系 统 实 验 之 二系 统 实 验 之 二

TT 淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定

系 统 实 验 之 二系 统 实 验 之 二

TT 淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定

付海英付海英fuhaiying612@yahoo.com.cnfuhaiying612@yahoo.com.cn

实验流程

1W

1. 双向免疫扩散试验③ 2. 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

④

1. 双向免疫扩散试验③ 2. 酶联免疫吸附试验 (ELISA)

④

OVA (1mg/ml)+CFAOVA (1mg/ml)+CFA 免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射 5500 00 µµl l

OVA (1mg/ml)+CFAOVA (1mg/ml)+CFA 免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射 5500 00 µµl l

OVA+CFA 加强免疫小鼠 500 µl ①

OVA+CFA 加强免疫小鼠 500 µl ①

摘眼球取血无菌取脾和胸腺②

摘眼球取血无菌取脾和胸腺②

分离血清②分离血清②

2W

取脾和胸腺②取脾和胸腺②淋巴细胞转化试验②淋巴细胞转化试验②

生理盐水（生理盐水（ 5500 00 µµll )) 免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射

生理盐水（生理盐水（ 5500 00 µµll )) 免疫免疫小鼠腹腔内注射小鼠腹腔内注射

生理盐水加强免疫小鼠 500 µl ①

生理盐水加强免疫小鼠 500 µl ①

2W

After 1W

对照组实验组

抗体效价

增殖功能

实验内容实验内容

小鼠摘眼球取血、小鼠摘眼球取血、

分离血清分离血清

淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验

教学要求教学要求

掌握小鼠血清的分离掌握小鼠血清的分离

掌握淋巴细胞转化试验掌握淋巴细胞转化试验

的基本原理及基本操作的基本原理及基本操作

淋巴细胞转化试验淋巴细胞转化试验((Lymphocyte transformation test)Lymphocyte transformation test)

原理原理

检测方法检测方法

操作步骤操作步骤

应用应用

原理原理

Lymphocytes(B/T)

Mitogens

Specificity Ag

ProliferationTransformation

Lymphoblast

NucleicAcid↑Protein ↑

检测方法检测方法

形态学方法形态学方法

33HH--TdRTdR掺入法掺入法

MTTMTT法法 ((本次实验采用本次实验采用))

形 形 形 形 形形 形 形 形 形

淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋 33--44淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋

淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋 淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋 淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋 200200淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋淋

100% 未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未未

33HH -- T dRT dR形 形 形形 形 形

G0G0 G1G1有有有有有有有有有有 SSPr,RNA,DNA有有有有 DNA↑↑ New DNANew DNA3H-TdR

TdRTdR33HH--TdRTdR

cpmcpm

未未未未 未未未未cpmcpmConASI

MTTMTT 形形

形形 //形形形形形形形形形形形形 有有有有有有有有有有有有有有 形形形形形形形形形形形形MTTMTTMTTMTT有有有有 有有有有

形形形形形形形形formazanformazan

形形形形形形 //形形形形形形形形形形 AA形形

未未未未 未未未未AAConASI

操作步骤

1W

1.双向琼脂扩散试验2.酶联免疫吸附试验（ ELISA）1.1. 双向琼脂扩散试验双向琼脂扩散试验

2.2. 酶联免疫吸附试验（酶联免疫吸附试验（ ELISAELISA））

OVA免疫 /生理盐水OVAOVA免疫免疫 //生理盐水生理盐水

无菌取脾 /胸腺研磨成单细胞悬液 (1/ 2脾 /胸

腺 +2ml I M DM（无 FCS)

无菌取脾 /胸腺研磨成单细胞悬液 (1/ 2脾 /胸

腺 +2ml I M DM（无 FCS)

摘眼取血摘眼取血摘眼取血 获取血清获取血清获取血清

细胞计数【?/ ml】

取 20µl细胞 +980µl的计数液

细胞计数【?/ ml】

取 20µl细胞 +980µl的计数液

加板 (三复孔 )

(加法见附图 )

加板 (三复孔 )

(加法见附图 )调细胞浓度

?/ ml× A=1.5× 1× 107

调细胞浓度?/ ml× A=1.5× 1× 107

37℃ 5%C O 2 培养

48小时

37℃ 5%C O 2 培养

48小时

培养终止前 2小时加入 MTT

(5mg/ ml ) 1 0µl/ well

培养终止前 2小时加入 MTT

(5mg/ ml ) 1 0µl/ well

37℃ 5% C O2

继续培养 2小时

37℃ 5% C O2

继续培养 2小时

2000rp m 5min2000rp m 5min小心弃去上清，加入 100µl/ 孔

DMS O振荡，使颗粒全部溶解

小心弃去上清，加入 100µl/ 孔

DMS O振荡，使颗粒全部溶解

酶标仪测吸光度值：

A570n m

酶标仪测吸光度值：

A570n m

结果判定： SI =ConA孔 A值 /对照孔 A值结果判定： SI =ConA孔 A值 /对照孔 A值

淋巴细胞转化试验的应用淋巴细胞转化试验的应用

检查患者细胞免疫功能检查患者细胞免疫功能 估计疾病的疗效及预后估计疾病的疗效及预后 细胞配型抗原的检查：移植免疫细胞配型抗原的检查：移植免疫 免疫药理学：具有免疫调节的药物、免疫药理学：具有免疫调节的药物、保健品、中草药及生物制品保健品、中草药及生物制品

卫生毒理学的研究卫生毒理学的研究

实验分组及材料实验分组及材料

器材器材1.1. 酒精棉球酒精棉球 若干若干2.2. 无菌纱布块 无菌纱布块 11块块 // 组组3.3. 无菌平皿无菌平皿 11块块 // 组组4.4. 无菌吸头（大、中、小）无菌吸头（大、中、小） 44盒盒 /room/room

5.5. 无菌无菌 9696 孔培养板孔培养板 11块块 // 组组6.6. 可调微量加样器可调微量加样器 44套套 /room/room

7.7. 细胞计数板细胞计数板 11套套 // 组组8.8. 显微镜显微镜 11台台 // 组组9.9. EPEP 管管 若干若干10.10. 眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子 44套套 /room/room

11.11. 细胞培养箱（细胞培养箱（ 37 5%CO℃37 5%CO℃ 22))

器材器材1.1. 酒精棉球酒精棉球 若干若干2.2. 无菌纱布块 无菌纱布块 11块块 // 组组3.3. 无菌平皿无菌平皿 11块块 // 组组4.4. 无菌吸头（大、中、小）无菌吸头（大、中、小） 44盒盒 /room/room

5.5. 无菌无菌 9696 孔培养板孔培养板 11块块 // 组组6.6. 可调微量加样器可调微量加样器 44套套 /room/room

7.7. 细胞计数板细胞计数板 11套套 // 组组8.8. 显微镜显微镜 11台台 // 组组9.9. EPEP 管管 若干若干10.10. 眼科剪、小镊子眼科剪、小镊子 44套套 /room/room

11.11. 细胞培养箱（细胞培养箱（ 37 5%CO℃37 5%CO℃ 22))

12.12. 酶标仪酶标仪13.13. 离心机离心机 22 个个 //roomroom

14.14. 超净台超净台 22 个个 //roomroom

动物及试剂动物及试剂1.1. 小鼠小鼠 22只只 // 组组 ((NS,OVA)NS,OVA)

2.2. 培 养 液 （培 养 液 （ IMDM) IMDM) 无无 FCS FCS 100ml/room100ml/room

3.3. 培养液（培养液（ IMDM)20%FCS 30ml/roomIMDM)20%FCS 30ml/room

4.4. ConAConA（（ 2.5,5,10µg/ml)2.5,5,10µg/ml) 各各 1.51.5ml/tube ml/tube

5.5. 白细胞计数液（白细胞计数液（ 2%2% 冰醋酸）冰醋酸） 22 瓶瓶 //roomroom

6.6. MTTMTT（（ 5mg/ml)5mg/ml) 1.5ml/room 1.5ml/room

7.7. 二甲亚砜（二甲亚砜（ DMSO)DMSO) 5ml/ 5ml/ 组组

12.12. 酶标仪酶标仪13.13. 离心机离心机 22 个个 //roomroom

14.14. 超净台超净台 22 个个 //roomroom

动物及试剂动物及试剂1.1. 小鼠小鼠 22只只 // 组组 ((NS,OVA)NS,OVA)

2.2. 培 养 液 （培 养 液 （ IMDM) IMDM) 无无 FCS FCS 100ml/room100ml/room

3.3. 培养液（培养液（ IMDM)20%FCS 30ml/roomIMDM)20%FCS 30ml/room

4.4. ConAConA（（ 2.5,5,10µg/ml)2.5,5,10µg/ml) 各各 1.51.5ml/tube ml/tube

5.5. 白细胞计数液（白细胞计数液（ 2%2% 冰醋酸）冰醋酸） 22 瓶瓶 //roomroom

6.6. MTTMTT（（ 5mg/ml)5mg/ml) 1.5ml/room 1.5ml/room

7.7. 二甲亚砜（二甲亚砜（ DMSO)DMSO) 5ml/ 5ml/ 组组

分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏

免疫血清分离过程

摘眼球取血 RT for 2hrs

Rotation3000rpm

for 20min

Transfer serum to a new EP

Double diffusion

Store at 4℃

ELISAELISA

1.5ml EP

实验步骤实验步骤 单细胞悬液的制备：单细胞悬液的制备：

1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。2. 于超净台内取出脾和胸腺组织 ( 各 1/2) ，分别放入预先盛有 2ml

IMDM培养液的平皿内。3. 将 3-4 层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻

压组织，将其捣碎。然后用 1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入 1.5ml EP管中。

细胞计数：细胞计数：1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 20µl，加到盛有 980µl计数

液的 EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。2. 调细胞浓度至 1×107/ml，所需量为 1.5ml，设需要的细胞悬液体

积为 Aml,可按公式： ?/ml×A=1.5×1×107

NOTE:NOTE: 在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。

单细胞悬液的制备：单细胞悬液的制备：1. 小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。2. 于超净台内取出脾和胸腺组织 ( 各 1/2) ，分别放入预先盛有 2ml

IMDM培养液的平皿内。3. 将 3-4 层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻

压组织，将其捣碎。然后用 1000µl加样器隔着纱布将细胞悬液吸出，放入 1.5ml EP管中。

细胞计数：细胞计数：1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出 20µl，加到盛有 980µl计数

液的 EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。2. 调细胞浓度至 1×107/ml，所需量为 1.5ml，设需要的细胞悬液体

积为 Aml,可按公式： ?/ml×A=1.5×1×107

NOTE:NOTE: 在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。

细胞计数板细胞计数板

查出四个大方格的总细胞数查出四个大方格的总细胞数 ((X)X)

算出每个大方格的细胞数：算出每个大方格的细胞数： Y=X/4Y=X/4

每个大方格的体积为每个大方格的体积为 V=1mm×1mm×0.1mm=0.1mmV=1mm×1mm×0.1mm=0.1mm33=10=10-4-4mlml

制备的细胞悬液的细胞浓度（制备的细胞悬液的细胞浓度（ /ml)=Y ×10/ml)=Y ×1044×× 稀释倍数稀释倍数 (50)(50)

4

细胞培养：

1. 按图所示加板。

2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 37 5%C0℃ 2 培养箱中，培养 48小时。

MTT 掺入：（隔一天 下午 2:00 ）1. 在终止培养前 2 小时，在显微镜下观察细胞转化情况。2. 每孔内加入 MTT（ 5mg/ml) 10µl，加完后轻轻搕板，使 MTT和细胞混匀。

3. 在 37 5%C0℃ 2 培养箱中继续培养 2 小时，然后离心 2000rpm， 5min，轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。

4. 加入 100µl 二甲亚砜（ DMSO)，将颗粒溶解。 （隔一天 下午 4:00） 结果测定：

1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值： A570nm（用空白孔调零），记录结果。2. 结果判定： SI（刺激指数） =Con A刺激孔 A 值 / 对照孔 A 值

细胞培养：

1. 按图所示加板。

2. 将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于 37 5%C0℃ 2 培养箱中，培养 48小时。

MTT 掺入：（隔一天 下午 2:00 ）1. 在终止培养前 2 小时，在显微镜下观察细胞转化情况。2. 每孔内加入 MTT（ 5mg/ml) 10µl，加完后轻轻搕板，使 MTT和细胞混匀。

3. 在 37 5%C0℃ 2 培养箱中继续培养 2 小时，然后离心 2000rpm， 5min，轻轻弃去上清，（注意不要将孔底部的颗粒物弃出）。

4. 加入 100µl 二甲亚砜（ DMSO)，将颗粒溶解。 （隔一天 下午 4:00） 结果测定：

1. 结果测量：用酶标仪测定光密度值： A570nm（用空白孔调零），记录结果。2. 结果判定： SI（刺激指数） =Con A刺激孔 A 值 / 对照孔 A 值

预习内容预习内容

单克隆抗体的制备（理论单克隆抗体的制备（理论 P70P70 ，，实验实验 P106P106））

双向免疫扩散（理论双向免疫扩散（理论 P241P241 ，，实验实验 P116P116））

八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺 每孔加入 100 µl 调好的细胞悬液 1-3 孔加入 10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl

4-6 孔加入 2.5 µg/ml的 Con A, 100 µl

7-9 孔加入 5 µg/ml的 Con A, 100 µl

10-12 孔加入 10 µg/ml的 Con A, 100 µl

NOTE:ConA用 10%FCS-IMDM培养液配制

八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺 每孔加入 100 µl 调好的细胞悬液 1-3 孔加入 10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl

4-6 孔加入 2.5 µg/ml的 Con A, 100 µl

7-9 孔加入 5 µg/ml的 Con A, 100 µl

10-12 孔加入 10 µg/ml的 Con A, 100 µl

NOTE:ConA用 10%FCS-IMDM培养液配制

1-3 4-6 7-9 10-12

AA spleen cell+

10% IMDM

spleen cell+

ConA 2.5µg/ml

spleen cell+

ConA 5µg/ml

spleen Cell+

ConA 10µg/ml

BB spleen cell+

10% IMDM

spleen cell+

ConA 2.5µg/ml

spleen cell+

ConA 5µg/ml

spleen Cell+

ConA 10µg/ml

CC thymus cell+

10% IMDM

thymus cell+

ConA 2.5µg/ml

thymus cell+

ConA 5µg/ml

thymus Cell+

ConA 10µg/ml

DD thymus cell+

10% IMDM

thymus cell+

ConA 2.5µg/ml

thymus cell+

ConA 5µg/ml

thymus Cell+

ConA 10µg/ml

N.S.

OVA

N.S.

OVA

加加样样方方法法

返回

八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺 每孔加入 100 µl 调好的细胞悬液 1-3 孔加入 10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl

4-6 孔加入 2.5 µg/ml的 Con A, 100 µl

7-9 孔加入 5 µg/ml的 Con A, 100 µl

10-12 孔加入 10 µg/ml的 Con A, 100 µl

八个人一块培养板，两人加脾，两人加胸腺 每孔加入 100 µl 调好的细胞悬液 1-3 孔加入 10%FCS-IMDM 培养液， 100 µl

4-6 孔加入 2.5 µg/ml的 Con A, 100 µl

7-9 孔加入 5 µg/ml的 Con A, 100 µl

10-12 孔加入 10 µg/ml的 Con A, 100 µl

1-3 4-6 7-9 10-12

AA spleen cell+

10% IMDM

spleen cell+

ConA 2.5µg/ml

spleen cell+

ConA 5µg/ml

spleen Cell+

ConA 10µg/ml

BB spleen cell+

10% IMDM

spleen cell+

ConA 2.5µg/ml

spleen cell+

ConA 5µg/ml

spleen Cell+

ConA 10µg/ml

CC thymus cell+

10% IMDM

thymus cell+

ConA 2.5µg/ml

thymus cell+

ConA 5µg/ml

thymus Cell+

ConA 10µg/ml

DD thymus cell+

10% IMDM

thymus cell+

ConA 2.5µg/ml

thymus cell+

ConA 5µg/ml

thymus Cell+

ConA 10µg/ml

N.S.

OVA

N.S.

OVA

加加样样方方法法