pruebas bioquimicas enterobacterias

4-2), lo cual indica que el microorganismo es capaz de formar cido a partir de la lactosa presente en el medio.'

La diferenciacin de Enterobacteriaceae, sin embar-go, se basa primariamente en la presencia o ausencia de diferentes enzimas codificadas por el material gentico del cromosoma bacteriano. Estas enzimas dirigen el me-tabolismo de las bacterias a lo largo de uno o ms cami-nos que pueden ser detectados por medios especiales usados en las tcnicas de cultivo in vitro. Los sustratos sobre los cuales pueden reaccionar estas enzimas estn incorporados al medio de cultivo, junto con un indicador que puede detectarse por la utilizacin de sustrato o por la presencia de productos metablicos especficos. Me-diante la seleccin de series de medios que miden las di-ferentes caractersticas metablicas de los microorganis-mos que se deben ensayar, puede determinarse un perfil bioqumiao para hacer una clasificacin de especies.

CARACTERSTICAS DE RELEVAMIENTO

La identificacin definitiva de ls miembros de Ente-robacteriaceae puede requerir una batera de pruebas bioqumicas. Pueden evitarse un tiempo considerable y una probable identificacin errnea si se hacen unas po-cas observaciones preliminares para asegurar que el mi-croorganismo que se va a probar pertenece a este grupo. Si el microorganismo es un gramnegtivo de otro grupo, puede ser necesario usar un juego de caractersticas dife-rentes del que se usa comnmente para la identificacin de Enterobacteriaceae. Con unas pocas excepciones, to-dos los miembros de Enterobacteriaceae demuestran las siguientes caractersticas:

Fermentadores de glucosa (vase lmina color 4-lE y F).

Citocromo oxidasa negativa (vase lmina color 4-1 G). Reduccin de nitrato a nitrito (vase lmina color

4-lH).

UTILIZACIN DE LOS HIDRATOS DE CARBONO

Es comn que los microbilogos de laboratorio se re-fieran a los hidratos de carbono como azcares. Esto es conveniente en un sentido operacional, aunque se entien-de que los alcoholes polidricos, como el dulcitol y el manito!, o las sales catinicas, como el acetato o el tar-trato, no son hidratos de carbono y por lo tanto no son verdaderos azcares en el sentido qumico.

El trmino fermentacin se usa tambin en forma algo laxa en referencia a la utilizacin de los hidratos de carbono por bacterias, con trminos como fermentado-res de lactosa o no fermentadores de lactosa. Por defi-nicin, la fermentacin es un proceso metablico de xi-do-reduccin que tiene lugar en un entorno anaerobio, en el que un sustrato orgnico sirve como aceptor final de hidrgeno (electrones) en lugar de oxgeno. En sistemas de prueba bacteriolgicos, este proceso se detecta por observacin del cambio de color de los indicadores de pH como consecuencia de la formacin de productos ci-dos. La acidificacin del medio de prueba puede ocurrir a travs de la degradacin de hidratos de carbono por otros caminos distintos de la fermentacin, o puede ha-ber en algunos medios ingredientes distintos de los hidra-

ENTEROBACTERIACEAE 173

tos de carbono que resulten en productos finales cidos. Aunque la mayora de las bacterias que metabolizan los hidratos de carbono son anaerobias facultativas, la utili-zacin puede no ocurrir siempre bajo estrictas condicio-nes anaerobias, como se observa en la produccin de pro-ductos cidos por colonias bacterianas que crecen sobre la superficie del agar. Aunque todas las pruebas usadas para medir la habilidad de un microorganismo para de-gradar enzimticamente un "azcar" en productos cidos no son "fermentativas", estos trminos sern usados por conveniencia en el resto del texto.

Principios bsicos de fermentacin. Los estudios de Pasteur de mediados del siglo XIX sobre la accin de las levaduras sobre el vino proveyeron las bases de la com-prensin actual de la fermentacin de los hidratos de car-bono. Pasteur observ que ciertas especies bacterianas contaminantes producan una cada del pH del vino (un sustrato de hidrato de carbono) debido a la produccin de una variedad de cidos. A partir de ese momento, y en forma rpida, se realizaron descripciones completas de los caminos fermentativos por los cuales se degrada un monosacrido como la glucosa. Por medio de una serie de clivajes y transformaciones glucolticas enzimticas, la molcula de glucosa se separa en una serie de com-

_pue.s!o de tres carbonos, el ms importante de loscuales eselcido pirvico. La secuencia qumica por la cual la glucosa se convierte en cido pirvico se conoce como va de Embden-Meyerhof (EMP; fig. 4-1). Muchas bac-terias, incluidas todas las Enterobacteriaceae, fermentan la glucosa a travs de EMP para formar cido pirvico. Sin embargo, la manera en que el cido pirvico se utili-za vara entre las especies bacterianas. Los destinos alter-nativos del cido pirvico son el resultado de una varie-dad de caminos de fermentacin que rinden productos fi-nales bastante diferentes (vase fig. 4-1).

Las bacterias se diferencian por el hidrato de carbono que metabo1izan y por los tiJOS y cantidades de cidos que pro ucen. Estas diferencias en la actividad enzimti-ca sirven como una de las caractersticas bioqumicas ms importantes por las cuales se reconocen las especies. Es esencial para los estudiantes de microbiologa com-prender que en la formacin glucoltica del cido pirvi-co, la adenosina trifostato (ATP) se genera a expensas de la reduccin del dinucletido de nicotinamida adenina (NAD) a NADH2. Por cada.molcula de glucosa que se fermenta para formar cido pirvico, se consumen cuatro iones hidrgeno a travs de la reduccin de dos NAD a dos NADH2 Dado que el NAD total de la clula es muy limitado, Ja fermentacin cesara muy rpidamente si el NADH2 no fuera reoxidado en un metabolismo posterior a cido pirvico. La figura 4-2 muestra la fermentacin de tres molcula\ de glucosa por medio de dos vas alter-nativas. Por ejemplo, la fermentacin de la glucosa por Escherichia coli ocurre por medio de la va fermentacin cido mixta y resulta en la produccin de grandes canti-dades de cido actico, lctico y frmico, con un~ mar-cada disminucin del pH en el medio de prueba. Esta es detectada por la prueba positiva del rojo de metilo (va-se fig. 4-2). Por otro lado, el grupo Klebsiella-Enterobac-ter-Hafnia-Serratia metaboliza el cido pirvico prima-riamente a travs de la va butiln-gluclica, producien-do acetilmetilcarbinoi(acetona) y una prueba de Voges-Proskauer positiva (VP) (vase fig . 4-2). Ntese que los principales productos finales de esta ltima va son aleo-

174 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

Glucosa 6-fosfato

l Fructosa 6-fosfato

l Fructosa 1,6 difosfato

l Gliceraldehdo 3-fosfato

cido propinico

Fig. 4-1. Fermentacin de la glucosa para formar piruva_-to (va Embden-Meyerhof) y los destinos alternativos del cido pirvico.

t cido frmico - H, + CO, cido succnico ---

Acetaldehdo ~ ---- Acetil -CoA - cido actico

t cido lctico

Alcohol etlico

Acetil-meti l-carbinol

(acetona)

cido butrico

1 2,3 Alcohol butlico

Buti lenglicol (butanodiol)

holes, y slo se produce una pequea cantidad de cido; por lo tanto, la prueba de rojo de metilo en general es ne-gativa para este grupo de microorganismos.

El gas resultante de la fermentacin bacteriana es pri-mariamente una mezcla de hidrgeno y dixido de car-bono formado por el clivaje del cido frmico. Es una re-gla aceptada que cualquier bacteria que forma gas en un medio para probar hidratos de carbono primero debe for-mar cido, lo cual es evidente en el esquema de EMP de la figura 4-1. El gas se detecta mejor utilizando un medio lquido para fermentacin de hidratos de carbono en el cual se han ubicado tubos invertidos de Durham (vase lmina color 4-lF). En el tubo de Durham pueden ser de-tectadas trazas de gas que se colectan como burbujas. Al-gunas especies de Enterobacteriaceae carecen de la en-zima frmico deshidrogenasa y no pueden formar cido frmico y como resultado de esto no pueden formar ni si-quiera trazas de C02 (p. ej., la mayora de las especies de Shigella) . Por el contrario, los microorganismos que usan la va butiln gluclica (es decir, VP positivos) producen cantidades copiosas de C02 (vase fig. 4-2). Por lo tanto, cuando se observan grandes cantidades de gas, se debe-ra considerar el grupo Klebsiella-Enterobacter-Hafnia-Serratia como la identificacin probable.

La formacin de alcohol etlico por microorganismos tiene gran importancia comercial en la manufactura de bebidas alcohlicas y reactivos orgnicos; sin embargo, su utilidad es limitada para la identificacin de bacterias en el laboratorio.

La ferrrientacin

Fermentacin butilengliclica

(1) (3) (2)

(3) Glucosa ij -12 H

(6) cido pirvico 1

--- -- 1 Fermentacin cido mixta

(3) (1)

7 ]" 3 co, \- , +4H (2) Acido ====> Alcohol actico etlico


Lactosa

Unin p-galactosdica

-- p-galactsido permeasa

Glucosa + Galactosa

Fig. 4-3. Fermentacin bacteriana de la lactosa: la lactosa, un disacrido compuesto de molculas de glucosa y galacto-sa unidas por un enlace P-galactosdico, difunde a travs de la pared bacteriana bajo la accin de la ~-galacts ido per-measa. Si la bacteria produce ~-galactosidasa , la lactosa es hidrolizada para producir glucosa y galactosa. La glucosa es luego metabolizada como se ilustra en la figura 4-1.

Pared celular Glucosa bacteriana

1

cidos mixtos (vase fig. 4-1)

manipulacin bastante ingeniosa de una molcula forma las bases para Ja prueba ONPG, la cual_ se resea en ~l diagrama 57. Esta prueba detecta la enzima ~-galactos1-dasa mucho ms rpidamente de lo que lo hace la prue-ba de fermentacin de la lactosa previamente descrita. Es til para la identificacin de Jos fermentadores tar-dos de la lactosa deficientes en ~-galactsido permeasa. El ONPG permeabiliza la pared bacteriana ms rpida-mente que la lactosa y, bajo la accin de la ~-galactos1-dasa se hidroliza a galactosa y o-nitrofenol (vase dia-gra~a 57). El o-nitrofenol es un crom?for~ 9ue no tiene color cuando est unido al o-galactop1ranos1do, pero es amarillo es su forma libre (no unida) (vase lmina co-lor 4-4A).

Las tabletas de prueba ONPG, que pueden ser fcil-mente reconstituidas por el agregado de una pequea cantidad de agua, estn disponibles comercialmente y son convenientes para utilizar en el laboratorio. Los mi-croorganismos con fuerte actividad de ~-galactosidas_a

ueden producir una prueba positiva en unos pocos mi-nutos despus de la inoculacin del medio. La prueba ONPG es ms til para Ja deteccin de actividad de ~-galactosidasa en fermentadores tardos de lactosa, como al-

1'\ gunas cepas de E. coli en las cuales la diferenciacin d~ especies de Shigella (excepto ciertas cepas de S. somm_~i) puede ser difcil por otro mtodo. La pr~eba es ~amb1en til para distinguir ciertas cepas de especies de Cttrobac-ter y Salmonella arizanae (ONPG-positivo) de ~a mayo-ra de las especies de Salmonella (ONPG-negat1vas). La prueba ONPG no es un sustituto de la dete cin..d.e-la fermentacion e 1a 1actosa porque slo se mide la en-zima ~-galactosidasa.

ACTIVIDAD CITOCROMO OXIDASA

Cualquier microorganismo que desarrolle actividad ci-tocromo oxidasa siguiendo los procedimientos y las con-diciones de prueba reseadas en el captulo 16 se excluye de Enterobacteriaceae. La reaccin de color que se desa-rrolla debe ser interpretada dentro de los 1 O a 20 segundos porque muchos microorganismos, incluidos miem~ros se-leccionados de Enterobacteriaceae, pueden producu reac-ciones falsas-negativas demoradas. Si hubiera alguna difi-cultad en interpretar Ja reaccin de la citocromo oxidasa, deben probarse tanto los microorganismos controles oxi-dasa-positivos como los oxidasa-negativos.

Los goteros comerciales de citocroin~ oxi?asa se usan con gran frecuencia debido a su convemencia. Las reac-ciones de color son claramente visibles en 10 segundos. Si se usan en el laboratorio asas metlicas de inoculacin enruladas o rectas para transferir bacterias al reactivo de oxidasa, las que son de acero inoxidable o de Nicrom pueden producir reacciones falsas positivas, debido a ~a presencia de trazas de xido de hierro en la superficie flameada del metal. Este problema puede solucionarse usando para inocular asas de plstico o de platino o pali-tos aplicadores de madera o hisopos pa~a llev~ a ca_bo ~a prueba de oxidasa. El reactivo tetrametil-1:7-femle~diaJ?lna se usa ms frecuentemente que el denvado d1met1lo, porque el reactivo es ms estable, ms sensible y menos txico (vanse cap. 16 y lmina color 4-lG).

REDUCCIN DE NITRATOS Todas las Enterobacteriaceae con excepcin de cier-

tos biotipos de Pantoea (Enterobacter) agglomerans y

ciertas especies de Serratia y Yersinia, reducen los nitra-tos a nitritos. Debido a que el perodo de incubacin que se requiere para llevar a cabo la prueba de reduccin de nitratos es variable (3 a 24 horas, segn el sistema usa-do), no se usa comnmente para hacer un relevamiento previo de aislamientos bacterianos desconocidos. Ms bien, la prueba se emplea en la mayora de los laborato-rios para confirmar la clasificacin correcta de un mi-croorganismo desconocido o como ayuda en la determi-nacin e identificacin de especies de bacterias. Los de-talles de la prueba de reduccin de nitratos se presentan en el diagrama 53.

Cualquier medie basal que soporte el crecimiento de microorganismos y contenga O, 1 o/o de concentracin de nitrato de potasio (KN03) es adecuado para llevar a cabo la prueba. El caldo nitrato o agar nitrato inclinado son las formas de presentacin del medio usado ms comn-mente en laboratorios clnicos. Dado que la enzima nitra-to reductasa tiene actividad mxima en condiciones anaerobias, ZoBell ha recomendado el uso de agar semi-slido. 129 El medio semislido tambin estimula el creci-miento de muchas especies de bacterias y provee el en-torno anaerobio que se necesita para la activacin de la enzima. El agregado de limaduras de cinc a todas las reacciones negativas , como se muestra en el diagrama 53, debera ser un procedimiento de rutina. La mayora de los microorganismos capaces de reducir nitratos, lo harn en 24 horas; algunos pueden producir cantidades detectables dentro de 2 horas. Una prueba rpida de ni-trato fue descrita por Schreckenberger y Blazevic.283 Tan-to la a-naftilamina como el cido sulfanlico son relati-vamente inestables, de modo que su reactividad debera ser determinada a intervalos frecuentes mediante la prue-ba de los microorganismos controles positivos y negati-vos. El compuesto de diazonio que se forma de la reac-cin del nitrato reducido y los reactivos tambin es rela-tivamente inestable, y el color tiende a decaer; de acuer-do con esto, las lecturas deberan hacerse inmediatamen-te despus de que se agregan los reactivos (vase lmina color 4-lH).

MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS PARA LA DETECCIN DE FERMENTACIN DE HIDRATOS DE CARBONO

Una variedad de diferentes medios lquidos o con agar pueden ser usados para medir la habilidad de un microor-ganismo para utilizar fermentativamente los hidratos de carbono. El principio de la fermentacin de hidratos de carbono se basa en los estudios de Pasteur sobre bacte-rias y hongos, escritos hace ms de 100 aos, los cuales afirman que la accin de muchas especies de microorga-nismos sobre un hidrato de carbono sustrato resulta en la acidificacin del medio. La frmula de un medio tpico base para la fermentacin contiene tripticasa (BBL), 10 g; cloruro de sodio, 5 g; rojo fenol, 0,018 g y agua destilada csp 1 L.

El hidrato de carbono que se va a probar como la glu-cosa, se filtra, esteriliza y se agrega aspticamente al me-dio basal hasta una concentracin final de 0,5% a 1 %. La tripticasa es un hidrolizado de casena que sirve como fuente de carbono y nitrgeno; el cloruro de sodio es un estabilizador osmtico; y el rojo fenol es un indicador de pH del medio que vira d~bajo de 6,8. La lmina color


4- lF ilustra las reacciones de fermentacin cida en cal-do prpura. Todas las Enterobacteriaceae crecen bien en este tipo de medio, y la frmula base usada es una cues-tin de preferencia personal. Adems de producir el cam-bio de color al modificar el pH en medios de cultivo pa-ra fermentacin , la produccin de cidos mixta, notable-mente cido butrico, genera a menudo un olor penetran-te y desagradable en el medio de cultivo. Cuando se de-tecta tal olor, inmediatamente se debe sospechar la pre-sencia de una de las Enterobacteriaceae (adems las bac-terias anaerobias generan productos metablicos caracte-rsticos con olores distintivos).

USO DE AGAR HIERRO DE KLIEGLERY AGAR HIERRO TRIPLE AZCAR

En la prctica, los microorganismos capaces de fer-mentar l~l1,1cosa en general se detectan mediante la ob- / servacin de las reacciones que ellos producen cuando se cultivan en agar hierro de Kliegler (KIA) o agar hierro I triple azcar (TSI) (fig. 4-4; vase lmina color 4- lE). Si un microorganismo no puede fermentar la glucosa, en-tonces se observa la superficie inclinada alcalina y en profundidad tambin alcalina (sin cambio) en el tubo (vase fig. 4-4A), lo cual indica la falta de produccin de cido y la falla del microorganismo prueba para fermen-tar cualquiera de los azcares presentes. Esta sola accin / es suficiente gara excluir un microorganismo de Entero- v bacteriaceae. La frmula de KIA se enumera en el re-cuadro 4-1 (la frmula de TSI es idntica excepto en que se agregan 10 g de sacarosa).

Varias observaciones son importantes para estudiar las frmulas de KIA y TSI. La incorporacin de cuatro deri-vados de protenas -extracto de carne, extracto de leva-dura, peptona y proteosa peptona- hace que KIA y TSI sean nutricionalmente muy ricos. La falta de inhibidor~ / perffiite el crecimiento de todas las especies bacterianas -V excepto las ms exigentes (excluidos los anaerobios obli-gados). Por esta razn, el agar KIA y TSI pueden ser sa- cvLm dos slo cuando se estn probando especies bacterianas p///l< seleccionadas de una colonia nia recuperada de placas --de agar primario o selectivo. La glucosa y la lactosa (y sacarosa en TSI) estn distribuidas por todo el tubo tan- v to en el pico de flauta como en profundidad. Sin embar-go, la factosa est presente en una concentracin 10 ve-ces mayor que la glucosa (de modo similar, la relacin

, sacarosa a glucosa es de 10: 1 en el medio TSI). Esta re- iY/ .;) !acin 1O:1 es importante para entender los principios }'"' biogumicos que se comentan ms adelante. El sulfato de / hierro es un detector de sulfuro de hidrgeno menos sen- v sible que otras sales fmcas o ferrosas; por lo tanto pue-de haber discrepancias en las lecturas de sulfuro de hi-drgeno entre KIA y TSI y otros medios de prueba (va-se lmina color 4-4B). El indicador rojo fenol es amari-llo a pH menor que 6,8. Dado que el pH~del med10 no inoculado se equilibra a pH con buffer 7,4, la produccin de cantidades relativamente pequenas de cido provocan un cambio visible de color.

PRINCIPIOS BIOQUMICOS

Los principios bioqumicos en los que se basan' las reacciones observadas en agar KIA y TSI se ilustran en


No fermentador ..q,.,_.

No "''!), fermentacin}

la superficie inclinada; y entre las 18 y las 24 horas, la superficie inclinada completa revierte a un pH alcalino y el color vuelve a ser rojo. En la porcin profunda (anae-robia) del tubo, la degradacin de aminocidos es insufi-ciente para contrarrestar el cido formado y el medio per-manece amarillo. Por lo tanto, una reaccin alcalina en la superficie inclinada y cida en profundidad en el KIA (o TSI) es un importante indicador inicial de un microorga-nismo prueba no fermentador de la lactosa (vanse fig . 4-4B y lmina color 4-lE).

Si el tubo KIA es inoculado con un microorganismo I fermentador de lactosa, entonces, aun cuando la glucosa

sea usada completamente despus de las primeras 8 a 12 horas, la fermentacin contina ya que el microorga-nismo es capaz de usar la lactosa (presente en una con-centracin 10 veces superior que la de la glucosa). En consecuencia, cuando se examina el tubo luego de 18 a 24 horas, la produccin de cido a partir de la fermenta-cin de la lactosa est ocurriendo an, y tanto la superfi-cie inclinada como la profundidad aparecen amarillas, lo que es consecuencia de una reaccin cida en la superfi-cie inclinada y cida en la profundidad (vanse fig. 4-4C y lmina color 4- lE).

Muchos microbilogos prefieren TSI a KIA porque el agregado de sacarosa a la frmula ayuda a investigar es-pecies de Salmonella y Shigella, ya que ninguna de stas (excepto cepas raras) metaboliza ni la lactosa ni la saca-rosa. Por lo tanto, cualquier reaccin de TSI indica que la lactosa o la sacarosa, o ambas, han sido fermentadas , ex-cluidas Salmonella y Shigella. Tambin debe recordarse

ENTEROBACTERIACEAE 179 /'

que Yersinia enterocolitica.fermenta la sacarosa, pero no la lactosa; por lo tanto, en TSI la reaccin ser cida-ci-da (similar a las coliforrnes corno E. coli), pero en KIA, la reaccin ser alcalin~ -cida (similar a los no ferrnen-tadori>s el-e ladosa) . En consecuencia, cuando se investi-gan muestras de materia fecal para Salmonella, Shigella y Yersinia , algunos podran argumentar que KIA es pre-ferible a TSI.

.J Para la deteccin de sulfuro de hidrgeno, que es inco-loro, el medio debe incluir un indicador. El tiosulfato de sodio es la fuente de tomos de azufre en la mayora de los medios usados para la produccin de sulfuro de hi-drgeno. Las sales de hierro (sulfato ferroso y frrico, ci-trato de amonio) se incorporan al medio de cultivo y reaccionan con sulfuro de hidrgeno para producir un precipitado negro insoluble (sulfuro de hierro). Se re-quiere un medio cido para que un microorganismo pro-duzca sulfuro de hidrgeno y, por lo tanto, debe proveer-se una fuente de iones hidrgeno. Dado que la profundi-dad de los tubos KIA y TSI se vuelve cida con la fer-mentacin de la glucosa (los iones hidrgeno aumentan), a menudo el ennegrecimiento se ve por primera vez all, particularmente con bacterias no fermentadoras de lacto-sa (vase lmina color 4- lE). Por lo tanto, el negro pro-fundo debera ser ledo corno cido si el color amarillo usual se oscurece con un precipitado negro. Los medios KIA y TSI son menos sensibles en la deteccin de sulfu-ro de hidrgeno que los medios que contienen hierro, co-mo el medio sulfuro indo! movilidad (SMI) (vase lmi-na color 4-4B) .

Si un microorganismo puede excluirse de Enterobac-teriaceae antes de que se establezca una extensa batera de pruebas bioqumicas se ahorra considerable tiempo y trabajo. Se recomienda que la superficie inclinada de KIA o TSI se utilice en todos los aislamientos que se sos-pecha que son Enterobacteriaceae al mismo tiempo que se utilicen los medios de prueba diferenciales. Aun cuan-do se trate de un microorganismo fermentador y se sos-peche que es Enterobacteriaceae, se debe llevar a cabo una prueba de citocromo oxidasa para excluir los mi-croorganismos pertenecientes a otros gneros de bacte-rias fermentadoras, como especies de Aeromonas, Plesiomonas, Vibrio y Pasteurella , que son oxidasa posi-tivos .

ELECCIN DE MEDIOS DE AISLAMIENTO RIMARIO

Deben usarse medios de cultivo selectivos para recu-perar las especies de bacterias importantes de las mues-tras que pueden alojar una mezcla de microorganismos. Para hacer rac!onal las selecciones. los microbilogos yf Al deben conocer la composicin de cada frmula y tlJ2ro- . r. psito y la 'cocentracin relativa

1/ 180 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

Se dispone de tres tipos generales de medio para la re-cuperacin de Enterobacteriaceae de muestras clnicas que potencialmente alojan bacterias mixtas: 1) medio no selectjyo para aislamiento primario (~_;_

QUMICOS Y COMPUESTOS USADOS EN MEDIOS SELECTIVOS

2) agar selectivo y diferencial (p. ej. , agar MacConkey y Q Hektoen entrico); y 3) caldos de enriquecimiento. En $' los cuadros 4-1y4-2 se comparan los diferentes medios El recuadro 4-3 enumera los tipos generales de qumi-

cos y los compuestos usados en medios selectivos e inclu-ye breves comentarios acerca de la funcin de cada uno.

~ '\\ comnmente usados en la prctica clnica. Las frmulas '- son complejas e incluyen ingredientes que no slo inhi- MEDIOS DE AISLAMIENTO SELECTIVOS

ben el crecimiento de ciertas especies bacterianas (selec-f vo ), sino que tambin detectan varias caractersticas

io umicas ue on im ortantes para hacer una identifi-cacin preliminar de los microorganismos presentes en la ~ferencial).

En 1905, MacConkeyl 94 describi por primera vez un medio selectivo diferencial Cagar rojo neutro-sales bi-liares) que l us para aislar bacilos entricos gramne-gativos de muestras que contenan mezclas de especies bacterianas. Incorpor lactosa y el indicador rojo neu-

CUADRO 4-1. MEDIOS SELECTIVOS DIFERENCIALES PARA LA RECUPERACIN DE ENTEROBACTERIACEAE ~ ~ ''

Medio Formulacin

Agar MacConkey (vase lmina 4-2A y B)

Peptona Poli peptona Lactosa Sales biliares Cloruro de sodio Agar

,. Rojo neutro Cristal violeta

17 g 3g

10 g 1,5 g

5g 13,5 g 0,03 g

0,001 g Agua destilada c.s.p.

pH final = 7, 1 l L

Agar eosina azul de me- Peptona tileno (EMB) Lactosa

(vase lmina color 4-2C Sacarosa* hasta F) Dipotsico, P04

Agar Eosina Azul de metileno Agua destilada c.s.p.

10 g 5g 5g 2g

13,5 g 0,4 g

0,065 g lL

pH final = 7 ,2

' '

Propsito e ingredientes diferenciales

El agar MacConkey es un medio de plaqueo diferencial para la se-leccin y recuperacin de Ente-robacteriaceae y bacilos gram-negativos entricos relacionados.

Las sales biliares y el cristal viole-ta inhiben el crecimiento pe bac-terias grampositivas y de algunas gramnegativas exigentes.

La lactosa es el nico hidrato de carbono.

Las bacterias fermentadoras de lactosa producen colonias que tienen distintos tonos de rojo, debido a la conversin del colo-rante indicador rojo neutro (rojo con pH por debajo de 6,8) por la produccin de cidos mixtos. Las colonias de bacterias no fer-mentadoras de la lactosa apare-cen sin color y transparentes.

El agar EMB es un medio de pla-queo diferencial que puede ser usado en lugar del agar MacCon-key en el aislamiento y deteccin de Enterobacteriaceae o deba-cilos coliformes de muestras con bacterias mixtas.

Los colorantes anilnicos (eosina y azul de metileno) inhiben a las bacterias grampositivas y a las gramnegativas exigentes. Se combinan para formar n preci-pitado a pH cido y, de ese mo-do, sirven tambin como indica-dores de la produccin de cido.

EMB Levine, con slo lactosa, da reacciones ms en paralelo con las del agar MacConkey; la fr-mula modificada tambin detecta fermentadores de la sacarosa.

* Frmula de Holt-Harris Teague modificada. Agar EMB Levine no contiene sacarosa.

Reacciones e interpretacin

Los fermentadores fuertes de la lactosa tpicos, como especies de Escherichia, Klebsiella y Ente-robacter producen colonias rojas rodeadas de una zona de bilis precipitada.

Los fermentadores lentos o dbi-les de la lactosa, como Citrobacter, Providencia, Serratia y Hafnia , pueden apare-cer sin color despus de 24 h o rosa plido en 24-48 h.

Las especies de Proteus, Edwad-siella, Salmonella y Shigella, con raras excepciones, producen colonias con poco color o trans-parentes .

Las colonias representativas de es-tas varias reacciones se muestran en la lmina color 4-2.

Las colonias de los fermentado-res de la,ctosa fuertes tpicos, notablemente Escherichia coli, son negro verdoso con brillo metlico.

Los fermentadores dbiles, inclui-dos Klebsiella, Enterobacter, Se-rratia y Hafnia, producen colo-nias prpura en 24-48 h.

Los no fermentadores de lactosa, que incluyen Proteus, Salmone-lla y Shigella, producen colonias transparentes.

Yersinia enterocolitica, un fermen-tador de sacarosa no fermenta-dor de lactosa, produce colonias transparentes en EMB Levine y colonias prpura a negro en la frmula modificada.

Vase lmina color 4-2.

ENTEROBACTER!ACEAE 181 V

tro en el medio para proveer un medio visual para de-tectar la utilizacin de lactosa por el organismo prueba. En ese momento, a todos los bacilos gramnegativos no formadores de esporas se los denominaba an bacilos entricos; sin embargo, los microbilogos haban reco-nocido que ciertas. especies eran ms patgenas para los humanos que otras. El patrn de utilizacin de hidratos

de carbono de varias especies de bacterias ya era cono-cido a fines del siglo, y la fermentacin de la lactosa, en particular, fue reconocida como un importante marca-dor para diferenciar ciertos patgenos entricos. En 1916, Holt-Harris y Teague 151 describieron un medio con eosina y azul de metileno como indicad para diferenciar entre las colonias fermentdoras y no fer-

Medio

Agar Salmonella-Shige-lla (SS)

Formulacin

Extracto de carne Peptona Lactosa Sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico Agar

5g 5g

10 g 8,5 g 8,5 g 8,5 g

Rojo neutro

1 g 12,5 g

0,025 g 0,033 g

lL Verde brillante Agua destilada c.s.p.

pH final, 7 ,4

Propsito e ingredientes diferenciales

El agar SS es un medio altamente selectivo formulado para inhibir el crecimiento de la mayora de los microorganismos coliformes y permitir el desarrollo de espe-cies de Salmonella y Shigella de muestras ambientales y clnicas.

Las altas concentraciones de sales biliares y citrato de sodio inhi-ben a todas las bacterias gram-positivas y muchos microorga-nismos gramnegativos, incluidos los coliformes.

La lactosa es el nico hidrato de carbono y el rojo neutro es el in-dicador para la deteccin de cido.

El tiosulfato de sodio es la fuente

Reacciones e interpretacin

Cualquier colonia fermentadora de lactosa que aparezca se colorea de rojo por rojo neutro. Ciertas cepas poco frecuentes de Salmo-nella arizanae son fermentado-ras de lactosa y pueden parecer-se a Escherichia coli.

El crecimiento de especies de Sal-monella no es inhibido, y las co-lonias aparecen sin color con centro negro, debido a la pro-duccin de sulfuro de hidrgeno. Las especies de Shigella mues-tran inhibicin variada y colo-nias sin color y sin ennegreci-miento.

Las cepas mviles de Proteus que aparecen en el agar SS no se dis-

de sulfuro. Cualquier bacteria persan.

Agar Hektoen entrico (HE)

(vase lmina color 4-3E y F)

que produce gas sulfuro de hi-drgeno se detecta por un preci-pitado negro formado con citrato frrico (relativamente insensi-ble).

La alta selectividad del agar SS permite el uso de un inculo car-gado.

Peptona 12 g El agar HE es una formulacin re-Extracto de levadura 3 g ciente diseada como un medio Sales biliares 9 g de plagueo indirecto para mu;-

} Lactosa 12 g tras fecales para incrementar el Sacarosa 12 g rendimiento de especies de Sal-Salicina 2 g monella y Shigella a pattir de Cloruro de sodio 5 g flora normal nuierosa. Tiosulfato de sodio 5 g L alta concentracin de sales bi-Citrato frrico de amonio 1,5 g liares inhibe el crecimiento de Fucsina cida 0,1 g todas las bacterias grampositivas Azul de timol 0,04 g y retarda el de muchas cepas co-Agar 14 g liformes. Agua destilada c.s .p. 1 L Pueden producirse cidos a partir

pH final , 7 ,6 de hidratos de carbono, y la fuc-sina cida, al reaccionar con el azul de timol, produce un color amarillo cuando baja el pH.

El tiosulfato de sodio es una fuen-te de sulfuro, y el gas sulfuro de hidrgeno se detecta mediante citrato frrico de amonio (relati-vamente sensible).

Los fermentadores rpidos de lac-tosa (como E. coli) son inhibi-dos moderadamente y producen colonias naranja brillante a rosa-do salmn.

Las colonias de Salmonella son azul-verdosas, tpicamente con centros negros de gas sulfuro de hidrgeno.

Shigella aparece ms verde que Salmonella, y las colonias pali-decen hacia la periferia.

Las cepas de Proteus son inhibi-das en cierta forma; las colonias que desarrollan son pequeas y transparentes, y de aspecto ms brillante o acuoso que el de las especies de Salmonella o Shige-lla. Vase lmina color 4-3.

(Contina)

'

v 182 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

CUADRO 4-2. MEDIOS ALTAMENTE SELECTIVOS PARA LA RECUPERACIN DE ENTEROBACTER/ACEAE A PARTIR DE MUESTRAS GASTROINTESTINAL (C NTINUACIN)" e ,e , '

Medio Formulacin Propsito e ingredientes

diferenciales Reacciones e interpretacin

Agar xilosa li sina desoxicolato (XLD) (vase lmina color 4-3A a D)

Xilosa Lisina Lactosa Sacarosa Cloruro de sodio Extracto de Levadura Rojo fenol

3,5 g 5g

7,5 g 7,5 g

5g 3g

0,08 g

El agar XLD es menos inhibidor del crecimiento de bacilos coli-formes que el agar HE y fue di-seado para detectar shigellae en heces despus de enriquecimien-to en caldo para gramnegativos.

Los microorganismoss como E coli y especies de Klebsiella-Enterobacter pueden usar ms de un hidrato de carbono y producir colonias amarillo brillante. Las colonias en muchas especies de Proteus son tambin amarillas.

Agar Deoxicolato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico de amonio Agua destilada c.s.p

13,5 g 2,5 g 6,8 g 0,8 g

Las sales biliares en concentracin relativamente baja hacen que el medio sea menos selectivo que los otros dos incluidos en este

La mayora de las especies de Salmonella producen colonias rojas, con centros negros de gas sulfuro de hidrgeno. cuadro.

1 L pH final, 7,4

Tres hidratos de carbono estn disponibles para la produccin de cido, y el rojo fenol es un indicador de pR

Shigella, Providencia y muchas especies de Proteus no usan nin-guno de Jos hidratos de carbono y producen colonias transparen-tes . Los microorganismos lisina positi-

vos, como especies de Salmone-lla, producen colonias inicial-mente amarillas debido a la utili-zacin de xilosa y colonias rojas retardadas por la descarboxila-cin de Ja lisina.

Colonias de Citrobacter son ama-rillas con centros negros; mu-chas especies de Proteus son amaiillas o transparentes con centros negros; las de Salmone-llae son rojas con centro negro. Vase lmina color 4-3. El sistema de deteccin de sulfuro

de hidrgeno es similar al del agar HE

mentadoras de lactosa. Se incluy sacarosa en el medio para detectar aquellos miembros del grupo coliforme que fermentan la sacarosa ms rpidamente que la lac-tosa.

Los agares MacConkey y EMB son solamente mode-_radamente inhjbjtorjqs y fueron diseados en principio para evitar el crecimiento de bacterias grampositivas a partir de cultivos mixtos. Muchas especies de microorga-nismos gramnegativos exigentes son inhibidas del mismo modo; sin embargo, todas las Enterobacteriaceae crecen bien. En el cuadro 4-1 se comparan las frmulas , ingre-dientes inhibitorios y caractersticas claves diferenciales para los agares MacConkey y EMB.

La decisin de usar agar MacConkey o EMB es ante todo una cuestin de preferencia personal, dado que las especies bacterianas que utilizan lactosa pueden ser dife-renciadas por ambos. El agar MacConkey contiene rojo neutro como indicador de pH y, como resultado, las co-lonias que metabolizan lactosa aparecen rosadas a partir de la produccin de cidos mixtos (vase lmina color 4-2A y B). Las bacterias que son fuertes productoras de cido, como E. coli, forman colonias rojo oscuro. Las bacterias productoras de bajas cantidades de cido for-man colonias rosado plido o colonias que son claras en la periferia y tienen centros rosados. Sobre agar EMB, las bacterias que son fuertes productoras de cido forman colonias con brillo metlico (vase lmina color 4-2C y D). La apariencia brillante es causada por la pre-cipitacin del colorante sobre las colonias, y es altamen-te indicativa de E. coli, aunque otros fuertes productores de cido, corno, Yersinia enterocolitica, pueden tener apariencia similar.

MEDIOS DE AISLAMIENTO ALTAMENTE SELECTIVOS USADOS PRINCIPALMENTE PARA MUESTRAS GASTROINTESTINALES

Los medios se hacen altamente selectivos mediante el agregado de una variedad de inhibidores a sus frmulas, generalmente en concentraciones ms altas que en agar MacConkey o EMB. Estos medios son usados primaria-mente para inhibir el crecimiento de E. coli y otros coli-formes , pero permiten el crecimiento de especies de Sal-monella y Shigella a partir de muestras de materia fecal.

Aqu se comentan varios medio~ selectivos formulados para su utilizacin en laboratorios clnicos. Los ms co-mnmente usados son el agar Salmonella-Shigella (SS), el agar xilosa-lisina-desoxicolato (XLD) y el agar Hek-toen entrico (HE). stos se describen en el cuadro 4-2.

La decisin respecto de cul de estos medios usar pa-ra la recuperacin de patgenos entricos de muestras fe-cales depende de la preferencia personal y de las especies que van a ser seleccionadas. En general, estos medios se emplean en el laboratorio clnico para la recuperacin de especies de Salmonella y Shigella de muestras de mate-ria fecal diarreica, o en laboratorios de salud pblica pa-ra investigar una posible contaminacin fecal de suminis-tros de agua y comida. Virtualmente todas las especies crecen bien en presencia de sales biliari;!s , lo cual explica por qu la vescula biliar a menudo sirve como reservo-rio en los seres humanos portadores. Se agregan sales bi-liares al medio selectivo debido a que otras especies de bacilos entricos, incluidas algunas de las cepas de Shi-gella ms exigentes, crecen poco o no crecen. El agar SS y el HE contienen concentraciones relativamente altas de

RECUADRO 4-4. SELECCIN DE MEDIOS DE CULTIVO PARA MUESTRAS FECALES O HISOPADOS RECTALES

l. Inocular la muestra directamente en placas de agar MacConkey o EMB para aislamiento primario de todas las especies de bacilos entricos gramnegativos.

2. Inocular directamente o en placas de agar XLD o HE para la investigacin ~electiva de especies de Salmone-lla o Shigella.

3. Enriquecer una pequea porcin de la muestra median-te inoculacin cargada de caldos selenito o GN. Si se usa selenito, subcultivar a agar HE dentro de las 8 a 12 horas; si se usa GN, subcultivar dentro de las 4 ho-ras. Nota: en el laboratorio del autor este paso no es lle-vado a cabo de rutina a menos que se investiguen pa-cientes asintomticos para detectar la presencia de un estado portador.

4. Incubar todas las placas de cultivo a 35C durante 24 a 48 horas. Seleccionar colonias sospechosas para la identificacin bioqumica definitiva o para pruebas se-rolgicas.

Para muestras distintas de heces o hi sopados rectales, una combinacin de agar MacConkey o EMB y de agar sangre es en general suficiente. No se requieren medios con mayores propiedades inhibidoras de modo rutinaro ya que la concentracin de la flora comensal o microor-ganismos contaminantes es relativamente baja en la ma-yora de las muestras no entricas. Puede efectuarse un subcultivo a un medio ms inhibidor en los casos en que parezca necesario.

Para muestras fecales e hisopados rectales es necesa-rio seleccionar slo un medio de cada uno de los grupos listados en los cuadros 4-1 y 4-2. Se sugiere la aproxima-cin reseada en el recuadro 4-4.

CARACTERSTICAS DIFERENCIALES DE IDENTIFICACIN

Aunque la identificacin preliminar de Enterobacte-riaceae se basa posiblemente en las caractersticas de las colonias y las reacciones bioqumicas en medios de ais-lamiento primarios, otras tcnicas de identificacin de especies requieren la determinacin de caractersticas fe-notpicas adicionales ue refle an el cdigo entico la 1 entidad nica de los microor anismos que se prueban .

sta discusin tiene el propsito de revisar os echos so-bresalientes de las pruebas que miden estas caractersti-cas fenotpicas y que son usadas comnmente en labora-torios clnicos. Esta orientacin es necesaria para que el personal del laboratorio pueda comprender los principios que se encuentran detrs de estos procedimientos con el fin de reconocer y corregir cualquier inconsistencia bio-qumica, problemas con cultivos mixtos y fallas en las tcnicas. No es posible comentar la variedad de diferen-tes pruebas y numerosos esquemas disponibles para la identificacin final de especies de Enterobacteriaceae. Sin. embargo, en el recuadro 4-5 se enumeran varias de


las pruebas ampliamente usadas en los laboratorios clni-c9s para medir las caracter:sticas metablicas por las cuales pueden identificarse todas las especies de Entero-bacteriaceae con excepcin de unos pocas especies raras y atpicas. La utilizacin de hidratos de carbono y la ac-tividad ONPG ya han sido comentadas.

PRODUCCIN DE INDOL

El indo] es uno de los productos de degradacin del metabolismo del aminocido triptfano. Las bacterias que poseen la enzima triptofanasa pueden clivar el tript-fano, y de este modo producir indol, cido pirvico y amonio. El indo] puede detectarse en un medio triptfa-no de prueba mediante la observacin del desarrollo de color rojo despus de agregar una solucin que contiene p-dimetilaminobenzaldehdo (p. ej., Reactivo de Ehrlich o de Kovac). La bioqumica y los detalles de la prueba de indol se ilustran esquemticamente en la figura 4-5 y el diagrama 40, respectivamente. Se muestra una reproduc-cin color en la lmina color 4-4C.

La eleccin entre los reactivos de Ehrlich o Kovacs de-pende de la preferencia personal. El reactivo de Ehrlich es ms sensible y se prefiere cuando se prueban bacilos no fermentadores o anaerobios en los cuales la produc-cin de indo] es mnima. Dado que el indo] es soluble en compuestos orgnicos, debera agregarse xileno o cloro-formo al medio de prueba antes del reactivo de Ehrlich. Este paso de extraccin es menos crtico en el caso del reactivo de Kovac porque se usa alcohol amlico para di-luir (con e l reactivo de Ehrlich se usa alcohol etlico).

PRUEBA DEL ROJO DE METILO

En la figura 4-2 se ilustra un esquema simplificado que muestra slo dos caminos alternativos (cido mixto y bu-tilengliclico) para el metabolismo del piruvato formado a partir de la fermentacin de la glucosa. Las bacterias que siguen en primer trmino la fermentacin cido mix-ta a menudo producen suficiente cido para mantener el

RECUADRO 4-5. PRUEBAS USADAS PARA MEDIR LAS CARACTERSTICAS METABLICAS DE ENTEROBACTERIA-CEAE

Utilizacin de hidratos de carbono Actividad de o-nitrofeni l-~-D-galactopiransido (ONPG) Produccin de indol Rojo de metilo Prueba de Voges-Proskauer (produccin de acetil-metil-

carbinol [acetooa]) Utilizacin de citrato Produccin de ureasa Descarboxilacin de la lisina, Ja ornitina y la arginina Produccin de fenilalanina desaminasa Produccin de sulfuro de hidrgeno Movilidad

~ 186 DIAGNSTICO MICROBIOLGICO

Xileno

Fig. 4-5. Formacin de indo! por bacterias producto-ras de triptofanasa que crecen en medios de cultivo que contienen triptfano. El indo! es uno de los productos de degradacin inmediata (adems de cido pirvico y amonio) que resultan de la desaminacin del triptfa-no. El indo! puede ser extrado de la fase acuosa del medio mediante cloroformo y detectado por la adicin de reactivo de Ehrlich (dimetilaminobenzaldehdo).

p-Dimetilaminobenzaldehdo (color rojo)

Indo!

Pi ruvato

Medio triptfano Caldo triptfano Agar sulfuro-indol-movil idad (SIM}

Triptfano Agar movil idad-indol-orn itina (MIO)

Bacteria

pH por debajo de 4,4. La prueba del rojo de metilo pro-porciona caractersticas valiosas para la identificacin de especies bacterianas que producen cidos fuertes a partir de la glucosa.

Los detalles de la prueba del rojo de metilo se mues-tran en el diagrama 48. La prueba, como se describi ori-ginalmente, requiere .48 a 72 horas de incubacin antes de que pueda obtenerse un resultado vlido, una cantidad de tiempo inaceptable para la mayora de los laboratorios de microbiologa clnicos. Barry y col.,22 describieron una modificacin que puede leerse entre las 18 a 24 ho-ras. Se emplea una alcuota de caldo de 0,5 mL con un inculo relativamente cargado para probar el microorga-nismo. Despus de 18 a 24 horas de incubacin a 35C se agregan 1 o 2 gotas de reactivo rojo de metilo, el desarro-llo de color rojo indica prueba positiva (vase lmina co-lor 4-4C). La modificacin de Barry es tan certera como la prueba originalmente descrita y ahorra una cantidad significativa de tiempo.

PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

Los detalles de la prueba de Voges-Proskauer se ilus-tran en el diagrama 75; esta prueba se basa en la conver-sin de acetil-metil-carbinol (acetona) a diacetilo a tra-vs de la accin del hidrxido de potasio y el oxgeno at-

mosfrico. El diacetilo se convierte en un complejo rojo bajo la accin cataltica del a-naftol y la creatinina (va-se lmina color 4-4D).

Ntese, en la figura 4-2, que la formacin de acetona y butilenglicol es un camino alternativo para el metabolismo del cido pirvico. Las bacterias que usan este camino, co-mo ciertas cepas dentro del grupo de Klebsiella-Entero-bacter-Serratia-Hafnia, producen slo pequeas cantida-des de cidos mixtos, que pueden ser insuficientes para disminuir el pH del medio rojo de metilo lo suficiente pa-ra producir un cambio de color. En consecuencia, la mayo-ra de las especies de Enterobacteriaceae Voges-Proskauer positivas, con raras excepciones, son rojo de metilo nega-tivas y viceversa (vase lmina color 4-4C y D).

UTILIZACIN DEL CITRATO

El principio de la prueba de utilizacin del citrato (dia-grama 12) es determinar la capacidad de un microorga-nismo para usar citrato de sodio como nica fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento.

La frmula original, descrita por Koser en 1923, con-sista en un caldo que contena fosfato de sodio y amo-nio, fosfato monopotsico, sulfato de magnesio y citrato de sodio. Se omitieron las protenas y los hidratos de car-bono como fuentes de carbono y de nitrgeno. El punto

final de la prueba de Ko'Ser era la presencia o Ja ausencia de turbidez visible despus de la incubacin del microor-ganismo prueba; este punto final es en realidad una me-dida de la capacidad del microorganismo de utilizar el carbn del citrato de sodio y producir un crecimiento su-ficiente para volverse visible. Sin embargo, se reconoci rpidamente que poda ocurrir turbidez no especfica en el medio de Koser. -

Simmons287 resolvi este problema con el agregado de agar y azul de bromotimol a la frmula de Koser, lo cual provee un punto final ms sensible. El agar citrato de Simmons se vierte en un tubo de prueba y se inclina. Se estra un inculo liviano de una colonia de crecimiento del microorganismo prueba sobre la superficie oblicua del agar. Si el inculo es muy cargado, los compuestos orgnicos preformados dentro de las paredes celulares tle bactefias moribundas pueden liberar suficiente carbon9 y nitrgeno para producir una prueba con resultado false positivo. Cuando se inocula una serie de tubos de medio de cultivo diferencial con un microorganismo desconoci-do, es importante que el medio citrato sea estriado prime-ro para prevenir el arrastre de protenas o hidratos de cf'= bono de otro medio.

La produccin de color azul en el medio de prueba despus de 24 horas de incubacin a 35C indica la pre-sencia de productos alcalinos y un resultado positivo de la prueba de utilizacin del citrato (vase lmina color 4-4D). Si se utiliza el carbn a partir del citrato de sodio, el nitrgeno se extrae del fosfato de amonio contenido en el medio, con lo cual se libera amonio. En ocasiones se detecta un crecimiento visible a lo largo de la estra an-tes de la conversin del medio al color azul. El creci-miento visible tambin indica una prueba de resultado positivo. El malonato, el acetato y el mucato son otros ra-dicales aninicos comnmente empleados para determi-nar la capacidad de las bacterias para usar estos com-puestos simples como nica fuente de carbono.

El acrnimo IMVIC (indo! , rojo de metilo, Voges-Proskauer y citrato) era utilizado por los sanitaristas y epidemilogos para referirse a las pruebas necesarias pa-ra detectar contaminacin fecal en el agua y la comida. Escherichia coli ha sido usado durante muchos aos por profesionales de salud pblica para indicar contamina-cin fetal. Enterobacter aerogenes produce colonias en medio de aislamiento primario que a menudo no pueden ser distinguidas de las de Eschericla coli. Sin embargo, la recuperacin de E. aerogenes a partir de la comida y el agua potable no necesariamente indica contaminacin fecal porque el microorganismo est ampliamente distri-buido en el suelo, los pastos y el material vegetal. Por lo tanto, se necesita un conjunto de caractersticas bioqu-micas para diferenciar los dos microorganismos. Las pruebas IMVIC fueron adoptadas para servir a este pro-psito. La mayora de las cepas de E. coli fueron indo! rojo de metilo positivas y Voges-Proskauer citrato nega-tivas. E. aerogenes tpicamente produce reacciones opuestas (vase lmina color 4-4C y D). Aunque las ca-ractersticas individuales incluid


CUADRO 4-4. MEDIO PARA LA DETECCIN DE SULFURO DE HIDRGENO

Sulfito de bismuto Agar sulfuro citrato

Medio

Agar desoxicolato citrato

Agar lisina hierro

Agar hierro de Kligler Agar hierro triple azcar

Agar ~cetato de plomo Agar.Salmonella-Shigella

Medio sulfuro-indol-movilidad

Xilosa-lisina-desoxicolato o Hektoen entrico

~ ~Cj!n los sis~nas de deteccin de H2S, el punto final es ' su1fil~ , unnrilar'pesadQ insoluble que produce un preci-

pitado negro en el medio o en la tira de papel de filtro . Dado que debe haber iones hidrgeno disponibles para la formacin de H2S, el ennegrecimiento se observa prime-ro en la zona del medio de prueba en la cual la formacin de cido es mxima, esto es, a lo largo de la lnea de ino-culacin, dentro del agar profundo e inclinado o en el centro de las colonias que crecen sobre la superficie de

~~ .

MOVILIDAD

Otra caracterstica importante para hacer la identifica-cin final de especies es la movilidad bacteriana. Las bacterias se mueven por medio de flagelos, cuyo nmero y localizacin varan entre las diferentes especies. Se dis-pone de tinciones flagelares para su determinacin (va-se cap. 5).

La movilidad bacteriana se puede apreciar directamen-te ubicando una gota del caldo de cultivo sobre un por-taobjetos y observndolo microscpicamente. Se dispo-ne de cmaras de gota pendiente de modo que la prepa-racin se pueda ver bajo mayor aumento sin peligro de bajar los objetivos hasta la gota contaminada. Esta tcni-ca se utiliza en primer lugar para detectar la movilidad de es ecies bacterianas ue no crecen bien en a ar senus-~ m em argo, ntero acterzaceae crece bien, y los tubos que tienen agar semislido son los que se emplean ms comnmente.

RECUADRO 4-6. CMO SE PRODUC E H2S'?

1. Liberacin de sulfuro de la cistena o el tiosulfato por la accin de enzimas bacterianas.

2. Acoplamiento de sulfuro (S2) con ion hidrgeno (W) para formar H2S.

3. Deteccin de H2S por hierro, bismuto o plomo que producen sulfuros de metales pesados que aparecen como precipitados negros.

Fuente de sulfuro

Peptonas ms sulfito

Tiosulfato de sodio

Peptonas

Tiosulfato de sodio

Tiosulfato de sodio

Tiosulfato de sodio

Tiosulfato de sodio Tiosulfato de sodio

Tiosulfato de sodio

Tiosulfato de sodio

Indicador de H2S

Sulfato de hierro

Citrato frrico de amonio Citrato frrico

Citrato frrico de amonio

Sulfato ferroso Sulfato ferroso

Acetato de plomo Citrato frrico

Hierro peptonizado

Citrato frrico de amonio

El medio para movilidad tiene una concentracin de agar de 0,4% o menos. A altas concentraciones, el gel es demasiado firme para permitir que los microorganismos se diseminen libremente. Las combinaciones de medios, como medio SIM 195 o agar MI092 han encontrado am-plio uso en los laboratorios de microbiologa clnica por-que se puede medir ms de una caracterstica en el mis-mo tubo. Primero se debe interpretar la prueba de movi-lidad, porque la adicin de un reactivo de indol puede oscurecer los resultados. Dado que el medio SIM y el agar MIO tienen una leve turbidez de fondo, las inter-pretaciones pueden ser algo difciles con especies bacte-rianas que crecen lentamente en estos medios. En estos casos se recomienda el medio para la prueba de movili-dad (recuadro 4-7) porque soporta el crecimiento de la mayora de las bacterias exigentes y tiene apariencia de cristal claro.

1 La prueba de movilidad se interpreta haciendo un exa-

men macroscpico del medio pai:_a detectar una zona di- 1 I fusa de crecimiento que se proyecta sob!_ nea de ino-Clacin (vase lmina color 4-4H). Se ha postu a o e -uso de sales de tetrazolio en medios de movilidad como una ayuda para la deteccin visual del crecimiento bac-teriano. Las sales de tettazolio son incoloras pero se con-vierten en complejos rojos de formazn insolubles por las propiedades reductoras de las bacterias en crecimien-to. En un medio para la prueba de movilidad que contie-ne tetrazolio, el desarrollo de este color rojo ayuda a se-guir la diseminacin de la bacteria desde la lnea de ino-culacin; sin embargo, estas sales pueden inhibir a cier-tas bacterias exigentes y no pueden ser usadas en todos los casos.

RECUADRO 4-7. MEDIO DE PRUEBA DE MOV ILIDAD (EDWARDS Y E WI NG)

Extracto de carne, 3 g

Peptona, 10 g Cloruro de sodio, 5 g

Agar, 4 g

Agua destilada, c.s.p. 1 L

pH final 7,3 t.

Protocolos 1 3 8 5

P rotocolo 1-3

P r u e b a d e l a c o a g u l a s a e n p o r t a o b j e t o s (c o n t.)

pueden servir de control positivo y negativo, respectivamente. Cada frasco de plasma de conejo con EDTA reconstituido debe probarse con cultivos de 18 a 24 horas de las cepas control.

IV. Procedimiento1. Prueba en portaobjetos (coagulasa unida): colocar dos gotas de agua o solucin fisiolgica estriles dentro de dos crculos dibu

jados con un lpiz de cera en un portaobjetos de vidrio. Emulsificar suavemente material de colonias del microorganismo por identificar en el lquido que se encuentra dentro de cada uno de los crculos. Agregar una gota de plasma para la prueba de la coagulasa a la suspensin en uno de los crculos y mezclar con un palillo de madera. Colocar otra gota de agua o solucin fisiolgica en el otro crculo, como control. Rotar el portaobjetos hacia adelante y atrs, buscando aglutinacin en la suspensin de prueba.

2. Prueba en tubo (coagulasa libre): emulsificar una pequea cantidad de la colonia del microorganismo en un tubo que contenga0,5 mL de plasma para la prueba de la coagulasa. Incubar el tubo a 35 C durante 4 horas y observar si se forma un cogulo inclinando suavemente el tubo. Si en ese momento no se observan cogulos, reincubar el tubo a temperatura ambiente y leer otra vez despus de 18 horas.

V. ResultadosA. Interpretacin

1. Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detectar dentro de los 10 a 15 segundos de mezclar el plasma con la suspensin por la formacin de un precipitado blanco y la aglutinacin de los microorganismos de la suspensin. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en el trmino de 2 minutos. El control con solucin fisiolgica debe permanecer uniforme y lechoso. Si la suspensin control tambin se aglutina, la prueba no puede leerse. Todas las cepas coagulasa positivas pueden informarse como Staphylococcus coagulasa positivo o, con menor precisin, como Staphylococcus aureus. Todas las cepas que producen pruebas negativas en portaobjetos deben ser probadas mediante la prueba en tubo.

2. Prueba en tubo: la prueba de la coagulasa en tubo se considera positiva si se detecta cualquier grado de formacin de cogulos. El tubo debe inclinarse con suavidad y no agitarse, ya que la agitacin puede deshacer los cogulos parcialmente formados. Las fibrinolisinas producidas por los microorganismos tambin pueden disolver los cogulos poco despus de su formacin. Los tubos que son negativos despus de 4 horas deben incubarse a temperatura ambiente durante la noche y leerse despus de 18 horas.

P rotocolo 1-4

P r u e b a d e l in d o l

I. PrincipioEl indol. un bencilpirrol, es uno de los productos de degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que tienen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano. con produccin de indol, cido pirvico y amonaco. La produccin de indol es una caracterstica importante para la identificacin de muchas especies de microorganismos, de particular utilidad en la diferenciacin de Escherichia coli (positiva) de los miembros del grupo Klebsiella-Enterobacter-Hajhia-Serratia (la mayora negativas).

La prueba del indol se basa en la formacin de un complejo de color rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehido del p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el producto qumico activo de los reactivos de Kovac y de Ehrlich. Debe utilizarse un medio rico en triptfano. En la prctica se utilizan medios combinados, como el medio de sulfuro indol para motilidad (SIM), el medio para motilidad indol omitina (MIO) o el medio indol nitrato. Las pruebas rpidas en mancha, utilizando tiras de papel de filtro impregnadas con el reactivo p-dimetilaminocinnamaldehdo, son tiles para la deteccin sistemtica de bacterias que producen indol con rapidez.

II. Medios y reactivosA. Caldo triptfano (triptfano al 1%)

P e p to n a o d ig e r id o p a n c re tic o d e c a s e n a (tr ip tic a s a ) 2 gC lo ru ro d e s o d io 0 ,5 gA g u a d e s tila d a 100 m L

B. Reactivo de KovacA lc o h o l a m lic o o is o a m ilic o p uro 15 0 m Lp -d im e tila m ln o b e n z a ld e h d o 10 gH C I c o n c e n tra d o 5 0 m L

1 3 8 6 Protocolos

P rotocolo 1-4

P r u e b a d e l i n d o l (cont.)

B. Reactivo de Ehrlichp -d im e tila m in o b e n z a ld e h d o 2 gA lc o h o l e tlic o a b s o lu to 190 m LH C I c o n c e n tra d o 4 0 m L

III. Control de calidadCada lote nuevo de medios o de reactivos debe ensayarse con pruebas negativas y positivas para indol. Los siguientes microorganismos son tiles como controles:A. Control positivo: Escherichia coli.B. Control negativo: Klebsiella pneumoniae.

IV. ProcedimientoSembrar el caldo triptfano (u otros medios apropiados para indol) con el microorganismo por probar e incubar a 35 C durante 18 a 24 horas. Una vez transcurrido este tiempo, agregar 15 gotas del reactivo haciendo que se deslicen por la pared del tubo. Si se utiliza el reactivo de Ehrlich, este paso debe ser precedido por el agregado de 1 mL de xilol. Esto no es necesario con el reactivo de Kovac.


El desarrollo de un color rojo fucsia brillante en la interfaz del reactivo y del medio lquido (o de la capa de xilol) segundos despus de agregar el reactivo indica la presencia de indol y constituye una prueba positiva (vanse lminas en color 6-4C y 7-2C).

VI. BibliografaBlazevic DJ, Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:63-67.Isenberg HD, Sundheim LH. Indole reactions in bacteria. J Bacteriol 1958;75:682-690.MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:173-183.Miller JM, Wright JW. Spot ndole test: Evaluation of four reagents. J Clin Microbiol 1982;15:589-592.Vracko R, Sherries JC. Indole-spot test in bacteriology. Am J Clin Pathol 1963;39:429-432.

M E C A N IS M O DE LA R E A C C I N D E L IN D O L

B

C HO

N (C H 3)2

Indo l p -N ,N -d im e tila m n o -b e n z a ld e h d o

C o m p u e s to q u in o id a l ro jo v io l ce o d i[4 -( in d o l-3 - il-m e tile n )-2 ,5 -

c ic lo -h e xa d ie n -1 - ilid e n o ]-d im e til- sa l a m n ic a

H 20

A g u a

(R o sa -ro jo )

Protocolos 1 3 9 3

P rotocolo 6-2

R e d u c c i n d e n i t r a t o s : a p l i c a c i o n e s g e n e r a l e s ( c o n t.)


El desarrollo de color rojo dentro de los 30 segundos despus de agregar los reactivos de prueba indica la presencia de nitritos y representa una reaccin positiva para reduccin de nitratos (vase lmina en color 6-1H). Si no se observa color despus de agregar los reactivos de prueba, esto puede indicar que no se han reducido los nitratos (reaccin realmente negativa) o que han sido reducidos a productos diferentes de los nitritos, como amonaco, nitrgeno molecular (denitrificacin), xido ntrico (NO) u xido nitroso (N ,0 ) e hidroxilamina. Como los reactivos de prueba slo detectan nitritos, los ltimos procesos dan resultados falsos negativos. Por lo tanto, es necesario agregar una pequea cantidad de polvo de cinc a todas las reacciones negativas. Los iones cinc reducen los nitratos a nitritos, y el desarrollo de un color rojo despus de agregar el polvo de cinc indica la presencia de nitratos residuales y confirma que la reaccin es verdaderamente negativa.

VI. BibliografaFinegold SM, Martin WJ. Scott EG. Bailey and Scotts Diagnostic Microbiology, 5a ed. St. Louis: Mosby, 1978:490.MacFaddin JE Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:236-245. Wallace GI, Neave SL. The nitrite test as applied to bacterial cultures. J Bacteriol 1927;14:377-384.

P rotocolo 6-3

R o j o d e m e t il o

I. PrincipioEl rojo de metilo es un indicador de pH con un rango entre 6 (amarillo) y 4,4 (rojo). El pH al cual el rojo de metilo detecta los cidos es mucho msibajo que el pH correspondiente a otros indicadores utilizados en medios de cultivo bacteriolgicos. Por lo tanto, para provocar un cambio de color, el microorganismo en estudio debe producir grandes cantidades de cido del sustrato de hidratos de carbono que se utilice.

La prueba del rojo de metilo es una prueba cuantitativa de la produccin de cido, que requiere que los microorganismos positivos produzcan cidos fuertes (lctico, actico, frmico) de la glucosa a travs de la va de fermentacin cida mixta (vase fig. 6-2). Como muchas especies de la familia Enterobacteriaceae pueden producir suficientes cantidades de cidos fuertes que pueden detectarse mediante el indicador rojo de metilo durante las fases iniciales de la incubacin, slo los microorganismos que pueden mantener este pH bajo despus de incubaciones prolongadas (48 a 72 horas), superando el sistema buffer del medio, pueden ser llamadas positivas para rojo de metilo.

H / l

HO

R E A C C I N D E L R O JO D E M E T IL OC H 2O H

. h V a m e ta b lica g lu c o lt lc a

V\ O H H l \

2 H 3C C,

O Hde E m b d e n -M ye rh o ff

O V a d e c id o s--------------------- c id o s m ix to s + 2 C 0 2

C O O H m ix to s

H O H

a - D - g l u c o s a c id o p ir v ico Ip H D i x id o d e c a rb o n o

Q R o jo de m e tilo ----------------------------------------------------------------------------------------------------- R ojo d e m e tilo

(A m a rillo ) (R o jo )pH 6 ,0 pH 4 ,4 o m e n o r

II. Medios y reactivosEl medio utilizado con mayor frecuencia es el caldo de rojo de metilo-Voges-Proskauer (MR/VP) segn la frmula de Clark y Lubs. Este medio tambin sirve para realizar la prueba de Voges-Proskauer.

1 3 9 4 Protocolos

P rotocolo 6-3

R o jo d e m e t il o (cont.)

A. Caldo VP/RM

P o lip ep to n a 7 9G lu co sa 5 gF o s fa to d ip o t s ic o 5 gA g u a d e s tila d a , esp 1 L

pH fin a l = 6 ,9

B. Indicador de pH rojo de metilo.Rojo de metilo, 0,1 g en 300 mL de alcohol etlico al 95%.Agua destilada, 200 mL.

III. Control de calidadRealizar controles positivos y negativos despus de la preparacin de cada lote de medio y luego de hacer cada lote de reactivos. Los controles sugeridos son los siguientes:A. Control positivo: Escherichia coli.B. Control negativo: Enterobacter aerogenes.

IV. Procedimiento1. Sembrar el caldo MR/VP con un cultivo puro del microorganismo en estudio. Incubar el caldo a 35 C durante 48 a 72 horas (no

menos de 48 horas).2. Finalizada la incubacin, agregar 5 gotas del reactivo de rojo de fenol directamente al caldo.


El desarrollo de color rojo estable en la superficie del medio indica la suficiente produccin de cido como para disminuir el pH a 4,4 y constituye una prueba positiva (vase lmina en color 6-4C). Como otros microorganismos pueden producir pequeas cantidades de cido del sustrato probado, puede observarse un color naranja, intermedio entre amarillo y rojo. Esto no indica una prueba positiva.

VI. BibliografaBarry AL. et al. Improved 18-hour methyl red test. Appl Microbiol 1970:20:866-870.Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:75-77.Clark WM. Lubs HA. The differentiation of bacteria of the colon-aerogenes family by the use of indicators. J Infect Dis 1915; 17:160. MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:209-214.

P rotocolo 6-4

P r u e b a d e V o g e s -P r o s k a u e r

I. PrincipioVoges-Proskauer es un epnimo doble, en honor de dos microbilogos que trabajaron a principios del siglo xx. Estos investigadores fueron los primeros en observar la reaccin de color rojo producida en medios de cultivo adecuados despus del tratamiento con hidrxido de potasio. Luego se descubri que el producto activo del medio, formado por el metabolismo bacteriano, es el acetil metil carbinol, producto de la va del butilenglicol.

El cido pirvico, el principal compuesto formado durante la degradacin fermentativa de la glucosa, se metaboliza ms tarde a travs de diferentes vas metablicas, segn los sistemas enzimticos que tengan las diferentes bacterias. Una de esas vas da como resultado la produccin de acetona (acetil metil carbinol), un producto final de reaccin neutra. Los microorganismos del grupo Klebsiella- Enterobacter-Hafnia-Serratia producen acetona como producto metablico final principal del metabolismo de la glucosa y forman cantidades pequeas de cidos mixtos. En presencia de oxgeno atmosfrico e hidrxido de potasio al 40%, la acetona se convierte a diacetilo y el a-naftol sirve de catalizador para producir un complejo de color rojo.

Protocolos 1 3 9 5

P rotocolo 6-4

P r u e b a d e V o g e s - P r o s k a u e r (c o n t.)

V a g lu c o ltic a

. OH H

Va del----------------------------------- 2 H 3C C

de E m b d e n -M ye rh o ff x CO O H b u tile n g lico l

I- H O C C

.O+ 2 C 0 2

C H 3"C H 3

H O Ha - D - g l u c o s a - c id o p irv ico A c e to n a (A M C ) D i x id o d e c a rb o n o

04-of --- ^ ----^,C-

1 3 9 6 Protocolos

Protocolo 6-4

P r u e b a d e V o g e s - P r o s k a u e r (cont.)


El desarrollo de color rojo 15 minutos o ms despus del agregado de los reactivos, que indica la presencia de diacetilo, el producto de oxidacin de la acetona, constituye una prueba positiva (vase lmina en color 6-4D). La prueba no debe leerse ms all de una hora despus de dejar los tubos en reposo, porque los cultivos Voges-Proskauer negativos pueden producir un color cobrizo, que se puede interpretar como un positivo falso.

VI. BibliografaBarritt MM. The intensifcation of the Voges-Proskauer reaction by the addition of a-naftol. J Pathol Bacteriol 1936;42:441-454. Barry AL, Feeney KL. Two quick methods for Voges-Proskauer test. Appl Microbiol 1967; 15:1138-1141.Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley. 1975:105-107.MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:308-320.Voges O, Proskauer B. Beitrag zur Ernhrungsphysiologie und zur Differential-diagnose der Bakterien der hmorrhagischen

Septicaemia. Z Hyg 1898;28:20-32.

P rotocolo 6-5

U t il iz a c i n d e l c it r a t o

I. PrincipioEl citrato de sodio es una sal del cido ctrico, compuesto orgnico simple que se encuentra como uno de los metabolitos del ciclo de los cidos tricarboxlicos (ciclo de Krebs). Algunas bacterias pueden obtener energa de fuentes distintas de la fermentacin de los hidratos de carbono, con el citrato como nica fuente de carbono. La medicin de esta caracterstica es importante para identificar muchos miembros de la familia Enterobacteriaceae. Cualquier medio usado para detectar la utilizacin del citrato por las bacterias que se van a probar debe carecer de protenas e hidratos de carbono como fuente de carbono.

La utilizacin del citrato por la bacteria que se va a probar se detecta en el medio de citrato por la produccin de subproductos alcalinos. El medio contiene citrato de sodio, que es un anin, como nica fuente de carbono, y fosfato de amonio como nica fuente de nitrgeno. Las bacterias que pueden utilizar el citrato tambin pueden extraer nitrgeno de la sal de amonio, con produccin de amonaco (NH+), lo que produce la alcalinizacin del medio por conversin del N H ;\ a hidrxido de amonio (NH4OH). El indicador es el azul de bromotimol, que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6.

P R U E B A D E L C ITR A TO

Enzim aC itra to de s od io ------------- > - P ro d u c to s m e ta b lico s a lca lin o s - T p H

A zu l de b ro m o tim o l ------------- A z u l de b ro m o tim o l(V erde) (A zu l)pH 6 ,9 pH 7,6

II. Medios y reactivosEl medio para citrato utilizado con mayor frecuencia es la frmula de Simmons. El medio se coloca en tubos inclinados (agar en pico de flauta). La frmula del medio de citrato de Simmons es la siguiente:

Protocolos 1 3 9 7

P rotocolo 6-5

U t il iz a c i n d e l c it r a t o (cont.)

F o s fa to d e a m o n io d ih id ro g e n a d o 1 gF o s fa to d ip o t s ic o 1 gC lo ru ro d e so d io 5 gC itra to d e s o d io 2 gS u lfa to d e m a g n e s io 0 ,2 0 gA g a r 15 gA zu l d e b ro m o tim o l 0 ,0 8 gA g u a d e s tila d a cs p 1 L

pH fin a l = 6 ,9

III. Control de calidadCada lote nuevo de medio debe ser probado con un microorganismo de reaccin positiva y uno de reaccin negativa. Las siguientes especies son los controles sugeridos:A. Control positivo: Enterobacter aerogenes.B. Control negativo: Escherichia coli.

IV. Procedimiento1. Se toma una colonia bien aislada de la superficie de un medio de aislamiento primario y se siembra en forma de estra nica en

el pico de flauta (agar inclinado) del tubo de agar citrato. El tubo se incuba a 35 C durante 24 a 48 horas.V. Resultados

A. InterpretacinLa prueba positiva est representada por la produccin de color azul oscuro en el trmino de 24 a 48 horas, que indica que el microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con formacin de productos alcalinos (vase lmina en color 6-4D). La prueba tambin puede considerarse positiva sin que haya color azul, si hay desarrollo visible en la estra de siembra. Esto es vlido porque para que el desarrollo sea visible, el microorganismo debi haber ingresado en la fase logartmica de crecimiento, lo que slo es posible si ha asimilado carbono y nitrgeno. Una interpretacin positiva basada en la lectura del trazo se puede confirmar incubando el tubo durante 24 horas ms, momento en que habitualmente se produce el color azul.

VI. BibliografaBBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: BioQuest, 1968:115,138.Blazevic DJ. Ederer GM. Principies of Biochemical Tests in Diagnostic Microbiology. Nueva York: Wiley, 1975:15-18.Koser SA. Utilization of the salts of organic acids by the colon-aerogenes groups. J Bacteriol 1923;8:493-520.MacFaddin JE. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:59-63.Simmons JS. A culture mdium for differentiating organisms of typhoid-colon aerogenes groups and for isolation of certain fungi. J

Infect Dis 1926;39:209-214.

P rotocolo 6-6

P r u e b a d e l a u r e a s a : c o n v e n c i o n a l

I. PrincipioLa urea es una diamida del cido carbnico con la frmula

OII

NH2 C NH,

Todas las amidas se hidrolizan fcilmente, con liberacin de amonaco y dixido de carbono.La ureasa es una enzima que tienen muchas especies de microorganismos que pueden hidrolizar la urea segn la siguiente reaccin qumica

NH, + 2HOH CO, + H ,0 + 2NH3 ; = (NH4)2CO} Ureasa

1 3 9 8 Protocolos

P rotocolo 6-6

P r u e b a d e l a u r e a s a : c o n v e n c i o n a l (cont.)

El amonaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinizacin y aumento de pH del medio.

M E C A N IS M O D E L A R E A C C I N DE LA U R E A S A

n/ N H 2 U re a sa

n h .I ' l i l 3 T C .

U re a A g u aE nz im a

A m O n ia C U U IO X IQ O

d e ca rb o n o

B F e n o lfta le n a ( In co lo ra )

pH < 8,1

A m o n a co ------------------- F e no lfta le n a

(R osa -ro jo )

pH > 8,1

II. Medios y reactivosLos dos medios utilizados con mayor frecuencia en los laboratorios clnicos para la deteccin de actividad ureasa son el caldo urea de Stuart y el agar urea de Christensen.

C A L D O U R E A D E S T U A R T A G A R U R E A DE C H R IS T E N S E N

E xtra c to d e levad ura 0,1 g P ep to n a 1 9F o s fa to m o n o p o t s ic o 9,1 g G lu co sa 1 gF o s fa to d is d ic o 9,5 g C lo ru ro d e so d io 5 gU rea 20 g F o s fa to m o n o p o ts ico 2 gR ojo fen o l 0,01 g U rea 20 gA g u a d e s tila d a esp 1 L R o jo fen o l 0 ,012 g

A g ar 15 gA g u a d e s tila d a esp 1 L

pH fin a l = 6 ,8 pH fin a l = 6,8

III. Control de calidadDeben probarse microorganismos de reaccin positiva y negativa con cada nuevo lote de medio. Se sugieren los siguientes microorganismos:A. Control positivo: especies de Proteus.B. Control positivo (dbil): especies de Klebsiella.C. Control negativo: Escherichia coli.

IV. ProcedimientoEl medio lquido se siembra con un ansa de cultivo puro del microorganismo por probar; la superficie inclinada del agar (pico de flauta) se siembra en estra con el microorganismo por probar. Ambos medios se incuban a 35 C durante 18 a 24 horas.


Los microorganismos que hidrolizan la urea rpidamente pueden producir reacciones positivas en l o 2 horas; las especies menos activas pueden requerir 3 das o ms. Las reacciones son las siguientes:1. Caldo de Stuart

Un color rojo en todo el medio indica alcalinizacin e hidrlisis de la urea.2. Agar de Christensen

Degradadores rpidos de la urea (especies de Proteus): color rojo en todo el medio.Degradadores lentos de la urea (especies de Klebsiella): inicialmente color rojo slo en el pico de flauta, que gradualmente se extiende a todo el tubo.

3. Ausencia de hidrlisis de la urea: el medio conserva su color amarillo original (vase lmina en color 6-4E).

Protocolos 1 3 9 9

P rotocolo 6-6

P r u e b a d e l a u r e a s a : c o n v e n c i o n a l (c o n t.)

VI. BibliografaBBL Manual of Products and Laboratory Procedures, 5a ed. Cockeysville MD: Bio-Quest, 1968:154.Christensen WB. Urea decomposition as a means of differentiating Proteus and paracolon cultures from each other and from Salmonella

and Shigella types. J Bacteriol 1946;52:461-466.MacFaddin JF. Biochemical Tests for Identification of Medical Bacteria, 2a ed. Baltimore: Williams & Wilkins, 1980:298-308.Stuart CA, Van Stratum E, Rustigian R. Further studies on urease production by Proteus and related organisms. J Bacteriol

1945:49:437-444.

P rotocolo 6-7

D e s c a r b o x i l a s a s

I. PrincipioLas descarboxilasas son un grupo de enzimas con sustrato especfico capaces de reaccionar con el residuo carboxilo (COOH) de los aminocidos, para formar aminas de reaccin alcalina. Esta reaccin, conocida como descarboxilacin, forma dixido de carbono como producto secundario. Cada descarboxilasa es especfica para un aminocido. Los tres aminocidos que se prueban habitualmente para la identificacin de las Enterobacteriaceae son lisina, ornitina y arginina. Los productos animados especficos son los siguientes: Lisina > cadaverinaOrnitina > putrescina Arginina -> citrulina

La conversin de arginina a citrulina es una reaccin de dihidrolasa y no de descarboxilasa, en la que un grupo NH, se elimina de la arginina como primer paso. La citrulina se convierte a continuacin a ornitina. que a su vez se descarboxila para formar putrescina.

El medio para descarboxilasas de Moeller es la base utilizada con mayor frecuencia para determinar la capacidad de descarboxilacin de Enterobacteriaceae. El aminocido por probar se agrega a la base de descarboxilasa antes de la siembra con el microorganismo en estudio. Tambin debe sembrarse en paralelo un tubo control, que contiene la base sin el aminocido agregado. Ambos tubos se incuban en condiciones anaerobias, lo que se logra cubriendo la siembra con una capa de vaselina lquida. Al principio de la incubacin ambos tubos viran al amarillo, debido a la fermentacin de la pequea cantidad de glucosa que contiene el medio. Si el aminocido es descarboxilado, se forman aminas alcalinas y el medio vira nuevamente a su color prpura original.

NH:

M E C A N IS M O D E LA R E A C C I N DE L IS IN A D E S C A R B O X IL A S A

U s in aQ H2N - C - H

C O O Hd e sc a rb o x ila sa

E nz im aL -lisina C a d a v e rin a D ix id o

de ca rb o n o

B P rp u ra de C a d a v e rin ab ro m o cre so l (A m a rillo )

pH < 5,2

- P rp u ra de b ro m o c re so l

(P rp u ra -la v a n d a )

pH > 5,2

LMINAS EN COLOR 6-1

La identificacin presuntiva de Enterobacteriaceae se basa en el aspecto de las colonias que crecen en los medios de aislamiento primario y en una evaluacin de ciertas reacciones bioqumicas. Por definicin, para que un microorganismo sea clasificado como Enterobacteriaceae debe fermentar la glucosa, produciendo cido o cido y gas; reducir nitratos a nitritos y no mostrar ninguna actividad de citocromo oxidasa.

A. Tincin de Gram de un frotis de esputo que muestra los bacilos gramnegativos pletricos y cortos caractersticos de los miembros de Enterobacteriaceae. Tambin se muestran dos leucocitos polimorfonucleares, lo que sugiere un proceso infeccioso continuo en este paciente. En este caso el cultivo confirm que el microorganismo era K. pneumoniae.

B. Cultivo mixto que muestra el crecimiento a las 24 horas en agar sangre de dos morfotipos de bacilos gramnegativos grandes y un tercer morfotipo de un microorganismo ms pequeo del que se puede sospechar que es una especie grampositiva. Un morfotipo se puede observar como colonias blancas, grandes y brillantes, mientras que el otro aparece como grandes colonias grises con bordes irregulares. Se puede sospechar que ambos tipos de colonias contienen bacilos gramnegativos tpicos de los miembros de Enterobacteriaceae. Tambin se presentan muchas colonias completas, blancas y pequeas, tpicas de uno de los cocos grampo- sitivos.

C. Colonias rosadas, grandes, mucoides y brillantes en agar de MacConkey tpicas de muchas especies de Klebsiella y Enterobacter. Slo sobre la base de su apariencia, se puede sospechar que estas colonias constituyen una especie de Enterobacteriaceae.

D. Patrn en forma de enjambre de una cepa mvil de especie de Proteus en una placa de agar chocolate.

E . Serie de tubos con agar hierro de Kigler (KIA) en pico de flauta (agar inclinado) que muestra varios patrones de reaccin. El tubo del extremo izquierdo ilustra una porcin inclinada cida (amarilla) y un extremo cido (amarillo), lo que indica tanto fermentacin de glucosa como de lactosa. Tambin obsrvese el espacio en la parte inferior del tubo y la divisin en el agar en el medio del tubo que indica la produccin de gas (C 0 2) por parte del microorganismo. Las cantidades abundantes de C 0 2, como se observan aqu, suelen ser producidas slo por microorganismos pertenecientes a la tribu V (Klebsielleae). El segundo tubo desde la izquierda ilustra una reaccin acida/cida pero sin presencia de gas, tpica del tipo de reaccin que se ve conE. coli. El tercer tubo de la izquierda muestra un agar inclinado alcalino (rojo)/profundidad cida caractersticos de un no fermentador de lactosa. El cuarto tubo ilustra un agar inclinado rojo/profundidad negra, que indica la produccin de sulfuro de hidrgeno (H,S). Cuando se observa este tipo de reaccin con un microorganismo oxidasa negativo, se presume que la porcin profunda del tubo es cida (amarillo), lo que indica fermentacin de glucosa aun cuando el color amarillo est enmascarado debido a la produccin de H,S. La reaccin en el quinto tubo (extremo derecho) rojo/rojo es tpica de los bacilos gramnegativos no fermentadores que no fermentan lactosa ni glucosa.

F. Tres tubos de medios de cultivo violeta que contienen tubos de Durham para demostrar la formacin de gas. Los dos tubos de la derecha muestran cido a partir de glucosa (color amarillo), comparados con el control negativo de la izquierda. El tubo del extremo derecho muestra la coleccin de gas dentro del tubo de Durham, caracterstica de un microorganismo que produce tanto cido como gas a partir de glucosa.

G. Prueba de citocromo oxidasa que muestra una reaccin color violeta positiva (izquierda) comparada con una reaccin negativa (derecha: no se observ ningn color azul dentro de los 10 segundos; vase protocolo 1-5). Cualquier microorganismo que da una reaccin positiva puede ser excluido de la familia Enterobacteriaceae.

H. Medios de prueba de nitrato que contienen tubos de Durham para demostrar la formacin de gas nitrgeno. El tubo de la izquierda muestra una reaccin positiva (roja) despus del agregado de a-naftilam ina y cido sulfnico. El microorganismo de prueba ha reducido los nitratos en el medio a nitritos, los cuales reaccionaron con los reactivos para formar el pigmento rojo p-sulfobenceno-azo-a-naftilam ina (vase protocolo 6-2). El tubo del medio tambin muestra una reaccin de nitrato positiva, pero en este caso todo el nitrato fue reducido primero a nitrito y luego reducido a su vez a gas nitrgeno, indicado por la coleccin de gas dentro del tubo de Durham. Como no hay nitrito en el tubo, no hay color rojo cuando se agregan reactivos. El tubo del extremo derecho no muestra ningn color rojo ni gas y muestra una prueba negativa para la reduccin de nitrato.

Id e n tific a c i n presuntiva de Enterobacteriaceae

LMINAS EN COLOR 6-2

El agar de MacConkey y el agar eosina azul de metileno (EMB) son dos medios de aislamiento primario de uso frecuente para la diferenciacin presuntiva de los miembros de Enterobacteriaceae fermentadores y no fermentadores de lactosa. En agar de MacConkey, las colonias que fermentan la lactosa aparecen rojas debido a la conversin cida del indicador, el rojo neutro. En agar EMB, los fermentadores vidos de lactosa producen un brillo metlico verde cuando la produccin del cido es suficiente como para reducir el pH hasta aproximadamente 4,5 o menos.

A. Superficie de agar de MacConkey con crecimiento de 24 horas de colonias rojas, fermentadoras de lactosa. El color rojo difuso en el agar que rodea las colonias es causado por microorganismos que fermentan con avidez la lactosa, con produccin de grandes cantidades de cidos mixtos y precipitacin de las sales biliares en el medio (p. ej., Escherichia coli).

B. Superficie de agar de MacConkey que muestra tanto colonias rojas, fermentadoras de lactosa, como colonias claras ms pequeas, que no fermentan la lactosa.

C y D. Superficie de placas de agar EMB que muestran el brillo verde producido por los miembros de Enterobacteriaceae vidos fermentadores de lactosa (o sacarosa). La mayora de las cepas de E. coli producen colonias con este aspecto de agar EMB y, como E. coli se encuentra entre las cepas ms frecuentes de muestras clnicas, el aspecto de estas colonias puede servir a menudo para su identificacin presuntiva. Sin embargo, se deben evaluar las caractersticas distintas de la produccin de un brillo verde en EMB antes de poder identificar en forma definida a un microorganismo como E. coli, ya que otras enterobacterias que fermentan la lactosa pueden tener un aspecto similar.

E y F. Superficie de placas de agar EMB que muestran un cultivo mixto de E. coli (colonias brillantes verdes) y especies de Shigella. La mayora de las especies de Shigella no fermentan lactosa y, por lo tanto, producen colonias semitranslcidas y no pigmentadas en agar EMB. Otras especies incapaces de fermentar lactosa producen colonias de aspecto similar a las ilustradas en estas fotografas.

A s p e c t o d e l a s c o l o n i a s d e E n t e r o b a c t e r ia c e a e e n a g a r e s d e M a c C o n k e y y E M B

LMINAS EN COLOR 6-4

A. Prueba de ono-nitrofenil-(3-D-galactopiransido (ONPG) que muestra una reaccin positiva (amarilla) (izquierda) comparada con el control negativo (derecha). Una reaccin positiva indica que el microorganismo es capaz de producir P-galactosidasa, enzima requerida para la degradacin inicial de lactosa, liberando el orfo-nitrofenol de color amarillo.

B. Tubo de agar semislido SIM (sulfuro indol motilidad) (derecha) y de agar hierro de Kligler (KIA) en pico de flauta" (izquierda), que muestra las diferencias en sensibilidad para detectar sulfuro de hidrgeno (H,S) por los diferentes medios. El delicado ennegrecimiento difuso en el tubo SIM es producido por un microorganismo mvil productor dbil de H,S (en este caso S. typhi). Obsrvese que el H,S producido en el tubo KIA menos sensible aparece slo en el medio del tubo, en la interfaz del agar inclinado y la profundidad, tpico de S. typhi en este medio.

C y D. Cuatro tubos en los que se realizaron las pruebas de indol (I), rojo de metilo (RM), Voges-Proskauer (VP) y citrato (C). Cuando estas cuatro pruebas se realizan juntas constituyen las reacciones IMViC clsicas. La formacin de indol a partir del triptfano est indicada por un color rojo con el agregado de reactivo de Kovac (tubo de la extrema izquierda, panel C). El desarrollo de un color rojo en el tubo de RM seala una cada en el pH hasta 4,4 o ms bajo, que indica fermentadores fuertes de cidos mixtos (segundo tubo desde la izquierda, panel C). Un color rojo en el tubo VP indica la presencia de acetona (acetilmetilcarbinol) formada a partir del piruvato en la va metablica del butilenglicol (tercer tubo desde la izquierda, panel D). El crecimiento en el pico de flauta del agar citrato de Simmon y la conversin del indicador de azul de bromotimol a un color azul alcalino indica que el microorganismo puede utilizar citrato de sodio como nica fuente de carbono (tubo ms a la derecha, panel D). C muestra las reacciones para E. coli (+ + ). El panel D muestra las reacciones para Klebsiella/Enterobacter ( + +).

E. Los dos tubos de la izquierda muestran reacciones de fenilalalina desaminasa negativa (amarillo claro) y positiva (verde oscuro). El color verde es producido por la reaccin entre el reactivo FeCl3 y el cido fenil- pirvico en el medio, resultante de la desaminacin de fenilalanina (vase protocolo 6-8). Los tres tubos de la derecha son los picos de flauta del agar urea de Christensen. El tercero desde la derecha muestra una reaccin positiva fuerte (color rojo en todo el medio, que indica una reaccin alcalina por la degradacin de la urea), comparado con el control negativo de la extrema derecha (color totalmente amarillo). La reaccin en el segundo tubo desde la derecha (color rojo slo en el agar inclinado) es producida por microorganismos como especies de Klebsiella y algunas especies de Enterobacter que son productores dbiles de ureasa.

F. Cuatro tubos que contienen medio de descarboxilasa de M0ller cubierto con una capa de vaselina para lograr un medioambiente anaerobio (vase protocolo 6-7). De izquierda a derecha: tubo de control de crecimiento desprovisto de aminocidos (el crecimiento est indicado por la conversin a un color amarillo debido a la fermentacin de glucosa en el medio), arginina, lisina y ornitina. El indicador violeta de bromocresol es amarillo a un pH cido y violeta a un pH alcalino. Por lo tanto, cualquier tubo que aparezca violeta indica un pH alcalino, reaccin producida por los microorganismos que pu

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