GENI SUPRESORI TUMORA

PROTOONKOGENI, ONKOGENI I GENI SUPRESORI TUMORA

ONKOGEN

- gen koji uzrokuje malignu transformaciju odreenih stanica

- dominantan gen ija funkcija dominira nad funkcijom alela protoonkogena*

- gain of function = tumor uzrokovan onkogenom

*PROTOONKOGEN - normalan gen u stanici slian onkogenu

1. TRANSFORMIRAJUI VIRUSI

Onkogeni su otkriveni u virusima koji ih nose i zbog toga transformiraju stanice.DNA virusi:

1. polyoma

2. HPV (humani papiloma virus)

3. adenovirus4. EBV (Epstein-Barr virus)

RNA virusi: - retrovirus

POLYOMA VIRUS

- inficira mieve i majmune -> SV 40 - simian virus 40- inficira ljude -> BK, JC (John Cunningham) virus (oba imaju 75% zajednikog genofora)

Permisivne stanice -> Litiki ciklus -> proizvodnja T-antigena alternativnim izrezivanjemNepermisivne stanice -> Abortivna infekcija -> T-antigeni transformiraju stanice

PAPILOMA VIRUS

- uzrokuje benigne i maligne epitelne tumore (npr. bradavice, karcinom grla maternice)- proteini E6 i E7 papiloma virusa imortaliziraju neke stanice u kulturi stanica

ADENOVIRUS

- ljudi: produktivne infekcije dinih organa- glodavci: transformacija stanica u kulturi i u novoroenih glodavaca

- proteini E1A i E2B adenovirusa ovisno o permisivnosti stanice sudjeluju u litikom ciklusu i transformacija stanica

EBV (Epstein-Barr virus)

- ljudi: herpes virus koji se javlja u infekcioznoj mononukleozi, karcinomu nazofarinksa i limfomima

- kultura stanica: imortaliziranje ljudskih B limfocita i transformacija stanica glodavaca

- kodira 6 EBNA (Epstein-Barr virus nuclear antigen) nuklearnih proteina od koji su 4 povezani s transformacijom B limfocitaProdukti gena ranog litikog ciklusa DNA virusa (T-antigen, E6, E7, E1A, E1B) inaktiviraju produkte staninih gena supresora tumora (npr. Rb gena ili p53 gena)

RETROVIRUS

- ugrauju se u genom stanice nakon reverzne transkripcije RNA u DNA

- ugraivanjem u spolne stanice prenose se na potomstvo

Onkogeni pronaeni u akutnim transformirajuim retrovirusima (v-onc, v=viral) slini su genima u normalnim stanicama, tzv. protoonkogenima (c-onc, c=cellular).

Razlika je u genomskoj organizaciji: c-onc gen posjeduje introne i egzone, a v-onc samo egzone (uninterrupted coding sequences).

1. Ugradnja retrovirusa u genom blizu c-onc gena

2. Prepisivanje retrovirusa i c-onc gena na istu mRNA

3. Izrezivanje introna i povezivanje egzona

4. Ugradnja u kapsulu virusa

U retrovirusima je pronaeno oko 25 c-onc gena.

Razliiti retrovirusi mogu nositi isti c-onc gen te isti retrovirus moe nositi razliite c-onc gene.

Prvi otkriveni onkogen bio je onkogen v-src iz Rousovog virusa sarkoma pilia za kojeg se pokazalo da postoji u formi protoonkogena c-src i u genomu ovjeka.

Tumori uzrokovani v-onc genima mogu nastati zbog:

a) KVANTITATIVNIH PROMJENA

- koliinski vee ekspresije (mos, ras, sis, mic)

- konstitutivne ekspresije (src) gena koje se funkcionalno ne razlikuju od protoonkogena

(Konstitutivna ekspresija - i u odsustvu regulacijskih proteina, RNA polimeraza se vee za promotor te prepisuje gene.)

- ekspresije u krivoj stanici

b) KVALITATIVNIH PROMJENA

- mutacijom c-onc gena nastaju aktivni transformirajui v-onc geni (ras)

2. ONKOGENI NASTALI AKTIVACIJOM PROTOONKOGENA- Onkogeni nastaju iz normalnih staninih gena - protoonkogena-Protoonkogeni kodiraju proteine koji pripadaju putevima pozitivne regulacije staninog ciklusa ili negativnim regulatorima apoptoze- Protoonkogeni se pretvaraju u onkogene:

KVALITATIVNOM PROMJENOM - mutacijom

KVANTITATIVNOM PROMJENOM - poveanjem nivoa ekspresije

Tokasta mutacija

-pretvaranje protoonkogena u onkogen

-primjeri: ras protoonkogeni (H-ras, N-ras, K-ras)*

*Nalaze se i u formi v-ras gena

* Ras= rat sarcoma

*Sudjeluju u diobi stanice

Amplifikacija gena

- vie kopija protoonkogena u genomu to vodi njihovoj pojaanoj ekspresiji- mogu biti smjeteni na jednom homolognom kromosomu u podruju HSR (eng. homogeneously staining region) ili na minijaturnim dvostrukim kromosomima (eng. double minute) koji se u mitozi nepravilno nasljeuju (ne veu se za diobeno vreteno jer nemaju centromere)

-primjeri: c-abl, c-myb, c-myc, c-erbB, c-K-ras

Insercija retrovirusa

- pojaavanje ekspresije protoonkogena ugradnjom kompletnih virusa bez v-onc gena u blizinu protoonkogena ili unutar njegovih regija (npr. c-myc)

-retrovirusi svojim snanim promotorima (LTR regija, long terminal repeat) djeluju kao promotori ili pojaivai (enhanceri)

-primjeri: c-myb, c-mos, c-raf, c-ras, c-erbB, int2, wnt1

Translokacija

- kromosomska aberacija kojom se dio jednog kromosoma otkine i premjesti na drugi kromosom

- moe biti i reciprona

1. Burkittov limfom u ovjeka- translokacija c-myc gena sa kromosoma 8 na 2/14/22- tumor B limfocita

2. Tumor T limfocita- translokacija c-myc gena sa kromosoma 8 na 7/14C-myc gen dolazi u blizinu regija koje potiu njegovu snaniju ili kontinuiranu ekspresiju, a limfociti se ne mogu prestati dijeliti i normalno diferencirati.

3. CML (Kronina mijeloina leukemija) i ALL (akutna limfatina leukemija)- pojava Philadelphia kromosoma sastavljenog od regija kromosoma 9 (c-abl) i 22 (bcr)

- abl i bcr se prepisuju i prevode u jedinstveni fuzijski proteini (Bcr-Abl) koji kodira za tirozin kinazu koja stimulira diobu i titi stanice od apoptoze

3. ONKOPROTEINI- produkti onkogena u stanici

- transmembranski proteini, proteini povezani sa membranom na njezinom citoplazmatskom licu, citoplazmatski proteini, jezgrini proteini- slini su faktorima rasta i aktiviraju receptore za faktore rasta i onda kada to nije potrebno, tj. u odsutnosti normalnih faktora rasta

TRANSMEMBRANSKI PROTEINI - odgovaraju proteinima koji su normalni receptori za faktor rasta- nedostaju im pojedini dijelovi prisutni u normalnim receptorima (truncated receptors)

- inkompletni receptori mogu biti stalno aktivni ili im je promijenjena regulacija pa stanica dobiva signal da su faktori rasta stalno prisutniPrimjer:

Vezanje liganda (EGF - Epidermal growth factor) za receptor potie dimerizaciju receptora i autofosforilaciju na citoplazmatskom dijelu membrane.

Erb B onkogen kodira za receptor slian EGF receptoru, ali mu nedostaju N- i C- terminalni kraj to omoguuje spontanu dimerizaciju 2 receptora i autofosforilaciju. => KONSTITUTIVNA AKTIVACIJA

U stanici je aktivna kaskada transdukcije nepostojeeg signala.

PROTEINI POVEZANI SA MEMBRANOM-odgovaraju proteinima:

> koji sudjeluju u transdukciji signala (ras i c-ras G protein, tj. protein koji vee GTP)

>intracelularnim tirozin-kinazama povezanim sa membranom (c-src)

CITOPLAZMATSKI PROTEINI- Bcl 2 onkogen proizvodi odgovarajui citoplazmatski protein koji je inhibitor apoptoze, tj. uzvodni inhibitor kaspazne kaskade

JEZGRINI PROTEINI- odgovaraju transkripcijskim faktorima ili receptoru

7 tipova staninih proteina koji se mogu promjeniti u onkoproteine zbog mutacije odgovarajuih gena:

1. Faktor rasta2. Receptor za faktor rasta/unutarstanini receptori

Virusni proteini mogu aktivirati receptore za faktore rasta.3. Unutarstanini prijenosnici signala4. Transkripcijski faktori5. Proteini koji zaustavljaju apoptozuKodirani dominantnim onkogenima.6. Proteini kontrole staninog ciklusa Kodirani recesivnim genima supresorima tumora.

7. Enzimi za popravak dnaPoveavaju mogunost mutacija u svim ostalim grupama.

4. KOLABORACIJA ONKOGENA- Parenjem transgeninog mia (myc onkogen) s drugim transgeninim miom (ras onkogen) nastaje vei broj tumora u F1 generaciji nego to je zbroj tumora u parentalnoj generaciji.

- Iako su onkogeni uneseni vektorima koji su omoguili pojaanu ekspresiju onkogena u specifinom tkivu , nisu sve stanice toga tkiva postale tumorske. => Potrebna je jo neka promjena koja e omoguiti pojavu tumora

Zakljuak: U organizmu postoje brojni kontrolni mehanizmi koji sprjeavaju pojavu tumora

MEN - Sindrom multiple endokrine neoplazije

- pojava tumora titnjae i nadbubrene lijezde i hiperplazije paratireoidnih lijezda

- mutirani ret protoonkogen koji kodira za memebranski receptor tirozin-kinazu (kromosom 10)

- navedene lijezde razvijaju se iz neuralnog grebena i krnog luka u kojima je takoer otkrivena ekspresija c-ret

5. PROTOONKOGENI-RAST-DIFERENCIJACIJA-KANCEROGENEZA

- Protoonkogeni u normalnoj stanici reguliraju proliferaciju i diferencijaciju

- Tumorigeneza uzrokovana gubitkom sposobnosti zaustavljanja proliferacije ili gubitkom sposobnosti diferencijacije

- Proliferacija izraena za vrijeme embrionalnog razvoja

- U embrionalnom razvoju se mnogi protoonkogeni eksprimiraju samo u odreenim tkivima ovisno o stadiju razvoja i vrsti tkivaDokazivanje uloge protoonkogena u razvoju:

- Ciljano inaktiviranje protoonkogena u transgeninim ivotinjama pomou homolognih konstrukata ( slini i afunkcionalni) -> Homologous gene targeting- Proizvodnja heterozigota s jednim mutiranim alelom ili "nul-mutanata" sa mutacijom oba alela

Primjer:

1. C-myb se eksprimira u stanicama prekursorima hematopoetskih stanica.

2. C-myb-0-mutanti ugibaju in utero zbog defekta hematopoetskih stanica.

3. C-myb neophodan za normalnu diferencijaciju hematopoetskih stanica.

1. C-ret protoonkogen tijekom razvoja ukljuen u proces neurogeneze i organogeneze bubrega.

2. C-ret-0-mutanti pokazuju defekte neurogeneze i organogeneze bubrega.

Postoji povezanost izmeu ekspresije odreenog protoonkogena u nediferenciranim tkivima i osjetljivosti tih tkiva na tumorsku preobrazbu.

PML (Promijelocitna leukemija) - lijeenje retinskom kiselinom (RA) koja omoguuje terminalnu diferencijaciju mijelocita u viim dozama od fizioloke.6. GENI SUPRESORI TUMORA

eng. Tumor supressor genes, antioncogenes, emerogenes

inhibiraju razvoj tumora

vrenje ove funkcije omogueno ouvanou u barem jednom kromosomu homolognog para kromosoma

gubitak funkcionalnosti obaju alela dovodi do pojave tumora -> tumor posljedica gubitka funkcije (eng. Loss of function)

Mutirani gen supresora tumora je stoga recesivan jer izaziva tumor samo u homozigotnom obliku

Sluajevi pojave tumora u heterozigotnom obliku alela:Dominantno-negativni uinak mutacija samo jednog alela koji kodira za mutirani protein, a on inaktivira normalni protein

Epigenetsko inaktiviranje alela procesom metilacije izostaje ekspresija neoteenog gena

*Paradoks tumora kao dominantnog nasljednog svojstva nasljeivanjem jednog mutiranog alela preko spolnih stanica postoji velika mogunost mutacije drugog

- Otkrie gena na normalnim kromosomima koji suprimiraju razvoj tumora:

1. Fuzija normalne i tumorske stanice pomou Sendai virusa

2. Nastanak interspicijske (mi-ovjek) stanice

3. Pojava normalizacije tumorskih stanica pomou normalnog genoma (supresija malignog fenotipa)

4. Oduzimanjem nekoliko normalnih kromosoma u hibridnim stanicama dolazi do ponovne pojave malignog fenotipa, tj. reverzije u maligni fenotip (Harris i Klein)5. Mikrocel tehnikom se pojedini kromosomi izoliraju i unose u maligne stanice:

Kromosom 11 suprimira pojavu Wilmsovog tumora, karcinome cerviksa uterusa, karcinoma dojke, rabdomiosarkoma i fibrosarkoma

- Vjerojatno nosi nekoliko gena supresora tumora

Kromosom 13 suprimira pojavu retinoblastomaDo sada otkriveni geni supresori tumora:

APC (adenomatozna polipoza kolona) - 5q21Rb (retinoblastomski) gen - 13q14

DCC (deleted in colon carcinoma)VHL (von Hippel-Lindau) gen

HNPCC (hereditary non-polyposis colorectal cancer)WT1 (Wilmsov tumor) gen - 11p13

p53

Proteini gena supresora tumora:

I. receptori za proteine inhibitore stanine proliferacije

II. intracelularni proteini koji inhibiraju ili reguliraju progresiju kroz faze staninog ciklusa

III. kontrolni proteini koji zaustavljaju stanini ciklus jer je dolo do oteenja DNAIV. enzimi koji sudjeluju u popravku DNAV. proteini koji podstiu apoptozuZajedniko svojstvo: inhibiranje stanine proliferacijeRETINOBLASTOMSKI GEN (Rb gen)

poloaj na kromosomu: 13q14 sadraj: 27 egzona na 200kb DNA

eksprimiranje na mRNA: 4,7 kb produkt: Rb1 protein slini proteini: p107, p130 izostanak ekspresije gena i proteina: retinoblastomRb1 protein1) U stanicama retinoblastoma nije eksprimiran pa se stanice nekontrolirano dijele

2) Vezanjem proteina:E1AAdenovirus

E7Papiloma virus

Large T antigenSV 40 (polioma virus)

na Rb1 protein, onemoguuje se njegova funkcija te se stanica nekontrolirano dijeli(E7 protein HPV virusa vee se na Rb protein to je znaajno za razvoj raka grla maternice.)Pocket proteins Rb proteinsku obitelj karakterizira dep kojim veu stanine proteine i proteine virusnog podrijetla

Funkcija normalnog Rb gena je supresija rasta, tj. negativna kontrola staninog ciklusa.

Nefosforilirani/hipofosforilirani Rb protein

- supresor rasta

- vee E2F transkripcijske faktore (oni aktiviraju gene ranog odgovora na faktore rasta ili sintezu DNA)

- fosforilira i inaktivira protein Cdk u kompleksu sa ciklinom (produkti grupe gena kasnog odgovora na djelovanje faktora rasta (G1(S, G2(M))

- G0 i G1 faza staninog ciklusa

Hiperfosforiliran Rb protein kasna G1 faza, S, G2 i M faza staninog ciklusa

- fosforiliranjem ili vezanjem virusnih proteina, E2F se oslobodi i vri svoju funkciju - U stanicama tumora, Rb gen: 1) nedostaje 2) nefunkcionalan 3) funkcionalan (infekcija virusom)2) Oteena oba alela -> geni nefunkcionalni -> izostanak ekspresije funkcionalnog Rb proteina

Oteenje moe biti:

a. Hereditarno

oteenje jednog alela nasljeenog od jednog roditelja

oteeni alel nalazimo i u somatskim stanicama ei i bilateralan (na oba oka) javlja se esto i osteosarkom i tumori mekih tkivaGubitak funkcije drugog alela: RFLP analizama dokazano da se gubitkom Rb gena, gubi i ira regija normalnog kromosoma jednog od roditelja gubitak heterozigotnosti* (LOH - loss of heterozigosity) = 70% tumora*Gubitak heterozigotnosti -> gubitak tumorskog supresora -> gubitak funkcije

Epigenetske promjene metilacija promotorske regije koja sprjeava transkripciju gena

Konverzija gena greka u popravku DNA kada se koristi mutirani gen kao predloak popravka

b. Nehereditarno

somatske stanice bolesnika posjeduju normalne Rb gene Two hit hypothesis (Knudson) u nediferenciranoj stanici mrenice dolazi do mutacije na oba kromosoma te se razvija prva tumorska stanica retinoblastoma

1:30 000 zdravih ljudi oboli nehereditarnim putem

Mutacije Rb gena: Kromosomska delecija ili tokasta mutacija pruge q14 kromosma 13 Aneuplodija gubitak kromosoma s normalnim genom

Mitotika rekombinacija - gubitak normalnog gena zbog crossing-overa (karakteristian samo za mejozu) s podrujem mutiranog gena

Mogui naini gubitka normalnog Rb gena:

1. Kromosomska delecija

2. Tokasta mutacija

3. Aneuplodija (gubitak kromosoma)

4. Gubitak kromosoma i udvostruenje kromosoma s mutiranim Rb genom

5. Mitotika rekombinacija

6. Konverzija gena

Rekonstitucija (unos normalnih kopija) Rb gena:

Nain: retrovirusna infekcija, transfekcija plazmida, mikrocel transfer itavog kromosoma

Posljedica: Suprimiranje rasta stanica u kulturi i/ili razvoja tumora u eksperimentalnim ivotinjamaRb protein i diferencijacijaPretpostavka: Rb protein je ubikvitaran, tj. prisutan u svim normalnim stanicama organizma zbog vane uloge u regulaciji normalnog staninog ciklusaOtkrie: Heterogenost ekspresije Rb proteina u stanicama ovisno o vrsti tkiva i njihovom stupnju diferencijacije za vrijeme embrionalnog razvitka.

Prisutan i u proliferirajuim i postmitotskim stanicama : osteoblasti, skeletni miii, neuroni i glija stanice CNS-a, megakariociti i krvni otoii jetre.

Prisutan u vie diferenciranim stanicama: Epitelna tkiva (koa, crijevo) Odsutan u slabije diferenciranim bazalnim stanicama

Mrenica (unutarnji postmitotski sloj diferenciranih ganglija) odsutan u mitotskom vanjskom sloju (neuroblasti) Zakljuak: Rb protein se javlja u stanicama koje prolaze odreeni put diferencijacije i ije se potomstvo vie nee dijeliti ili e biti vie diferencirano.

Rb gen pokazuje diferencijalnu aktivnost tijekom razvoja zametka.

Dokaz:

Homozigotni Rb nokautirani mievi ugibaju oko 14. dana gestacije (razdoblje noenja embrija/fetusa u viviparnih sisavaca) zbog:

abnormalne hematopoeze (nemogunost terminalne diferencijacije eritrocita)

malformacija i nekroza CNS-a (sa ektopinim diobama stanica)

Heterozigotni mievi sa mutacijom i drugog alela razvijaju adenokarcinom hipofize, no ne dolazi do retinoblastoma.

Razvoj retinoblastoma se pojavljuje u mieva kojima je inaktiviran i srodan p107 gen.Zakljuak 2: Protein p107 kolateralni spasilaki put u mieva kojima je inaktiviran samo Rb1 gen.Rb protein i diferencijacija miia

Mioblast ->Sincicij ->Miotubi ->Mii

Ekspr. malo Rb proteinaPuno Rb proteina na polovima

Glavni gen za regulaciju diferencijacije miia Myo D gen, pretvara tumorske stanice u skeletne miine samo ako posjeduju aktivni Rb gen.Vezanje Myo D i Rb proteina uzrokuje zaustavljanje staninog ciklusa i indukciju gena specifinih za diferencijaciju skeletnog miia.Danas je utvreno da 3 oblika Rb proteina pokazuju odreene razlike u ekspresiji i funkciji u pojedinim stupnjevima diferencijacije.

Zato se kod nedostatka Rb gena u nasljednom retinoblastomu javlja samo tumor oka i tumori mezenhimalnog tkiva ?

Zbog mogunosti realiziranja tumorskog potencijala.

Osim mutacije drugog alela, bitna je i sudbina pogoenog tkiva.

Primjer: Razlika izmeu diferenciranih stanica (sadre Rb protein) mrenice i crijeva jest ta to su potonje osuene da propadnu (odljute se sa povrine) pa ne mogu ni realizirati svoj tumorski potencijal.

Genska terapija Rb proteinom uspjeno zaustavljena proliferacija HeLa stanica u kulturi (stanina linija dobivena iz karcinoma cerviksa uterusa) koritenjem vektorskih konstrukata s konstutivno aktivnim Rb genom oblikom gena iji se protein ne moe fosforilirati Normalni Rb gen unesen pomou adenovirusnog vektora inhibira rast tumora

GEN p53 gen supresor tumora

zaustavlja proliferaciju stanica veui se na DNA i induciranjem transkripcije gena za protein 21kDProtein se vee na kompleks G1 ciklina i Cdk, to zaustavlja stanicu u G1 kontrolnoj toki. inaktivacija p53 gena u tumorskom tkivu je prisutna u vie od 50% svih ljudi oboljelih od raka NAJEA GENETSKA PROMJENA U TUMORIMA mutacija p53 alela javlja se u nasljednom obliku Li-Fraumeni sindrom Na p53 protein veu se:

T antigenSV 40

E1BAdenovirus

E6Papiloma virus

(HPV producira E6 protein to je znaajno za nastanak raka grla maternice.) Protein p53 se ne eksprimira u normalnim stanicama kao Rb protein! Pokus i opaanje: p53-0-mutanti mievi se normalno razvijaju za vrijeme gestacije, ali oko 3. mjeseca ivota dobiju tumor.

Zakljuak: p53 potreban za vrijeme ekspozicije stanice mutagenima (UV zrake, gama zrake). Poveanom razinom p53 dolazi do zastoja proliferacije u G1 fazi ili do apoptoze.

GEN WT1

WT1 protein je transkripcijski faktor koji regulira transkripciju razliitih gena, tj. inhibira rast.

Javlja se prilikom diferencijacije bubrega.

Wilmsov tumor ili nefroblastom je djeji tumor bubrega uzrokovan mutacijama nekoliko lokusa.

Rijetko se javlja i pojavom dviju neovisnih mutacija WT1 gena na 11p13 kromosomu. (Knudsonova hipoteza) Kolorektalni karcinom

- nastaje sporo i razvija se godinama

- nedostaci gena supresora tumora i aktivnost onkogena

Hipoteza o razvoju kolorektalnog karcinoma (Vogelstein)

INICIJACIJA

1. Zapoinje u stanicama sluznice debelog crijeva gubitkom tumor-supresor APC gena na kromosomu 5q21.Dolazi do hiperproliferacije epitela crijeva i pojave polipa crijeva.

PROMOCIJA

2. Aktivacijom K-ras onkogena dolazi do pojave adenoma (=benigni epitelni tumor).

Nedostatkom transmembranskog DCC proteina (od tumor-supresor DCC gena) razvija se kasni adenom.

PROGRESIJA3.Mutacija tumor-supresor gena p53 omoguuje akumulaciju razliitih mutacija sve do velikih kromosomskih aberacija koje su tipine za razvijeni maligni tumor.

Druge promjene dovode do metastaze tumora.

U nasljednom nepolipoznom kolorektalnom karcinomu javlja se inaktivacija HNPCC tumor-supresor gena koji popravlja neslaganje sekvenca nukleotida u dva lanca DNA uzvojnice.

Obiteljski rak

U 0,1% ljudi koji imaju rak, radi se o nasljednoj predispoziciji:-Retinoblastom

-Wilmsov tumor

-Obiteljski kolorektalni karcinom

-Naljedni tumor bubrega (RCC- renal cell carcinoma) u koji spada i VHL (Von Hippel-Lindau sindrom)

-MEN (multipla endokrina neoplazija)

-neurofibromatoza

-Li Fraumeni sindrom (LFS)

-nasljedni karcinom dojke i ovarija

Veina obiteljskih malignih tumora poinje gubitkom homozigotnosti gena supresora tumora i somatskom mutacijom drugog alela.

U poetku tumora, vanija je inaktivacija gena supresora tumora nego li aktivacija onkogena.