y otro lado. Incubar a 35 C durante 18-24 hs, pero no ms de 24 hs.. Interpretacin y Controles Para el TSI siempre se informa el resultado en el siguiente orden: pico, fondo, produccin de gas y H2S. Pico alcalino/fondo alcalino (Alc/Alc/gas-/H2S-) No hay fermentacin de azcares. Caracterstica de bacterias no fermentadoras como Ej. Pseudomonas sp Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S-) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas ni de H2S. Ej. Shigella spp. Pico alcalino/fondo cido (Alc/A/gas-/ H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas. No hay produccin de gas, si de H2S. Ej. Salmmonella typhi. Pico alcalino/fondo negro (Alc/A/gas+/H2S+) Glucosa fermentada, ni lactosa ni sacarosa fermentadas, produccin de gas y produccin de cido sulfhdrico. Ej. Salmonella spp. (la mayora de las especies de Salmonella). Pico cido/fondo cido (A/A) Glucosa y lactosa y/o sacarosa fermentadas. Puede producirse H2S o no. E.coli (A/A/H2S -) A estos resultados se les agrega el resultado de la produccin de gas. Ej. A/A/gas+/H2S-.

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LIA (LYSINE IRON AGAR) Introduccin Este ensayo permite diferenciar los m.o. que producen descarboxilacin o desaminacin de la lisina. Se puede detectar adems la produccin de H2S. Es muy utilizado en las tcnicas de bsqueda de Salmonella, principalmente para descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar en los medios diferenciales utilizados durante el aislamiento selectivo. Principio Durante las primeras etapas de la incubacin el fondo virar el indicador de pH del medio al cido (amarillo) por la fermentacin de glucosa. Luego, si el aminocido es descarboxilado se formarn aminas que provocan un retorno al color original del medio o hacia un viraje al bsico (color violeta). En la desaminacin se produce un cido carboxlico y NH3 y se visualiza en la superficie la aparicin de un color rojo intenso. La produccin de H2S a partir de tiosulfato se visualiza por la precipitacin de sulfuro ferroso de color negro. Medios y reactivos Peptona Extracto de levadura Glucosa L-lisina HCl Citrato frrico amnico Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua destilida pH = 6,7 0,2 Interpretacin y controles pico alcalino/fondo alcalino/H2S +, descarboxilacin de lisina positiva. Ej.: Salmonella choleraesuis. pico rojo/fondo cido/H2S-, desaminacin de lisina positiva, descarboxilacin de lisina negativa. Ej.: Proteus mirabilis. pico alcalino/fondo cido/H2S- descarboxilacin de lisina negativa. Ej. E. coli pico alcalino/fondo cido/H2S+ descarboxilacin de lisina negativa, produccin de H2S. Ej. Citrobacter freundii. 5g 3g 1g 10 g 0,5 g 0,04 g 0,02 g 15 g 1L

PRODUCCIN DE PIGMENTOS PARA PSEUDOMONAS SP. Introduccin La capacidad para producir pigmentos como pioverdina (fluorescena) y piocianina es una caracterstica importante para la identificacin de especies de Pseudomonas. Algunas de ellas elaboran slo fluorescena (ej. Ps. fluorescens) y otras ambos pigmentos (ej. Ps. aeruginosa). La piocianina solamente es producida por Ps. aeruginosa aunque no todas las cepas de esta especie la producen. Se han diseado medios de cultivo que potencian la elaboracin de uno de los pigmentos e inhiben la formacin del otro. Principio El medio King A (o Pseudomonas Agar P) potencia la elaboracin de piocianina mientras que el King B (o Pseudomonas Agar F) potencia la elaboracin de fluorescena e inhibe parcialmente la de piocianina. Estos pigmentos son solubles en agua y difunden al medio. La piocianina es un pigmento azul-verde mientras que la fluorescena es amarillo-verdoso y fluoresce cuando es expuesto a la luz UV (=254 nm). Existen pigmentos amarillo-verdosos producidos por algunas especies de Pseudomonas que no fluorescen.Pg. 35

Medios y reactivos King A Peptona 20 g Glicerol 10 g K2SO4 10 g MgCl2 1,4 g Agar 15 g Agua 1L

King B Proteosa Peptona Glicerol K2HPO4 MgSO4.7H2O Agar Agua

20 g 10 g 1,5 g 1,5 g 15 g 1L

Los medios se reparten en tubos, se esterilizan a 121C durante 15 minutos y se dejan solidificar inclinados. Procedimiento Inocular los tubos por estras. Incubar a 35C durante 24 hs. Interpretacin Observar al UV, la produccin de pigmento azul-verdoso en el medio King A y la de pigmento amarillo-verdoso, en el King B Controles Pseudomonas aeruginosa: King A + P. fluorescens: King A P. fluorescens: King B + P. stutzeri: King B -

DNASA - DESOXIRRIBONUCLEASA Introduccin La actividad desoxirribonucleasa (DNAsa) se ha demostrado fundamentalmente en los gneros Staphylococcus y Serratia y consiste en la propiedad de degradar el ADN a fracciones de menor peso molecular. Esta caracterstica se ha utilizado para identificar las especies de Serratia marcescens y Staphylococcus aureus. Weckman y Catlin demostraron la estrecha correlacin entre la produccin de DNAsa de los cultivos de Staphylococcus aureus con la produccin de coagulasa. Principio Los m.o. DNAsa positivos degradan el DNA cuando son incubados en un medio que lo contiene. Esto puede ser visualizado de diferentes maneras: ya sea inundando las placas crecidas con HCl 0,1 N y observando zonas transparentes alrededor de las estras o incorporando al medio indicadores como azul de toluidina o verde de metilo (viran a rosado cuando el test es positivo). Medios y reactivos DNAsa agar Triptosa ADN NaCl Agar Azul de toluidina* Agua c.s.p. * o verde de metiloPg. 36

20 g 2g 5g 15 g 0,1 g 1L

Procedimiento Estriar la superficie de la placa e incubar a 35C durante 18-24 horas. Observar el viraje del indicador a rosado alrededor de las estras. Interpretacin Un resultado positivo est dado por el viraje del indicador en la zona de la estra a rosado. Controles Positivo: S.aureus y Serratia marcescens Negativo: S.epidermidis:

COAGULASA Introduccin La coagulasa es una enzima proteica con actividad semejante a la protrombina, capaz de transformar el fibringeno en fibrina, provocando la formacin de un cogulo visible en un sistema analtico adecuado. Se cree que la coagulasa funciona in vivo, produciendo una barrera en el sitio de infeccin estafilocccica. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. Principio La coagulasa se halla presente en dos formas, libre y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas de determinacin diferentes: Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija est unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las clulas suspendidas en plasma (que contiene fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un cogulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina. Medios y reactivos Plasma coagulasa (Difco, o BBL) Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente. Procedimiento Prueba en portaobjetos Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensin cargada homognea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensin del m.o. Mezclar bien con el ansa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. Prueba en tubo Colocar aspticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estril. Aadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensin en suero fisiolgico de un cultivo en placa). Mezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en bao de agua a 37C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formacin de un cogulo visible.

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Interpretacin Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparicin de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija. Prueba en tubos: 1+: pequeos cogulos no organizados. 2+: pequeos cogulos organizados. 3+: gran cogulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ Controles Positivo: S.aureus Negativo: S.epidermidis:

PRUEBA DE LA BILIS ESCULINA Introduccin La prueba de la bilis-esculina est basada en la capacidad de ciertas bacterias, particularmente los estreptococos del grupo D, de hidrolizar la esculina en presencia de bilis al 1 o 4%. La esculina es, qumicamente, un derivado de la cumarina (6-b-glucsido-7-hidroxicumarina), que por su estructura pertenece a los glucsidos. Por definicin, stos estn constitudos por dos restos unidos por un puente de oxgeno. En el caso de la esculina, uno de los restos es una glucosa y el otro la 7hidroxicumarina (que no es un hidrato de carbono, y es denominado aglucona).

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Principio Las bacterias capaces de desarrollar en bilis y tambin hidrolizar esculina, producen glucosa y esculetina (7,7 dihidroxicumarina) y sta puede visualizarse en un medio con una sal de hierro, por formacin de un complejo marrn oscuro o negro. Algunos medios bilis-esculina incluyen tambin azida sdica para inhibir el desarrollo de organismos Gram negativos, transformndose en selectivos para estreptococos. Medios y reactivos Medio bilis-esculina Peptona Extracto de carne Bilis de buey Esculina Citrato frrico Agar Agua destilada

5g 3g 40 g 1g 0,5 g 15 g 1L

Procedimiento Se estra el organismo en estudio en placas o tubos en pico de flauta del medio bilis-esculina. Se incuba a 37C durante 24 horas. Interpretacin La esculetina difunde hacia el medio de agar por ser hidrosoluble. La reaccin es positiva si se observa un ennegrecimiento difuso del tubo o un halo marrn oscuro o negro alrededor de las colonias en placa. Controles Positivo: streptococo del grupo D Negativo: estreptococo no del grupo D

UREASA Introduccin La urea es una diamida del cido carbnico que puede ser hidrolizada con liberacin de amonaco y dixido de carbono. Principio La ureasa es una enzima que poseen muchas especies de m.o. que pueden hidrolizar urea de acuerdo a la siguiente reaccin qumica: Urea + 2H2O CO2 + H2O + 2NH3

El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, producindose alcalinizacin y aumento de pH del medio. Medios y reactivos El caldo urea y agar urea de Christensen son los dos medios mas comnmente usados en los laboratorios para la deteccin de la ureasa de m.o.

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Caldo de Stuart Extracto de levadura Fosfato monopotsico Fosfato disdico Urea Rojo fenol Agua pH = 6,8

0,1 g 9,1 g 9,5 g 20 g 0,01 g 1L

Agar urea de Christensen Peptona 1g Glucosa 1g Cloruro de sodio 5g Fosfato monopotsico 2 g Urea 20 g Rojo fenol 0,012 g Agar 15 g Agua 1L pH = 6,8 Procedimiento Inocular el caldo con una ansada cargada con el cultivo puro del m.o. o estriar la superficie del agar. Incubar a 35C durante 24 hs. Interpretacin Los m.o. que hidrolizan urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en 1 a 3 hs. Las especies mas lentas pueden requerir 3 o mas das. Caldo: una coloracin rojiza indica alcalinazacin e hidrlisis de urea Agar: una coloracin rojiza en el medio indica hidrlisis de urea positiva. Los degradadores lentos producen coloracin parcial (generalmente el pico), los rpidos producen coloracin en todo el tubo. Si no hay hidrlisis el medio permanece con el colo original (amarillo) y se observa crecimiento. Controles Positivo: Proteus sp Negativo: Escherichia coli

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PROBLEMAS TERICOS GENERALIDADES La identificacin de una cepa bacteriana requiere comparar las caractersticas de esa cepa con las caractersticas de las especies conocidas descritas. Esta descripcin se encuentra en el Bergeys Manual of Determinative Bacteriology. Las propiedades que usa para clasificar los procariotas en grandes grupos (secciones del Manual de Bergey) son las morfolgicas, el tipo de pared y la tolerancia al oxgeno. Esas son generalmente las caractersticas por donde se comienza la identificacin de una bacteria. Puede ocurrir que esta sea una nueva bacteria, en ese caso comparando con las ya descritas slo podremos decir que se parece mucho a una especie ya descrita pero que no pertenece a la misma. En la mayora de los anlisis de rutina en un laboratorio de microbiologa el problema que se presenta no es identificar una bacteria an no descrita, sino determinar si una cepa aislada pertenece o no a una especie de inters. El conocimiento de las propiedades de esa especie de inters se utiliza en el proceso de aislamiento para seleccionar especies con determinadas caractersticas. Por ej. si se quiere determinar si en una muestra de agua estn presentes estreptococos fecales (cocos Gram positivos anaerobios facultativos) utilizar medios y condiciones de incubacin tales que excluyan a otros grandes grupos de bacterias como los cocos Gram positivos anaerobios estrictos y durante su anlisis incubar aerbicamente. La informacin de la ecologa del m.o. aislado, es decir la muestra de la cual proviene, as como el proceso de aislamiento del mismo reducen considerablemente el espectro de especies posibles. Por ello, en el proceso de identificacin es posible que no necesite analizar todas las caractersticas que indica el Manual de Bergey. Otra razn por la cual el nmero de caractersticas a analizar puede reducirse es que en la mayora de los anlisis microbiolgicos se busca confirmar o descartar que la cepa aislada pertenece a una especie dada. Si la cepa no pertenece a la especie de inters, no es necesario identificarla. Por ej. si en una muestra dada para la cual se exige ausencia de Pseudomonas aeruginosa se aisla una bacteria que pertenece al gnero Pseudomonas pero no es de la especie P. aeruginosa, no es necesario determinar a que especie del gnero pertenece. Problema I (E.coli) Antecedentes Las bacterias de la especie Escherichia coli son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo hbitat natural es el intestino humano y de animales de sangre caliente. Las cepas de E. coli generalmente no son patgenas, sino indicadores de contaminacin fecal. Su presencia en una muestra implica que otros m.o. de origen fecal, incluyendo patgenos, pueden estar presentes en la misma. Slo algunas cepas de E.coli son agentes etiolgicos de infecciones gastrointestinales. Estas cepas patgenas entricas se diferencian entre si y de las no patgenas por su biotipo, generalmente asociado a la presencia de plsmidos. En los procedimientos de rutina de anlisis de especialidades farmacuticas y de alimentos se determina la presencia o el nmero de bacterias de la especie E.coli pero no se determina si esas cepas son potenciales patgenos entricos. Cuando hay sospecha de presencia de E.coli patgena se realiza una serotipificacin de un numero determinado de cepas aisladas y/o se envan a Centros de referencia. La contaminacin fecal puede originarse en las materias primas utilizadas en la elaboracin de un producto o por contaminacin durante o posteriormente al proceso de elaboracin. El nmero de bacterias generalmente depende del tipo de producto y proceso y determina el procedimiento que se realizar para aislar bacterias que pertenezcan a la especie E.coli. El otro factor que determina el procedimiento de aislamiento es la flora acompaante: la proporcin relativa de E.coli a las dems bacterias presentes y las propiedades fisiolgicas de esas otras bacterias. En muestras que se preparan a partir de materias primas que no deben tener contaminacin fecal (como medicamentos preparados a partir de materias primas sintticas) o en muestras en las cuales despus de su preparacin se ha realizado un proceso para disminuir la carga bacteriana (alimentos pasteurizados) se podra esperar un nmero muy bajo de E.coli. En esas muestras sePg. 41

realiza un procedimiento de bsqueda, en el cual por siembra en medios de enriquecimiento se aumenta el nmero de bacterias para despus realizar su aislamiento e identificacin. En muestras de origen natural (generalmente materias primas de origen natural como leche no pasteurizada, aguas presumiblemente contaminadas) se podra esperar un nmero mas alto de estas bacterias. En ese caso no se realiza la etapa de enriquecimiento sino que directamente se cuenta el nmero de estas bacterias empleando un mtodo de recuento de bacterias viables en un medio selectivo para E.coli. En ambos casos la etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no a la especie E.coli. Los procedimientos oficiales para su deteccin en alimentos y medicamentos generalmente llegan a esta etapa despus del aislamiento en medios selectivos y diferenciales. Los medios selectivos mas comunes utilizan inhibidores para las bacterias de origen fecal que acompaan a E.coli (como enterococos) o para bacterias que no son de origen fecal. Los medios slidos generalmente contienen sales biliares y cristal violeta y los medios lquidos que se emplean para el recuento por nmero ms probable de coliformes en alimentos y agua (Caldo Lauril Sulfato, Caldo Lactosa Bilis Verde Brillante y caldo Escherichia coli) contienen lauril sulfato de sodio o sales biliares y verde brillante. Estos medios son generalmente diferenciales porque tienen adems lactosa - E.coli fermenta lactosa y glucosa- y un modo para detectar su fermentacin (indicadores de cambio de pH) o la produccin de gas en medio lquido (campanas de Durham). Las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio puede detener el crecimiento de los otros m.o. contaminantes sin eliminarlos. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir el anlisis slo con las colonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especie que se busca aislar. EN ESTA COMO EN CUALQUIER OTRA IDENTIFICACION ES IMPORTANTE QUE CONOZCA LAS CARACTERISTICAS PRINCIPALES DE ACUERDO AL MANUAL DE BERGEY- DEL MICROORGANISMO QUE INTENTA IDENTIFICAR. Problema En jarabes preparados a partir de extractos naturales de plantas la Farmacopea Europea exige ausencia de E.coli en 1 mL de jarabe. Para realizar dicho anlisis se realiza un enriquecimiento en caldo lactosa, se aislan colonias de dos tipos en medio Mac Conkey incubado entre 43-450C: 1) colonias rojas con halo de precipitacin alrededor, 2) colonias incoloras sin halo de precipitacin. Cules son las colonias que podran pertenecer a la especie E. coli? Ud. recibir un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. Cmo crecera una cepa de E. coli en ese medio? Que ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser E. coli? Que otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepa que tiene en ese reaislamiento podra pertenecer a la seccin en la cual el Manual de Bergey ubica a E.coli? En que Familia se ubica a E. coli? Que propiedades debera determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma seccin? En que caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? Puede continuar con las etapas de identificacin? Si no puede, que procedimiento realizara? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias tpicas en el medio selectivo) indica la presencia probable de E.coli. Para la confirmacin se recomienda el test para la produccin de indol y otras pruebas bioqumicas. En qu consiste la prueba de indol? Qu resultado espera para esta prueba si fuese E.coli? Utilice la tabla de pruebas bioqumicas para Enterobacterias resumida del Manual de Bergey. (recuerde que el nmero que aparece en la tabla es el % de cepas que dan un resultado positivo para ese test en el total de cepas analizadas)

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Podra perderse alguna cepa de E.coli si realizara slo esta prueba? Es decir una cepa que, siendo E.coli, no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en la produccin de indol. La recomendacin de la American Public Health Association (APHA) para el anlisis de alimentos incluye tres pruebas adems del indol: Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato. Las 4 pruebas se resumen en la sigla IMViC (Indol, Metilo, Voges, Citrato). Qu cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas? En qu consisten estas pruebas? Qu resultados espera para E.coli? Los manuales de mtodos del APHA dan por identificada una cepa como Ecoli si el resultado de las pruebas IMViC es ++-- (Indol y Rojo de Metilo positivos, VP y Citrato negativos) o si es -+--. Podra perderse una cepa de E.coli en este caso? Podra darse el caso al revs, es decir que identifique como E.coli una cepa que no es? Problema II (Salmonella) Antecedentes Las bacterias del gnero Salmonella son bastones Gram negativos que no reducen sulfato cuyo habitat es el intestino humano y de animales. Aunque no todas las especies de Salmonella son igualmente patgenas, todas son importantes para la salud pblica, y por tanto el procedimiento de anlisis debe estar dirigido a recuperar cualquier especie que pertenezca a este gnero. En especialidades farmacuticas y alimentos a diferencia de muestras clnicas- se espera un nmero bajo de estas bacterias, que adems pueden estar fisiolgicamente daadas debido al procesamiento y almacenamiento de la muestra. Debido a ello en el anlisis de estas muestras se incluyen siempre etapas de enriquecimiento. El aislamiento generalmente se realiza en mas de un medio de cultivo (no todas las especies de Salmonella crecen en un solo tipo de medio slido). Los medios selectivos ms comunes utilizan inhibidores como el colorante verde brillante o sales biliares para bacterias que no son de origen fecal. Varios de estos medios son diferenciales porque tienen adems lactosa o xilosa y un modo para detectar su fermentacin (indicadores de cambio de pH) o lisina y la deteccin de la decarboxilacin. La etapa siguiente es determinar si las colonias aisladas pertenecen o no al gnero Salmonella. Las pruebas bioqumicas y la serologa se usan de rutina para la identificacin presuntiva en laboratorios de anlisis microbiolgico. La identificacin definitiva se realiza en centros de referencia por serologa. Recuerde que las colonias aisladas en medios selectivos no necesariamente son cultivos puros debido a que el inhibidor del medio no elimina los otros m.o. contaminantes. Se debe reaislar en un medio no selectivo para asegurarse de obtener un cultivo puro. En el reaislamiento se debe observar si hay colonias con una o varias morfologas y se debe proseguir el anlisis slo con las colonias con morfologa macro y microscpica caractersticas de la especie que se busca aislar. Problema En preparaciones farmacuticas que contienen plantas medicinales la Farmacopea Europea exige ausencia de Salmonella en 10 g de la preparacin. Para realizar dicho anlisis se realizan dos etapas de enriquecimiento: una en caldo lactosa y la siguiente en un caldo selectivo con tetrationato, bilis y verde brillante. A partir de all se aislan colonias en mas de un tipo de medio de cultivo selectivo: en uno de ellos, el Agar Verde Brillante (que tiene adems lactosa, sacarosa y rojo fenol), crecen dos tipos de colonias: 1) colonias que viran el medio a amarillo, 2) colonias incoloras que no viran el medio a su alrededor. Cules colonias podran pertenecer al gnero Salmonella? Ud. recibir un reaislamiento de una colonia sospechosa en medio Agar Lactosa Rojo Fenol. Cmo crecera una cepa de Salmonella en ese medio? Qu ensayos adicionales a la observacin de la colonia y de sus caractersticas en el medio de cultivo debe realizar en el momento para determinar si dicha colonia puede ser una especie de Salmonella?

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Qu otras propiedades puede deducir a partir de este crecimiento? De acuerdo a ellas, la cepa que tiene en ese reaislamiento podra pertenecer al grupo de bacterias en el cual el Manual de Bergey ubica a las especies de Salmonella? En qu Familia se ubica a las especies de Salmonella? Que propiedades debera determinar para distinguir esa Familia de las otras de la misma seccin? En qu caso puede afirmar que tiene un cultivo puro? Puede continuar con las etapas de identificacin? Si no puede, que procedimiento realizara? De acuerdo a la Farmacopea Europea, la cepa sospechosa que Ud. tiene hasta ahora (colonias tpicas en los medios selectivos) indica la presencia probable de bacterias del gnero Salmonella. La identificacin presuntiva se realiza con la prueba bioqumica llamada Tripe Sugar Iron (TSI). En que consiste esta prueba? Que resultados espera para las distintas especies del gnero Salmonella? Utilice la tabla de pruebas bioqumicas para Enterobacterias resumida. Podra perderse alguna cepa de Salmonella? Es decir una cepa que, siendo Salmonella sp., no la puede identificar como tal porque la cepa da un resultado atpico en esta prueba. La Farmacopea Europea recomienda la realizacin de otras pruebas bioqumicas y pruebas serolgicas para la identificacin definitiva. La recomendacin de la American Public Health Association (APHA) para el anlisis de alimentos sigue un procedimiento similar para enriquecimiento y aislamiento pero usa otras pruebas bioqumicas como la produccin de indol, y la descarboxilacin de lisina entre otras. Recuerde adems que, durante el aislamiento, se eligieron para la identificacin las cepas no fermentadoras de lactosa. Que cree que se logra incluyendo mas pruebas bioqumicas? En que consisten estas pruebas? Que resultados espera para las especies de Salmonella? Podra perderse alguna cepa de Salmonella en este caso? Podra darse el caso al revs, es decir que identifique como una especie del gnero Salmonella a una cepa que no lo es? Problema III (P. aeruginosa) Antecedentes En el curso de una investigacin epidemiolgica de varios casos de infeccin por Pseudomonas aeruginosa en una sala de atencin de quemados, se realizaron cultivos de los posibles fuentes o reservorios de la bacteria en el ambiente. Ud. recibir una placa de Agar Cetrimide sembrada con uno de los antispticos analizados, cultivada durante 24 horas a 37C, en aerobiosis. Se solicita que determine si el antisptico pudo ser el reservorio o fuente de la cepa de Pseudomonas aeruginosa que provoc los casos de infeccin. Qu tipo de medio de cultivo es el Agar Cetrimide? Las bacterias que crecen en l requieren factores de crecimiento? Requiere altas concentraciones de NaCl? A cul seccin del Manual Bergey corresponde la o las bacterias en estudio? Podra tratarse de una bacteria aerobia estricta? Como hara para confirmar que se trata de una bacteria aerobia estricta? Cul es el fundamento de los ensayos King A y King B? Si una cepa creciera en Agar Cetrimide con produccin de un pigmento difusible de color azul, realizara ambos ensayos?

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Es el antisptico analizado un posible reservorio de la cepa que caus las infecciones en los pacientes? El antisptico del cual se obtuvo este aislamiento fue una solucin de un compuesto de amonio cuaternario. Es posible suponer que fuera un reservorio para P. aeruginosa? Problema IV (S. aureus) Antecedentes Las bacterias pertenecientes a la especie Staphylococcus aureus son cocos Gram positivos, que pueden ser patgenos para el hombre. Las principales afecciones que producen son intoxicacin alimentaria, por produccin de una toxina termoresistente en alimentos, e infecciones de piel. Existen seres humanos que son portadores sanos de S. aureus, el cual se aloja en narinas y piel. A partir de esas fuentes, puede llegar a los alimentos donde su proliferacin constituye un riesgo potencial para la salud pblica por la posible produccin de enterotoxinas. Las siguientes situaciones llevan a analizar los alimentos para determinar la presencia o el nmero de clulas de S. aureus: A) confirmar si es el agente causal de una enfermedad alimentaria. B) determinar si un alimento o ingrediente es una fuente potencial de estafilococos enterotoxignicos C) demostrar contaminacin post-proceso, que generalmente se debe a contacto humano con alimentos procesados. Los alimentos que se sospecha fueron vectores de una toxiinfeccin alimentaria debida a S. aureus frecuentemente presentan altos nmeros de clulas del m.o.. En cambio, si se sospecha una contaminacin post proceso, puede esperarse una poblacin menor. En general S. aureus no es el nico m.o. presente en el alimento, por lo cual debe emplearse medios selectivos para su aislamiento y recuento. Las especialidades farmacuticas tambin se analizan para detectar S. aureus, debido a la posibilidad de causar infecciones en piel y mucosas. En este tipo de muestras, por lo general se exige ausencia de S. aureus en 1 g de producto. Los medios selectivos contienen inhibidores de otros m.o., de modo de impedir el desarrollo de otras especies. Los agentes selectivos ms comnmente usados en medios para S. aureus son NaCl (S. aureus puede crecer en presencia de concentraciones entre 5.5% y 10%) y telurito de potasio (K2TeO3, S. aureus reduce el telurito de potasio, produciendo colonias negras), y otros cloruro de litio, polimixina, azida de sodio y neomicina. Debe considerarse que el uso de los agentes selectivos no garantiza la completa inhibicin de otros m.o., como por ejemplo miembros de los gneros Bacillus, Micrococcus, Streptococcus y an levaduras. Por esta razn, la aparicin de colonias tpicas no es suficiente y debe confirmarse si dichas colonias tpicas desarrolladas en placas de medio selectivo verdaderamente pertenecen a la especie S. aureus. Problema Una familia presenta sntomas de toxiinfeccin alimentaria 2 a 4 horas despus de comer, con nusea, vmitos, diarrea y dolor abdominal. Esta sintomatologa puede deberse al desarrollo de elevados nmeros de S. aureus y formacin de toxina en el alimento ingerido. Se decide analizar una muestra remanente de queso artesanal que form parte de la comida, de modo de determinar si el m.o. responsable fue S. aureus. Qu mtodo puede usarse para aislar S. aureus de dicha muestra si el m.o. estuviera presente en nmeros altos?

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A Ud. se le entregar una placa de MSA proveniente de esta muestra. Considerando que las bacterias del genero Staphylococcus son fermentadoras de glucosa y manitol. Es posible afirmar que en la muestra haba S. aureus? Por qu? En caso de que haya que continuar el anlisis: Cmo determinara si las colonias tpicas corresponden a S aureus o no? Qu morfologa y reaccin al Gram presenta el gnero Staphylococcus? Cmo se clasifican las bacterias de este gnero segn sus relaciones con el oxgeno? Cmo puede diferenciarse el gnero Staphylococcus de otros relacionados? (Deber recurrir a Tablas del Manual de Bergey que tendr para consulta en clase) Cmo puede diferenciarse S. aureus de otras especies del gnero Staphylococcus?

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DETERMINACIONES CUANTITATIVAS DE LA BIOMASA - RECUENTOSSe propone la siguiente clasificacin: 1. Recuentos (determinacin del nmero de microorganismos) Recuento en placa ya sea en superficie o incorporado Mtodo de las diluciones mltiples o del Nmero Ms Probable (NMP) Filtracin por membrana e incubacin de sta sobre medio de cultivo slido Recuento microscpico directo de los m.o., ya sea en frotis o en cmaras Filtracin por membrana, coloracin del filtro, y conteo al microscopio . Conteo electrnico, usando contadores de partculas.

2. Determinacin de la masa celular Medida de la masa Medida del volumen Determinacin del contenido de N Turbidimetra y nefelometra

3. Determinacin de la actividad celular Determinacin de una actividad enzimtica Determinacin de un metabolito Medida del consumo de oxgeno Medida de ATP Calorimetra Medida de impedancia Radiometra (de CO2)

Al momento de elegir la tcnica de recuento a emplear, se debe tener en cuenta el tipo de muestra sobre la que se va a trabajar, porque es posible que algunos de los mtodos no sean aplicables. Cuando es necesario llevar a cabo diluciones, la toma y preparacin de la muestra se realiza de la manera descrita anteriormente (toma de muestra). En las descripciones que siguen se denominar homogeneizado a la muestra preparada para su anlisis microbiolgico.

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RECUENTOSRECUENTO EN PLACA Permite determinar indirectamente el nmero de m.o. presentes en una muestra en base a que se desarrollen en medio de cultivo, en placa, formando colonias. Por lo tanto se determinan por este mtodo slo las clulas microbianas VIABLES en las condiciones de trabajo (nutrientes, atmsfera, temperatura). Como las colonias pueden originarse tanto de una clula como de un grupo de clulas, se utiliza el trmino: UNIDADES FORMADORAS DE COLONIAS (u.f.c.) Adems, a los efectos de que todas las clulas que estn en una placa tengan una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que la incertidumbre del mtodo sea menor, se establece que las condiciones ptimas de recuento se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa. Esta regla general se usa siempre que no haya una especificacin diferente. Para alimentos se utilizan el rango de colonias ptimas entre 25 a 250 ufc por placa. Si fuera posible y necesario se puede repetir el recuento para obtener placas con un nmero de colonias ptimas. Procedimiento La preparacin de la muestra se realiza como para cualquier mtodo utilizando diluyentes adecuados. Se preparan diluciones decimales sucesivas (relacin muestra/volumen de dilucin 1 en 10), partiendo en general de 10 g o mL de muestra en 90 mL de diluyente para la primera dilucin (1/10 o 10-1). Para la segunda dilucin (1/100 o 10-2) se toma 1 mL de la 10-1 y se descarga en 9 mL de diluyente y as sucesivamente. Se descarta la pipeta luego de cada descarga. Cada vez que se prepara una dilucin en necesario homogeneizarla adecuadamente para lograr una distribucin de los m.o. en todo el volumen de dilucin. Esto se logra por agitacin (si es un frasco con tapn hermtico se realiza con agitacin durante 25 veces, formando un arco de aprox. 30 cm y si es un tubo con agitacin con Vortex). Tambin puede cargarse y descargarse un determinado volumen de la dilucin con una nueva pipeta (al menos tres veces), y finalmente tomar el volumen deseado .

Segn la carga esperada, o permitida, se eligen las diluciones a sembrar. Cuando se esperan cargas altas, se siembran no menos de tres diluciones consecutivas Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3). Una vez preparadas las diluciones, se siembra dentro de los 15 minutos siguientes .

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ANTES DE PROCEDER A LA SIEMBRA SE ROTULAN LAS PLACAS CON LOS SIGUIENTES DATOS: Identificacin de la muestra: Nombre y/o cdigo Dilucin, Volumen sembrado Superficie o incorporado Fecha Operador SIEMBRA INCORPORADA Se deposita 1 mL de cada dilucin en placas estriles, vacas, por duplicado. Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la ms diluida. Posteriormente, se agrega a cada placa 15 a 20 mL del medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45C (en bao o estufa). Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular, horario y antihorario yy hacia delante y hacia atrs. En algunas situaciones puede sembrarse un volumen diferente, en general no ms de 3 mL por placa. SIEMBRA EN SUPERFICIE Se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo, 0.1 mL de cada dilucin. Se realiza duplicado para cada dilucin. Se puede emplear la misma pipeta para todas las diluciones si se comienza por la ms diluida. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas para que se absorba, usando rastrillo estril. Medio de cultivo Se elige segn el tipo de m.o. que se quiere contar pudiendo emplearse medios selectivos o no selectivos. Incubacin Una vez enfriado el agar en el caso del recuento incorporado, y absorbida la muestra en el caso de recuento en superficie, las placas se invierten, y se ponen en la estufa que corresponde segn los m.o. a contar, durante el tiempo propuesto en la tcnica correspondiente. INTERPRETACIN Finalizado el perodo de incubacin se observa con buena luz a efectos de visualizar todas las colonias y diferenciarlas de cualquier partcula de muestra que pueda confundir. Contar todas las colonias desarrolladas por placa, marcando cada una con un lpiz de tinta indeleble. Se cuentan como colonias individuales todas aquellas que disten de las colonias prximas una distancia al menos igual al dimetro de la colonia ms pequea. Cuando se utilizan medios NO SELECTIVOS se procede de la siguiente forma: 1) Se cuentan en primer lugar las placas que tengan entre 30 y 300 colonias (o 25 250). Se hace el clculo multiplicando por la inversa de la dilucin y luego se promedian si corresponde- los valores de las distintas placas y diluciones. Para el informe final se toma en cuenta solo los valores de estas placas. Si no hay placas que contengan entre 30 y 300 colonias proceder de la siguiente manera: 2) Si slo hubieran placas con menos de 30 colonias, se hace el clculo multiplicando por la inversa de la dilucin y se informa igualmente el resultado, expresndolo por g o mL de muestra. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO. Si no hubiera colonias en ninguna de las placas, se informa como: Menor que 1 o 10 (segn sea incorporado en superficie) por la inversa de la dilucin menor.Pg. 49

3) Si en todas las placas hubiera ms de 300 colonias, se estima el resultado. Si no es posible distinguir colonias individuales (crecimiento confluente) se puede informar el resultado como mayor de 300 por la inversa de la dilucin mayor. Si es posible distinguir colonias individuales y estn homogneamente distribuidas, se cuentan las colonias en una superficie conocida de la placa y luego se extrapola a la superficie total de la placa: 65 cm2 para las de vidrio comunes, o 57 cm2 para las de plstico. Se siguen las siguientes reglas: Si hay menos de 10 colonias por cm2, se cuentan 13 cuadrados de 1 cm de lado: 7 consecutivos horizontales y 6 consecutivos verticales. El total de colonias contadas se multiplica por 5 o 4.4 segn el tipo de placa, para estimar el nmero de colonias en toda la placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO Si hay ms de 10 colonias por cm2, se cuentan 4 cuadrados de 1 cm de lado, y el promedio se multiplica por 65 o 57 segn el tipo de placa. En este caso se informa el resultado como ESTIMADO Si hay ms de 100 colonias en 1 cm2, no se cuentan sino que se estima el resultado como mayor de 6500 o 5700 por placa. Una vez estimado el nmero de colonias por placa, se aplica el factor de conversin para expresar el resultado por gramo o mL de muestra, de acuerdo al mtodo (incorporado o superficie), y a las diluciones sembradas. Es frecuente que desarrollen colonias extendidas sobre la superficie o el fondo y bordes de la placa, o que se den cadenas de colonias unidas. Este tipo de crecimiento se denomina "spreaders" y se cuentan como una. Cuando el spreader cubre ms del 50% de la placa, esta no debe contarse. Cuando el spreader cubre una superficie menor del 50%, se cuentan las colonias en el resto de la placa, SOLO si estn uniformemente distribuidas. Si en todas las placas hay spreaders se informa : Spreaders Todas las situaciones en las que no se pueda informar el recuento por no caer en los casos anteriores, (ej.: contaminacin, mal funcionamiento del medio), se informa como: "Accidente de laboratorio" Cuando se emplean medios SELECTIVOS, el nmero de colonias que se considera ptimo para contar, suele ser menor de 300, es necesario referirse a la tcnica correspondiente (de referencia) a los efectos de la interpretacin de los resultados. VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE AMBOS MTODOS: Incorporado Mayor cantidad de muestra. Mayor precisin Mejor aprovechamiento de nutrientes Dificultades al subcultivar colonias Visualizacin de colonias dificultosa Superficie Menor cantidad de muestra Menor precisin Peor aprovechamiento de nutrientes Facilidad para subcultivar colonias Fcil visualizacin

Temperatura del agar puede afectar la No se afectan los m.o. termosensibles viabilidad de algunos m.o. Se desarrollan m.o. microaerofilicos En aerobiosis slo crecen aerobios y anaerobios facultativos

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Expresin de los resultados: Se informan los resultados de recuento con slo DOS CIFRAS SIGNIFICATIVAS, redondeando los valores cuando corresponda. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata superior si la tercera cifra es 6 ,7, 8 o 9. Redondear la segunda cifra significativa a la inmediata inferior si la tercera cifra es 1, 2, 3 y 4. Si la tercera cifra es 5 redondear hacia arriba si la segunda cifra es impar y hacia abajo si es par Ej.: 137 se informa 140 1,4 x 102 145000 se informa 1,4 x 105 En el informe de un recuento en placa se expresa,: Recuento de ..............(tipo de microorganismo): X u.f.c. /g o mL

NUMERO MAS PROBABLE (NMP) O METODO DE LOS TUBOS MULTIPLES Se basa en la determinacin de la presencia o ausencia de un determinado tipo de m.o. (en funcin de que crezcan o de que produzcan determinada reaccin en el medio), en cantidades decrecientes de muestra. Se analizan en forma paralela por triplicado o quintuplicado porciones de la muestra cada vez menores inoculadas en un medio lquido. Por ejemplo, se utilizan un total de nueve tubos con medio de cultivo, en tres de los cuales se siembra 0,1 g. de muestra, en tres 0,01 g y en los otros tres restantes 0,001 g. Luego de la incubacin, se observan y cuenta el nmero de tubos positivos. Segn el tipo de m.o que se desea contar se utilizan medios de enriquecimiento selectivo o medios nutrientes. En funcin de esto se puede considerar como positivos aquellos tubos en los que: 1) Hubo crecimiento que se detecta como aparicin de turbidez (siempre que la muestra sembrada no enturbie el medio). 2) Deteccin de productos del metabolismo del m.o. a) produccin de gas que se observa en una campanita invertida (Durham) en el tubo. c) viraje de indicador (de pH, de potencial redox, etc). d) produccin de pigmento. e) otros (reduccin de NO3-, produccin de indol, hidrlisis de una protena, etc) Ocasionalmente, es necesario subcultivar cada uno de los tubos positivos, o presuntamente positivos a placa, o a otro tubo (con el mismo u otro medio) a efectos de confirmarlo. El nmero de tubos (positivos) que se busca en las tablas para el informe final es el que resulta de esta etapa de confirmacin, siendo el valor anterior slo un valor presuntivo. La interpretacin de los resultados, se hace en base a una distribucin de tipo Poisson, y en general se emplean tablas preparadas de acuerdo a la cantidad de muestra que se siembra en cada serie de tubos. Ejemplo 1: N de tubos sembrados: Volumen por tubo (mL) Dilucin de la muestra: Equivalente en g de muestra Tubos positivos 3 1 10-2 0,01 3 3 1 10-3 0,001 1 3 1 10-4 0,0001 0

El resultado 3-1-0 se busca en tabla III y se obtiene un valor de 43/g mL, cuando en la primer serie de tubos se siembra 0,1 g. Como en nuestro caso no estamos en condiciones hay que realizar la conversin. En este caso resulta claro que estamos sembrando diez veces menos en laPg. 51

primera serie de tubos (0,01 g), por lo tanto el factor a utilizar es multiplicando el resultado de tabla por diez. El resultado a informar es entonces: NMP de (tipo de m.o) = 43/g.

Una manera general de calcular el resultado es multiplicar el valor de tablas por el inverso de la dilucin sembrada en la serie del medio. Ej: 3 1 0 en Tabla III 43/g

NMP de tipo de m.o/mL = 43 x 1/dilucin de la serie del medio = 43 x 1/10-3 = 430/g 4,3 x 102/g 100 100

Ejemplo 2: N de tubos sembrados: 5 5 5 Volumen de muestra en c/u (mL): 10 1 0,1 Nmero de tubos positivos: 2 0 0 (dos tubos positivos para la primera dilucin, ninguno en las siguientes) De la tabla IV surge el valor: 5/mL. Como la siembra no esta realizada en las condiciones de la tabla debe aplicarse el factor de correccin. El resultado final se informa: NMP de .... (tipo de m.o):= 5 x 1/100= 0,05/mL 5/100 mL 100 Si la muestra es agua es habitual informar el resultado por 100 mL.

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Es de fundamental importancia antes de leer la tabla, asegurarse que est construida para condiciones similares a las de trabajo, que sea para igual nmero de tubos por serie, y para cantidades de muestra que sean mltiplo o submltiplo ya que hay variedad de tablas segn el nmero de tubos y diluciones a sembrar. La correccin se hace utilizando proporcionalidad inversa. En todos los casos el valor informado se considera un ndice de la carga microbiana, y se conocen los lmites de confianza para cada valor. Dado que la distribucin de las clulas obedece una distribucin de Poisson puede calcularse el nmero de clulas promedio de la dilucin sembrada cuando no se trabaja en las condiciones ms comunes para las que existen tablas, usando la siguiente ecuacin: NMP/g o mL = ___________N de tubos positivos____________________ (mL o g de muestra en tubos negativos X mL o g de muestra) en todos los tubos

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DEL MTODO: Puede emplearse para aquellos m.o. que no crezcan en medio slido y para aquellos m.o. de crecimiento lento (paras los cuales se evidencia el crecimiento por una reaccin y no por turbidez) Este mtodo es especialmente til para determinar cargas microbianas bajas, menores de 10 por gramo para slidos o menores a 1 por 10 mL para lquidos, pero puede igualmente emplearse para cargas mayores utilizando las diluciones apropiadas. Asimismo, es el nico mtodo a utilizar en el caso de muestras como por ejemplo polvos insolubles, en los que no es aplicable el mtodo de filtracin ni es recomendable el recuento en placa debido a la presencia de partculas. Se prefiere tambin este mtodo cuando los m.o. son de lento crecimiento, o cuando han sido sometidos a condiciones adversas (temperatura alta, desecacin, etc.) Es posible enumerar tambin por este mtodo m.o. anaerobios utilizando en los tubos medio prerreducido, que se tapan con vaselina-parafina luego de inocular, e incuban en condiciones aerobias.

FILTRACION POR MEMBRANA Este mtodo consiste en hacer pasar un volumen determinado de muestra lquida, o solucin en agua o en solvente apropiado estril a travs de un filtro de membrana estril (dimetro 50 mm, poro 0,45 m), colocado en un equipo de filtracin. Luego de enjuagar con soluciones estriles apropiadas se retira el filtro, y se lo coloca sobre la superficie de una placa de Petri con el medio de cultivo a utilizar e incuba. Los filtros pueden ser de distintos materiales; en microbiologa se emplean de nitrato o acetato de celulosa generalmente, y pueden tener bordes hidrofbicos, que minimizan la adsorcin de conservadores y antimicrobianos. Luego de transcurrido el tiempo de incubacin, se cuentan las colonias desarrolladas en el filtro. Se considera que las condiciones ptimas del mtodo se dan cuando desarrollan entre 20 y 200 colonias en el filtro. Se utilizan filtros reticulados, y existen reglas para el conteo:Pg. 53

1) Si hay 1 o 2 colonias por cuadrado del retculo, o menos, se cuentan todas. 2) Si hay entre 3 y 10 por cuadradito, se cuentan 10 cuadrados, y se promedia, multiplicando por 100 para obtener el nmero de colonias en el filtro (se multiplica por 100 porque el rea del cuadrado representa la centsima parte del rea total del filtro). 3) Si hay entre 10 y 20 se cuentan 5 cuadrados y promedia, multiplicando luego por 100. 4) Si hay ms de 20 se considera >2000 por filtro Toda vez que se utilice el promedio por cuadrado, el recuento se informa como ESTIMADO. Ventajas y desventajas: Sirve para determinar cargas muy bajas, pues se puede filtrar volmenes de 100 y hasta 1000 mL. Es adems el mtodo de eleccin para muestras lquidas o solubles que contienen agentes antimicrobianos, por cuanto no es necesario neutralizarlos. Expresin de los resultados: Una vez conocido el nmero de colonias por filtro, se expresa el valor en u.f.c. al igual que el recuento en placa expresndolo por gramo, o mililitro de muestra.

RECUENTO MICROSCOPICO DIRECTO Este mtodo permite determinar el nmero de clulas microbianas, por observacin en el microscopio. La muestra puede utilizarse tal cual, (si es lquida como leche o cultivos puros en medio lquido), o puede prepararse una dilucin tal como se realiza para otros mtodos de recuento. Se basa en contar m.o. en una cantidad conocida de muestra utilizando frotis coloreados, cmaras del tipo de las de contar glbulos, o las especialmente diseadas para contar hongos en alimentos como la cmara de Howard. Se determina el nmero TOTAL de clulas presentes (VIABLES Y NO VIABLES) Ocasionalmente se pueden utilizar colorantes que indiquen diferentes estados metablicos de las clulas. Por ejemplo en un recuento en cmara de un cultivo de levaduras con azul de metileno, se pueden distinguir las clulas VIABLES (no absorben el colorante, se vern transparentes) de las NO VIABLES (absorben el colorante y se vern azules). Recuento sobre frotis coloreado Se marca sobre un portaobjetos limpio y desengrasado, un cuadrado de 1 cm de lado. Sobre la superficie opuesta del portaobjetos, se deposita en el centro 0,01 mL de muestra ya sea con ansa calibrada o con micropipeta. Se extiende por todo el cuadrado con ansa. Se deja secar en posicin horizontal. Se fija y colorea, ya sea por Gram o con azul de metileno 1 minuto (mtodo de Breed para leche). Se observa por inmersin, contando los m.o. en cada uno de varios campos. El nmero de campos a contar depende del nmero de m.o. por campo y del factor del microscopio. Se transcribe la tabla que se propone para el recuento directo en leche (Standard Methods for the Examination of Dairy Products APHA)

Nmero de campos a contar segn el factor del microscopio y el nmero de microorganismos:

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Microorganismos por campo Menos de 1 1 a 10 Ms de 10

Factor del microscopio 300000 30 20 10 400000 40 20 10 500000 50 20 10 600000 60 30 20

Clculo del factor del microscopio Con objetivo de 40 x, o 100 x, se mide el radio del campo utilizando un portaobjetos calibrado, o el retculo de una cmara cuenta glbulos. Si se utiliza el de 40 x, luego debe hacerse la correccin utilizando el factor 40/100 para llevarlo al aumento de trabajo. Se calcula el rea del campo: r2 El nmero de campos por cm2 es: 1 / r2 Si se extendi en 1 centmetro cuadrado 0,01 mL de muestra, el nmero de campos por mililitro, llamado Factor del Microscopio (FM), se calcula de la siguiente forma: FM = 100 / r2 donde r se expresa en cm, o FM = 10000/ r2 con r en mm. Expresin de resultados Una vez contado el nmero de m.o. en los campos que corresponde, se promedia, y multiplica por el Factor del microscopio; de esa forma se obtiene el resultado que se expresa en trminos de: Recuento microscpico directo = N microorganismos por mL Recuento en cmara de Neubauer Es una cmara que se utiliza para contar glbulos (En E se cuentan eritrocitos y en L los leucocitos) y est diseada de manera de contener una cantidad fija de lquido. Consta de un cuadrado central de 1 mm de lado dividido en 25 cuadraditos. Cada uno de ellos est, a su vez, dividido en 16 cuadrados. Se coloca un cubreobjetos sobre la zona cuadriculada, apoyado sobre dos hombros laterales de manera que cuando hay un buen contacto entre ellos, queda una distancia de 0.1 mm entre el cubreobjetos y la cmara. Esto determina que el lquido quede contenido en un volumen de 0.1 mm3. Ventajas del mtodo: Es rpido Los frotis se pueden guardar Las exigencias de equipo son mnimas Se pueden observar las diferentes morfologas de los m.o. Se observan tanto los m.o. viables como los no viables Desventajas del mtodo: La cantidad de muestra analizada es poca Provoca cansancio del operador Slo sirve para muestras con cargas superiores a 10.000 por mL. Es difcil distinguir los m.o. de las partculas de muestra Una inadecuada distribucin de la muestra sobre la superficie del portaobjetos puede ocasionar serios errores.Pg. 55

DETERMINACIN DE LA MASA CELULAR TURBIDIMETRA Este mtodo da informacin sobre el contenido de macromolculas, y no sobre el nmero de clulas. En el laboratorio de microbiologa se usa un colormetro, o un espectrofotmetro y se mide la absorbancia de la suspensin de m.o. en comparacin con un blanco que es el medio esterilizado, y sin sembrar. Cuanto mayor es el nmero de clulas en suspensin, tanto menor es el porcentaje de luz que atraviesa el medio. Se cumple una ley similar a la de Lambert-Beer y expresando la relacin en trminos de masa microbiana y absorbancia, la ecuacin es la siguiente: A= k x W: donde: Absorbancia k: constante W: masa celular La grfica correspondiente construida con valores reales muestra una desviacin a medida que aumenta la masa microbiana. W A

Para utilizar la medida de la absorbancia como mtodo de recuento, es necesario hacer para cada m.o. una curva de calibracin, midiendo el nmero de m.o. por otro mtodo de recuento. El mtodo se emplea fundamentalmente para preparar inculos, cuando se trabaja con cultivos puros. ESCALA DE MAC FARLANDPg. 56

Existe la posibilidad de estimar cargas altas de m.o., comparando a simple vista con una escala formada por tubos numerados de 1 a 10 y elaborada con diferentes cantidades de sulfato de bario. Se conoce la cantidad aproximada de clulas bacterianas a que corresponde cada tubo, y de esa forma se puede estimar la cantidad de m.o. presentes. Este mtodo slo da una estimacin del nmero de m.o. (viables y no viables) y sirve slo para cargas altas. Tiene la ventaja de ser muy rpido y no es necesaio disponer de espectrofotmetro. Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Millones de bacterias/ mL 300 600 900 1.200 1.500 1.800 2.100 2.400 2.700 3.000

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ALGUNAS APLICACIONES DE RECUENTOS

MICROORGANISMOS INDICADORES Los mtodos usados para el aislamiento y el recuento de los m.o. patgenos en agua, alimentos, etc. pueden no ser eficaces debido a que dichos m.o. se encuentren en muy baja cantidad, sobre todo en presencia de nmeros altos de otros m.o. Tambin puede ocurrir que tengan una distribucin irregular en la muestra. An cuando se cuenta con mtodos sensibles, en general son largos y costosos; adems, hay patgenos que no pueden determinarse en laboratorios no especializados, como, por ejemplo, el virus de la hepatitis A. Estas dificultades han impulsado a que se utilicen grupos de m.o. de deteccin y enumeracin ms fciles y cuya presencia en cierto nmero se considera como una indicacin de que la muestra estuvo expuesta a condiciones que pudieron determinar la llegada a la misma de m.o. peligrosos y/o permitir la proliferacin de especies patgenas. Estos grupos de m.o. se denominan indicadores. Se usan como m.o. indicadores aquellos cuya relacin con los patgenos ha sido estudiada. Los indicadores utilizados ms frecuentes son: - mesfilos aerobios totales o hetertrofos - Enterobacterias - Coliformes totales y fecales - Estreptococos fecales y Enterococos - Clostridios sulfito-reductores AGUA El anlisis microbiolgico de muestras de agua tiende a determinar la calidad sanitaria de sta y su aptitud para distintos usos. En general, los mtodos utilizados estn diseados de modo de detectar el grado de contaminacin del agua con desechos de origen humano y/o animal. Tradicionalmente se han usado ensayos para la determinacin de m.o. indicadores ms que para la determinacin de patgenos. El grupo de bacterias coliformes ha sido siempre el principal indicador de calidad de los distintos tipos de agua; el nmero de coliformes en una muestra se usa como criterio de contaminacin y por lo tanto, de calidad sanitaria de la misma. Los coliformes son bastones Gram (-), aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con formacin de gas cuando se incuban 48 horas a 35C. Incluye los gneros Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y especies lactosa positivas de otros gneros. Tambin interesa la determinacin de coliformes fecales que representan la fraccin de coliformes que provienen de intestinos y materias fecales de hombre y animales de sangre caliente (coliformes termotolerantes). Esto provee informacin importante sobre la fuente y el tipo de contaminacin presente. Un mtodo muy utilizado para el recuento de coliformes en agua ha sido siempre el NMP, pero han ido variando los medios de cultivo, las condiciones y las tcnicas de manera de obtener cada vez mayor sensibilidad y precisin hasta hacerlo aceptable como mtodo estndar. Los distintos mtodos de NMP para coliformes totales se basan, en primera instancia, en una seleccin de los m.o. que producen gas de lactosa a 35C. Por ello, el primer paso es siempre la siembra en tubos de algn caldo lactosado, con tubo de fermentacin para recoger el gas que pueda producirse. A esto sigue una confirmacin en un medio lquido selectivo y/o una determinacin de los coliformes fecales cuya diferenciacin se realiza en base al hecho de que pueda producir gas de lactosa en un medio apropiado cuando se incuba a 44,5C mientras que los dems coliformes no.Pg. 58

Tambin es muy utilizado el mtodo de filtracin por membrana para el recuento de bacterias coliformes totales y fecales. Es un mtodo altamente reproducible, puede usarse para analizar volmenes de muestra relativamente grandes y se obtienen resultados en menor tiempo que con el NMP. Sin embargo, no puede aplicarse a cualquier tipo de muestra y tiene sus limitaciones. Tambin se encuentra entre los mtodos estndar. A los efectos de la filtracin por membrana debe replantearse la definicin de coliformes: bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, que dan colonias oscuras con brillo metlico en medio Endo, luego de 24 hs. de incubacin a 35C. La determinacin de coliformes fecales por filtracin puede hacerse a partir de las colonias desarrolladas en Endo o directamente incubando la membrana en medio m-FC e incubando a 44,5C. Para la deteccin simultnea de coliformes totales y Escherichia coli se puede utilizar la prueba de sustrato enzimtico. En este caso el grupo de coliformes totales se define incluyendo todas las bacterias que presentan la enzima beta-D-galactosidasa, que hidroliza el sustrato cromognico (por ejemplo, ONPG) liberando el cromgeno. Como E. coli se incluyen todas las bacterias que dan positiva la reaccin de coliformes totales y que tienen actividad beta-glucuronidasa, que hidroliza el sustrato fluorognico (por ejemplo, MUG), liberando el fluorgeno. Tambin se usa como indicador de contaminacin fecal el grupo Estreptococos fecales que incluyen especies de Estreptococos grupo D de Lancefield (Enterococcus faecalis, E. faecium, Streptococcus equinus, S. bovis) y algunas subespecies y una especie del grupo Q (Streptococcus avium). El grupo Enterococos estara includo dentro de estreptococos fecales y comprende las especies Enterococcus faecalis y E. faecium y sus subespecies (origen humano) y tambin se usa como indicador de contaminacin fecal en agua. El hbitat normal de los estreptococos fecales es el intestino del hombre y los animales de sangre caliente, por lo tanto son indicadores de contaminacin fecal, sobre todo en muestras de lagos, estuarios, ros, etc. La identificacin de las especies puede proporcionar informacin sobre la fuente de contaminacin debido a que algunas especies son especficas de sus huspedes; por ejemplo, una predominancia de S. bovis o S.equinum indicara una contaminacin por heces no humanas. El recuento de hetertrofos totales consiste en un mtodo estandarizado para determinar la densidad de bacterias hetertrofas, mesfilas aerobias y anaerobias facultativas en el agua. As se obtiene informacin til que se estudia junto con el ndice de coliformes; tambin se le usa para controlar un proceso de tratamiento de agua o para verificar la calidad del agua tratada, luego de recorrer toda la red de distribucin. Tambin interesa estudiar la presencia o el recuento de Pseudomonas aeruginosa en distintos tipos de agua (potables, recreacionales, de industrias, etc.) Otro grupo de indicadores que ha comenzado a utilizarse en aguas lo constituyen los colifagos. Los colifagos son bacterifagos de coliformes que se encuentran siempre que haya coliformes totales y fecales. De acuerdo a estudios de correlacin entre nmero de colifagos y coliformes en agua, se podra utilizar el ndice de colifagos como ndice de calidad sanitaria de agua. Adems, como son ms resistentes a la cloracin que los coliformes, pueden ser mejores indicadores de desinfeccin que stos ltimos. El mtodo de enumeracin se basa en la formacin de playas de lisis. Los colifagos (bacterifagos) infectan y se multiplican en bacterias sensibles a ellos. Esto provoca la lisis celular de esas bacterias y liberacin de partculas virales que infectarn a las clulas bacterianas adyacentes. A medida que stas bacterias se vayan lisando, se formarn zonas claras, conocidas como playas de lisis, entre el crecimiento confluente de la bacteria utilizada. La cepa utilizada en los ensayos es

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una cepa de E. coli sensible a la infeccin por colifagos (ATCC 13706). La metodologa empleada est descripta en el Standards Methods for the examination of water and wastewater". BIBLIOGRAFA Los mtodos de referencia para los anlisis antedichos se pueden encontrar en: - "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater", APHA-AWWA-WPCF, 20th Ed. Normas UNIT: 856-91, 857-91, 858-91, 893-91, 894-91, 942-93, 943-93. Normas ISO (varias) Las normas vigentes en nuestro pas respecto a la calidad microbiolgica de los diversos tipos de agua se pueden encontrar en: - Normas de calidad de agua potable... OSE - Reglamento Bromatolgico Nacional Ordenanza P.E. 315/94 - Ordenanza Bromatolgica Municipal ...................I.M.M (Decreto 27235) - Norma 833/90.......................UNIT - Decreto 253/79 (12/89)................Poder Ejecutivo - Decreto 16235 (1974)..................Junta de Vecinos de Montevideo

Para el anlisis de diferentes tipos de muestras, y los lmites aconsejados se puede consultar: - Standard Methods for the examination of Dairy Products", APHA, 16 th Ed., 1992. - U.S. Food and Drug Administration Bacteriological Analytical Manual, AOAC,Gaithersburg, MD, 8th ed., 1995.. - Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists, 16th Ed., 1995. - Microorganisms in foods 1 & 2" ICMSF. - USP 28. - Reglamento Bromatolgico Nacional - Normas UNIT (varias) - Ordenanza Bromatolgica Municipal (IMM) - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods, 1992, 3rd Ed. - Farmacopea Europea y suplementos - Normas ISO (varias)

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EJERCICIOS DE RECUENTOS 1) Se realiza un recuento en placa de una muestra slida por siembra incorporada de 0,5 mL en cada placa en VRBA de las diluciones que se indican. Se incuba 24 hs a 35 C. Se cuentan las colonias rojas desarrolladas. Informe claramente los recuentos para los siguientes resultados:

Muestra 1 2 3 4

Dilucin sembrada y nmero de ufc 10-2 0 190 > 300 5 10-3 0 28 114 0 10-4 0 0 9 0

2) Se realizaron recuentos por NMP en dos muestras de gelatina en caldo lauril triptosa. Se sembraron tres tubos por dilucin, (1 mL de dilucin por tubo) y se incub a 35C durante 48 horas. Cmo informara los recuentos si obtuvo los siguientes resultados?:

Muestra A B

Dilucin sembrada y tubos positivos 10-2 3/3 3/3 10-3 1/3 3/3 10-4 0/3 3/3

3) Disear un mtodo de recuento para cada uno de los siguientes casos: a) Determinar la aceptacin o rechazo de una muestra de carne a la que se le acepta un lmite de S aureus de 104 /g. b) Determinar la aceptacin o rechazo de una muestra de harina a la que se le exige menos de 100 microrganismos aerobios mesfilos por gramo.

4) En una muestra de almidn se exige una carga bacteriana menor de 105 /g. Cul de los siguientes mtodos utilizara para el anlisis y cules no? Fundamente su eleccin y disee el o los experimentos (diluciones a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin). Recuento en placa Recuento microscpico directo NMP Turbidimetra 5) Explique que mtodo (volmenes a sembrar, medios, temperatura y tiempo de incubacin) utilizara para hacer el recuento de coliformes en agua potable si la exigencia es de 0/100 mL.

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6) Se realiz el recuento en una muestra de agua de pozo por filtracin. Se filtraron 10mL de la dilucin 1/10 (-1), se coloc la membrana en una placa de TSA y se incub por 48hs, se contaron 30 colonias en la placa. Cmo se expresa el resultado?

7) Cmo informara el recuento por NMP de las siguientes muestras de agua de playa con los siguientes resultados? Muestra 1. (se sembr 1 mL de cada dilucin se incubaron los tubos a 35C por 48 hs.) Medio CLT CLBVB (subcultivo) Dilucin sembrada y tubos positivos -1 3/3 1/3 -2 3/3 0/3 -3 2/3 0/3

Muestra 2. (se sembr 1 mL de cada dilucin se incubaron los tubos de CLT a 35C por 48 hs. y EC a 44,5 C por 24 hs.) Medio CLT EC (subcultivo) Dilucin sembrada y tubos positivos -2 2/3 0/3 -3 1/3 0/3 -4 0/3 0/3

8) Las normas vigentes para la calidad microbiolgica del pescado fresco indican: n= 5, c=3, m=106 M=107 Hetertrofos mesfilos. n= 5, c=3, m=104 M=106 Hetertrofos psicrfilos. n= 5, c=3, m=103 M=2x103 Staphylococcus aureus. n= 5, c=3, m=4 M=400 Coliformes fecales. Cmo hara cada recuento? Especificar el mtodo, las diluciones, medios de cultivo y temperatura de incubacin.

9) Las normas de calidad microbiolgica de un producto farmacutico lquido de uso oral indican: un lmite de 500 ufc/mL para bacterias hetertrofas. Se realiza el recuento del producto en TSA de dicho producto (que contiene parabenos) sembrando 1 mL (incorporado) de las diluciones que se indican y se obtienen los siguientes resultados: Dilucin sembrada y nmero de ufc 0 3 -1 40 -2 5

De acuerdo a estos resultados qu puede concluir?

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Se realiza la validacin del procedimiento expuesto en el ejercicio anterior. Para ello se prepara una suspensin de un cultivo de E. coli . Se realiza el recuento de esta suspensin de E. coli y se obtiene: Recuento en placa (TSA) en superficie (0,1mL)

Dilucin sembrada y nmero de ufc -5 358 -6 70 -7 6

Para realizar la validacin, se inocula 1 mL de la dilucin 7 de la suspensin de E. coli preparada anteriormente y se agrega a cada una de las placas sembradas con las diluciones del producto lquido (0, -1 y -2) y se obtiene el siguiente resultado: Dilucin sembrada de producto (+ suspensin) y nmero de ufc 0 -1 -2 55 113 75

Se considera el mtodo validado? Qu recomendaciones hara para analizar esta muestra? Podra utilizar otro mtodo?.

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MUESTREO PARA ANALISIS MICROBIOLOGICO

La primera etapa del anlisis microbiolgico es la extraccin de la o las muestras de un lote y cualquier resultado carece de significado si la muestra no ha sido apropiadamente tomada. Es responsabilidad del laboratorio de control constatar que la muestra que se analizar es representativa del lote y rechazarla antes de realizar el anlisis si se tiene indicios de que no lo es. Generalmente en los textos especializados se describen los protocolos para el muestreo en las reas clnicas, de alimentos, de aguas y de medicamentos y es necesario referirse a ellos en primera instancia. Aqu sealaremos algunas consideraciones generales aplicables a las tres ltimas reas. El lote es el nmero de unidades o la cantidad de un producto que ha sido sometido a las mismas condiciones durante un proceso determinado. Esta es una consideracin terica puesto que es difcil asegurar la uniformidad durante la mayora de los procesos conocidos. Por ej. en una esterilizacin por vapor no todas las zonas del autoclave alcanzan la misma temperatura, sin embargo se considera que todos los recipientes sometidos a ese proceso en esa instancia constituyen un lote. Se considera que una muestra o un conjunto de muestras son representativas de un lote cuando reflejan, tanto como sea posible, la totalidad del lote. Para determinar que la muestra es representativa y que no se ha alterado despus de la extraccin deben tenerse en cuenta las etapas de: recoleccin, transporte y preparacin para el anlisis propiamente dicho. 1) Recoleccin Los planes de muestreo determinan el nmero, tamao y zonas de recoleccin de la muestra. Se disean por criterios estadsticos teniendo en cuenta adems algunas caractersticas del producto tales como: - riesgo potencial para el consumidor, si el riesgo es alto se aumentar el nmero de muestras para dismimuir la probabilidad de que llegue al consumidor una muestra contaminada - facilidad de homogeneizar el lote. Si la produccin es en batch y el producto es fcilmente mezclable, como un lquido, se requiere menor nmero de muestras que si no lo es; si el lote es un conjunto de unidades y se presume que no es de calidad uniforme entonces se extraern muestras de los puntos donde se supone que la calidad es inferior los cuales se denominan puntos crticos (en el ejemplo del autoclave stos seran las zonas donde se alcanza menor temperatura). A su vez deber considerarse la homogeneidad dentro de la unidad o envase, p.ej. en un alimento congelado hay un gradiente de temperatura durante el proceso de enfriamiento de tal manera que la zona central es la que tarda mas tiempo en alcanzar la temperatura de congelamiento. - posibilidad de controlar y registrar el tratamiento al cual ha sido sometido el producto; cuanto mayor sea la seguridad de que el tratamiento ha sido correcto para la totalidad del lote, se requiere menor nmero de muestras. Debe tenerse en cuenta que el aumento del nmero de muestras est restringido por el costo del anlisis y porque existe un lmite por encima del cual no hay un aumento significativo de los intervalos de confianza.

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La muestra se extrae de unidades cuyo envase externo est inalterado. La extraccin se realiza en forma asptica para evitar la contaminacin de la muestra y del resto del contenido del envase. La muestra debe identificarse con un nmero, fecha, origen, contenido e iniciales del extractor. 2) Transporte Para un producto almacenado en batch la muestra se toma y transporta en recipientes previamente esterilizados y hermticos. El transporte se realiza de acuerdo a las condiciones de almacenamiento. Si es un producto alterable debe transportarse refrigerado (0-4C) por no mas de 24hs. Si se trata de un alimento congelado debe conservarse a la temperatura de congelamiento. El recipiente de transporte no debe llenarse completamente (hasta un 75% de su capacidad) para permitir homogenizar. 3) Preparacin para el anlisis Se debe realizar la observacin macroscpica de la muestra y del envase de transporte y registrar cualquier particularidad. Se procede a la homogeneizacin de la muestra mediante manipulacin asptica. Si es un slido o una pasta se diluye en buffer o agua peptonada estriles y se mezcla en una licuadora o en bolsas de plstico previamente esterilizados. Si es un producto oleoso (p.ej. una pomada) se termostatiza en el diluyente a 35C para lograr una emulsin. Si el anlisis se realizar por filtracin es necesario disolver el producto en un solvente orgnico inocuo para los m.o. (p.ej.miristato de isopropilo). Para alimentos se recomienda que la toma no sea inferior a 10 g y que la relacin con el diluyente sea 1:10. Esta dilucin debe prepararse inmediatamente antes del anlisis. APLICACIONES. I) Muestreo de equipos y utensilios. Se puede realizar por varios mtodos: a) Enjuagado: consiste en enjuagar el equipo con un volmen medido de medio de cultivo o de buffer, el cual es sometido al anlisis microbiolgico. b) Contacto de superficie: consiste en pasar un hisopo embebido en buffer por un rea determinada del equipo y posteriormente descargar el hisopo en un volmen medido de diluyente el cual es analizado. Este mtodo es recomendado para zonas de difcil acceso, en cambio para reas planas se recomienda el contacto directo de la superficie a analizar con un cilindro de agar del dimetro de una placa de Petri el cual se corta aspticamente, y se expresa el resultado por rea de contacto (Replicate Organism Direct Agar Contact Plates). c) Inmersin: los utensilios se sumergen en un volmen determinado de diluyente y se determina el nmero de m.o. por unidad. II) Muestreo de aire. a) Sedimentacin: se exponen placas de agar durante 15' a 2h dependiendo de la contaminacin del rea a analizar. Se detectan slo los m.o. que estn adheridos a partculas sedimentables.

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b) Impacto: se hace pasar un volmen determinado de aire mediante aplicacin de vaco a travs de una serie de tamices que retienen distinto tamao de partcula. Los tamices son incubados sobre agar y se puede determinar el nmero de m.o. asociados a partculas de distinto tamao. c) Impregnacin de lquidos: consiste en hacer burbujear un volmen determinado de aire a travs de un diluyente estril el cual retiene los m.o. presentes.

Bibliografa - Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. APHA (American Public Health Association), 1976. Ed.Spceck,M. - Microorganismos in Foods 2: Sampling for microbiological analysis, Principles and specific applications. ICMSF (International commision on Microbiological Specifications for Foods), 1974. Ed. Ingram,M. - Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater APHA, 1976. 14th. ed. Ed.Rand,M.

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VALIDACINCONCEPTOS Validar un proceso cualquiera significa verificar que el procedimiento seguido es el adecuado para obtener el fin propuesto. Por ejemplo para validar un proceso de llenado asptico de ampollas inyectables se prepara un lote en el que se sustituye el producto con medio de cultivo. Se incuba entonces las ampollas y se observa si hay o no crecimiento, lo que validar o no, el procedimiento de llenado. Para validar un proceso de esterilizacin de un producto en un envase dado, se prepara un lote de envases llenos con medio de cultivo inoculado con una cepa adecuada. Luego del ciclo de esterilizacin se incuba y se observa el crecimiento. Este concepto se puede aplicar a un proceso analtico. Por ejemplo, si se busca