Embed Size (px)
Citation preview
Genetika bakterija i bakteriofaga
dr Branka Vuković-Gačić, redovni profesordr Biljana Nikolić, vanredni profesor
Katedra za mikrobiologiju Biološki fakultet Univerzitet u Beogradu
2. REGULACIJA EKSPRESIJE GENA KOD PROKARIOTA
• Više stotina različitih enzimskih reakcija odvija se simultano u toku ćelijskog rasta
• Regulacija enzimske sinteze - relativno spor proces (nekoliko min. treba da se sintetiše ili zaustavi sinteza)
• Prokarioti su razvili brojne mehanizme za regulaciju:- aktivnosti ili- količine enzima i drugih proteina u ćeliji
• Usklađivanje biohemijskih reakcija u ćeliji• Efikasno korišćenje supstrata • Adekvatan odgovor na spoljašnje stimuluse • Ekonomično trošenje energije
Značaj regulacije ekspresije gena?Nivoi regulacije ekspresije gena?
• Mehanizmi regulacije količine proteina:- regulacija sinteze na nivou transkripcije (regulacija količine
iRNK) i- regulacija sinteze na nivou translacije (regulacija količine
proteina sintetisanog na iRNK). Mehanizmi post-translacione regulacije:- protein je sintetisan kao deo velikog inaktivnog prekursorskog
proteina, aktivira se uklanjanjem dela prekursora, ili- smanjenje količine enzima degradacijom određenog broja
molekula.
REGULACIJA TRANSKRIPCIJE
• Transkripcija - prvi korak u ekspresiji gena. • Jačina promotora - nije jedini mehanizam kontrole količine iRNK u ćeliji. • Kontrola transkripcije - Efektori - mali molekuli (poreklom iz spoljašnje
sredine) interaguju sa regulatornim proteinima i utiču na njihovo vezivanje za specifična mesta na molekulu DNK - operatore.
Pojmovi operona, promotora, operatora?Uticaj jačine promotora, uticaj efektora?
Promoters of prokaryotic organisms, e.g., such as bacteria, have similar elements as the eukaryotic promoters although there are a few basic differences. Prokaryotic promoters contain at least three conserved features defining the region where the RNA polymerase binds:the start point, defined as +1;the TATA box is located at -10 position to the start point; in contrast to the -35 bp in eukaryotic promoters; and the TTGACA sequence, also called the -35 sequence, located around 35 bp upstream of the start point.An additional feature, much more common in prokaryotic organisms, is that a promoter serves to initiate the transcription of multiple structural genes that are immediately adjacent to it. This arrangement is called an operon. A single transcribed mRNA is translated into several proteins whose functions are interrelated. In operons, promoters have adjacent, juxtaposed or interspersed regulatory sites to which regulatory proteins bind. In eukaryotic promoters, the regulatory sites are spread out over a longer distance.
Proteini koji se vezuju za DNK-Interakcija proteina sa nukleinskim kiselinama
• Nespecifična interakcija - protein se vezuje na bilo koje mesto na nukleinskoj kiselini: histoni, relativno mali proteini sa visokim procentom pozitivno naelektrisanih amino kiselina (arginin, lizin, histidin), pa se čvrsto i relativno nespecifično vezuju za negativno naelektrisani molekul DNK.
• Specifične interakcije - interakcija specifična za određenu sekvencu DNK, ključna u regulaciji ekspresije gena kod svih organizama.
Specifična i nespecifična interakcija?
Proteini koji se vezuju za DNKSpecifična interakcija
• Domeni – regioni na proteinu (proteini su često dimeri) koji specifično interaguju sa DNK.
• Asocijacije bočnih lanaca AK sa nukleotidima u DNK molekulu.
• Region DNK sa invertovanim ponovcima (inverted repeats) sa specifičnom sekvencom za koje se vezuje po jedan monomer proteina.
• Najčešće u velikom žljebu (nekovalentna interakcija proteinskog domena i baznih parova u invertovanom ponovku).
Struktura regulatornih proteina, mesto interakcije na DNK, značaj invertovanih ponovaka?
helix-turn-helix motiv
• Helix-turn-helix motiv, 2 -heliksa povezana sa 3 ak. • Jedan -heliks ima ulogu u prepoznavanju i interakciji sa DNK
(recognition helix), a drugi ga stabilizuje hidrofobnim interakcijama.
• Mnogi DNK vezujući proteini Bacteria imaju helix-turn-helix motiv, proteini represori (lac i trp operona kod E. coli ili represor bakteriofaga ).
”Cink prst” (zinc finger)• Tip substrukture DNK vezujućih proteina koji se često sreće kod eukariota.• DNK vezujući domen sadrži -heliks koji interaguje sa DNK i jon Zn povezan preko dva cisteina i histidina
(postoje najmanje 2 zinc finger strukture).• Zink finger je mali strukturni motiv u proteinu sa jednim ili više Zn jona, čija je uloga da stabilišu
vezu sa DNK.
“Leucinski patent zatvarač” (leucine zipper)• Česta substruktura DNK vezujućih proteina• Formira se preko bočnih grupa leucina, 7 ak, i podseća na patent zatvarač, “zip”. • Za razliku od prve dve substrukture, leucine zipper ne interaguje sa DNK, već služi
za pravilno pozicioniranje dva druga -heliksa koji interaguju sa DNK.
Proteinski motivi odgovorni za specifične interakcije sa molekulom DNK?
Represija i indukcija na nivou transkripcije
Represija na nivou transkripcije
• Represori - u aktivnoj formi vezuju za operatore, specifične DNK sekvence (između promotora i strukturnih gena), i blokiraju vezivanje RNK polimeraze.
• Negativna kontrola - regulacija represorima, jer je uloga represora inhibitorna.• Sinteza enzima se kontroliše sprečavanjem inicijacije sinteze iRNK. • Svi sistemi koji uključuju represore imaju zajednički mehanizam dejstva,
inhibiciju inicijacije sinteze iRNK.
Pojam represora, koju fazu transkripcije blokiramo represorima, zašto je kontrola označena kao negativna?
Represija konačnim produktom sistem: represor + korepresor?
• Neki represori se sintetišu u formi u kojoj ne mogu da se vežu za operator. • Vezivanjem korepresora (mali molekuli), dovodi do promene konformacije
represora (alosterički protein), tako da se on može vezati za operator i blokirati transkripciju.
Represija konačnim produktom sistem: represor + korepresor?
• Represija konačnim produktom, jer su molekuli korepresora najčešće produkti biosinteze.
• Kontroliše se sinteza enzima uključenih u biosintezu amino kiselina, purina i pirimidina (enzimska represija)
• Biološki smisao - sprečava se gubitak energije za sintezu nepotrebnih enzima.
• Primer: -Enzimi za biosintezu arginina sintetišu se samo ukoliko ova AK
nije prisutna u medijumu.- Dodavanjem arginina zaustavlja se sinteza ovih enzima, a
kultura bakterija nastavlja rast istom brzinom. - U ovom slučaju arginin je korepresor.
1. Primer represija konačnim produktom - regulacija sinteze enzima koji učestvuju u sintezi amino kiseline triptofana. • trp operon kod E. coli sadrži 5 strukturnih gena koji kodiraju neophodne enzime. • Neaktivni represor se ne vezuje se za operatorski region trp operona pa je
omogućena sinteza enzima za sintezu amino kiseline triptofana.
Triptofanski operon u odsustvu korepresoraNeaktivni represor se ne može vezati za operator RNK, pa Pol vezuje za promotorski region.Sintetiše se policistronska iRNK, sa informacijom za sve enzime neophodne za biosintezu triptofana.
Sinteza triptofana – represija konačnim produktom?
2. Primer represija konačnim produktom • Sa dovoljnom količinom triptofana prestaje transkripcija svih enzima potrebnih za njegovu
biosintezu. • Triptofan, krajnji produkt ove enzimske reakcije, ima ulogu korepresora.• Vezuje se za alosteričko mesto na represoru, usled čega dolazi do konformacione
promene, pa je omogućeno vezivanje za operatorski region.• RNK polimeraza ne može transkribovati gene neophodne za biosintezu triptofana.
Triptofanski operon u prisustvu korepresoraUkoliko je triptofan prisutan vezaće se za inaktivni represor i aktivirati ga. Aktivni represor se vezuje za operator i sprečava transkripciju. Nema sinteze neophodnih enzima za sintezu triptofana.
Tip regulacije - indukcija supstratom• Represor se sintetiše u aktivnoj formi i blokira transkripciju.• Vezivanjem inducera (molekuli efektori) za alosteričko mesto represora menja se
njegova konformacija, represor gubi sposobnost vezivanja za operator. • Molekuli induceri - najčešće povremeno dostupni molekuli (često supstrati).
Indukcija supstratom(čest način indukcije katabolitičkih enzima)
• Vezivanjem molekula inducera (efektora) (najčešće povremeno dostupni supstrati) za alosteričko mesto represora menja se konformacija represora, gube sposobnost vezivanja za operator na DNK.
• Enzimi uključeni u katabolizam organskih jedinjenja i različitih izvora energije su veoma često pod ovim vidom kontrole.
bez efektora sa efektorom
Indukcija supstratom Primer: laktozni operon (lac operon) Regulacija sinteze enzima za katabolizam laktoze?
• E. coli kodira 3 enzima neophodna za razgradnju laktoze: – Z gen kodira β-galaktozidazu, enzim koji razlaže laktozu na glukozu i galaktozu, – Y gen kodira laktoznu permeazu, enzim koji transportuje laktozu u ćeliju, – A gen kodira transacetilazu, enzim koji pomaže u oslobađanju galaktozidaze.
• Laktoza ima funkciju inducera - sinteteza ovih enzime samo ako je laktoza prisutna. Praćenje nivoa -galaktozidaze u ćeliji:- ukoliko laktoze nema u medijumu, nema sinteze- dodatkom laktoze, sinteza počinje skoro istovremeno.
• Analozi efektora - supstance koje mogu indukovati enzimsku aktivnost, iako same ne predstavljaju supstrat; pr. izopropil-β-D-tiogalaktozid (IPTG) je inducer -galaktozidaze, iako ne može biti hidrolizovan ovim enzimom).
1. Ukoliko nema laktoze, represor se vezuje za operator i RNK polimeraza ne može transkribovati gene laktoznog operona.• Nema sinteze enzima za razgradnju laktoze.
Laktozni operon u odsustvu induceraRegulatorni gen kodira aktivni represor koji se vezuje za operator, sprečava vezivanje RNK polimeraze za promotor i nema transkripcije.
2. Prisutna laktoza, vezaće se za represor, promeniti njegovu konformaciju pa se on ne može vezati za operator. • Sada RNK polimeraza može transkribovati gene čiji su produkti
neophodni za razgradnju laktoze.
Laktozni operon u prisustvu induceraInducer laktoza se vezuje za aktivni represor i inaktivira ga. RNK polimeraza se vezuje za promotor, sintetiše se iRNK i enzimi za razgradnju laktoze.
POZITIVNA KONTROLA – aktivatoripozitivno kontrolisani promotori
POZITIVNA KONTROLA – aktivatori? pozitivno kontrolisani promotori
• Pozitivno kontrolisani promotori - imaju nukleotidne sekvence koje se ne uklapaju u konsenzus sekvence.
• RNK polimeraza ih i u prisustvu korektnog sigma faktora veoma teško prepoznaje.
• U blizini pozitivno kontrolisani h promotora nalaze mesta za vezivanje aktivatora (activator binding site, ACB).
• Aktivatori - regulatorni proteini, omogućuju RNK polimerazi da prepozna promotor i započne transkripciju.
POZITIVNA KONTROLA –Neaktivni protein aktivator • Neaktivni protein aktivator - u formi u kojoj se ne može vezati za activator
binding site (ABS), RNK pol ne vezuje za promotor i nema transkripcije gena.
• Inducer – molekul koji vezivanjem za neaktivni protein aktivator, menja njegovu konformaciju i omogućava mu vezivanje za ABS
Protein aktivator u odsustvu induceraU odsustvu inducera neaktivni protein aktivator se ne može vezati za ABS.
Protein aktivator u prisustvu inducera aktivator menja konformaciju i vezuje se za activator-binding site. Omogućena transkripcija i sinteza enzima.
• Vezivanjem molekula inducera za aktivator menja se njegova konformacija.
• Ovako Izmenjen aktivator se može vezati za activator binding site, omogućuje RNK polimerazi vezivanje za promotor i inicijaciju transkripcije.
POZITIVNA KONTROLAVezivanjem molekula inducera za neaktivni protein aktivator
Primer pozitivne regulacije - regulacija enzima za katabolizam maltoze kod E. coli, molekuli maltoze induceri
• Enzimi koji razlažu maltozu sintetišu se samo ukoliko je maltoza prisutna u medijumu.
• Protein aktivator – nakon vezivanja maltoze može se vezati za DNK• Geni za ove enzime se nalaze u okviru maltoznog regulona*, koga
čini nekoliko operona koji poseduju mesto za vezivanje aktivne forme aktivatora.
*Regulon - više od jednog operona pod primarnom kontrolom istog regulatornog proteina. Reguloni su poznati i za negativno regulisane operone. Na primer, enzimi koji učestvuju u biosintezi arginina kodirani su argininskim regulonom, kod koga su svi operoni pod kontrolom argininskog represora.
ATENUACIJA (prigušivanje, slabljenje)
• Kod prokariota transkripcija i translacija odvijaju se skoro simultano, čim se deo iRNK oslobodi sa DNK, za nju se vezuju ribozomi i započinje translacija.
• Atenuacija - sistem kontrole u kome stepen translacije utiče na stepen transkripcije.
• Do prekida transkripcije dolazi kada se deo novosintetisane iRNK organizuje u dvolančanu terminacionu petlju, koja zaustavlja RNK polimerazu.
• Prvootkriveni operon regulisan atenuacijom je bio triptofanski operon kod E. coli (opisana je i za enzime biosintetičkih puteva histidina, treonina-izoleucina, fenilalanina i još nekoliko amino kiselina).
Primer regulacije ekspresije triptofanskog operona?
Višak triptofana -Zaustavljanje transkripcije • U trp operonu ispred strukturnih gena su i
sekvence koje kodiraju tzv. vodeći (leader) peptid (sekvence sadrže tandeme triptofanskih kodova i funkcionišu kao atenuator).
• U ćeliji triptofan u višku, nesmetana translacija sa iRNK i sinteza vodećeg peptida.
• Usled toga formira se terminaciona petlja na iRNK i zaustavlja RNK polimeraza.
• Iza ovog mesta na iRNK nalazi se region bogat uracilom pa dolazi do terminacije.
Manjak triptofana - Nastavak transkripcije • Ukoliko je u ćeliji nema triptofana, zaustavljen je
proces translacije i nema sinteze vodećeg peptida.• Formira se alternativna petlja koja nije signal za
terminaciju. • RNK polimeraza nastavlja transkripciju strukturnih
gena za triptofan.
ATENUACIJA (prigušivanje, slabljenje)• Delujući zajedno sa represijom, omogućava veoma finu regulaciju sinteze
enzima uključenih u biosintetičke puteve.
Drugi mehanizmi atenuacije transkripcije
• I gram pozitivne bakterije (Bacillus) koriste atenuaciju transkripcije za regulaciju sinteze amino kiselina.
• Atenuacija uključuje alternativne sekundarne strukture vodeće (leader) iRNK od kojih neke vode terminaciji.
• Mehanizam je nezavisan od translacije i umesto ribozoma u njega je uključen RNK vezujući protein.
• RNK vezujući protein - vezuje za iRNK kao rezultat interakcije sa efektorom (tRNK za određenu ak ili sama ak).
• Kod triptofanskog operona Bacillus subtilis, protein nazvan trp atenuirajući protein se u prisustvu triptofana vezuje za vodeću iRNK i favorizuje terminaciju.
• Ukoliko triptofana nema dovoljno, protein se ne može vezati i transkripcija se nastavlja.
Regulacija sinteze enzimaREGULACIJOM TRANSLACIJE
• Prokarioti mnogo ređe koriste kontrolu na nivou translacije kao način regulacije sinteze enzima.
• Mehanizmi:- bakterije sintetišu antisens
RNK, komplementarna molekulu iRNK za određeni enzim, ne dolazi do translacije
- riboswitch atenuacija translacije, vodeći peptid sprečava translaciju sledećeg proteina sa policistronske iRNK.
Antisense RNK - regulacija translacije
• Antisense RNK se ne prepisuje sa nekodirajućeg lanca istog gena, već postoje kratki geni za njih, ‘anti-geni’(na slici gen X)
• Gen X se transkribuje kada je potrebno isključiti ekspresiju gena A• Antisense RNK – dužina ~100nt (komplementarni region ~30nt) • Jedna antisense RNK može da blokira translaciju sa nekoliko iRNK (zajednička
ciljna sekvenca)• Postoje neobični primeri da antisense RNK omogućuje translaciju (iRNK ima
sekundarnu strukturu, ona je razmotava i čini dostupnom ribozomima)
Riboswitches - 5’ domeni iRNK
Uzvodno od kodirajućeg regiona je ‘riboswitch’ region koji vezuje metabolit (krajnji produkt biosintetskog puta u kome učestvuje enzim sintetisan sa regulisane iRNK).
Regulišu sintezu: vitamina (tiamin, riboflavin, kobalamin), amnokiselina (retko), adenina i guanina.
• Alosterički enzimi, pored aktivnog mesta za koje se vezuje supstrat imaju i alosteričko mesto za koje se reverzibilno vezuje inhibitor (efektor).
• Alosterički enzimi su veoma česti u anaboličkim reakcijama, a naročito su značajni u putevima koji se granaju.
• Nekovalentnim vezivanjem inhibitora menja se konformacija molekula enzima, supstrat se ne može vezati za aktivno mesto.
• Kada koncentracija inhibitora opadne dolazi do disocijacije inhibitora sa alosteričkog mesta i enzim ponovo zauzima svoju aktivnu konformaciju.
REGULACIJA AKTIVNOSTI ENZIMA
REGULACIJA AKTIVNOSTI ENZIMAINHIBICIJA POVRATNOM SPREGOM (feedback inhibition)
Inhibicija povratnom spregom - Krajnji produkt D je alosterični inhibitor enzima koji katalizuje prvu reakciju u metaboličkom putu (A → B).
Krajnji produkt deluje kao reverzibilni inhibitor aktivnosti prvog enzima u biosintetičkom putu. Aktivnost već sintetisanih enzima podleže ćelijskoj kontroli (brza adaptacija ćelije na promenjene uslove rasta).
Kompetitivna inhibicija enzima krajnjim produktom
• Neki biosintetički putevi regulisani su postojanjem izoenzima (katalizuju iste reakcije, ali podležu različitoj regulatornoj kontroli).
• Na pr., 3 različita enzima katalizuju prvu reakciju u biosintezi aromatičnih amino kiselina (tirozin, fenil alanin, triptofan), ali je svaki regulisan nezavisno, jednom od amino kiselina.
• Za razliku od situacije u kojoj inhibitor kompletno zaustavi enzimsku aktivnost, u slučaju izoenzima početna enzimska aktivnost nestaje postepeno i gubi se samo ukoliko su sva tri produkta prisutna u višku.
Kompetitivna inhibicijaKrajnji produkt D je kompetitivni inhibitor enzima koji deluje na početni supstrat A.
KOVALENTNA MODIFIKACIJA• Aktivnost enzima se reguliše njegovom modifikacijom -
kovalentnim vezivanjem nekog malog organskog molekula.• Kovalentno vezivanje menja konformaciju proteina i njihovu
katalitičku aktivnost. • Uklanjanjem modifikujuće grupe enzim se vraća u svoj aktivni oblik. • Kovalentna modifikacija - dodavanje adenozin monofosfata,
adenozin difosfata ili neorganskog fosfata, kao i metilaciju. • Smatra se da su mehanizmi regulacije aktivnosti enzima
najverovatnije evoluirali zato što omogućavaju veoma brzu adaptaciju na promene spoljašnje sredine.
GLOBALNI KONTROLNI MEHANIZMI
• Globalni kontrolni sistemi simultano regulišu više različitih gena, omogućava ćelijama adekvatan odgovor na promene u spoljašnjoj sredini.
• U nedostatku fosfat preko 80 različitih gena će biti transkribovano kod E. coli.
• Produkti ovih gena imaju ulogu u adaptaciji bakterije na uslove bez fosfata i mogu biti kodirani većim brojem regulona.
• Kod E. coli postoji nekoliko grupa gena koji su koordinativno eksprimirani u odgovoru na određene uslove i koji čine tzv. globalno kontrolisane sisteme.
Globalna regulatorna mreža Katabolička represija
• Katabolička represija - efekat glukoze.
• Ukoliko ćelije rastu u prisustvu i laktoze i glukoze, laktozni operon će biti katabolički reprimiran i -galaktozidaza (razgradnja laktoze) se neće sintetisati sve dok je glukoza prisutna u medijumu.
• Nakon utroška glukoze, -galaktozidaza će se sintetisati i ćelija će početi sa korišćenjem laktoze.
Katabolička represija kod E. coli • Kontrola transkripcije proteinom aktivatorom, katabolički aktivator protein (CAP). • Alosterički protein CAP se vezuje za DNK samo ukoliko je u kompleksu sa cAMP -
cikličnim adenozin monofosfatom, (sintetiše se od ATP-a enzimom adenilat ciklazom). • cAMP - ključni element u kontrolnim sistemima, (prokarioti i eukarioti).• U prisustvu glukoze koncentracija cAMP je niska pa se CAP protein ne može vezati za
molekul DNK, onemogućena je ekspresiju lac operona i u prisustvu inducera (laktoze).• Na sličan način je u prisustvu glukoze onemogućena ekspresija ara, gal i drugih operona.
Drugi globalni kontrolni mehanizmiAlternativni sigma faktor
• Globalni kontrolni sistemi - uključuju alternativne sigma faktore i regulacija se obavlja promenom količine ili stabilnosti ovih faktora.
• Većina gena kod E. coli za transkripciju zahteva sigma faktor označen kao 70 (70 kDa).
• Geni koji se indukuju povećanjem temperature (36 gena koji kodiraju proteine šaperone, Lon proteazu, itd.) poseduju promotore sa potpuno različitim sekvencama i RNK polimeraza zahteva drugi sigma faktor, 32, (32 je produkt gena rpoH, htpR).
• Količina alternativnog sigma faktora reguliše odgovor na toplotni šok (heat shock).• 32 je nestabilan (poluživot mu je 1-2 minuta) i pre razgradnje FtsH proteazom se kompleksuje
sa DnaK i nekim drugim proteinima. • Protein DnaK je šaperon, koji pomaže ćelijskim proteinima da povrate korektnu konformaciju,
a potreban je i za degradaciju 32. • DnaK protein je esencijalan za normalni rast E. coli na svim temperaturama, a njegova sinteza
se povećava u slučaju heat shock odgovora. • Na povišenoj temperaturi aktivnost DnaK se usmerava na mnoge ćelijske proteine koji su
denaturisani, što smanjuje degradaciju 32.
Odgovori na drastično povećanje kiselosti sredine (acid shock)
• Bakterije odgovaraju i na drastično povećanje kiselosti sredine (acid shock). • Proteini koji se sintetišu u ovom odgovoru smanjuju oštećenja ćelijskih
komponenti i omogućavaju ćelijama da prežive čak i na pH 3,3. • Kod S. typhimurium indukovano je preko 50 gena, a njihova ekspresija je
regulisana sigma faktorom s i Fur proteinom.
Microorganisms developed various effective mechanisms to survive the acidic environment, among which the most common mechanisms are the Gad system, biofilm formation and cell density, the F1–F0–ATPase proton pump, protection or repair of macromolecules and alkali production
Povećana ekspresija antioksidativnih enzima
• Povećanje količine reaktivnih vrsta kiseonika i oksidativnog stresa, povećava ekspresiju antioksidativnih enzima: katalaze, peroksidaze, superoksid dismutaze, itd.
• Kod E. coli OxyR protein aktivira se oksidacijom - pozitivan regulator za više od 30 gena uključenih u odbranu od oksidativnih oštećenja.
• Drugi regulon koji je uključen u oksidativni stres je pozitivno regulisan produktima soxR/soxS gena.
• Kod bakterija koje su izložene gladovanju (nedostatku esencijalnih amino kiselina) indukuje se odgovor na nestašicu (stringent response), koji uključuje inhibiciju sinteze proteina, rRNK, DNK i različitih ćelijskih komponenti.
• Signal za indukciju - tRNK koje ne nose ak na A mestu ribozoma. • Biološki smisao – smanjenje potrošnju energije i materijala u nepovoljnim uslovima.
Odgovor na nestašicu amino kiselina (stringent response)
ppGpp inhibira sintezu rRNK i tRNK i aktivira sintezu amino kiselina
• Stimulisana aktivnost enzima pirofosfotransferaze (produkt relA gena).
• Sintetiše se ppGpp (guanozin 5’difosfat 3’difosfat) od GTP i ATP.
• ppGpp - klasa ćelijskih alarmona, akumuliraju se u stresnim uslovima i signal su za preusmeravanje ćelijskog metabolizma.
• Mutante bez RelA proteina - relaksirani, jer ne indukuju ovaj odgovor.
Diagram of the bacterial stringent response system
• Two parallel pathways synthesize pppGpp (which is subsequently converted into ppGpp) from ATP and GTP in response to any of several stress signals.
• Through interactions with RNA polymerase (RNAP), ppGpp alters much of metabolism (– indicates inhibition; + indicates stimulation).
PRENOŠENJE SIGNALA IZ SPOLJAŠNJE SREDINE
• Bakterije regulišu metabolizam u zavisnosti od faktora spoljašnje sredine (temp., pH, koncentracije kiseonika, dostupnosti hranljivih materija, promene u broju ćelija).
• Signal transduction - spoljašnji signali se detektuju proteinima senzorima, pa prenose u izmenjenoj formi do odgovarajućih regulatornih sistema.
• Mnogi sistemi za prenos signala se sastoje od dve komponente:
(1) specifičnog senzornog molekula lociranog u ćelijskoj membrani i
(2) intracelularnog regulatora odgovora, zbog čega su nazvani dvokomponentni sistemi.
Dvokomponentni sistem
Fosforilisani regulator deluje kao represor, ali fosforilisani regulatori mogu delovati i kao aktivatori.
• Senzor kinaze - transmembranski proteini koji detektuju signal na spoljašnjim domenom.
• Kinaze - enzimi koji vrše fosforilaciju supstrata.
• Nakon vezivanja signalnog molekula podležu ATP zavisnoj autofosforilaciji (na aktivnom mestu na unutrašnjoj površini citoplazmatične membrane).
• Fosforilisana senzor kinaza fosforiliše drugi protein, regulator odgovora.
• Ovaj regulatorni protein je tipično DNK vezujući protein koji reguliše transkripciju.
• Da bi se regulatorni ciklus završio, mora postojati i način da se signal ukloni - uključuje uklanjanje fosfatne grupe sa proteina regulatora.
• Protein regulator se autodefosforiliše ili je u ovaj proces uključen poseban enzim.
• Korišćenje fosfata i osmoregulacija kod E. coli, fiksacija azota kod Klebsiella i Rhizobium i sporulacija kod Bacillus su primeri regulacije dvokomponentnim sistemima.
• Regulatorni sistem sličan ovom pokazan je i kod kvasca Saccharomyces cerevisiae i drugih nižih eukariota.
• Viši eukarioti takođe koriste fosforilaciju kao mehanizam prenošenja signala.
Dvokomponentni sistemnastavak
REGULACIJA HEMOTAKSIJE
• Regulacija pokreta flagela u različitim hemotaksijama bakterije uključuje dvokomponentne sisteme sa posebnim senzor proteinima, MCP (methyl-accepting chemotaxis proteins) transduceri.
• To su transmembranski proteini koji mogu da se vezuju za različite hemoatraktante ili hemorepelente.
• Regulacija hemotaksije u kojoj učestvuje MCP transducer.
Regulacija hemotaksije i adaptacija
REGULACIJA HEMOTAKSIJE NASTAVAK
• MCP transducer je u proteinskom kompleksu i sa senzor kinazom.• Vezivanje atraktanta ili repelenta utiče na autofosforilaciju senzor kinaze, a time i na
fosforilaciju regulatora odgovora.• Jedan od njih direktno interaguje sa proteinima motornog dela flagele i određuje da li
se ćelija okreće.• Drugi je uključen u adaptaciju MCP transducera na koncentraciju određenog molekula,
kako bi ćelije mogle da registruju promenu koncentracije u vremenu.• Adaptacija MCP transducera uključuje njihovu metilaciju, koja utiče na aktivnost
senzor kinaze u kompleksu.
QUORUM SENSING
• U nekim slučajevima bakterije pokazuju određene karakteristike samo ukoliko je populacija brojna (quorum sensing).
• Brojnost populacije se registruje preko signalnih molekula, autoinducera, koje ćelije sintetišu i koji se u toku rasta akumuliraju u medijumu.
• Autoinduceri ulaze u ćeliju difuzijom ili se transportuju posebnim permeazama, a u nekim slučajevima ih registruju senzor kinaze.
• Kada koncentracija autoinducera dostigne kritični nivo dolazi do indukcije gena uključenih u quorum sensing odgovor.
QUORUM SENSING• Mehanizmi indukcije mogu biti različiti i često su veoma kompleksni.• Gram-negativne bakterije uglavnom sintetišu različite N-acetil-L-homoserin laktone kao
autoinducere. • Za gram-pozitivne bakterije karakteristični peptidni molekuli, tzv. feromoni. • Bioluminiscencija kod Photobacterium (Vibrio) fischeri i indukcija kompetencije kod
Bacillus subtilis su samo neki primeri fenomena zavisnih od gustine populacije.
Povećanje sinteze autoinducera je jedan od quorum sensing odgovora.
Autoinducer concentration increases as bacterial cell population density increases. These chemical molecules accumulate and after reaching a threshold level, bacteria detect autoinducers and alter gene expression (a bacterial cell has signal producing protein and it produces autoinducers intracellulary then released outside of the cell). Also, bacterial cell has signal receptor protein for autoinducer. When autoinducers’ concentration passes a threshold, autoinducer binds to receptor protein triggering signal transduction cascade that result in population-wide changes in cells’ behavior. However, when a single bacteria performs the mechanism it is futile since there are no other bacteria to receive the signal and concentration of autoinducers cannot reach the threshold.Gram-negative bacteria N-acyl homoserine lactones (HSLs).
