2. Laporan Analisa Kuantitatif Mikroorganisme

LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI

ANALISA KUANTITATIF MIKROORGANISME

Disusun Untuk Memenuhi Tugas Mata Kuliah MikrobiologiYang Dibimbing Oleh Bapak Bambang Hariyono,S.TP

Oleh :

VINDA ALVIONITA12046JALUM 9A

PEMERINTAH PROPINSI JAWA TIMURDINAS KESEHATAN PROPINSIAKADEMI GIZI SURABAYATAHUN AJARAN 2012 2013

KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan rahmat serta karunia-Nya kepada saya sehingga saya berhasil menyelesaikan laporan hasil analisa kuantitatif mikroorganisme yang Alhamdulillah tepat pada waktunya.

Laporan ini disusun dalam rangka memenuhi tugas mikrobiologi untuk mendapatkan nilai yang baik dimata kuliah mikrobiologi di AKADEMI GIZI SURABAYA.Laporan ini memuat laporan hasil analisa kuantitatif mikroorganisme. Walaupun laporan ini mungkin kurang sempurna akan tetapi memilki detail yang cukup jelas bagi pembaca.Ucapan terimakasih, saya sampaikan kepada Dosen mikrobiologi yaitu Bapak Bambang Hariyono, STP yang telah membimbing saya dalam menyelesaikan tugas ini.Semoga materi ini dapat bermanfaat dan menjadi sumbangan pemikiran bagi pihak yang membutuhkan. AminSaya menyadari bahwa laporanh] ini masih jauh dari sempurna, oleh Karena itu kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat membangun selalu saya harapkan demi kesempurnaan laporan ini. Terimakasih.

Surabaya, 22 Oktober 2013Penyusun,

Vinda Alvionita

BAB IPENDAHULUAN1.1 LATAR BELAKANG

Mikroorganisme adalah makhluk yang sangat kecil dan hanya dapat dilihat dibawah mikroskop. Salah satu jenis mikroorganisme adalah bakteri. Bakteri merupakan organisme uniselular yang tumbuh dengan cara pembelahan biner yaitu satu sel membelah secara simetris. Untuk mempermudah penghitungan koloni diperlukan pengetahuan mengenai morfologi bakteri tersebut sehingga media pertumbuhan yang akan digunakan sesuai dengan sifat bakteri tersebut.

Kehadiran mikrobia pada makanan dapat bersifat menguntungkan atau merugikan. Ada hasil metabolisme spesies mikrobia tertentu pada makanan dibutuhkan dan digemari oleh manusia. Akan tetapi ada beberapa species yang dapat merusak makanan dengan pembusukan atau menghasilkan toksin yang berbahaya bagi manusia. Setiap produk yang dihasilkan oleh mikrobia tergantung jumlah mikrobia yang terkandung dalam suatu bahan atau lingkungan.

Analisis kuantitatif mikrobiologi pada bahan pangan penting dilakukan untuk mengetahui mutu bahan pangan, dan proses yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Ada beberapa cara untuk mengukur atau menghitung mikrobia yaitu dengan perhitungan jumlah sel, perhitungan massa sel secara langsung, dan pendugaan massa sel secara tak langsung. Perhitungan jumlah sel pada bahan pangan dapat dilakukan dengan 3 metode yaitu, dengan hitungan Mikroskopik, MPN (Most Probable Number), dan hitungan cawan (Fardiaz, 1989).

Pada pemeriksaan sutu produk, jumlah bakteri akan menggambarkan mutu bahan baku, proses pembuatan dan tingkat kerusakan suatu bahan makanan. Metode penghitungan sangat banyak, hanya biasanya metode yang di pilih adalah di sesuaikan dengan kepentingan pemeriksaan, kecepatan dan ketepatan hasil pemeriksaan.

1.2 RUMUSAN MASALAH

1. Bagaimana cara menganalisa kuantitatif mikroorganisme yang baik agar mendapatkan hasil yang benar?2. Apa penyebab bakteri bisa tumbuh pada media padat dan cair ?3. Bagaimana cara melakukan pengenceran hitungan cawan dan MPN?

1.3 TUJUAN PRAKTIKUM

1. Agar mahasiswa dapat menentukan jumlah mikroba dalam sampel dengan metode MPN (Most Probable Number), dan hitungan cawan 2. Agar mahasiswa dapat menentukan jumlah mikroba dalam sampel dengan metode SPC(Standar Plate Count) untuk menghitung jumlah koloni.3. Untuk mengetahui uji kuantitatif pertumbuhan pada mikroba dan teknik pengenceran.1.4 MANFAAT

1. Mahasiswa mampu mengetahui bagaimana cara menganalisa kuantitatif mikroorganisme yang baik agar mendapatkan hasil yang benar 2. Mahasiswa mampu melakukan pengenceran hitungan cawan dan MPN 3. Mahasiswa mampu menghitung jumlah mikroba pada bahan pangan

BAB IITINJAUAN PUSTAKA

MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai MPN/satuan volume atau massa sampel. Contoh : data yang didapat adalah : 3 tabung positif dari pengenceran 1/10, 2 tabung positif dari pengenceran 1/100 dan 1 tabung positif dari pengenceran 1/1000. Lalu dicocokkan dengan tabel, menghasilkan nilai : 150 MPN/g (Gallup, 2008).

Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang pas/sesuai dan jika ditanam dalam tabung menghasilkaan frekensi pertumbuhan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semakin besar jumlah sampel yang dimasukkan (semakin rendah pengenceran yang dilakukan) maka semakin sering tabung positif yang muncul. Semakin kecil jumlah sampel yang dimasukkan (semakin tinggi pengenceran yang dilakukan) maka semakin jarang tabung positif yang muncul. Jumlah sampel/pengenceran yang baik adalah yang menghasilkan tabung positif kadang-kadang tetapi tidak selalu. Semua tabung positif yang dihasilkan sangat tergantung dengan probabilitas sel yang terambil oleh pipet saat memasukkannya ke dalam media. Oleh karena itu homogenisasi sangat mempengaruhi metode ini. Frekuensi positif (ya) atau negatif (tidak) ini menggambarkan konsentrasi mikroorganisme pada sampel sebelum diencerkan (Gallup, 2008).

(Umbreit, 1960) menyatakan asumsi yang diterapkan dalam metode MPN adalah :- Bakteri terdistribusi sempurna dalam sampel- Sel bakteri terpisah-pisah secara individual, tidak dalam bentuk rantai atau kumpulan (bakteri coliform termasuk E. coli terpisah sempurna tiap selnya dan tidak membentuk rantai).- Media yang dipilih telah sesuai untuk pertumbuhan bakteri target dalam suhu dan waktu inkubasi tertentu sehingga minimal satu sel hidup mampu menghasilkan tabung positif selama masa inkubasi tersebut.- Jumlah yang didapatkan menggambarkan bakteri yang hidup (viable) saja. Sel yang terluka dan tidak mampu menghasilkan tabung positif tidak akan terdeteksi.

Banyak tersedia metode untuk menganalisa jumlah mikroorganisme dalam suatu sampel, diantaranya adalah plate count (spread plate, pour plate, spiral plate), membrane filtration, MPN, menghitung langsung dengan Petroff Hausser ataupun cara lainnya (misalnya aktivitas metabolik, turbidimetri, berat kering dll.). Namun dalam ulasan ini lebih ditekankan pada metode yang memerlukan penghitungan koloni pada cawan petri, seperti membrane filtration, spread plate, pour plate dll (Umbreit, 1960).

Pemahaman tentang satuan dalam menghitung sel mikroba khususnya bakteri adalah sangat penting. Pada hasil akhir penghitungan bakteri pada cawan digunakan satuan CFUs/volume atau berat. CFUs adalah singkatan dari Coloni Forming Units yang artinya unit-unit / satuan pembentuk koloni. Yang dimaksud satuan pembentuk koloni adalah sel tunggal atau sekumpulan sel yang jika ditumbuhkan dalam cawan akan membentuk satu koloni tunggal. Pada dasarnya sel tersebar homogen pada sampel, tetapi ada jenis bakteri yang memang pembelahan selnya dapat terpisah baik sehingga tersebar merata tiap sel dan ada pula bakteri yang setelah membelah sel anakan masih menempel pada induknya, seperti halnya yang terjadi pada streptococcus, diplococcus, sarcina dll. sehingga penyebarannya berkelompok-kelompok. Pada jenis yang seperti ini jika tersebar merata dalam kelompok-kelompok sel maka pertumbuhan menjadi koloni tunggal bukan berasal dari satu sel saja melainkan dari beberapa sel (Nuryono,2006).

Plummer (1987) menyatakan ada beberapa cara yang dapat digunakan untuk menghitung atau mengukur jumlah jasad renik di dalam suatu suspensi atau bahan, yang dapat dibedakan atas beberapa kelompok yaitu:

A. Perhitungan jumlah sel1. Hitungan mikroskopik2. Hitungan cawan3. MPN (Most Probable Number)

B. Perhitungan massa sel secara langsung1. Volumetrik2. Gravimetrik3. Kekeruhan (turbidimetri)

C. Perhitungan massa sel secara tidak langsung1. Analisis komponen sel2. Analisis produk katabolisme3. Analisis konsumsi nutrient

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah menumbuhkan sel mikroba yang masih hidup pada metode agar, sehingga sel mikroba tersebut akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dengan mata tanpa menggunakan mikroskop (Gallup, 2008).

BAB IIIMETODE PERCOBAAN

2.1 WAKTU DAN TEMPAT PERCOBAANPraktikum pengamatan morfologi mikroorganisme dilaksanakan pada hari Selasa, 22 Oktober 2013 mulai pukul 10.00 12.00 di Laboratorium mikrobiologi di Akademi Gizi Surabaya.

2.2 HITUNGAN CAWAN (TPC)2.2.1 ALAT1. Tabung reaksi2. Cawan petri3. Pipet tetes4. Pipet ukur5. Autoclave6. inkubator2.2.2 BAHAN1. Ikan segar2. Ikan pindang3. Daging sapi segar4. Dendeng daging5. Media PCA

2.2.3 PROSEDUR KERJA1. Sterilisasi semua alat dan media2. Sediakan 4 tabung reaksi steril, 1 tabung diisi larutan buffer phospat 10 ml (), dari 3 tabung reaksi lainnya diisi 9 ml (, , )3. Swab permukaan bahan (2x2cm) dengan alat swab yang telah dibasahi dengan buffer phospat, kemudian masukkan alat tersebut kedalam tabung pengencer . Aduk dan homogenkan dari tabung ambil larutan tersebut 1 ml dengan pipet steril dan pindahkan ke tabung dan seterusnya sampai tabung )4. Dari masing-masing tabung pengercer ( , , ) ambil 1 ml lalu masukkan ke cawan petri yang telah di beri label pengencer5. Isi masing-masing cawan petri dengan medium PCA yang masih hangat (suhu 38 C) sebanyak 15 ml. kemudiankan homogenkan dengan menggoyang cawan6. Biarkan agar memadat, lalu bungkus dengan kertas pembungkus dengan posisi terbalik dan inkubasi selama 3 hari

2.3 MPN (MOST PROBABLE NUMBER)2.3.1 ALAT1. Tabung reaksi2. Pipet tetes3. Pipet ukur4. Autoclave5. inkubator2.3.2 BAHAN1. Air es batu2. Air matang3. Media LB (Lactose Broth)

2.3.3 PROSEDUR KERJA 1. Sterilisasi semua alat dan media2. Sediakan 3 tabung reaksi steril, isi masing-masing dengan larutan buffer phospat 9 ml (, , )3. Ambil 1 ml sampel air, lalu masukkan ke dalam tabung pengencer lalu aduk dan homogenkan.4. Dari tabung pengencer , ambil 10 ml larutan dengan pipet steril dan masukkan ke dalam tabung pengencer , lalu aduk dan homogenkan, demikian seterusnya sampai dengan 5. Dari masing-masing tabung pengencer ( , ), ambil 1 ml dan masukkan pada tabung series (5 tabung) sesuai pengenceran yang di beri label (sudah diisi media LB 1/3 tabung)6. Inkubasi tabung series selama 24 jam7. Amati perubahan yang ada

BAB IVHASIL PENGAMATAN

4.1 HITUNGAN CAWAN (TPC)

DATA KELOMPOK 3 (DAGING SAPI SEGAR)No.SampelGambarKeterangan

1.Daging sapi segarTerdapat koloni mikroba sebanyak 343 koloni




Data semua kelompok terhadap jumlah koloni mikroba pada setiap bahan pangan, sebagai berikut :

KelompokSampelPengenceranSPC

1Ikan segar3673088375

2Ikan pindang96356468312

3Daging sapi segar34330527843

4Dendeng daging57484542

PERHITUNGAN :

1.) 10-1 10-2 10-3 10-4 SPC 367 308 83 75 750000/83000 = 9,0Dilaporkan 8,3 x 104

2.) 10-1 10-2 10-3 10-4 SPC 96 356 468312 9,6 x 102

3.) 10-1 10-2 10-3 10-4 SPC 343 305 27843 430000/278000 = 1,5Rata-rata 354000 atau 3,5 x 105

4.) 10-1 10-2 10-3 10-4 SPC 57 48 4542 570+4800+45000+420000 = 470370Rata-rata 117592,5 atau 1,1 x 105

4.2 MPN (MOST PROBABLE NUMBER) DATA KELOMPOK 3 (AIR MATANG) Gambar pada saat praktikum (warna jernih) No.SampelGambarKeterangan

1.Air matang- Ada 4 tabung positif terdapat mikroorganisme

- Terdapat gelembung-gelembung disekitar tabung durham

2.Air matang-Ada 3 tabung positif terdapat mikroorganisme


3.Air matang-Ada 2 tabung positif terdapat mikroorganisme


Data semua kelompok pada perhitungan MPN (Most Probable Number)KelompokSampelJumlah positif mikrobaMPN

1Air es33431

2Air es 43345

3Air matang43239

4Air matang33224

BAB VPEMBAHASAN Sebelum melakukan perhitungan dilakukan pengenceran untuk memperkecil jumlah suspensi mikroba. Terdapat dua cara yang kami lakukan dalam memperkecil jumlah suspensi mikroba, yaitu metode hitungan cawan (Technique Plate Count/TPC) dan metode hitungan Most Probable Number/MPN.

5.1 PERHITUNGAN CAWAN (TPC) Dalam metode hitungan cawan (Technique Plate Count/TPC) dilakukan pengenceran bertingkat untuk menentukan konsentrasi mikroba. Dalam praktikum analisa kuantitatif mikrorganisme ini menggunakan bahan : ikan segar, ikan pindang, daging sapi segar, dan dendeng daging. Pada praktikum ini, pemupukan pertumbuhan mikroba dalam cawan petri di bungkus dengan kertas pembungkus dengan posisi terbalik dan di inkubasi selama 3 hari.

Berdasarkan hasil pengamatan setelah 3 hari pada metode hitungan cawan, diperoleh jumlah koloni mikroba pada cawan petri sebagai berikut :

KelompokSampelPengenceranSPC

1Ikan segar3673088375

2Ikan pindang96356468312

3Daging sapi segar34330527843

4Dendeng daging57484542

Berdasarkan data di atas dapat diketahui jumlah koloni mikroba terbanyak yaitu pada bahan daging sapi segar, dan jumlah koloni mikroba yang paling sedikit yaitu pada ikan pindang. Dari data diatas, Berikut ini urutan jumlah koloni mikroba dari yang terbanyak sampai yang paling sedikit:1. Daging sapi segar2. Dendeng daging3. Ikan segar4. Ikan pindang

Prinsip Hitungan Cawan :Jika sel mikroba yang masih hidup ditumbuhkan pada medium agar, maka sel tsb akan berkembang biak dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dg mata telanjang. Kelemahan Hitungan Cawana. Beberapa koloni yang berdekatan dan membentuk satu koloni, sehingga berpengaruh terhadap jumlah.b. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda cenderung menghasilkan nilai yang bedac. Mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium pada dan membentuk koloni yang kompak dan jelas.d. Memerlukan persiapan dan waktu agak lama (3 hari)

5.2 MPN (MOST PROBABLE NUMBER)

Dalam metode hitungan Most Probable Number/MPN menggunakan medium cair dalam tabung reaksi, perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang positif yaitu ditumbuhi oleh mikroba setelah di inkubasi pada suhu tertentu. Pengamatan tabung positif juga dapat dilihat dengan mengamati perubahan warna medium atau terbentuknya gas dalam tabung durham untuk mikroba pembentuk gas. Medium LB yang telah disiapkan dituang di tabung series sebanyak 1/3 tabung , kemudian memasukkan 1 ml sampel air yang sudah homogen dengan larutan buffer pospat (fase tabung pengenceran). Setiap seri pertumbuhan mikroba memerlukan 5 tabung series yang di isi media LB sehingga untuk pertumbuahan mikroba diperlukan 15 tabung series untuk 3 seri pengenceran. Kemudian diinkubasi selama 24 jam lalu mengamati pertumbuhan mikroba.

Berdasarkan hasil pengamatan setelah 24 jam, pada perhitungan MPN (Most Probable Number)KelompokSampelJumlah positif mikrobaMPN

1Air es33431

2Air es 43345

3Air matang43239

4Air matang33224

Berdasarkan data di atas dapat diketahui tabung yang positif ditumbuhi mikroba terbanyak yaitu pada bahan air es pada kelompok 2 yaitu MPN = 45. Sedangkan pada pengamatan kelompok 1 MPN air es = 31. Dan pada pengamatan air matang, kelompok 3 menghitung jumlah mikroba yang tumbuh (MPN) = 39, sedangkan pada kelompok 4, MPN mikroba pada air matang adalah 24

Berdasarkan data yang diperoleh maka dapat dijelaskan, bahwa mikroba yang terbentuk dalam tabung reaksi memerlukan oksigen untuk hidup, sehingga mikroba tersebut tergolong kedalam bakteri aerob, dan salah satu cara untuk mengenali adanya mikroba dapat dilihat dari terbentuknya gas pada tabung, dan tabungnya bersifat positif.

KETERANGAN :

Pengamatan tabung positif dilakukan dengan mengamati perubahan warna pada sampel yang sebelumnya dicampurkan dengan medium LB (Laktose Broth), atau dengan terbentuknya gelembung gas dalam tabung durham. Fungsi dari tabung durham sendiri sebagai media untuk menampung gas akibat metabolisme bakteri. Dan penyebab lain dari terbentuknya gas dalam tabung, diakibatkan karena kontaminasi dari udara ketika proses isolasi dalam inkubator. Medium LB digunakan karena medium ini berfungsi sebagai media untuk mendeteksi kehadiran Coliform dalam air dan dalam mempelajari fermentasi laktosa oleh bakteri pada umumnya. Pepton dan ekstrak beef menyediakan nutrien esensial untuk memetabolisme bakteri. Laktosa menyediakan sumber karbohidrat yang dapat difermentasi untukorganism Coliform. Pertumbuhan dengan pembentukan gas adalah presumptive test untuk Coliform. Lactose broth dibuat dengan komposisi 0,3% ekstrak beef; 0,5% pepton; dan 0,5% laktosa.

Dari hasil pengamatan, kedua sampel (air es dan air matang) tersebut positif mengandung bakteri Coliform. Hal ini ditunjukkan dengan adanya gelembung gas yang berada dalam tabung durham dan warna larutan berubah menjadi keruh.

Menurut Suriawiria (1985), kekeruhan yang terdapat pada tabung reaksi disebabkan karena adanya aktivitas dari suatu mikroorganisme. Kekeruhan yang terjadi pada tabung-tabung reaksi tersebut berbeda, ada yang mengalami kekeruhanpada bagian permukaannya saja dan juga ada yang mengalami kekeruhan merata pada seluruh media dan sampel. Kekeruhan yang terjadi merata pada media disebabkan karena adanya mikroorganisme anaerob fakultatif, yaitu mikroorganisme yang mampu hidup ataupun tumbuh dengan atau tanpa adanya oksigen. Kekeruhan yang terjadi pada permukaannya saja disebabkan karena adanya mikroorganisme aerob.

Menurut Fardiaz (1992), Gelembung udara yang dihasilkan pada tabung durham disebabkan oleh adanya aktivitas yang respirasi mikroorganisme, sehingga dapat dilihat hasil dari respirasi mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas.

Berdasarkan data yang diperoleh maka dapat dijelaskan, bahwa mikroba yang terbentuk dalam tabung reaksi memerlukan oksigen untuk hidup, sehingga mikroba tersebut tergolong ke dalam bakteri aerob, dan salah satu cara untuk mengenali adanya mikroba dapat dilihat dari terbentuknya gas pada tabung yang menandakan tabung bersifat positif.

BAB VPENUTUP

6.1 KESIMPULAN

Adapun kesimpulan yang dapat diambil dari praktikum analisa kuantitatif mikroorganisme, yaitu :Sebelum melakukan perhitungan dilakukan pengenceran untuk memperkecil jumlah suspensi mikroba. Terdapat dua cara dalam memperkecil jumlah suspensi mikroba, yaitu metode hitungan cawan (Technique Plate Count/TPC) dan metode hitungan Most Probable Number/MPN.

Dalam metode hitungan cawan (Technique Plate Count/TPC) dilakukan pengenceran bertingkat untuk menentukan konsentrasi mikroba.

Pada metode MPN, Adanya mikroba dapat ditandai dengan timbulnya gelembung gas pada tabung durham, dan terjadi perubahan warna pada sampel. Mikroba yang diperoleh merupakan bakteri aerob yang membutuhkan gas O2 untuk hidup, dan menghasilkan gas CO2. Tabung bersifat positif apabila di dalam tabung tersebut terdapat mikroba.

6.2 SARAN

Diharapkan kepada seluruh mahasiswa lebih memahami menghitung jumlah mikroba dengn metode hitungan cawan dan metode MPN, serta memahami prosedur kerja pada praktikum analisa kuantitatif mikroorganisme.

BAB VIIDAFTAR PUSTAKA

1. Alvionita, Vinda. 2013. mikrobiologi, pengamatan morfologi mikroorganisme. Hasil pemikiran sendiri. Akademi Gizi : Surabaya.2. Hariyono S,TP, Bambang. 2013. mikrobiologi, isolasi dan analisa jumlah mikroba. Akademi Gizi : Surabaya.3. Fardiaz, S., 1996, Analisis Mikrobiologi Pangan, PT. Radja Grafindo Persada, Jakarta4. Dwidjoseputro, D. 1978. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Penerbit Djambatan; Jakarta5. http://rieckamissziiph.blogspot.com/2012/03/analisis-kuantitatif-mikroba-praktikum.html

.

Documents

2. Laporan Analisa Kuantitatif Mikroorganisme